CN116555334A - 一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用，通过探究猕猴桃果实内外果皮AsA差异的机理，发现一系列造成猕猴桃果实内外果皮AsA含量差异的基因，包括7个AsA合成途径的基因和3个AsA循环途径的基因；同时通过MicroRNA组学测定与分析，比较猕猴桃果实内外果皮中的差异表达的miRNA，发现miR156表达水平与ASA含量正相关，可能是调控猕猴桃果实内外果皮AsA含量差异的关键miRNA；瞬时过表达或干扰表达miR156，可相应调控猕猴桃果实7个AsA合成途径的基因和3个AsA循环途径的基因的表达，从而调控猕猴桃果实的AsA含量。

Description

一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体而言，涉及一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用。
背景技术
抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)即维生素C，广泛存在于植物组织中的天然抗氧化剂，对植物的生长发育及果实品质的形成具有重要作用，是维持人类正常生长发育所必需的营养物质。人类及一些灵长类动物由于最后一个AsA合成酶的突变，致使自身无法合成AsA，必须从果实、蔬菜等食物中摄取。鉴于AsA在生物体内的重要功能，提高植物尤其是蔬菜和水果中AsA的含量的研究具有重要的产业意义和应用价值。
猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属中多年生落叶藤本植物之一，又称毛木果、麻藤果、奇异果等。猕猴桃果实富含AsA，其含量是梨和苹果的80-100倍，高AsA代谢积累成为猕猴桃果实营养物质的研究热点，猕猴桃果实也成为研究AsA代谢的模式植物。
本课题组研究发现，猕猴桃果实内外果皮AsA含量存在显著差异，内果皮AsA含量显著大于外果皮，然而内外果皮AsA差异的生理和分子机制尚不清楚。因此还需探究猕猴桃内外果皮AsA代谢差异的原因，希望能够揭示猕猴桃果实AsA代谢生理和分子机制，期待丰富AsA生物合成调控途径和提高果实AsA含量提供理论基础，从而实现对猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用，通过探究猕猴桃果实内外果皮AsA差异的机理，发现一系列造成猕猴桃果实内外果皮AsA含量差异的基因，包括7个AsA合成途径的基因和3个AsA循环途径的基因；同时通过MicroRNA组学测定与分析，比较猕猴桃果实内外果皮中的差异表达的miRNA，发现miR156表达水平与ASA含量正相关，可能是调控猕猴桃果实内外果皮AsA含量差异的关键miRNA；瞬时过表达或干扰表达miR156，可相应调控猕猴桃果实7个AsA合成途径的基因和3个AsA循环途径的基因的表达，从而调控猕猴桃果实的AsA含量。
本发明所述猕猴桃内果皮是指猕猴桃果实中靠近中心处的果肉，其中心呈黄色，周围有红色果肉；猕猴桃外果皮是指包裹内果皮的外层果肉，呈翠绿色(图1)。
本发明经研究表明，猕猴桃果实内外果皮AsA含量存在显著差异，果实内果皮中AsA(还原性ASA)和T-ASA(总抗坏血酸，包括还原性和氧化性ASA)含量显著高于外果皮，而且在猕猴桃果实发育过程中抗坏血酸含量逐渐降低，然而内外果皮AsA差异的生理和分子机制还需要进一步研究探索。于是，本发明通过生理生化以及分子互作调控手段，探究猕猴桃内外果皮AsA代谢差异的原因，以此来揭示猕猴桃果实AsA代谢生理和分子机制，期待丰富AsA生物合成调控途径和提高果实AsA含量提供理论基础。
L-半乳糖途径是猕猴桃果实ASA合成的主要途径。本发明利用实时荧光定量PCR技术，分析ASA合成途径相关基因表达水平，发现AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR是导致猕猴桃果实内外果皮ASA差异的主要基因，且主要存在于果实发育早期。
为了进一步探索猕猴桃内外果皮ASA含量差异机制，本发明还分析了ASA循环和降解途径相关基因表达水平，发现在ASA循环途径中，AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是导致猕猴桃果实内外果皮ASA差异的主要基因，主要存在于果实发育后期，ASA讲解途径未见明显差异的基因。
因此，本课题组研究表明，造成猕猴桃果实内外果皮AsA差异的基因，包括7个AsA合成途径的基因：AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR，和3个AsA循环途径的基因：AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR。
