CN108728453A - 一种印度南瓜EF1-α基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种印度南瓜EF1‑α基因及其应用。印度南瓜EF1‑α基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。利用该基因序列设计的印度南瓜实时荧光定量PCR引物如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示，本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，具有很高稳定性、可靠性和重复性。研究表明印度南瓜EF1‑α在不同组织、不同时期及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，适合在印度南瓜基因表达研究中作为内参基因。

Description

一种印度南瓜EF1-α基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种印度南瓜不同组织、不同时期及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达的elongation factor 1-alpha（EF1-α）基因及其作为内参基因的应用。

背景技术

南瓜（Cucurbita.L，2n=2x=40）是世界范围内的一种重要经济作物，广泛分布于世界各地，其果肉和籽粒均可食用。南瓜果肉中富含维生素、能量及多种微量元素，部分南瓜籽粒含油量高，并且对于人体具有极佳的保健效果。南瓜具有丰富的营养价值，特别是某些品种含有较高的胡萝卜素、维生素及淀粉，属于世界范围内的大宗栽培蔬菜。南瓜属包含一些重要的栽培种，其中中国南瓜、美洲南瓜和印度南瓜这3个栽培种在世界范围内均被认为是经济价值较高的作物。印度南瓜(Cucurbita maxima L．)生产上又被称为西洋南瓜、日本南瓜、栗南瓜和算瓜等。印度南瓜经济价值高，既富含营养，又具有天然保健及药用价值，倍受消费者喜爱，其需求量正在不断增大, 栽培面积也正日益扩大，具有广阔的应用前景。随着其分子生物学研究的不断深入和发展，基因表达分析正逐渐应用于揭示印度南瓜基因调控机理的研究中。

实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）是在传统PCR 技术基础上发展而来的一种新的核酸定量技术，具有灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等特点，已被广泛地应用于基因的表达和转录组分析等研究中。然而，在进行qRT-PCR 过程中，其准确性及可靠性往往受到很多因素的影响，包括RNA 的质量、反转录效率和内参基因的选择等。在基因表达分析中，选择合适的内参基因是精确分析qRT-PCR 结果的重要前提。EF1-α普遍存在于细胞内并且能够大量表达，是一种多聚体核糖体蛋白质，在蛋白质合成过程中起到重要作用。其基因及表达调控十分保守，具有内参基因的特性。EF1-α作为内参基因在分析植物基因表达中应用广泛。但目前关于印度南瓜EF1-α基因的克隆和作为关于印度南瓜内参基因的研究还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种印度南瓜不同组织、不同时期及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达的EF1-α基因及其作为内参基因的应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一种印度南瓜内参基因EF1-α，所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；根据本课题组对印度南瓜果实转录组Illumina高通量深度测序获得并经验证。

进一步地，以所述内参基因的核苷酸序列为基础，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

且该实时荧光定量PCR引物为：

正向引物5'- ACGGTGATGCTGGTATGGTTA -3'，

反向引物5'- CATTGTTGTTGGTTGGCTTATT -3'。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种印度南瓜内参基因，同时揭露了利用该印度南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于印度南瓜基因表达分析时，能够提高印度南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大提高采用实时荧光定量检测印度南瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1 是本发明中实施例2的1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2 是本发明中实施例3的PCR扩增曲线图。

图3 是本发明中实施例3的溶解曲线图。

图4 是本发明中实施例4的1% 的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：美国ABI7500 实时定量PCR 仪，美国ABI Veriti 96-well热循环仪，美国ABI PowerSYBR® Green PCR Master Mix, pMD18-T-vector、cDNA第一链合成试剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、Marker DL 2000、Taq DNAPolymerase、dNTP均为宝生物工程（大连）有限公司产品，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品，引物合成和克隆测序由铂尚生物技术(上海)有限公司完成，其余生化试剂均为国产分析纯。

实施例1 内参基因的获得

根据本课题组对印度南瓜果实转录组Illumina高通量深度测序的结果，筛选得到EF1-α基因cDNA全长，经PCR扩增、测序验证，该基因cDNA全长1701 bp，开放阅读框大小为1344bp，序列如下：

