CN108753923A - 一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒 - Google Patents

一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。本发明接头序列中的胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。本发明用于构建甲基化测序文库的接头序列，巧妙的应用了C3～C21长碳链的化学修饰，应用于单链形成的茎环结构测序接头，与现有的主流建库接头相比，有不易产生接头二聚、无需额外进行双链退火和无需使用酶打开茎环中环状结构的优势，在重亚硫酸盐转化后，在不影响后期PCR扩增的基础上，大大的节省了反应时间和试剂成本。

Description

一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建甲基化测序文库的方法 及相应的接头序列和试剂盒。
背景技术
随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和 基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺 的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的 空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、 法医等领域中得到广泛的应用。在生物发育过程中，一个基因组可以衍生出许 多不同类型的表观基因组，它们通过不同的基因组DNA修饰方式构成不同的表 观遗传信息，使有不同表型的细胞可以将其表观遗传信息通过复制传递给后代 细胞。基因组DNA甲基化作为参与范围最广的表观遗传修饰之一，一直是分子 遗传学的研究热点，它通过影响基因的表达和染色体结构变化来参与不同的生 长发育调控过程。第二代测序技术能够通过全基因组研究，从而对全基因组范 围内的5-加急胞嘧啶(5mC)进行研究。
常用的甲基化测序又被划分为富集型和单碱基分辨率的甲基化测序两大 类：1)富集型的甲基化测序主要通过与高甲基化区域高度亲和的蛋白和抗体， 对基因组DNA进行富集，把富集后的基因组DNA进行常规的建库，包括 MeDIP-seq和MBD-seq测序等，其使用的建库试剂和接头都与常规的基因组 DNA测序文库构建一致；2)单碱基分辨率的甲基化测序，主要是通过重亚硫酸 盐(Bisulfite)转化，把没有被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，再通过后续的PCR 反应把原有的胞嘧啶遗传密码改变为胸腺嘧啶，实现对是否被甲基化的胞嘧啶 进行很好的分辨，因此涉及到亚硫酸盐转化的甲基化测序文库构建的试剂与普 通基因组DNA文库构建对接头和后续PCR用的酶有特殊的要求。
甲基化测序文库构建常规流程包括：1)基因组DNA的分离提取及打断；2) 检测打断后基因组DNA片段质量；3)基因组DNA片段末端补平；4)基因组 DNA片段3’端加A尾；5)基因组DNA片段加甲基化专用接头；6)选择基因 组DNA片段大小；7)重亚硫酸盐转化；8)PCR扩增；9)检测基因组DNA 文库的质量。甲基化测序文库常用试剂为NEB Ultra系列、IlluminaTruseq系列 及Kapa Hyper系列等，甲基化专用接头必须保证接头上的所有胞嘧啶都是经过 甲基化修饰的，保证在重亚硫酸盐转化的过程中接头的碱基序列不会产生变化， 从而影响后续的测序反应。而建库试剂中的接头主要有三种经典结构，包括平 端双链接头(以Thermo公司的建库试剂为代表)、Y型结构双链接头(以Illumina 公司的建库试剂为代表)和U型结构单链接头(以NEB公司的建库试剂为代表)。 这三种接头的主要优势和弊端分别为，平末端的双链接头效率中等，易形成接 头自连；Y型结构双链接头连接效率偏低，制作工艺需要额外添加退火步骤， 而且退火前两条单链的浓度及比例常因为定量问题而存在批次间产生比例失衡 而不稳定；U型结构单链接头由于为单链结构，天然形成部分双链的茎环结构， 无需额外退火，连接效率高，不易产生接头自连，但是需要在文库PCR扩增之 前使用酶把U型结构打开，增加实验的步骤及试剂成本。现阶段所有的接头设 计序列上仍然受到测序上游公司的制约，而设计出连接效率高、最终文库得率 高且步骤简单节省试剂成本的接头，将有利于进一步降低基因组测序文库构建 成本，推动基因测序的不断发展。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于构建甲基化测序文库的接头序列，所 述接头序列的5’端用磷酸修饰，且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端 的CGACGCTCTTCCGATC形成双链茎结构，其余碱基形成环状结构；3’端最 后一个碱基为T，并以硫代修饰；同时，胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。
