CN112210618A - 适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了适用于天目地黄的qRT‑PCR内参基因及其应用。本发明基于天目地黄花的5个不同发育时期和叶转录组数据中筛选出6个表达量相对稳定的候选内参基因，并利用qRT‑PCR技术，通过GeNorm、NormFinder和Bestkeeper 3种不同算法对候选参考基因的稳定性进行分析。结果表明，针对天目地黄花和叶组织的最佳内参基因数目为两个，为RcTIP41和Rc18S；其中，RcTIP41基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Rc18S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明确定了天目地黄花和叶qRT‑PCR的最适内参基因，并提供了内参基因的特异性引物，为天目地黄中相关基因表达的精确定量分析提供了重要参考。

Description

适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因及其应用

技术领域

本发明涉及适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

天目地黄(Rehmannia chingii Li.)属于玄参科地黄属多年生草本植物，主要分布在浙江、安徽等地，其花冠大而艳，呈紫红色，与地黄属其它物种有着明显的区别，是常见大宗中药材地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的野生近缘种。天目地黄花和叶含有丰富的环烯醚萜苷、苯乙醇苷、花青素、多糖等多种化学成分，具有保肝、抗炎、神经保护、抗氧化、降血糖等多种药理活性，不仅在中药开发和利用方面具有重要的价值，而且也可用于食品、饲料及天然产物提取。对天目地黄花和叶的发育和次生代谢产物合成积累及其调控机制的研究，需要进一步挖掘参与器官发育和次生代谢产物积累的功能基因，并研究基因的时空表达模式和分子功能。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是对目标基因表达定量应用最广泛的分子生物学方法，具有精确度高、灵敏性强、特异性强和重复性好等特点，也常用于植物学、医学、微生物学等众多领域的研究。但是，qRT-PCR对目标基因表达量准确分析的前提是筛选出稳定表达的内参基因。理想的内参基因应该不受生长阶段、组织器官及实验处理条件的影响。然而，内参基因在不同植物以及不同实验条件下并不是恒定的，而且内参基因在不同植物中并不具有通用性。此外，关于天目地黄内参基因的研究还较为匮乏，虽然天目地黄的近缘物种地黄的内参基因筛选和利用已有报道，然而天目地黄和地黄的基因序列存在较大差异，且表达特性也有所不同，因此，地黄的内参基因并不能作为天目地黄qRT-PCR的内参基因。

目前，适宜用于天目地黄qRT-PCR研究的内参基因还未见报道。因此，对天目地黄功能基因表达特性的进一步研究，必须针对天目地黄筛选出表达稳定可靠的内参基因。

发明内容

本发明的目的是提供适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RcTIP41基因和/或Rc18S基因，该内参基因基于天目地黄花的5个不同发育时期和叶转录组数据筛选得到，为进一步准确定量天目地黄功能基因转录表达水平及相关基因工程工作的开展奠定基础。

本发明的另一目的是提供RcTIP41基因和/或Rc18S基因作为内参基因在qRT-PCR检测天目地黄基因转录表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RcTIP41基因和/或Rc18S基因，所述RcTIP41基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述Rc18S基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了RcTIP41基因和/或Rc18S基因作为内参基因在qRT-PCR检测天目地黄基因转录表达水平中的应用。

RcTIP41基因的特异性引物为：

RcTIP41-F：5’-AAGAGCAGCTTCAGACTTCC-3’(SEQ ID NO.3)

RcTIP41-R：5’-GAATTTCCATTGAGCAGCCG-3’(SEQ ID NO.4)

Rc18S基因的特异性引物为：

Rc18S-F：5’-AGCAAGGGCAGTGTTACAAG-3’(SEQ ID NO.5)

Rc18S-R：5’-GCACTACTTAGTGACGGTGG-3’(SEQ ID NO.6)

优选的，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的反向引物对RcTIP41基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物对Rc18S基因进行特异性扩增。

