CN111500762A - 一种慈菇ssr引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种慈菇SSR引物组及其应用，本发明以对不同地域的慈菇材料进行DNA提取、测序、分析获得相应的SSR引物组，该引物组能对本申请几种不同地域的慈菇材料进行分类、鉴别，判定其亲缘关系的远近，为研究慈菇品种的基因组成、亲缘关系、育种提供分子生物学上的参考依据，是一组具有高多态性的SSR引物组，能起到对不同种质资源慈菇的良好聚类和鉴定作用。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种慈菇SSR引物组及其应用。
【背景技术】
慈菇(学名：Sagittaria sagittifolia L.)，又称茨菰、慈菇、燕尾草、白地栗等，是泽泻科慈菇属的一种多年生草本植物，果实可食用，味涩。慈菇在我国南方常食用的野生蔬菜，在广西种质资源极其丰富，但是在种质资源遗传多样性的研究和保护方面研究还较少，随着市场需求，目前涌现出越来越多的科研人员对慈菇进行育种研究，而如何有效对慈菇品种进行分类鉴定是育种前期的要求，基于慈菇的地域限制，目前对慈菇的分子遗传标记开发还少有报道，利用分子标记的方法对不同品种的慈菇进行分类就显得尤为重要。
因此，需要对慈菇的SSR引物进行开发，以为后续开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种慈菇SSR引物组及其应用，该引物组具有多态性好，能快速区分慈菇品种，对慈菇进行亲缘关系鉴别，可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的基因位点和鉴定引物。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种慈菇SSR分子标记引物组，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～42所示。
进一步的，所述SSR引物组能对不同地域的慈菇进行区分。
进一步的，所述不同地域的慈菇分别为：昭平慈菇、荔浦慈菇、合浦慈菇、柳江慈菇、灌阳慈菇、田阳慈菇和野生慈菇。
一种构建如所述一种慈菇SSR分子标记引物组的方法，所述方法为：提取慈菇的DNA、对DNA进行测序、对测序完成的DNA序列进行分析、选取适合引物设计的位点设计引物序列并合成相应引物、用引物对不同种质资源的慈菇样品进行扩增，选取具有特异性的引物构建引物组。
进一步的，所述用引物对不同种质资源的慈菇样品进行扩增的PCR反应体系为：ddH2O8μl，PCR扩增试剂10μl(其中，PCR扩增试剂为2×TSINGKE Master Mix(green))，10μM的SSR上游引物0.5μl，10μM的SSR下游引物0.5μl，DNA模板1μl；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
本发明还包括一种慈菇SSR分子标记引物组的应用，该引物组用于检测不同慈菇品种遗传多样性。
本发明还包括一种慈菇SSR分子标记引物组的应用，该引物组用于对不同地域的慈菇品种进行区分和/或聚类分析。
本发明具有如下有益效果：
本发明以慈菇为材料，提取慈菇的DNA并进行酶切、测序、分析得到相应的SSR引物，可为慈菇的遗传多样性和遗传关系的应用研究提供更多有效的SSR标记，经分析该引物具有高多态百分数的特点，多态性位点达到83.33％以上，使用该引物组进行验证扩增效果良好，能对不同地域的慈菇品种进行遗传性分析；且该引物组的选择为慈菇在今后的遗传育种中如QTL定位、亲缘关系鉴定、遗传多样性研究及杂种优势预测等方面提供有价值的遗传工具，并通过系谱亲本间遗传关系的研究能为慈菇的育种亲本合理选配及慈菇种质创新利用提供参考依据。
【附图说明】
图1是本发明实施例中慈菇的SSR基序类型分布图；
图2-6是本发明引物组在7个样品中的琼脂糖凝胶电泳图；其中，图2-6中的第一泳道均为Maker，为DL500，从上至下条带大小依次为：500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp；
图7是本发明实施例不同地域慈菇的聚类分析树状图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
一、实验方法：
(一)主要仪器设备：
(1)梯度PCR仪：Easy Cycler德国AnalytikJena
(2)全自动化学发光/荧光图像分析系统：5200Multi上海天能
(3)台式冷冻离心机：5430R德国eppendorf
(4)涡旋混合器：XH-C江苏省金坛市荣华实验器材有限公司
(5)电泳仪电源：DYY-8C北京六一生物科技有限公司
(6)电泳仪：DYCZ-20G北京六一生物科技有限公司
(7)扫描仪：MRS-6900TFU2L上海中晶科技有限公司
(二)主要试剂
(1)PCR扩增试剂(2×TSINGKE Master Mix(green))：TSE002擎科生物
(2)DNA提取试剂盒：BSC1S1，博日
(3)引物在通用生物系统(安徽)有限公司合成
(三)样本来源：荔浦慈菇，地方品种，收集自荔浦市修仁镇念村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
(四)SSR引物构建方法：
1、采用DNA提取试剂盒和试剂盒操作说明对慈菇样品进行慈菇的基因组DNA提取；
2、对步骤1的DNA进行测序，使用SSR search软件分析RAD测序组装后的DNA序列，测序测序数据质量表如表1所示，对RAD组装的contig进行SSR分析得到32,487条双端含有100bp序列的SSR片段，其中28,859个片段可以用于设计引物，片段引物设计率为88.83％。可以设计引物的SSR中，重复类型从二碱基到六碱基，每种类型的数目分别是三碱基重复>二碱基重复>四碱基重复>五碱基重复>六碱基重复(如图1所示)。测序分析所得的SSR序列的统计表如表2所示(表2)。数量最多的前20种SSR重复如表3所示。
