CN111118198B

CN111118198B - 一组梨果皮qRT-PCR内参基因及其引物和应用

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Publication number: CN111118198B
Application number: CN202010067122.8A
Authority: CN
Inventors: 陈建清; 陈昌妹; 谢桂烽; 夏忠恒; 袁梦; 程翔宇; 陈清西
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111118198A

Abstract

本发明提供一组可用于广泛梨品种果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏中基因表达分析的新内参，其中ACT6/7/8/9和NAP1可作为最优内参基因组合用于梨果皮基因表达分析。本发明基于基因组和转录组筛选出的5个新内参在梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理中的表达稳定度优于传统内参基因(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26‑18S rRNA)；从5个新内参中开发了一对ACT6/7/8/9和NAP1的内参组合，其用于广泛梨品种果皮发育过程、低温贮藏和套袋处理中的基因表达均化效果最佳；5个新内参及所开发的ACT6/7/8/9和NAP1内参基因组合可应用于广泛梨品种的果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理的基因表达研究。

Description

一组梨果皮qRT-PCR内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及5个可用于广泛梨品种果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏中基因表达分析的新内参基因，其中推荐ACT6/7/8/9和NAP1作为最优内参基因组合用于广泛梨品种果皮基因表达分析。

背景技术

梨(Pyrus L.)世界上最具经济价值的水果之一，大体可分为西方梨和东方梨两大类。由于砀山酥梨(P.bretschneideri)已完成基因组测序(～512Mb)，因此成为研究梨属植物的模式植物。梨果实发育过程分为坐果期，分裂期，膨大期，成熟期和衰老期。从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。梨果皮是果实品质和商品性的重要组成部分，是最能引起注意的果实性状。因此，果皮发育的调控机制也是广大植物学家和育种工作者共同关心的问题，而这需要从广泛而全面的分子层面进行研究。基因表达定量分析是解决复杂的基因网络调控的关键。由于实时荧光定量PCR(Quantitative reverse-transcription PCR,qRT-PCR)的特异性、高灵敏度和可重复性，其成为基因表达分析的首要方法，而精确的转录均化是获得可靠的qRT-PCR结果的基础。因此，该方法需要特定实验条件下稳定表达的内参基因(Reference Genes，RGs)对靶基因进行数据均化，未能使用合适的RGs可能导致真实的基因表达量出现偏差和低重复率。

由于看家基因(Housekeeping Genes，HKGs)在细胞中的基础作用和稳定的表达水平，在qRT-PCR分析中常常将其作为均化目的基因表达量的RGs。目前，在梨果皮的qRT-PCR研究中，最常用的六个传统HKGs是Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA。然而，这些传统HKGs的表达稳定性并没有经过系统验证，仅仅是基于它们在任何条件下都有恒定的表达水平的假设，就被应用于梨果皮的基因表达研究。越来越多的证据表明，在不同条件下，传统HKGs的稳定性会有相当大的波动。例如，传统HKGs在拟南芥种子和花粉中出现了较高的变异系数CoV值(衡量基因表达稳定性的指标，CoV值越低表达越稳定)。这说明，这些传统的HKGs并不能广泛适用于所有的实验条件，对特定实验条件下的RGs表达稳定性进行综合评估是十分必要的。为此，研究人员开发了geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder等软件，用于统计分析以筛选出表达最稳定的RGs。

转录组分析广泛应用于植物复杂分子过程的研究。RNA-seq作为一种全局性的评估技术，以其大数据集、高通量和敏感性的优势提供了一个极具代表性的样品转录组快照。利用RNA-seq数据集来筛选在不同条件下稳定表达的RGs，已成功应用在拟南芥、小麦和番茄等植物中。目前，梨果皮的相关研究产生的大量RNA-seq数据集为筛选果皮的最理想RGs提供了丰富的资源。

现有技术存在的问题：

目前，在梨果皮研究中常使用的内参主要为Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA，这六个传统内参基因作为单内参在果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏中用于均化目标基因表达量。

主要缺陷如下：

1)这些传统内参基因在梨果皮研究中的应用仅是参考其他物种，而没有在基因组范围内进行系统的表达稳定度比较验证，而且众多研究表明这些传统内参基因在不同实验条件下表达并不稳定；

