CN114292901B

CN114292901B - 一种乌饭树实时荧光定量pcr内参基因的筛选方法

Info

Publication number: CN114292901B
Application number: CN202111048325.3A
Authority: CN
Inventors: 肖家欣; 何锋; 桂良仙; 张晓平; 樊基胜; 张春龙
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-12-29
Anticipated expiration: 2041-09-08
Also published as: CN114292901A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术，公开了一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。该筛选方法包括以下步骤：(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；(3)将实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。本发明通过分析各候选内参基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，有助于在乌饭树基因表达研究中获得可靠的标准化qRT‑PCR数据。

Description

一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术，具体地，涉及一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。

背景技术

乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)常绿灌木，与蓝莓同属，其小浆果是饮食中酚类物质如黄酮醇和花青素的丰富来源。乌饭树也是一种药用植物，其果实和叶提取物具有镇定催眠、预防癌症等积极作用。

乌饭树的果、叶、根均可入药食用，记载于《开宝本草》、《本草纲目》、《中药大辞典》等中医药典籍，被我国历代本草学家极为推崇。在《中药大辞典》中，乌饭树被记载为具有“益精气、强筋骨、明目止泻”的功效；在唐代《本草拾遗》中就有记载“乌饭树树叶取汁渍米作乌饭，食之健如牛筋；止泻除睡，强筋益气力”。乌饭树中的黑色素含有极为丰富的有效成分，如花青素类、黄酮类、多酚类化合物、绿原酸类、环烯醚萜苷类、单宁类、三菇类、有机酸类、肌醇类和维生素等。随着对乌饭树资源的研究不断深入，其叶和果实中功能性成分的分子验证尤为重要。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是分子验证的重要手段，而qRT-PCR验证最重要的一个环节是内参基因的选择。传统的越橘属所使用的内参基因如actin、β-tubulin等，在乌饭树果实膨大成熟过程中，一般呈上调表达模式，不适合分析果实发育基因的转录水平。现有技术中，关于乌饭树内参基因的鉴定工作还未有相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；

(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以所述内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；

(3)将所述实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。

优选地，步骤(1)中所述乌饭树候选内参基因为肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶对应的所述内参基因引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.30所示。

优选地，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程包括：利用PrimerPremier软件提供多个与所述乌饭树候选内参基因合适的备选引物对，将所述备选引物对进行评分和特异性评价，筛选出该乌饭树候选内参基因对应的所述内参基因引物对。

优选地，所述评分的条件包括：

a、引物的长度在20-24bp之间；

b、引物3’端的5个碱基中含有1-3个G、C，末尾不是A；

c、扩增长度在80-150bp之间；

d、引物序列的GC含量在50％-60％范围内；

e、引物序列自身二聚体和交叉二聚体连续的碱基数少于4个，不连续的少于7个；

f、没有发卡结构的二聚体。

优选地，所述特异性评价通过所述实时荧光定量PCR的溶解曲线进行评价。

优选地，步骤(2)中，以1μg所述乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为基准，所述内参基因引物对中的每条引物的用量为0.1×10^-3-1×10^-3μmol。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：90-100℃预变10-20min；90-100℃解链5-15s，55-65℃退火25-35s，反应35-45个循环。

优选地，步骤(2)中，所述乌饭树组织选自乌饭树果实、乌饭树叶片和乌饭树嫩根中的至少一种。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明通过分析各乌饭树候选内参基因的表达变化，筛选出稳定性较高的基因作为乌饭树实时荧光定量PCR的内参基因，为研究乌饭树基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在乌饭树基因表达研究中获得可靠的标准化qRT-PCR数据。

附图说明

图1是实施例中10个乌饭树候选内参基因的溶解曲线图，其中，a为actin1，b为actin2，c为actin3，d为actin4，e为actin5，f为RP，g为UBE，h为UBQ，i为NADH，j为ADK；

图2是实施例中10个乌饭树候选内参基因的Ct值分布图；

图3是实施例中GeNorm软件分析乌饭树候选内参基因的表达稳定性；

图4是实施例中GeNorm软件分析乌饭树内参基因的最适数目；

图5是实施例中以NADH、ADK、NADH+ADK作为内参基因，分析乌饭树3个不同成熟度果实(绿果S1、红果S2和蓝果S3)中ACO与PG的表达量。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N为正整数且N≥2；

(3)将所述实时荧光定量PCR(以下简称qRT-PCR)得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。

根据本发明，步骤(1)中乌饭树候选内参基因的挑选方法，可以参照现有的植物内参基因相关研究文献从乌饭树转录组测序数据中挑选；乌饭树转录组测序数据可以是乌饭树的任意一个组织所获得的转录组测序数据，例如乌饭树果实的转录组测序数据、乌饭树叶片的转录组测序数据、乌饭树嫩根的转录组测序数据等。

根据本发明，步骤(2)中，所述乌饭树组织选自乌饭树果实、乌饭树叶片和乌饭树嫩根中的至少一种；优选为乌饭树果实。

根据本发明，针对乌饭树稳定内参基因研究的空白，通过分析各乌饭树候选内参基因的表达变化，筛选出稳定性较高的基因作为乌饭树实时荧光定量PCR的内参基因，为研究乌饭树基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在乌饭树基因表达研究中获得可靠的标准化qRT-PCR数据。

根据本发明，步骤(1)中所述乌饭树候选内参基因的数量为10个，分别为肌动蛋白1(actin1)、肌动蛋白2(actin2)、肌动蛋白3(actin3)、肌动蛋白4(actin4)、肌动蛋白5(actin5)、核糖体蛋白(RP)、泛素结合酶(UBE)、泛素蛋白基因(UBQ)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和腺苷酸激酶(ADK)。其中，actin1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，actin2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，actin3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，actin4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，actin5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，RP的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，UBE的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，UBQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，NADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，ADK的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