需要说明的是，本发明接头序列中，所述环状结构至少包含2个碱基， 其中间还以C3(3个连续碳链)～C21(21个连续碳链)修饰。
作为一种优选技术方案，所述环状结构上的碱基为39个，其中间以1～3个 C18(18个连续碳链)修饰。
作为一种最优选技术方案，所述环状结构由19个碱基+C18+20个碱基构成。
本发明另一目的是提供一种构建甲基化测序文库的方法，其包括如下步 骤：
S1、提取样品的基因组DNA，进行DNA分子的打断；
S2、将打断的DNA分子进行末端修复和加A；
S3、在经过末端修复和加A的DNA分子两端加入所述的接头序列；
S4、对加入接头序列的DNA分子进行重亚硫酸盐转化，然后进行扩增，得 到甲基化测序文库。
作为一种优选技术方案，所述接头序列的浓度为5～20μM。
作为一种更优选技术方案，所述接头序列的浓度为15μM。
本发明还有一个目的是提供一种用于构建甲基化测序文库的接头试剂盒， 其中，所述试剂盒包含上述接头序列。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中，利用能兼容Illumina测序平台的接头序列，利用互补序列 以外游离的核酸序列之间加上特殊的修饰，形成一个具有突出T粘性末端，并 形成茎环二级结构的单链经修饰接头，应用于构建甲基化测序文库。
(2)本发明所描述的用于构建甲基化测序文库的接头，能够通过搭配各大 主流的建库试剂盒，包括NEB、Thermo和Kapa公司的建库试剂盒，均能实现 高效的连接，最终得到浓度足够高的甲基化文库，完成上机测序和后续的甲基 化测序相关的应用，有效实现基因测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领 域的广泛应用。
(3)本发明所描述的用于构建甲基化测序文库的接头，与现有市面上比较 成熟的接头产品相比，具有基本的所有胞嘧啶碱基均经过甲基化修饰，保证在 重亚硫酸盐转化过程中不会被转化为U而导致无法正常测序。同时，由于有带 T碱基的突出末端，与平末端的双链接头相比，具有不容易产生接头自连的优势； 由于是单链带茎环的发夹结构，与一端游离的Y型接头相比，无需额外增加退 火的步骤，以及无需承担批次间由于定量不准而导致两条单链其一退火后冗余 造成的接头质量差异风险；与U型的接头相比，由于结构上巧妙的以一段修饰 组成的茎环结构，无需额外使用酶把环状结构打开，在成本上有很大的优势， 而且修饰结构并不会影响后期的PCR反应，在步骤上也可以节省工序和时间。
(4)通过使用本发明的接头进行文库构建，经不同起始量的测试、不同的 物种和样品种类来源、与不同主流建库试剂盒试剂搭配使用，以及上机测序的 数据，均表明本发明设计的接头能够达到预期的甲基化文库建库和测序的性能 要求，不仅在甲基化文库PCR后的片段大小和文库浓度上与行业内标准媲美， 所构建的甲基化文库能够能满足基因检测的测序要求，具有广泛应用于各种物 种来源的甲基化测序。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应 理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子 克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试 剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
在一些实施方案中，本发明设计的用于构建甲基化测序文库的接头，接头 上所有的胞嘧啶碱基都经过甲基化修饰，此外，使用C3～C21(3～21个连续的碳 修饰)结构，能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的甲基化测序文库。
在一些实施方案中，本发明设计的用于构建甲基化测序文库的接头，使用 C18(18个连续的碳修饰)结构，使用1～3个C18间隔的修饰结构，能够得到 满足上机测序的片段长度和文库浓度的甲基化测序文库。
在一些实施方案中，本发明设计的用于构建甲基化测序文库的接头，使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构，接头浓度为15μM，能够得到满足上机测序 的片段长度和文库浓度的甲基化测序文库。
在一些实施方案中，本发明设计的用于构建甲基化测序文库的接头，使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构，接头浓度为15μM，起始基因组DNA为 1000ng，搭配不同的建库试剂盒试剂，能够得到满足上机测序的片段长度和文 库浓度的甲基化测序文库。
在一些实施方案中，本发明设计的用于构建甲基化测序文库的接头，使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构，接头浓度为15μM，起始基因组DNA为 500-2000ng，搭配不同的PCR循环数，能够得到满足上机测序的片段长度和文 库浓度的甲基化测序文库。