优选的，所述qRT-PCR的反应体系为25μl，包含

Premix Ex Tap II 12.5μl，正向引物和反向引物分别1μl，cDNA 1μl，ddH₂O补足25μl，其中cDNA由RNA反转录得到。

优选的，所述qRT-PCR的反应程序为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

本发明的有益效果在于：

首先，本发明根据天目地黄得转录组数据选出6个候选内参基因，并通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对6个候选内参基因在5个不同发育时期的花和叶组织样品中的稳定性进行了分析。结果表明，天目地黄最适的内参基因数目为两个，为RcTIP41基因和Rc18S基因。本发明首次提出将RcTIP41和/或Rc18S基因作为天目地黄qRT-PCR的内参基因对目标基因的表达水平进行归一化，解决了天目地黄qRT-PCR没有内参基因的现状。并且，本发明提供的适用于天目地黄qRT-PCR的两个内参基因序列均来自天目地黄花和叶转录组序列，与其他物种上的通用内参基因相比具有特异性好，稳定性高等优点。

其次，本发明提供了RcTIP41基因和/或Rc18S基因作为内参基因在qRT-PCR检测天目地黄基因转录表达水平中的应用，能够用于天目地黄发育过程中关键基因的表达分析，能显著提高所得数据的精准性，应用广泛、灵敏度高、稳定性好。并且，本发明还提供了上述内参基因的特异性引物，引物的PCR扩增片段只有一个，没有非特异扩增，表明RcTIP41和Rc18S荧光定量PCR引物特异性强，保证了目的片段的扩增效率。

最后，本发明还基于转录组筛选了4个不同代谢途径的关键酶基因作为验证基因，并以RcTIP41、Rc18S、RcTIP41+Rc18S及表达稳定性相对较低的RcGAPDH分别作为内参基因，进行qRT-PCR分析，其分析结果与转录组对应基因的FPKM值进行相关性分析，从而验证内参基因的稳定性，进一步确定内参基因的适用性与可靠性。

附图说明

图1是天目地黄供试材料的样品采集图；

图2是本发明中天目地黄6个候选内参基因引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是天目地黄中6个候选内参基因qRT-PCR熔解曲线；

图4是本发明中6个候选内参基因平均Cq值分布；

图5是通过GeNorm软件比较6个候选内参基因的表达稳定性M值折线图；

图6是GeNorm分析得到的Vn/Vn+1，用于确定准确定量分析最优的内参基因数目；

图7是以RcTIP41、Rc18S、RcTIP41+Rc18S及RcGAPDH分别作为内参基因对验证基因进行qRT-PCR分析的结果图及验证基因的FPKM值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。以下实施例采用的供试材料为种植在河南农业大学农大红试验田的二倍体天目地黄不同发育时期的花(小蕾期(C1)、现蕾期(C2)、大蕾期(C3)、初花期(C4)、盛花期(C5))以及叶(L)作为实验材料(图1)。每份样品进行3次生物学重复混合取样。将所取样品迅速放入液氮中速冻并放置于-80℃冰箱保存备用。

实施例1：植物总RNA的提取及cDNA的合成

按照RNA提取试剂盒(TaKaRa，大连)的说明书对所有试验样品进行总RNA的提取，通过DNA酶处理，去除基因组DNA的污染。采用超微量核酸蛋白测定仪对总RNA的浓度和质量进行测定，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

每个试验样品RNA的OD260/OD280、OD260/OD230均符合要求，琼脂糖凝胶电泳图检测显示28S及18S条带清晰，无降解现象，满足要求。

采用反转录试剂盒6210A型(TaKaRa，大连)进行反转录合成cDNA。用于cDNA第一链合成需要约1μg的总RNA，1μL oligo dT引物(浓度：50μmol·L^-1)，1μL dNTP，0.5μL RNase抑制剂(40U·μL^-1)，1μL PrimeScript II反转录酶(200U·μL^-1)，加去离子水补齐至20μL。反应程序为：65℃，5min；42℃，60min；95℃5min；4℃2min终止反应。

每个样品进行3次生物学重复。由此制备得到天目地黄各个样品组织的cDNA。

实施例2：候选内参基因的选择与引物设计

根据天目地黄花和叶的转录组测序数据，筛选了6个不同的候选内参基因，分别为RcTIP41、RcUBQ、RcActin、Rc18S、RcGAPDH和RcEF-1α，在所有供试样品(不同发育时期的花：小蕾期(C1)、现蕾期(C2)、大蕾期(C3)、初花期(C4)、盛花期(C5)以及叶(L))中，这6个基因FPKM值均相对稳定(表1)。其中FPKM即每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片，该值可以反映基因的表达水平，FPKM值越大即基因的表达水平越高。利用NCBI在线分析软件ORFFinder对每个基因的cDNA序列进行开放阅读框预测。然后根据基因的序列在NCBI-PrimerBLAST在线软件上设计定量特异性引物，引物PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表1天目地黄转录组数据中6个候选参考基因的FPKM值

