CN107190062A - 梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用，本发明涉及梨分子生物学研究领域。根据多个品种梨果实动态RNA‑Seq测序结果、后期实验验证及数据分析，针对性的获得了在翠冠、丰水和雪青梨果实不同发育时期中比常用的管家基因更为稳定的内参基因，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，能够实现对目标基因表达水平的校正和标准化，以达到对梨果实功能基因表达的精确定量。

Description

梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学研究领域，具体涉及梨果实发育过程中实时荧光定量PCR内参基 因的筛选及其应用。
背景技术
梨(Pyrus)是我国的主栽果树之一，栽培历史悠久，栽培区域涵盖全国各地，栽培面积 和产量一直居世界首位。近年来，我国科研工作者围绕梨从分子生物学层面开展了众多研 究，尤其2012年5月世界首个梨全基因组测序、组装和基因注释工作完成后，基因表达分 析已经广泛应用于揭示梨果实基因调控机理的研究中。
实时荧光定量PCR具有灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等特点，目前广泛地应 用于农学、医学、微生物学等众多研究领域。然而，RNA的质量和产量、反转录效率的差异等因素都会对目的基因表达分析结果的准确性产生影响，因此要精确判断特定靶基因表达 的水平，需要选择合适的内参基因对目标基因的表达水平进行校正和标准化，减小检测样本 本身对定量结果的影响。这也进一步说明合适的内参基因是精确分析qRT-PCR结果的重要 前提，筛选稳定的内参基因在基因表达分析中起着关键的作用。
理想的内参基因应该是不受生长阶段，组织器官，以及实验处理条件的影响。然而，大 量的研究结果表明，并没有这样理想的稳定基因。梨树中常用的传统看家基因有肌动蛋白基 因Actin、微管蛋白基因β-Tubulin、转录延伸因子基因EF-1α、多聚泛素蛋白基因Ubiquitin 等，这些基因表达较为稳定，本身拷贝数高，在不同器官、组织或者细胞中组成型表达，具 有相当的保守性，表达水平能够保持一致。但是越来越多的报道指出，在不同的生长阶段或 者实验条件下，传统的管家基因作为内参基因荧光定量PCR的结果迥异，并不能够稳定表 达，有时会导致结论相反，不能真实的反映出基因的表达水平。随着RNA-Seq技术的快速 发展，根据实验目的和组织器官，筛选鉴定开发出新的稳定表达的内参基因是解决传统看家 基因弊端的有效途径。
本发明基于RNA-Seq比较基因表达差异以筛选梨果实发育相关基因的研究过程，从中挖 掘表达量较高并且表达稳定的基因作为梨果实候选内参基因，并通过具体的试验验证，以及 利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ReFinder 4种软件从不同统计学角度分析验 证候选内参基因在果实的整个发育阶段中的表达稳定性。本发明成功发现了梨果实发育过程 中稳定的内参基因，并对后期通过qRT-PCR探索梨果实关键基因奠定了坚实的基础。
发明内容
1、要解决的技术问题
为梨果实发育过程中相关基因表达分析提供更可靠的内参基因，以克服上述背景技术中 传统看家基因的缺点和不足，更精确的验证基因表达水平，为挖掘梨果实发育中的有意义的 基因奠定基础。
2、技术方案
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
梨果实不同发育时期荧光定量内参基因，包含以下(1)～(3)中的至少一种：
(1)翠冠梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr028511，该内参基因Pbr028511 的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)丰水梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr038418，该内参基因Pbr038418 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
(3)雪青梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr041114，该内参基因Pbr041114 的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
上述梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的特异性引物，其在于：
(1)所述Pbr028511基因的特异性引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
(2)所述Pbr038418基因的特异性引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；
(3)所述Pbr041114基因的特异性引物如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
上述的内参基因或上述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。
一种梨果实不同发育时期荧光定量试剂盒，其包含上述特异性引物中的至少一种。
上述的梨果实不同发育时期荧光定量试剂盒中还包含PCR技术常用试剂。
基因Pbr028511、Pbr038418和Pbr041114中的至少一种作为梨果实不同发育时期荧光 定量内参基因的应用，基因Pbr028511的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；基因Pbr038418 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；基因Pbr041114的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