2)目前，在梨果皮基因表达研究中仅使用单内参进行均化，而缺乏更精准的多内参组合应用；

3)缺乏一种合适的内参基因体系用于广泛梨品种范围内果皮基因表达研究。

因此，有必要尽快基于广泛的转录组数据，在全基因组范围内确立一种合适的内参基因体系以解决梨果皮中传统内参稳定性差，基因表达量均化效果不理想的问题。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供一组梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏中稳定内参基因及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一组梨果皮qRT-PCR内参基因，所述内参基因为NAP1基因、BPS1基因、Alba-like1基因、UBC32基因和ACT6/7/8/9基因；NAP1基因的基因序列如SEQ ID NO：1所示，BPS1基因的基因序列如SEQ ID NO：2所示，Alba-like1基因的基因序列如SEQ ID NO：3所示，UBC32基因的基因序列如SEQ ID NO：4所示，ACT6/7/8/9基因的基因序列如SEQ ID NO：5(PbrACT6、PbrACT7、PbrACT8、PbrACT9的基因序列100％一样，转录水平无法区分，本发明将它们的转录本合并为PbrACT6/7/8/9来使用，后期的qRT-PCR实验表明利用PbrACT6/7/8/9的转录本来用表达也很稳定。)。

优选地，所述内参基因为NAP1基因和ACT6/7/8/9基因；NAP1基因的基因序列如SEQID NO：1所示，ACT6/7/8/9基因的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了上述的内参基因在梨果皮的发育过程、套袋和采后低温贮藏过程中的基因qRT-PCR中的应用。

本发明还提供了上述的内参基因的qRT-PCR引物，NAP1基因的引物序列如SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7所示；BPS1基因的引物序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；Alba-like1基因的引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；UBC32基因的引物序列如SEQID NO：12和SEQ ID NO：13所示，ACT6/7/8/9基因的引物序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。

本发明还提供了上述的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：(1)利用梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏相关基因组和转录组数据分析获得候选内参基因；(2)利用转录组数据分析候选内参基因在梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中表达稳定性；(3)利用qRT-PCR分析验证候选内参基因在梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中的表达稳定性。

优选地，步骤(1)包括：

(1)定义在梨果皮qRT-PCR研究中使用的内参基因包括：Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18S rRNA为常用内参基因；

(2)从NCBI收集梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理RNA-seq数据，共收集到6个数据集，总共54个转录组数据；

(3)以FPKM值≥100，CoV值≤0.15的标准，在转录组数据中筛选筛选候选内参基因。

优选地，步骤(2)包括：

(1)以每个候选内参基因的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到该候选内参基因在果皮中的相对表达量；

(2)依据候选内参基因在在转录组数据中变异度，对候选内参基因进行表达稳定性排序；随后使用RankAggreg程序，融合所有排序，得到一个综合排序，对其稳定度进行综合性评估；

(3)利用geNorm软件，利用稳定值M评估基因表达的稳定度，对候选内参基因的所有RNA-seq数据进行分析获得稳定度排行。

优选地，步骤(3)包括：

(1)分析候选内参基因在qRT-PCR实验中的循环阈值；

(2)通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度、稳定性、标准差和变异度和几何平均值；

(3)通过geNorm软件对候选内参基因进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定基因均化所需的最少的内参基因组合个数。

有益效果：

(1)基于基因组和转录组筛选出5个新内参在梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理中的表达稳定度优于传统内参基因(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18S rRNA)；

(2)从5个新内参中开发了一对ACT6/7/8/9和NAP1内参组合，用于梨果皮发育过程、低温贮藏和套袋处理中的基因表达均化效果最佳；

(3)5个新内参及所开发的ACT6/7/8/9和NAP1内参组合可应用于广泛梨品种的果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理的基因表达研究。

附图说明

图1梨果实构造图

从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。

图2梨Actin基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出9个Actin基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥Actin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00022的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrACT6(基因登入号：JN684184)是梨果皮qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图3梨Tublin基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出7个Tublin基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥Tublin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00091和PF03953的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrTUB5(基因登入号：AB239681)是梨果皮qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图4梨EF1α基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出6个EF1α基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥EF1α基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00009、PF03144和PF03143的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrEF1α4(基因登入号：AY338250)是梨果皮qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图5梨GAPDH基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出7个GAPDH基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥GAPDH基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF02800和PF00044的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrGAPDH7(基因登入号：AB266449)是梨果皮qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图6梨UBI基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出2个UBI基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥UBI基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF01599.18和PF00240.22的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrUBI2(基因登入号：AF386524)是梨果皮qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图7梨传统内参基因家族表达丰度和表达变异度分析

