CN114058732A - 一种高效鉴定粒重基因gw5不同等位的引物组合及鉴定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合及鉴定方法和应用，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组包括序列号为SEQ ID NO.1的GW5_YN_F、序列号为SEQ ID NO.2的GW5_YN_R1、序列号为SEQ ID NO.3的GW5_YN_R2；所述第二引物组包括序列号为SEQ ID NO.4的GW5_YZ_F、序列号为SEQ ID NO.5的GW5_YZ_R1、序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2。本发明构建的引物组合鉴定类型能够实现同时鉴定粒重基因GW5的三种等位，是一种全新的标记组合类型，相比之前的鉴定标记，该标记组合的鉴定效率成倍增加，在节约成本、提高效率方面有巨大优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物鉴定技术领域，尤其涉及一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合及鉴定方法和应用。
背景技术
水稻产量主要由穗数、每穗粒数及千粒重决定，增加上述任何一种性状都可有效提高产量。相比穗数和每穗粒数，粒重性状的表现不易受环境影响，因此在不影响其它两个产量要素的前提下改良粒重性状可以稳定提升产量。目前水稻中已经克隆了多个与粒重有关的QTL位点，其中GW5位点在已有的连锁分析和关联分析中都被证实是与粒重和粒型相关性最高的位点，对该位点进行育种应用可实现品种粒重的快速提升。研究显示水稻中GW5位点存在三种自然变异等位，一种为1212bp缺失变异类型，一种为950bp的缺失变异类型，这两种变异类型都会导致粒宽和粒重增加表型，而没有任何缺失的野生型为窄粒类型。针对GW5不同变异类型设计特异分子标记将有效实现对粒重和粒型性状的追踪，加快水稻粒重改良育种进程。当前已有一些研究针对GW5位点开发了分子标记，但这些标记仅能区分特定两种等位变异类型，有的甚至需要多轮PCR扩增才能区分不同等位，且PCR片段长度较长，增加了基因型鉴定的时间成本和试剂成本。针对该位点亟需开发一种能够同时鉴定三种等位的高效分子标记类型。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合及鉴定方法和应用，目的是实现同时鉴定粒重基因GW5的三种等位。
基于上述目的，本发明提供了一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组包括序列号为SEQ ID NO.1的GW5_YN_F、序列号为SEQ ID NO.2的GW5_YN_R1、序列号为SEQ ID NO.3的GW5_YN_R2；所述第二引物组包括序列号为SEQ ID NO.4的GW5_YZ_F、序列号为SEQ ID NO.5的GW5_YZ_R1、序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2。
优选的，所述引物组合还包括第三引物组，第三引物组包括序列号为SEQ ID NO.4的GW5_YZ_F、序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2、序列号为SEQ ID NO.7的GW5_YZ_R3。
本发明还提供一种采用所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合的鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一、将第一引物组中的GW5_YN_F引物及GW5_YN_R2引物与第二引物组组合形成五引物组合；
步骤二、将提取的DNA采用所述五引物组合进行PCR扩增，若扩增出476bp+124bp条带，则为野生型；若扩增出411bp+124bp条带，则为1212bp缺失变异类型；若扩出573bp条带和一条微弱的124bp条带，则为950bp缺失变异类型。
优选的，所述步骤一中采用GW5_YZ_R3引物替换第二引物组中的GW5_YZ_R1；所述步骤二中，若仅扩增出292bp条带，则为野生型；若同时扩增出292和411bp的条带，则为1212bp缺失变异类型；若特异扩增出573bp条带，则为950bp缺失变异类型。
所述PCR扩增是以20μl的PCR扩增体系为基准，每条引物各0.5μl，模板的用量均为2μl。
