CN110452959A - 一种黄草乌实时定量pcr内参基因的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，属于分子生物学领域，具体步骤为：RNA提取；反转录cDNA合成；根据肌动蛋白基因、3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶、β‑微管蛋白基因、18S核糖体RNA基因和泛素基因6个候选内参基因的核苷酸序列分别设计定量引物；荧光定量分析；数据分析后筛选出表达稳定的内参基因和内参基因组合。本发明通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究黄草乌基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在黄草乌基因表达研究中获得可靠的标准化qRT‑PCR数据。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法。
背景技术
实时定量PCR(quantitative real-time PCR)是利用实时荧光定量仪，来检测PCR反应后产物的量，以达到对核酸定量的目的。与传统的RNA定量技术相比，它对于探测低拷贝数的mRNA更加灵敏。实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction)从定性到定量的飞跃，具有定量准确性高、重复性好、灵敏度强、速度快等优点。随着基因组学以及高通量测序技术的发展，在分子生物学领域中，实时荧光定量已经成为分析基因表达特性的重要工具。利用分析基因相对定量表达时，为了消除不同组织细胞间初始模板量、质量、酶促反应效率等偏差，往往需要引入内参基因对其进行校正。
鉴于实时定量PCR的众多优点，在植物科学领域中，越来越多的研究者利用实时荧光定量PCR技术筛选合适的内参基因，以进行基因表达和转录组分析，植物内参基因筛选的相关报道也越来越多，挑选表达稳定的内参基因是进行实时定量PCR分析的重要前提，但到目前为止，对黄草乌内参基因的筛选的相关报道较少。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究黄草乌基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在黄草乌基因表达研究中获得可靠的标准化qRT-PCR数据。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，具体步骤为：
1)RNA提取：黄草乌组织经液氮冷冻后再研磨，采用trizol法提取总RNA，提取完成后用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性；
2)反转录cDNA合成：按照反转录试剂盒(TransScriptⅡOneStep gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix)的操作方法，将样品RNA反转录合成第一链，反转录体系为20μL，获得的产物直接使用或-80℃冰箱贮藏备用；
3)引物设计：根据3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、β-微管蛋白基因(β-TUB)、肌动蛋白基因(Actin)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)和泛素基因(UBQ)6个候选内参基因的核苷酸序列(见序列表SEQ ID No.1-6)分别设计定量引物，引物序列见下表：
4)荧光定量：以cDNA为模板，稀释5个梯度，每个梯度5倍，即模板浓度分别为初始浓度的1、1/5、1/52、1/53、1/54倍进行实时荧光定量分析；
5)数据分析：读取荧光定量PCR的CT值，根据公式Q＝EΔCT进行计算出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，采用Bestkeeper、GeNorm和Norm-finder软件对6个候选内参基因在黄草乌组织的表达稳定性进行分析，Bestkeeper软件直接采用基因表达Ct值进行分析，而GeNorm和Norm-finder软件将Ct值经ΔCt方法转换后进行数据分析，筛选出表达稳定的内参基因和内参基因组合。
进一步地，步骤1)中，所述的黄草乌组织为根、茎、叶、花中的一种。
进一步地，RNA提取的具体步骤为：在黄草乌组织样品中，加1ml trizol试剂混匀，加200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀后冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；取上清约450μL至新离心管，加入400μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀后冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；取上清约400μL至新的离心管中，加入异丙醇400μL，晃动混匀后-20冰箱放置30min后4℃、12000rpm离心30min；倒掉管内液体，管内加入500μL的75％酒精洗涤，4℃、7500rpm离心15min，重复该步骤，洗3次；倒掉管内液体，晾干离心管后向管内加入20μL DEPC水。
进一步地，步骤4)中，荧光定量分析体系为：SYBR PremixEx Taq10μL，上、下游引物各0.8μL，cDNA模板1μL，RNase-free ddH2O加至20μL；反应条件为：95℃预变性15min，94℃变性10sec，53℃退火20sec，72℃延伸30sec，40个循环，72℃延伸10min。
本发明的有益效果：本发明通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究黄草乌基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在黄草乌基因表达研究中获得可靠的标准化qRT-PCR数据。
附图说明
图1为黄草乌不同组织的总RNA凝胶电泳；