GGGCTGCTTGCTACTGCGTAAAATTGAGGCTGCTTCTTTCTTCTCATTTCTCTGCAAATTCTTGTGGGCTCATTTGGTTAATATCAAATGGGTAAGGAAAAGATTCATATTAACATCGTGGTTATTGGCCATGTCGACTCTGGAAAGTCGACCACCACCGGTCATCTTATCTACAAGCTTGGTGGAATTGACAAGCGTGTGATCGAGAGATTCGAGAAGGAAGCTGCTGAGATGAACAAAAGGTCATTCAAGTATGCTTGGGTGCTCGACAAACTTAAGGCAGAGCGTGAACGTGGTATTACCATTGACATTGCTCTGTGGAAGTTTGAGACCACCAAGTACTACTGCACAGTCATCGATGCCCCCGGACATCGTGACTTTATCAAGAACATGATTACTGGAACCTCTCAGGCTGATTGTGCCGTCCTCATCATTGACTCGACCACTGGTGGTTTTGAAGCTGGTATTTCCAAGGATGGTCAAACCCGTGAGCACGCTCTCCTTGCTTTCACCCTTGGTGTCAAGCAAATGATCTGCTGCTGTAACAAGATGGATGCCACCACCCCCAAATATTCAAAGGCAAGGTATGATGAAATCGTGAAGGAAGTGTCTTCTTACCTCAAGAAGGTTGGATACAATCCAGACAAAATCCCCTTCGTGCCCATCTCCGGATTTGAGGGTGACAATATGATTGAGAGGTCCACCAACCTTGATTGGTACAAGGGACCAACACTTCTTGAGGCTCTTGACTTGATCCAGGAGCCCAAGAGGCCCTCAGACAAGCCCCTCCGTCTCCCACTTCAGGACGTGTACAAGATTGGTGGTATTGGAACTGTTCCTGTCGGTCGTGTTGAGACTGGTGTCCTCAAGCCTGGTATGGTTGTCACCTTCGGACCAACTGGACTGACCACTGAAGTTAAGTCTGTTGAAATGCACCACGAGTCTCTCCCAGAGGCCTTGCCTGGTGACAATGTTGGGTTCAATGTGAAGAACGTTGCAGTCAAGGATCTCAAGCGTGGTTTCGTTGCCTCAAACTCCAAGGATGACCCTGCCAAGGAGGCTGCCAACTTCACATCTCAGGTTATCATCATGAACCACCCTGGCCAGATCGGTAATGGTTATGCCCCAGTCCTTGATTGCCACACCTCCCACATTGCTGTTAAGTTCGCCGAGATCCTCACCAAGATCGATCGTCGATCTGGTAAGGAACTTGAGAAGGAGCCCAAGTTCTTGAAGAACGGTGATGCTGGTATGGTTAAGATGATTCCCACCAAGCCCATGGTTGTGGAGACCTTCTCTTCATACCCACCTTTGGGTCGTTTTGCTGTTCGTGACATGCGTCAAACCGTTGCTGTTGGTGTGATCAAGAGCGTGGAGAAGAAGGATCCAACTGGAGCCAAGGTGACCAAGTCCGCAGTGAAGAAGAAATAAGCCAACCAACAACAATGAACCGAACCGAACCGAACTTGCATTTTGTGTCGTAGACAGAACATTTTAGTTTGCAAAACATGAGAAAGACTTTTGGGTTGATGGTAGTTGTGAGTGGCTTCTACTTTGTGTTTGAGCGGCTCTGACTCGTAGCAGTTTTTCATTTATTTTTAGTTTTATCTGTCTGGTTTTGTGTTGTTAATTTTGAGACATTTAAATCGTTGGATACCGTTGAGAGTTTAAAAGGTTTTTAATTACAAGTCAATTTCCCTT。

实施例2 实时荧光定量PCR 设计和常规PCR检测

以实施例1获得的印度南瓜内参基因EF1-α的核苷酸序列为基础，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为211 bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物（如SEQ ID NO：2、3所示）：正向引物5'-ACGGTGATGCTGGTATGGTTA -3'，反向引物5'- CATTGTTGTTGGTTGGCTTATT -3'。

提取印度南瓜总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板、以实时荧光定量PCR引物为引物对进行PCR扩增，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：

PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含25 ng模板、0.4 μmol/L正向引物、0.4 μmol/L反向引物、0.15 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5 μL、其余成分为灭菌的超纯水；

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35个循环；最后72℃下延伸10 min；于4℃下保存。

将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示；由图1可知，PCR扩增得到一条单一条带，没有出现非特异性扩增条带，经测序大小为211 bp，符合预期大小；则可继续下游的实时荧光定量PCR 引物验证。

实施例3 实时荧光定量PCR 引物验证

提取印度南瓜总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板、按照Power SYBR® Green PCR Master Mix说明书在ABI7500 实时定量PCR 仪上进行PCR 反应，PCR 反应的反应体系与反应程序如下：

反应体系为：反应体系的总体积为25μL，12.5 μL Power SYBR® Green PCR MasterMix，1 μL 模板，实施例2中实时荧光定量PCR引物的正向引物0.5 μL（浓度为10 μmol/ L），实施例2中实时荧光定量PCR引物的反向引物0.5 μL（浓度为10 μmol/ L），补蒸馏水至总体积25 μL。

反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共 40个循环；4℃保存；每个反应做3个重复。

反应的结果如图2（其中，ΔRn指荧光强度、cycle指循环数）所示，从图2可以看出，3次重复的荧光定量PCR 扩增曲线均很好。且为检验反应的特异性，申请人在PCR 后进行融解曲线分析，分析结果如图3所示，从图3可显示出，3次重复的平均Tm（溶解温度）分别为82.86℃，且均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现，从而表明所设计的一对引物特异性强（即实施例2中的实时荧光定量PCR引物），扩增效率高，特异性强，能够用于印度南瓜荧光定量PCR的内参引物实验。

