CN111118197B

CN111118197B - 一组梨果肉qRT-PCR内参基因及其引物和应用

Info

Publication number: CN111118197B
Application number: CN202010067118.1A
Authority: CN
Inventors: 陈建清; 宋娟娟; 陈昌妹; 刘悦滢; 陈之一; 周金玉; 陈清西
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111118197A

Abstract

本发明提供一组梨果肉qRT‑PCR内参基因及其引物和应用，分别是RABF2b、ALFIN‑like1、BPS1和ICDH1，其中BPS1和ICDH1可作为最优内参基因组合用于梨果肉基因表达分析。本发明基于基因组和转录组筛选出的4个新内参在梨果肉发育过程中表达稳定度优于传统内参基因(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26‑18S rRNA)；从4个新内参中开发了一对BPS1和ICDH1内参组合，用于梨果肉发育过程中基因表达均化效果最佳；4个新内参及所开发的一对BPS1和ICDH1内参组合可应用于广泛梨品种的果肉发育过程的基因表达研究。

Description

一组梨果肉qRT-PCR内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及4个可用于广泛梨品种果肉发育过程中基因表达分析的新内参，其中推荐BPS1和ICDH1作为最优内参基因组合用于广泛梨品种果肉发育过程的基因表达分析。

背景技术

梨(Pyrus L.)世界上最具经济价值的水果之一，大体可分为西方梨和东方梨两大类。由于砀山酥梨(P.bretschneideri)已完成基因组测序(～512Mb)，因此成为研究梨属植物的模式植物。梨果实发育过程分为坐果期，分裂期，膨大期，成熟期和衰老期。从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。膨大的花托变成梨果实的肉质部分，是其主要的食用部分。果实发育的调控机制是广大植物学家和育种工作者共同关心的问题，而这需要从广泛而全面的分子层面进行研究。基因表达定量分析是解决复杂的基因网络调控的关键。由于实时荧光定量PCR(Quantitativereverse-transcription PCR,qRT-PCR)的特异性、高灵敏度和可重复性，其成为基因表达分析的首要方法，而精确的转录均化是获得可靠的qRT-PCR结果的基础。因此，该方法需要特定实验条件下稳定表达的内参基因(Reference Genes，RGs)对靶基因进行数据均化，未能使用合适的RGs可能导致真实的基因表达量出现偏差和低重复率。

由于看家基因(Housekeeping Genes，HKGs)在细胞中的基础作用和稳定的表达水平，在qRT-PCR分析中常常将其作为均化目的基因表达量的RGs。目前，在梨果肉的qRT-PCR研究中，最常用的六个传统HKGs是Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA。然而，这些传统HKGs的表达稳定性并没有经过系统验证，仅仅是基于它们在任何条件下都有恒定的表达水平的假设，就被应用于梨果肉的研究。越来越多的证据表明，在一定条件下，包括在不同的发育阶段，传统HKGs的稳定性会出现相当大的波动。例如，传统HKGs在拟南芥种子和花粉中出现了较高的变异系数CoV值(衡量基因表达稳定性的指标，CoV值越低表达越稳定)。这说明，传统的HKGs并不能广泛适用于所有的实验条件，对特定实验条件下RGs的表达稳定性进行综合评估是十分必要的。为此，研究人员开发了geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder等软件，用于统计分析以筛选出表达最稳定的RGs。在前人的研究中，wu等人对梨果肉发育过程中的8个HKGs进行表达稳定性评估，最终推荐GAPDH和TUB-b2为最佳内参基因；而Imai等人的研究结果表明EF1α和TIP41是梨果肉基因表达研究中最佳RGs。

转录组分析广泛应用于植物复杂分子过程的研究。RNA-seq作为一种全局性的评估技术，以其大数据集、高通量和敏感性的优势提供了一个极具代表性的样品转录组快照。利用RNA-seq数据集来筛选在不同条件下稳定表达的RGs，已成功应用在拟南芥、小麦和番茄等植物中。目前，梨果肉的相关研究产生的大量RNA-seq数据集为筛选果肉的最理想RGs提供了丰富的资源。

现有技术存在的问题：

目前，在梨果肉研究中常使用的内参主要为Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA，这六个传统内参基因一般作为单内参在果肉发育过程中用于均化目标基因表达量。

主要缺陷在于：

1)这些传统内参基因在梨果肉发育研究中的应用仅是参考其他物种，而没有在基因组范围内进行系统的表达稳定度比较验证，而且众多研究表明这些传统内参基因在其他物种的组织发育过程中表达不稳定；