图2为检测6个候选内参基因扩增产物的凝胶电泳；
图3为6个候选内参基因在不同组织中的溶解曲线图；
图4为GeNorm软件分析各参考基因在不同组织中的表达稳定值曲线图；
图5为HMGCR和PMK基因在不同组织中的相对表达量。A：以MDH、GADPH、18S RNA、ACT和UBQ为内参基因，通过实时定量PCR计算得到根茎叶花组织中的HMGCR基因的相对表达量。B：以MDH、GADPH、18S RNA、ACT和UBQ为内参基因，通过实时定量PCR计算得到根茎叶花组织中PMK基因的相对表达量。C：转录组数据得到的HMGCR和PMK基因的在根形成初期(root1)、中期(root2)和形成期(root3)表达量(FPKM)；以MDH为内参基因，通过实时定量PCR计算得到在根形成初期、中期和形成期HMGCR和PMK基因的相关表达量。
具体实施方式
实施例
一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，具体步骤为：
1)RNA提取：黄草乌根、茎、叶、花组织分别经液氮冷冻后再研磨，加1ml trizol试剂混匀，加200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀后冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；取上清约450μL至新离心管，加入400μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀后冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；取上清约400μL至新的离心管中，加入异丙醇400μL，晃动混匀后-20冰箱放置30min后4℃、12000rpm离心30min；倒掉管内液体，管内加入500μL的75％酒精洗涤，4℃、7500rpm离心15min，重复该步骤，洗3次；倒掉管内液体，晾干离心管后向管内加入20μLDEPC水，分别提取黄草乌根、茎、叶、花组织的总RNA，提取完成后用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性，电泳图见图1；
2)反转录cDNA合成：按照反转录试剂盒(TransScriptⅡOneStep gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix)的操作方法，将样品RNA反转录合成第一链，反转录体系为20μL，获得的产物直接使用或-80℃冰箱贮藏备用；
3)引物设计：根据肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、β-微管蛋白基因(β-TUB)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)和泛素基因(UBQ)6个候选内参基因的核苷酸序列分别设计定量引物，由硕擎生物科技有限公司合成；
4)荧光定量：以根、茎、叶、花不同组织的cDNA为模板，稀释5个梯度，每个梯度5倍，即模板浓度分别为初始浓度的1、1/5、1/52、1/53、1/54倍进行实时荧光定量分析；分析体系为：SYBR PremixEx Taq10μL，上、下游引物各0.8μL，cDNA模板1μL，RNase-free ddH2O加至20μL；反应条件为：95℃预变性15min，94℃变性10sec，53℃退火20sec，72℃延伸30sec，40个循环，72℃延伸10min。
5)数据分析：读取荧光定量PCR的CT值，根据公式Q＝EΔCT进行计算出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，采用Best Keeper软件对各候选内参基因在黄草乌不同组织中的稳定性进行分析，稳定性排序见下表。
| 组织 | 稳定排名 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 根 | 基因名称 | MDH | GADPH | 18s RNA | ACT | UBQ | β-TUB |
| 标准差 | 0.03 | 0.04 | 0.16 | 0.26 | 0.34 | 0.37 | |
| 变异系数(％) | 0.08 | 0.12 | 0.53 | 0.93 | 1.02 | 1.10 | |
| 茎 | 基因名称 | MDH | β-TUB | UBQ | 18s RNA | GADPH | ACT |
| 标准差 | 0.11 | 0.14 | 0.19 | 0.14 | 0.19 | 0.27 | |
| 变异系数(％) | 0.52 | 0.55 | 0.58 | 0.62 | 0.79 | 1.27 | |
| 叶 | 基因名称 | MDH | GADPH | 18s RNA | β-TUB | ACT | UBQ |
| 标准差 | 0.05 | 0.06 | 0.06 | 0.13 | 0.13 | 0.21 | |
| 变异系数(％) | 0.21 | 0.25 | 0.28 | 0.44 | 0.54 | 0.62 | |
| 花 | 基因名称 | GADPH | β-TUB | UBQ | MDH | 18s RNA | ACT |
| 标准差 | 0.12 | 0.22 | 0.31 | 0.22 | 0.23 | 0.37 | |
| 变异系数(％) | 0.55 | 0.90 | 0.96 | 0.98 | 1.17 | 1.81 |
采用GeNorm软件对各候选内参基因在黄草乌不同组织中的稳定性进行分析，稳定性排序见下表。
采用NormFinder软件对各候选内参基因在黄草乌不同组织中的稳定性进行分析，稳定性排序见下表。
对通过各软件分析的稳定性数据进行综合排序，得到各候选内参基因在黄草乌不同组织中表达稳定性的综合排名，见下表。
| 组织 | 稳定排名 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 根 | 基因名称 | MDH | GADPH | 18s RNA | ACT | UBQ | β-TUB |
| 茎 | 基因名称 | MDH | 18s RNA | β-TUB | GADPH | UBQ | ACT |
