KR102623817B1 - 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 국내에서 식품 및 한약재로 사용되고 있는 매실과 살구를 정확하게 구별할 수 있으므로, 매실과 살구의 재배 및 원료 혼용 방지에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on nuclear genome sequence for discriminating Prunus mume, Prunus armeniaca or hybrid of Prunus mume and Prunus armeniaca and uses thereof}
본 발명은 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
매실(Prunus mume; Japanese apricot, plum)은 장미과에 속하는 낙엽활엽교목 형태로, 매화나무의 핵과를 매실이라 부른다. 원산지는 중국 사천성으로 알려져 있으며 한국, 중국 및 일본 등에 널리 분포되어 있고 국내의 매실 주산지로는 전남 광양시 순천시와 경남 하동군 등이 있다. 매실은 숙신산(succinic acid), 시트르산(citric acid), 말산(malic acid) 등의 유기산을 포함하여 시토스테롤(sitosterol)과 같은 무기질을 내포하고 있으며 소화불량 해소, 피로 회복, 해열 작용 및 비타민C가 풍부하여 3000년전부터 건강보조 식품이나 약재로도 많이 사용되어 왔다. 특히 2015년 한해 매실의 2829톤이 농축액, 매실 절임, 매실주 등 많은 부분에서 가공되어 이용되었으며 간 기능 개선, 성인병 예방, 변비 예방 등 다양한 효능이 보고되었다.
살구(Prunus armeniaca; apricot)는 장미과에 속하는 목본류 형태로, 원산지는 동부아시아이고 국내를 포함하여 중국, 일본, 유럽 등 넓게 분포되어 있다. 살구에는 β-카로틴(carotene) 등의 성분들이 포함되어 있고, 이는 체내에서 비타민A로 전환되어 눈 건강에 좋고 노화 예방에도 효과적이다. 살구는 독특한 향이 있어 신선한 상태로 이용되거나 통조림, 잼, 건과 등으로 가공되기도 하며, 씨는 행인이라고 하여 한방에서는 진해 거담약으로 널리 이용되고 있다.
매실과 살구는 과실 및 수체 모양이 매우 유사할 뿐만 아니라 아주 가까운 근연종으로 상호교잡이 가능하여 잡종 품종들이 많기 때문에, 매실의 출하기가 되면 매실 과실과 매우 유사한 미숙 상태의 살구 과실이 매실로 둔갑되어 농산물의 유통질서를 어지럽히고 있는 실정이다. 따라서, 매실과 살구 과실을 명확히 구분하는 것이 필요하지만, 종래에는 과실 내의 핵 모양, 핵 표면의 홈, 구멍 모양 등의 식물 형태적 특성을 이용해서 매실과 살구를 구분했기 때문에 전문가가 아니면 그 구분이 어려웠다. 또한 매실과 살구의 중간계통들에 대한 종 판별은 더욱 어려워서 이들 종을 명확하게 구별할 수 있는 DNA 표지의 개발이 절실히 요구되고 있다.
최근 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종 내 품종 간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위해 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 감별은 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 근래에 발달한 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 통해 DNA 정보를 비교하여 차이점을 찾아내고, 이를 활용한 분자마커 개발은 매실, 살구 또는 이들의 교잡종의 정확한 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 분자마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다. InDel 마커는 염기서열에서 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 염기서열의 차이를 이용하는 것으로 종간뿐만 아니라 종내에서도 다양한 유전형으로 존재하여 품종 구분에 적합한 분자마커이다.
한편, 한국공개특허 제2005-0106967호에 '매실과 살구 과실을 구분하는 방법 및 이를 위한 SCAR 표지 프라이머'가 개시되어 있으나, 본 발명의 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 매실(Prunus mume), 살구(Prunus armeniaca) 및 매실과 살구의 잡종 개체 간의 게놈 염기서열을 비교하여 핵 게놈 내 Prude_001688 유전자(NCBI accession No. AP019297) 영역에서 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였다. 또한, 상기 InDel 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 매실, 살구 및 이들의 잡종 개체를 정확하게 각각 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 매실(Prunus mume), 살구(Prunus armeniaca) 또는 매실과 살구의 교잡종 구별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 매실, 살구 또는 매실과 살구의 교잡종 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 매실 또는 살구 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 매실, 살구 또는 매실과 살구의 교잡종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 국내에서 식품 및 한약재로 사용되고 있는 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 정확하게 구별할 수 있으므로, 매실과 살구의 재배 및 원료 혼용 방지에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 InDel 다형성 기반 프라이머 세트(표 2)를 이용하여 매실, 살구 및 이들의 교잡종 개체들을 대상으로 PCR을 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 매실(Prunus mume), 살구(Prunus armeniaca) 또는 매실과 살구의 교잡종 구별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 및 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는, 서열번호 1 및 2의 각 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 매실, 살구 및 매실과 살구의 교잡종 개체 간에 InDel(insetion/deletion) 다형성을 보이는 영역을 증폭시키기 위해 제작된 것으로, 상기 InDel 다형성을 보이는 서열은 서열번호 3으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 3은 삽입(insetion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 1에 나타내었으며, 본 발명에 따른 InDel 다형성은 매실, 살구 및 매실과 살구의 교잡종 개체의 핵 염기서열에서 Prude_001688 유전자 영역에 위치하는 것으로 확인되었다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 매실, 살구 또는 매실과 살구의 교잡종 구별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
매실 또는 살구 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 매실, 살구 또는 매실과 살구의 교잡종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 매실 또는 살구 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 매실, 살구 또는 매실과 살구의 교잡종을 구별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해서 상세하게 설명한다. 하기의 특정한 예시 및 실시예는 발명의 일부 구현예를 포함하는 것으로 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 여기에서 설명되는 특정 실시예로 제한되지 않고, 본 발명이 속한 기술 분야에 있어 통상의 기술자가 다양하게 구현할 수 있다는 것을 포함하는 것은 자명하다. 따라서 본 명세서에 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
재료 및 방법
1. 매실, 살구 및 이들의 교잡종 유전자원 수집 및 DNA 추출
본 실험에 사용된 매실 12개체, 살구 4개체 및 매실과 살구의 교잡종 개체 8개체, 총 24개체(청주, 강릉, 과천, 함양에서 수집)의 게놈 DNA는 액체질소를 이용하여 어린 잎 시료를 급속 냉각하고 막자사발로 분쇄한 후 plant gDNA Extraction kit(Biomedic)를 이용하여 추출하였다.