为了在传统内参基因家族中探索是否存在其他合格的内参基因(RGs)用于梨果皮基因表达研究，本发明在6个转录组数据集(RNA-seq)(总共包括54个转录组)中评估传统内参基因的表达稳定度(CoV，变异系数)和表达丰度(RPKM，每百万Reads中来自于某基因每千碱基长度的Reads数)，以CoV≤0.2，RPKM≥100为阈值筛选标准。通过对5个传统内参基因家族成员的表达稳定度和表达丰度的进行统计分析，若CoV和RPKM的数据平均值符合阈值筛选标准，即认定其为本发明的候选内参基因。CoV分析如图左侧所示，RPKM分析如图右侧所示。箱型图中的每个数据点来自一个RNA-seq数据集，黑线表示中值，虚线表示筛选阈值。

图8基因组范围内鉴定4个稳定表达的新内参候选基因

为了在基因组范围内探索是否存在更优质的内参基因(RGs)用于梨果皮基因表达研究，本发明提高了筛选标准，基于6个转录组数据集(RNA-seq)，以CoV≤0.15，RPKM≥100为阈值筛选标准，若该基因在每个转录组数据集中同时满足以上条件，即被作为新候选内参基因。a.维恩图显示了从梨基因组中筛选得到的4个新候选内参基因。b.基于6个RNA-seq数据集，我们将所有候选内参基因进行分组，(1)梨果皮特异性RGs(‘PPS’RGs)；(2)常用RGs(‘commonly used’RGs)；(3)传统HKGs(‘traditional’HKGs)。对所有候选内参基因进行CoV值和RPKM值的统计分析。RPKM分析如图右侧所示，CoV分析如图左侧所示。箱型图中的每个数据点来自一个RNA-seq数据集，黑线表示平均值，虚线表示筛选阈值。c.根据候选内参基因在每个RNA-seq数据集中的表达稳定性排名(根据CoV值高低排名，CoV值越低排名越高)，依此在6个RNA-seq数据集中获得关于候选内参基因的表达稳定性排名表。接着，使用RankAggreg程序对这6个表达稳定性排名表进行聚合，得到一个综合排名。结果显示，Actin基因的表达稳定性最好，而4个新候选内参基因的稳定性明显优于传统HKGs和其余常用RGs。d.本发明也使用geNorm软件通过计算每个基因的稳定值(M)来衡量其表达稳定性。M值越低基因表达稳定性越好。结果表明geNorm分析的排名趋势与RankAggreg分析结果相似。综上，RNA-seq数据分析结果表明，Actin基因表达稳定性最好，4个新候选内参基因明显优于其余的候选RGs。注:由于26-18S rRNA没有在梨基因组上被注释出来，因此在转录组分析中没有对其进行分析。

图9候选内参基因表达变化率

图中，12个候选内参基因(RGs)在54个与梨果皮发育、套袋处理和采后低温贮藏处理相关的RNA-seq文库(包括6个转录组数据集)中的表达变化率。每个基因的相对表达变化率是由每个文库的表达值(RPKM值)除以每个转录组数据集中的平均表达水平(平均RPKM值)得到的。

图10模式图简析新候选内参基因功能

图中，本发明简要分析了4个新候选内参基因的细胞功能。a.NAP1介导的核小体形成的机制。CAF1结合组蛋白H3-H4四聚体，与增殖细胞核抗原(PCNA)相互作用，然后释放出CAF1。NAP1介导H2A-H2B二聚体向组蛋白四聚体靠拢。b.BYPASS1的功能模型。BPS1能够阻止由根系产生的过量移动信号传输到茎，这种信号足以阻止茎和根的发育。c.Alba-like1介导的转录后调控机制。Alba-like1参与维持mRNA的稳定性始于pre-mRNA转录合成、pre-mRNA剪接、添加poly(A)尾巴、成熟mRNA通过细胞质输出及蛋白翻译。d.UBC基因介导的泛素化过程模型。泛素与E1连接，由ATP激活，然后转移到E2。E3催化泛素从E2转移到底物。最后，泛素化蛋白被26S蛋白酶体降解。UBC基因编码E2泛素结合酶。SCF E3泛素连接酶复合体由Cullin、Skp1、RBX1和F-box组成。支架蛋白Cullin与RING指蛋白RBX1和适配器蛋白SKP1相关。SKP1连接到F-box蛋白。