为了找到调控猕猴桃果实ASA含量的方法，通过MicroRNA组学研究，比较高AsA含量的猕猴桃果实样品与低AsA含量的猕猴桃果实样品中的基因表达差异，找到能用于调控猕猴桃果实AsA含量的基因miR156；本发明提供了如下的技术方案：
一方面，本发明提供了miR156基因用于制备提高和/或降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，所述miR156基因具有如序列表Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步地，本发明通过促进miR156基因的表达来提高猕猴桃的抗坏血酸含量；通过降低miR156基因的表达来降低猕猴桃的抗坏血酸含量。
进一步地，所述促进miR156基因的表达，能够促进AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因的表达从而提高猕猴桃的抗坏血酸含量；所述降低miR156基因的表达能够降低AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因的表达从而降低猕猴桃的抗坏血酸含量；所述AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR具有如序列表Seq ID NO.2～11所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了miR156基因用于制备提高和/或降低果实中的AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因表达的制剂的用途；所述AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR具有如序列表Seq ID NO.2～11所示的核苷酸序列。
进一步地，所述果实包括猕猴桃。
再一方面，本发明提供了一种miR156基因过表达载体用于制备提高猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，所述miR156基因过表达载体具有如Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。
通过构建miR156过表达载体，过表达miR156，可相应促进7个AsA合成途径的基因(AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR)和3个AsA循环途径的基因(AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR)的表达，从而提高猕猴桃果实的AsA含量。
再一方面，本发明提供了一种miR156基因干扰表达载体用于制备降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，所述miR156基因干扰表达载体具有如Seq ID NO.17所示的核苷酸序列。
通过构建miR156干扰表达载体，干扰表达miR156，可相应抑制7个AsA合成途径的基因(AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR)和3个AsA循环途径的基因(AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR)的表达，从而降低猕猴桃果实的AsA含量。
再一方面，本发明提供了一种用于提高猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂，所述制剂包括miR156基因的过表达载体。
进一步地，所述miR156基因过表达载体含有如Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。
再一方面，本发明提供了一种用于降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂，所述制剂包括miR156基因的干扰表达载体。
进一步地，所述miR156基因干扰表达载体含有如Seq ID NO.17所示的核苷酸序列。
再一方面，本发明提供了一种提高猕猴桃的抗坏血酸含量的方法，所述方法通过在猕猴挑上施用如上所述的包括miR156基因的过表达载体的制剂。
再一方面，本发明提供了一种降低猕猴桃的抗坏血酸含量的方法，所述方法通过在猕猴挑上施用如上所述的包括miR156基因的干扰表达载体的制剂。
再一方面，本发明提供了一种标志物用于制备预测果实中抗坏血酸含量的制剂的用途，所述标志物包括miR156、AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因，所述miR156、AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR分别具有如序列表Seq ID NO.1～11所示的核苷酸序列。
