CN110982931A - 一种西番莲内参基因及其专用引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西番莲内参基因及其专用引物和应用，属于植物分子生物学技术领域。本发明提供的西番莲内参基因为EF1基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过西番莲的转录组测序库，挑选了10个候选参考基因，并依此设计了实时荧光定量引物，经过筛选，得到以上所述内参基因，在不同算法和不同样本处理的9种情况中，EF1稳定性在五种条件下稳定性排名第一和第二，其余四种情况下排名第三至第五，稳定性也较好。本发明不仅解决了现有西番莲检测中没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物用于西番莲组织中基因表达分析时引物特异性强，从提高了实时荧光定量检测西番莲基因时的检测效率和检测结果的可信度。

Description

一种西番莲内参基因及其专用引物和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，更具体地说，涉及一种西番莲(Passifloraedulis)内参基因及其专用引物和应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)由于其灵敏度强、重复性高、特异性强、快速、高效性等特点，成为研究基因表达的主要方法。然而，qRT-PCR可能受到RNA纯度，数量和反转录效率的影响。因此，通常需要引入内参基因作为标准以准确量化基因表达。内参基因是一类组成性表达基因，并且对于维持细胞基本生命活动至关重要。理想情况下，内参基因在个体的不同组织器官、不同生长发育阶段或不同试验条件处理下均能持续稳定表达，不会受到任何内源性或外源性环境因素的影响。近年来关于内参基因的报道日益增多，已经鉴定出合适内参基因物种有：拟南芥、杨树(Populus trichocarpa)、豌豆(Pisum sativum L.)、大豆(Glycine max)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill)、小麦(Triticum aestivum)、黑麦草(Lolium perenne)、马尾松(Pinus massoniana L.)、紫薇(Lagerstroemia indica)、油菜(Brassica napus)等。

不同物种和不同样本间内参基因的稳定性存在一定差异。18S被鉴定为水稻(Oryza sativaL.)和杨树稳定的内参基因，但18S是桃(Amygdalus persica)中最不稳定的基因；UBQ在桃和香蕉(Musa nana)果实不同发育阶段表达稳定，但在葡萄果实不同发育阶段表达不稳定。绿藻(Chlorophyta)在盐胁迫和紫外线处理下TUB2表达稳定，然而在不同温度和干燥胁迫处理下Histone2为最适合的内参基因。如果内参基因选取不当会对实验结果造成严重影响，甚至的得到错误结论，当选用合适的内参基因APT1、UBQ5、EF1a对拟南芥目标基因At5g02840进行校准时，At5g02840在整个豆荚发育阶段中表达量基本一致，而选用不合适的内参基因TUB6对At5g02840进行校准时，At5g02840的表达量出现100倍的偏差^[153]。因此，在使用qRT-PCR进行表达分析前有必要先选则合适的内参基因。由于西番莲的分子研究较少，尚未有一个比较稳定的内参基因，因此有必要鉴定出稳定的西番莲的内参基因用于西番莲的基因表达研究。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种西番莲内参基因，能够应用在西番莲荧光定量实验中。本发明所要解决的另一技术问题是提供上述内参基因的专用引物。本发明最后所要解决的技术问题是提供上述内参基因在西番莲荧光定量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种西番莲内参基因，为EF1基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的EF1基因作为西番莲不同组织的荧光定量内参基因。

所述的EF1基因作为西番莲冷胁迫下的荧光定量内参基因。

所述的EF1基因的引物序列如下：

EF1正向引物5′-GGCTGAGCGTGAACGTGGTA-3′

EF1反向引物5′-CGGCACAATCAGCCTGGGAA-3′。

所述的EF1基因的引物序列在西番莲荧光定量中的应用。

本申请通过GeNorm、NormFinder和RefFinder这三个软件对10个候选参考基因进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出一个稳定表达的内参基因，为EF1基因，是在不同组织和冷胁迫下都能稳定表达的内参基因。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

本发明通过西番莲的转录组测序库，挑选了10个候选参考基因，并依此设计了实时荧光定量引物，在不同算法和不同样本处理的9种情况中，EF1稳定性在五种条件下稳定性排名第一和第二，其余四种情况下也具有较好的稳定性(排名第三至第五)。因此，经geNorm，NormFinder和RefFinder鉴定EF1为西番莲稳定的内参基因。本申请为首次尝试鉴定西番莲标准化的内参基因，并鉴定出了一个可靠的参考基因EF1。本申请不仅解决了现有西番莲检测中没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物用于西番莲组织中基因表达分析时引物特异性强，从而能够大大的提高采用实时荧光定量检测西番莲基因时的检测效率，提高检测结果的可信度。为后续研究西番莲的基因表达奠定基础。

附图说明

图1为10个候选基因熔解曲线图；

图2为10个候选基因qRT-PCR的Ct值图；

图3为候选基因在不同样品中geNorm的值图，a)为所有样品，b)为不同组织，c)为胁迫处理，x轴上的基因按照增加稳定性的顺序，y轴M值；

图4为geNorm的候选内参基因的变异分析柱状图；

图5为比较RNA测序(RNA-seq)和qRT-PCR之间的表达结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例所使用的主要供试材料为：试验材料采用西番莲抗寒品种‘平塘1号’新鲜的根、茎、幼叶、成熟叶、幼花、成熟花、小果(1cm≤diameter＜3cm)、中果(3cm≤diameter＜6cm)、大果(diameter≥6cm)为不同组织样本。盆栽的1年生扦插苗，用于4℃低温胁迫及25℃常温恢复试验，并在其低温胁迫0h(对照，CK)、1h(LST-1h)、4h(LST-4h)、8h(LST-8h)、24h(LST-24h)、72h(LST-72h)及其放置于常温恢复1h(NTR-1h)、4h(NTR-4h)、8h(NTR-8h)、24h(NTR-24h)、72h(NTR-72h)等11个时间点取其叶片作为冷胁迫样品。每个实验3个生物学重复，样品在收集后立即在液氮中速冻并在-80℃下储存。