图11qRT-PCR分析中梨样品说明

在本发明中，用于qRT-PCR分析的梨果皮样品采自‘翠冠’梨品种。a.梨果皮样品分别在开花后第7、19、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、110和117天15个发育阶段进行采收，用于不同发育阶段的基因表达研究。b.采后进行4℃低温处理后第3、6、9、12、15、18天收集梨果皮样品用于低温处理的梨果皮基因表达研究。

图12qRT-PCR分析中梨样品RNA质量分析

本发明对梨果皮样品RNA进行质量分析。a.通过琼脂糖凝胶电泳试验检测样品RNA的完整性。核糖体RNA条带清晰可见，说明样品RNA是完整的。b.利用Nanodrop工具测定样品RNA的OD 260/280比值，进一步评估样品RNA质量，所有的比值都接近2，表明RNA质量良好。

图13qRT-PCR分析中候选内参基因的引物特异性分析

本发明对候选内参基因(RGs)的引物特异性进行分析。a.qRT-PCR中候选RGs引物的熔融曲线分析，所有引物只产生一个峰值，说明引物具有特异性。b.利用2.5％琼脂糖凝胶对qRT-PCR中PCR产物进行电泳分析，发现仅有单一条带且与预测的产物大小一致。两种分析都证实了本研究中引物具有特异性。

图14qRT-PCR分析中筛选最优内参基因的分析策略图

图中，本发明使用不同的评估软件筛选最优内参基因(RGs)。首先，评估了每个候选RGs的引物效率和特异性；其次，分析候选内参基因(RGs)在样品中的表达丰度及变化幅度(CT值)；随后，分别使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度(M)、稳定性(Stab)、标准差(SD)、变异度(CoV)和几何平均值(GM)，评估其表达稳定性，这些值越低对应越高的基因表达稳定度，由此得出候选内参基因(RGs)稳定度的5个排行；然后，利用RankAggreg将不同软件的排行结果进行加权合并，得到候选内参基因(RGs)的综合排名，确定最稳定的内参基因；同时，通过geNorm软件对候选内参基因(RGs)进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定qRT-PCR数据均化所需的最少的内参基因(RGs)组合个数。最后，综合表达丰度、表达稳定度以及最佳内参基因(RGs)组合个数评估，推荐在梨果皮发育过程、套袋和采后低温处理中最优内参基因(RGs)组合。

图15qRT-PCR分析中候选内参基因表达丰度与变化幅度分析

图中，本发明对梨果皮发育过程、套袋和采后低温处理中候选内参基因(RGs)在qRT-PCR分析中的表达丰度(CT值，CT值越低，基因表达量越高)进行评估分析。箱型图显示了12个候选内参基因(RGs)的CT值变化。箱型图中的水平线表示所有样品中CT值的中值，箱型上限和下限分别表示样品中基因CT值第25和第75百分位数的值。上下Bar端表示基因在样品中基因CT值的最小值和最大值。

图16qRT-PCR综合分析‘翠冠’梨中内参基因表达稳定度

图中，为了评估候选内参基因(RGs)的表达稳定性，基于候选内参基因(RGs)在‘翠冠’梨所有样品中的CT值，使用geNorm(a)、NormFinder(b)、BestKeeper(c、d)和RefFinder(e)程序计算了基因稳定度(M)(a)、稳定性(Stab)(b)、标准差(SD)(c)、变异系数(CoV)(d)和几何平均值(GM)(e)。使用RankAggreg程序对以上四种软件获得的稳定性排名进行合并，得到一个综合的候选RGs排名(f)。

图17qRT-PCR数据均化所需的最少RGs组合个数分析

本发明通过geNorm软件对候选内参基因(RGs)进行两两变异(PV,Vn/Vn+1)系数分析，以确定qRT-PCR数据均化所需的最少的内参基因(RGs)组合个数。如果n个基因组合后，其PV值低于0.15(这是一个普遍接受的推荐阈值)，就认为继续增加内参基因数量将不能提高均化效果。该分析表明在梨果皮基因表达研究中最优内参基因(RGs)组合为ACT6/7/8/9和NAP1。