相应地，分别针对上述10个乌饭树候选内参基因，设计出各自对应的用于实时荧光定量PCR的内参基因引物对。

具体地，肌动蛋白1(actin1)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示：

正向引物actin1-F：GCTGCTTATGGTCTGGTCAT(SEQ ID NO.11)；

反向引物actin1-R：CACCCATTACTACTTCCCTCAG(SEQ ID NO.12)；

扩增长度：154bp；Tm值：57.8℃；

肌动蛋白2(actin2)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQID NO.14所示：

正向引物actin2-F：AGTCCTCTTCCAGCCATCTT(SEQ ID NO.13)；

反向引物actin2-R：GAACCACCACTGAGCACAAT(SEQ ID NO.14)；

扩增长度：132bp；Tm值：58.6℃；

肌动蛋白3(actin3)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQID NO.16所示：

正向引物actin3-F：CTCCAAGGACAGATTCAAGAGG(SEQ ID NO.15)；

反向引物actin3-R：GAGCAGCACGACAAGAGAAT(SEQ ID NO.16)；

扩增长度：136bp；Tm值：58.2℃；

肌动蛋白4(actin4)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQID NO.18所示：

正向引物actin4-F：GGACTCTGGTGATGGTGTGAG(SEQ ID NO.17)；

反向引物actin4-R：GCTCTGCTGTAGTAGTGAAGG(SEQ ID NO.18)；

扩增长度：158bp；Tm值：60.6℃；

肌动蛋白5(actin5)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQID NO.20所示：

正向引物actin5-F：GTCGTCTTCTCCACTACCAT(SEQ ID NO.19)；

反向引物actin5-R：ACACGGCTCTACATTACCAG(SEQ ID NO.20)；

扩增长度：196bp；Tm值：55.4℃；

核糖体蛋白(RP)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示：

正向引物RP-F：GCACAGCGATTCAGTTCTAG(SEQ ID NO.21)；

反向引物RP-R：CAACTACGGACAGAGCACTT(SEQ ID NO.22)；

扩增长度：137bp；Tm值：56.3℃；

泛素结合酶(UBE)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24所示：

正向引物UBE-F：CCCAAATCCTTCAGACCCAT(SEQ ID NO.23)；

反向引物UBE-R：CCTCGTCACTTATCTCCTCATC(SEQ ID NO.24)；

扩增长度：164bp；Tm值：61.1℃；

泛素蛋白基因(UBQ)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQID NO.26所示：

正向引物UBQ-F：CTACTGGCAATCCTACTCCTAC(SEQ ID NO.25)；

反向引物UBQ-R：GGAAATAGAGACGGACCAAGAC(SEQ ID NO.26)；

扩增长度：150bp；Tm值：59.1℃；

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.27和SEQ ID NO.28所示：

正向引物NADH-F：ACACCTCGTCCAGCAATATC(SEQ ID NO.27)；

反向引物NADH-R：CTCAACCGCCTCAACCTTAG(SEQ ID NO.28)；

扩增长度：162bp；Tm值：59.9℃；

腺苷酸激酶(ADK)对应的内参基因引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ IDNO.30所示：

正向引物ADK-F：GTGTCACTTGGCTACTGGAG(SEQ ID NO.29)；

反向引物ADK-R：GGCTTCTTCAGTGCTTCATC(SEQ ID NO.30)；

扩增长度：183bp；Tm值：57.6℃.

根据本发明，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程可以是采用现有技术公开的或者常规的引物设计软件，针对每个乌饭树候选内参基因设计出多个适于该乌饭树候选内参基因的引物对，再通过溶解曲线等方式进行评价，以选出最合适于该乌饭树候选内参基因的引物对作为内参基因引物对。

作为本发明中设计内参基因引物对的一种优选实施方式，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程包括：利用Primer Premier软件提供多个与某个所述乌饭树候选内参基因合适的备选引物对，将多个所述备选引物对进行评分和特异性评价，筛选出该乌饭树候选内参基因对应的所述内参基因引物对。

根据本发明，Primer Premier软件可以采用现有的各种版本，优选为采用PrimerPremier 6软件。

根据本发明，对备选引物对进行评分的条件包括：

a、引物的长度在20-24bp之间，过短则不易扩增，过长会增高延伸温度不适合聚合酶反应的进行；

b、引物3’端的5个碱基中含有1-3个G、C，末尾不是A；

c、扩增长度在80-150bp之间；

d、引物序列的GC含量在50％-60％范围内；

f、没有发卡结构的二聚体。

优选情况下，评分的条件b中引物3’端的5个碱基中含有3个G、C。

根据本发明，对备选引物对进行特异性评价通过所述实时荧光定量PCR的溶解曲线进行评价，具体地，判断备选引物对所对应的乌饭树候选内参基因的溶解曲线是否为单峰，如果为单峰，则表明该备选引物对具有特异性。

示例性地，实时荧光定量PCR的溶解曲线获得的过程为：将实时荧光定量PCR的反应液体系经65℃、0.05S，每0.05S上升0.5℃，直至95℃，连续检测信号。

根据本发明，步骤(2)中，实时荧光定量PCR分析所使用的乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA，可以通过常规的试剂盒或者现有技术中公开的方式制得，也可以是在现有试剂盒或方法的基础上进行改进。示例性地，可以采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(SYBR Green)获得乌饭树组织的RNA，再将乌饭树组织的RNA使用FastQuant RT Kit(with gDNase)进行反转录，得到相应的cDNA。

根据本发明，在获得提取得到的乌饭树组织的RNA后，采用酶标仪进行RNA的纯度及浓度检测，衡量核酸是否被污染的重要指标为OD₂₆₀/OD₂₈₀，高质量的RNA其比值在1.8～2.1之间，OD₂₃₀/OD₂₈₀是用来判断有机试剂及多糖污染的指标，当其比值大于2时，RNA纯度较高。

根据本发明，步骤(2)中，以1μg所述乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为基准，所述内参基因引物对中的每条引物的用量为0.1×10^-3-1×10^-3μmol。

具体地，实时荧光定量PCR的模板采用1μg乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA的100倍稀释液；实时荧光定量PCR的反应液体系的总体积可以采用常规的体积规格，例如10μL、25μL、50μL；反应液体系包括cDNA的100倍稀释液、含有内参基因引物对的两条引物的溶液和缓冲液。示例性地，实时荧光定量PCR的反应液体系可以采用已有的试剂盒或者在已有试剂盒的基础上改进获得的体系，例如RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(SYBRGreen)试剂盒，其含有的缓冲液为2×SuperReal PreMix Plus。

根据本发明，在对乌饭树组织进行RNA提取时，对乌饭树组织进行如下的预处理：将乌饭树组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入β-巯基乙醇浓度为3-8％的裂解液，涡旋剧烈震荡使乌饭树组织与裂解液充分混匀。具体地，乌饭树组织与β-巯基乙醇浓度为3-8％的裂解液的质量体积比为50-100：0.7(g/mL)。

根据本发明，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：90-100℃预变10-20min；90-100℃解链5-15s，55-65℃退火25-35s，反应35-45个循环。示例性地，实时荧光定量PCR的反应程序为：905℃预变15min；95℃解链10s，60℃退火30s，反应40个循环。

根据本发明，步骤(3)中，将实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析的具体过程为：GeNorm和NormFinder根据候选内参基因相对表达量Q进行评价，BestKeeper根据候选内参基因的Ct值进行评价；最后采用几何平均值法计算乌饭树候选内参基因表达稳定性的综合排名。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，乌饭树果实来自安徽省南陵县徽王莓岭蓝莓生态园，RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、FastQuant RT Kit(with gDNase)、SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司，其它原料和试剂盒均为市售品。

制备例

S1、采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取乌饭树果实样品的RNA，实验开始前先将镊子、枪头、离心管、研钵等进行严格的灭菌处理，并提前60min将制冰机打开，提前30min将实验室与超净工作台紫外灯打开进行紫外杀菌处理，实验全程需在超净台上进行，谨防各类污染；RNA的提取步骤参考多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的使用说明书，并作了如下改进：