实施例1：

1、RNA的提取及cDNA的合成

分别提取茎、叶、花和果实的RNA，进行等量混样，用于后续转录组测序。RNA的提取使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，China)。提取完成后，分别通过1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA的完整性和纯度。由于RNA易降解，在得到RNA后，需立刻置于-80℃超低温冰箱进行保存。具体操作步骤如下：

1)配制DNA酶I：向200μL的RNase-Free离心管中加入10μLDnase I和70μL RDD，轻柔混匀。4℃保存，待用。

2)吸取475μL裂解液SL和25μL的β-巯基乙醇于1.5mL RNase-Free管中，充分混匀，待用。

3)将50-100mg的植物样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入到步骤2中含有预混液的离心管，立即涡旋使其充分混匀，12000rpm离心2min。

4)小心吸取上层清液，并将其转移到过滤主CS上，12000rpm离心2min。

5)吸取上层清液到一个新的RNase-Free管中，缓慢加入0.4倍上层清液体积的C₂H₅OH，混匀。

6)将步骤5中的溶液及沉淀转移到CR3中，12000rpm离心30sec，弃废液。

7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃废液。

8)将步骤1中配置好的80μL的DNA酶I加入到CR3中，室温静置15min。

9)向CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心30sec，弃废液。

10)再向CR3中加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心30sec，弃废液。将CR3重新放回收集管中。

11)重复步骤10，之后12000rpm离心2min。把CR3放置到一个新的1.5ml RNase-Free管中。

12)向吸附膜中央加入40μLRNase-Free ddH₂O，室温静置2min，12000rpm离心1min，得到RNA溶液。

13)使用TaKaRa公司的PrineScriptTMRT Master Mix试剂盒进行反转录。反应体系(10μL)为：2μL5×Prime Script RT Master Mix，1μLTotal RNA(500ng/μL)，7μLRNaseFree ddH₂O；反应程序：37℃15min；85℃5s。(cDNA稀释3倍后用于qRT-PCR)。

2、内参基因的选择及引物的设计和实时荧光定量PCR

基于发明人已获得的西番莲转录组测序数据，挑选了10个候选参考基因：50s(SEQID NO.4)、Ts(SEQ ID NO.10)、UBQ(SEQ ID NO.2)、OTU(SEQ ID NO.9)、OmpH(SEQ IDNO.7)、Liom(SEQ ID NO.8)、EF1(SEQ ID NO.1)、18S(SEQ ID NO.6)、eIF-5A(SEQ ID NO.3)和HIS(SEQ ID NO.5)。使用Oligo 7软件设计特异性引物(表1)，参数如下：引物长度17-25bp，GC含量40-60％，解链温度58-62℃，最优长度80-210bp(不超过300bp)。引物由上海Invitrogen生物技术公司合成。

表1内参基因引物描述及序列

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用ABI ViiA 7 Real time PCR Systems仪器，每个样品重复三次。

qRT-PCR反应体系(10.0μL)：5.0μLSYBR Premix Ex Taq TM，0.5μLPCR ForwardPrimer，0.5μLPCR Reverse Primer，2.0μLcDNA模板，2.0μLddH₂O。

qRT-PCR反应程序：50℃2min；95℃2min；95℃1s，60℃30s，40个循环；95℃15s；60℃1min；95℃15s。

3、数据处理

从ABI ViiA 7中导出每个循环的原始荧光数据，并用LinRegPCR软件中分析以计算每个基因对应的实际扩增效率(E)。循环阈值(Ct)值是扩增阈值达到特定阈值时的循环次数，反映了候选基因的表达水平。使用geNorm、NormFinder和RefFinder对qRT-PCR数据进行分析。geNorm和NormFinder分析使用E^-ΔCt值，其中E^-ΔCt＝E^{-(样本CT-最小CT)}(样本的Ct值减去样本中基因的最小Ct值)。RefFinder分析使用原始Ct值。所有软件均按照操作说明进行。

4、定量验证

在发明人获得的转录组表达数据中，随机选择11个差异表达基因进行qRT-PCR验证。引物如表2所示，实验方法和反应体系同上，每个样品设三次技术重复，结果采用ΔCt法进行相对定量的分析。

表2引物序列

5、结果

(1)内参基因引物特异性与扩增效率

所有候选基因qRT-PCR反应的熔解曲线(图1)表明，大多数候选基因显示在特定解链温呈现的单峰。分析基因的Ct值，可以从中判断各候选内参基因的表达丰度，如果Ct值越大，那么该基因表达丰度越低。可以看到10个候选基因的表达丰度范围分布较广，而且不同基因的表达丰度存在明显差异(图2)。OmpH的平均Ct值最大，这表示其的表达水平相对较低。相比之下，18S显示出最低的平均Ct值，基因表达丰度较高。此外，各内参基因Ct值的波动范围有明显差异。50S、OmpH、Liom和HIS的Ct值在样品间的波动范围较大；UBQ、18S和eIF-5A的Ct值在样品间的波动范围较小；并且，OmpH和18S具有离散数据。Ct值只能简单地反映出10个候选基因表达是否稳定，为了得到更加准确、可靠的内参基因性，需要通过多种软件进行综合分析、判断。

(2)GeNorm分析

GeNorm软件通过计算基因表达稳定系数M值对内参基因进行筛选，M值小于1.5则认为是稳定表达。根据说明，M值最小的基因稳定性最好。如图3所示，在所有实验条件下，10个候选基因的M值均低于1.5，表明各候选基因表达都较为稳定。在所有样品中，M值的由小到大顺序依次是Ts＝EF1＜eIF5A＜OTU＜HIS＜50S＜Liom＜UBQ＜18S＜OmpH。不同的组织中，HIS和EF1表达最稳定。冷胁迫处理时，UBQ和HIS的M值相同且最小。OmpH在所有实验条件下表达最不稳定。

