CN104630206A - 转录组文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转录组文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对待测菌种中总RNA是否存在污染进行鉴定；S2，从未受污染的待测菌种的总RNA中去除rRNA，得到mRNA和非编码RNA；S3，对mRNA和非编码RNA进行转录组文库的构建，得到转录组文库。上述方法通过增加对总RNA进行质控的步骤，在确定RNA样品不存在污染的情况下，再进行后续的转录组文库构建步骤，避免了因RNA存在污染而造成的人力财力的浪费，也改善了后续的测序数据比对率低的问题。且该鉴定步骤所需样品量少，操作简单，获得结果快速且准确，还具有高通量的能力，可以广泛用于转录组文库构建步骤中待测菌种总RNA的鉴定。

Description

转录组文库的构建方法

技术领域

本发明涉及文库构建领域，具体而言，涉及一种转录组文库的构建方法。

背景技术

利用第二代高通量测序技术对待测生物样品的转录本(mRNA和非编码RNA)进行测序，能够全面快速地获取特定待测生物样品在特定状态下的所有转录本的信息。通过转录组测序研究可以揭示待测生物样品不同表现型形成的分子调控机制。

转录组建库时通常先去除总RNA中的rRNA(可以利用Ribo-zero试剂盒进行去除)，然后利用现有技术中的RNA文库构建试剂盒进行转录组文库的构建(比如采用NEBUltraDirectional RNA Library Prep Kit进行建库)，具体操作按试剂盒操作说明书进行。

然而，目前转录组文库构建方法往往会出现测序数据比对率(mapping率)低的问题。是通过测序完成后对文库测序数据进行核苷酸数据库(NT)比对来评估测序数据中的污染情况，即取10000条reads数据比对到NCBI核苷酸数据库(NT)，选取比对结果中的前5个同源比对，判定样本是否存在外源污染。这种文库构建方法和污染评估方法并不能改变其所构建的转录组文库测序数据比对率的状况，因此，仍需要对现有的转录组文库构建方法进行改进，以提高所构建的转录组文库后续得到的测序数据的比对率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种转录组文库的构建方法，以解决现有技术所构建的转录组文库后续得到的测序数据的比对率低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库的构建方法，该方法包括以下步骤：S1，对待测菌种中总RNA是否存在污染进行鉴定；S2，从未受污染的待测菌种的总RNA中去除rRNA，得到mRNA和非编码RNA；S3，对mRNA和非编码RNA进行转录组文库的构建，得到转录组文库。

进一步地，步骤S1中利用rRNA对待测菌种的总RNA是否存在污染进行鉴定。

进一步地，总RNA中的rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA。

进一步地，步骤S1包括以下步骤：S11，对待测菌种的总RNA进行反转录，得到cDNA；S12，以cDNA为模板，对待测菌种的rRNA进行扩增并测序，得到测序序列；S13，将测序序列与NCBI核苷酸数据库中的参考序列进行同源性比对，得到比对结果；S14，根据比对结果判断总RNA是否存在污染。

进一步地，rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA的全长序列。

进一步地，步骤S13中，比对结果为：(1)测序序列与至少前10条同源性高的参考序列来源于同一菌种，且菌种为目的菌种；或者(2)测序序列与至少前10条同源性高的参考序列来源于两种或两种以上的菌种。

进一步地，当比对结果为(1)时，步骤S14包括：根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若不存在，则判断总RNA不存在污染；当比对结果为(2)时，步骤S14包括：根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若存在，则判断总RNA存在污染。

进一步地，步骤S2采用Ribo-zero试剂盒从总RNA中去除rRNA。

进一步地，步骤S3包括以下步骤：S31，对mRNA和非编码RNA进行进行反转录，得到双链cDNA；S32，对双链cDNA依次进行末端修复、加A和连接头，得到带接头修复双链cDNA；S33，对带接头修复双链cDNA进行USER酶消化及PCR富集，得到转录组文库。

进一步地，在步骤S32之后以及步骤S33之前，还包括对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择的步骤，优选采用磁珠对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择。