所述PCR扩增的过程中退火温度为55-60℃，退火时间为30s。
优选的，所述PCR扩增的过程中退火温度为55℃。
本发明还提供所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合在水稻品种鉴定试剂盒中的应用。
本发明还提供所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合在水稻杂交育种鉴定中的应用。
本发明的有益效果：本发明构建的引物组合鉴定类型能够实现同时鉴定粒重基因GW5的三种等位，是一种全新的标记组合类型，相比之前的鉴定标记，该标记组合的鉴定效率成倍增加，在节约成本、提高效率方面有巨大优势。本发明的引物组合及鉴定方法有市场推广潜力，将产生良好的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为GW5不同等位变异的序列缺失及不同引物位置示意图；
图2为本发明GW5_YN和GW5_YZ三引物PCR扩增鉴定三种变异的最佳退火温度探索示意图；其中，M代表Marker；Y代表YYP1变异型；N代表NIP变异型；Z代表ZS97变异型；
图3为本发明GW5_YN和GW5_YZ三引物鉴定自然品种的凝胶电泳图；其中，1-24代表24个不同品种；Y代表YYP1变异型；Z代表ZS97变异型；N代表NIP变异型；
图4为本发明GW5_YN三引物鉴定分离群体的凝胶电泳图；其中，1-24代表24个不同单株；Y代表YYP1变异型；N代表NIP变异型；H代表杂合型；
图5为本发明两种五引物鉴定三种变异的最佳退火温度探索示意图；其中，M代表Marker；Y代表YYP1变异型；N代表NIP变异型；Z代表ZS97变异型；
图6为本发明两种五引物鉴定不同品种的凝胶电泳图；其中，1-9代表九个不同品种；Y代表YYP1变异型；N代表NIP变异型；Z代表ZS97变异型。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。
针对GW5位点，设计了一对InDel引物GW5_InDel，该引物扩增野生型(代表品种为YYP1)片段长度为1631bp，扩增1212bp缺失型(代表品种为日本晴(NIP))变异长度为419bp，引物延伸时间需要1.5分钟，完整一轮基因型鉴定需要时间约为1小时50分钟，且该引物无法实现对950bp缺失变异类型(代表品种为珍汕97(ZS97))的准确鉴定。为了解决上述问题，首先对三个品种的缺失及其侧翼序列进行了明确，发现NIP和ZS97的缺失有部分重叠(如图1所示)，重叠范围为444bp，NIP缺失片段中768bp对应的ZS97片段是没有缺失的，而ZS97缺失片段中有506bp在NIP中保留。
基于上述这种特点，首先分别设计了区分YYP1和NIP及区分YYP1和ZS97的三引物组合，方法为一对引物位于缺失片段的两侧，用于识别缺失变异类型，再在缺失序列中设计一条反向引物与上述一对引物的正向引物匹配，用于识别野生型，在设计三引物的两对扩增组合时确保扩增大小小于500bp，以实现减少扩增时间，降低时间成本的需求。最终获得区分YYP1和NIP的三引物：序列号为SEQ ID NO.1的GW5_YN_F，序列号为SEQ ID NO.2的GW5_YN_R1，序列号为SEQ ID NO.3的GW5_YN_R2和区分YYP1和ZS97的三引物：序列号为SEQ IDNO.4的GW5_YZ_F，序列号为SEQ ID NO.5的GW5_YZ_R1，序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2，六条引物序列如下：
GW5_YN_F：GCAGCGTCGTCAGAGGTAG
GW5_YN_R1：TGGGAAACATCATGGTCGT
GW5_YN_R2：GAACGGCAGAATGAGGAGC
GW5_YZ_F：CGCCGTTCTGCCTGTTATT
GW5_YZ_R1：GGATAGATGGATGGGATTTGG
GW5_YZ_R2：ATGCCATTCGCTCCATCAA
其中，GW5_YN三引物组合中F和R1能够扩增出275bp(识别YYP1类型)的条带，F和R2能够扩增出411bp(识别NIP类型)或1623bp(也识别YYP1类型)的条带，但由于PCR反应时会降低引物延伸时间，1623bp条带在实际应用时不会被扩出，因此利用275bp和411bp的条带差异可区分YYP1对应的野生型和NIP对应的1212bp缺失型；同理，GW5_YZ三引物组合中F和R1能够扩增出476bp(识别YYP1类型)的条带，F和R2能够扩增出573bp(识别ZS97类型)的条带或1523bp(识别YYP1类型)条带，可在降低延伸时间的PCR反应条件下用476bp和573bp的条带差异区分YYP1对应的野生型和ZS97对应的950bp缺失型。