GeNorm还通过计算标准化因子(Normalization factor)的配对变异V值(Pairwise variation)，并根据Vn/Vn+1的值确定最佳参考基因的数目。如果Vn/Vn+1的值小于0.15，那么最合适的参考基因的数目是n，而如果Vn/Vn+1大于0.15，则适合的参考基因的数目是n+1。在所有实验条件下V2/3值都低于0.15(图4)，所以西番莲的适合内参基因是2个。Ts和EF1被认为是所有样品内参基因。在胁迫处理条件下，UBQ和HIS是最稳定的基因，EF1则排名第五。数据表明，不同组织中排名前两位的内参分别为Ts和HIS。综合考虑，geNorm推荐的两个内参基因分别为Ts和EF1。

(3)NormFinder分析

NormFinder基于方差分析直接评估参考基因的基因表达稳定性，并对候选组进行排名。将所有样品考虑在内时，Ts被确定为其中最稳定的基因(从最稳定[最小稳定性值]到最不稳定[最大稳定性值])：Ts＜OTU＜eIF5A＜EF1＜50S＜Liom＜HIS＜UBQ＜18S＜OmpH。NormFinder分析结果如表3所示，在不同的组织中，HIS，EF1和Ts被鉴定为较为稳定的基因。UBQ，EF1和eIF5A显示较小的稳定性值，在胁迫处理时具有良好的稳定性。NormFinder分析表明，在不同的实验条件下，只有EF1出现在前四名中。总的来说，我们可以将EF1视NormFinder最稳定的内参基因。

表3 Normfinder分析结果

(4)RefFinder分析

RefFinder(http://150.216.56.64/referencegene.php)是一个在线的工具，综合分析推荐候选基因的稳定性顺序。对RefFinder的综合排序分析(表4)，Ts是总样本中最稳定的基因，其次是EF1基因。在不同组织中HIS为排名第一，EF1为排名第二的稳定参考基因。在胁迫处理中，UBQ最稳定，其次是HIS，紧接着是EF1。在所有的实验条件下，OmpH显示出较低的稳定性并且被认为最不稳定的参考基因。因此，RefFinder分析可知EF1为本实验中最合适的内参基因。

表4 RefFinder分析中的最稳定和最不稳定的参考基因

(5)qRT-PCR验证

为了验证转录组表达及内参基因筛选的可靠性，本研究上述筛选出的EF1作为内参基因，随机选择11个DEGs进行qRT-PCR验证。定量结果显示，DEGs的表达模式与转录组数据一致(R²＝0.81321，p＝0.002334)，充分说明本研究中转录组学分析与内参基因的筛选具有高度可重复性和可靠性(图5)。

(6)综合排名

50s、Ts、UBQ、OTU、OmpH、Liom、EF1a、18s、eIF-5A和HIS在不同实验条件下的表达分析结果(表5)不尽相同(排名数字越小意味着该基因更稳定)。

表5 geNorm、NormFinder和RefFinder对内参基因的综合排序

注：G，N，R分别代表geNorm、NormFinder和RefFinder

在不同算法和不同样本处理的9种情况中，EF1稳定性在五种条件下稳定性排名第一和第二，其余四种情况下也具有较好的稳定性(排名第三至第五)。因此，经geNorm，NormFinder和RefFinder鉴定EF1为西番莲稳定的内参基因。这是第一次尝试鉴定西番莲标准化的内参基因。本申请鉴定出了一个可靠的参考基因EF1，为后续研究西番莲的基因表达奠定基础。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种西番莲内参基因及其专用引物和应用