表2天目地黄6个候选内参基因引物序列及扩增产物特征

实施例3：候选内参基因稳定性分析

以稀释10倍的cDNA为模板，根据宝生物的

Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus)(TaKaRa，大连)试剂盒说明书配制qRT-PCR反应体系，每个反应进行3次重复，并在BIO-RAD IQ5定量仪(伯乐，上海)的96孔板上进行实时荧光定量PCR。

反应体系为：12.5μL的

Premix Ex酶，1μL正向引物(10μmol·L-1)，1μL反向引物(10μmol·L-1)，1.0μL cDNA模板，加去离子水9.5μL，总体积共25μL。

qRT-PCR反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

候选内参基因的表达水平可以初步通过qRT-PCR得到的原始Cq值进行评估，基因的Cq值越大，则基因的表达量越低，反之，则越高。而候选内参基因的稳定性则通过GeNorm、NormFinde和Bestkeeper 3种软件进行分析。

结果：实施例2中提供的6对引物在实时荧光实时定量中熔解曲线均为明显的单一峰(图3)，且电泳检测也只有单一条带图(图2)，说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。Cq值与基因的表达量呈反比，6个候选内参基因Cq平均值在19.54～27.15之间，其中RcGAPDH基因表达量较高，RcUBQ基因的表达量较低(图4)。

数据分析：

GeNorm软件分析：GeNorm软件是根据平均变异度M值来衡量基因的稳定性，程序默认M阈值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参基因，且M值越低表示基因越稳定。此外GeNorm软件还能够根据候选内参基因的配对差异值Vn/Vn+1来确定合适的内参基因个数，当Vn/Vn+1＜1.5时，采用n个内参基因个数。根据软件计算结果6个候选内参基因在天目地黄中的表达稳定性依次为：RcTIP41/RcActin>Rc18S>RcEF-1α>RcUBQ>RcGAPDH(图5)，Vn/Vn+1分析结果显示，当n＝2时，V2/3为0.097小于0.15(图6)。由此初步确定天目地黄最适内参基因数目为2个。

NormFinder软件分析：NormFinder同样是计算候选内参基因的表达稳定性，同时考虑了组内和组间的变异。表3列出了NormFinder计算的6个候选内参基因在天目地黄中表达稳定性值(M)。由NormFinder列出的候选内参基因稳定性排列顺序，可以确定在天目地黄中表达较稳定的前3个基因分别是RcTIP41、RcEF-1α、Rc18S，最不稳定的基因是RcGAPDH。

表3 NormFinder软件分析结果

Bestkeeper软件分析：BestKeeper软件是基于内参基因Cq值的标准差(SD)和调节系数标准差SD来评判基因的表达稳定性，直接对基因表达Cq值进行分析。该算法得到的CV和SD值越小，内参基因表达越稳定，其中程序默认SD临界值为1，当SD值大于1时，认为该基因表达不稳定。r是选择内参基因组合的重要指标。r越大表明该基因与其他基因的相关性越好，越适宜与其他基因共同作为内参基因组合。Bestkeeper分析结果显示在天目地黄中表达相对较稳定的基因是Rc18S、RcTIP41和RcActin，表达最不稳定的基因是RcGAPDH(表4)。

表4 Bestkeeper软件分析结果

6个候选内参基因表达稳定性的统计分析：

根据3种不同算法对6个候选内参基因的稳定性进行赋值分析，按基因的稳定性由高至低，分别赋值1-6，以综合评定候选内参基因的稳定性(表5)。由统计分析结果显示6个候选内参基因的稳定性由高至低分别为：RcTIP41>Rc18S>RcActin>RcEF-1α>RcUBQ>RcGAPDH。由于GeNorm分析确定最适内参基因数目为2，因此确定天目地黄qRT-PCR的内参基因为Rc18S和RcTIP41。