2)目前，在梨果肉发育过程的基因表达研究中仅使用单内参进行均化，而缺乏更精准的多内参组合应用；

3)缺乏一种合适的内参基因体系适用于广泛梨品种范围内果肉发育基因表达研究。

因此，有必要尽快基于广泛的转录组数据，在全基因组范围内确立一种合适的内参基因体系以解决梨果肉中传统内参稳定性差，基因表达量均化效果不理想的问题。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供一组梨果肉qRT-PCR内参基因及其引物和应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一组梨果肉qRT-PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为RABF2b基因、ALFIN-like1基因、BPS1基因、ICDH1基因；RABF2b基因转录本如序列表SEQ ID NO：1所示；ALFIN-like1基因转录本如序列表SEQ ID NO：2所示；BPS1基因转录本如序列表SEQ ID NO：3所示；ICDH1基因转录本如序列表SEQ ID NO：4所示。

上述4个基因可作为广泛梨品种果肉发育过程中基因表达分析的新内参基因，其中推荐BPS1和ICDH1作为最优内参组合用于广泛梨品种果肉发育过程中基因表达分析。

本发明还提供了上述的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：(1)砀山酥梨基因组和梨果肉发育过程相关的转录组分析获得候选内参基因；(2)利用转录组数据检测候选内参基因在梨果肉发育过程中的表达稳定性；(3)利用qRT-PCR分析验证候选内参基因在梨果肉发育过程的表达稳定性。

优选的，上述步骤(1)包括：(1)定义在梨果皮qRT-PCR研究中使用的内参基因包括：：Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18S rRNA；(2)获取梨果肉发育过程RNA-seq数据，从NCBI收集到6个数据集，总共35个转录组数据；(3)将SAND1、Ann4、TIP1、HTR13、RPL27.9、TUA1和TUA2基因定义为传统看家内参基因。(4)以FPKM值≥100，CoV值≤0.15的标准，在转录组数据中筛选筛选候选内参基因。

优选的，上述步骤(2)包括：(1)以每个候选内参基因的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到该候选内参基因在果皮中的相对表达量；(2)依据候选内参基因在在转录组数据中变异度，对候选内参基因进行表达稳定性排序；随后使用RankAggreg程序，融合所有排序，得到一个综合排序，对其稳定度进行综合性评估；(3)利用geNorm软件，利用稳定值M评估基因表达的稳定度，对候选内参基因的所有RNA-seq数据进行分析获得稳定度排行；(4)对新候选内参基因进行基因功能分析。

优选的，上述步骤(3)包括：(1)分析候选内参基因在qRT-PCR实验中的循环阈值；(2))通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度、稳定性、标准差和变异度和几何平均值；(3)通过geNorm软件对候选内参基因进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定基因均化所需的最少的内参基因组合个数。

有益效果：

1)基于基因组和转录组筛选出的4个新内参在梨果肉发育过程中表达稳定度优于传统内参基因(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18S rRNA)；

2)从4个新内参中开发了一对BPS1和ICDH1内参组合，用于梨果肉发育过程中基因表达均化效果最佳；

3)4个新内参及所开发的一对BPS1和ICDH1内参组合可应用于广泛梨品种的果肉发育过程的基因表达研究。

附图说明

图1梨果实构造图

从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。

图2梨Actin基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出9个Actin基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥Actin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00022的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrACT6(基因登入号：JN684184)和PbrACT3(基因登入号：AF386514)是梨果肉qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图3梨Tublin基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出7个Tublin基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥Tublin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00091和PF03953的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域。PbrTUB5(基因登入号：AB239681)是梨果肉qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图4梨EF1α基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出6个EF1α基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥EF1α基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00009、PF03144和PF03143的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrEF1α4(基因登入号：AY338250)是梨果肉qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图5梨GAPDH基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出7个GAPDH基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥GAPDH基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF02800和PF00044的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrGAPDH7(基因登入号：AB266449)是梨果肉qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图6梨UBI基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出2个UBI基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥UBI基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF01599.18和PF00240.22的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrUBI2(基因登入号：AF386524)是梨果肉qRT-PCR研究中常用的内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图7梨Annexin基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出12个Annexin基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥Annexin基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF0019的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrAnn4(基因登入号：AB826126)是Imai等人研究中的候选内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图8梨HTR基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出15个HTR基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥HTR基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00125的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrHTR13(基因登入号：AB824718)是Imai等人研究中的候选内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图9梨RPL27基因家族鉴定

图中，砀山酥梨基因组中共鉴定出14个RPL27基因。本发明采用最大似然法(ML)构建梨和拟南芥RPL27基因的系统发育树。结构域分析表明，Pfam标号为PF00828、PF01777和PF01016的结构域在梨和拟南芥中具有高度保守性。本发明利用InterProScan工具获得保守结构域注释。PbrRPL27.9(基因登入号：AF195213)是Imai等人研究中的候选内参基因。图中，At代表拟南芥，Pbr代表梨，aa为氨基酸单位。