<130> 100

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 350

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 1

gcttggtggc attgacaagc gtgttattga gaggttcgag aaggaagcgg ctgagatgaa 60

caagaggtcc ttcaagtacg cttgggttct tgacaagctc aaggctgagc gtgaacgtgg 120

tatcactatt gatattgcct tgtggaagtt tgaaaccacc aagtactact gcacagtcat 180

tgatgctccc ggacatcgtg acttcatcaa aaacatgatt actggtactt cccaggctga 240

ttgtgccgtc cttatcattg actccaccac tggaggtttt gaagccggta tctccaagga 300

tggtcagact cgcgagcatg ctttgcttgc ctttaccctc ggtgtcaagc 350

<210> 2

<211> 480

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 2

agaaattgtt gtatttcaat tatataatta gaaggttacc ttaaaattca aaccaagaat 60

cagaaaacaa caattaaagc tttagcgaaa gctttcatac aggagcaaac attgaactcg 120

accaatatta agagtcgagc atcaatagtt gctagccaat aagcgtactc gaaaaaaatc 180

caaagactca tttctcaaat tgaaataaaa cttcataacc attaagctat ccaaagtagc 240

agcaaagcag aacataacaa caagttaaac aaccataacg tcaaaataaa aataagacat 300

ttataaaact ttgactaaaa gctttctatt tgaaaaatca gtcacctccg gccttctggt 360

aaacataggt aaggccacac ttgccgcagt aatgcctgtc aaaatgattc gccatgaaag 420

ttccggcacc acactcggca ttagggcact ccttcctcag cctctgaacc tttcctgaat 480

<210> 3

<211> 560

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 3

gtccggtcca aataatctgg tctaattaac gacaaagcga accagcgaag aacactagta 60

aaaaacccat aattagttcc acaaacaaga ttatagacca tagagtaata aacagtaact 120

ttgttgtatc cataaattgg cacaaattca atctgcgttg cagggagtgt ctacttgagt 180

tttcaatatg caatctataa gagtcctcct ggagggaaaa aaataaaaat aaaaataaat 240

aaaaggcttt ccacttgagt tggaacagct ttctaagcag taaagccctt ggtatatcta 300

attctttggg ccgatgtcct tgagagaaca gatctgctcc tctcccatgg cagacatgac 360

tgtcacaaca agatctttcc cctcagcgaa accatccttg atctgggtac ggagactctc 420

atcagttggg agcctcaagt catccttagt gttcccagtt tcagtaagca aactgacaaa 480

ttcgtcctcg gagatatcaa tcaactggta gtcagtgcga ttgacatgag gaacatcaca 540

gttgtgggag gaaggaacaa 560

<210> 4

<211> 969

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 4

gagagcagta atatatctgt atcattattt aattgtaaca cattaattaa tatgcaacat 60

atccttacat tctcgcccct agacattaat taatggctcg ttatcttttt attttgccgg 120

actatctcat tgtgaaacat gccaatgaca gaaacaatct taatagaata tacctaccat 180

actaatgaag cagaccatca agtatgcaca gcattacagc aaacatgaca aagaaacaga 240

actaccagga attgcatggt ttctcaacgt catcaaagta caccataccg agtcgatata 300

tatatattgg cttatgcaga tttttcagct tccttagctg cctcttcccg caacttcttc 360

aaagatggtg gtggtctgac aacaatgctc ttcttccatt ttcgatcaag ctttcttgac 420

aatctcttgt tgattccctc ctcaagctct ctttctcgtc taacagttag catgcgcgct 480

atccttttgc gcattcggcg aaactcactg gacttgaact cgttacgggc ggatttctga 540

aggcgaagca taaggagttc acctttaaga tcaacgactt cttcattaat ttcctgggtg 600

gtcatggccc tgatttcctt caattcttct tctctcttcg ccatcattac aactctagac 660

ttaccagaaa acgaagccga caggattctg tttgtgctaa gattaatggg ccatgcgtgc 720

cggactggga tgccggtgga gagtgatata ggggtgcgag acaagaacgc cggtgggaaa 780

gtaattgcgg tcaggctcaa cattttaggt tgttcacgct tttccggttt cccagaggtt 840

ttctatacaa gggataaggc tatttctctc tttgtttgtt tggtcggtat tttttattta 900

tccaactgaa cctcgattat taacttgctt tctcctggtc gcagcaaatt gaaatgcgat 960

attagtttt 969

<210> 5

<211> 1801

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 5

cggggacatt acaaaagaag aatccttatc gcgggtgtaa gaggcttata ttttctctct 60

ggttgttctt ccgtaaattg aagacattcc cagatggctc gtaccaagca aaccgctcgt 120

aagtccaccg gaggcaaggc tcccaggaag cagctcgcca ctaaggctgc tcgtaaatct 180

gccccaacca ccggaggagt gaagaagcca cacagatacc gtcccggaac cgtcgcccta 240

cgtgaaattc gcaagtacca aaagagtacc gagctcctca tcaggaaact tcccttccag 300

agacttgttc gagaaatcgc ccaggacttc aagaccgatt tgcgattcca gagccatgca 360

gtgttggcac tgcaggaggc agcagaagct taccttgttg ggctctttga ggatacaaat 420

ctctgtgcca tccacgccaa gcgtgtcaca atcatgccca aggatatcca acttgccagg 480

agaatccgtg gcgagcgagc ctagagcttc aactcctgaa gataaaactg atttgttggg 540

tattcatagt agaagctttg gcagctggtc taggaatttt ctccccgctg attttcggtc 600

tgtaatgtgt tttctgacgt gaatgattgg taggaacttc tcgtgctcac tttagtttgc 660

tctagttttc tatgttgaag gctttgatga tatgtttgaa tgttactgtt gaacattgct 720

aaattctgcc tctcttcgct cgcactcata tatctgttaa cggactagca tttcgccgtt 780

caccttgtgt taaccaagga aattctcaag ctgccattgc gtatatgttt ccttggctga 840

ggtgggtaag aatcctcgag tattgaaaac agcatattta tactttctag tatgtgcgca 900

tgtgtctatt gtactgtgat gcggcaatta gctcgcacca tttcataata attataccaa 960

catctatggt aaactagtta gctgtttgaa acaagtagca ctattacttt attatctcac 1020

tggcagtgcg acgagttcca ttctgctcaa tctgcctgtg actgtcataa atcaaattag 1080

atcggcgtga aaaaaaaagg gaagaaacaa tcttctgtct taaagatcgt aagctgtgac 1140