实施例4 印度南瓜EF1-α基因表达稳定性分析

分别提取印度南瓜根、茎、花、幼叶、老叶、幼瓜、老瓜、高温处理（38℃）叶片、低温处理（8℃）叶片、干旱处理1天叶片、干旱处理3天叶片的总RNA，之后分别按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，以获得各自的cDNA；利用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对，以获得的11种的cDNA 为模板，分别进行PCR扩增，PCR扩增体系与扩增程序如下：

PCR扩增体系：反应体系的总体积为25μL，25 ng模板、0.4 μmol/L正向引物、0.4 μmol/L反向引物、0.15 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5 μL、其余成分为灭菌的超纯水。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸10 min；于4℃下保存。

将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示，且图4中标识1至11分别为印度南瓜根、茎、花、幼叶、老叶、幼瓜、老瓜、高温处理（38℃）叶片、低温处理（8℃）叶片、干旱处理1天叶片、干旱处理3天叶片的的PCR扩增反应结果；由图4显示，采用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对时，扩增所得的11个条带亮度基本一致，从而表明在印度南瓜不同组织、各生长发育阶段、及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，即说明了实时荧光定量特异引物在印度南瓜基因表达中的稳定性，从而适用于印度南瓜基因表达的研究。

综上，本发明提供了一种印度南瓜内参基因，并揭露了利用该印度南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于印度南瓜基因表达分析时，能够提高印度南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测印度南瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院作物研究所

<120> 一种印度南瓜EF1-α基因及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggctgcttg ctactgcgta aaattgaggc tgcttctttc ttctcatttc tctgcaaatt 60

cttgtgggct catttggtta atatcaaatg ggtaaggaaa agattcatat taacatcgtg 120

gttattggcc atgtcgactc tggaaagtcg accaccaccg gtcatcttat ctacaagctt 180

ggtggaattg acaagcgtgt gatcgagaga ttcgagaagg aagctgctga gatgaacaaa 240

aggtcattca agtatgcttg ggtgctcgac aaacttaagg cagagcgtga acgtggtatt 300

accattgaca ttgctctgtg gaagtttgag accaccaagt actactgcac agtcatcgat 360

gcccccggac atcgtgactt tatcaagaac atgattactg gaacctctca ggctgattgt 420

gccgtcctca tcattgactc gaccactggt ggttttgaag ctggtatttc caaggatggt 480

caaacccgtg agcacgctct ccttgctttc acccttggtg tcaagcaaat gatctgctgc 540

tgtaacaaga tggatgccac cacccccaaa tattcaaagg caaggtatga tgaaatcgtg 600

aaggaagtgt cttcttacct caagaaggtt ggatacaatc cagacaaaat ccccttcgtg 660

cccatctccg gatttgaggg tgacaatatg attgagaggt ccaccaacct tgattggtac 720

aagggaccaa cacttcttga ggctcttgac ttgatccagg agcccaagag gccctcagac 780

aagcccctcc gtctcccact tcaggacgtg tacaagattg gtggtattgg aactgttcct 840

gtcggtcgtg ttgagactgg tgtcctcaag cctggtatgg ttgtcacctt cggaccaact 900

ggactgacca ctgaagttaa gtctgttgaa atgcaccacg agtctctccc agaggccttg 960

cctggtgaca atgttgggtt caatgtgaag aacgttgcag tcaaggatct caagcgtggt 1020

ttcgttgcct caaactccaa ggatgaccct gccaaggagg ctgccaactt cacatctcag 1080

gttatcatca tgaaccaccc tggccagatc ggtaatggtt atgccccagt ccttgattgc 1140

cacacctccc acattgctgt taagttcgcc gagatcctca ccaagatcga tcgtcgatct 1200

ggtaaggaac ttgagaagga gcccaagttc ttgaagaacg gtgatgctgg tatggttaag 1260

atgattccca ccaagcccat ggttgtggag accttctctt catacccacc tttgggtcgt 1320

tttgctgttc gtgacatgcg tcaaaccgtt gctgttggtg tgatcaagag cgtggagaag 1380

aaggatccaa ctggagccaa ggtgaccaag tccgcagtga agaagaaata agccaaccaa 1440

caacaatgaa ccgaaccgaa ccgaacttgc attttgtgtc gtagacagaa cattttagtt 1500

tgcaaaacat gagaaagact tttgggttga tggtagttgt gagtggcttc tactttgtgt 1560

ttgagcggct ctgactcgta gcagtttttc atttattttt agttttatct gtctggtttt 1620

gtgttgttaa ttttgagaca tttaaatcgt tggataccgt tgagagttta aaaggttttt 1680

aattacaagt caatttccct t 1701

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

acggtgatgc tggtatggtt a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cattgttgtt ggttggctta tt 22

Claims (2)

1.一种印度南瓜EF1-α基因，其特征在于，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

2.权利要求1 所述印度南瓜EF1-α基因在印度南瓜有关基因的实时定量PCR 中的应用，其特征在于，所述印度南瓜EF1-α基因作为内参基因使用，以所述内参基因的核苷酸序列为基础，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；且该实时荧光定量PCR引物为：

正向引物5'- ACGGTGATGCTGGTATGGTTA -3'，

反向引物5'- CATTGTTGTTGGTTGGCTTATT -3'。