①取0.08g乌饭树果实样品作为组织样品，在液氮中迅速研磨成粉末，加入β-巯基乙醇浓度为5％的裂解液SL700μL(665μL裂解液SL中加入35μL的β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡使组织样品与裂解液SL充分混匀；

②说明书中离心30s改为离心1min；

③说明书中最后一步加入40μL的RNase-Free ddH₂O，室温放置5min，12000rpm(～13400×g)离心1min，得到RNA溶液；

S2、将2μL步骤S1中提取得到的RNA溶液采用酶标仪进行RNA的纯度及浓度检测；制备1.5％的琼脂糖凝胶电泳，取5μL提取得到的RNA溶液，加入loading Buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，28SrRNA条带亮度约为18SRNA条带亮度的1.5～2.0倍，说明RNA无降解、具有良好的完整性；

S3、使用Tiangen FastQuant RT Kit(with gDNase)并参照其使用说明书进行反转录，具体步骤为：

①将步骤S1获得的RNA溶液在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH₂O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上；使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体；以下操作步骤在冰上进行，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成混合液，然后再分装到每个反应管中；

②按照表1所示的基因组DNA去除体系配制混合液，彻底混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体，得到反应液A；

③按照表2所示的反转录反应体系配制混合液Mix；

④将反转录反应中的混合液Mix，加到反应液A中，充分混匀后，依次在42℃孵育15min，95℃孵育3min之后放于冰上，得到乌饭树果实的RNA反转录获得的cDNA。

表1基因组DNA去除体系

组成成分	体积
		5×gDNA Buffer	2μL
Total RNA	1μg
		RNase-Free ddH₂O	补足至10μL

表2反转录反应体系

组成成分	体积
		10×Fast RT Buffer	2μL
RT Enzyme Mix	1μL
		FQ-RT Primer Mix	2μL
RNase-Free ddH₂O	补足至10μL

实施例

(1)根据植物内参基因相关研究文献中提供的方法，在乌饭树果实的转录组数据库中，挑选10个乌饭树候选内参基因，分别为肌动蛋白1(actin1)、肌动蛋白2(actin2)、肌动蛋白3(actin3)、肌动蛋白4(actin4)、肌动蛋白5(actin5)、核糖体蛋白(RP)、泛素结合酶(UBE)、泛素蛋白基因(UBQ)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和腺苷酸激酶(ADK)，其中，10个乌饭树候选内参基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示；

将10个乌饭树候选内参基因的核苷酸序列依次复制输入Primer Premier 6软件中，设置筛选引物的评分条件后，利用Primer Premier 6软件为输入的乌饭树候选内参基因的基因序列提供M条合适的备选引物对，并会对所设计的备选引物对进行综合评分，在Primer Premier 6软件中选出评分为最高的备选引物对引物后，再通过软件分析是否形成二聚体、发卡结构等DNA二级结构，最终选择符合以下条件的引物序列，以作为对应的乌饭树候选内参基因的内参基因引物对，具体见表3：

①引物的长度在20-24碱基之间，过短则不易扩增，过长会增高延伸温度不适合聚合酶反应的进行；

②引物3’端的5个碱基中最好有3个G、C，末尾最好不是A；

③扩增长度在80-150bp之间；

④引物序列的GC含量在50％-60％范围内；

⑤选择自身二聚体和交叉二聚体连续的碱基数少于4个，不连续的少于7个的引物序列；

⑥选择没有发卡结构的二聚体；

将获得的内参基因引物对由华大基因公司合成，采用PAGE纯化方式获得；

表3乌饭树候选内参基因对应的引物对

(2)将步骤(1)获得的各组内参基因引物对的引物，分别装入引物管中并以12000rpm离心3min，再加入内参基因引物对的摩尔数×10⁵倍的ddH₂O，涡旋振荡混匀使其充分溶解，制成内参基因引物对各自的浓度为10μM的正向引物工作液和反向引物工作液；

以制备例获得的乌饭树果实RNA反转录的cDNA为荧光定量反应体系的模板，使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒，在Bio-Rad CFX实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪上进行qRT-PCR反应，qRT-PCR反应的反应体系按表4配制，qRT-PCR反应的扩增条件如表5所示，反应结束后导出数据，每个样品做三次技术性重复；

表4实时荧光定量PCR的反应体系

反应成分	体积
		2×SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)	5μl
正向引物(10μM)	0.5μl
		反向引物(10μM)	0.5μl
cDNA	0.5μl
		RNase free dH2O	3.5μl

表5实时荧光定量PCR的扩增条件

同时，以qRT-PCR反应的反应体系生成溶解曲线，来判断内参基因引物对的特异性，溶解曲线的具体操作程序为：65℃、0.05S，每0.05S上升0.5℃，直至95℃，连续检测信号，结果见图1。从图1可以看出，表3中所示的10个乌饭树候选内参基因对应的引物对溶解峰单一，无引物二聚体，证明可以用于后续荧光定量PCR的分析；

(3)将步骤(2)获得的qRT-PCR数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件，分析乌饭树候选内参基因表达的稳定性；其中，GeNorm和NormFinder根据候选内参基因相对表达量Q进行评价，BestKeeper根据候选内参基因的Ct值进行评价；最后采用几何平均值法计算乌饭树候选内参基因表达稳定性的综合排名。

具体过程为：读取步骤(2)中qRT-PCR获得的Ct值，10个乌饭树候选内参基因的Ct值箱线图如图2所示，Ct值在17.61-29.73的范围内波动，不同的候选内参基因在乌饭树果实中的表达有一定差异，核糖体蛋白(RP)的变化差异最大，肌动蛋白3(actin3)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、腺苷酸激酶(ADK)的变化差异都比较小。

GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件的分析结果如下：

①GeNorm分析候选内参基因的稳定性

GeNorm软件通过平均表达稳定指数M来衡量候选内参基因的表达稳定性，M值越小，表明候选内参基因的表达稳定性越好；若M<1.5，则表示候选内参基因的表达相对稳定，可作为乌饭树的内参基因，若M>1.5，则表示候选内参基因的表达不稳定，不能作为乌饭树的内参基因；GeNorm软件的分析结果见图3和表6。10个乌饭树候选内参基因的M值均小于1.5，且都低于0.5，其中，肌动蛋白2(actin2)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和腺苷酸激酶(ADK)的M值小于0.15，表达稳定性较好；10个候选内参基因的稳定性从低到高依次为：