gcttactagt aacttctcca cctagttctg attgacaagc caaaatttct tattagcgat 1200

atcagagcat tccctgataa tagatttctc tgagaaaatt tggtctgctg gtacaaactc 1260

actgtggtag cagaaagcaa actgtggata aacagttaaa cagagcatcc gtctacagag 1320

gacctggaaa cgtgccattc tccctttgct cattccatct ctcaatccat tcagtagggc 1380

agagagaacg ataatatttg gcatacttat cacactccgg tgcaccttca cccttggcag 1440

ccgtgcatcg atgatactca atatatcttg taaagcagtg ccttgtctgg tttgttgttg 1500

gaaaacggta atctgccgga gctgtctcaa gctggatcga gaatcccatt aaccataatg 1560

cataaacaaa caatgattca tatgtataat atacaatcat ctctatacaa aaattcaaga 1620

ctgatctcaa aaccttaatc tctggtttct cttcctctgc gtcttgttcg cctgagtttt 1680

cctcttgggt ggtttcatta ctttcttcag cagcaggagg aacatcttca gcattgtttt 1740

caacagaagc agaattagtt tcagtttttt cttcagcagc acttgcaggg gtttcctcag 1800

c 1801

<210> 6

<211> 998

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 6

gagtaacatc cgccaatccc tggtcggcat cgtttatggt tgagactagg acggtatctg 60

atcgtcttcg agcccccaac tttcgttctt gattaatgaa aacatccttg gcaaatgctt 120

tcgcagttgt tcgtctttca taaatccaag aatttcacct ctgactatga aatacgaatg 180

cccccgactg tccctgttaa tcattactcc gatcccgaag gccaacagaa taggaccgaa 240

atcctatgat gttatcccat gctaatgtat acagagcgta ggcttgcttt gagcactcta 300

atttcttcaa agtaacagca ccggaggcac gacccggcca gttaaggcca ggagcgcatc 360

gccggtagaa gggacgaggc aaccggtgct caccgaaagg cggaccggcc gacccatccc 420

aaggtccaac tacgagcttt ttaactgcaa caacttaaat atacgctatt ggagctggaa 480

ttaccgcggc tgctggcacc agacttgccc tccaatggat cctcgttaag ggatttagat 540

tgtactcatt ccaattacca gactcaaaga gcccggtatt gttatttatt gtcactacct 600

ccccgtgtca ggattgggta atttgcgcgc ctgctgcctt ccttggatgt ggtagccgtt 660

tctcaggctc cctctccgga atcgaaccct aattctccgt cacccgtcac caccatggta 720

ggcctctatc ctaccatcga aagttgatag ggcagaaatt tgaatgatgc gtcgccggca 780

cgaaggccgt gcgatccgtc gagttatcat gaatcatcag agcgacgggc aaagcccgcg 840

tcgacctttt atctaataaa tgcatccctt ccgagagtcg gggtttgttg cacgtattag 900

ctctagaatt acctggttga tcctgccagt agtcatatgc ttgtctcaaa gattaagcca 960

tgcatgtgta agtatgaact aattcaaact gtgaaact 998

<210> 7

<211> 1471

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 7

gaggttttgt attttattaa actggaaatt tgggtggtcc tatctcattt atcttccatg 60

gtaatatata agtggagccc atgagctctc agccatcgac tttcgttggt tttcttttga 120

aggggggctt ttgtctgctg agatttgaga ggaagacccc agtagggaag agtttttatt 180

cggttctttc gaccacactg atagggagac aacctctgct tttgtaacaa caattatctc 240

tcttgccctt tcctcatcgt ctctttgttt ctcttcgttg ccaacgtata gtagaaaaga 300

ccagaacttt gtttagaggt gaaaaggcag acagaaaaaa aaaaaaaaaa ggaaaagaga 360

gaaaatgaaa atgatgcaag aggaaacccg caagggtcca tggacagaac aggaagatgt 420

tgttctgata cactttgtgc acttgtttgg agatagaaga tgggattcta ttgcaaaagt 480

ttcaggtttg aaggtggcgg ggaacacata ctaggtttaa acagaacagg aaaaagttgc 540

aggttacgat gggttaatta tctgcaccct ggtctcaaaa gaggcaagat gacacctcag 600

gaagagagac ttgtgctgga acttcacgcc aagtggggaa atagatggtc aagaattgct 660

cgcaagttgc ctggtcgaac ggataatgag ataaagaact actggaggac tcatatgagg 720

aagaaagctc aagagcggaa aaggacagta ctatgtccgt ctcagtcatc ttctaaccat 780

tcctcctctt cgaattcctc aacaaacact actgcagtga cttgctctcc tttcccagag 840

actggcgaaa caagttttta cgacacaggc gggcatgagg cagcgacttt taaagggaaa 900

aacaacgagg ctgtcaaaga aaatgaaaaa gggacctctt tggatgacat atggaaggat 960

ttagaaaaca acatggaacc agtttgtgat gggtttagtg aagaaggtgg caatttcgat 1020

ttctcgatgc cttctccatc ttgggacttc tgtccagaca cactatggag cttggatgac 1080

gaggaaggta agatgtttct cccctacgag gatggaacac tgcttttgac tggataatca 1140

gaaattcttt attcaaattt gttcataaat gcagtacgta ttgctctgag agtaaactct 1200

aacctgtata gagcatgggt ttcctctgga gctttcttcg gtgtatcgat caacttacgg 1260

cataacctgt gtctctgcac tttgtgtgtt ttaatttgcc tttctagaat atagatactg 1320

tgtcaaatct cccacaagga gatggctatg cttaagaatg tataatagac cttcatatca 1380

agtttccctt taaatcaaag ccagtgctct aaagctttta cttcaagctg cataattgtc 1440

cttggtgatg ttcttgccac gaaggagaag g 1471

<210> 8

<211> 2327

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 8

gtacagatgc ttatgcctcg gcctctatcg ccattagcgt gtggttgcag caactatgca 60

cctactctta aacgactcat aacctgcact ctacaccatc accaccgtcg agagcctctt 120

cgccgtcttc ttcttcttag cagcaccacc accaccgcaa tcctcccatc tacgtactat 180

cccgtactct tgcctctggg attccctgga ggcttcggtt gtttactcac gggtaactct 240

ttcttcttca ggatgcagtc attctggtct ggaaccggca ttaataagaa caaggagatg 300

gtaaagaatc tgcagcgata tggagttata agttcaaaaa atgtggccga agtaatggaa 360

acagttgaca gggctttatt cgtacctgac ggaactcctg cttatgttga tagccctatg 420

gcaattggtt ataatgccac tatctctgca cctcatatgc atgccatgtg cctcgagttg 480