在一些实施方案中，本发明设计的用于构建甲基化测序文库的接头，使用1 个C18(18个连续的碳修饰)结构，接头浓度为15μM，不同物种和样品来源起 始基因组DNA为1000ng，能够得到满足上机测序的片段长度和文库浓度的甲基 化测序文库，经上机测序及后期数据分析，该文库能得到预期的甲基化检测分 析结果。
本领域技术人员应能理解，本方法中的用于构建甲基化测序文库的接头， 同时也可以应用于其他与甲基化相关的基因测序应用领域，只要符合甲基化建 库流程的原理。
本发明所描述的用于构建甲基化测序文库的接头，巧妙的应用了长碳链的 化学修饰，应用于单链形成的茎环结构测序接头，与现有的主流建库接头相比， 有不易产生接头二聚、无需额外进行双链退火和无需使用酶打开茎环中的环状 结构的优势，在重亚硫酸盐转化后，接头碱基序列不会改变，在不影响后期PCR 扩增的基础上，大大的节省了反应时间和试剂成本。
实施例1碳链修饰的长度
1、细胞培养
使用GIBCO的DMEM和10％的FBS血清，37℃和5％CO2培养条件下对 293T细胞进行培养，正常培养2天后，细胞密度在60-80％(4万-5万个) 左右。
2、基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNAMini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3、甲基化测序文库构建
1000ng起始量(细胞的DNA)，用NEBNext DNA超快速文库制备试剂盒- Illumina进行文库构建，主要步骤为：DNA片段化(片段化后平均片段长 度为180bp)；末端修复及纯化；3'末端加A及纯化；测序接头连接及纯化； 重亚硫酸盐转化；PCR扩增及纯化，得到了甲基化测序文库。其中具体步骤 按照超快速文库制备试剂盒和其他试剂盒说明书指示进行，不同长碳链修饰 的测序接头序列如表2所示，连接反应的储存液浓度为15μM。
表2
4、甲基化测序文库质检
使用Agilent 4200TapeStation和Qubit 2.0进行文库质检。片段平均长度 300-320bp，文库浓度大于15ng/μl为质检合格的文库，
5、结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用C3(3 个连续的长碳链修饰)、C9(9个连续的长碳链修饰)、C18(18个连续的长 碳链修饰)和C21(21个连续的长碳链修饰)的测序接头，其构建的甲基化 测序文库均能达到质检要求，能够进行后续的上机测序，表明本方法能够高 效的实现测序接头连接并进行甲基化测序文库扩增。同时，本方法设计的长 碳链修饰的接头，随着碳链的增长，对应构建的甲基化测序文库浓度有所提 升，平衡成本和性能指标，以C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头性 能最好。
表3
实施例2碳链修饰的单元数
1、细胞培养
具体方法同实施例1。
2、基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3、甲基化测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行，不同长碳链修饰 单元数的测序接头序列如表4所示，连接反应的储存液浓度为15μM。
表4
4、甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5、结果分析：
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用1个C18(18个连续的长碳链修饰)、2个C18(18个连续的长碳链修饰)和3 个C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头，其构建的甲基化测序文库均 能达到质检要求，能够进行后续的上机测序，表明本方法能够高效的实现测 序接头连接并进行甲基化测序文库扩增。同时，本方法设计的长碳链修饰的 接头，随着碳链的增长，对应构建的甲基化测序文库浓度相当，平衡成本和性能指标，以一个C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头性能最好。
表5
实施例3接头浓度
1、细胞培养
具体方法同实施例1。
2、基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3、甲基化测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行，测序接头序列如 表6所示，连接反应的储存液浓度分别为5μM、10μM、15μM和20μM。
表6