RP<actin5<UBQ<actin1<actin4<UBE<actin3<actin2<NADH＝ADK。

②GeNorm分析候选内参基因组合

GeNorm软件还能够通过分析配对差异值Vn/n+1，确定候选内参基因的最佳数目，选择多个稳定的候选内参基因从而消除使用单一内参基因引起的偏差。Vn/n+1的阈值为0.15，当Vn/n+1<0.15，则表明最适的内参基因数量为n个，无需选择更多的内参基因；当Vn/n+1>0.15，则需引入第n+1个内参基因；GeNorm软件的配对差异值Vn/n+1分析结果见图4，,所有的Vn/n+1均小于0.15，V2/3配对变异值为0.044，说明乌饭树果实选择2个基因作为内参基因时结果即稳定可靠，无需选择更多的内参基因。

③NormFinder分析候选内参基因的稳定性

NormFinder软件根据表达稳定值M衡量候选内参基因的表达稳定性；稳定值越小，则该基因的表达稳定性越好，分析结果见表6；NADH的稳定值最小，说明该基因的稳定性越好，肌动蛋白2(actin2)的稳定值最大，则肌动蛋白2(actin2)的稳定性最差，这个结果同GeNorm软件的分析结果基本一致。

④BestKeeper分析候选内参基因的稳定性

BestKeeper软件主要根据候选内参基因Ct值的标准偏差SD分析内参基因的稳定性，SD越小，表明候选内参基因的稳定性越好；若SD>1，则说明该基因不稳定，分析结果见表6；其中，肌动蛋白1(actin1)的SD值最小，表明肌动蛋白1(actin1)基因的稳定性最好，其他几个候选基因的SD值均小于1。综合标准差与变异系数，肌动蛋白1(actin1)、泛素结合酶(UBE)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)这3个基因的稳定性最好；泛素蛋白基因(UBQ)、肌动蛋白5(actin5)与核糖体蛋白(RP)这3个基因的稳定性最差。

表6 GeNorm、NormFinder和BestKeeper分析候选内参基因的表达稳定值和排名

⑤三个软件综合分析候选内参基因的稳定性

为了进一步确定乌饭树候选内参基因的表达稳定性以及三个软件的可靠性，将10个乌饭树候选内参基因分别按照在各个软件分析中的稳定性排序进行打分，按照稳定性从高到低的顺序打1-10分，结果见表7；综合三个软件的总分，分数最低的认为是稳定性最好的候选内参基因。表7的数据证明，总分排序的结果与GeNorm软件的分析结构最为相似，特别是最稳定的内参基因，即在所有样品中最稳定的候选内参基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和腺苷酸激酶(ADK)，稳定性比较差的候选内参基因是肌动蛋白5(actin5)和核糖体蛋白(RP)。

表7候选内参基因表达稳定性的综合排名

基因	GeNorm	NormFinder	Bestkeeper	综合排名
					NADH	1	1	3	5
ADK	2	3	4	9
					UBE	5	5	2	12
actin3	4	9	1	14
					actin4	6	2	6	14
actin2	3	10	5	18
					actin1	7	6	7	20
UBQ	8	4	8	20
					actin5	9	8	9	26
RP	10	7	10	27

内参基因稳定性的验证

为了进一步验证筛选得到的内参基因的稳定性，以稳定性较好的NADH、ADK、NADH+ADK、RP以及actin5分别作为内参基因，分析目的基因多聚半乳糖醛酸酶基因(PG)和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ACO)在乌饭树不同成熟度的果实中的表达模式。

PG和ACO一般均随着果实成熟而上调表达；根据候选NADH、ADK、NADH+ADK、RP以及actin5各自的表达量，计算目的基因PG和ACO在乌饭树不同成熟度果实(绿果S1、红果S2和蓝果S3)中的相对表达量，结果见图5。用候选内参基因RP分析ACO1、ACO2和PG这三个基因的变化趋势时，可以看出分析得到的ACO1和ACO2变化趋势是与预期不符的；用候选内参基因actin5分析ACO1、ACO2和PG这三个基因的变化趋势时，同样可以看出分析得出的PG变化趋势是与预期不符的；而在用NADH、ADK及NADH+ADK作为内参基因分析得出的结果，与预期的表达趋势是大体一致的，进一步验证了NADH和ADK作为内参基因的可靠性。

但是，在分析PG基因中，NADH和ADK两个基因的组合与NADH、ADK的结果有一些差别，故不建议选择两个基因的组合作为内参基因，综合内参稳定性验证的结果，认为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是最适合乌饭树果实基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法