图10梨传统内参基因家族表达丰度和表达变异度分析

为了在传统内参基因家族中探索是否存在其他合格的内参基因(RGs)用于梨果肉发育过程中基因表达研究，本发明在6个转录组数据集(总共包括35个转录组)中评估候选内参基因的表达稳定度(CoV，变异系数)和表达丰度(RPKM，每百万Reads中来自于某基因每千碱基长度的Reads数)，以CoV≤0.2，RPKM≥100为阈值筛选标准。通过对8个传统内参基因家族成员的表达稳定度和表达丰度的进行统计分析，若CoV和RPKM的数据中值符合阈值筛选标准，即认定为本发明的候选内参基因。CoV分析如图左侧所示，RPKM分析如图右侧所示。箱型图中的每个数据点来自一个RNA-seq数据集，黑线表示中值，虚线表示筛选阈值。

图11基因组范围内鉴定4个稳定表达的新内参候选基因

为了在基因组范围内探索是否存在更优质的内参基因(RGs)用于梨果肉发育过程中基因表达研究，本发明将筛选标准(CoV≤0.15，RPKM≥100)应用于6个转录组数据集(RNA-seq)中，若该基因在每个转录组数据集中同时满足以上筛选标准，即被认可为新候选内参基因。a.维恩图显示了从梨基因组中筛选得到的4个新候选内参基因。b.基于6个RNA-seq数据集，我们将所有候选内参基因进行分组，(1)梨果肉发育特异性RGs(‘PFDS’RGs)；(2)常用RGs(‘commonly used’RGs)；(3)传统HKGs(‘traditional’HKGs)。对所有候选内参基因进行CoV值和RPKM值统计分析。RPKM分析如图右侧所示，CoV分析如图左侧所示。箱型图中的每个数据点来自一个RNA-seq数据集，黑线表示平均值，虚线表示筛选阈值。c.根据候选内参基因在每个RNA-seq数据集中的表达稳定性排名(根据CoV值高低排名，CoV值越低排名越高)，依此在6个RNA-seq数据集中获得关于候选内参基因的表达稳定性排名表。接着，使用RankAggreg程序对这6个表达稳定性排名表进行聚合，得到一个综合排名。结果表明4个新候选内参基因的稳定性明显优于常用RGs和传统HKGs。d.本发明也使用geNorm软件通过计算每个基因的稳定值(M)来衡量其表达稳定性。M值越低基因表达稳定性越好。结果表明geNorm分析的排名趋势与RankAggreg分析结果相似。综上，RNA-seq数据分析结果表明，4个新候选内参基因的表达稳定性优于常用RGs和传统HKGs。注:由于26-18SrRNA没有在梨基因组上被注释出来，因此在转录组分析中没有对其进行分析。

图12候选内参基因表达变化率

图中，18个候选内参基因(RGs)在35个与梨果肉发育相关的RNA-seq文库(包括6个转录组数据集)中的表达变化率。每个基因的相对表达变化率是由每个文库的表达值(RPKM值)除以每个转录组数据集中的平均表达水平(平均RPKM值)得到的。

图13模式图简析新候选内参基因功能

本发明简要分析了4种新内参基因的细胞功能。a.BPS1的功能模型。BPS1能够阻止由根系产生的过量移动信号传输到茎，这种移动信号足以阻止茎和根的发育。b.ICDH1的功能模型。它能够可逆地催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成2-氧戊二酸(2OG)，催化NADP⁺生成NADPH。c.RabF2b介导的核内体/液泡转运途径机制。RabF2b由VPS9a催化，定位于液泡前体/多泡体(PVC/MVB)。内吞和液泡转运通路(TNG:trans-Golgi Network)都需要RabF2b。d.Alfin-like1调控染色体的机制。Alfin-like1通过PHD finger与活性组蛋白标志物(h3k4m3/2)结合，参与染色质调控。

图14qRT-PCR分析中梨样品说明

在本发明中，用于qRT-PCR分析的梨果肉样品采自‘翠冠’梨品种，梨果肉样品分别在开花后第7、19、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、110和117天15个发育阶段进行采收。

图15qRT-PCR分析中梨样品RNA质量分析

本发明对梨果肉样品RNA的质量进行分析。a.通过琼脂糖凝胶电泳试验检测样品RNA的完整性。核糖体RNA条带清晰可见，说明RNA的完整性。b.利用Nanodrop工具测定样品RNA的OD 260/280比值，进一步评估RNA质量，所有的比值都接近2，表明RNA质量良好。

图16qRT-PCR分析中候选内参基因的引物特异性分析

本发明对候选内参基因(RGs)的引物特异性进行分析。a.qRT-PCR中候选RGs引物的熔融曲线分析，所有引物只产生一个峰值，说明引物具有特异性。b.利用2.5％琼脂糖凝胶对qRT-PCR中PCR产物进行电泳分析，发现仅有单一条带且与预测的产物大小一致。两种分析都证实了本研究中引物具有特异性。