表1测序数据质量表
| 项目 | 数值 |
| Raw Base(bp) | 141,185,328,300 |
| Clean Base(bp) | 140,867,537,700 |
| Effective Rate(％) | 99.77 |
| Q20(％) | 97.71 |
| Q30(％) | 93.40 |
| GC Content(％) | 38.23 |
| Clean reads | 469,558,459 |
| Removed duplication reads | 322,971,767 |
| Clean duplication rate(％) | 31.22 |
| Digestion reads | 318,515,554 |
| Digestion ratio(％) | 98.62 |
| Cluster Tag number | 82,945,224 |
| Cut Tag number | 318,515,553 |
| Cut pair reads | 8,329,336 |
| Total contig base(bp) | 217,892,148 |
| Total contig number | 68.41 |
| Average contig length(bp) | 1,576,586,730 |
| N50length(bp) | 7,743,995 |
上表中，各项目的注释为：Raw Base(bp)：原始数据产量，以bp为单位。Clean Base(bp)：过滤之后的有效数据量，以bp为单位。Effective Rate(％)：过滤后获得clean data与raw data的比值。Q20、Q30：Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。GCContent(％)：碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。Clean reads：clean datareads数目。Removed duplication reads：去重之后reads数目。Clean duplication rate(％)：clean reads的重复率。Digestion reads：酶捕获的reads数目。Digestion ratio(％)：酶捕获的reads数目与去重之后reads数目的比值。Cluster Tag number：数据聚类后的类数。Cut Tag number：统计类中的reads支持数在10-400之间的类数目。Cut pairreads：对reads支持深度进行过滤之后所剩下的pair reads数。Total contig base(bp)：组装结果总长度。Total contig number：组装结果总个数。Average contig length(bp)：组装contig的平均长度。N50 length(bp)：序列从大到小排列，当长度达到组装总长度一半时，contig的长度。
从表1可知，本研究所进行的RAD测序总共得到141.185G的Raw Base(bp)，经过数据有效性过滤之后，所得的Clean Base(bp)数据量为140.868G，数据有效率为99.77％，Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比分别为97.71％和93.40％，GC含量(GCContent)为38.23％。得到的Clean Reads数量为469,558,459条，去重后的reads数为322,971,767条，Clean reads的重复率为31.22％，具有EcoRⅠ酶切位点的reads数为318,515,554条。对含EcoRⅠ酶切位点的reads用Cd-hit进行聚类，把相似的RAD-tag相近的reads聚集到一起作为一个聚类(Cluster)，总共得到82,945,224个聚类数(Cluster tag number)。把聚集在一起的reads数少于10个的类进行过滤，得到了8,329,336个聚类，这些聚类中包含的可用reads数为217,892,148条。对筛选后的每一类进行局部组装，去除小于100bp的contig，总共得到7,743,995个contig，每个contig的平均长度为203bp，N50长度为2,313,691bp。
表2 RAD测序分析所得的SSR序列的统计表
从表2可知，可以设计引物的SSR中，所得的SSR核心序列(Motif)的长度从二碱基到六碱基，在碱基类型中最多的三碱基数量为20142条，占总数量的69.79％，平均的SSR长度为13.14个碱基，重复次数最多的是4次重复，为15761条。在碱基类型第二丰富的二碱基重复数量为6701条，比率为23.22％，平均SSR长度为15.46个碱基，重复次数最多的是6次重复，为2985条。
表3数量最多的前20种SSR重复
| SSR核心序列 | 计数 | 平均长度 | ％占比 |
| AT | 2219 | 17.17 | 7.69 |
| AAG | 1675 | 13.21 | 5.80 |
| TCT | 1608 | 13.14 | 5.57 |
| CTT | 1372 | 13.38 | 4.75 |
| GAA | 1258 | 13.33 | 4.36 |
| TA | 1216 | 16.10 | 4.21 |
| AGA | 1188 | 13.74 | 4.12 |
| TTC | 1143 | 13.68 | 3.96 |
| AG | 693 | 14.05 | 2.40 |
| TC | 692 | 13.96 | 2.40 |
| CCA | 550 | 12.55 | 1.91 |
| GA | 540 | 14.21 | 1.87 |
| TGG | 539 | 12.61 | 1.87 |