表5 6个候选内参基因表达稳定性的统计分析

试验例1：RcTIP41基因和Rc18基因作为内参基因的应用及稳定性验证

为了进一步验证天目地黄中内参基因的稳定性和可靠性，基于转录组数据筛选了Rc4CL、RcC4H、RcERF和RcPAL 4个基因，分别以稳定表达的RcTIP41、Rc18S、RcTIP41+Rc18S及表达相对不稳定的RcGAPDH作为内参基因，对Rc4CL、RcC4H、RcERF和RcPAL 4个基因进行实时荧光定量PCR分析(具体的反应体系和方法与“实施例3：候选内参基因稳定性分析”中qRT-PCR的方法一致)，并将基因表达量的变化趋势比对RNA-Seq结果得到的对应基因FPKM值的变化趋势(图7)，并进行相关性分析。

4个用于验证的基因分别为Rc4CL(SEQ ID NO.7)、RcERF(SEQ ID NO.10)、RcC4H(SEQ ID NO.13)和RcPAL(SEQ ID NO.16)基因其特异性引物分别为：Rc4CL(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)、RcERF(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)、RcC4H(SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.15)、RcPAL(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)；RcGAPDH(SEQ ID NO.19)基因的特异性引物为RcGAPDH(SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21)。

用所筛选出的内参基因RcTIP41、Rc18S和RcTIP41+Rc18S组合分别作为内参时，4个验证基因与转录组的PFKM值有着相似的变化趋势，但用RcGAPDH基因来做内参时，4个验证基因表达情况与转录组数据不一致，说明所筛选的内参基因RcTIP41和Rc18S是准确可靠的(图7)。

表6天目地黄中4个验证基因的相对表达量与FPKM值的相关性分析

相关性分析结果显示(表6)，无论是RcTIP41、Rc18S单独作为内参基因还是RcTIP41+Rc18S组合作为内参基因，Rc4CL、RcERF、RcC4H和RcPAL 4个验证基因的相对表达量与FPKM值显著相关(其中“*”表示P<0.05，达显著水平，“**”表示P<0.01，达极显著水平)。由此可见，RcTIP41或Rc18S单独作为内参基因时也具有较高稳定性，能够作为天目地黄qRT-PCR的内参基因。优选的，根据GeNorm的配对变异V值分析结果，为了更准确的归一化qRT-PCR的结果，我们采用RcTIP41+Rc18S组合作为天目地黄qRT-PCR的内参基因。

<110> 河南农业大学

焦作市玖道种苗繁育有限公司

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atgctgggcg gtgcctactg a 1161

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcERF-F

<400> 11

cggggaacta tcactcgaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcERF-R

<400> 12

cgatctcgtc ttcatcgtcg 20

<210> 13

<211> 1521

<212> DNA

<213> 天目地黄(Rehmannia chingii Li.)