图18基于PbrEXPA8a转录变化验证候选内参基因实用性

a.基于RNA-seq分析，PbrEXP8a的表达量在不同梨品种果皮发育成熟前逐渐增加，之后急剧下降；在采收后低温贮藏中，其表达量先升高后降低。b.以ACT6/7/8/9和NAP1内参组合在qRT-PCR分析中对‘翠冠’梨果皮发育过程和采后低温贮藏处理中PbrEXP8a的相对表达水平均化后的结果与(a)中的RNA-seq数据得出的PbrEXP8a表达趋势相似。同时，利用单个梨果皮特异性RG(‘PPS’RG)或ACT6/7/8/9对PbrEXP8a进行均化，也得到了类似的结果。c.利用其余常用RGs(‘commonly used’RGs)对qRT-PCR分析中梨果皮PbrEXP8a的表达水平进行均化后，其相对表达量的趋势呈现出与RNA-seq分析结果不同程度的变化。d.通过计算皮尔森相关系数(R)进行两两相关分析，评估不同内参基因(RGs)归一化后PbrEXP8a相对表达水平趋势的相似性，R值越大相似性越高；结果表明单个梨果皮特异性内参基因(‘PPS’RGs)对PbrEXP8a进行均化后的表达模式与ACT6/7/8/9和NAP1内参组合的均化结果类似，而其余常用RGs(‘commonly used’RGs)的均化结果与它们相似性相对较低。

图19(表1)梨果皮相关转录组信息

图20(表2)候选内参基因及其引物信息

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供了梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏内参基因序列，包括：

(1)NAP1基因转录本如序列表SEQ ID NO：1所示；

(2)BPS1基因转录本如序列表SEQ ID NO：2所示；

(3)Alba-like1基因转录本如序列表SEQ ID NO：3所示；

(4)UBC32基因转录本如序列表SEQ ID NO：4所示；

(5)ACT6/7/8/9基因转录本如序列表SEQ ID NO：5所示。

实施例2

本实施例提供了一组梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏内参基因筛选方法，包括如下步骤：

从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。梨果皮是果实品质和商品性的重要组成部分，是最能引起注意的果实性状(图1)，本发明是关于梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏的内参基因筛选。

1、本发明所提供的候选内参基因是基于砀山酥梨(P.bretschneideri)基因组和梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏相关转录组分析获得

1.1)目前，在梨果皮qRT-PCR研究中，最常使用的内参基因(RGs)包括：Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA，本发明将其定义为常用内参基因(‘commonly used’RGs)；

1.2)关于Actin、EF1α、TUB、UBI和GAPDH家族中是否存在更优秀的RGs成员尚未进行调查，为了解决这个问题，本发明通过搜索砀山酥梨基因组，发现在Actin,Tubulin,EF1α,GAPDH和UBI的基因家族中分别包括12,16,7,7和2个成员(图2-图6)。基于梨与拟南芥蛋白序列的系统发育树聚类和保守功能区域分析，本发明使用拟南芥的命名规则为这些基因家族成员进行重命名。

1.3)本发明获取了公开可用的梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理RNA-seq数据。本发明从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)收集到6个数据集，总共54个转录组数据，其中包括“Starkrimson,”“Starkrimson mutant,”“Bartlett”梨品种果皮发育实验、“Chili”和“Meirensuli”梨品种果皮套袋实验和“Bartlett”梨品种低温贮藏实验。54个转录组源数据拼接到砀山酥梨基因组计算基因表达量(RPKM值，RPKM值越高表达丰度越高)，拼接率均在71.02％以上，表明RNA-seq源数据可靠性较高(表1)。在筛选合格内参基因方面，本发明考虑了两个主要因素:(i)基因具有一定的表达丰度，即RPKM值≥100，RPKM值代表基因表达量，RPKM值越高，基因表达量越高；(ii)基因具有一定的表达稳定性，即CoV值≤0.2，CoV值是衡量基因表达稳定性的指标，CoV值越低，基因表达越稳定。如果候选基因在6个转录组数据集的平均RPKM值和CoV值同时满足这两条件，则该基因可作为梨果皮基因表达研究的候选内参基因(RGs)。经筛选，共有8个基因在传统基因家族成员里脱颖而出，分别是ACT6,ACT7,ACT8,ACT9,EF1α2,GAPDH7,TUA6和TUA7(图7)。本发明将ACT6,EF1α4,UBI2,TUB5和GAPDH7定义为常用内参基因(‘commonly used’RGs)，将其余基因定义为传统看家内参基因(‘traditional’HKGs)。

