CN114277033A - 中国桔梗rpl13内参基因序列及其引物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个中国桔梗RPL13内参基因序列及其引物与应用，属于基因工程技术领域。所述RPL13内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该RPL13基因可以做为对中国桔梗以及与其亲缘关系较近的桔梗科其它植物中的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因在中国桔梗及其同科其它植物的蓝、紫、白3种不同花色花器官中进行基因表达谱分析研究的内参基因。也可以做为对中国桔梗及其同科其它植物中的茎、叶及蓝、紫、白3种不同花色花器官共5种不同组织部位中的目标基因进行表达谱分析研究时所用的内参基因。

Description

中国桔梗RPL13内参基因序列及其引物与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因以及中国桔梗不同组织部位间目标基因进行表达分析的RPL13内参基因序列及其引物与应用。

背景技术

中国桔梗(Platycodon grandiflorus)为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属(Platycodo n L.)多年生草本植物，别名包袱花、铃铛花、僧帽花等，原产我国，广布华南至东北。桔梗属仅中国桔梗一种。作为卫生部公布的第一批药食同源目录品种，中国桔梗具有很高的药用和食用价值。除了药食以外，中国桔梗因其花开似铃铛，有蓝、紫、白等花色，单瓣、重瓣等花型，植株挺拔优美，花朵色彩清新淡雅，作为一种很好的园林观赏植物。对中国桔梗的研究主要集中在栽培应用、药用成分检测及功能分析等方面，近年来随着生物技术的迅猛发展，开展了诸如目标基因筛选克隆、转录组分析、基因组测序等分子生物学领域的研究工作，但与其做为一种药、食、观赏兼用的多用途经济作物的重要性来比，分子方面的研究相对还较少，关于中国桔梗目标基因表达分析内参基因的相关研究更是鲜见报道。

基因表达分析是阐明植物生命周期中的遗传、信号传导及代谢途径等复杂调控过程的重要工具。目前，转录组测序技术已成为分析生物体基因转录表达水平的普遍方法之一。实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)由于具有定量准确，特异性强，敏感度高，重复性好等特点，被广泛应用于基因表达定量和转录组数据验证等研究工作。然而，由于在试验中受RNA质量、反转录效率、引物特异性、样品量以及扩增效率等因素的影响，容易造成qRT-PCR结果与目标基因的真实表达量之间存在一定误差。为了提高qRT-PCR结果的准确性，需利用内参基因进行标准校正，内参基因的稳定性对qRT-PCR结果的准确性具有决定性影响。一般以在生物体的各个组织及各个生长阶段表达水平都较为稳定的看家基因(house-keeping Gene)如：肌动蛋白基因(actin，ACT)、亲环蛋白基因(cyclophilin，CYP)、转录延伸因子基因(elongation factor，EF)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、组蛋白基因(histone，HIS)、18S核糖体RNA基因(18S ribosomal RNA，18SrRNA)、微管蛋白基因(tubulin，TUB)、多聚泛素酶基因(polyubiquitin，UBQ)等作为内参基因。理想的内参基因应该是在所有的细胞、生理特性和样品类型中都稳定表达，但是目前尚未发现这样理想化的内参基因。大量的实验研究表明，在不同的植物、组织及生理状态条件下，内参基因的表达量并不是始终稳定表达。而且选择不适当的内参基因往往会导致错误结论。因此，根据具体的物种、材料及试验条件筛选合适的内参基因至关重要。

对于植物类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因的表达谱分析，由于不同研究者分析所用的物种、样品组织及实验条件等的差异较大，所选用的内参基因也有较大差异，另外关于适用于中国桔梗的内参基因鲜见报道。所以有必要筛选出适合用来对中国桔梗类黄酮/花青素色素合成途径中的色素合成相关基因或其它目标基因进行基因表达谱分析的内参基因。

发明内容

本发明主要目的是为了解决在对现有野生中国桔梗中的类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因进行表达情况分析时，缺少合适且稳定的内参基因及qRT-PCR分析用内参引物的问题。本发明提供一个长为570bp的中国桔梗RPL13基因序列，可以做为内参基因，根据研究需要设计相应的RT-PCR、qRT-PCR及Northern blot等分析对应的扩增引物来对中国桔梗以及与其亲缘关系相近的同科其它植物的不同花色材料的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因的表达情况进行分析。同时，该内参基因也可用做对中国桔梗及其亲缘关系较近同科的其它植物的茎、叶及花等不同组织部分中的目标基因表达情况进行分析时的内参基因。所提供的一对qRT-PCR分析用内参引物可以直接用做对中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官之间的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因的表达情况进行分析的qRT-PCR内参引物，也可做为中国桔梗茎、叶及蓝、紫、白不同花色花器官等不同组织部分中的目标基因表达情况进行分析的qRT-PCR内参引物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供中国桔梗RPL13内参基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供中国桔梗RPL13内参基因在中国桔梗茎、叶及蓝色、紫色、白色不同花色、不同组织部位的目标基因进行表达谱分析研究中的应用。

进一步，优选的是，该内参基因做为分析中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况的内参基因。

进一步，优选的是，分析采用qRT-PCR法。

进一步，优选的是，采用qRT-PCR法分析时，所用的内参引物如下：

正向引物：5’-gtccaaggctggtgattc-3’；

反向引物：5’-cgcggactattggtaaataag-3’。

进一步，优选的是，qRT-PCR法分析时，扩增体系为：

cDNA 1μL，

Green qPCR SuperMix 5μL，上游引物10μmol·L^-10.2μL，下游引物10μmol·L^-1 0.2μL，Nuclease-free H₂O 3.6μL，总计10μL；

