CN108753922A - 一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。本发明用于构建转录组测序文库的接头序列,巧妙的应用了以C3~C21长碳链的化学修饰,应用于单链形成的茎环结构测序接头,与现有的主流建库接头相比,有不易产生接头二聚、无需额外进行双链退火和无需使用酶打开茎环中环状结构的优势,在不影响后期PCR扩增的基础上,大大的节省了反应时间和试剂成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。
背景技术
随着现代科学技术的发展,生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究,特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医等领域中得到广泛的应用。随着新一代高通量测序技术的快速发展,转录组测序已经成为研究基因表达与转录调控的重要手段。转录组是指单个生物物种的个体,或者该个体的特定组织或特定细胞类型,在特定的环境条件下,或者实验处理条件下所产生的所有转录本的集合。各种类型的转录本都可以通过新一代测序技术进行高通量定量检测,这项技术被称为转录组测序。转录组测序技术可以用作转录本的结构及其变异、基因表达水平、非编码区域功能和低丰度全新转录本发现等各方面的研究上。通过对转录组的研究,人们能够从生物的整体水平上研究基因结构及其基因功能。转录组测序已被广泛应用于遗传学、农学和医学基础研究、医疗诊断和药物研发等领域中。
转录组文库构建常规流程包括:1)总RNA的分离和纯化,富集mRNA 或者去除核糖体RNA(rRNA);2)富集后的RNA进行打断;3)第一链cDNA 反转录;4)第二链cDNA合成;3)双链cDNA片段末端补平;4)双链cDNA 片段3’端加A尾;5)双链cDNA片段加接头;6)选择双链cDNA片段大小;7)PCR扩增;8)检测转录组文库的质量。转录组建库常用试剂为NEB Ultra系列、Illumina Truseq系列及Kapa Hyper系列等,而建库试剂中的接头主要有三种经典结构,包括平端双链接头(以Thermo公司的建库试剂为代表)、Y型结构双链接头(以Illumina公司的建库试剂为代表)和U型结构单链接头(以NEB公司的建库试剂为代表)。这三种接头的主要优势和弊端分别为,平末端的双链接头效率中等,易形成接头自连;Y型结构双链接头连接效率偏低,制作工艺需要额外添加退火步骤,而且退火前两条单链的浓度及比例常因为定量问题而存在批次间产生比例失衡而不稳定;U型结构单链接头由于为单链结构,天然形成部分双链的茎环结构,无需额外退火,连接效率高,不易产生接头自连,但是需要在文库PCR扩增之前使用酶把 U型结构打开,增加实验的步骤及试剂成本。现阶段所有的接头设计序列上仍然受到测序上游公司的制约,而设计出连接效率高、最终文库得率高且步骤简单节省试剂成本的接头,将有利于进一步降低基因组测序文库构建成本,推动基因测序的不断发展。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于构建转录组测序文库的接头序列,其中,所述接头序列的5’端用磷酸修饰,且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的CGACGCTCTTCCGATC形成双链茎结构,其余碱基形成环状结构; 3’端最后一个碱基为T,并以硫代修饰。
需要说明的是,本发明接头序列中,所述环状结构至少包含2个碱基,其中间还以C3(3个连续碳链)~C21(21个连续碳链)修饰。
作为一种优选技术方案,所述环状结构上的碱基为39个,其中间以1~3个 C18(18个连续碳链)修饰。
作为一种最优选技术方案,所述环状结构由19个碱基+C18+20个碱基构成。
本发明另一目的是提供一种构建转录组测序文库的方法,其包括如下步骤:
S1、提取样品的总RNA,或进一步经mRNA富集,或去rRNA处理后得到的RNA,进行反转录,形成双链cDNA;
S2、将cDNA分子进行末端修复和加A;
S3、在经过末端修复和加A的cDNA分子两端加入所述的接头序列;
S4、对加入接头序列的cDNA分子进行扩增,得到转录组测序文库。
作为一种优选技术方案,所述接头序列的浓度为5~20μM。
作为一种更优选技术方案,所述接头序列的浓度为15μM。
本发明还有一个目的是提供一种用于构建转录组测序文库的接头试剂盒,其中,所述试剂盒包含上述接头序列。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明中,利用能兼容Illumina测序平台的接头序列,利用互补序列以外游离的核酸序列之间加上特殊的修饰,形成一个具有突出T粘性末端,并形成茎环二级结构的单链经修饰接头,应用于构建转录组测序文库。
(2)本发明所描述的用于构建转录组测序文库的接头,能够通过搭配各大主流的建库试剂盒,包括NEB、Thermo公司的建库试剂盒,均能实现高效的连接,最终得到浓度足够高的转录组文库,完成上机测序和后续的转录组测序相关的应用,有效实现转录组测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。