图17qRT-PCR分析中筛选最优内参基因的策略图

图中，本发明使用不同的评估软件筛选最优内参基因(RGs)。首先，评估了每个候选RGs的引物效率和特异性；其次，分析候选内参基因(RGs)在样品中的表达丰度及变化幅度(CT值)；随后，分别使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度(M)、稳定性(Stab)、标准差(SD)、变异度(CoV)和几何平均值(GM)，评估其表达稳定性，这些值越低对应越高的基因表达稳定度，由此得出候选内参基因(RGs)稳定度的5个排行；然后，利用RankAggreg将不同软件的排行结果进行加权合并，得到候选内参基因(RGs)的综合排名，确定最稳定的内参基因；同时，利用geNorm软件对候选内参基因(RGs)进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定qRT-PCR数据均化所需的最少的内参基因(RGs)组合个数。最后，综合表达丰度、表达稳定度以及最佳内参基因(RGs)组合个数评估，推荐在梨果肉发育过程中最优内参基因(RGs)组合。

图18qRT-PCR分析中候选内参基因表达丰度与变化幅度分析

图中，本发明对梨果肉发育过程中候选内参基因(RGs)在qRT-PCR分析中的表达丰度(CT值，CT值越低，基因表达量越高)进行评估分析。箱型图显示了18个候选内参基因(RGs)的CT值变化。箱型图中的水平线表示所有样品中CT值的中值，箱型上限和下限分别表示样品中基因CT值第25和第75百分位数的值。上下Bar端表示基因在样品中基因CT值的最小值和最大值。

图19qRT-PCR综合分析‘翠冠’梨中内参基因表达稳定度

图中，为了评估候选内参基因(RGs)的表达稳定性，基于候选内参基因(RGs)在‘翠冠’所有样品中的CT值，使用geNorm(a)、NormFinder(b)、BestKeeper(c、d)和RefFinder(e)程序计算了基因稳定度(M)(a)、稳定性(Stab)(b)、标准差(SD)(c)、变异系数(CoV)(d)和几何平均值(GM)(e)。使用RankAggreg程序对以上四种软件获得的稳定性排名进行合并，得到一个综合的候选RGs排名(f)。

图20qRT-PCR数据均化所需的最少RGs组合个数分析

本发明通过geNorm软件对候选内参基因(RGs)进行两两变异(PV,Vn/Vn+1)系数分析，以确定qRT-PCR数据均化所需的最少的内参基因(RGs)组合个数。如果n个基因组合后，其PV值低于0.15(这是一个普遍接受的推荐阈值)，就认为继续增加内参基因数量将不能提高均化效果。该分析表明梨果肉发育过程中最优内参基因(RGs)组合为BPS1和ICDH1。

图21基于PbrCAD1转录变化验证候选内参基因实用性

a.基于RNA-seq分析，PbrCAD1的表达量在不同亚洲梨品种中的分裂期升高，膨大期达到高峰，达到成熟期后逐渐降低。b.以BPS1与ICDH1的内参组合在qRT-PCR分析中对‘翠冠’梨果肉发育过程中PbrCAD1的相对表达水平均化结果与(a)中的RNA-seq数据分析得出的PbrCAD1表达趋势相似。同时，利用单个梨果肉发育特异性RG(‘PFDS’RG)对PbrCAD1进行均化，也得到了类似的结果。c.利用常用RGs(‘commonly used’RGs)对qRT-PCR分析中梨果肉发育过程中PbrCAD1的表达水平进行均化后，其相对表达量的趋势呈现出与RNA-seq分析结果不同程度的变化。d.通过计算皮尔森相关系数(R)进行两两相关分析，评估不同内参基因(RGs)归一化后PbrCAD1相对表达水平趋势的相似性，R值越大相似性越高；结果表明单个梨果肉发育特异性内参基因(‘PFDS’RGs)对PbrCAD1进行均化后的表达模式与BPS1和ICDH1的内参组合的均化结果类似，而常用RGs(‘commonly used’RGs)的均化结果与它们相似性相对较低。

图22(表1)梨果肉发育相关转录组信息

图23(表2)候选内参基因及其引物信息

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供了一组梨果肉qRT-PCR内参基因，包括：内参基因为RABF2b基因、ALFIN-like1基因、BPS1基因、ICDH1基因；RABF2b基因转录本如序列表SEQ ID NO：1所示；ALFIN-like1基因转录本如序列表SEQ ID NO：2所示；BPS1基因转录本如序列表SEQ ID NO：3所示；ICDH1基因转录本如序列表SEQ ID NO：4所示。

实施例2

本实施例提供了一组梨果肉发育过程内参基因筛选方法，包括如下步骤：

从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。膨大的花托变成梨果实的肉质部分，是其主要的食用部分(图1)，本发明是关于梨果肉发育过程内参基因筛选。

1、本发明所提供的候选内参基因(RGs)是基于砀山酥梨(P.bretschneideri)基因组和梨果肉发育相关转录组分析获得

1.1)目前，在梨果肉qRT-PCR研究中，最常使用的六种内参基因(RGs)包括：Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18S rRNA，本发明将其定义为常用内参基因(‘commonly used’RGs)；

