CN112501342A - 一种大麦休眠基因mkk3的kasp功能分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴定大麦穗发芽相关的休眠基因MKK3等位变异的KASP分子标记及其应用。具体技术方案为：一种引物组合物KASP‑N260T，包括两条正向引物(AL1,AL2)，其序列分别如SEQIDNO.3、4所示；一条反向引物C，其序列如SEQIDNO.5所示。本发明提供了一种KASP功能分子标记，能对大麦MKK3等位基因进行准确分型，预测大麦种子的休眠性。利用本发明所提供的技术，可在实验室条件下大规模快速鉴定大麦群体中的MKK3休眠等位基因，进一步用于分子标记辅助选择育种，可显著提高大麦抗穗发芽新品种培育的效率和准确性。

Description

一种大麦休眠基因MKK3的KASP功能分子标记及应用

技术领域

本发明属于大麦基因检测及作物遗传育种技术领域，具体涉及一种大麦休眠基因MKK3的KASP功能分子标记及其应用。

背景技术

穗发芽(Pre-harvest Sprouting，PHS)是指谷物在收获前遇到连绵阴雨，未及收获便在穗上发芽的一种现象。

穗发芽不仅会造成大面积粮食减产，而且会严重劣化谷物加工食品品质，并直接影响籽粒种用价值。穗发芽导致大麦产量和品质严重下降，尤其啤用大麦穗发芽的籽粒麦芽完全不可用。选育和推广抗性品种是防治大麦穗发芽的最有效途径。

穗发芽是受多个遗传因子控制和环境影响的复杂数量性状。其中，种子休眠性强弱与穗发芽性状密切相关，弱休眠品种易穗发芽，而强休眠品种表现较高的穗发芽抗性。已报道大麦中存在两个与种子休眠相关的主效QTL位点SD1和SD2，其中SD2主效QTL位点(Qsd2-AK)能解释品种间23％-37％的种子休眠和穗发芽抗性表型变异。大麦的丝裂原活化蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase kinase 3,MKK3)作为Qsd2-AK位点的候选基因，是控制大麦品种休眠性和穗发芽抗性的关键基因。MKK3的第7个外显子存在两个功能性的单核苷酸多态性(SNP)变异：A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹，该位置的单碱基突变使得MKK3蛋白的第260个天冬酰胺(N)变为苏氨酸(T)，从而使MKK3蛋白激酶的活性降低，直接影响种子的休眠特性。通常携有A³⁰⁴¹(Allele A)的品种休眠性弱、易穗发芽，携有C³⁰⁴¹(Allele C)的品种则表现较强的种子休眠和穗发芽抗性。携有Allele A或Allele C的大麦MKK3等位基因分布与品种来源和长期的人工选择有关，在抗穗发芽大麦品种培育中具有很好的育种价值。

杂交结合表型选择的传统育种方法往往因为宏观上性状鉴定不准确而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。采用与性状连锁的分子标记辅助选择，结合常规表型鉴定的分子育种，不但显著提高了目标性状选择的准确性，而且能大大降低工作量，减少育种的成本和周期。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP数量多，分布广泛，已成为第三代遗传标记。大量研究证实，在农作物抗病、抗逆、产量和品质等重要性状基因中存在丰富的SNP，某些位于基因内含子或编码区的SNP突变导致基因功能的显著改变，从而产生明显的性状变异。因此，针对目标基因序列变异的功能分子标记开发在等位基因鉴定和分子标记辅助选择育种中具有更强的应用前景。

相比于CAPS标记，凝胶电泳等传统的SNP检测方法，基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)技术的SNP基因分型方法具有明显的诸多优点。KASP标记可以通过通用荧光探针来无差别的连接目标引物，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害，具有准确性和通量化程度高、针对性强、操作简单、平台兼容性好、实验操作安全和数据自动化采集准确等优势。目前，KASP已成为国际上SNP鉴定的主流方法之一，在遗传研究的基因分型和分子标记辅助育种中发挥重要作用。

因此，针对大麦穗发芽抗性相关的种子休眠基因MKK3的SNP变异，开发为能准确鉴定种子休眠等位基因的KASP功能分子标记，并建立高效、环境友好的检测体系，将为进一步利用分子标记辅助选择筛选具有MKK3强休眠等位基因的杂交后代材料，提供精准的通量化鉴定技术，对于通过多基因聚合的分子育种手段加快大麦穗发芽性状改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种大麦休眠基因MKK3的KASP功能分子标记及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：

一组引物组合物，分别延长SNP A³⁰⁴¹前后40bp碱基序列后获得。

相应的，一组引物组合物，包括正向引物AL1，其序列如SEQIDNO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQIDNO.4所示；反向引物C，其序列如SEQIDNO.5所示。