<221> RcC4H

<400> 13

atggatcttc tcctcctcga gaagactctt ctcggactct tcttcgccat agtcatcgcc 60

actctagtat ccaagctacg cggcaagaaa ttcaagcttc ctccaggccc aatccccgtt 120

ccaatattcg gaaattggct ccaagtcggc gatgacctaa accaccgcaa tctcaccgat 180

tacgccaaaa aattcggcga tattttgctc ctccgtatgg ggcagcgcaa tttggtcgtc 240

gtctcatccc ccgacctcgc caaggatgtt ctccacacgc agggagtcga attcgggtcg 300

cggacccgaa acgtggtgtt cgatattttc accggaaagg ggcaggatat ggtgttcacg 360

gtgtacggtg agcactggcg caagatgcgg cggatcatga cggtgccgtt tttcaccaac 420

aaggttgtgc agaggaaccg ccacggatgg gaggcggagg ccgccgccgt ggtggaggac 480

gtgaagaata atccagaggc ggcgacgaat ggaattgtgc tgaggaggag gttgcagttg 540

atgatgtaca ataacatgta ccggattatg ttcgacagaa ggtttgagag tgaggatgat 600

cctttgtttt tgaagttgaa ggcgttgaat ggagagagaa gtcgattggc tcagagcttt 660

gagtataatt atggtgattt tattccaatt ttgaggcctt ttttgagagg gtatctcaag 720

atctgcaagg aggtcaagga gaagaggtta cagctgttca aggactattt tgttgatgag 780

agaaagaagt tgtcaagcac aaaggcaacg gcggaccacg atggcctaaa atgtgcgatt 840

gatcacattc ttgaagccca acagaaggga gagatcaatg aggataatgt tctttacatt 900

gttgagaaca tcaatgttgc tgcaatcgaa actactcttt ggtcaatcga gtggggcatc 960

gcggaattag ttaaccaccc ggagatccaa aagaagctta gagacgagat ggacaccatc 1020

ctcggcccgg gagtacaaat aacagagccc gatacctaca aactcccata ccttcaggca 1080

gtgatcaaag aaactcttcg tcttagaatg gccatccctc ttttggttcc ccacatgaac 1140

ctccacgact ccaagctcgg cggctatgac attcctgccg agagcaagat cttggtcaac 1200

gcttggtggc tcgctaacaa ccctgcgaac tggaaaaagc ccgaagagtt caggcccgaa 1260

agattcttgg aagaggagtc gaaggttgag gccaatggaa acgacttccg ttatcttccg 1320

tttggcgttg gccggaggag ctgccccggg attattcttg ctttgccgat tcttggtatc 1380

actttgggac ggcttgtgca gaatttcgag ctgttgcctc ctcctgggca gtcgaagatt 1440

gacacgactg agaaaggcgg gcagtttagt ctccacattt tgaagcactc caccattgtt 1500

ttaaagccaa ggtctttttg a 1521

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcC4H-F

<400> 14

caccgcaatc tcaccgatta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcC4H-R

<400> 15

tatcgaacac cacgtttcgg 20

<210> 16

<211> 2139

<212> DNA

<213> 天目地黄(Rehmannia chingii Li.)