<130> 2021.09.07

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1833

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

agactcgtct tgtttatgta cgtttggttg gtaagcaaat caagctcaaa caccttgata 60

atagatgagc tgagtttgaa acagacacga gccgagttcg agctctacta attttggacc 120

agccgagctt gaataatagt acaaaattca gctaggttcc tctttagcag cccaactata 180

agcccaaaaa attgttgctt ttgtctattt cacatgacaa taatgcaaag ctccatgcgt 240

aaaatgagta aaggcactcc aagcatggaa aagctacaat ctgtaactct ctctctagaa 300

aagagttcaa gcttccggaa ttaagaaaag catggaattt cgatccgatt tcatcttcct 360

cagtctgtaa agcaagaaaa atccacgctt tggaaccact tcaattcaaa aaaaacccaa 420

agcaaaaaga gaaaaagacg cacacaaacc cacacccaca aagaaactct tcagaatttg 480

taaagaaaac ttgagaattt ctagagagag agagagagtg atgatacttt tgcagtctca 540

ctcgaggtat cttctacaga tcttgtcaaa tcgggttcag aatgttgaga aaggggttga 600

attggatagc tactgggttg aatttggtga tatacgttac catattcagg catcaatgaa 660

gaatccccat ctcctgttgt tatctgtctc attacccacc ccgcctccag aaactgtttt 720

ctttggggga cttcctcttg gagccataga agctgtaaaa gctgcttatg gtctggtcat 780

acaaattctt gatcctccaa gagatggctt taatctcacc gtgaagttga atttaactaa 840

acttcctcca gatgaagaga acaaaaacaa tcttttggtg aagattgcat ctctgaggga 900

agtagtaatg ggtgccccat taagagtaat gctaaagcat cttgcttcaa ggactgttgc 960

tccggatata gataggcttg ttgcccttgt gcatcggcct acagagtctt ttttccttgc 1020

tccgcaggca gaaaaggtta ctgtggtttt tcctatgaga ttcaaggatt ccatagatac 1080

tgctcttgca acttcattcc tgcaggaatt tgtggaagca agacgtacag ctggactttt 1140

caatgcccct ccttgttcat ggtctccttc tcctccctca gaactgaagg gtgcgcctgt 1200

tgaggcgttg tctgcaaatg ccggatttgt ctcttttgtt cttttcccac gtcacgtaga 1260

aggcaataaa ctcgacaaaa ctgtttggaa tttatcgacg tttcatgcgt atgtcaatta 1320

tcatgtaaag tgttcagaag gattcatgca cactcgaatg aggcggcgtg tggagtccct 1380

gattcaggct ctggatcggg ccaaaccaga taaagagaaa gcaaagaaaa ctggacaaag 1440

tagatctttc aagcggctga gcctcaagga agccaggagc gggttgaagt cttgaagttg 1500

cggatgctgt aatcaagggg agaacatgtg aattggctgg gtttgcccag atctttgaaa 1560

gaaatggttc tgtttttgct tggaagatca ctgcaggcac ttgaggccaa gaagacgtct 1620

agagtttaga gactataaaa tgtgattttt gtcgggctgt actggtgcca cttaacacat 1680

tgtaaaattt ccccattagt aggtgttaca tcgctggtta actcatgtta tttgggtcat 1740

gaccctgtaa atctagctgc gatcgcttga gcatgtgtaa cgtcttgaac aatcttatct 1800

agccctaata ataatccgac acatgcttca aag 1833

<210> 2

<211> 2206

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

ctcgaaatga ttccccactc tctctcttca aaatttaaaa atcggaattt agtcctcatt 60

tcatttgcat ttcaaatcgc cattatacct cactatatta tctccctatc tacttccttt 120

cctctcctca tttcgttttg gccgttcgac ggaggagaga gaaaacagtg aggtctagtg 180

agagaaagct tgcgtgattt tcgatctaca atccaaacta cgttataaag aatggctgat 240

gcagaggata ttcaacccct tgtctgtgac aatggaactg gaatggtcaa ggctggtttt 300

gccggtgatg atgctcccag ggcagttttc cccagtattg taggtcgacc caggcatact 360

ggtgtcatgg ttgggatggg ccagaaagat gcttatgtag gtgacgaagc ccaatccaaa 420

aggggtattc ttaccttgaa gtatcccatc gaacacggta ttgtcagcaa ctgggatgac 480

atggaaaaaa tttggcatca cacattctac aatgagcttc gtgttgctcc agaagagcac 540

ccagttcttc ttacagaggc accactcaac cctaaggcca acagagaaaa gatgacccaa 600

attatgtttg agactttcaa tgttcctgcc atgtatgttg ccatacaggc cgtactctct 660

ctatatgcca gtggtcgtac aactggtatt gtgctggatt ctggtgatgg tgtgagtcac 720

actgtgccta tctatgaggg atatgctctt cctcatgcga tcctccgtct tgatcttgct 780

ggtcgcgatc ttacagatgc cctcatgaag atccttactg agagaggtta catgttcacc 840

accacagccg aacgggaaat tgtccgtgac atgaaggaaa agcttgcata cgtggctctt 900

gactacgagc aagagctgga gactgcaaag agcagctcct cagttgaaaa gaactacgag 960

cttcctgatg gtcaggtcat taccattggg gctgagagat tcagatgccc agaagtcctc 1020

ttccagccat ctttgattgg aatggaagct gcgggaatcc acgagactac gtacaactca 1080

atcatgaagt gcgatgtgga tattaggaag gatctttacg gaaacattgt gctcagtggt 1140

ggttcaacta tgttccctgg tattgcagac cgtatgagca aggaaattac tgctcttgct 1200

ccaagcagca tgaagatcaa ggttgtggca ccaccagaga gaaaatacag tgtctggatt 1260

ggaggatcta tccttgcatc cctcagcacc ttccaacaga tgtggatttc aaagggtgaa 1320

tatgacgaat ctggcccatc cattgtccac aggaagtgct tctgatttct caattgcttt 1380

ggtggtgagt ttctgtttcg ttaatttgtt ggcttttcat gttaattgtc atgaagtcag 1440

tctggttgac atggaattgc tgaggtgggg cttatgaatg gagggattaa tttgattggg 1500

atggattggt ttctcttcat catcagatgc ggttcatttt tagacgctgg ccttgcttca 1560

tctgtgattc aaccgtcttt ttagtaggat gcttgtaggt tgagagtggt tgtggtggat 1620

ttttcttttt ttctttcttt tttccctgtc ttttctttca attttcagat ttgtttcttt 1680

cccctgttat tatgctagta tttactgtat gagaattttt tattagcgtc tgtttgcggt 1740

cagaaattat tatggagatc atattttgat actgggttta aacattccaa gtattatgca 1800

tgggtaataa agtactttga taacctttgt gtctgctggt caatccaaat ctaaagcaat 1860

gaaacacagt tgtgggcacg gatgttaggc acatgccgaa cacggatgct ttcgggatgt 1920

gtttgagcac ctttttgttg tggggttcac ggttctggac tcatctaagt atgcatctgt 1980

gtatgtatat ctttgtgatc aaacttctcc aatatgttgc ggaggatctt catttaagtt 2040

atgttttcag cagatgcctc ccatcttgtt tcttgcaatt tgccagggaa tgctggtgtc 2100

ttgtcctgtc atattcatgt aatttgtaaa gcatgcgaac tcatcttata gaggggtggg 2160

gtcacttgaa tcttggtcag atttgccgaa tgttatcaga atggcc 2206

<210> 3

<211> 873

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

gaaggcaaaa agaacttacc gctttattgt attcaagatt gaggagaaac aaaagcaggt 60

ggttgtggaa aaggttggtg agcccactga gagctatgat gacttcactg cgagccttcc 120

tgctgatgag tgtcgatatg ctgtctacga ttatgacttt gtgacaaatg agaattgcca 180

aaagagcagg attttcttca ttgcatggtc ccccgataca tcacgggtga ggagcaaaat 240

gatttatgca agctccaagg acagattcaa gagggagcta gatggtatcc aggtagaact 300

acaagcaaca gatccaaccg agataggcct tgatgttatc aaatgccgcg ctgaaaaata 360

attgattctc ttgtcgtgct gctcgtgcat tggagtactt tgctcgtagc ttcactgaag 420

agaaatgtta atagtttcgg gacagtggaa cctgtttaag atatgatatt ggtttgctgt 480

tcagagctcg acattataat atttgtcctc atctagaacg agttcagtaa tttggagctt 540

atttgatgac ttcatcttgt gtggaactta atatacttgt gtctaattcg caagaccaat 600

gtatgtcaat atctgctatc atcttttggt ttgtgtttcc cgaccttgcg tgagacttgt 660