相应的，所述引物组合物在鉴定大麦MKK3休眠等位基因，或鉴定、筛选大麦MKK3强休眠等位基因及种子休眠性、穗发芽抗性，或培育抗穗发芽大麦品种中的应用。

优选的，以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因分型。

优选的，在各引物的5’端添加不同的标记基团，发芽率小于20％的为携有强休眠等位基因的植株，发芽率大于20％的为携有弱休眠等位基因的植株；可识别出正向引物AL2标记的标记基团的待测样品为携有MKK3强休眠等位基因的植株类型；和/或；可识别出正向引物AL1标记的标记基团的待测样品为携有MKK3弱休眠等位基因的植株类型。

优选的，所述标记基团为荧光修饰基团。

优选的，包括如下步骤：

(1)提取待测大麦样品DNA；

(2)取浓度为50～100ng/μL的模板DNA 1.0μL、混合引物0.7μL、KASP Master Mix5.0μL、双蒸水加至总量为10μL；所述混合引物为正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C的混合溶液；

PCR扩增反应条件为：95℃预变性15分钟；95℃变性20秒，65℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，共32个循环；完成后进行荧光读数；

(3)分析PCR扩增产物等位基因类型；检测出Allele C的样品为携有MKK3强休眠等位基因的植株类型，检测出Allele A的样品为携有MKK3弱休眠等位基因的植株类型。

优选的，所述混合引物的制备方法为：正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C均按照10μM的浓度，分别取150μL、150μL和300μL进行混合后得到。

相应的，一种含有所述引物组合物的产品。

相应的，所述产品用于鉴定、筛选大麦MKK3休眠等位基因，或鉴定、筛选大麦种子休眠性、穗发芽抗性，或培育抗穗发芽大麦品种。

优选的，所述产品为试剂盒。

本发明具有以下有益效果：本发明针对大麦MKK3基因第7个外显子的SNP等位变异A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹提供了一种KASP功能分子标记，能对MKK3基因进行准确分型，预测大麦MKK3休眠等位基因，从而能在实验室条件下对含有MKK3强休眠等位基因的资源材料进行快速准确鉴定，筛选获得有育种价值的优异亲本材料。利用本发明所提供的方法能够实现大麦穗发芽抗性相关的MKK3强休眠等位基因的分子标记辅助选择，有助于提高抗穗发芽大麦育种的效率和准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1中SNP A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹的KASP分子标记在已知等位基因的4个大麦品种中的基因分型结果示意图，其中，携有Allele C的为具有MKK3种子强休眠等位基因的优良材料；

图2为本发明实施例2中SNP A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹的KASP分子标记在66个大麦育成品系中的基因分型结果示意图，其中，携有Allele C的为具有MKK3种子强休眠等位基因的优良材料。

具体实施方式

本发明提供了一种能鉴定大麦MKK3休眠基因等位变异的KASP功能分子标记。分子标记位点位于大麦MKK3基因的第7个外显子(第3041个碱基)，其多态性为：A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹。扩增所述分子标记的引物组KASP-N260T包括：正向引物AL1，其序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物C，其序列如SEQ ID NO.5所示。本发明提供的各序列中，左侧为5’端，右侧为3’端。

本发明还提供了一种将所述KASP分子标记用于大麦休眠基因MKK3等位基因鉴定的产品。本领域技术人员可以根据业内常规技术，在本发明提供的KASP分子标记的基础上，制备鉴定用试剂盒等产品。

本发明还提供了一种所述KASP分子标记在鉴定大麦休眠基因MKK3等位基因中的应用方法，具体包括如下步骤：

(1)提取待测大麦样品DNA。

(2)用KASP分子标记引物组合KASP-N260T进行PCR扩增。

所述荧光PCR的反应体系为：浓度为50～100ng/μL的模板DNA 1.0μL、混合引物0.7μL、KASP Master Mix 5.0μL、双蒸水加至总量为10μL；所述混合引物由引物AL1、AL2、C均按照10μM的浓度，分别取150μL、150μL和300μL进行混合后得到。

所述荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性15分钟；95℃变性20秒，65℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，共32个循环；完成后进行荧光读数。

(3)通过ABI实时荧光定量PCR仪和分析软件QuantStudio Design&AnalysisSoftware v1.5.1对PCR扩增产物进行荧光收集和分型检测。

(4)采用分子标记KASP-N260T引物组来判断目标SNP的类型。检测出Allele C的样品，即为携有MKK3强休眠等位基因的植株类型，检测出Allele A的样品为携有MKK3弱休眠等位基因的植株类型。

下面将结合附图1～2对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：大麦休眠基因MKK3等位基因的鉴定及分子标记的获得