上述的应用，其在于：
(1)所述的基因Pbr028511作为翠冠梨果实不同发育时期荧光定量内参基因；
(2)所述的基因Pbr038418作为丰水梨果实不同发育时期荧光定量内参基因；
(3)所述的基因Pbr041114作为雪青梨果实不同发育时期荧光定量内参基因。
上述的应用，其在于：
(1)所述Pbr028511基因的特异性引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
(2)所述Pbr038418基因的特异性引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；
(3)所述Pbr041114基因的特异性引物如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
上述的内参基因Pbr028511、Pbr038418和Pbr041114或上述的试剂盒在相对定量法实 时荧光定量PCR中的应用。
上述的内参基因Pbr028511、Pbr038418和Pbr041114或上述的试剂盒在相对定量法实 时荧光定量PCR中的应用，其在于：在翠冠、丰水和雪青果实不同发育时期功能基因表达试 验中采用所述的内参基因定量，所述基因在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因使 用。
本发明所述梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选过程为：
(1)结合翠冠、丰水和雪青梨品种从幼果到成熟果动态发育过程转录组测序结果分析， 筛选在梨果实发育中表达水平相对稳定的基因作为候选内参基因；
(2)在每个测序梨品种中，选取更多发育阶段的果实，利用高质量的RNA逆转录成相 同浓度的cDNA，再通过荧光定量PCR检测候选内参基因及对照的看家基因微管蛋白基因(TUB)的表达量。
(3)根据每个品种的多个时期表达水平，通过GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行各内参基因稳定性分析，最后结合分析结果运用ReFinder计算出候选内参基因稳定性综合排名。
与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：
1、本发明结合梨果实动态RNA-Seq测序结果以及后期实验验证数据分析，明确了翠 冠、丰水和雪青3个主栽梨品种果实发育稳定内参基因，为后期深入挖掘果实功能基因奠定 了基础。
2、筛选出适合主栽品种翠冠、丰水和雪青的内参基因，适用于果实发育过程中糖、酸 以及其他功能基因的表达分析，应用广泛，灵敏度高，稳定性好，精确度高。
3、本研究经过严格的内参基因筛选程序，数据真实可靠，确定了梨果实稳定的内参， 明确了看家基因并不是最理想的内参基因。
附图说明
图1是候选内参基因及PbrTUB基因引物特异性琼脂糖凝胶电泳图。
图2是36个样品RNA逆转录成相同浓度的cDNA琼脂糖凝胶电泳图。
图3是候选内参基因和PbrTUB在各个样品中的Ct值。
其中，折线图A1、A2、A3分别是翠冠、丰水和雪青果实发育的候选基因的Ct平均值，箱线图B1、B2、B3分别是翠冠、丰水和雪青果实发育的候选基因整个时期Ct的最 大、最小和平均值。
图4是通过GeNorm软件比较每个候选内参基因的表达稳定度M值排序图。
图A、B、C分别为翠冠、丰水和雪青。其中，M值越大稳定度越低，最右侧两个基因 是GeNorm分析中最稳定的两个基因。
图5是通过NormFinder和BestKeeper软件比较每个候选内参基因的表达稳定度排序图。
其中，图A1、A2、A3分别是翠冠、丰水和雪青通过NormFinder软件表达稳定值；图B1、B2、B3分别是翠冠、丰水和雪青通过BestKeeper软件平均STDEV值。图中，靠右排 序的越稳定。
具体实施方式
本发明研究翠冠、丰水和雪青三个主栽梨品种果实发育内参基因。下面主要以翠冠 (cg)梨为例，结合附图和实施例详细说明：
1、基于研究果实发育相关基因的研究，选取了翠冠、丰水和雪青3个品种的全部发育 过程的4个阶段果实进行转录组测序。筛选了表达量较高，并且表达水平较为稳定的9个候 选内参基因。
2、将RNA-Seq表达谱数据库中挑选9个表达相对稳定的基因作为候选内参基因(表2)，梨看家基因微管蛋白基因(PbrTUB)为对照。根据候选内参基因的cDS序列和qRT-PCR 设计原则，利用Primer5.0软件设计10对特异性引物(表1)。内参基因目的片段的PCR扩 增检测(图1)。
3、选取3个品种各个阶段果实发育动态样品(翠冠cg1-cg10 10个时期样品、丰水fs1- fs13 13个时期样品和雪青xq1-xq13 13个时期样品)，用液氮速冻，以备RNA提取。采用 RNA试剂盒(北京天根生化科技公司)提取样品总RNA，以1μg总RNA为模板，采用 First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒(北京全式金)去除基因组 DNA并反转录合成cDNA第一链，获得高质量的cDNA(图2),-20保存备用。
4、内参基因荧光定量PCR扩增，使用SYBR Green Master(Roche)试剂盒，具体操作按照试剂盒说明书进行。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，65℃退火15s，72℃延伸15s，45个循环。每个样品设3个重复。