(3)本发明所描述的用于构建转录组测序文库的接头,与现有市面上比较成熟的接头产品相比,由于有带T碱基的突出末端,与平末端的双链接头相比,具有不容易产生接头自连的优势;由于是单链带茎环的发夹结构,与一端游离的Y型接头相比,无需额外增加退火的步骤,以及无需承担批次间由于定量不准而导致两条单链其一退火后冗余造成的接头质量差异风险;与U型的接头相比,由于结构上巧妙的以一段修饰组成的茎环结构,无需额外使用酶把环状结构打开,在成本上有很大的优势,而且修饰结构并不会影响后期的PCR反应,在步骤上也可以节省工序和时间。
(4)通过使用本发明的接头进行文库构建,经不同起始量的测试、不同的物种和样品种类来源、与不同主流建库试剂盒试剂搭配使用,以及上机测序的数据,均表明本发明设计的接头能够达到预期的转录组文库建库和测序的性能要求,不仅在转录组文库PCR后的片段大小和文库浓度上与行业内标准媲美,所构建的转录组文库能够能满足基因检测的测序要求,具有广泛应用于各种物种来源的转录组测序。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例结合详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
在一些实施方案中,本发明设计的用于构建转录组测序文库的接头,使用 C3~C21(3~21个连续的碳修饰)结构,能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的转录组测序文库。
在一些实施方案中,本发明设计的用于构建转录组测序文库的接头,使用 C18(18个连续的碳修饰)结构,使用1~3个C18间隔的修饰结构,能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的转录组测序文库。
在一些实施方案中,本发明设计的用于构建转录组测序文库的接头,使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构,接头浓度为15μM,能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的转录组测序文库。
在一些实施方案中,本发明设计的用于构建转录组测序文库的接头,使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构,接头浓度为15μM,起始总RNA为100ng,搭配不同的建库试剂盒试剂,能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的转录组测序文库。
在一些实施方案中,本发明设计的用于构建转录组测序文库的接头,使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构,接头浓度为15μM,起始总RNA为1-100ng,搭配不同的PCR循环数,能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的转录组测序文库。
在一些实施方案中,本发明设计的用于构建转录组测序文库的接头,使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构,接头浓度为15μM,不同物种和样品来源起始总RNA为100ng,能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的转录组测序文库,经上机测序及后期数据分析,该文库能得到预期的基因检测分析结果。
本领域技术人员应能理解,本方法中的用于构建转录组测序文库的接头,同时也可以应用于其他与转录组RNA起始或者经富集的RNA有关的转录组及调控组测序应用领域,只要符合转录组建库流程的原理。
本发明所描述的用于构建转录组测序文库的接头,巧妙的应用了长碳链的化学修饰,应用于单链形成的茎环结构测序接头,与现有的主流建库接头相比,有不易产生接头二聚、无需额外进行双链退火和无需使用酶打开茎环中环状结构的优势,在不影响后期PCR扩增的基础上,大大的节省了反应时间和试剂成本。
实施例1碳链修饰的长度
1.细胞培养
使用GIBCO的DMEM和10%的FBS血清,37℃和5%CO2培养条件下对 293T细胞进行培养,正常培养2天后,细胞密度在60-80%(4万-5万个)左右。
2.总RNA提取
按照Qiagen的QIAamp RNA Blood Mini Kit说明书指示进行总RNA的提取。
3.转录组测序文库构建
100ng起始量(细胞的总RNA),用NEBNext RNA超快速文库制备试剂盒 -Illumina进行文库构建,主要步骤为:RNA片段化(片段化后平均片段长度为200bp);一链反转录;二链反转录;双链cDNA末端修复及纯化;3'末端加A 及纯化;测序接头连接及纯化;PCR扩增及纯化,得到了转录组测序文库。其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行,不同长碳链修饰的测序接头序列如表2所示,连接反应的储存液浓度为15μM。
表2
4.转录组测序文库质检
使用Agilent 4200TapeStation和Qubit 2.0进行文库质检。片段平均长度 310-330bp,文库浓度大于30ng/μl为质检合格的文库,
5.结果分析