为此，首先进行了两种三引物组合的最佳扩增退火温度探索。
从田间获取YYP1、NIP和ZS97三个品种的叶片组织，采用TPS少量抽提法提取DNA，方法如下：1、将叶片用球磨仪震荡破碎，加入500ul TPS缓冲液，65℃放置45分钟；2、12000转速离心10分钟，吸300ul上清液到新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置45分钟；3、12000转速离心10分钟，获得DNA沉淀，倒掉上清液，加入500ul 75％乙醇；4、7500转速离心5分钟，倒掉上清液并吸干残液，室温放置30分钟后加入100ul双蒸水获得DNA溶液。获得的DNA用于不同引物组合的PCR扩增，反应体系为20ul，包含DNA模板2ul、PCR buffer(北京鼎国生物)2ul、浓度为10uM的每条引物各0.5ul、Taq聚合酶(北京鼎国生物)0.3ul，最终用水补齐至20ul。PCR反应条件为：94℃变性3分钟，随后进行35个循环的“94℃变性20秒-梯度温度退火30秒-72℃延伸20秒”，最后72℃延伸5分钟完成反应，整个扩增反应在一个小时左右完成。每种引物组合都设置8个退火温度梯度，分别为48、49、50.7、53.4、56.5、59.1、60.9、62℃，PCR完成后吸取10ul扩增产物进行3％浓度的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后用紫外凝胶成像系统拍照。如图2所示，结果显示：GW5_YN三引物在八个温度下都能从YYP1和NIP模板中扩增出条带，由于该三引物中有两个引物位于ZS97的950bp缺失片段中(如图1所示)，故无法扩增出条带；该三引物在较低温度(48-49℃)下，容易在NIP模板中扩增出杂带，综合比较不同温度条带亮度，筛选出55-60℃的范围是GW5_YN三引物的较优退火温度，其中YYP1条带和NIP条带分别为275bp和411bp，在电泳图上差异明显，可有效区分两种GW5等位变异；GW5_YZ三引物也在所有温度下可将YYP1和NIP模板扩增出条带，在低于50.7℃温度下几乎无法扩增出ZS97条带，而在55-60℃的范围内可较好地扩增出ZS97条带，其中ZS97条带大小为573bp，YYP1和NIP条带大小为476bp，差异也较为明显，证明该三引物组合可以有效识别ZS97的GW5缺失变异。至此，利用两组三引物成功实现了对三种GW5变异的有效区分，且应用效果比已有的双引物标记用时更短，证明三引物的鉴定策略更优。
进一步的，为了验证鉴定效果，利用88份来自世界各地的水稻品种进行测试两组三引物的高通量鉴定效果，水稻品种DNA提取及PCR反应体系同上，引物退火温度设置为55度。凝胶电泳显示两组三引物扩增在品种间都呈现出多态性(如图3所示)，GW5_YN三引物扩增结果中存在275bp和411bp条带，分别对应YYP1和NIP变异型，以及没有扩增出条带的类型，推测为ZS97变异型；GW5_YZ三引物扩增结果中存在476bp和573bp条带，573bp条带对应ZS97类型，与GW5_YN三引物未扩增出任何条带的结果完全一致，证明GW5_YN三引物在一定程度上也可以用于鉴别ZS97变异类型。最终从88份品种中鉴定出了52份品种为YYP1型GW5变异(野生型等位)，12份品种为NIP型变异(1212bp缺失)，24份品种为ZS97型变异(950bp缺失)。对这88份品种进行了粒型及粒重表型调查，粒型调查方法为利用浙江万深SC-G型自动考种分析系统拍照获取图片，软件分析获得粒长、粒宽及长宽比数据，粒重则利用电子天平对100粒水稻种子称重，获得百粒重数据。结果显示，包含YYP1型变异品种的粒重和粒宽平均值低于包含NIP和ZS97型变异的品种，而长宽比和粒长则高于包含NIP和ZS97型变异的品种(如下表1)，这与GW5野生型和突变体对比的预期效应一致，证明通过鉴定三种变异型可以有效筛选粒型和粒重性状。
表1.三引物区分大量品种粒重及粒型的效果比较。