本发明的有益效果为：
1、发现猕猴桃果实内外果皮AsA水平存在明显差异，并发现7个AsA合成途径的基因(AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR)和3个AsA循环途径的基因(AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR)，是导致猕猴桃果实内外果皮AsA水平差异的重要原因；
2、通过MicroRNA组学研究，找到能用于调控猕猴桃果实AsA含量的基因miR156；
3、通过构建miR156过表达载体实现miR156的过表达，可相应促进7个AsA合成途径的基因和3个AsA循环途径的基因的表达，从而提高猕猴桃果实的AsA含量；
4、通过构建miR156干扰表达载体实现miR156的干扰表达，可相应抑制7个AsA合成途径的基因和3个AsA循环途径的基因的表达，从而降低猕猴桃果实的AsA含量。
附图说明
图1为猕猴桃内果皮和外果皮部分的区分示意图；
图2为实施例1中猕猴桃果实发育过程AsA和T-AsA含量变化的测定结果示意图，其中1-a为AsA含量的测定结果，1-b为T-AsA含量的测定结果；
图3为实施例2中分析猕猴桃果实生长过程中AsA合成途径相关的9个基因表达水平的测定结果示意图，其中2-a～2-i分别为AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGME、AcGGP、AcGPP、AcGalDH、AcGalLDH、AcGalUR的表达水平；
图4为实施例3中猕猴桃果实生长过程中AsA循环和降解途径基因表达的实时荧光定量PCR分析结果示意图，其中3-a～3-f分别为AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR、AcAO、AcAPX的表达水平；
图5为实施例5中猕猴桃果实生长过程中miR156表达水平示意图；
图6为实施例6中miR156对实抗坏血酸合成和循环途径基因表达的影响结果示意图；
图7为实施例6中miR156对猕猴桃果实抗坏血酸含量的影响结果示意图，其中，6-a为miR156表达水平的检测结果，6-b为ASA含量检测结果，6-c为T-ASA含量检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂、物料均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、猕猴桃果实内外果皮ASA和T-AsA含量差异分析
本实施例以‘红阳’猕猴桃内外果皮为试材，供试材料采自浙江省宁波市东钱湖红心猕猴桃种质资源圃，采样时间为2022年5-9月，于盛花期后40d开始，每隔20d采样1次，选取大小均匀的无损伤猕猴桃果实，采收后尽快运往实验室，果实分内外果皮，于液氮中磨至粉状，放入-80℃冰箱中保存，用于抗坏血酸分析。
为了探究猕猴桃果实内外果皮抗坏血酸含量差异，我们以‘红阳’猕猴桃花后40d，60d，80d，100d，120d果实内、外果皮为试验材料，测定AsA和T-AsA含量变化。
AsA和T-AsA含量的测定方法如下：
称取约0.2g猕猴桃果实样品于离心管中，加入15mL 5％三氯乙酸(TCA)。于4℃，10000r/min，离心25min，收集上清液，用于测定AsA。另取1mL上清液，加入0.5mL 60mmol/LDTT-乙醇，用Na2HPO4-NaOH混合液调pH至7～8，在室温下反应10min后，加入0.5mL 20％ TCA调pH至1～2，所得溶液用于测定T-AsA。
取1mL上清液于试管中，加入反应体系：1mL 5％ TCA，1.0mL无水乙醇，0.5mL0.4％磷酸-乙醇溶液，1.0mL 0.5％菲罗啉-乙醇溶液，0.5mL 0.03％ FeCl3-乙醇溶液；将溶液置于30℃下反应60min，然后测定AsA和T-AsA的OD534值。
标准溶液配制：以5％TCA为溶剂，配置浓度为1mg/ml的AsA标准溶液，并进行梯度稀释，之后按照还原型AsA的方法测定其OD534值。
猕猴桃果实发育过程AsA和T-AsA含量变化的测定结果如图2所示，其中AsA含量的测定结果如图2-a所示，T-AsA含量的测定结果如图2-b所示。
由图2-a可知，猕猴桃果实中抗坏血酸主要以还原型的AsA形式存在，在幼果时期，AsA含量达到最高值，之后随着果实的发育快速下降。果实内果皮AsA含量在花后100d趋于稳定，而果实外果皮中AsA含量在花后80d已无明显变化。花后120d(商业化成熟期)时，内、外果皮中AsA的含量分别为花后40d的29.2％和22.7％。
由图2-b可以看出，T-AsA和AsA含量水平变化趋势大体一致，且在整个生长过程中，果实内果皮中AsA和T-AsA含量显著高于外果皮(图2-a，图2-b)。
综上所述，猕猴桃果实发育过程抗坏血酸含量逐渐降低，果实内果皮抗坏血酸含量显著大于外果皮。