扩增程序为：94℃预变性30s；95℃变性6s，60℃退火+延伸30s，共45个循环。

本发明第三方面提供中国桔梗类花色素合成基因表达情况分析的内参引物，所述的内参引物如下：

正向引物：5’-gtccaaggctggtgattc-3’；

反向引物：5’-cgcggactattggtaaataag-3’。

申请人在已完成的中国桔梗蓝、紫、白3种不同花色花器官组织的转录组测序结果数据，根据unigene表达量FPKM值在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官各3个生物学重复共9个不同样本中的一致性筛选了9个较常用的内参基因进行稳定性分析，9个常用内参基因分别为aquaporin(AQP)，ɑ-Tubulin(ɑ-TUB)，β-actin(β-ACT)，cyclophilin(CYP)，elongation factor 1-α(EF-1α)，histone(HIS)，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)，60S ribosomal protein L13-1(RPL13)和polyubiquitin(UB Q)。利用geNorm、Normfider和Bestkeeper3个软件分析这9个候选内参基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种花色单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花植株的茎和叶共6种不同材料各3次重复总18个样品中的稳定性，根据软件分析结果再采用几何平均值计算候选内参基因表达稳定性的综合排名，通过综合排名筛选出表现最稳定的候选基因为RPL13基因，再以RPL13做为内参基因对中国桔梗蓝、紫、白3种不同花色花器官组织转录组测序结果中类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因的表达情况进行qRT-PCR分析验证。验证结果发现利用RPL13基因的qRT-PCR内参引物对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中10个色素合成相关基因表达谱的分析结果与转录组测序的分析结果完全一致。综上，通过对候选内参基因qRT-PCR结果稳定性综合评价，再结合对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因的验证结果证明：RPL13基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种花色的单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花器官植株的茎和叶6种不同材料各3次重复总18个样品中的表达差异最小，表现最稳定；RPL13基因的一对qRT-PCR内参引物，可用来做为对中国桔梗蓝、紫、白3种不同花色花器官中的类黄酮/花青素合成途径中的花色素合成相关基因的表达情况进行分析的内参引物。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、本发明公开了来自于中国桔梗(Platycodon grandiflorus)中的一个RPL13基因的核苷酸序列以及根据该核苷酸序列设计的内参引物，为首次报道的可做为中国桔梗类黄酮/花青素合成途径相关基因表达分析时的内参基因及qRT-PCR分析用内参引物。该内参引物可直接做为对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的基因表达情况进行qRT-PCR分析时的内参引物。另外，由于该RPL13基因在中国桔梗的蓝、紫、白色单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花器官植株的茎、叶共6种不同的组织部位中表达非常稳定，因此该RPL13基因也可做为中国桔梗以及与中国桔梗亲缘关系较近同科其它植物的某一目标基因在中国桔梗以及与中国桔梗亲缘关系较近同科其它植物的茎、叶及蓝、紫、白不同花色花器官进行基因表达情况分析时的内参基因。

2、理想的内参基因在各种类型的组织、细胞和各种实验因素条件下应均恒定表达。然而许多研究表明并没有表达绝对稳定的内参基因，任何一种内参基因所谓的恒定表达都只是在一定类型植物或实验条件下“有范围”的恒定。因此，前人文献报道的一些来自于其它物种和组织中的色素合成途径相关基因表达分析时所用的内参基因和引物，不一定适合于中国桔梗中的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因表达分析。而且，关于中国桔梗以及其同科其它植物的内参基因鲜见公开报道。本申请提供了一个来自于中国桔梗的RPL13内参基因核苷酸序列及其一对qRT-PCR分析用内参引物，可用来做为对中国桔梗的类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况进行分析时的内参基因及qRT-PCR分析用内参引物。而且，由于该RPL13基因在中国桔梗的不同组织部位(包括中国桔梗的蓝、紫、白色单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花器官植株的茎和叶)中表达差异非常小，因此该RPL13基因也可做为中国桔梗的某一目标基因在中国桔梗的茎、叶及蓝、紫、白不同花色或单、重瓣不同花型花器官的不同组织部位中表达情况进行分析时的内参基因。另外，由于亲缘关系较近的同属或同科植物中的同一类内参基因的保守性相对更高，因此RPL13基因也可以进一步做为除中国桔梗之外的与中国桔梗亲缘关系较近的桔梗科其它植物不同花色材料(或品种)间类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况分析的内参基因及qRT-PCR分析的内参引物。

3、与qRT-PCR分析用引物扩增片段相比，半定量RT-PCR和Northern blot等分析需要扩增的片段要长的多，所以进行目标基因表达量qRT-PCR分析用内参引物不一定适合RT-PCR和Northern blot分析用。本发明不仅提供了一对可以直接用于中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中相关基因qRT-PCR表达分析用的内参引物，而且还提供了该RPL13基因长为570bp的核苷酸序列，研究者可以根据研究需要设计逆转录(reverse transcription PCR，PCR RT-PCR)分析的内参引物，还可以设计扩增合适长度的RPL13基因片段，做为对这些基因表达情况的Northern blot分析时的内参基因核酸杂交片段。

附图说明

图1为中国桔梗不同组织材料；A、B、C、D、E、F分别为中国桔梗的蓝色单瓣花、紫色单瓣花、白色单瓣花、紫色重瓣花、蓝色单瓣花植株的茎杆和叶片；

图2为RPL13和其它8个候选内参基因的qRT-PCR扩增曲线和熔解曲线；

图3为RPL13和其它8个候选内参基因的C_t值分布图；箱体代表C_t值的集中范围，箱体中央横线代表中位数，箱体上、下边分别代表上四分位数和下四分位数，箱体上、下端分别代表最大值与最小值；

图4为以RPL13做为内参基因对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因表达情况的qRT-PCR分析结果。蓝、紫、白分别代表中国桔梗的蓝色、紫色及白色花器官。＊＊＊表示P＜0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号代表质量百分数。

中国桔梗(公知公用材料，吴姝菊，孟玥，野生桔梗的综合开发与利用研究，北方园艺，2010，(24)：219-221)蓝、紫、白色单瓣花器官组织进行转录组测序。根据植物中常用的内参基因名称在转录组测序结果搜索该类基因的gene id及其对应CDS序列和核苷酸序列，再根据gene id搜索该基因在中国桔梗蓝、紫、白色单瓣3种不同花色花器官各3个生物学重复总9个样品中的FPKM值，选择FPKM值在9个样品中都大于100且基本一致的内参基因做为候选内参基因。共筛选了9个候选内参基因，其中RPL13内参基因核苷酸序列为(下划线为qRT-PCR分析用内参引物位置)：atggtgaagcataacaatgttatcccaaatggccacttcaagaaacactggcaggagcgtgttcgcacctggttcaaccaaccagcccgtaaaaccaggagaagaattgcaagacaaaagaaggccgtgaagatctttcccaggcctactgctgggccacttcgtcccattgttcatggccagacattgaagtacaacatgaaagtcagggctggacgaggattctctcttgaggagcttaaggcagcaggcattccaaagaagcttgccccgacaattggtatctctgttgatcaccgccgaagaaaccgatctctagaaggtctccagacaaatgttcagaggttgaagacatacaaggccaaattagttgtcttcccaaggcgtgcacgcaagtccaaggctggtgattctgcccctgaggaactggctacagcaactcaagtccaaggtacttatttaccaatagtccgcgagaagccagctgccgagcttgttaagatcactgatgaaatgaaatccttcaatgcctatgccaagctgcgtattgagaggacaaatgaacgtcat.