1.4)为了进一步在基因组范围内筛选梨果皮中更优质的内参基因(RGs)，并且这些基因能在广泛的梨品种中适用为果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理研究的内参基因，本发明采取了更加严格的筛选标准，(i)RPKM≧100；(ii)CoA≦0.15；若候选基因在每个转录组数据集中的平均RPKM值和CoV值同时满足以上条件，则该基因可作为梨果皮中的候选内参基因(RGs)。经过筛选，在全基因范围内有4个新基因选作为候选内参基因(RGs)(图8a)。这些基因包括BYPASS蛋白1(BYPASS protein 1,BPS1)；核小体组装蛋白1(NucleosomeAssembly Protein 1,NAP1)；Alba DNA/RNA-结合蛋白1(Alba DNA/RNA-binding protein1,Alba-like1)和泛素-结合蛋白32(ubiquitin-conjugating enzyme 32，UBC32)(图8b)。本发明将这些候选内参基因命名为梨果皮特异性内参基因(‘Pear Peel Specific’Reference Genes，‘PPS’RGs)。

2、本发明利用转录组数据(RNA-seq)检测候选内参基因(RGs)在梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中表达稳定性

为了比较这些候选基因在转录组数据(RNA-seq)中的表达稳定性，本发明将‘PPS’RGs与‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs进行了比较。

2.1)首先，计算每个基因在6个转录组数据集中的表达变化率(每个样本的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到基因在果皮中的相对表达量)。结果表明，在54个转录组数据库中，ACT6/7/8/9表达最稳定，剩余的‘commonly used’RGs表达最不稳定；相比之下，大多数‘traditional’RGs表达更为稳定，而‘PPS’RGs表现出更好的表达稳定性(图9)。

2.2)其次，依据候选内参基因(RGs)在在转录组数据中变异度，即CoV值的大小，对候选内参基因(RGs)在6组转录组实验系中进行表达稳定性排序，CoV值越小，基因表达越稳定排名越靠前，从而得到6个候选基因表达稳定性排行。随后利用RankAggreg程序(一种使用非加权无监督算法的秩聚合方法)融合这6个排行，得到一个综合排名，结果表明除了ACT6/7/8/9，‘PPS’RGs的表达稳定性优于‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs，表达稳定性最好的两个基因是ACT6/7/8/9和NAP1；相比之下，排名最后的是剩余的‘commonlyused’RGs，这暗示它们的表达稳定性可能更差(图8c)。

2.3)同时，本发明利用geNorm软件(利用稳定值M评估基因表达的稳定度的软件，M值越低，基因表达越稳定)，对候选内参基因(RGs)的所有RNA-seq数据进行分析获得稳定度排行，该分析所得排名结果与RankAggreg分析结果大体一致(图8d)。RNA-seq数据的相关分析结果表明，ACT6/7/8/9及‘PPS’在梨果皮中的稳定度优于‘traditional’HKGs和剩余的‘commonly used’RGs。

2.4)此外，本发明对所获得的4个新候选内参基因进行简要的基因功能分析(图10)，暗示了这些基因在梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中发挥基础性作用。

3、本发明利用qRT-PCR分析验证候选内参基因(RGs)在梨果皮发育和采后低温贮藏处理中的表达稳定性

本发明将梨果实发育过程划分为15个阶段，分别是开花后第7、19、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、110、117(成熟期)天，我们同时对‘翠冠’梨的发育过程和低温贮藏过程进行追踪观察(图11)。在进行qRT-PCR实验之前，本发明对所有样品的RNA进行质量检测，结果表明RNA优质合格(图12)。本发明引用了前人用于梨果皮研究的ACT6/7/8/9,EF1α4,UBI2,TUB5,GPDH7和18S rRNA的引物，同时为其余的候选内参基因(RGs)设计了新的引物，并对所有引物的PCR效率和特异性进行全面评估，结果均显示合格(表2，图13)。本发明的qRT-PCR分析按照如下策略检测候选内参基因(RGs)在梨果皮中的表达稳定度(图14)：本发明使用不同的评估软件筛选最优内参基因(RGs)。首先，评估了每个候选内参基因(RGs)引物的效率和特异性；其次，利用qRT-PCR分析所得的CT值评估候选内参基因(RGs)在样品中的表达丰度及变化幅度；随后，评估候选内参基因(RGs)的表达稳定性，分别使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算它们的稳定度(M)、稳定性(Stab)、标准差(SD)和变异度(CoV)和几何平均值(GM)，这些值越低对应越高的基因表达稳定度，由此得出候选内参基因(RGs)稳定度的4个排行；接着，利用RankAggreg将不同软件所得排行结果进行加权合并，得到候选内参基因(RGs)的综合排名，确定最稳定的内参基因；同时，通过geNorm软件对候选内参基因(RGs)进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定基因均化所需的最少的内参基因(RGs)组合个数。最后，综合表达丰度、表达稳定度以及最佳内参基因(RGs)组合个数评估，推荐在梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理中最优质的内参基因(RGs)组合。