实施例2、猕猴桃果实内外果皮AsA合成途径相关基因表达变化分析
L-半乳糖途径是猕猴桃果实AsA合成的主要途径，猕猴桃果实AsA合成主要与9个合成基因有关，分别为AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGGP、AcGPP、AcGalDH、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR，其序列分别如Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.12、Seq IDNO.5、Seq ID NO.13、Seq ID NO.6、Seq ID NO.7、Seq ID NO.8所示。因此，本实施例以“红阳”猕猴桃花后40d、60d、80d、100d、120d果实内、外果皮为试验材料，利用实时荧光定量PCR技术，分析猕猴桃果实生长过程中AsA合成途径相关的9个基因表达水平。
通过内外果皮转录组测序筛选猕猴桃的AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGGP、AcGPP、AcGalDH、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR相关基因。先进行猕猴桃总RNA提取及cDNA的合成，具体步骤为：称取约0.1g果实冻样，采用植物RNA提取试剂盒(Omega,美国)来提取不同发育时期果实总RNA。加入DNaseⅠ去除RNA中基因组DNA污染，利用核酸蛋白仪与琼脂糖电泳仪来检测所提取RNA的质量，根据SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(CWBIO，中国)说明书合成反转录第一链cDNA；再根据内外果皮转录组数据找到猕猴桃的AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGGP、AcGPP、AcGalDH、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR基因。
再分别对“红阳”猕猴桃花后40d、60d、80d、100d、120d果实内外果皮样本进行实时荧光定量PCR，具体步骤如下：根据美国赛默飞世尔公司的DyNAmo Flash SYBR Green qPCR试剂盒，采用CFX96 Touch Real-Time PCR系统进行三步法Q-PCR扩增。实时荧光定量PCR使用仪器为StepOnePlusTM(Thermo Fisher Scientific,美国)，9个合成基因的荧光定量PCR引物见表1，按如下程序运行：95℃7min，95℃15s，45～60℃退火30s，进行39个循环，75℃15s。以猕猴桃AcActin作为内参基因，设置3个生物学重复，每个基因的相对表达量以2-ΔCT方法进行分析。
表1、9个合成基因的荧光定量PCR引物
实时荧光定量PCR分析结果如图3所示，其中9个基因的表达水平分别见图3-a～3-i。
由图3可以看出，9个合成基因显现出与AsA水平相似的变化趋势，随着果实发育，整理上呈现下降的变化趋势。果实发育早期即花后40-80d，果实内果皮中AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR基因转录水平显著高于外果皮，其中，AcGME基因仅在花后60d出现显著差异，AcGalUR仅在花后40d出现显著差异，AcGGP和AcGalDH转录水平无差异(图3-a～3-i)。
综上结果表明，在AsA合成途径中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR是导致猕猴桃果实内外果皮AsA差异的主要基因，且差异主要存在于果实发育早期(花后40-80d)。
实施例3、猕猴桃果实内外果皮AsA循环和降解途径相关基因表达变化分析
为了进一步探索‘红阳’猕猴桃果实内外果皮AsA含量差异机制，本实施例利用实时荧光定量PCR技术，分析AsA循环途径的4个相关基因AcMDHAR1(Seq ID NO.14)、AcMDHAR2(Seq ID NO.9)、AcDHAR(Seq ID NO.10)、AcGR(Seq ID NO.11)和降解途径的2个相关基因AcAO(Seq ID NO.15)和AcAPX(Seq ID NO.16)的表达水平。
通过实施例2获得的转录组数据找到猕猴桃的AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR、AcAO、AcAPX相关基因。
再分别对“红阳”猕猴桃花后40d、60d、80d、100d、120d果实内外果皮样本进行实时荧光定量PCR，具体步骤如实施例2所示，6个基因的荧光定量PCR引物见表2。
表2、6个基因的荧光定量PCR引物
猕猴桃果实生长过程中AsA循环和降解途径基因表达的实时荧光定量PCR分析结果如图4所示，其中6个基因的表达水平分别见图4-a～4-f。