ttggagcaga atttgaagcc tggaatgcat gctttagatg ttggctcagg aactgggtat 540

ttgacagcat gctttgcact gatggttgga tcacaaggtc gtgctgttgg tgttgaacac 600

attccagagt tagttgacct ctcaataaaa aatatcgaga aaagtgttgc agctccgtta 660

ttcaaagatg gttctctgtc agttcatgtt ggtgatggaa ggcaaggttg gccagagttc 720

gcaccatatg atgccataca tgtcggggca gcagcccctg aactcccaca ggctcttctt 780

gaccagttaa aaccaggtgg cagaatggtg attccagtcg gcgatatatt tcaggagttg 840

aaggtggtcg acaagaaaca ggatggttcc atcagtgtcc acgacgaaac ttccgttcgt 900

tatgttcctt taacaagtcg ggattctcag ttgcgcaaca actaagttca actgtcttaa 960

gactaaagtt tctggtcgga gagaccgcca tgttctctgc ggtgcttcag agttttcctg 1020

tacagatagt tgtgttgttg gtactcaata cttgaataac aactgcgtgc tttccgcacc 1080

ctgctttcct gagatctaaa ggctgtagtt gtggaggcaa tccgactttc tgacactgtt 1140

atagtaacat atacttgtaa agaagttgcc agtcctagaa tgtgatgttc caacaaattt 1200

aatccaatat acgtgaagag acatattaga gcactttcgc cagtgaccat ctccaggtaa 1260

aaatgaaaaa aagagacaaa aacataacca aaagctcttc tagttcatgc aagactaaaa 1320

tctggccctc cctctttctt cagcaacact tacccggaca ggtcttccat ccaaattctg 1380

tccatctaag gcagcgacgg catcagccaa ctcattctga gatgagaaag taacaaaccc 1440

aaagccacgt gaacgtcctg tatccttttc gataatgacc cgggcattta acacctgacc 1500

gtgctcgctg aaaacttcct ccaggcgagc ttcatcaacg ctccatggaa ggttgccaac 1560

ataagcttta taaccaggct caggaggacg agagaggcgt ccagatcctc tacgaacagc 1620

tttatttaca gtcaagcgcc ttccatccat ggaataacgg tcaaacatgt ttatagcctt 1680

ctcggcttct tcaacggtac tcattgtcac gaacccaaaa cctcgacttg tatcagtttg 1740

tctgtcaaaa ataatctcag ctatctcaac agttccggcc tgctcaaaca acatggccaa 1800

cctctcactt tccagatcaa acggcaaatt cccaacatat agccttgtat cttcagctgg 1860

caatgaataa ccctcctcac cattagagcg cccatcttca tcgccctcca catcaccaac 1920

acctcgaacg tcctctgcag aaccatcctc tacctcggac tcagagtcgg aaatttcatt 1980

atcaaagcca tggctttcct ggttttccca tgtgggttcc tcctctaatt ctgtaagggt 2040

cgctgctgga ttattttttt ctccttcatc ttgttgctga gcccagtccg aggtctgtgc 2100

tacaaagggg acggtcagag agaaatgggt tttgggtctt agagagatag aatacgagag 2160

gtgaagcttg acgtttttgt gtggtacaga gaggtgttgg tgtggtggtc ttgaggtgaa 2220

gattgaaggt aaggaaaaga ggcatgatgc ttctgccttt gataaggtct tgaagctggg 2280

tatggtattg gctgacattt ctgcaacaaa aaggtgaggg agaggga 2327

<210> 9

<211> 1938

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 9

gttggtttcc gtgtttgggt ttgcgaaatt taggtgcttt gacgtgagaa agtgggttgc 60

agtcatcaat atcgtatctt ttggtttagt atttgatggg ttttcttctg tttttcgttt 120

cattggataa atttatattt tttgctggat attgcaggcc attgcctatt ttttcttact 180

cgattcatgt ttctggtttg ggaggagaga tggattggtt ggctttgttg gatcataccg 240

ggaagaaaga ttgcatattg atgaacgaga gttgtctgat ggattgatct ttgtttgcct 300

ttagttttat tggtttactt aaatatttag actttaatat gaaaaaacag agctttgaaa 360

tattgaacat ttgcattggc caactatctg gtgagaaaat ttcctagtta ttgcattgac 420

cgactgtctg ttgagaaata tcaggttatt gcattggcta attgtctagt gagaaacatc 480

caagttgtct tttcagggtc ttcacgagac tcttatgcag gataaatttc tgatatgttg 540

aatcattttt gttatattca tggcctcatt cctgttattt tacaggctgt ctactgaaag 600

ttttgttgca cacacataaa gagattttcc ggctaatcga ttgaggatga tagtgcatga 660

gctagatcct gatgttatcc gatggggtct tcattccctg attgatgttt ttgcactttc 720

acatagtggt tcgtgcaata gtatcacgca gtgtgccgca gatgctagtg aagttggata 780

tgttggacca tattatgctg gaactgtacc gtctaataac gtggagaatg atgccattat 840

tgctagtgct cttcaagagg aactttcacg aattgctacc gcagaagcat ctggggttaa 900

taatcctgaa caagaattag ttgttgcaca gaattggcat ggaagacacc atcattcagg 960

ctctggcgga aaatcccttg atgcagagga gccgacactt ttattggact tgttagatga 1020

agaagctctt gatggtgaag ttgggaagag gttcaatcag atggttccag ttcctcatgt 1080

accaaaagtc aacggcgaac tactaccatc agaggacgaa cagatttctg atcatcaaag 1140

gctgctagac aggttgaagc tatacgatct tgttgagaag aaggttcaag gagatggaaa 1200

ttgccagttt cgttctttgt cagatcaact ctattcttct cccgatcacc acaaatttgt 1260

gagacaacga gttattgatc agcttaaggc tcaacctcac ctgtacgaag gttacgttcc 1320

taggacgtac tgtgactatt tgaagaaaat gagcaagtct ggtgaatggg gtgatcatgt 1380

cacactgcaa gctgctgctg attcgtatgg tctcaggata tttgtgatga cttctttcaa 1440

ggatacatgt tacatcgaga tccttccgct ggttcaaaaa tccgaacgag ttatctactt 1500

gagcttttgg gcagaggttc actacaactc gatatatcct gaaggagagc tagctctgta 1560

tgagaccaag aaacagaaga aatggtggga actatgaacc tgcttcggtg gtacatcaga 1620

aagaagctcc ttccttctat cgtcgatgct cctatatata ttaagatatt actcttcacg 1680

accatgcttt ttcgtgcata gctccagaga agttgacgca ggcgccatgg gtgcttttcg 1740

tgctctgctt cgggtttcat atgtaaatat tgttccttag ttaggcttaa tccatttttt 1800

cctgcatgtt ttcagaaatt tgttgttatt ccttattgaa atcgtcccag ctctgataca 1860