5、实时荧光定量PCR得出各样品Ct值，每个基因在不同样品中的表达丰度均存在差 异，通过Excel 2010获得翠冠果实发育的候选基因的Ct平均值折线图(图3，A1)，以及通过R获得翠冠果实发育的候选基因整个时期Ct的最大、最小和平均值(图3，B1)，初步 内参基因稳定性进行排序(表2，翠冠，Delta CT)，具体排序为Pbr002841、Pbr028511、Pbr038418、Pbr016129、Pbr027964、Pbr041114、Pbr000214、Pbr016048、Pbr018827、PbrTUB。
6、通过GeNorm软件计算每个候选内参基因的表达稳定度M值(图4)，M值越大， 表明稳定性越低；反之M值越小，稳定性越高，其中M＝1.5是上限。从而获得两个最稳定 的基因(Pbr028511，Pbr027964)，并且获得候选基因稳定性排序(图4A；表2，翠冠， Genorm)。
7、通过NormFinder软件计算Ct值组内方差与组间方差来确定候选内参基因的稳定值 (图5，A1)，稳定值越小，内参基因表达就越稳定；反之不稳定。获得候选基因稳定性排序(图5，A1；表2，翠冠,NormFinder)，具体排序为Pbr002841、Pbr028511、 Pbr038418、Pbr016129、Pbr027964、Pbr041114、Pbr000214、Pbr016048、Pbr018827、 PbrTUB。继续通过BestKeeper软件计算标准偏差(STDEV)来筛选最稳定的内参基因(图 5，B1)，其中标准差越小，稳定性越好；反之稳定性越差。获得候选基因稳定性排序(图 5，B1；表2，翠冠，BestKeeper)，具体排序为Pbr028511、Pbr002841、Pbr041114、 Pbr016129、Pbr038418、Pbr027964、Pbr000214、Pbr016048、Pbr018827、PbrTUB。
8、最后我们通过ReFinder软件对上述多种分析得到的稳定性排名求几何平均值，获得 翠冠果实发育中内参基因稳定性排序(表2，翠冠，Comprehensive ranking)，从而获得了 比看家基因更稳定的内参基因Pbr028511，该内参基因Pbr028511的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。同样方法获得了丰水梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr038418，该 内参基因Pbr038418的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；雪青梨果实不同发育时期荧光定 量内参基因为Pbr041114，该内参基因Pbr041114的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
表1候选内参基因引物列表
SEQUENCE LISTING
<110> 南京农业大学
<120> 梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1323
<212> DNA
<213> 翠冠梨
<221> 内参基因Pbr028511
<400> 1
atggcttcca cggagggtat agtaccaata accagggctt ttctcgcttc ctactacgac 60
acataccaat ttccccctct ctcaaacggc gtcgctcgcc tctcctccga gattcgctcc 120
ttcaccgccg atttgctcca ccactctccg gcggctcaag gcgaggagag attgttagtg 180
agtgaattgg aaagtgaacc gccgcacaaa gtagacgaaa acatgtggaa gaatcgagag 240
catatggagg agatactatt tttgcttgaa aaaccccatt ggccccaaac tcttcgagag 300
cagtcgagtc ttgatgatgc tgaacttgcg actgtgattg atcgcctccg ccagaaattt 360
caaaccagtt tgaagacact ggagtctttc caagcgaaaa attccgaacg tgtgttcaac 420
acggttatga cttacattcc tcaggatttt cggggaaggc tcatcagaca acagcgggag 480
cgttcagaga ggaataagca agcagaggtt gaagctttgg ttagttctgg agcaactata 540
cgtgaacgtt atgctctctt gtggaatcag caaatggaga ggaggagact cttggcgcag 600
cttggttctg caactggtgt ctacaagacg cttgtcaagt acttggttgg ggttccacag 660
gttctacttg attttattcg ccaaataaat gatgatgatg ggcccatgga agagcaacgg 720
caacgttatg gacccccttt atacagcctt acaactatgg tacttcttat acgacttctt 780
atttcgctgt cttgggggcg ctttgagagt agaaaattaa acaagcaaga gttagctgtc 840
ttggaagaag ctgttgatgt ctacaccact gaatttgaaa ggtttattac gttcatcagt 900
gaggtctttg caaattcccc cttttttatc ccagcagagg ttgcgggcgc attagaagga 960
aggaataatg atgattacca agagacgagt gttccagctg ggaaaactca tgaggtttta 1020
ttggctgtgg atgcgataaa ttcatatatt gcttgggatt tcgcgcttgt acaggggaag 1080