tctgatttgc aagaccagcg tctgctatca ccttttggtt tggttttaag tgggtagtgc 720

ttgaaaacaa ctgtacatca cggggccgaa gtaagaaatt ttttacccca gtatgtttga 780

atttgttcac catctggtat tctggtgagg aagtaagctc gtagagctgg gaatagtgtc 840

ctttgttttg aatattatga tcgattagct gat 873

<210> 4

<211> 1126

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

aatggccctt ttcccccaag aacgtgtcaa ccgggtccgt acatccagac tgtaatccga 60

tccaacggtc cggatcaaat ctctcccccc tcctttttct ataacccaca aactccattc 120

tcccatttcg cgtccattca tctccgcata cttgacttac cctcctctta ctttctctca 180

tctctctctc tctaggattt ccaggaggta gcataagatg gcagaagctg aggatattca 240

gccactcgtg tgcgacaatg gaacaggaat ggttaaggct ggatttgctg gagatgatgc 300

cccgagggct gtgttcccta gcattgtagg tcgacctcgt cacactggtg tgatggttgg 360

catgggccag aaagatgctt atgttggaga tgaagcccaa tccaagcgtg gtatcttaac 420

attgaaatac ccaatcgagc atggtattgt gagcaactgg gatgatatgg agaagatctg 480

gcatcacacg ttctacaacg agctccgagt tgccccagag gagcaccctg tcctccttac 540

tgaagcacct ctgaacccca aggctaaccg tgagaagatg acccaaatca tgtttgaaac 600

cttcaacacc cctgctatgt atgttgctat tcaggctgtg ctttccctat atgctagtgg 660

tcgtacaact ggaatcgtgc tggactctgg tgatggtgtg agccatacgg tccctatata 720

cgaaggatac gcactcccac acgccatcct tcgtcttgac ttggcgggcc gcgatctcac 780

cgatgctttg atgaaaatcc ttactgagcg cggctactcc ttcactacta cagcagagcg 840

ggaaatcgtg agggacatga aggagaagct cgcttatatt gccctagact atgaacaaga 900

gctagagact tccaaaacaa gctcctctgt tgagaaaagc tacgagcttc ccgatggcca 960

agtgatcacc attggcgcgg agcgtttccg gtgccccgag gttcttttcc agccgtcgat 1020

gattggaatg gaagcggcgg gaattcacga gaccacttat aattctatca tgaagtgtga 1080

tgtggatatc agaaaagatc tctacggaaa cattgtgctc agtggt 1126

<210> 5

<211> 2128

<212> DNA

<213> 未知

<400> 5

agagagagag gagagagaga gagtcgttgg gtagtcatta ccaaggaaag aatccgatac 60

acagagagag agagaagata attcaatgat tacaattcat atgctcgtct ctgaaatatg 120

aaatggatgg agtgaaaacc atcttctccg acccaccacc acttcacttt ccgtcgttga 180

gccgcccttt tcgcttccaa tcaacgtcgt cttctccact accatgatca cccccttcct 240

taaacccctt caaggatctc agcagcagat ccaccacctc ctcgctcttt ctctctcctc 300

tctcctctct catggacccc gccacctctc gccccgccgc tgtcatcgac aacggcaccg 360

ggtatactaa gatgggattt gctggtaatg tagagccgtg ttttatactt cctacagtcg 420

tcgccgtcaa cgattcattc gtaaaccaaa ctcgaagctc ttcaaaggga agcaattggc 480

tagcgcagca cagcgcaggc gtgatggccg atctcgattt cttcatagga gacgagggtt 540

tgtctagatc caaatcgaat agtacgtata ctctaacgca tccgattagg aatggccagg 600

ttgataattg ggatgccatg gagaggtttt ggcagcagtg tatattcaat tacttgcggt 660

gtgatccaga ggatcattat ttcttgttga ctgagagtcc gctgactccg ccggagagcc 720

gggagtacac aggcgagatt atgttcgaga ctttcaatgt gccggggctt tatatcgcgg 780

tgcagcctgt gcttgcactt gcagccgggt acacgacgtc taagtgtgag atgacagggg 840

ttgtagtgga tattggagat ggggctactc atgttgtccc tgttgcagat ggttacgtta 900

ttgggagcag cattaagtcg attccaattg ctggaaaaga tgtaactctc ttcatccaac 960

agcttatgcg ggaaagagga gagcatgttc ctcctgaaga ttcatttgaa gtagctcgaa 1020

aggtgaagga aacatattgc tacacttgtt ctgatattgt caaggagtat aataagcatg 1080

acaaagaacc agctaagtac atcaagcatt acagaggtat taaacctaaa acgggggcac 1140

catattcttg tgatgttggt tatgaacgtt ttcttggccc tgaggttttc tttaatcctg 1200

agatttacag caacgatttt gcaatgcccc taccagctgt aattgacaag tgtattcagt 1260

ctgcaccaat tgacacaaga agggctttgt ataagaatat tgtattgtct ggtgggtcaa 1320

caatgttcaa agacttcaac cgaagattac aacgggatct aaagaagatt gttgacgctc 1380

gtgtacttgc atctgatgcc cggctcggtg gagagttaaa gtcacaacca gtggaggtca 1440

atgttgtcag ccatcccatc cagcggtatg ctgtctggtt cggaggctct gtccttgcat 1500

caacaccaga attttttgcg gcttgtcaca ccaaagcaga atatgaagaa tatggggcaa 1560

gcatttgccg tacaaatcct gttttcaagg gtatgtattg acgcaaataa ctatgtcaga 1620

agatgttgta tgggcattca acgattgtaa tgcctcatca tttccacttc caacgtgctc 1680

cagatttgga gatccagtct acaggcggaa atcatgtgca atttagaggc ttagcttgca 1740

ggaggtggtg tacaatatat ctttggtttg atttgtacga aagtgaagtt tttgtattct 1800

ttcattagcg tagggggcag caagtagtca aaagactgac catgtctaaa ggcatatcta 1860

cattggtaac actgatataa gaaggttttt ttttttttca ctgttgttag ggagttgata 1920

ttcccttata ggacattctc aattaggtgg tttgattcat tcgcattgga ttgaggagga 1980

atagggttgg cgtaataagt agaaaagttc cctttatttg taatcaaaat ctgaactttt 2040

cattagtgtc tgtacattgt taatctttac atattggtga actgcttgca gacttattag 2100

ttgaggttgt tgatagaagc agcgagat 2128

<210> 6

<211> 1187

<212> DNA

<213> 未知

<400> 6

gatgatgtca tcaaaactaa aacaaaaact aaattgggaa acaaacaggg ccaatataat 60

ttggagataa aaatttgcgt taatcggtcg gtcaataaca taattttgag tctgttgggg 120

ctaatcggtg atattcagaa gttgtagggc gaaatttgcg gaactaagaa aataaacatg 180

tatcagccct aaattacaat tctatttacc gctccaaaac cttcatcgta aatcgaacaa 240

agctggcgga agcaccggcg actatcggcg gcttcggcga agagtagcac aggaagcagg 300

aagatgaatt ttgtgacgtc actttgtaga agattgaata tcaatgagct ggttacaaat 360

gctcctgtat acagctctgc tagtgatata actgggggag gattaagttt gacattcaga 420

cgctgggcta caaaaaagac ggcgggatcc acaaagaatg gtcgagactc caatccaaag 480

tatcttggag taaaaaagtt cggtggagag agagtgattc ctgggaatat cattgttcgt 540

caaagaggaa cccgattcca tcctggagac tatgttggaa tgggaaggga tcacaccctt 600

tatgctttga aagcaggttg tgtcaaattt gaacgccata agctgagcgg aaggaagtgg 660

gtgcatgttg agccgaagga aggccatgtc ctccaccctg tctattcaga tgcttcatca 720

gctcctaaga tgcagactgc tttctagact tcatcctttc attttcatcg agtgttcaat 780

atctgatgca acttcaagtg actgttcaga aacagttctg ttttcagttc tctctctttt 840

tttttttttg cttttgtttc ttctgttttt agaaacaggc agccctatta cttgattgga 900

aacaagctgc atctgaaatc ttgtagccaa aaaaatactg cctttgattc atgaattgga 960

ctcaacatgc gtcttgtgct gttgtcacgc caagattcag agctaaataa agtgtataag 1020

tacttttatg tgtttttcgt tttcaattac cggagatgag tatatcgttt gggtttgtct 1080

tttgtttttc attctcctcc agtcgatgag ggcaggaagc ttggtttggt tttgtttctt 1140

gttttgaagt gtggtgttca ataaggccac accaaattca attgcag 1187

<210> 7

<211> 1124

<212> DNA

<213> 未知

<400> 7

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gcgatctatt gaatcgtaca gtttctcatt cgacgtcagt agataatttg tactcaagat 120