其它8个候选内参基因AQP、ɑ-TUB、β-ACT、CYP、EF-1α、HIS、GAPDH、UBQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.11所示；及10个中国桔梗类黄酮/花青素合成途径色素合成相关基因DN23871_c1_g5_i5_1、DN25860_c1_g2_i2_1、DN21700_c0_g1_i1_2、DN10067_c0_g1_i1_1、DN18511_c0_g1_i2_1、DN13766_c0_g1_i7_1、DN15424_c0_g1_i1_2、DN20596_c0_g2_i6_2、DN22437_c0_g1_i9_2、DN25292_c0_g2_i1_2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12-SEQID NO.21所示。

同时，根据转录组测序KEGG数据，选取中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因，其中有2个基因在中国桔梗蓝、紫、白色3种花器官之间表现一定差异表达(表1)。根据中国桔梗RPL13基因核苷酸序列，利用Roche LCPDS2软件设计引物，RPL13基因引物序列如下：

正向引物：5’-gtccaaggctggtgattc-3’，(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-cgcggactattggtaaataag-3’。(SEQ ID NO.3)

以中国桔梗的蓝、紫、白色单瓣花器官、紫色重瓣花器官、蓝色单瓣花植株的茎杆和叶片共6种不同材料。每个材料3个生物学重复总18个样品组织的cDNA为模版进行qRT-PCR扩增。按照mirVana^TM RNA Isolation Kit说明书提取中国桔梗不同材料总RNA，取部分总RNA利用NanoDrop 2000分光光度计检测浓度及OD260/OD280值，再通过质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取0.5μg总RNA按照

All-in-One Fir st-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR说明书反转录合成cDNA，合成的cDNA稀释10倍后-20℃储存备用。

通过

480Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)进行qRT-PCR反应，反应体系：cDNA 1μL，

Green qPCR SuperMix 5μL，上、下游引物(10μmol·L^-1)各0.2μL，Nuclease-free H₂O 3.6μL。反应程序：94℃预变性30s；95℃变性6s，60℃退火+延伸30s，共45个循环。每反应设置3次技术重复。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。

利用Microsoft Excel 2016对原始C_t值进行统计计算得出平均C_t值(Mean C_t)。利用geNorm、Normfider和Bestkeeper软件分析候选内参基因在中国桔梗不同样品中的稳定性，geNorm和NormFinder软件在导入数据时，先将每个样品的原始C_t值根据公式Q＝2C_tmin-C_t sample(C_t min为依次从各候选内参基因中选出的各样品中的最小C_t值，C_t samp le为该候选内参基因的各样品Ct值)转换成相对表达量Q，再将Q值输入geNorm或Nor mFinder软件，计算得到各内参基因的平均表达稳定值(M或S)，该值的大小反映了基因稳定性的高低。BestKeeper软件可直接分析各候选内参基因原始Ct值之间的标准差(stand arddeviation，SD)和变异系数(co-variance，CV)即可筛选出最适内参基因。SD和CV值越小，基因表达越稳定，若SD值大于1，说明该基因稳定性较差。根据geNorm、NormF inder和BestKeeper软件分析得到的候选内参基因的稳定性值，再采用几何平均值法计算候选内参基因表达稳定性的综合排名，通过综合排名筛选出表现最稳定的内参基因。

以通过综合排名筛选出表现最稳定的候选基因做为内参基因，对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个花色素合成相关基因的表达量进行qRT-PCR分析(qRT-PCR反应体系及程序与上文所述一致)。qRT-PCR结果采用2(^-ΔΔCt)法计算目标基因在中国桔梗不同花色花器官之间的表达变化。统计学分析采用平均数±标准差方式，两组样品之间比较采用独立样本t检验(α＝0.01)，p＜0.05被认为具有统计学差异。运用Microsoft Excel2016和R 3.2.3软件处理数据，绘制图表。

表1中国桔梗3种不同花色花器官转录组测序结果中筛选到的9个候选内参基因及10个类黄酮/花青素合成途径相关基因的FPKM值

表2 9个候选内参基因及10个类黄酮/花青素合成途径相关基因表达qRT-PCR分析引物

表3 9个候选内参基因C_t值分析

排序	内参基因	平均值(MD)	标准差(SD)	变异系数(CV)
					1	CYP	24.063	0.376	1.561％
2	GAPDH	20.272	0.520	2.565％
					3	RPL13	22.187	0.747	3.356％
4	HIS	20.385	0.701	3.441％
					5	β-ACT	21.289	0.923	4.335％
6	UBQ	22.217	0.975	4.387％
					7	EF-1α	23.249	1.148	4.938％
8	ɑ-TUB	22.008	1.216	5.525％
					9	AQP	23.277	1.786	7.673％

表4 9个候选内参基因稳定性分析

表5 9个候选内参稳定性综合排序分析

排序	内参基因	几何平均数
			1	RPL13	1.587
2	β-ACT	2.714
			3	CYP	3.634
3	HIS	3.634
			5	GAPDH	3.684
6	UBQ	3.780
			7	<sub>ɑ</sub>-TUB	6.592
8	EF-1<sub>α</sub>	7.319
			9	AQP	9.000

从表1可以看出：根据转录组测序结果中筛选到的包括RPL13在内的9个候选内参基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官共9个样品中的FPKM值都超过100且基本一致。中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因有2个在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官表现一定差异表达：其中DN23871_c1_g5_i5_1在中国桔梗的蓝色、紫色花器官中相对中国桔梗白色花器官都表现为上调表达，在中国桔梗的紫色花器官中相对蓝色花器官也表现为上调表达；DN25860_c1_g2_i2_1在中国桔梗紫色花器官中相对白色和蓝色花器官表现为上调表达，在蓝色和白色花器官之间表现为无差异；其它7个候选内参基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官中的表达无明显差异。

从图2可以看出：包括RPL13在内的9个候选内参基因的qRT-PCR的熔解曲线均为明显的单一峰，不存在引物二聚体，说明9个内参基因引物的特异性都较好，专一性高，结果准确可靠，符合qRT-PCR标准。

从图3和表3可以看出：9个候选内参基因在中国桔梗不同组织样品中的C_t平均值最低的为GAPDH，最高的为CYP，波动范围相对较小。单个候选内参基因在不同样品间的C_t值差异最小的为CYP，最大的为AQP。C_t值与表达量成反比，因此GAPDH的表达量最高，CYP表达量最低，其它候选内参基因C_t值介于二者之间。9个候选内参基因中CYP变异系数最低(1.561％)，其稳定性也最好，而AQP的稳定性相对最差(CV为7.673％)。

从表4可以看出：geNorm和Normfider软件分析结果显示RPL13基因在9个候选内参基因中稳定性最好，而AQP的稳定性最差。Bestkeeper软件分析得出的结果则是CYP的稳定性最好，但也是AQP的稳定性最差。