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用C3(3个连续的长碳链修饰)、C9(9个连续的长碳链修饰)、C18(18个连续的长碳链修饰) 和C21(21个连续的长碳链修饰)的测序接头,其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。同时,本方法设计的长碳链修饰的接头,随着碳链的增长,对应构建的转录组测序文库浓度有所提升,平衡成本和性能指标,以C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头性能最好。
表3
实施例2碳链修饰的单元数
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速转录组文库制备试剂盒说明书指示进行,不同长碳链修饰单元数的测序接头序列如表4所示,连接反应的储存液浓度为15μM。
表4
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析:
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用1个C18(18 个连续的长碳链修饰)、2个C18(18个连续的长碳链修饰)和3个C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头,其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。同时,本方法设计的长碳链修饰的接头,随着碳链的增长,对应构建的转录组测序文库浓度相当,平衡成本和性能指标,以一个C18(18 个连续的长碳链修饰)的测序接头性能最好。
表5
实施例3接头浓度
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速转录组文库制备试剂盒说明书指示进行,测序接头序列如表6所示,连接反应的储存液浓度分别为5μM、10μM、15μM和20μM。
表6
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头,不同的测序接头浓度(5μM、10μM、15μM 和20μM),其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。同时,本方法设计的长碳链修饰的接头,随着测序接头浓度的增长,对应构建的转录组测序文库浓度有所增加,以15μM浓度C18(18个连续的长碳链修饰) 的测序接头性能最好。
表7
实施例4不同品牌的建库试剂盒兼容性
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
NEB和Illumina的转录组文库构建分别根据对应的试剂盒说明书指示进行,测序接头序列如表8所示,连接反应的储存液浓度为15μM。
表8
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析
转录组测序文库质检结果显示,以超快速文库制备搭配NEB和Illumina接头为阳性对照,使用C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头,搭配市面上主流的NEB和Illumina的转录组建库试剂盒试剂,分别构建mRNA普通转录组文库和去rRNA的链特异文库,其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。同时,本方法设计的长碳链修饰的接头,构建的转录组测序文库浓度有所增加,平衡成本和性能指标,本发明设计的测序接头性能最好。
表9
实施例5不同起始量的RNA测序文库构建
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速转录组文库制备试剂盒说明书指示进行,测序接头序列如表10所示,连接反应的储存液浓度为15μM,RNA的起始浓度分别为 1ng、10ng、50ng和100ng,对应最后转录组测序文库扩增的PCR循环数为12 个循环、9个循环、7个循环和6个循环。
表10
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头,测序接头浓度为15μM,RNA的起始浓度分别为1ng、10ng、50ng和100ng,对应不同的PCR扩增循环数,其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。平衡成本和性能指标,本专利设计的转录组文库测序接头性能对于不同起始的转录组RNA均有很好的兼容性。
表11
实施例6不同物种和样品种类起始
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速转录组文库制备试剂盒说明书指示进行,测序接头序列如表12所示,连接反应的储存液浓度为15μM,分别使用人源性、小鼠源性和大鼠源性的样品来源,以及细胞来源、FFPE来源和组织血液来源的样品进行测试。
表12
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头,测序接头浓度为15μM,RNA的起始分别使用人源性细胞系、小鼠源细胞系、大鼠源细胞系、小鼠源FFPE样品和大鼠源血样样品,其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。平衡成本和性能指标,本专利设计的转录组文库测序接头性能对于不同物种和样品来源的转录组RNA均有很好的兼容性。