| CT | 519 | 14.29 | 1.80 |
| ATG | 514 | 13.24 | 1.78 |
| GAT | 507 | 14.17 | 1.76 |
| CAT | 503 | 13.50 | 1.74 |
| TCA | 447 | 13.41 | 1.55 |
| CAA | 446 | 12.79 | 1.55 |
| TGA | 440 | 12.92 | 1.52 |
从表3中可看出，数量最多的前20种SSR重复均为二碱基重复和三碱基重复单元，其中，AT是数量最多的，有2219条，占总数的7.69％，平均长度分别为17.17bp；其次为AAG，总数为1675条，占总数的5.80％，平均长度为13.21bp(如表3所示)
2、用引物对不同种质资源的慈菇样品进行扩增：
提取不同样品的慈菇DNA，提取方法参考步骤1；
采用如下反应体系和反应程序对不同样品的慈菇DNA进行扩增：
PCR反应体系为：ddH2O 8μl，PCR扩增试剂10μl，10μM的SSR上游引物0.5μl，10μM的SSR下游引物0.5μl，DNA模板1μl；共20μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
根据电泳结果选取具有特异性的引物构建引物组(筛选出的引物见表4)下列引物信息如序列表SEQ ID NO.1～42所示。
表4引物信息表
| 序号 | 引物 | 正向序列 | 反向序列 |
| 1 | P8 | CCATCACTACCTCATTAGCAACC | GTTTGATGACACGTTTGCCTTAC |
| 2 | P14 | GATGACAGGTGCTCCCTATCC | GTTCATGACGCTCAACTCCAT |
| 3 | P17 | ACACAACCTTCTGATCAGGCTT | TCCTTGAGAAATTTGCTTCTTCA |
| 4 | P19 | CAACAAGTCATTTGGTTTCTTGA | GGCATGACAAAGAATTCAGTTTA |
| 5 | P20 | AAAAGCACAATGAAAGCAGAAAG | GCTCTTTGCTTGGATTACAAATG |
| 6 | P25 | AGAACAGTTGTTGCTTGTGTTGA | GAGAAAGAGCTCACAATTGCATC |
| 7 | P42 | ACTCAATATGATAGGCTTTGCCC | CCACAAGGCATGTCACTTATCTC |
| 8 | P46 | AGCAATGGTTTAGTAAAAATTCGG | GTTAGGTAGGTGTGTGCATATGTGT |
| 9 | P47 | TTTATACTTGATTGCCTCGGTGT | GAAATGATGAAATGTGAAGAACGA |
| 10 | P53 | AAGAATTGGATAAGAGCAACCGT | TTTTTACCTTGGTTGCTTGATTG |
| 11 | P55 | ATCACAAAACCCTCATTTAAGCA | AAGGAAACATAACCATGGGAGAT |
| 12 | P57 | CCGTTGTGTAATTAACCCAAAAA | TCCACACTTGTGGCTTTTAATCT |
| 13 | P62 | TCTGAACACAACATGGTTGAGAC | GAGAATGCATTTCTTGTGTTGC |
| 14 | P63 | GTTCTTCCATTGATGATGTCTCC | GTTGGGAGTTAGGCCTAGATGAT |
| 15 | P64 | TGTTGGTGAACTACATTGTGAGAA | CCAGTGGAGGTCTTCAGATTTAC |
| 16 | P67 | AAATATTGCTGGACACCTGTCAT | GATCCCAACATTATTGAGGCTAA |
| 17 | P70 | AGCATCAAAAGTTGATCAAGACC | AAACAAATGGACTTCACTTCCAG |
| 18 | P87 | AAGTTGAGACATCCTGTTGCCTA | ACATGACACCGATCTCCTTCTT |
| 19 | P88 | GACACACTAACAGAATTGCATTGA | GTGTCAACCAAACACTCTCTTGA |
| 20 | P89 | GGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGA | GCAGGTGCTACTTCAAACTCCT |
| 21 | P91 | TATTCTTGAGAGCAAGGGAGAAG | TTGGTCCAAGTACTACCTTTCCA |
实施例2：
应用实施例1构建的引物组对不同地域的慈菇品种进行多样性分析：
一、样本来源：
昭平慈菇(ZPCG)：收集自广西昭平县樟木林乡三江村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
荔浦慈菇(LPCG)：收集自广西荔浦市修仁镇念村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
合浦慈菇(HPCG)：收集自广西合浦县星岛湖镇上洋村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
柳江慈菇(LJCG)：收集自广西柳州市柳江区百朋镇怀洪村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
灌阳慈菇(GYCG)：收集自广西灌阳县洞井瑶族乡洞井村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
田阳慈菇(TYCG)：收集自广西田阳县那坡镇六合村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