<221> RcPAL

<400> 16

atggagaatg ggcaccacca ctcgaatggg ttgtgcgtgg agaccacgac taaaggcggc 60

ggagatccgt tgaactgggc ggcggcggcg gagtcgctga aggggagcca cctggacgag 120

gtgaagagga tggtggagga gttcaggaag ccggcggtga agctcggcgg ggagagtctg 180

acgatatcgc aggtggcggc gatcgccgcc agggataatg cggtggcggt ggagctggcg 240

gaggcggcga gggccggggt taaggcgagt agcgattggg ttatggagag tatgaataaa 300

gggactgaca gttatggagt tacaacgggt tttggtgcca cgtcacatag gaggactaag 360

cagggtggtg ctcttcagaa ggagctcatt aggttcttga acgccggaat attcggcaac 420

ggcacagaat ccaatcacgc gctgccacac tccgccacaa gagccgccat gctcgtccgt 480

atcaacacgc tcctccaagg atattccggc atccgattcg aaatcctaga agccttaaca 540

aaattcctca accacaacat caccccctgt ttgcccctcc gcggcacgat caccgcctcc 600

ggcgacctcg tcccgctatc ctacatcgcc gggctattaa cgggccggcc caactccaag 660

gccgtcggcc caaacggcga agccctcacc gccggcgagg ctttcagcct cgccggcgtt 720

agcgacttct tcgagctgca gcccaaagaa ggcctcgcgc tggtcaacgg gacagctgtc 780

gggtccggat tggcctcgat cgccctgtac gacgcgaaca tcctcgccgt cctgtcggaa 840

gtgacgtcag cgattttcgc cgaggtcatg aatgggaaac cagaatttac ggatcatttg 900

acgcataagc tgaaacatca ccctggtcag attgaggccg ctgctataat ggaacacatt 960

ctagatggca gcgcgtacgt taaggccgct cagaaattgc acgaaaccga tccgttgcaa 1020

aaaccgaaac aggaccggta cgcgcttaga acgtcgcctc aatggctcgg cccccaaatc 1080

gaagttatcc gaaccgcgac gaaaatgatc gagcgggaaa ttaattcggt taacgacaac 1140

cctctaatcg atgtttctag aaataaagcg ttacacggcg gtaacttcca gggcacgcca 1200

atcggggtgt cgatggacaa cacccgattg gcgatagcag ctatcggaaa attgatgttc 1260

gctcaatttt ccgagctggt taacgatttc tacaacaatg gattgccgtc taatctttcc 1320

ggcggtagga atccgagctt ggattacgga ttcaaaggat ccgaaatcgc gatggcgtcg 1380

tattgttcgg agcttcaatt tttagctaat cctgttacca atcatgtcca gagtgcagag 1440

cagcataacc aagatgtgaa ttcacttgga ttgatttctt ctagaaagac cgtcgaggct 1500

ctggatattc taaagctgat gtcatccaca tatttgatcg ctctctgcca ggccgtcgat 1560

ttgaggcacc tggaggagaa tttgaggctt tcggttaaaa ataccgttag ccaagtggcg 1620

aagaggaccc tgacgatggg cgttaacggc gagctccatc cgtcgagatt ctgcgagaag 1680

gatcttctcc gtgtggtgga ccgcgagtac gtgtttgcgt acatcgacga tccgtgcagc 1740

gggacctacc ccttgatgca gaagttgagg caagttctcg tggaccacgc gttgaacaac 1800

ggtgagagtg agaaaaacgt gagcacgtct atttttcaga agatcgaggc gtttgaggcc 1860

gaactgaagg cgatcttgcc taaagaggtc gagagcgcac ggatcgcgct ggagagtgga 1920

aatcccgcga ttggtaacag gatcacggaa tgcagatcgt atccgttgta caagtttatc 1980

agagaggaac ttgggacgaa cttcttgacg ggcgaaaagg ttgtttctcc aggggaggag 2040

tgtgataagg tttttacagc tttgagtaag ggtttgattg ttgatccatt gttgaagtgt 2100

cttgagggct ggaatggtgc acctctgcct atctgctag 2139

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcPAL-F

<400> 17

agttgaggca agttctcgtg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcPAL-R

<400> 18

caaacgcctc gatcttctga 20

<210> 19

<211> 1014

<212> DNA

<213> 天目地黄(Rehmannia chingii Li.)

<221> RcGAPDH

<400> 19

atgggaaaga tcaagattgg aattaatgga tttggaagga tcggtcgttt ggttgcaagg 60

gttgccctac agagggatga tgtagagctt gttgctgtta atgatccatt cataagcact 120

gattacatga catacatgtt caagtatgac agtgtgcatg gccactggaa gcataatgag 180

gtgaaggtga aggatgaaaa gacccttctt tttggtgata aaccagtcag agtatttggg 240

tgcaggaacc ctgaggagat tccatgggcc gaagctggtg ctgagtttgt tgtggagtca 300

actggggttt tcacagacaa ggataaggct gctgctcatt tgaagggtgg cgccaagaag 360

gttgtgatct ctgctccaag caaagatgct cccatgtttg ttgtgggagt caatgagaag 420

gaatacaagc ctgagttgaa catcgtctcc aatgctagtt gcaccaccaa ctgccttgcc 480

ccattggcca aggtcattca tgataggttt ggcattgtgg aaggcctcat gaccactgtc 540

cactctatta ctgccactca gaagaccgtc gatggaccat cgagcaagga ctggagaggt 600

ggaagagccg cctcattcaa tatcattccg agcagtactg gagctgccaa ggctgttggt 660

aaagtgcttc ccgccctcaa cggtaagtta actgggatgt ctttccgagt tcccactgtt 720

gatgtttctg tagtggacct caccgttagg ctagagaaag aggcaaccta cgaagacatc 780

aaagctgcca tcaaggaaga atcggagaac aagctcaagg gcatcttagg ttacactgaa 840

gacgatgtgg tgtccaccga ctttgtcggt gatagcagat cgagtatttt tgatgccaag 900

gctgggattg cattgaacaa gaacttcgtg aaactcgtct cgtggtacga caacgaatgg 960

ggttacagtt ctcgagtgat cgacttgatt gtccacatgg cttctgttgc atga 1014

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcGAPDH-F

<400> 20

ccgagttccc actgttgatg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RcGAPDH-R

<400> 21

atgcccttga gcttgttctc 20

Claims (5)

1.适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为RcTIP41基因和/或Rc18S基因，所述RcTIP41基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述Rc18S基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.RcTIP41基因和/或Rc18S基因作为内参基因在qRT-PCR检测天目地黄基因转录表达水平中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物对RcTIP41基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物对Rc18S基因进行特异性扩增。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述qRT-PCR的反应体系为25μl，包含

Premix Ex Tap II 12.5μl，正向引物和反向引物分别1μl，cDNA 1μl，ddH₂O补足25μl，其中cDNA由RNA反转录得到。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述qRT-PCR的反应程序为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

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