1、收集大麦育成品种(系)70份，在2019年、2020年分别种植收获于四川什邡实验基地。

2、种子休眠的表型鉴定。

收获大麦蜡熟期种子，将其悬挂于阴凉通风处自然风干7天后，进行人工脱粒。在塑料培养皿中铺上用3～5mL蒸馏水润湿的滤纸进行发芽试验，试验设置三个重复，每个重复随机选取50粒种子，各籽粒间差异不显著。每隔一天挑出已露白的种子，并分别计数，种子发芽率以7天发芽种子数占总种子数百分比表示，计算发芽率。发芽率(％)＝(发芽种子数/种子总数-发霉数)×100％。通常将发芽率小于20％的材料定为强休眠材料，其穗发芽抗性也较强。

3、种子休眠基因MKK3的序列变异分析。

(1)DNA提取：选择1份强休眠大麦品种(编号DM33，发芽率＝12％)与3份弱休眠大麦品种(编号DM108，发芽率＝89％；DM153，发芽率＝72％；DM156，发芽率＝93％)，采用常规方法(离心柱法)提取材料的基因组DNA。

(2)序列扩增：为了鉴定上述4份大麦品种中MKK3基因第7外显子SNP的分布情况，设计PCR引物扩增特定区域870bp左右片段。以4份大麦品种的基因组DNA为模板，利用设计的特异引物对模板进行PCR扩增。引物N260TF的序列如SEQ ID NO.1所示；引物N260TR的序列如SEQ ID NO.2所示。

PCR扩增体系如表1所示。

表1 PCR扩增体系

总体积	50μL
		2×Pfu	25μL
引物N260TF	1μL，浓度为10μM
		引物N260TR	1μL，浓度为10μM
100ng/μL DNA	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	21μL

PCR反应程序如表2所示。

表2 PCR反应程序

反应步骤	温度	时间	循环数
				预变性	94℃	2min	不循环
变性	94℃	30s	不循环
				退火	59℃	30s	35个循环
延伸	72℃	30s	不循环
				延伸	72℃	10min	不循环

(3)测序：琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据片段大小(870bp)确认目标条带后，送有康生物工程公司测序。

结果显示：扩增的870bp左右的片段在4份材料中十分保守，相似度达到99.97％，只在目标区段存在1个SNP多态性：A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹。强休眠品种DM33携有C³⁰⁴¹(Allele C)，而弱休眠品种DM108、DM153、DM156均携有A³⁰⁴¹(Allele A)，实验结果与预期相符。

4、KASP分子标记的开发和SNP鉴定

为方便对种子休眠基因MKK3等位基因变异的SNP进行鉴定和辅助选择，同时为了降低育种成本和工作量，高通量地检测大量材料，最终得到清晰直观的分型结果，故针对目标基因SNP，开发基于常规分子生物学手段的可用于MKK3等位基因鉴定和筛选的KASP功能分子标记。

预实验时，提取DNA过程中使用了TE缓冲液溶解DNA，导致设计的KASP分子标记引物分型失败，不能准确识别荧光信号。可能的原因是：EDTA会改变PCR反应体系中Mg²⁺浓度，进而影响分型效果。因此，在DNA提取、引物稀释、PCR体系构建时均需要使用超纯水或者双蒸水。

同时，DNA浓度也是影响基因分型结果的关键，经大量前期试验后发现：DNA浓度50～100ng/μL为最佳，浓度过低或者浓度不均一都可能导致基因分型失败。除浓度要达到50～100ng/μL以外，使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，以保证A260：A280达到1.8～2.0范围。

经上述优化设计后，将目标SNP开发为KASP分子标记的具体操作步骤如下：

(1)分别延长SNP A³⁰⁴¹前后大约40bp碱基序列，设计两条正向引物(AL1、AL2)和一条共用反向引物C。

(2)以上述4个大麦品种的基因组DNA为模板，添加强休眠大麦与弱休眠大麦材料DNA体积比为1：1的混合样模板2个(模板1，DM33:DM108＝1:1；模板2，DM33:DM156＝1:1)。每个模板设计4个重复，添加3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白，利用引物组合KASP-N260T(即引物AL1、AL2和C)对各模板分别进行PCR扩增。

需要说明的是：PCR扩增体系及反应程序直接关系到结果的成败，且体系、程序中各参数并非常规调整、选择即可获得的，任意调整参数，很可能导致扩增失败。发明人在建立所述扩增体系时，使用定量PCR设备设定一个较多循环次数的PCR程序，实时检测FAM和HEX荧光，观察PCR扩增，在确定大部分样本进入平台期后，得到最佳循环次数。循环数过多或过少会导致分型变差或失败。

PCR扩增体系如表3所示。其中，DNA浓度为50～100ng/μL均可实现发明目的，本实施例使用浓度为100ng/μL。

表3 PCR扩增体系

总体积	10μL
		2×PARMS	5μL
引物AL1	0.15μL，浓度为10μM
		引物AL2	0.15μL，浓度为10μM
引物C	0.4μL
		50～100ng/μL DNA	1μL