在果实发育过程，AsA循环途径相关基因AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR整体上呈现下降趋势。果实发育后期即花后80-120d，果实内果皮中AsA循环途径基因表达水平显著高于外果皮(图4-a～4-d)。
在AsA降解途径中，AcAO和AcAPX基因也呈下降趋势，但内外果皮中未见显著差异(图4-e～4-f)。
综上表明，在AsA循环途径中，AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是导致猕猴桃果实内外果皮AsA差异的主要基因且差异主要存在于果实发育后期(花后80-120d)，降解途径未见差异。
实施例4、miR156的筛选过程
通过MicroRNA组学研究，比较猕猴桃果实内外果皮样品中的基因表达差异，找到能用于调控猕猴桃果实AsA含量的基因miR156，具体过程如下：
鉴于猕猴桃果实花后60天ASA含量差异显著且最早出现，因为我们以猕猴桃花后60天果实内外果皮样品进行组学测定，每个点3个独立生物学重复。文库构建按照Small RNA Library Prep Set for/>(美国，NEB)产品说明书执行，测序在Illumina Hiseq2500平台完成，作由北京百迈克生物科技有限公司(百迈克，北京，中国)工作人员协助完成。
经测序得到的原始数据，先除去接头序列和低质量测序结果。随后再去除含N碱基序列(既不能识别的碱基)、短片段序列(小于18nt)和长片段序列(大于30nt)，最后获得高质量序列。获得的高质量序列分别与Silva数据库、GtRNAdb数据库、Rfam数据库和Repbase数据库进行序列比对，去除核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核内小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等序列。将未注释的序列比对到‘红阳’猕猴桃参考基因组上，利用miRDeep2软件对猕猴桃果实miRNA进行预测。
miRNA家族分类是基于与miRbase数据库(http://www.mirbase.org/)中植物miRNA成员序列比对的结果。
将获得的差异表达miR156与ASA含量进行相关性分析，根据相关系数锁定miR156(Seq ID NO.1)可能与ASA含量具有一定的相关性，具体调控机理进一步进行验证。
实施例5、猕猴桃果实内外果皮miR156表达变化分析
根据实施例4的小RNA组和降解组数据，我们发现猕猴桃果实内外果皮中miR156表达水平差异显著，因此认为miR156基因有希望成为调控猕猴桃果实抗坏血酸含量的基因。
猕猴桃果实内外果皮样品存在抗坏血酸明显差异，本实施例针对猕猴桃果实内外果皮样品，分别检测其中的miR156基因含量，验证猕猴桃果实内外果皮miR156表达情况与抗坏血酸含量的关系。
猕猴桃果实内外果皮miR156含量的检测方法包括如下步骤：
1、小RNA的提取
小RNA提取采用Takara公司的RNAiso for Small RNA(9753A，Takara，大连，中国)试剂进行提取，方法如下：
(1)在液氮中研磨0.1g植物组织(猕猴桃果实内、外果皮样品)成粉状，加入1.8mLRNAiso for Small RNA，研磨成透明液体状态，转入2mL离心管中，室温静置5min，4℃，12000rpm离心5min；
(2)取1.5mL上清至2mL离心管中，加入300μL的氯仿，涡旋混匀后，室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min；
(3)取600μL上清液转移至1.5mL离心管中，加相同体积的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min；
(4)弃上清，加入1mL的75％乙醇清洗沉淀，4℃，12000rpm离心5min；
(5)重复步骤(4)；
(6)弃上清，瞬离后吸净上清，将离心管置于超净工作台中吹干，加入40μL的DEPC水溶解。
(7)将提取的小RNA用Nanodrop 2000及2％琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和质量。
2、小RNA反转录cDNA
根据茎环法设计miR156和5s rRNA(miR156的内参)的反转录茎环引物和半定量引物，反转录cDNA，通过实时荧光定量检测miR156表达量。
反转录反应体系和步骤如表3所示。
表3、反转录反应体系和步骤
冰上加样，混匀后瞬时离心，42℃1h，70℃10min。产物-20℃保存或者进行qRT-PCR反应，具体步骤如实施例2所示，miR156和5s rRNA的荧光定量PCR引物见表4。
表4、6个基因的荧光定量PCR引物