| 叶 | 基因名称 | MDH | 18s RNA | ACT | β-TUB | GADPH | UBQ |
| 花 | 基因名称 | GADPH | β-TUB | MDH | UBQ | ACT | 18s RNA |
从上述分析结果可看出，黄草乌根组织中，GADPH、MDH和18s RNA表达较为稳定，可作为黄草乌根组织的内参基因；综合分析MDH和18s RNA在茎组织中表达较为稳定，可作为黄草乌茎组织的内参基因；综合分析MDH、18sRNA和ACT在叶组织中表达较为稳定，可作为黄草乌叶组织的内参基因；GAPDH、β-TUB和MDH在花组织中表达较为稳定，可作为黄草乌花组织的内参基因。
内参基因的验证：根据Bestkeeper、GeNorm和Norm-finder软件的分析结果得到的理想内参基因，用2-ΔΔct法测定，检测与生物碱代谢相关的两个功能基因hydroxymethylglutaryl-CoAreductase(HMGCR)和phosphomevalonate kinase(PMK)的表达水平，验证根茎叶花的参考基因。此外，通过对黄草乌两个功能基因HMGCR和PMK在根发育过程中的相对表达模式与根转录组中这两个基因的表达模式(FPKM)进行相关分析，以进一步验证根组织所选内参基因的稳定性。
HMGCR的引物为：5’-ATGGTGATGGTGATGGTG(正向)和5’-ATTCCTCCTCCTGTCTCT(反向)。
PMK的引物为5’-CCGATTGAGCCAGAACTAC(正向)和5’-AACTCCTGCCACAAGAAC(反向)。
黄草乌的不同内参基因(MDH、GADPH、18s RNA、ACT、UBQ)验证HMGCR和PMK两个目的基因的表达水平结果表明，经稳定表达的MDH、GADPH、18S RNA、ACT参考基因标准化后，HMGCR和PMK基因的表达谱相似。
本发明通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出黄草乌各组织中表达相对稳定的基因作为内参基因，为研究黄草乌基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在黄草乌基因表达研究中获得可靠的标准化qRT-PCR数据。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的。
SEQ ID No.1
408
DNA
人工序列
1
1 actgttgatg ggccatccag caaagattgg agaggaggaa gagctgcatc atttaacatc
61 atccccagta gtactggtgc tgctaaggca gttgggaaag ttcttccatc attgaatggt
121 aaattaacag ggatggcttt ccgtgtacct acagtggatg tctcagttgt ggatctcact
181 gtgaggcttg agaaaaaggc cacttacgaa caaatcaaag cggctatcaa ggaggaatct
241 gaaggaaaga tgaaagggat tttaggttac actgaggatg atgttgtttc caccgacttt
301 gtgggtgaca gtaggtccag catatttgat gccaaggctg gaattgcttt gaacgacaac
361 tttgtgaagc ttgtgtcatg gtatgacaat gagtggggtt acaggtga
SEQ ID No.2
999
DNA
人工序列
2
1 atggcgaagg atccagttcg cgttctcgtc accggagctg caggacaaat aggttatgct
61 cttgtcccca tgattgctag aggagtaatg ctcggtcccg accagcctgt aattcttcac
121 atgcttgata ttgcacctgc tgctgaggct ttgaatggag tgaagatgga gttgatagat
181 gctgcatttc cccttctcaa aggtgttgtt gctacaactg atgctgttga gggatgcact
241 ggagtcaaca tcgccgttat ggttggtggg ttcccaagga aagaaggaat ggagaggaag
301 gacgtgatga caaaaaatgt atccatctac aaagaccaag cttctgcttt ggagaagcat
361 gctgctgcaa actgcaaggt tttggttgtt gctaatcccg caaacaccaa tgccttgatc
421 ctgaaagagt ttgcaccctc cattcctgaa aggaacatca cttgcttgac acgtctcgat
481 cacaaccgtg ctcttggcca aatatcagaa agactcaatg ttcaggtcag tgatgttagg
541 aacgttatca tatggggaaa tcactcgtcg actcaatatc ccgatgtcaa ccatgccact
601 gttaaaacac cagctggaga aaaatctgtg aaagagcttg ttgcggatga tacgtggttg
661 actggagcct tcatcaccac tgtacaacaa cgtggtgctg caattattaa agctcgaaag
721 ctttcaagtg ctttatctgc tgctagttct gcttgtgatc atatacgtga ttgggtgctt
781 ggaacaccag agggaacctg ggtttccatg ggagtgtact cagatggatc ctatgatgtc
841 ccagcaggac ttatctattc cttccctgtc acttgtgaaa agggggaatg gaaaatcgtg
901 caagggcttt caattgatga gttctcaaga aagaaattgg acttgacagc agaggagctc
961 tctgaggaaa aggctttggc atactcctgc ctgacataa