ataaacttgg atattggatt tagtgtcgag tatacaaatt cttctgggga aaaatctctc 1140
attttacctt accaacgcta cgattctgac caaggaaact tctgcacatg tgaggctgga 1200
aactacaaac tgatttggga caattcctat tcgaattttt ttaagaaggt tctgcgcttc 1260
aaggtagatt gcataccgcc agttgcagag tcggtgcaac ctgcgaacga ggttgaagaa 1320
tga 1323
<210> 2
<211> 1548
<212> DNA
<213> 丰水梨
<221> 内参基因Pbr038418
<400> 2
atggatggac ctgttggccg tggtggcagc ggtgcagata cttatttacc aaattacaag 60
ctcggaaaga ctcttggtat tggttctttt ggaaaggtta aaattgcaga gcatgcatta 120
actggacata aagttgctat caagatcctt aaccgccgca aaataaagaa catggaaatg 180
gaagagaaag tgagaagaga aatcaaaata ttgaggttgt ttatgcatcc tcacattata 240
cgactctatg aggtcattga aacaccatcc gacatttatg tcgtgatgga gtatgtgaag 300
tctggggagc tctttgatta tatagtagag aagggtaggc tgcaggaaga tgaagctcgt 360
aacttttttc aacagataat atctggcgta gagtattgtc acaggaatat ggttgttcat 420
agagatttaa agcccgaaaa tttgcttctg gattccaaat gcaatgtgaa aattgctgat 480
tttggtctga gcaacataat gcgtgatggc cattttctca agacaagttg tggcagcccg 540
aattatgcgg ctccagaggt tatatctggc aagctgtacg ctgggcctga agtggatgtg 600
tggagttgtg gggttatact atatgctctt ctttgtggca cccttccatt tgatgatgaa 660
aatattccaa acttgtttaa gaaaataaag ggtgggatat acactcttcc tagtcatttg 720
tcacctggtg caagagactt gattccaaga atgctcgtag ttgatccaat gaagcgaatg 780
accattcctg agattcgaca tcatgcatgg ttccaggctc atcttcctcg ttatttagct 840
gttcctccac cagacaccat gcaacaagca aaaaagattg atgaggaaat tcttcaggag 900
gtagttaaga tgggatttga caggaaccat ctggttgagt ctcttcgtag tagagtacag 960
aatgagggaa cagttgcata ctatttgtta ttggacaacc gtttccgtgt atccagtggc 1020
tatcttggag ctgagtttca ggagactgtg gaatgtggtt tcaatcgtat gcagcaaagt 1080
gagactgctg cttcacctgt tgggcaccgc cttcctggat atatggagta tcaaggaatg 1140
ggttttaaac cacagttccc tgttgaaagg aaatgggctc ttggacttca gtctcgagca 1200
catcctcgtg aaataatgac agaagtcctt aaagctttac aagaattgcg ggttagttgg 1260
aagaagatag gacactacaa catgaagtgt aggtgggttc ttgacaatcc aggtcaaaac 1320
gaaggcatga tcgacaaccc tgtgcacagt aaccattatt ttggagatga gtccagcatc 1380
atcgaaaatg atggtgctat gaagatgcca aatgtggtca agtttgaagt gcagcttttc 1440
aaaactccgg cggagaagta cctgcttgat cttcagaggg ttcagggtcc gcagtttctc 1500
ttcttggatc tttgtgctgc tttccttgcc caacttcgtg tcctttag 1548
<210> 3
<211> 1260
<212> DNA
<213> 雪青梨
<221> 内参基因Pbr041114
<400> 3
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gaaggtatct ccttggaaag ccctatcgtt acttcatgtg gtactggtgt gacagcttgc 1140
attcttgcat tgggtcttca tcgacttggt aagcctgatg taccagtcta tgatggatcg 1200
tggactgaat ggggagcgca gtccgacaca cccgttgaca gttctacaga aagtgcgtaa 1260
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Pbr028511-F