从表5可以看出：利用Excel对geNorm、Normfider和Bestkeeper 3个软件分析出的9个候选内参基因的稳定性综合性评价结果表明RPL13的稳定性最好，因此RPL13最适合做为本研究的内参基因。

以通过稳定性综合分析筛选出的RPL13通过对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因的表达量进行qRT-PCR分析，对筛选到的RPL13的稳定性进行验证。

从图4可以看出：中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因中有2个基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官中的表达水平表现一定差异表达，其它10个表达无差异。qRT-PCR表达分析结果与转录组测序分析结果相一致。通过验证结果再次证明RPL13在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官中的表达稳定，可以用来做为对中国桔梗不同花色花器官材料间的类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因qRT-PCR分析的内参基因。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南省农业科学院花卉研究所

<120> 中国桔梗RPL13内参基因序列及其引物与应用

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggtgaagc ataacaatgt tatcccaaat ggccacttca agaaacactg gcaggagcgt 60

gttcgcacct ggttcaacca accagcccgt aaaaccagga gaagaattgc aagacaaaag 120

aaggccgtga agatctttcc caggcctact gctgggccac ttcgtcccat tgttcatggc 180

cagacattga agtacaacat gaaagtcagg gctggacgag gattctctct tgaggagctt 240

aaggcagcag gcattccaaa gaagcttgcc ccgacaattg gtatctctgt tgatcaccgc 300

cgaagaaacc gatctctaga aggtctccag acaaatgttc agaggttgaa gacatacaag 360

gccaaattag ttgtcttccc aaggcgtgca cgcaagtcca aggctggtga ttctgcccct 420

gaggaactgg ctacagcaac tcaagtccaa ggtacttatt taccaatagt ccgcgagaag 480

ccagctgccg agcttgttaa gatcactgat gaaatgaaat ccttcaatgc ctatgccaag 540

ctgcgtattg agaggacaaa tgaacgtcat 570

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtccaaggct ggtgattc 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgcggactat tggtaaataa g 21

<210> 4

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gggaatccgc tagtggggct aatttttgcg gcccttgctc atggattcat agtggttgtg 60

atgataggtg ccggtctccg tttctccgcc ggacacctca acccagccgt cactctcggc 120

ctatgctttg gtggctatat caccgtcttc cgatcctttc tttacttgat tgatcagttg 180

ttagctgctg ttgctgcctg tgctctactc aagtatctta ccggagcctc ggtgagtcca 240

attttgactt tggcccatac acaaaaagaa ggctacaaat tgggcttaag cccagtatga 300

tttaacactc gctcgcaaaa gttagggcct cgtgtaataa aatgtttgaa agtgtacagt 360

acaactaaaa aatgcattaa tatatatttt ggattttgtt ttgtgcagac agtgccagtg 420

cagactcttg gagcaggaac ggactacttg caaggggtga ttatggagat tgtgttgaca 480

ttttctttac tattcgtggt gtatgctact cttgtggacc ctaagaaagg atctcttgat 540

gggcatggag cattgataac tgggcttcta gttggggcca atatcttggc tggtggagtt 600

ttctcggggg ctgcgatgaa ccctgcaaga gcatttggac ctgctttggt gtccggtgac 660

tggacagacc actgggttta ttgggttggg ccactcattg ggggtgggct ttctgggttc 720

atctatgaaa atgtcttcat ttctgggact tatgctgctg ttcctagaga tgaagaa 777

<210> 5

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cagcctgatg gacagatgcc aagtgacaaa accgttggtg gaggagatga tgcattcaac 60

actttcttta gtgaaactgg tgcgggaaag cacgtccccc gtgctatttt tgtagatctt 120

gagcccactg tcattgatga agtgaggaca gggtcatacc gccaactctt tcaccctgag 180

caactcatca gtgggaagga agatgctgct aacaactttg cccgtggaca ctataccatt 240

gggaaagaga tagtcgatct ctgcttggat cgtatccgca agcttgctga caactgcact 300

ggtcttcaag gattcctagt tttcaatgct gttgggggtg gcactggttc tggtcttgga 360

tcacttctgt tggagcgcct ttccgttgat tatggcaaga aatcaaaact tgggtttact 420

gtttacccat caccacaggt ctccacctcc gttgtggagc cttataacag tgtgctttct 480

acccactctc tccttgaaca cactgatgtt gctgtgcttc ttgacaatga ggccatttac 540

gacatttgca ggcgctctct tgacattgag cgccctactt acaccaatct caaccgtctt 600

gtctctcagg taaatgaaca ctttact 627

<210> 6

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atgcaggctg gatttgctgg tgatgatgca ccaagggctg tgttccctag tattgttggt 60

cgacctcgac acaccggtgt gatggttgga atgggccaaa aggatgctta cgtcggtgac 120

gaggcacagt caaagagagg tatcctcacc ttgaaatatc caattgaaca tggcatagtc 180

agcaactggg atgacatgga gaagatctgg catcatacct tctacaatga acttcgagtt 240

gcccctgaag aacaccctgt attactcaca gaagctcctc tcaatcccaa ggcgaacagg 300

gagaagatga cccagattat gtttgagaca ttcaatgtgc ctgcaatgta tgtcgctatc 360

caggctgtgc tctctcttta tgcaagtggc cgtacaacag gtattgtcct ggattctggt 420

gatggtgtca gccatacagt gccaatttat gagggttatg ccctacctca tgcaatcctt 480

cgtctggacc ttgctggacg tgatcttacc gattccttga tgaagatcct aacagagaga 540

gggtacatgt tcactactac tgctgaacgg gaaattgtcc gtgacatgaa ggagaaactt 600

gcctatgttg cccttgatta tgagcaggag ttggagactg ccaagagcag ctcttctgta 660

gagaaaagtt atgagctgcc tgatgggcaa gtgatcacta ttggagctga aaggttccgg 720

tgcccggaag tcctattcca gccatcactc attggtatgg aatctcctgg aatccatgaa 780

accacctaca actcaatcat gaagtgtgat gtcgatatta ggaaggatct gtatgggaat 840

attgtgctca gtggtggatc aactatgttt cccggtattg ctgatcgtat gagcaaagaa 900

atcactgcac ttgctcccag cagcatgaag attaaggtgg tggcaccccc tgaaagaaaa 960

tacagtgtct ggattggagg atctatcttg gcttctctca gcaccttcca acagatgtgg 1020

atctccaaag gtgaatatga tgaatctggc ccatccattg tccacaggaa gtgcttt 1077

<210> 7

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atggcaaatc ctagagtctt cttcgacatg accgtcggcg gtgcaccaac cggtaggatt 60