SEQ ID No.3
747
DNA
人工序列
3
1 atgccagaga agattacagc cgaaaacctg ctgagcagca taatggaaac tcttgcagat
61 aatgctccaa agcataaagc atcttcgttt tttgagctgg agagatcgaa ctcagtttct
121 gatcagataa ataggctatt tggacgcgag aagccagtcc acaaaatttt gggaggagga
181 aaatctgctg atgttttgtt atggagaaac aagaaaatat ctgcaagtgt tttgacttgt
241 gcaacagcca tctgggtgat ctttgaattt cttaattatc atctcctgtc tatggtgttc
301 ttctcattag ttcttggtat ggttacacaa tttgcttggt caaatgcatc aagcttatta
361 aaccgggccc catctaaagc gcctcgtctt cgtttgtccg aggagttatt cgtcaatata
421 ggtgtcttcg ttggctctga gattaaccgc tttttggggt ttctccagga tgtggcatgc
481 ggtggaaact tgaagcaatt tctgatgatt gtatttggct tatgggctgc tgctgtgatt
541 gggagttggt gcaatttcct gactgtcgtg tatattggat ttgttgctgc ccatactttg
601 ccagttttgt atgagaggta tgacgatcaa gtcgacaact tcatttataa acttctcaat
661 cagctgcggc gtcactatcg taagatcgat tacaacctac taaacagaat tcccaagcga
721 aatctgaaga aaaagaaaag tttctagact
SEQ ID No.4
378
DNA
人工序列
4
1 atgatgccag atcttctcca tgtcatccca gttactaact attccatgct caattgggta
61 cttcaatgtg aggatacctc ttttggactg ggcttcatct cctacataag catctttctg
121 tcccatccca accatgacac ctgtatgtcg tggtcttcca acaatactgg gaaacactgc
181 cctaggagca tcatcaccag caaatccagc cttcaccatt ccagttccat tgtcgcagac
241 gaggggttgg atttcctcag catcagccat ttttttatac ctttgcagtg gtggtggaga
301 cgaagaaagc aaggagattt agggcagaga agcctttcag agaagccttt cttctctcct
361 tggtgccgaa atcactaa
SEQ ID No.5
354
DNA
人工序列
5
1 atgtggttga tggcagaggg ggagatacgt agacgtcata attttgatgt ccgtgtctcc
61 cgctctttca tctctcatgg ctgcaagtca accgaagttg tgggcgatgg taagggggca
121 ccaataatgt cgaaatggga aggggctaag aaagttggct tcttcgttgt ccctgtccct
181 cgaattgcat tccccttgcc ctctcgttct ataccaaggt ttaccaagat gtggttgatg
241 gcggaggggg gatacggaga cgtcataatt ttgacgtccg tgtctcccgc tctttcatct
301 ctcatggctg caagtcaacc gaagttgtgg gcgatggtaa gggggcacca ataa
SEQ ID No.6
552
DNA
人工序列
6
1 aatctttcga atctcctcaa atcccccatc ttccgaatac gaaaaccaga gaaacacaac
61 gaaagcagag caaggaatcg aagctcgaag gtttgcgatc gaaacatggc ttcgaaacgg
121 atcttgaaag aactcaagga tctgcagaaa gatccgccta cttcttgcag tgcagggcct
181 gttgctgaag atatgtttca ctggcaagct acaattatgg gtccaccaga cagtccttat
241 gcaggaggag tgtttttggt tactattcat ttccctccag attatccttt taaaccacca
301 aaggtagctt ttaggacaaa agtatttcac ccaaatatca acagcaatgg tagcatttgc
361 cttgacatct tgaaggagca gtggagtcct gctctgacta tttccaaggt gttgctctca
421 atctgctccc tattgacgga cccaaaccct gacgatcctt tggtgccaga gattgctcac
481 atgtacaaga cagacaggag caagtacgag accactgctc ggagctggac tcaaaaatat
541 gccatgggat ag
SEQ ID No.7
18
DNA
人工序列
7
gctatcaagg aggaatct 18
SEQ ID No.8
18
DNA
人工序列
8
aatatgctgg acctactg 18
SEQ ID No.9
18
DNA
人工序列
9
ccagcctgta attcttca 18
SEQ ID No.10
20
DNA
人工序列
10
ctatcaactc catcttcact 20
SEQ ID No.11
19
DNA
人工序列
11
ttcttctcat tagttcttg 19