atacgccgag gaactgtggt gctatgcaat tatatttaga atgaaatata tacgtggtaa 1920

ataattgaat atcagaag 1938

<210> 10

<211> 3585

<212> DNA

<213> Passiflora edulis

<400> 10

caaacaggca tatctaatcc tgtagacaaa aaaactggaa aatacaccta gccgcctcac 60

gcacacccct tcctcggaca atggcaacct catactccct ctaccatccc tcactttact 120

ccaccgctat cacgcataaa cacaggcacc ttcagcacaa tcctaaactc gctgcctccc 180

gccgttttcc ctcgagaatc tactgctccg acaactccaa cagtcactcc tcctcctcct 240

cagcttctgc tgtgaccacc aagttccgcc gtccatccga tgagaacatc cgcgacgagg 300

ccaggcgtca ccgctccgag aagaacgcct ccttctccgc caagtacgtt ccgtttaacg 360

ctgacccgga ctcctcagaa tggtactcgc tcgacgagat cgtgtaccgg agccgctccg 420

ggggccttct ggacgttcag catgacatgg aggctctgaa gaagttcgac ggtgcatact 480

ggcgtgacct cttcgactca cgcgtgggga agaccacctg gccttatggg tctggcgtgt 540

ggtcgaagaa ggaatgggtc ttgccggaga tcgacccgga cgacattgtc tccgcttttg 600

aaggcaactc gaatcttttc tgggccgagc ggttcggtaa ggagtttttg ggaatgagcg 660

atttgtgggt gaaacattgt gggattagcc acaccgggag tttcaaggat ctggggatga 720

ctgttctggt gagccaagtg aaccgtttac gtaaattgaa acgccccgtc gtcggcgtag 780

gctgcgcttc cacaggtgac acttctgccg ctctctctgc ctactgtgca tcggctggga 840

ttccctctat cgtgttcttg cctgccaata agatttccat cgcgcagttg gtgcagccca 900

ttgcaaatgg ggcttttgtg ttaagtattg acaccgattt cgacgggtgt atgaagctca 960

ttcgcgaggt tacggccgag ttgccgatat atttagcgaa ttcgttgaat agtttgaggc 1020

tagaagggca gaaaactgcc gctatcgaga ttttgcagca gtttgattgg gaggttccgg 1080

attgggttat cgtacctggt ggaaacttgg ggaacatata tgccttttac aaagggttta 1140

aaatgtgcaa agatttgggt ctcgtagaca gaatacctag gctggtttgt gctcaggctg 1200

ccaatgccaa tcctctgtac ttgtattaca agtctgggtg gaaagaattt cagcctgtca 1260

gggcaaatac aacgtttgct tccgctatcc agattggaga ccctgtttcc atcgacagag 1320

ctgtgtttgc tttgaagaat tcgaatggga tagttgagga ggcgacggag gaggagctga 1380

tggacgcaat ggcgcaagcg gattctacag ggatgtttat atgcccccat acaggggttg 1440

ccttgacggc tttgattaag ctcaggcaga gtggggttat aggccctatg gatagggcag 1500

tggtggtgag cacggctcat gggttgaaat ttacccagtc caagattgat tatcactcca 1560

aggcaatacc ggatttggct tgccggtttg ccaacccgcc ggtgcaagtg aaggctgatt 1620

tcggggtcgt catggatact ctcaaaaagt acttgggtca taattaaggt tttggcatct 1680

tcataaattt agcgcctaca agttgggttt cttttatctt tttctttttc acgtgccagt 1740

tctattgtta tataggtttt gatgagtagg atcctctata attgaagttt gacgcatgat 1800

ggttacccac cagcactaaa aaagaatcac aatggtggtt ctgctctaca aacataaatg 1860

gcacgcagta tgttgtgcct gcggtcatat aagctgtgca agaatatgaa tcattcgttc 1920

gcatagaacc tgtgcaacac ctacatatgt tcgggaaaaa gtccagagaa taaatcagca 1980

atcactagca tcagcctccc aatcagggtc acgtcactcc tccagccgta tctatactgg 2040

tctccacata ctcctctagc tggctcaggc ccgggtttaa cttgcccacc gtcggtgctt 2100

attttatcgt cccttggcaa gccaatccac cataatttct ggatggactc ttgttggatt 2160

tatattgttc gcatcatcat tcccatgtta ctacatagca aacctcaaag aatagaaggg 2220

tggcaagctt aattaccctg agttaaatga ctgacatagg gacgaaccga acccaaaatc 2280

cagcgtacaa gatctgacac taaaatacaa tcttgtaaaa gctctttttt ttcctggcaa 2340

tctattgtta ggacttgaaa tctctcgata aagcacatgc tcgaatatat gacactaagc 2400

atccgtgatg ttattggtaa attgttacat tgagagaaca gatccagcag tcaggtccca 2460

attgttttag ccccaaaaca gagaaaaatt ttcaggaata atcataaagc gaaatgcttt 2520

tgtcatctga cacactaacg agacggccag cgcggtcact tactcctgca ggtcgaaagg 2580

ccactcccca tacttggtcc gaatgattgc tcatcgtctg cacagcagct ctcataccaa 2640

gatcccaaag cctcactgtt ctgtcacttg agccagttgc aattgcgttt ccatctgggc 2700

tagcagcaac acttaatacc caacttgcat gaccagacat agctgtaatc aagctctttc 2760

cctcggcatc atacatgtgg acatgagcat catctgatgc agaaaagagc aatcgaggct 2820

cgatagggga ataaacaaga gagcgcacag gcatgaaatg cccttccaga tgatgaagaa 2880

atttagctcg agcaacgtca aaaacagaaa tagtgccatc cattgagcca caagcaagtc 2940

gtttcccgtc aggactccat gcaacagaca ggacaaattt cttgctgcta ttcttgtcag 3000

atggtttggg tccttcagga cgaggaattg acaaagtcgc gacgagtttc catgatgcag 3060

tatcccaaag cttgaccgaa gcactccccc caccagcaac cgcaagagtg tgcccctcgg 3120

gatgaaattg catctgccaa acttccgacg gtggagcttc gagggtagca atagtcgcat 3180

tggtatctac atcaaagacc cgcacgaagc agtcgagaga agcagaagcc gcgatgactc 3240

cggacggatg tgcagccacc gaaacgacac cgaggcagtg accggtgttg gtgcgttcga 3300

gcttcagctc gtcagtaccc cagagcttca cggtctcgtc tagcgacccg gtaaggagga 3360

gagggggtcg gtccctggtt gccggaaccc aggtacaagc ccagattgat tcctcgtgcg 3420

cgttatcaat tgatttcaac cctgccaact tcatcgcttg actgggtgac cggtcgttat 3480

tttttgctgc agtgtagaaa ccctagcacc agttacgcca ccggtcgtta attgtttgat 3540

gacgataagt cggttaagtc agcggtgccg tttcgaaaga taaac 3585

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 50S F(Artificial)

<400> 11