鉴于育种过程需要对杂交后代进行筛选，采用如下方法测试了上述第一引物组中的三引物对分离群体的鉴定效果。具体方法为：种植一个GW5分离的F2群体，其亲本基因型分别为YYP1型和NIP型，对该群体的144个单株进行了DNA提取和GW5_YN三引物PCR鉴定，方法同上。鉴定结果发现分离单株中存在三种基因型，即275bp的YYP1型条带和411bp的NIP型条带以及两种条带都存在的杂合型条带(如图4所示)，证明三引物也可以有效区分杂合单株，这在杂交种鉴定中有重要应用价值。最终，我们从144个单株中鉴定出了143个单株(有一个单株未扩增出条带)的基因型，包括40个YYP1型单株，35个NIP型单株，68个杂合型单株，符合分离位点1:2:1的比例，也再次说明本发明的三引物系统具有高通量的鉴定优势。
进一步的，对其中结实较好的36个YYP1型单株、31个NIP型单株和55个杂合型单株进行了百粒重表型测量，结果显示YYP1型单株百粒重平均值为2.06g，NIP型单株百粒重平均值为2.26g，杂合型单株百粒重平均值为2.17g，NIP型单株较YYP1型单株粒重增加约10％，证明利用三引物对NIP型变异进行追踪可高效筛选粒重增加的个体，可减少表型观察和测量的工作量。
上述两组三引物可有效实现水稻品种中三种主要GW5变异类型的高通量鉴定，但仍需进行两轮PCR，随后又对两组三引物的组合应用效果进行了探索，期望实现用一轮PCR同时鉴定三种变异类型。根据图1示意可知，GW5_YN三引物中的F和R2引物是特异识别NIP变异型的，其扩增大小为411bp，而GW5_YZ三引物中的F和R2特异识别ZS97变异型，扩增大小为573bp，GW5_YZ的F和R1引物则同时识别YYP1和NIP变异型，扩增大小为476bp。此外，GW5_YN的F引物和GW5_YZ的R1引物组合还能在YYP1型和NIP型中扩出一条124bp的条带。那么将GW5_YN的F和R2引物与GW5_YZ三引物的F、R1和R2组合扩增三种类型的结果是：YYP1型476bp+124bp条带，NIP型411bp、476bp和124bp条带同时存在，ZS97型573bp条带。下面对上述五引物组合的实际扩增效果进行探索，设置8个引物退火温度梯度，分别为50、51、52.9、55.7、59、62、63.8、65℃。PCR反应体系仍然为20ul，包含DNA模板2ul、PCR buffer(北京鼎国生物)2ul、每条引物各0.5ul、Taq聚合酶(北京鼎国生物)0.3ul，最终用水补齐至20ul。结果显示(如图5所示，箭头指示第一个五引物的差异性条带)，五引物只有在55℃左右温度范围内表现出较好的区分效果，其中YYP1可以扩增出476bp+124bp条带，而NIP则只扩增411bp+124bp条带，ZS97则扩增出573bp条带和一条微弱的124bp条带，通过片段大小差异能够实现三种GW5变异类型的有效区分，初步证明五引物的设计具有可行性。
进一步的，为了便于对五引物组合进行优化，将GW5_YZ_R1引物替换成GW5_YZ_R3引物，引物序列为CATGGAGTAGTAGCAATTACCG(序列号为SEQ ID NO.7)，其与GW5_YZ_F引物将扩增出292bp条带，且R3引物位于GW5_YN_F引物左侧，将无法扩增出之前非特异的124bp的条带，从而提高引物利用效率。温度梯度结果显示在大于55度的退火温度下，新的五引物组合表现出优秀的扩增效果和区分度，其中YYP1仅能扩增出292bp条带，而NIP则同时扩增出292和411bp的条带，ZS97特异扩增出573bp条带，最终实现三个GW5变异的高精度区分。
进一步的，为了便于测试上述两组五引物用于品种鉴定的效果，随机挑选覆盖GW5不同变异型的九个品种进行测试，PCR反应条件同上，退火温度为55度。并采用了PCR mix反应体系进行PCR扩增，以便进一步简化操作步骤。20ul反应体系如下：包含DNA模板2ul、2×Taq Master Mix(南京诺唯赞)10ul、每条引物各0.5ul，最终用水补齐至20ul。
如图6所示，结果显示，采用PCR mix的扩增效果比用单酶体系的分析效果更好，条带更亮且容易区分。其中，第一组五引物扩增NIP类型凝胶电泳图显示三条带，对应476bp+411bp+124bp条带组合，其中476bp条带亮度较弱，扩增YYP1类型凝胶电泳图显示两条带，对应476bp+124bp条带组合，扩增ZS97类型凝胶电泳图显示两条带，对应573bp+124bp条带组合；第二组五引物扩增NIP类型凝胶电泳图显示两条带，对应292bp+411bp条带组合，扩增YYP1类型凝胶电泳图仅显示一条292bp的条带，扩增ZS97类型凝胶电泳图仅显示一条573bp的条带，与温度梯度分析时获得的条带类型一致。至此，成功实现了GW5五引物应用的优化和简化，可在低成本投入条件下实现大量水稻品种及群体的高通量鉴定。本发明中的引物可以与PCR相关试剂进行组合构成一个高通量鉴定试剂盒，用于商业推广。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合及鉴定方法和应用