SEQ ID No.12
18
DNA
人工序列
12
acacctatat tgacgaat 18
SEQ ID No.13
18
DNA
人工序列
13
ctgtatgtcg tggtcttc 18
SEQ ID No.14
18
DNA
人工序列
14
caatggaact ggaatggt 18
SEQ ID No.15
18
DNA
人工序列
15
agttggcttc ttcgttgt 18
SEQ ID No.16
23
DNA
人工序列
16
catcttggta aaccttggta tag 23
SEQ ID No.17
18
DNA
人工序列
17
tgttgctgaa gatatgtt 18
SEQ ID No.18
18
DNA
人工序列
18
ctaccattgc tgttgata 18
Claims (6)
1.一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：具体步骤为：
1）RNA 提取：黄草乌组织经液氮冷冻后再研磨，采用trizol法提取总RNA；
2）反转录cDNA合成：将样品RNA反转录合成第一链，反转录体系为20µL，获得的产物直接使用或-80℃冰箱贮藏备用；
3）引物设计：根据肌动蛋白基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶、β-微管蛋白基因、18S核糖体RNA基因和泛素基因6个候选内参基因的核苷酸序列分别设计定量引物；
4）荧光定量：以cDNA为模板，稀释5个梯度，每个梯度5倍，即模板浓度分别为初始浓度的1、1/5、1/52、1/53、1/54倍进行实时荧光定量分析；
5）数据分析：读取荧光定量PCR的CT值，根据公式Q=EΔCT进行计算出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，采用Bestkeeper、GeNorm和Norm-finder软件对6个候选内参基因在黄草乌组织的表达稳定性进行分析，Bestkeeper软件直接采用基因表达Ct值进行分析，而GeNorm和Norm-finder软件将Ct值经ΔCt方法转换后进行数据分析，筛选出表达稳定的内参基因和内参基因组合。
2.根据权利要求1所述的一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤1）中，所述的黄草乌组织为根、茎、叶、花中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：RNA 提取的具体步骤为：在黄草乌组织样品中，加1ml trizol试剂混匀，加200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀后冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；取上清约450μL至新离心管，加入400μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀后冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；取上清约400μL至新的离心管中，加入异丙醇400μL，晃动混匀后-20冰箱放置30min后4℃、12000rpm离心30min；倒掉管内液体，管内加入500μL的75%酒精洗涤，4℃、7500rpm离心15min，重复该步骤，洗3次；倒掉管内液体，晾干离心管后向管内加入20μL DEPC水。
4.根据权利要求1所述的一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤3）中，所述的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的具有如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，苹果酸脱氢酶具有如序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，β-微管蛋白基因具有如序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，肌动蛋白基因具有如序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，18S核糖体RNA基因具有如序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，泛素基因具有如序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤3）中，所述的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7和SEQID No.8所示，苹果酸脱氢酶的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，β-微管蛋白基因的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，肌动蛋白基因的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，18S核糖体RNA基因的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，泛素基因的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。
6.根据权利要求1所述的一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤4）中，荧光定量分析体系为：SYBR PremixEx Taq10µL，上、下游引物各0.8µL，cDNA模板1µL，RNase-free ddH2O加至20µL；反应条件为：95℃预变性15min，94℃变性10sec，53℃退火20sec，72℃延伸30sec，40个循环，72℃延伸10min。
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