<400> 4
gaaaacactc attcttcaac ctcgt 25
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Pbr028511-R
<400> 5
tctctcattt taccttacca acgctac 27
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Pbr038418-F
<400> 6
gatggtgcta tgaagatgcc aaatgt 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Pbr038418-R
<400> 7
tcccgagcat cacgatagat tcac 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Pbr041114-F
<400> 8
actggtgtga cagcttgcat tcttg 25
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Pbr041114-R
<400> 9
gtattggcaa accccaggct attc 24

Claims (10)

1.梨果实不同发育时期荧光定量内参基因，其特征在于：包含以下(1)～(3)中的至少一种：
(1)翠冠梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr028511，该内参基因Pbr028511的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)丰水梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr038418，该内参基因Pbr038418的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
(3)雪青梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr041114，该内参基因Pbr041114的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.权利要求1所述梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的特异性引物，其特征在于：
(1)所述Pbr028511基因的特异性引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
(2)所述Pbr038418基因的特异性引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；
(3)所述Pbr041114基因的特异性引物如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
3.权利要求1所述的内参基因或权利要求2所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。
4.一种梨果实不同发育时期荧光定量试剂盒，其特征在于包含权利要求2所述特异性引物中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的梨果实不同发育时期荧光定量试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包含PCR技术常用试剂。
6.基因Pbr028511、Pbr038418和Pbr041114中的至少一种作为梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的应用，基因Pbr028511的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；基因Pbr038418的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；基因Pbr041114的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
(1)所述的基因Pbr028511作为翠冠梨果实不同发育时期荧光定量内参基因；
(2)所述的基因Pbr038418作为丰水梨果实不同发育时期荧光定量内参基因；
(3)所述的基因Pbr041114作为雪青梨果实不同发育时期荧光定量内参基因。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：
(1)所述Pbr028511基因的特异性引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
(2)所述Pbr038418基因的特异性引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；
(3)所述Pbr041114基因的特异性引物如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
9.权利要求1所述的内参基因Pbr028511、Pbr038418和Pbr041114或权利要求4所述的试剂盒在相对定量法实时荧光定量PCR中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：在翠冠、丰水和雪青果实不同发育时期功能基因表达试验中采用所述的内参基因定量，所述基因在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因使用。
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