<130> 1
<141> 2021-12-07
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcgtcgt cagaggtag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggaaacat catggtcgt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacggcaga atgaggagc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgccgttctg cctgttatt 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatagatgg atgggatttg g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgccattcg ctccatcaa 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catggagtag tagcaattac cg 22
Claims (9)
1.一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组包括序列号为SEQ ID NO.1的GW5_YN_F、序列号为SEQ ID NO.2的GW5_YN_R1、序列号为SEQ ID NO.3的GW5_YN_R2；所述第二引物组包括序列号为SEQ ID NO.4的GW5_YZ_F、序列号为SEQ ID NO.5的GW5_YZ_R1、序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2。
2.根据权利要求1所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括第三引物组，第三引物组包括序列号为SEQ ID NO.4的GW5_YZ_F、序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2、序列号为SEQ ID NO.7的GW5_YZ_R3。
3.一种采用权利要求1或2所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将第一引物组中的GW5_YN_F引物及GW5_YN_R2引物与第二引物组组合形成五引物组合；
步骤二、将提取的DNA采用所述五引物组合进行PCR扩增，若扩增出476bp+124bp条带，则为野生型；若扩增出411bp+124bp条带，则为1212bp缺失变异类型；若扩出573bp条带和一条微弱的124bp条带，则为950bp缺失变异类型。
4.根据权利要求3所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中采用GW5_YZ_R3引物替换第二引物组中的GW5_YZ_R1；所述步骤二中，若仅扩增出292bp条带，则为野生型；若同时扩增出292和411bp的条带，则为1212bp缺失变异类型；若特异扩增出573bp条带，则为950bp缺失变异类型。
5.根据权利要求3或4所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增是以20μl的PCR扩增体系为基准，每条引物各0.5μl，模板的用量均为2μl。
6.根据权利要求3或4所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的过程中退火温度为55-60℃，退火时间为30s。
7.根据权利要求6所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的过程中退火温度为55℃。
8.权利要求1或2所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合在水稻品种鉴定试剂盒中的应用。
9.权利要求1或2所述高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合在水稻杂交育种鉴定中的应用。
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