1.2)2012年，wu等人评估了EF1α,TUB-b2,GAPDH,18S rRNA,RP-L27P,UBI,ACT和ACT2在梨果肉发育过程中的表达稳定性，最终推荐GAPDH和TUB-b2为最佳RGs；2014年，Imai等人评估了8个传统内参基因(HKGs)在梨果肉发育过程中的表达稳定性，分别是Tubulin,Histone H3,Actin,EF1α,GAPDH,Annexin,SAND和TIP41，评估结果表明EF1α和TIP41是梨果肉基因表达研究中的最佳RGs。然而，他们各自家族中是否存在其他合格的RGs成员尚未进行调查。为了解决这个问题，本发明搜索砀山酥梨(P.bretschneideri)基因组，发现在Actin,Tubulin,EF1α,GAPDH,UBI,Annexin,HTR,RPL27,SAND和TIP的基因家族中分别有12,16,7,7,2,12,15,14,1和1个成员(图2-图9)。基于对梨和拟南芥蛋白序列的系统发育树聚类和保守区域功能分析，本发明使用拟南芥的命名规则为这些基因家族成员进行重命名。

1.3)本发明获取了公开可用的梨果肉发育过程RNA-seq数据。本发明从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)收集到6个数据集，总共35个转录组数据，包括了“Kuerlexiangli,”“Yali,”“Xueqingli,”“Dangshansuli”和“Lianglizaosuli”等5个亚洲梨品种的6个果肉发育实验系列。35个转录组源数据拼接到砀山酥梨基因组计算基因表达量(RPKM值，RPKM值越高表达丰度越高)，拼接率均在70.07％以上，表明RNA-seq源数据可靠性较高(表1)。在筛选合格内参基因时，本发明考虑了两个主要因素:(i)基因具有一定的表达丰度，即RPKM值≥50，RPKM值代表基因表达量，基因表达量越高，RPKM值越高；(ii)基因具有一定的表达稳定性，即CoV值≤0.2，CoV值是衡量基因表达稳定性的指标，CoV值越低，基因表达越稳定。若候选基因在6个转录组数据集的平均RPKM值和CoV值同时满足条件，则该基因可作为梨果肉发育中的候选内参基因(RGs)。经筛选，只有TUA1和TUA2符合条件(图10)。因此，本发明将ACT3,ACT6,EF1α4,UBI2,TUB5,GAPDH7和18SrRNA定义为常用内参基因(‘commonly used’RGs)，将前人研究中的候选基因SAND1,Ann4,TIP1,HTR13,RPL27.9以及符合上述条件的TUA1和TUA2基因定义为传统看家内参基因(‘traditional’HKGs)。

1.4)为了进一步在基因组范围内筛选梨果肉发育过程中更优质的内参基因(RGs)，并确保其能在广泛的梨品种中适用于果肉发育基因表达分析，本发明将以上筛选标准(RPKM≧100；CoA≦0.2)应用于6个转录组数据集的所有基因。经筛选，在全基因范围内有4个新基因被选为候选内参基因(RGs)(图11a)。这些基因包括BYPASS1(BPS1)；ALFIN-likeprotein 1(Alfin-like1)；Rab GTPase homolog F2b protein(RABF2B)和NADP-specificisocitrate dehydrogenase 1(ICDH1)(图11b)。本发明将这些候选内参基因命名为梨果肉发育特异性内参基因(‘Pear Flesh Development Specific’Reference Genes，‘PFDS’RGs)。

2、本发明利用转录组数据(RNA-seq)检测候选内参基因(RGs)在梨果肉发育过程中表达稳定性

为了比较这些候选基因在转录组数据(RNA-seq)中的表达稳定性，本发明将‘PFDS’RGs与‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs进行比较。

2.1)首先，计算每个基因在6个转录组数据集中的表达变化率(每个样本的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到基因在果肉发育过程中的相对表达量)。结果表明，在35个转录组数据库中，‘commonly used’RGs表达最不稳定；相比之下，少数‘traditional’HKGs表达更为稳定；然而，‘PFDS’RGs表现出更高的稳定表达水平(图12)。

2.2)其次，依据候选内参基因(RGs)在转录组数据中的变异度，即CoV值的大小，对候选内参基因(RGs)在6组转录组实验系中进行表达稳定性排序，CoV值越小基因表达越稳定，排名越靠前，从而得到6个候选基因表达稳定性排行。接着，利用RankAggreg程序(一种使用非加权无监督算法的秩聚合方法)融合这6个排行，得到一个综合排名。结果表明，在梨果肉发育中表达最稳定的是两个‘PFDS’RGs，BPS1和ICDH1；相比之下，排名最后的是‘commonly used’RGs，这表明它们的表达稳定性较差(图11c)。

2.3)同时，本发明利用geNorm软件(利用稳定值M评估基因表达稳定度的软件，M值越低，基因表达越稳定)，对候选内参基因(RGs)的所有RNA-seq数据进行分析获得稳定度排行，该分析所得排名结果与RankAggreg分析结果大体一致(图11d)。这些RNA-seq数据的相关分析结果表明，‘PFDS’RGs在梨果肉发育过程中的稳定度优于‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs。