具体方法如下：

3.1)为了评估候选内参基因(RGs)的表达丰度，本发明分析了其在qRT-PCR实验中的循环阈值(CT值)，CT值越低，基因表达量越高。候选内参基因(RGs)的CT值从8.72(26-18S)到27.72(UBC32)不等。ACT6/7/8/9和NAP1的变异度最小，分别为0.61和0.84。与其余的‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs相比，‘PPS’RGs表达变异度更低。这些结果表明，在梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中，ACT6/7/8/9和‘PPS’RGs比‘traditional’HKGs和其余‘commonly used’RGs的表达水平更稳定，并具有适宜的表达丰度(图15)。

3.2)qRT-PCR综合分析‘翠冠’梨中候选内参基因(RGs)表达稳定度。通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度(M)、稳定性(Stab)、标准差(SD)和变异度(CoV)和几何平均值(GM)，这些值越低对应越高的基因表达稳定度，由此得出候选内参基因(RGs)稳定度的5个排行(图16a,b,c,d,e)；然后，利用RankAggreg将不同软件所得排行结果进行加权合并，得到候选内参基因(RGs)的综合稳定性排名(图16f)，所得结果与不同软件所得的评估结果基本一致，即ACT6/7/8/9和NAP1是梨果皮中表达最稳定的基因，且‘PPS’RGs的表达比‘traditional’HKGs和剩余‘commonly used’RGs更稳定。这一结论也印证RNA-seq数据的分析结果(图8)。

3.3)在qRT-PCR分析中，利用多个RGs同时对目标基因表达量进行均化能显著提高结果的准确性。因此，本发明尝试确定在梨果皮发育、低温贮藏和套袋处理研究中基因表达量均化步骤中的最佳RGs个数。该方法通过geNorm软件对多重变异量(PV,Vn/n+1)进行分析，一旦引入新基因后标准化因子的配对差异值低于0.15(这是一个普遍接受的PV阈值)，则认为添加RGs数量已不能提高提高均化质量。结果表明，V2/3的PV值(0.130)低于阈值(图17)，因此，在梨果皮中两个RGs(ACT6/7/8/9和NAP1)就能够准确的均化目的基因的表达量。

以上结果显示：本发明首先基于梨基因组范围，结合转录组筛选，获得梨果皮发育、套袋和低温贮藏处理中4个稳定表达的新基因，即BPS1、NAP1、Alba-like1和UBC32；除了ACT6/7/8/9，‘PPS’RGs的表达稳定度在转录组和qRT-PCR比较分析中均优于‘traditional’HKGs和其余‘commonly used’RGs(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA)。利用geNorm程序进行多重变异量(PV,Vn/n+1)分析，得到作为梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中基因表达分析的最佳内参基因组合为ACT6/7/8/9和NAP1。这项研究结果为梨果皮的基因表达研究提供了更有用、更可靠的内参基因(RGs)资源，可用于广泛梨品种中果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理的基因表达分析。

实施例3

本实施例提供了一组梨果皮发育过程、套袋和采后低温贮藏处理中内参基因的应用，包括如下步骤：

本发明利用梨果皮中PbrEXPA8a的表达模式验证以上分析所推荐内参基因(RGs)的实用性

1.1)扩张蛋白(Expansins，EXP)在梨果皮中具有延长细胞生长及降解细胞壁等重要作用。结合梨基因组和RNA-seq数据，本发明鉴定到一个EXP基因(PbrEXPA8a)的表达谱与不同梨品种的果皮发育及采后低温贮藏密切相关。详细调查发现，PbrEXPA8a的表达量在梨果实的分裂前期升高，在分裂后期急剧上升并达到峰值，成熟期后逐渐降低。在采后低温贮藏处理中，PbrEXPA8a的表达量先上升后下降(图18)。这些结果表明PbrEXPA8a在不同梨品种的果皮发育、套袋和采后低温贮藏中具有延长细胞生长及降解细胞壁的作用。因此，本发明利用PbrEXPA8a在梨果皮发育过程和采后低温贮藏处理中的表达模式验证筛选所得RGs的可靠实用性。