野生慈菇(YSCG)：收集自广东乐昌市北乡镇黄坌村，保存于广西农业科学院生物技术研究所水生蔬菜种质资源圃。
采样后提取上述样品的基因组DNA，利用如表4所示引物进行琼脂糖电泳扩增，扩增结果参见图2-6，可见上述引物对不同地域品种的慈菇具有良好的多态性，能对上述不同地域的慈菇品种进行区分；根据图2-6的有带无带情况建立0，1数据矩阵；对总位点和多态位点进行统计，并计算多态百分数，其扩增的数据结果见表5；采用NTsys2.10e聚类分析软件UP-GMA法进行聚类分析，构建了7个品种的遗传关系聚类图(结果参见图7)。
表5 P8引物组在样品中的扩增数据结果表
从表5和图2-6可看出，本申请的引物具有丰度高、条带丰富、多态性好的特点，引物的多态性能达到83.33％以上。总计多态性高达95.45％，其中，图2-6中其泳道和对应的引物如表6所示：
表6电泳引物和泳道对应表
图2-6中，在引物扩增的样品从左到右依次为：昭平慈菇、荔浦慈菇、合浦慈菇、柳江慈菇、灌阳慈菇、田阳慈菇和野生慈菇。
如图7所示，7个树种/群体的遗传相似系数在0.3864以上，最高为0.9，平均值为0.3864。遗传距离范围0.1054～0.951在之间，平均遗传距离为0.5742，变幅较大；图中可见，昭平慈菇与荔浦慈菇的亲缘关系最近、合浦慈菇与柳江慈菇亲缘关系较近、田阳慈菇与野生慈菇亲缘关系较近、灌阳慈菇单独聚到一类，说明，不同地域的慈菇其品种间亲缘关系较远，可通过上述的SSR引物组进行区分。
遗传相似系数分析参见表7：
表7 Nei's无偏遗传相似系数(对角线上)和遗传距离(对角线下)
注:上表中1、昭平慈菇；2、合浦慈菇；3、柳江慈菇；4、灌阳慈菇；5、田阳慈菇；6、荔浦慈菇；7、野生慈菇
从表7可知，7个树种/群体的遗传相似系数在0.3864以上，最高为0.9，平均值为0.3864。遗传距离范围0.1054～0.951在之间，平均遗传距离为0.5742，变幅较大，说明本申请的SSR引物组能很好的对这7种不同地域的慈菇材料进行很好的区分，结果和图7吻合。
综上所述，使用本申请得到的SSR引物具有良好的多态性，能对不同地域的慈菇进行扩增标记，特别是对昭平慈菇、荔浦慈菇、合浦慈菇、柳江慈菇、灌阳慈菇、田阳慈菇和野生慈菇具有良好的区分作用；能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新思路。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 一种慈菇SSR引物组及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatcactac ctcattagca acc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtttgatgac acgtttgcct tac 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgacaggt gctccctatc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcatgacg ctcaactcca t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acacaacctt ctgatcaggc tt 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccttgagaa atttgcttct tca 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacaagtca tttggtttct tga 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcatgacaa agaattcagt tta 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaagcacaa tgaaagcaga aag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctctttgct tggattacaa atg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agaacagttg ttgcttgtgt tga 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagaaagagc tcacaattgc atc 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
actcaatatg ataggctttg ccc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccacaaggca tgtcacttat ctc 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcaatggtt tagtaaaaat tcgg 24
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttaggtagg tgtgtgcata tgtgt 25