gtcatggagc ttttcgccga tacaactccc aaaaccgccg agaactttcg cgctctctgt 120

accggcgaga aaggcgtcgg ccgatacggc aagccactcc attacaaagg atcctccttc 180

caccgtgtga tcccagggtt catgtgtcag ggaggagact tcaccgctgg aaacggcacc 240

ggtggcgaat caatctacgg attgaagttt gccgacgaga acttcatcaa gaagcacact 300

ggacctggaa ttctgtcgat ggcgaatgct ggacctggaa ccaacggatc gcagtttttc 360

atttgtactg cgaagaccga gtggttggat gggaagcacg tggtgtttgg acaagtagtg 420

gagggactgg acgttgttaa gaagattgag gctgttggat cgggcagtgg aaggacctcg 480

aagcccgttg ccatcgctga ttgcggccag ctt 513

<210> 8

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

atgggtaagg aaaagtttca catcaacatc gtggtcattg gccatgtcga ctctggaaag 60

tctaccacca ctggtcactt gatctacaag cttggaggta ttgacaagcg tgtcattgaa 120

aggtttgaga aggaggctgc tgagatgaac aagaggtcat tcaagtatgc ctgggttctt 180

gacaagctca aggcagagcg tgagcgtggt attaccattg atattgcctt gtggaagttt 240

gagacaacca aatactactg cacagtcatt gatgctcctg gacatcgtga tttcattaag 300

aacatgatta ctggtacctc acaggctgac tgtgctgtcc tcattattga ttccaccact 360

ggtggttttg aagctggtat ttccaaggat ggacagaccc gtgagcatgc tttgcttgct 420

tttacccttg gtgtcaagca gatgatttgc tgttgtaaca agatggacgc gactacacca 480

aagtactcca agggcaggta cgatgaaatc gtgaaggaag tttcttccta cttgaagaag 540

gtggggtaca accccgacaa gattccattt gtgcccatct ctggttttga gggagataac 600

atgattgaga ggtccactaa ccttgactgg tacaagggcc caacacttct ggaggctctt 660

gaccagatct ctgagcccaa gagaccctca gacaagcccc tccgactccc acttcaggac 720

gtctacaaga ttggtggaat tggaactgtg ccagtgggac gggttgagac cggtaccatc 780

aagcctggta tggttgtcac atttggacct actggattga caactgaagt taagtctgtt 840

gagatgcacc acgaagcact taccgaggca cttcctggtg ataatgttgg gttcaacgtt 900

aagaatgttg ctgtcaagga tctcaagcgt gggtatgttg catctaactc caaggatgat 960

cctgccaagg gtgcggctag tttcacctcc caggttatca tcatgaacca ccctggccag 1020

attggcaatg gttatgcccc agttctggat tgccacacat ctcacattgc tgtcaagttt 1080

gctgagctcc tgaccaagat tgacagacga tctggcaagg agatcgagaa ggagcccaag 1140

tttttgaaga atggtgatgc tggaatggtt aagatgattc ccaccaagcc tatggttgtg 1200

gagactttct ccgagtatcc tcctcttgga cgttttgctg ttagggacat gcgacagacc 1260

gttgctgtgg gagttatcaa gagtgttgac aagaaggacc cc 1302

<210> 9

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tttgtttttg cttacaaaat taagctttgg tatgtgtaga tggctcgtac caagcagact 60

gctcgcaaat ccactggagg aaaggctcct aggaagcaac ttgccaccaa ggctgctcgt 120

aagtcagctc caaccactgg tggagtgaag aagccccaca gataccgccc tggaactgtt 180

gctcttcgtg aaatccgcaa gtatcagaag agtactgagc tccttatcag gaagctgcca 240

ttccagaggc ttgttcgtga gattgcccag gattttaaga ctgatcttcg tttccagagt 300

catgcagtgc tggcattgca ggaggctgct gaggcatacc tggttggtct ctttgaagac 360

accaaccttt gtgccatcca tgccaagagg gtgaccatta tgcccaaaga tatccagctt 420

<210> 10

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ttagccaaga tcaagattgg aattaacggg ttcggaagga ttggacgatt ggtggccaga 60

gtggctttgc agagggacga tgttgaactt gtcgccgtta acgacccctt tatcaccgtt 120

gactacatga catacatgtt taagtatgat actgtgcatg gtcaatggaa gcatcatgac 180

ctcaaagtta aggacagtaa aacccttctc tttggtgaga aagaagttgc tgtttttgga 240

gttaggaacc cagaagagat cccatgggct cagactggtg ccgagttcat tgttgagtct 300

actggagtct ttactgacaa ggacaaggcc gctgctcatt tgaagggtgg tgcgaagaag 360

gttatcattt ctgccccgag caaggatgcc cccatgtttg ttgtgggtgt caatgagaag 420

gaatacaagc cagagcttaa cattgtttct aatgccagtt gcaccaccaa ctgccttgcc 480

cctcttgcaa aggtcattaa tgacagattt ggcattgttg agggactcat gaccaccgtc 540

cactccatta ctgccacaca aaaaactgtt gatgggccct ctgccaagga ctggagaggt 600

ggaagagctg cttcgttcaa catcattcct agcagcactg gtgctgcaaa ggctgtaggt 660

aaagttctac ctgcactgaa tgggaaattg actggaatgg ccttccgagt tcccactgtt 720

gatgtctctg tagttgacct cactgtgagg ttggagaagg cagccagcta tgatgaaatc 780

aaagctgcta tcaaggaaga gtccgaggga aagcttaaag gaatcttggg ttacaccgaa 840

gatgatgtgg tttccaccga ctttgtgggt gataacaggt caagtatctt tgatgccaag 900

gcaggaattg ctttgagtgc aaattttgtt aagcttgttt cgtggtatga caatgagtgg 960

ggttacagca cccgtgtggt tgatttgatt gttcatatgg cctctgttca g 1011

<210> 11

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tttgtgaaaa ctctcaccgg caagacaatc acccttgagg ttgaaagttc agacaccatt 60