应用本发明的技术方案，通过在利用待测物种的去除rRNA后的总RNA进行转录组文库构建之前，增加了对待测菌种的总RNA是否存在污染的鉴定步骤，通过增加对总RNA进行质控的步骤，在确定所欲构建转录组文库的RNA样品不存在污染的情况下，再进行后续的转录组文库构建步骤，避免了因RNA存在污染而对建库及后续测序工作造成的人力财力的浪费，也减少了对后续的测序数据进行分析而产生的不利影响。且该鉴定步骤所需样品量少，操作简单，在数小时之内即可获得结果，快速准确，同时具有高通量的能力，可以广泛用于转录组文库构建步骤中待测菌种总RNA污染情况的鉴定。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的一种典型实施方式中转录组文库构建方法的流程示意图；

图2示出了根据本发明的实施例中样品1和样品2中16S rRNA扩增片段的电泳检测结果图；

图3示出了根据本发明的实施例中样品1的16S rRNA扩增片段的测序峰图；

图4示出了根据本发明的实施例中样品2中16S rRNA扩增条带的测序峰图；以及

图5示出了根据本发明的实施例中总RNA鉴定是否存在污染之后的文库构建方法的详细流程图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

正如背景技术部分所提到的，现有技术中所构建的转录组文库测序后得到的测序数据的比对率较低，为了改善这一状况，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种转录组文库的构建方法，如图1所示，该方法包括以下步骤：S1，对待测菌种中总RNA是否存在污染进行鉴定；S2，从未受污染的待测菌种的总RNA中去除rRNA，得到mRNA和非编码RNA(non-coding RNA)；S3，对mRNA和非编码RNA进行转录组文库的构建，得到转录组文库。

本发明的上述转录组文库构建方法，通过在利用待测物种的去除rRNA后的总RNA进行转录组文库构建之前，增加了对待测菌种的总RNA是否存在污染的鉴定步骤，通过增加对总RNA进行质控的步骤，在确定所欲构建转录组文库的RNA样品不存在污染的情况下，再进行后续的转录组文库构建步骤，避免了因RNA存在污染而对建库及后续测序工作造成的人力财力的浪费，也减少了对后续的测序数据进行分析而产生的不利影响。且该鉴定步骤所需样品量少，操作简单，在数小时之内即可获得结果，快速准确，同时具有高通量的能力，可以广泛用于转录组文库构建步骤中待测菌种总RNA污染情况的鉴定。

本发明的上述方法中的步骤S1的目的是确定待测菌种的总RNA中是否存在污染，因而任何检测待测序菌种的总RNA是否存在污染的步骤或手段都适用于本发明。在本发明一种优选的实施例中，上述步骤S1中利用总RNA中的rRNA对待测菌种的总RNA是否存在污染进行鉴定。利用待测菌种中总RNA中的rRNA来检测是否存在污染，是利用了不同菌种来源的rRNA中存在一定的特异性序列，根据该特异性序列即可判断判断总RNA是否来源于同一菌种，进而可以判断该总RNA是否存在其他菌种污染。

在本发明的上述构建方法中，根据待测菌种的不同，可以利用的rRNA既可以是原核生物的16S rRNA，也可以是真核生物的18S rRNA或ITS序列的rRNA。这些rRNA序列中都存在菌种特异性的序列，因而可以很方便地鉴别菌种来源。

在本发明一种更优选的实施例中，上述步骤S1包括以下步骤：S11，对待测菌种的总RNA进行反转录，得到cDNA；S12，以cDNA为模板，对待测菌种的rRNA进行扩增并测序，得到测序序列；S13，将测序序列与NCBI核苷酸数据库中的参考序列进行同源性比对，得到比对结果；S14，根据比对结果判断总RNA是否存在污染。该步骤S1通过将反转录后的cDNA中扩增能够分辨菌种来源的rRNA的序列，将该rRNA测序后得到的序列与NCBI核酸数据库中已知物种的参考序列进行同源性比对，可以得到按照与该测序序列同源性由高到低的顺序排列的比对信息，然后根据该比对信息即可判断rRNA测序序列是否来源于同一菌种，且可以判断是否为目的菌种，进而可以判断该待测菌种的总RNA是否存在其他菌种的污染。