PCR反应程序如表4所示。

表4PCR反应程序

使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃时对上述扩增产物进行荧光收集，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型，并与经测序鉴定的等位基因类型进行比对。

研究结果如图1所示。用KASP引物进行扩增时，1份强休眠品种(编号DM33)检测出了Allele C，3份弱休眠品种(编号DM108、DM153、DM156)检测出Allele A，3个混合样模板显示出杂合性(Allele A/C)。上述品种目标基因的SNP分型结果与基因序列测定结果完全一致。综上所述，本发明中利用影响种子休眠的MKK3基因SNP位点开发的KASP分子标记，可以成功地进行休眠等位基因鉴定以及杂合后代识别，并用于与穗发芽密切相关的种子休眠性状选择。

实施例二：KASP分子标记在筛选携带MKK3强休眠等位基因大麦资源中的应用

1、选择66份大麦资源材料进行MKK3休眠等位基因的KASP分子标记检测，具体方法为：

(1)PCR扩增：提取66份大麦材料叶片基因组总DNA。选择DM33、DM108、DM156作为对照，以及66个大麦材料的基因组DNA为模板，添加3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白，用开发的KASP分子标记引物组合KASP-N260T按实施例一的方法进行PCR扩增。

(2)基因分型：扩增完成后，使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃进行荧光读数，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型，并与含已知等位基因的材料进行比对。

2、基因分型结果：利用KASP功能分子标记对上述共69份材料进行基因分型，结果如图2所示。在66份大麦材料中同样能成功鉴定休眠基因MKK3的等位基因类型。其中，8份材料(编号：DM19、DM24、DM39、DM40、DM99、DM106、DM172、DM188)携有强休眠等位基因(AlleleC)，其余58份携有弱休眠等位基因(Allele A)。

以上结果表明：本发明提供的鉴定MKK3休眠基因等位变异的KASP分子标记，确实具有等位基因鉴定分型的作用，能准确鉴别具有MKK3种子强休眠等位基因的大麦资源材料。经验证，本发明的KASP分子标记的序列、引物明确，结果高效、准确，经案例实施，可直接用于大麦穗发芽相关的MKK3等位基因鉴定和休眠性状的分子标记辅助选择。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种大麦休眠基因MKK3的KASP功能分子标记及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(N260TF)

<400> 1

atgagatgag aacattatgt gaagc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(N260TR)

<400> 2

atacaaccta ctatgtgaaa cagct 25

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 正向引物(AL1)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tatgtcacct gagagaattc gtaa 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 正向引物(AL2)

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tatgtcacct gagagaattc gtac 44

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 反向引物(C)

<400> 5

gcacactcca atatcgttag tcc 23

Claims (10)

1.一组引物组合物，其特征在于：分别延长SNP A³⁰⁴¹前后40bp碱基序列后获得。

2.一组引物组合物，其特征在于：包括正向引物AL1，其序列如SEQIDNO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQIDNO.4所示；反向引物C，其序列如SEQIDNO.5所示。

3.权利要求1或2所述引物组合物在鉴定、筛选大麦MKK3休眠等位基因，或鉴定、筛选大麦种子休眠性及穗发芽抗性，或培育抗穗发芽大麦品种中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行MKK3基因分型。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：在各引物的5’端添加不同的标记基团，发芽率小于20％的为携有强休眠等位基因的植株，发芽率大于20％的为携有弱休眠等位基因的植株；可识别出正向引物AL2标记的标记基团的待测样品为携有MKK3强休眠等位基因的植株类型；和/或；可识别出正向引物AL1标记的标记基团的待测样品为携有MKK3弱休眠等位基因的植株类型。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述标记基团为荧光修饰基团。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待测大麦样品DNA；

(2)取浓度为50～100ng/μL的模板DNA 1.0μL、混合引物0.7μL、KASP Master Mix 5.0μL、双蒸水加至总量为10μL；所述混合引物为正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C的混合溶液；

PCR扩增反应条件为：95℃预变性15分钟；95℃变性20秒，65℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，共32个循环；完成后进行荧光读数；

(3)分析PCR扩增产物等位基因类型；检测出Allele C的样品为携有MKK3强休眠等位基因的植株类型，检测出Allele A的样品为携有MKK3弱休眠等位基因的植株类型。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述混合引物的制备方法为：正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C均按照10μM的浓度，分别取150μL、150μL和300μL进行混合后得到。

9.一种含有权利要求1或2所述引物组合物的产品，其特征在于：用于鉴定、筛选大麦MKK3休眠等位基因，或鉴定、筛选种子休眠性及大麦穗发芽抗性，或培育抗穗发芽大麦品种。

10.根据权利要求9所述产品，其特征在于：所述产品为试剂盒。

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