gataatgtca aggctaagat ccaagacaag gaaggaattc ccccggacca gcagaggctc 120

atctttgccg gtaagcagct tgaagacggc cgtacccttg ccgattacaa catccagaag 180

gagtccaccc ttcacttggt cctccgcctg aggggaggga tgcaaatctt tgtcaaaact 240

ctcaccggca agactatcac ccttgaagtt gagagttcag acaccattga taatgtcaag 300

gcgaagatcc aggataagga aggaattccc cctgatcagc agaggttgat atttgctggg 360

aagcaactgg aggatgggcg caccctggcg gactataaca tccagaagga gtccaccctt 420

cacttggtcc tccgcctccg cggtggtatg cagatttttg ttaagacctt gactgggaaa 480

accattactc tggaagttga gagctcggat accattgata atgtgaaagc caaaattcag 540

gacaaggagg gtattccacc agaccaacag aggcttatct ttgctggtaa acagctcgag 600

gacggccgta ctcttgctga ttataacatt cagaaggaat ccacccttca tttggtgctt 660

cgtcttaggg gtggaatgca gatctttgtg aagacattga ccggaaagac tatcactctg 720

gaggtggaaa gttcggacac tatagacaat gtgaaggcta agattcaaga taaggagggc 780

atcccaccag accagcagag gttgattttt gctgggaagc agctggagga tgggaggacc 840

ctggccgatt acaacatcca gaaggagtct acccttcacc ttgtgctccg tcttcgtggt 900

ggttgttat 909

<210> 12

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

acaagcgagt atgcgaagca actaagaacc ctagtaacaa agatactctc tgttctatct 60

ctaggattgg gactagaaga aggaaggcta gaaaaggaag ttggaggaat tgaagagcta 120

ctccttcaaa tgaagataaa ctattaccca aaatgccctc aaccggaact agccctcggg 180

gtggaggctc acacagatgt aagtgcactc acattcatac tccacaatat ggtccctgga 240

ctccaactct tctacaacgg aaaatggatc actgccaaat gcgtgccaaa ctccattatc 300

atgcatattg gagacaccat tgagattcta agcaatggca agtacaagag tattcttcat 360

aggggcgtag tcaacaagga aaaagtcagg atttcttggg cagttttctg cgagccacac 420

aaggagaaga tcatactaaa gccgctgcca gagactgttt ccgaggttga gccaccactc 480

ttcccacccc gtacctttca gcagcatatt gagcataagc tgtttaggaa gagccaagat 540

gaactt 546

<210> 13

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

atggaggcgg agagagtgca agatattgct tcccattcaa agtgcgtcaa cacgatccca 60

actgagttca taaggttgga gactgagcaa ccagcaatca cgaccatcca cggggtagtt 120

ttggaagttc cggtcattga tttcggagac gcggatgagg ataacctcgt cctgttgatc 180

gcgaatgctt gccgggattg ggggatattc caagttgtaa atcatgggat accaagccaa 240

gttataagca agttgcagaa agttggcgag gagttctttg agttgccaca agaagagaag 300

gagagagttg cgaagccaca agatgggcag ggtattgaag ggtatgggac aaagcttcaa 360

aaagaattgg atggaaagaa aggatgggtt gatcatttgt ttcataagat ttggcctcct 420

gctgctatca actatcaatt ctggcctcaa aatcctcctt cctacagaga agcaaacgag 480

cagtatgggg agcggttgcg cagggtggca gacaagttgt tagagaggtt atcgaagggg 540

cttggtcttg aagggaagga gttgaaagaa gcagttggtg gggatgactt aatttacctg 600

atgaaaataa actattaccc accatgtcct cgtcctgatc ttgctcttgg tgtggtggca 660

cacaccgaca tgtctgcaat cacaattctt gtccctaatc aagtacaagg actccaggtt 720

ttcaaagatg gccattggta tgatgtcaaa tacatccctc atgctctcat tgttcatgtt 780

ggtgaccaaa ttgaggtaag taactcttct ttttaccgc 819

<210> 14

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

atgcagactg acagtgtgca aaacattgct tctaggtcag aggaaatgcc acctgaattt 60

attaggccag aaagcgaaca acctgggctc acaaccttcc gtgggcaaac ccccgaagtc 120

ccagtcattg atttcggcat taaagacgaa gaaaagctca gaaagttgat cttggatgcg 180

agttgcgaat ggggtctctt ccaaattgtc aaccatgata tacctaccca tgtcataagt 240

aaattaaaag aggttggaaa agggttcttt gagctgccgt cagaagagaa agaagtttac 300

gccacgcctc cagatgctaa aagcatggaa gggtatggta caatgctaca aaaggagatt 360

gaaggaaaga gagcctgggt tgatcacttg ttccattata tttctccccc ttcagctatt 420

aactaccaat tctggcctaa aaatccacca tcatacaggc agagcacaga ggagtatgga 480

aaacacttgc atggggtggt agacaagttg ctaagggagc tgtcattagg ggtaggattg 540

gaaggggatg agcttaggga tgcagttggt ggggatgatg tggtttacaa tctgaaaata 600

aattactacc caccatgccc tcgtcctgat ctagctcttg gcgtaccagc tcactcggac 660

atgtctgcct taactgttct tgttccgaac gaagtacaag gcctccaagc ctttcaggat 720

ggccactgga ttgatgtcaa ctacatcccc aatgcccttg tgattcatat tggcgaccag 780

cttgagatat tgagcaatgg aaaatacaag ggcgtgatgc acagaacaac agtgaacaag 840

gacaaggcaa ggatgtcatg gccagtgttc atagagccac caaaggagct ccaagttggt 900

ccatttccta agcttgtcac tcccgacaac cctccaaagt acaagacaaa gaagtttagt 960

gattatgttt actgtaaact caacaagata ccccagtaa 999

<210> 15

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atcatcggaa acctccctca ccttgccacc atgccccacc aatcccttgc cgctttggct 60