猕猴桃果实生长过程中miR156表达水平如图5所示。
荧光定量PCR结果显示，miR156基因的表达水平整体呈下降趋势，且在整个生长过程中，果实内果皮中miR156基因含量显著高于外果皮，在花后120d趋于平衡(图5)。综上所述，猕猴桃果实发育过程miR156基因的表达和抗坏血酸含量变化一致，即果实内果皮miR156基因表达量显著高于外果皮。
实施例6、miR156对抗坏血酸合成和循环途径基因表达的影响，以及对猕猴桃果实抗坏血酸含量的影响
为了进一步验证miR156基因对抗坏血酸的调控机理，我们利用实时荧光定量PCR技术，分析AsA合成和循环途径相关基因表达水平，同时分析miR156基因对猕猴桃果实抗坏血酸的影响。
本实施例分别构建了35S:MIR156a过表达载体和35S:MIM156干扰表达载体，再分别将35S:MIR156a过表达载体和35S:MIM156干扰表达载体瞬时转化猕猴桃果实，并以未进行瞬时转化的猕猴桃果实为空白对照；分别考察35S:MIR156a过表达猕猴桃果实和35S:MIM156干扰表达猕猴桃果实中的miR156表达水平(检测方法如实施例5所示)、11种AsA合成和循环途径相关基因的表达水平(分析方法如实施例2、3所示)、ASA含量和T-ASA含量(检测方法如实施例1所示)，检测结果如图6和图7所示，pRI101为空白对照组，图7中的7-a为miR156表达水平的检测结果，7-b为ASA含量检测结果，7-c为T-ASA含量检测结果，pRI101为空白对照组。
35S:MIR156a过表达和35S:MIM156干扰表达载体的构建方法如下：
(1)目的片段的获得
以“红阳”猕猴桃果实DNA为模板。克隆miR156前体基因序列，将miR156前体基因序列插入载体35S启动子之后。干扰载体由pRI 101-AN载体改造而成，在该载体插入一段内含子，由沈阳农业大学张志宏老师实验室改造并惠赠，目前该载体已商品化(TaKaRa，V010822#)。选取一段长度为200bp左右的miR156前体基因片段用于构建35S:MIM156干扰表达载体。选取的片段分别正向、反向插入干扰载体。根据基因序列设计特异引物，并在引物两端加入合适的酶切位点，进行PCR扩增反应。引物如表5所示：
表5、分别用于扩增过表达载体和干扰载体的引物
(2)载体酶切和目的片段的回收
表达载体与(1)中的扩增产物分别进行双酶切，1％琼脂糖电泳后切下目的基因片段和所需要连接的载体片段的胶块，进行胶回收。
(3)目的片段与过表达载体的连接
目的片段和载体的连接使用T4 DNA Ligase(2011A，Takara)，反应体系如表6：
表6、反应体系
轻弹混匀4℃过夜连接。
(4)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定。
(5)将构建好的表达载体转化农杆菌感受态EHA105，用于转化瞬时转化猕猴桃果实。构建的35S:MIR156a过表达载体具有如Seq ID NO.1所示的核苷酸序列(过表达载体采用的是miR156基因全场序列)；35S:MIM156干扰表达载体具有如Seq ID NO.17所示的核苷酸序列(干扰表达载体采用的是针对miR156基因的干扰片段)。
根据图6可以看出，与对照组(pRI101)相比，除了AcMDHAR1基因外，在35S:MIR156a过表达果实中AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR表达水平显著升高，而在35S:MIM156干扰表达果实中上述基因的表达水平显著下降，但AcPMM表达水平几乎不变。因此可以明确得出，miR156能够通过调控猕猴桃果实中的抗坏血酸合成和循环途径相关基因的表达。
根据图7-a可以看出，35S:MIR156a过表达猕猴桃果实中miR156表达水平显著升高；35S:MIM156干扰表达果实中miR156表达水平显著降低，可见本实施例构建的35S:MIR156a过表达载体和35S:MIM156干扰表达载体都能明确起到过表达和干扰表达miR156的效果。
根据图7-b和7-c可以看出，与对照组相比，T-AsA和AsA含量在35S:MIR156a过表达猕猴桃果实中显著增加，而在35S:MIM156干扰表达果实中显著减少。可见miR156确实能够调控猕猴桃果实中的抗坏血酸含量，而且该调控为正向调控，miR156基因表达高时，猕猴桃果实中的抗坏血酸含量也高，miR156表达低时，猕猴桃果实中的抗坏血酸含量也低。
根据图6和图7可以看出，过表达或干扰表达miR156基因，能够调控猕猴桃果实中的抗坏血酸合成和循环途径相关基因的表达，从而调控猕猴桃果实中的抗坏血酸含量。