2.4)此外，本发明对4个新候选内参基因进行简要的基因功能分析(图13)，暗示了这些基因在梨果肉整个发育过程中发挥基础性作用。

3、本发明利用qRT-PCR分析验证候选内参基因(RGs)在梨果肉发育过程中的表达稳定性

本发明将梨果肉发育过程划分为15个阶段，分别是开花后第7、19、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、110、117(成熟期)天，我们同时对‘翠冠’梨的发育过程进行追踪观察(图14)。在进行qRT-PCR实验之前，本发明对所有样品的RNA质量进行检测，结果表明RNA优质合格(图15)。本发明引用了前人用于梨果肉研究的内参基因ACT6/7/8/9,ACT3,EF1α4,UBI2,TUB5,GPDH7和18SrRNA的引物，同时为其余的候选内参基因(RGs)设计了新的引物，并对所有引物的PCR效率和特异性进行全面评估，结果均显示合格(表2，图16)。本发明的qRT-PCR分析按照如下策略检测候选内参基因(RGs)在梨果肉中的表达稳定度(图17)：本发明使用不同的评估软件筛选最优质的内参基因(RGs)。首先，评估了每个候选内参基因(RGs)引物的效率和特异性；其次，利用qRT-PCR分析所得的CT值评估候选内参基因(RGs)在样品中的表达丰度及变化幅度；随后，评估候选内参基因(RGs)的表达稳定性，分别使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算它们的稳定度(M)、稳定性(Stab)、标准差(SD)和变异度(CoV)和几何平均值(GM)，这些值越低对应越高的基因表达稳定度，由此得出候选内参基因(RGs)稳定度的4个排行；接着，利用RankAggreg将不同软件所得排行结果进行加权合并，得到候选内参基因(RGs)的综合排名，确定最稳定的内参基因；同时，通过geNorm软件对候选内参基因(RGs)进行两两变异(Vn/Vn+1)系数分析，以确定基因均化所需的最少的内参基因(RGs)组合个数。最后，综合表达丰度、表达稳定度以及最佳内参基因(RGs)组合个数评估，推荐在梨果肉发育过程中最优质的内参基因(RGs)组合。

具体方法如下：

3.1)为了评估候选内参基因(RGs)的表达丰度，本发明分析了其在qRT-PCR实验中的循环阈值(CT值)，CT值越低，基因表达量越高。候选内参基因(RGs)的CT值从9.09(26-18S)到29.99(ACT3)不等。‘PFDS’RGs的平均CT值范围为26.12～27.47，与‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs相比，其表达变化更小(CT值变化范围小于0.8)。这些结果表明，在梨果肉发育过程中，‘PFDS’RGs比‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs的表达更稳定，并且具有适宜的表达丰度(图18)。

3.2)qRT-PCR综合分析‘翠冠’梨中候选内参基因(RGs)表达稳定度。通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件计算候选内参基因的稳定度(M)、稳定性(Stab)、标准差(SD)和变异度(CoV)和几何平均值(GM)，这些值越低对应越高的基因表达稳定度，由此得出候选内参基因(RGs)稳定度的5个排行(图19a,b,c,d,e)；然后，利用RankAggreg将不同软件所得排行结果进行加权合并，得到候选内参基因(RGs)的综合稳定性排名(图19f)，所得结果与不同软件所得的评估结果基本一致，即BPS1和ICDH1是梨果肉发育过程中表达最稳定的基因，且‘PFDS’RGs的表达均比‘commonly used’RGs和‘traditional’HKGs更稳定。这一结论也印证RNA-seq数据的分析结果(图11)。

3.3)在qRT-PCR分析中，利用多个RGs同时对目标基因表达量进行校正和标准化可以显著提高结果的准确性。因此，本发明尝试确定在梨果肉发育中基因表达量均化步骤中的最佳RGs个数。该方法通过geNorm软件对多重变异量(PV,Vn/n+1)进行分析，一旦引入新基因后标准化因子的配对差异值低于0.15(这是一个普遍接受的PV阈值)，则认为再添加RGs的数量已不能提高均化质量。结果表明，V2/3的PV值(0.07)低于阈值(图20)，因此，在梨果肉发育过程中两个RGs(BPS1和ICDH1)就能够准确的均化目的基因的表达量。

以上结果显示：本发明首先基于梨基因组范围，结合转录组筛选，获得梨果肉发育中4个稳定表达的新基因，即BPS1、Alfin-like1、RABF2B和ICDH1；它们的表达稳定度在转录组和qRT-PCR比较分析中均优于‘traditional’HKGs(SAND1,Ann4,TIP1,HTR13,RPL27.9，TUA1和TUA2)和‘commonly used’RGs(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18S rRNA)。利用geNorm程序中的多重变异量(PV,Vn/n+1)分析，得到作为梨果肉发育中基因功能分析的最佳内参基因组合为BPS1和ICDH1。这项研究结果为梨果肉发育的基因表达研究提供了更有用、更可靠的内参基因(RGs)资源，可用于广泛梨品种中果肉发育过程中基因功能分析。