表13
实施例7小鼠细胞样品不同起始检测基因数目和转录本数目对比
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速转录组文库制备试剂盒说明书指示进行,测序接头序列如表14所示,连接反应的储存液浓度为15μM,分别使用100ng和1000ng 的小鼠总RNA样品起始构建转录组测序文库,最后上机测序并对测序数据进行基因数目和转录本数目分析,衡量测序接头在转录组测序中的应用情况及性能。
表14
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头,测序接头浓度为15μM,总RNA的起始分别使用100ng和1000ng构建转录组测序文库,其均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。同时,最后上机测序并对测序数据进行基因数目和转录本,从100ng 样品A和1000ng样品B的两种接头不同起始量的测序结果,分析分别检测到的转录组数据中的基因数目和转录本数目,本专利设计的转录组文库测序接头能够很好的实现基因检测的功能,与NEB的商业接头相比,没有引入新的偏好,最终在同等起始量下,能够检出的基因数和转录本书都与商业试剂相当,能够很好的得出转录组测序文库的检测结论,实现该测序接头在转录组测序文库构建中的功能。
表15
实施例8环状结构的长短
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.总RNA提取
具体方法同实施例1。
3.转录组测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速转录组文库制备试剂盒说明书指示进行,不同长碳链修饰单元数的测序接头序列如表16所示,连接反应的储存液浓度为15μM。
表16
4.转录组测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析:
转录组测序文库质检结果显示,以NEB接头为阳性对照,使用环状结构为 19nt-修饰-20nt、10nt-修饰-10nt、10nt-修饰-20nt、19nt-修饰-10nt和5nt-修饰-5nt 的测序接头,其构建的转录组测序文库均能达到质检要求,能够进行后续的上机测序,表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行转录组测序文库扩增。同时,本方法设计的长碳链修饰的接头,随着单侧或者双侧的环状结构的碱基减少,对应构建的转录组测序文库浓度相当,平衡成本和性能指标,以环状结构为19nt-修饰-20nt的测序接头性能最好。
表17
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明,该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明所为的等效实施或变更,均应包含于本案的专利范围中。
Claims (10)
1.一种用于构建转录组测序文库的接头序列,其特征在于,所述接头序列的5’端用磷酸修饰,且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的GCTCTTCCGATC形成双链茎结构,其余碱基形成环状结构;3’端最后一个碱基为T,并以硫代修饰。
2.根据权利要求1所述的用于构建转录组测序文库的接头序列,其特征在于,所述环状结构至少包含2个碱基,所述环状结构的中间还以C3~C21修饰。
3.根据权利要求2所述的用于构建转录组测序文库的接头序列,其特征在于,所述环状结构上的碱基为39个。
4.根据权利要求2所述的用于构建转录组测序文库的接头序列,其特征在于,所述环状结构的中间以1~3个C18修饰。
5.根据权利要求4所述的用于构建转录组测序文库的接头序列,其特征在于,所述环状结构的中间以1个C18修饰。
6.根据权利要求5所述的用于构建转录组测序文库的接头序列,其特征在于,所述环状结构由19个碱基+C18+20个碱基构成。
7.一种构建转录组测序文库的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、提取样品的总RNA,或进一步经mRNA富集,或去rRNA处理后得到的RNA,进行反转录,形成双链cDNA;
S2、将双链cDNA分子进行末端修复和加A;
S3、在经过末端修复和加A的双链cDNA分子两端加入权利要求1~6中任意一条权利要求所述的接头序列;
S4、对加入接头序列的cDNA分子进行扩增,得到转录组测序文库。
8.根据权利要求7所述的构建转录组测序文库的方法,其特征在于,所述接头序列的浓度为5~20μM。
9.根据权利要求8所述的构建转录组测序文库的方法,其特征在于,所述接头序列的浓度为15μM。
10.一种用于构建转录组测序文库的接头试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~6中任意一条权利要求所述的接头序列。
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