gcgcattcgg cgaaactcac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 50S R(Artificial)

<400> 12

atcagggcca tgaccaccca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Ts F(Artificial)

<400> 13

cagttggtgc agcccattgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Ts R(Artificial)

<400> 14

ggccgtaacc tcgcgaatga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> UBQ F(Artificial)

<400> 15

tcagtcacct ccggccttct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> UBQ R(Artificial)

<400> 16

cgagtgtggt gccggaactt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> OTU F(Artificial)

<400> 17

tcgtgctctg cttcgggttt 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> OTU R(Artificial)

<400> 18

caccacagtt cctcggcgta 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> OmpH F(Artificial)

<400> 19

agaggcaaga tgacacctca gga 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> OmpH R(Artificial)

<400> 20

ttcgaccagg caacttgcga 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Liom F(Artificial)

<400> 21

taaggcagcg acggcatcag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Liom R(Artificial)

<400> 22

tttcagcgag cacggtcagg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> EF1 F(Artificial)

<400> 23

ggctgagcgt gaacgtggta 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> EF1 R(Artificial)

<400> 24

cggcacaatc agcctgggaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 18S F(Artificial)

<400> 25

ttaaggccag gagcgcatcg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 18S R(Artificial)

<400> 26

agccgcggta attccagctc 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> eIF-5A F(Artificial)

<400> 27

tgggccgatg tccttgagag a 21

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> eIF-5A R(Artificial)

<400> 28

ggatgacttg aggctcccaa ctg 23

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.11960 F(Artificial)

<400> 29

tggacagcgg aatccacacg 20

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> Cluster-5862.11960 R(Artificial)

<400> 30

gcttcaacca gctcctgaga cg 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.13467 F(Artificial)

<400> 31

tccacttcgt tgcgctgtct 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.13467 R(Artificial)

<400> 32

tctgaccgca cccaacaacc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.68259 F(Artificial)

<400> 33

tcgcttggcc atctctgcaa 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.68259 R(Artificial)

<400> 34

cgtggcaggc catatttgcg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.13589 F(Artificial)

<400> 35

acagccacat ggtgtgcgat 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Cluster-5862.13589 R(Artificial)

<400> 36

ggacgacgga atcagcgtca t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.13751 F(Artificial)

<400> 37

tcacagtcac gccacacagg 20

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Cluster-5862.13751 R(Artificial)

<400> 38

cggccaaatc ttggtcgcat c 21

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.19659 F(Artificial)

<400> 39

gcgccatcct caggcttctt 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.19659 R(Artificial)

<400> 40

gagagactcg cgctgtcacc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.20992 F(Artificial)

<400> 41

tcagctgtgc ttgggttgct 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.20992 R(Artificial)

<400> 42

cgcctcgatc tcctccatgc 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.23604 F(Artificial)

<400> 43

ggaagtggtg gcagcggtta 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.23604 R(Artificial)

<400> 44

gctggttcgt gctcggacat 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.24391 F(Artificial)

<400> 45

aagcaccaca gcggtagcag 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.24391 R(Artificial)

<400> 46

tagagggagg gcgagggaga 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Cluster-5862.25752 F(Artificial)

<400> 47

ctgacgccac tgaatcctgc t 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.25752 R(Artificial)

<400> 48

atgcctggca gtagcgtagc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.25955 F(Artificial)

<400> 49

cgacgacgac gatgatggct 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Cluster-5862.25955 R(Artificial)

<400> 50

tgccgccaac aactgcaaac 20

Claims (5)

1.一种西番莲内参基因，其特征在于，为EF1基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的西番莲内参基因，其特征在于，所述的EF1基因作为西番莲不同组织的荧光定量内参基因。

3.根据权利要求1所述的西番莲内参基因，其特征在于，所述的EF1基因作为西番莲冷胁迫下的荧光定量内参基因。

4.权利要求1所述的EF1基因的引物序列如下：

EF1正向引物5′-GGCTGAGCGTGAACGTGGTA-3′

EF1反向引物5′-CGGCACAATCAGCCTGGGAA-3′。

5.权利要求4所述的EF1基因的引物序列在西番莲荧光定量中的应用。

Images