综上所述，猕猴桃果实内外果皮AsA含量存在显著差异，内果皮AsA含量显著大于外果皮。在AsA合成途径中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR是导致猕猴桃果实内外果皮AsA差异的主要基因且差异主要存在于果实发育早期(花后40-80d)。在AsA循环途径中，AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是导致猕猴桃果实内外果皮AsA差异的主要基因且差异主要存在于果实发育后期(花后80-120d)，降解途径未见差异。瞬时转基因手段证实miR156调控猕猴桃果实中的抗坏血酸合成和循环途径基因表达，包括合成途径基因：AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME、AcGalUR；循环途径基因：AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR，从而介导猕猴桃果实内外果皮抗坏血酸合成差异。该结果可为探究猕猴桃内外果皮AsA差异的生理和分子机制提供方向，通过生理生化以及分子互作调控手段，探究猕猴桃内外果皮AsA代谢差异的原因，以此来揭示猕猴桃果实AsA代谢生理和分子机制，期待丰富AsA生物合成调控途径和提高果实AsA含量提供理论基础。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (10)

1.miR156基因用于制备提高和/或降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，其特征在于，所述miR156基因具有如序列表Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，通过促进miR156基因的表达来提高猕猴桃的抗坏血酸含量；
或通过降低miR156基因的表达来降低猕猴桃的抗坏血酸含量。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述促进miR156基因的表达，能够促进AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因的表达从而提高猕猴桃的抗坏血酸含量；所述降低miR156基因的表达能够降低AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因的表达从而降低猕猴桃的抗坏血酸含量；所述AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR具有如序列表Seq ID NO.2～11所示的核苷酸序列。
4.miR156基因用于制备提高和/或降低果实中的AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因表达的制剂的用途；其特征在于，所述AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR具有如序列表Seq ID NO.2～11所示的核苷酸序列。
5.一种miR156基因过表达载体用于制备提高猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，其特征在于，所述miR156基因过表达载体含有如Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。
6.一种miR156基因干扰表达载体用于制备降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，其特征在于，所述miR156基因干扰表达载体含有如Seq ID NO.17所示的核苷酸序列。
7.一种用于提高和/或降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂，其特征在于，包括miR156基因的过表达载体，和/或miR156基因的干扰表达载体。
8.如权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述miR156基因过表达载体含有如Seq IDNO.1所示的核苷酸序列；所述miR156基因干扰表达载体含有如Seq ID NO.17所示的核苷酸序列。
9.一种提高和/或降低猕猴桃的抗坏血酸含量的方法，其特征在于，在猕猴挑上施用如权利要求7或8所述的制剂。
10.一种标志物用于制备预测果实中抗坏血酸含量的制剂的用途，其特征在于，所述标志物包括miR156、AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR中的任意一种或多种基因，所述miR156、AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcGaIUR、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR分别具有如序列表Seq ID NO.1～11所示的核苷酸序列。
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