实施例3

本实施例提供了一组梨果肉发育过程内参基因的应用，包括如下步骤：

本发明利用梨果肉中PbrCAD1的表达模式验证以上分析所推荐内参基因(RGs)的实用性

1.1)肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)在梨果实成熟过程中参与了石细胞木质素的生物合成。结合梨基因组和RNA-seq数据，本发明鉴定到一个CAD基因(PbrCAD1)的表达谱与不同梨品种的木质素含量密切相关。详细观察发现，PbrCAD1的表达量首先在梨果实的分裂期升高，在果实的膨大期达到高峰，成熟期后逐渐降低(图21)。这些结果表明PbrCAD1在不同梨品种的果实成熟过程中促进木质素的生物合成。因此，本发明利用PbrCAD1在梨果肉发育过程中的表达模式验证筛选所得RGs的可靠实用性。

1.2)在‘翠冠’梨果肉发育过程中，以BPS1和ICDH1的内参组合在qRT-PCR分析中对PbrCAD1的相对表达水平均化后的结果与图21a中的RNA-seq数据得出的PbrCAD1表达趋势相似(图21b)；同时，利用单个梨果肉发育特异性内参基因(‘PFDS’RGs)对PbrCAD1进行均化，也得到了类似的结果(图21b)。然而，利用‘commonly used’RGs对PbrCAD1的表达水平进行均化后，其表达趋势呈现出与RNA-seq分析结果不同程度的变化(图21c)；通过计算皮尔森相关系数(R)进行两两相关分析，评估不同内参基因(RGs)归一化后PbrCAD1相对表达水平趋势的相似性，R值越大，相似性越高；结果表明单个‘PFDS’RGs对PbrCAD1进行均化后的表达模式与BPS1和ICDH1内参组合的均化结果类似，而‘commonly used’RGs的均化结果与它们相似性相对较低(图21d)。因此，这些结果证实了‘PFDS’RGs，尤其以BPS1和ICDH1内参组合，比‘commonly used’RGs更适合作为梨果肉发育研究中基因表达均化的内参。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

<110>福建农林大学

<120> 一组梨果肉qRT-PCR内参基因及其引物和应用

<160>4

<210>1

<211> 603

<212>DNA

<213>梨(Pyrus L.)

<400> 1

1 atggccaccg ccgggaacaa gaacatcaat gccaaattgg tgcttcttgg ggatgttgga

61 gctgggaagt ctagtctggt gttgcgcttt gtaaaaggac aattcattga atttcaggaa

121 tcaacaatag gtgctgcctt cttctcacaa acattggctg taaacgatgc aactgtaaaa

181 tttgagattt gggatacagc aggtcaagag aggtaccata gtttggcgcc aatgtattac

241 agaggagctg ctgctgcaat tattgtgtat gatttaacaa atcaagcctc atttgagcga

301 gcaaaaaaat gggtcctcga actcaagtca caaggtaacc caaacatggt tatggcacta

361 gctggtaata aagcggatct ggtggaggcc aggaaagtgg cagcagagga tgcacaatca

421 tatgctcaag agaatggcct tttcttcctg gaaacctctg caaaaactgc agacaatgtc

481 aatgacattt tctatgagat agcaaagaga ttacctcgag tgcagcctgt gcagaacccc

541 gcaggaatgg ttcttatgga cagaccttct gaaagggtgg caagctcgtc ttgttgctca

601 tag

<210>2

<211> 720

<212>DNA

<213>梨(Pyrus L.)

<400> 2

1 atggagatgg cctcgagtcc ccgtacggtg gaggagatct tcaaggatta cagtgctcgg

61 agaaaggccg tcgtccgtgc tttaacttcc ggtgtcgatg aattttacgg actctgtgat

121 ccagaaaagg agaacttgtg tctgtatggg cacccgaatg aaacctggga ggtgacgctt

181 ccagcagaag aagtcccacc ggagcttcct gagccagcac ttgggatcaa ttttgcaaga

241 gatggcatga accgcaggga ctggctttct ctggttgctg ttcacagtga ttcttggctg

301 ctctctgtgg ccttttattt tggagcacgt ctgaaccgca atgagaggaa acgcctattt

361 agcttgatca atgatctgcc tactgtcttt gaagttgtta cggaacggaa acccatcaaa

421 gaaaagccca gcgtggatag tggaagcaaa tctcgaggca gcacaaagag atctggtgat

481 ggactagtga aaagcactcc taagctacct gacgagagct tcgaggagga ggaggatgaa

541 catagcgaaa ctctctgcgg tagctgtggc ggaaattaca atgcagatga attttggatc

601 gggtgtgaca tctgcgagaa atggttccat ggaaaatgtg ttaagataac acctgctaag

661 gccgagaaca tcaagcaata caaatgcccg tcttgcagct tgaaaagggg caggcagtag

<210>3

<211> 1059

<212>DNA

<213>梨(Pyrus L.)