taccaagatg tcatctccaa gcaagaggag agatatggat gtcatgaaat tgatgatgag 180

tgactatgct gtggagccta taaatgatgg aattagcgag ttcaatgtgg aattccatgg 240

tccaaaagaa agcctttatg aaggtggtgt atggaaagtc cgtgttgagc taccggacgc 300

ttacccttac aagtctcctt ccattgggtt tctgaacaaa attttccacc caaatgttga 360

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cccattaaat ggtgatgcag catcgctaat gatgaaggat cagaagcaat atgaacagaa 540

agtgaaagag tattgtgaac gttatgcaaa gaaagagaat atcaccagta ctttgtcaga 600

cgagagtgat gaggagataa gtgacgagga tgtcagtgat ggccgaagtt tgtctagtga 660

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gccaaatcta tttcatgttt ggtttttgac ttttacttaa atgtatgaca aaatgctatt 780

ttcttgtaaa tttatttatg gagcagtagt tagagactgg atacaaggta ccatgcttgg 840

tatctaatcc attatatatt ctggcacatt tgttcaaaga agaatagaaa tgaagttgtc 900

cttttcattc aatctcttgt tactgttcct gtaattattt gagcatgtaa caaattctcg 960

gattaggcgt ttatattaag tttgtcgtac tttagtgatt tgttatgcaa accaataaag 1020

cagggctcat ccttatcact catcaaagtc gtgtctagct gatccagatc actgcctggc 1080

tctcacatga gcttggtgcg agtctttcta actttttcaa gcat 1124

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<211> 2330

<212> DNA

<213> 未知

<400> 8

gttttcagct acactcagca aggaaatccg tcctgtttgc aagaaattta tgcaagatgt 60

aatgtcccac agccagctct acttgaattt agaagaaccc ttttccgtaa acgccctgct 120

tctgtaggcg atgactagat agttggggtt gtggtgattg caccgttata ccttctttct 180

ttcttttttt tttttttaaa ttgatttggg aatgggtgcg gaaggggagg cagctgagtc 240

gagcttgggc gtgagcggtg gtgaggaaga attggtagct ctcaacattc gatgctccaa 300

cggatcgaaa ttctcggtgc ggatgagcct cgaggcgacc gtcgaggcgt tcaaaactgt 360

tcttgcgcag aactgtgatg tgccggctga tcagcagagg ttgatttaca agggtcggat 420

cttgaagaat gaccaaaccc tagctagcta tggtttacag gcagatcaca ctgtccatat 480

ggtacgcggt tttgctccag cagcagcatc aacgcctgct gctgctgctg ctactggcaa 540

tcctactcct acctctggca atgcacaggg tgttggtttg aatgagggtg cgggcgttgg 600

aggtgttggt cttggtccgt ctctatttcc tgggcttggt ctcaactccc tgggaggctc 660

tggagcatct ggattatttg gagcggggct gccggaattt gaacaagtgc agcaacaatt 720

gactcagaat cccaacatga tgagagaaat aatgaacatg ccagccattc agggcctaat 780

gaataaccct gagctgatgc gcagcatgat catgaacaac cctcaaatgc gcgagatcat 840

tgaccgtaat ccagagcttg ctcatgttct caatgatcct ggtatccttc gacagacatt 900

agaagcagca cgaaaccctg agcttatgcg ggagatgatg cgaaacactg acagggcaat 960

gagtaacatt gaatcttctc ccgagggatt caacatgctc aggagaatgt atgaaaatgt 1020

tcaggaacca tttctcaatg ctacaactct ggctggaggc actggaaatg atccagggtc 1080

aaacccgttt gcagctcttt tgggaaatca aggtggtgtt tcccaaacca gagatggatc 1140

taacaatacc tcaaccactg ggtctcagac aactgcaggg tctactgttc caaactccaa 1200

tccccttcct aacccttggg gtggaactgg tggaggtccc caagcaaaca ctactgcaag 1260

gtcaaatcct tctggggatg ccagggcacc aaccattggt gggttaggag ggcttggtgt 1320

tccagagttg gagcgcatgt ttggcatgcc tgacccctct tcaatgaatc agctcttgca 1380

gaatccagct gtgtcacaaa tgatgcagag cttattatcc aacccccaat acatgaatca 1440

gtttcttggt ctgaatccgc aactccggaa tatgctcgac tcgaaccctc agttaaggga 1500

aatgatgcaa aacccagaga tgcttaggca attaacctcg cctgagacta tgcagcaaat 1560

gttgactgta cagcagggtc ttttgtctca gcttaacagg cagcaatcga ctcaggaaac 1620

aactcagact ggtgggactc aaggaacgca aaacaatatg ggacttgagt tgttgatgaa 1680

catgttaggt ggacttggag gtggtggctt ggctgttcca aacacgccta atgtgcctcc 1740

agaagagctt tatgcaactc aactgcaaca gcttcaagaa atgggtttct ttgatactgc 1800

agagaatatt agggcacttc gtgccacctc aggaaatgtt catgctgctg tggagcgact 1860

tttgaacaac cctggcctgt agttagtgca cctgtattga tgttcagtca aaaatacagt 1920

tgggcgtgta aaagtggacc attttcttgg aaaggatgaa aaacgtgttg gcactctcat 1980

tttgatttcg ggcctcgtga ataagtacac tttcaatcaa tgtttagagg tgaacctggc 2040

tgacaaagta ttttgcatta ccactgttac atgccctctc tctttctctt gttctctttc 2100

cctccctctc tgtgaccgtg cgctgatgta catacacaat taagtattct tccgtggaac 2160

atttcaaaat tgtatggatg tttgaggatg tgcaattcct gtcttctgtt tgtgttttag 2220

ttgaattgcc gttatgctgg gaaatttgct gatctttgtc tagggttgac cggagcccaa 2280

gtctcaattc ttatcagcgg atagaattat gtttatcttc ttcttcttct 2330

<210> 9

<211> 1289

<212> DNA

<213> 未知

<400> 9

cacacagaga gagagagaga gagtgagaga gagaggaaaa gcagcgatgg ggaggaagaa 60

gggagtggtg ttcgacgagg gggcgccgga tgatttcgat ccagagaacc cgtacaagga 120

cccagtggcg atgctggaga tgagggagca tatagtgaga gagaagtgga tccaaatcga 180

gacggccaag atcatccgtg agaagctcaa gtggtgttac cgcatcgagg gcgtcaacca 240

ccaccagaag tgccgacacc tcgtccagca atatctcgat tccactcgcg gcataggctg 300

gggcaaggac cagcgtcccc tttctcttca cggtcctaag gttgaggcgg ttgaggctga 360

gtgatttctt ccaggtcact gaaattagtt gtctcgttga caaataaagt gacgattgcg 420

agggttacct gtttagcatc tggtaaattg ttctgctgtt ggttgttttc tttcttgttg 480

aactagagtc aaattatgcg ggctttggct ttatgtttag tcttttgatt tttggcattg 540

taaactgata agatttgtat caaagcaaca attcaaagga catcagaaga tggaataagt 600

ttcttttctt tttcggtgga aaaatgcagt gtttgcccgt atttagctta tttgtgtttg 660

aaagtgctat gttgcagact tgcagtatct tgaacgagga ctgtcttatt ctagcaacaa 720

ctataggatg aagttgtaat gtctcataat gcgtggacct tgtaagggac aaatgacaga 780