cgtacctacg gccctctcat gcacctccgt ctcggtctcg ttgacgtggt tgttgccgcc 120

tcgggttctg tggcggagca attcctcaag gtgcacgatg cgaatttcgc caacaggcca 180

ccgaattcag gagccaagca tatagcttat aattatcagg acctggtgtt tgcaccctac 240

ggcccacggt ggcgcttgct tcgtaagatc tcgtcggtgc accttttctc caccaaggct 300

ctcgatgact tccgtcacgt acgccaggaa gaagtagcca tactaattcg cgctctagcg 360

agtgcgggcg atgcggcagt gaacttgaat cagctactca acgtgtgtac caccaacgcg 420

ctaggccgag tgatgctggg caagagggtg tttagcggtg gtgccgattc caaggccgac 480

gagttcaaac agatggtggt ggagctgatg gtgctagccg gcgttttcaa catcggcgac 540

tttattccca tgctcgattg gttggacttg caaggcgttg tggggaagat gaagaaattg 600

cacacccggt ttgactcgtt cctcaaccac attcttgagg agcataagat caacggtcgc 660

ggtgcttcgg gtaaacacgt ggatctgttg agtacattga tttcgctcaa ggatgatctt 720

tctggagaag gggaaaagtt atccgacacc gaaatcaaag ctttgcttct gaatatgttt 780

gttgcaggga ctgatacgtc ttctagcaca gttgaatggg ccttagcgga acttatccga 840

catccgaaaa tcctagtcca agcccaacaa gagctggaca aggttgttgg tcgagaaagg 900

cttgtaaccg aatccgacct atcccaacta acttttttcc aagccatcat caaagaaacc 960

ttccgtctac acccatctac cccactatct cttcctcgaa tggctaccga gagctgcgaa 1020

atcaatggct acttcattcc aaaaggctcg acacttctcg ttaatgtttg ggccattgca 1080

cgtgacccag atgtatggtc cgagccacta gagttccggc ctgagcggtt cctaccaggt 1140

ggggagaagg ctaatgttga tgttaaagga aacgatttcg aagtgatacc atttggggca 1200

ggaagaagaa tatgtgcggg gttgaacctt gggttaaggg tggtccaatt agtgactgca 1260

acattagtcc attcgtttga ttgggacttg gctgaaggac agttgccaga ggagctcaat 1320

atggaagaag gctatggatt gaccctacaa cgggctaaac cattaaaggt gcaccctcga 1380

cctaggctag ccccacatgt ctatcaggcc taa 1413

<210> 16

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

atgccaatag tgactagcac cccaccagag agacatgttg cagtttttgc cttcccaata 60

gcctcgcacc ctaggctcct cttaagccta gtccatagac tagccacagc tgctcccacc 120

gtgaccttct cattcttcaa cacggccaag tccaaccgct cattgttctc tgtaacacca 180

cccgataaca taaggcccta tgatgtgtcc gatggtatac cagagggcta tgtgtttatg 240

gggaaaccac aggaggatat tgacttgttc ttggcagtgg ctgatgagga attcaggaga 300

gcccttgaag ttgctgaggc tgacattgga aagcagatca actgcctagt gacggacaca 360

tttttgtggt tttccagcga gatggcggag aaaaggcgag tcccatgggt cccattttgg 420

acgtcggggg ctagctccct ctcaatccat ttttacaccg accttattag gcaaactgta 480

ggccttaatg gtaagtaact atattccgta ggtctcacca ttaaaaatcg catcacgttc 540

ataattgtgt atatactggc aggtattgat gagcgtaaag atgaaatcct cgatttcatt 600

ccaggatttt ctgcagtaag actaggcgac ttgcctggtg gagtcgtcta tggaaactta 660

gaatcaccct tctcaatcat gctacataaa atgggccaaa caataacaaa agccactgct 720

atcccaataa actcttttca agagttagat cctgaactca accaaaatct caatacaaat 780

ttcaaaaact tcctaaacat tggccccttc catttaatat ccccaccccc actgaacaat 840

gatgagtttg cctgcatacc atggatggac aagcacatac cacgatccgt tgcatacatt 900

gggttcggaa ctgtggcaac gcctccaccg cacgagctag tggcgttggc tgaagcacta 960

gaagaaagta ggactccatt tctttggtct attaacgaca gttcaaagaa gcatttgcca 1020

gaagggtttt tagaaagggt gggggataat gggaaaatag taccatgggg acctcagata 1080

caagtattag cacacccttc agctggggtt ttcattactc acggtggatg gaattcggtg 1140

ttggagagca ttggagccgg ggtgcctttg attgttagac cattttttgg ggagcagcag 1200

cttaatgctt ggatggttga gaaggtttgg gaagttggag taaaagttaa ggatggggtg 1260

ttctccaaaa atggagcctt acacgctctc gaacaaatat tgctgcttca gaaagggaag 1320

aaactgaagg ctcaaatcga agggtttaaa gagcttgctc ataaggctgt cggaccaagt 1380

gggagttcta ccgaaaattt taggactttg ctaagggtaa tcacc 1425

<210> 17

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atacgcaagg cccaacgtgc agatggtcct gcaaccattc tcgctattgg caccgccaca 60

ccttccaact gtgtttatca atccgactac cctgattact acttccgtat caccaacagc 120

gaacacatga ccgacctcaa actcaagttc aaacgcatgt gtgagaaatc gatgatcagg 180

aagcgttaca tgcacttgac cgaagacatc ctcaaagaaa atccaaatat atgcgaatac 240

atggctccct ctctcgacgc ccgtcaagac atggtcgtcg ttgaagtccc taaactcggt 300

aaggaagctg cctccaaggc tatcaaggag tggggcctcc ccaaatccaa gattacccac 360

ctcgtcttct gcaccacctc tggtgttgac atgcccggtg ctgactacca gctcaccaag 420

ctccttggcc tccgcccctc tgtcaagcgc ctcatgatgt accagcaggg ctgcttcgcg 480

ggcggcaccg tcctccgtct cgccaaggac cttgccgaga acaacagggg cgcccgcgtc 540

ctggtggttt gctccgagat caccgccgtc actttccgtg gcccgtccga tacgcatttg 600

gactccatgg tggggcaggc gcttttcggg gacggtgcgg cagccgtcat tgtgggggcg 660

gatccggata tgtcggtgga gcggccggtg ttccagctgg tatcagcggc acagactata 720

ctgccagact cagacggagc aatagacgga cacctgaggg aagtgggtct gacctttcac 780

ttactaaagg acgtccccgg gttgatatcc aagaacattg gaaaggcgtt gaacgaggca 840

tttagtccga ttggaatcag cgactggaac tcgttattct ggatagccca cccgggtggt 900

ccagccatac ttgaccaagt ggagctcaag ctgggtctca aggaggagaa gctaagggcc 960

accaggcacg tgctcagtga gtacggcaac atgtctagcg catgcgttct gttcatcctt 1020

gatgagatga gaaagaaatc catccaggac ggccactcaa ccaccggtga aggtttggat 1080

tggggcgttc tcttcgggtt cggcccgggt ctcaccgtcg agactgtggt tctgcacagt 1140

ctccctgccg caataagcac c 1161

<210> 18

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ggcccctttg agaaattcgc acagataaca atgattttgc cattaactgg taagcaatac 60