<400> 3

1 atgagtcgtc cacaggaacc acaccgacca ttcttccatt ttggaaatcc ttttaagatg

61 attgcaccaa agggttccca actgtcacca aggcttgttg gactgttgaa cacgtttgag

121 gaaacattgg ctgggaggct aagaaagctt aacccaaaag acaaggatga tgtcctcagc

181 ttgtcatgga tgaaattagc tatggagtct ctttgtggaa ctcataatga cataaaatcc

241 ctcatagctg aaattgatct ccctgttagt aactgggacg agaaatggat tgatgtgtac

301 ttggacatca gtgtgaagtt gcttgatgta tgcattgctt ttagctctga gatctcacgt

361 ttaaaccagg gacatcttta tcttcagtgc gtcttgcata atttggattc aactacttca

421 gaccaattta ttcgggcccg ttcctcactt gatggctgga ggcatcatat tagttcaaaa

481 aaccctagag ttgagaactg tagcaccatt ttagataagc ttgtggaatc ccttgatctg

541 ccaaaagtta agaactcagc caaagggaaa cttttgatgc gtgctatgta tggagtgaag

601 gtgttgacag tatccgtttg cagtgtcttt gctgccgcct tttctggttc tgcaaagaag

661 ttgttagatt tgaatgtcgc tgatacatat ttgtgggctc aagcgtttaa cgatttacag

721 ggtattgtaa atggggaaat tagaaatgta ttttctagtg gaagagtcat ggtactgaaa

781 gagctggaag cagttgatga tactgtcaag gaaatgtatc ccaagatcca agatggcgtt

841 gaccttgctg aagggaatgc attcaagaat tctatttcag acttagacag gaaggcacag

901 aaactctccc aagggctcga tcttcttaca aaggaagttg atggattttt ccaaatcctg

961 ttagccgggc gtgacacatt gctttccaaa ctaagatcag gtggagcagt ctcagaacgg

1021 atgctgatgg gaaatgtgga aggtcagttt gtgagatga

<210>4

<211> 1239

<212>DNA

<213>梨(Pyrus L.)

<400> 4

1 atggctttcc aaaagatcaa ggtggccaac cccatcgtcg agatggacgg ggatgaaatg

61 accagggttt tctggaaatc catcaaggac aagcttattt tgccatttgt ggaattggac

121 atcaaatact ttgaccttgg tcttcctcat cgggatgcca ctgatgacaa ggttaccgtt

181 gaaagtgctg aggctactct caagtacaat gtagcgatca agtgtgcaac tattactcca

241 gatgaagctc gtatgaagga gtttaacttg aagagtatgt ggaggagtcc caatgggact

301 attaggaata ttttgaatgg tactgttttc agagaaccaa ttatttgcaa aaacatccct

361 cgccttatcc caggctggac aaagccgata tgcattggaa gacatgcttt tggtgatcag

421 tatcgagcaa ctgatgcagt cattaaagga cctgggaaat tgaaattggt gtttgtgcca

481 gaaggaaagg atgagaagac agagctagag gtttacaact ttacagggga ggggggagtt

541 gcattggcca tgtataacac tgatgagtcc atccgtgctt ttgccgaggc ttccatgacc

601 acagcttatg agaaaaagtg gcctctttat cttagcacaa aaaatactat tctgaagaag

661 tatgatggaa gattcaagga catatttcaa gaagtttatg aagctaactg gaaatcaaag

721 tttgaagctg ctggcatatg gtatgagcat cgtctcattg atgatatggt ggcttatgca

781 cttaaaagtg atggtgggta tgtttgggca tgcaagaatt atgatggaga tgtgcaaagt

841 gatatgttag ctcaagggtt tggatctctt ggattgatga catcagtact ggtgtgccca

901 gatggaaaga ctatagaagc tgaagctgcc cacggtacag ttactcggca ttacagggtt

961 caccagaagg gaggtgaaac gagtacaaat agcatagctt ctatctttgc ttggacaaga

1021 ggcctagcac acagggcgaa gttggatgac aatgcaagac ttttggagtt cactcaaaaa

1081 ctcgaggaag cttgtattgg aactgtggaa tcagggaaaa tgaccaagga tcttgcacta

1141 attcttcacg gatccaagct ggctaggaac cactacttga atactgaaga gttcattgat

1201 gctgtggccg acgaactgaa agctaagctt gcttgctag

Claims

1.一种梨果肉qRT-PCR内参基因组在梨果肉发育过程中作为梨果肉稳定内参基因组的应用，其特征在于，所述内参基因组由BPS1基因和ICDH1基因组成；BPS1基因转录本如序列表SEQ ID NO：3所示；ICDH1基因转录本如序列表SEQ ID NO：4所示。