2. InDel 마커 개발
매실 12개체, 살구 4개체 및 매실과 살구의 교잡종 8개체의 게놈 염기서열을 CLC Main Workbewnch 프로그램(version 20)을 통해 비교·분석하여, 매실 핵 게놈의 Prudu_001688 유전자(NCBI accession No. AP019297) 영역에서 94 bp의 염기서열이 삽입된 것을 확인하였고(표 1), 상기 InDel 다형성을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다(표 2). 프라이머 세트는 최대 길이, 최소 길이, 증폭 산물의 크기, 온도, GC 비율 등의 조건을 조절하여 제작되었다.
매실의 InDel 다형성 염기서열 정보
GGTATGTTTTGCGCCATT GCATTACCCTTATTTCTTTATGTGACTGAGAACATTAAGCTATGCCAAAATTTTGTTGTCAGTAAAACTTTTTTATTTTATTATTACCAACCTGATCTGAGTCCAAGGTATNTGGTTTATTGGTTGAGAGTTCATCATTCCTCATAGTCTGTGAATAGAAACCTGCTAATATGATAACATTACTAGGCTTGCAAACATTGATCAGGAGTGAGTTGAATTTTTAAATATATGAAGTTTGATACTGTCTCAATGTAAAAT AGGTGAAAGGTATGCAAG (서열번호 3)
굵은 글씨체 및 밑줄 : 프라이머 위치.
밑줄 : 94 bp의 염기서열이 삽입된 위치.
본 발명의 프라이머 세트 정보
프라이머 명칭 서열(5'→3') (서열번호)
NC-InDel-19_Fwd GGTATGTTTTGCGCCATT (1)
NC-InDel-19_Rev CTTGCATACCTTTCACCT (2)
3. PCR을 이용한 DNA 증폭
상기 추출된 매실, 살구 또는 매실과 살구 교잡종의 게놈 DNA를 10 ng/㎕로 희석하여 DNA 1 ㎕(DNA 10 ng), InDel marker 2 ㎕(forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕), Taq mixture 10 ㎕ 및 증류수 7 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 3분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 52℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 10분 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.
실시예. 본 발명의 InDel 마커를 이용한 매실과 살구의 구별
매실, 살구 및 매실과 살구의 교잡종 간의 InDel 다형성에 기반하여 제작된 상기 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 매실 12개체, 살구 4개체 및 매실과 살구의 교잡종 8개체들의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행한 후 아가로스 겔에 전기영동하여 다형성 패턴 분석을 수행하였다.
그 결과, 매실 개체에서는 294 bp 크기의 밴드를 확인하였고, 살구 개체에서는 200 bp 크기의 밴드를 확인하였으며, 매실과 살구의 교잡종 개체에서는 294 bp와 200 bp 크기의 밴드를 모두 확인하였다(도 1). 이를 통해, 본 발명의 InDel 다형성에 기반한 프라이머 세트는 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 정확하게 각각 구별하는 것이 가능함을 알 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on nuclear genome sequence for discriminating Prunus mume, Prunus armeniaca or hybrid of Prunus mume and Prunus armeniaca and uses thereof <130> PN21391 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggtatgtttt gcgccatt 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cttgcatacc tttcacct 18 <210> 3 <211> 294 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Prunus mume <400> 3 ggtatgtttt gcgccattgc attaccctta tttctttatg tgactgagaa cattaagcta 60 tgccaaaatt ttgttgtcag taaaactttt ttattttatt attaccaacc tgatctgagt 120 ccaaggtatn tggtttattg gttgagagtt catcattcct catagtctgt gaatagaaac 180 ctgctaatat gataacatta ctaggcttgc aaacattgat caggagtgag ttgaattttt 240 aaatatatga agtttgatac tgtctcaatg taaaataggt gaaaggtatg caag 294

Claims (4)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 매실(Prunus mume), 살구(Prunus armeniaca) 또는 매실과 살구의 교잡종 구별용 프라이머 세트 조성물.
  2. 제1항의 프라이머 세트 조성물을 포함하는 매실(Prunus mume), 살구(Prunus armeniaca) 또는 매실과 살구의 교잡종 구별용 키트.
  3. 매실 또는 살구 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 매실(Prunus mume), 살구(Prunus armeniaca) 또는 매실과 살구의 교잡종을 구별하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 매실과 살구를 구별하는 방법.
KR1020210160943A 2021-11-22 2021-11-22 매실, 살구 또는 이들의 교잡종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 KR102623817B1 (ko)

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