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttatacttg attgcctcgg tgt 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaaatgatga aatgtgaaga acga 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aagaattgga taagagcaac cgt 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tttttacctt ggttgcttga ttg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcacaaaac cctcatttaa gca 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaggaaacat aaccatggga gat 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccgttgtgta attaacccaa aaa 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tccacacttg tggcttttaa tct 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tctgaacaca acatggttga gac 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagaatgcat ttcttgtgtt gc 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttcttccat tgatgatgtc tcc 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gttgggagtt aggcctagat gat 23
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgttggtgaa ctacattgtg agaa 24
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccagtggagg tcttcagatt tac 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaatattgct ggacacctgt cat 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gatcccaaca ttattgaggc taa 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agcatcaaaa gttgatcaag acc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaacaaatgg acttcacttc cag 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aagttgagac atcctgttgc cta 23
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acatgacacc gatctccttc tt 22
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gacacactaa cagaattgca ttga 24
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtgtcaacca aacactctct tga 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ggtgtgtgtg tgagagagag aga 23
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcaggtgcta cttcaaactc ct 22
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tattcttgag agcaagggag aag 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttggtccaag tactaccttt cca 23
Claims (7)
1.一种慈菇SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～42所示。
2.根据权利要求1所述一种慈菇SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR引物组能对不同地域的慈菇进行区分。
3.根据权利要求1所述一种慈菇SSR分子标记引物组，其特征在于，所述不同地域的慈菇分别为：昭平慈菇、荔浦慈菇、合浦慈菇、柳江慈菇、灌阳慈菇、田阳慈菇和野生慈菇。
4.一种构建如权利要求1-3任意一项所述一种慈菇SSR分子标记引物组的方法，其特征在于，所述方法为：提取慈菇的DNA、对DNA进行测序、对测序完成的DNA序列进行分析、选取适合引物设计的位点设计引物序列并合成相应引物、用引物对不同种质资源的慈菇样品进行扩增，选取具有特异性的引物构建引物组。
5.根据权利要求4所述一种慈菇SSR分子标记引物组的方法，其特征在于，所述用引物对不同种质资源的慈菇样品进行扩增的PCR反应体系为：ddH2O 8μl，PCR扩增试剂10μl，10μM的SSR上游引物0.5μl，10μM的SSR下游引物0.5μl，DNA模板1μl；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
6.如权利要求1-3任意一项一种慈菇SSR分子标记引物组的应用，其特征在于，该引物组用于检测不同慈菇品种遗传多样性。
7.如权利要求1-3任意一项一种慈菇SSR分子标记引物组的应用，其特征在于，该引物组用于对不同地域的慈菇品种进行区分和/或聚类分析。
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