tctgacaagg tgtcagaaaa ctgtgtggca atttggaaaa cacttggaat ctacactgat 120

gcggaggctg atgccattga aaagtttcaa gaggctttca aggatgaaac atttccaccc 180

ggtgcctcta tcttgttcag cttatcacca cttggatctt taacggtagg tagtatatat 240

ttgcagattg aagattttct tatgctttat tttatctttt gattattttc acagctctaa 300

tgtaacaatg gtctttctgc accatcaaat tttcataatt tcctaatctt atgttttctc 360

aaatattcca aagatgtaat gacaatgatt tcttaatatc atcgataatt aagtttttgc 420

tgagcatcaa ttgctggcaa caaagggaac ccaattcgtt ctgttaagga cttcattttc 480

tggtatagga gaagaccaaa atctattctt ttttcattct tcttattaat atttgaacct 540

tttcaattac agatcagttt ctccaaggat ggttctgtac ctgaagttgg gaatgtaata 600

atagagaaca aacaactatc tcaagcaatc ctggagtcca taattggcaa acatggtgtt 660

tcacctgaag caaaacagag tttggccaca agattatcgg acttgttcaa gtcgtatgaa 720

ggtgacgctt ttgaaaacgg gaaaccggaa tcagaaaagg tagccgataa tgagattccg 780

gtg 783

<210> 19

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

atatatacca atctgcaggg agaagcagtt caagattggc gtgagatagt gacatatttc 60

tcgtacccaa ttaaggccag ggactactcg aggtggccag acaagccggc agagtggcgg 120

gcggtgacgg agaagtacag cgagaagcta atggagctag cttgtaaatt gttgggtgtg 180

ttatcggagg cgatggggct agacaaggag gcgctaacaa aggcctgtgt ggacatggat 240

caaaaagtag tagtgaatta ttacccaaaa tgccctcagc cagacctcac tcttgggctt 300

aagcggcata cggatccggg gactattacc cttttgctgc aggaccaagt tggtgggctt 360

caagccacta gggacggtgg gaagaattgg atcactgttg agcccattga aggtgctttt 420

gttgttaatc tcggtgatca cggccat 447

<210> 20

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

atgaaaggcg attcaccggt caacgtctgt gtaaccggag cggccggata cattggctcg 60

tggttagtca tgagacttct tgaacgcggg tatattgtcc gtgcaactgt ccgtgatccc 120

gggaacttga agaaggtgaa gcatctgcta gaactgccga aagctgacac caacttgact 180

ctatggaagg cagatttaac ggaagaagga agctttgatg aagccattga aggttgccgt 240

ggagttttcc atgtcgccac ccctatggac tttgaatcca aagaccctga gaatgaaata 300

ataaagccaa caatagaggg agtgttaggc atcataaagt catgtgccaa agccaaaact 360

gttaagaggt tggtcttcac ctcttctgct ggcactgtca atgttcaaga gcatcaactc 420

cccgtctacg atgaatccaa ttggagcgac ttggatttca tttactcaaa gaagatgact 480

gcttgggta 489

<210> 21

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

gatttattca cggcggggac tgatacatca tcaagcatca ttgaatgggc actaactgag 60

atgttgaaca acccacgcat cctgaatcgg gcacaagaag aaatggatca agttatcggc 120

agaaaccgaa gactcgaaga atccgacata ccgaaactgc cttacttaaa ggccatatgc 180

aaagaaacat tcagaaaaca cccttctaca cccttaaatc tccctcgggt ttcaagcgaa 240

gcatgtcaag tagacggttt ttacgtaccc aaaaacacta gacttattgt caacatatgg 300

gcaatcggga gagaccctaa cgtgtgggaa aacccgttgg atttcacccc cgaaagattt 360

ttgagtggaa agtatgcgaa cattgatcct cgaggaaata atttcgagct gattcctttc 420

ggggccggac ggaggatttg tgccggggct agaatgggaa tcggaatggt tgagtacatt 480

ttgggtacat tggttcactc atttgattgg aaattacctg acggagtcgt tgcagttgac 540

atggaagaga gctttgggat cgcattgcaa aaggctgtgc ctctttcggc cagtgttact 600

ccaaggctgc ttccaagtgc ttacact 627

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

caatatcttg gctggtggag 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

ccagtggtct gtccagtca 19

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

tcaccctgag caactcat 18

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

agatcgacta tctctttccc aa 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

gttcactact actgctgaac g 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

tctccaactc ctgctcataa t 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

tttcatttgt actgcgaaga cc 22

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

taacaacgtc cagtccct 18

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

gatctcaagc gtgggtatg 19

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

gataacctgg gaggtgaaac 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

cttatcagga agctgccatt 20

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

ctgcatgact ctggaaacg 19

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

gccgagttca ttgttgagtc ta 22

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

ataaccttct tcgcaccac 19

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

ttgaccggaa agactatcac tc 22

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

gatgccctcc ttatcttgaa tc 22

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

gatcactgcc aaatgcgt 18

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

cttgtacttg ccattgctta g 21

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gagttcataa ggttggagac tg 22

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

ccgaaatcaa tgaccgga 18

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

gaggaaatgc cacctgaat 19

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

gccgaaatca atgactggga 20

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

tgtaaccgaa tccgaccta 19

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

gggtagatgg gtgtagacg 19

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

gggtgccttt gattgttaga c 21

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

tactccaact tcccaaacct 20

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

tgaagtccct aaactcggta ag 22

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

agaagacgag gtgggtaat 19

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

tcagtttctc caaggatggt t 21

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

ggactccagg attgcttga 19

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

gacaaggagg cgctaaca 18

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

taagcccaag agtgaggtc 19

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

taaagccaac aatagaggga gt 22

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

gaggtgaaga ccaacctctt a 21

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

gcaatcggga gagaccctaa 20

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

tcgaggatca atgttcgca 19

Claims (7)

1.中国桔梗RPL13内参基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的中国桔梗RPL13内参基因在中国桔梗茎、叶及蓝色、紫色、白色不同花色、不同组织部位的目标基因进行表达谱分析研究中的应用。

3.根据权利要求2所述的中国桔梗RPL13内参基因在中国桔梗不同花色形成基因研究中的应用，其特征在于：该内参基因做为分析中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况的内参基因。

4.根据权利要求3所述的中国桔梗RPL13内参基因在中国桔梗不同花色形成基因研究中的应用，其特征在于：分析采用qRT-PCR法。

5.根据权利要求4所述的中国桔梗RPL13内参基因在中国桔梗不同花色形成基因研究中的应用，其特征在于：采用qRT-PCR法分析时，所用的内参引物如下：

正向引物：5’-gtccaaggctggtgattc-3’；

反向引物：5’-cgcggactattggtaaataag-3’。

6.根据权利要求5所述的中国桔梗RPL13内参基因在中国桔梗不同花色形成基因研究中的应用，其特征在于：qRT-PCR法分析时，扩增体系为：

cDNA 1μL，

Green qPCR SuperMix 5μL，上游引物10μmol·L^-1 0.2μL，下游引物10μmol·L^-1 0.2μL，Nuclease-free H₂O 3.6μL，总计10μL；

扩增程序为：94℃预变性30s；95℃变性6s，60℃退火+延伸30s，共45个循环。

7.中国桔梗类花色素合成基因表达情况分析的内参引物，其特征在于：所述的内参引物如下：

正向引物：5’-gtccaaggctggtgattc-3’；

反向引物：5’-cgcggactattggtaaataag-3’。

Images