1.2)在‘翠冠’梨果皮基因表达研究中，以ACT6/7/8/9和NAP1的内参组合在qRT-PCR分析中对PbrEXPA8a的相对表达水平均化后的结果与图18a中的RNA-seq数据得出的PbrEXPA8a表达趋势相似(图18b)；同时，利用ACT6/7/8/9或单个梨果皮特异性内参基因(‘PPS’RG)对PbrEXPA8a进行均化，也得到了类似的结果(图18b)。然而，利用其余的‘commonly used’RGs对PbrEXPA8a的表达水平进行均化后，其表达趋势呈现出与RNA-seq分析结果不同程度的变化(图18c)；通过计算皮尔森相关系数(R)进行两两相关分析，评估不同内参基因(RGs)归一化后PbrEXPA8a相对表达水平趋势的相似性，R值越大，相似性越高；结果表明ACT6/7/8/9和单个‘PPS’RGs对PbrEXPA8a进行均化后的表达模式与ACT6/7/8/9和NAP1内参组合的均化结果类似，而其余的‘commonly used’RGs的均化结果与它们相似性相对较低(图18d)。因此，这些结果证实了ACT6/7/8/9和‘PPS’RGs，尤其以ACT6/7/8/9和NAP1内参组合最适合作为梨果皮发育、套袋和采后低温贮藏处理中基因表达均化的内参。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

<110>福建农林大学

<120> 一组梨果皮qRT-PCR内参基因及其引物和应用

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1 atgagcagcg acaaggataa catcaacatg tccgatctct cctctgctct caacgacgtg

61 gatcgagccg gcctcgttaa tgctctcaaa aataagatag agagtctggc cgggcagcac

121 tctgatatcc tcgagagcct atcgcctgtt gtcagaaagc gcgtcgatgt tcttagagaa

181 atccagaccc aacatgatga acttgaggca aagtttttcg aggagagagc agctctcgaa

241 gctaagtatc agaaattgta tcaacctttg tataccaaga gatacgagat cgtaaatggt

301 gttgttgaag ctgaaggcgt tactaatgaa gcagcaacag atgaagaggg agtgcctgat

361 ttctggctca atgcaatgaa aaacaacgaa gtgctagctg aggagatatc tgagcgtgat

421 gaaggtgctc ttaaatatct tagagacatc aagtggttta ggatagataa ccctaaggga

481 ttcaaactgg agttctactt tgacaccaat ccctttttta agaactctgt cttgacaaag

541 acataccaca tgattgatga agatgaaccc attctcgaga aagcaatagg gaccgagatt

601 gaatggtatc ctgctaaatg cttgacacag aagcttctta agaagaagcc taagaaggga

661 tctaagaatg ctaagccaat aactagaact gaaaattgcg aaagtttctt caactttttc

721 agtccacctc aagtccctga ggacgatgaa gatattgatg aagatgctgc tgaggaactc

781 caaaaccaga tggaacaaga ttatgacatt gggtctacca ttcgagataa gatcatccct

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301 ttggacatca gtgtgaagtt gcttgatgta tgcattgctt ttagctctga gatctcacgt

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481 ggaaggttta gagggaatgg ctatgtctca actgaatatg acgatggagg ctatgaccgc

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361 atgcctacca acccaaatgg tgcgttaggt tcactggaat ataagaagga agaaaggcgt

421 gccctggcta tcaaatctcg tgcagcagcc ccaagatatg gcactgatga acgccagaag

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361 atgacccaaa tcatgtttga gaccttcaat gtgcctgcca tgtatgttgc catccaggcc

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481 gtgagtcaca ctgtgccaat ctatgaaggt tatgccctcc ctcatgccat ccttcgtctg

541 gaccttgctg gtcgtgacct aacagattct ttgatgaaaa ttctcactga aagagggtac

601 atgttcacca ctactgctga acgggaaatt gtccgtgata tgaaggagaa gcttgcatat

661 gttgctctgg actatgagca agaacttgag actgccaaga gcagctcttc agttgagaag

721 aactatgagc ttcccgatgg ccaagtcatc acaattggag ctgagagatt ccggtgccca

781 gaagtcctct tccaaccatc tcttattgga atggaagctg ctggcattca tgagactact

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Claims

1.一种梨果皮qRT-PCR内参基因组在梨果皮的发育过程、套袋和采后低温贮藏过程中作为梨果皮稳定内参基因组的应用，其特征在于，所述内参基因组由NAP1基因和ACT6/7/8/9基因组成；NAP1的基因序列如SEQ ID NO：1所示，ACT6/7/8/9的基因序列如SEQ ID NO：5所示。