4、甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5、结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用C18 (18个连续的长碳链修饰)的测序接头，不同的测序接头浓度(5μM、10μM、 15μM和20μM)，其构建的甲基化测序文库均能达到质检要求，能够进行后 续的上机测序，表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行甲基化测序 文库扩增。同时，本方法设计的长碳链修饰的接头，随着测序接头浓度的增 长，对应构建的甲基化测序文库浓度有所增加，平衡成本和性能指标，以 15μM浓度C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头性能最好。
表7
实施例4不同品牌的建库试剂盒兼容性
1、细胞培养
具体方法同实施例1。
2、基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3、甲基化测序文库构建
NEB Ultra II建库方法同实施例1，Thermo的ClaSeek LibraryPreparation Kit基因组文库构建试剂盒和Kapa的KAPAHyperPrep Kit基因组文库构建试剂 盒具体步骤按照试剂盒说明书指示进行，测序接头序列如表8所示，连接反 应的储存液浓度为15μM。
表8
4、甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5、结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以超快速文库制备搭配NEB甲基化接头为 阳性对照，使用C18(18个连续的长碳链修饰)的测序接头，搭配市面上主 流的Thermo和Kapa的建库试剂盒试剂，其构建的甲基化测序文库均能达到 质检要求，能够进行后续的上机测序，表明本方法能够高效的实现测序接头 连接并进行甲基化测序文库扩增。同时，本方法设计的长碳链修饰的接头， 构建的甲基化测序文库浓度有所增加，平衡成本和性能指标，本发明设计的 测序接头性能最好。
表9
实施例5不同起始量的基因组DNA测序文库构建
1、细胞培养
具体方法同实施例1。
2、基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3、甲基化测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行，测序接头序列如 表10所示，连接反应的储存液浓度为15μM，基因组DNA的起始浓度分别 为500ng、1000ng和2000ng，对应最后甲基化测序文库扩增的PCR循环数 为15个循环、10个循环和8个循环。
表10
4、甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5、结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用C18 (18个连续的长碳链修饰)的测序接头，测序接头浓度为15μM，基因组DNA 的起始浓度分别为500ng、1000ng和2000ng，对应不同的PCR扩增循环数， 其构建的甲基化测序文库均能达到质检要求，能够进行后续的上机测序，表 明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行甲基化测序文库扩增。本发明 设计的甲基化文库测序接头性能对于不同起始的基因组DNA均有很好的兼 容性。
表11
实施例6不同物种和样品种类起始
1、细胞培养
具体方法同实施例1。
2、基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3、甲基化测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行，测序接头序列如 表12所示，连接反应的储存液浓度为15μM，分别使用人源性、小鼠源性和 大鼠源性的样品来源，以及细胞来源和组织血液来源的样品进行测试。
表12
4、甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5、结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用C18 (18个连续的长碳链修饰)的测序接头，测序接头浓度为15μM，基因组DNA 的起始分别使用人源性细胞系、小鼠源细胞系和大鼠源血液样品，其构建的 甲基化测序文库均能达到质检要求，能够进行后续的上机测序，表明本方法 能够高效的实现测序接头连接并进行甲基化测序文库扩增。平衡成本和性能 指标，本专利设计的甲基化文库测序接头性能对于不同物种和样品来源的基 因组DNA均有很好的兼容性。
表13
实施例7RRBS文库测序数据分析
1、细胞培养
具体方法同实施例1。
2、基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3、甲基化测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行，测序接头序列如 表14所示，连接反应的储存液浓度为15μM，分别使用2000ng的人源和小 鼠源细胞系基因组DNA起始构建RRBS甲基化测序文库，最后上机测序并 对测序数据进行CpG岛和启动子区域覆盖度的分析，衡量测序接头在甲基化 测序中的应用情况及性能。