ttggtccccc tgacttctgg gaaattgtat ttttgcctat aaccccctta cgaagggcaa 840

aatcattctt tcctcccata ccaccgccac atactcattc aaatttttgt gcgggataga 900

aggcccctgg agcactattt ggctgtgctt caagagcatt gaataatcat ttcccatttt 960

gcccctcaaa tcctatgtcc aaaaaaatgg atgtaccggt gtttcgatgc atatctcgta 1020

acgtgaaacg atgagaaaca aatgcaccaa aataccggta ggaacttatt tttttgacat 1080

agaggatttg ggctccccat tttgctaatt tgacccattt ttcacaacct tctttgaagg 1140

ctcaagtgta atggatcccc ctctagttcc tagaaatcca attctaagtg accctatcag 1200

aggatgaatg atgtacagtg ttagtgttat gtattaataa ttgaatttag tatgatttat 1260

gtcgtgatcc tctgatcttt tttatttat 1289

<210> 10

<211> 1219

<212> DNA

<213> 未知

<400> 10

ccatctctct ctctctctct ctcaaactgc actaagcttc agatcgaaaa cttagagaga 60

gaaaactccc ggaaggtcaa caatggcgag cccttcgtcc tcgtcagtga atttggaaga 120

cattccttca acggatctca tgaccgaact cttgcgtcga atgaaatgtt ccaccaaacc 180

agacaaacgc ctcattctta tcggcccgcc tggatctgga aaaggcacgc aatcaccaat 240

tattaaggat gagtactgct tgtgtcactt ggctactgga gatatgctta gggctgctgt 300

tgctgctaaa accccccttg ggattaaagc caaagaagcg atggaaaagg gagaacttgt 360

ttctgatgac ttggttgttg gaataattga tgaagcactg aagaagcctt catgtcaaaa 420

aggtttcatc cttgatggat ttccaaggac tgtggtccaa gcacaaaagc ttgatgacat 480

gcttgagaag cgtggagtca aagttgataa ggttctcaat tttgcaattg atgatgtaat 540

cttggaggag aggatcactg gtcgctggat ccacccttcg agtggtcgga cctaccacac 600

aaaatttgca cctcctaaag ttcctggtgt agatgatgtc actggagaac ccctgattca 660

acgtaaagat gatacagcag ctgttctcaa gtcaaggctg gaggcatttc ataagcaaac 720

ggaacctgta atcgactact atgccaagaa gagtattgtt gccaaccttc ctgcagagaa 780

accccccaag gaggtaacta ccgaggttca gaaggtgctc tcgtcgtgaa gaaaaaccga 840

tcttatttta actaggaatt gggttgaaca tttcatactc caagattttg ctcatatgta 900

tcatcacatt cctatatcac taacccagca gctattcgtt ttgtgttgct ttactttaag 960

gctttaagca ctggatctgt gagatctcga gttgagttga atctccgaaa taaaaaaaaa 1020

aaactagagc atatcagtcc ggtttgtgaa tgctgttttt gtggtgactg catgtcagaa 1080

tttaactagt gtttgaaaat ggatacggtg cagattttgg gaggagtttc cgtatatgaa 1140

aatgctggaa atgtcctagt cccttctcac aagatgcaaa ctcttcaaac ttaaaatgaa 1200

atttggagat gcgttttac 1219

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gctgcttatg gtctggtcat 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cacccattac tacttccctc ag 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

agtcctcttc cagccatctt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gaaccaccac tgagcacaat 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ctccaaggac agattcaaga gg 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gagcagcacg acaagagaat 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggactctggt gatggtgtga g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gctctgctgt agtagtgaag g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gtcgtcttct ccactaccat 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

acacggctct acattaccag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gcacagcgat tcagttctag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

caactacgga cagagcactt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

cccaaatcct tcagacccat 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

cctcgtcact tatctcctca tc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

ctactggcaa tcctactcct ac 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

ggaaatagag acggaccaag ac 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

acacctcgtc cagcaatatc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

ctcaaccgcc tcaaccttag 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gtgtcacttg gctactggag 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

ggcttcttca gtgcttcatc 20

Claims

1.一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用乌饭树转录组测序数据，挑选10个乌饭树候选内参基因，以挑选的10个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对；

（2）以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA 为模板，以所述内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；

（3）将所述实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合；

其中，步骤（1）中所述乌饭树候选内参基因为肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.1- SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶对应的所述内参基因引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11- SEQ IDNO.30所示。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程包括：利用Primer Premier软件提供多个与所述乌饭树候选内参基因合适的备选引物对，将所述备选引物对进行评分和特异性评价，筛选出该乌饭树候选内参基因对应的所述内参基因引物对。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述评分的条件包括：

a、引物的长度在20-24bp之间；

b、引物3’端的5个碱基中含有1-3个G、C，末尾不是A；

c、扩增长度在80-150bp之间；

d、引物序列的GC含量在50%-60%范围内；

f、没有发卡结构的二聚体。

5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述特异性评价通过所述实时荧光定量PCR的溶解曲线进行评价。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，以1μg 所述乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为基准，所述内参基因引物对中的每条引物的用量为0.1×10^-3-1×10^-3μmol。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：90-100℃预变10-20 min；90-100℃解链5-15s，55-65℃退火25-35 s，反应35-45个循环。

8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乌饭树组织选自乌饭树果实、乌饭树叶片和乌饭树嫩根中的至少一种。