表14
4、甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5、结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用C18 (18个连续的长碳链修饰)的测序接头，测序接头浓度为15μM，基因组DNA 的起始分别使用2000ng的人源和小鼠源细胞基因组DNA构建RRBS甲基化 测序文库，其均能达到质检要求，能够进行后续的上机测序，表明本方法能 够高效的实现测序接头连接并进行甲基化测序文库扩增。同时，最后上机测 序并对测序数据进行CpG岛和启动子区域的覆盖率分析，从两个样品对应的 两种接头不同起始量的测序结果CpG岛和启动子区域的覆盖率显示覆盖度 相当，本发明设计的甲基化文库测序接头能够很好的实现甲基化基因检测的 功能，与NEB的商业接头相比，没有引入新的偏好，能够很好的得出甲基 化测序文库的检测结论，实现该测序接头在甲基化测序文库构建中的功能。
表15
实施例8环状结构的长短
1.细胞培养
具体方法同实施例1。
2.基因组DNA提取
具体方法同实施例1。
3.甲基化测序文库构建
具体方法同实施例1。
其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行，不同长碳链修饰 单元数的测序接头序列如表16所示，连接反应的储存液浓度为15μM。
表16
4.甲基化测序文库质检
具体方法同实施例1。
5.结果分析
甲基化测序文库质检结果显示，以NEB甲基化接头为阳性对照，使用环状 结构为19nt-修饰-20nt、10nt-修饰-10nt、10nt-修饰-20nt、19nt-修饰-10nt和5nt- 修饰-5nt的测序接头，其构建的甲基化测序文库均能达到质检要求，能够进行后 续的上机测序，表明本方法能够高效的实现测序接头连接并进行甲基化测序文 库扩增。同时，本方法设计的长碳链修饰的接头，随着单侧或者双侧的环状结 构的碱基减少，对应构建的甲基化测序文库浓度相当，平衡成本和性能指标， 以环状结构为19nt-修饰-20nt的测序接头性能最好。
表17
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用 以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含 于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.一种用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述接头序列的5’端用磷酸修饰，且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的GCTCTTCCGATC形成双链茎结构，其余碱基形成环状结构；3’端最后一个碱基为T，并以硫代修饰；同时，所述接头序列中的胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。
2.根据权利要求1所述用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构至少包含2个碱基，所述环状结构的中间还以C3～C21修饰。
3.根据权利要求2所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构上的碱基为39个。
4.根据权利要求2所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构的中间以1～3个C18修饰。
5.根据权利要求4所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构的中间以1个C18修饰。
6.根据权利要求5所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构由19个碱基+C18+20个碱基构成。
7.一种构建甲基化测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取样品的基因组DNA，进行DNA分子的打断；
S2、将打断的DNA分子进行末端修复和加A；
S3、在经过末端修复和加A的DNA分子两端加入权利要求1～4中任意一条权利要求所述的接头序列；
S4、对加入接头序列的DNA分子进行重亚硫酸盐转化，然后进行扩增，得到甲基化测序文库。
8.根据权利要求7所述的构建甲基化测序文库的方法，其特征在于，所述接头序列的浓度为5～20μM。
9.根据权利要求8所述的构建甲基化测序文库的方法，其特征在于，所述接头序列的浓度为15μM。
10.一种用于构建甲基化测序文库的接头试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～6中任意一条权利要求所述的接头序列。
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