为了进一步提高菌株来源检测的准确性，在本发明另一种更优选的实施例中，上述rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA的全长序列，扩增上述rRNA的全长序列，能够使测序序列更全面地覆盖其rRNA较其他菌种的特异性区域，进而使得比对结果更准确。

在本发明的上述优选实施例的步骤S13中，将测序序列与NCBI核酸数据库GenBank中的参考序列进行比对的操作采用本领域的常规操作即可，因而得到的比对结果也是本领域技术人员所熟知的按照与参考序列同源性由高到底顺序排列的比对结果。根据测序序列的长度和与参考序列的同源性高的菌种的种类的多少，可以适当调整判断待测菌种的总RNA中是否存在污染的标准。

在本发明一种优选的实施例中，对上述rRNA扩增得到的片段，进行测序比对得到的比对结果为：(1)测序序列与至少前10条同源性高的参考序列来源于同一菌种，且菌种为目的菌种；或者(2)测序序列与至少前10条同源性高的参考序列来源于两种或两种以上的菌种。上述两种比对结果，能够准确地判断出rRNA的来源，进而能够判断出待测菌种总RNA中是否存在外源菌种的污染。

在上述比对结果已经能够判断出总RNA是否存在污染的情况下，为了使判断结果更准确，还可以利用上述rRNA的测序序列的测序峰图来进一步确认判断步骤。在保证扩增步骤不存在操作污染的情况下，当测序峰图中存在套峰现象时，表明测序样品中的测序序列的来源不唯一，因而出现多种不同碱基排列顺序的序列套叠在相同位置的现象。因此，在本发明一种优选的实施例中，当上述比对结果为(1)时，步骤S14包括：根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若不存在，则判断总RNA不存在污染；当比对结果为(2)时，步骤S14包括：根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若存在，则判断总RNA存在污染。该优选实施例能够对总RNA的判断地更准确。

在本发明的上述构建方法中，步骤S2是将总RNA中的rRNA进行去除的步骤，采用现有技术中常用的去除方法即可，也可以采用现有的试剂盒进行去除，如采用Ribo-zero试剂盒从总RNA中去除rRNA，采用该试剂盒去除rRNA快速且去除得相对更彻底。

在本发明的上述构建方法的步骤S3中，采用现有技术的步骤来进行文库构建即可。在本发明一种优选的实施例中，上述步骤S3包括以下步骤：S31，对去除rRNA的总RNA进行进行反转录，得到双链cDNA；S32，对双链cDNA依次进行末端修复、加A和连接头，得到带接头修复双链cDNA；S33，对带接头修复双链cDNA进行USER酶消化及PCR富集，得到转录组文库。该方法稳定性好、可重复性高。

在上述优选的实施例中，在步骤S32之后以及步骤S33之前，还包括对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择的步骤，优选采用磁珠对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择。通过对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择，使得所构建的文库中的片段大小适合测序，进而使得测序数据有效量提高。而采用磁珠对上述片段大小进行选择，操作简单，且选择性高，得到的目的大小片段的纯度高。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。

下列实施例中，如无特别说明，所有试剂均来自NEB。下列实施例是对客户提供的大肠杆菌(样品1)和盐单胞菌(样品2)两份RNA样品进行转录组文库的构建。在对这两份RNA样品是否存在污染进行鉴定之后，按照图5所示的文库构建流程进行构建，具体步骤如下：

一、总RNA样品的质控检测

1.采用下列20μl反应体系进行第一链cDNA的合成：

对上述20μl反应体系进行轻轻混匀，瞬时离心后置于25℃孵育5min，然后42℃孵育30min，即得到。

2.以第一链cDNA为模板，对16S rRNA基因进行PCR扩增：

a.检测16S rRNA基因引物序列为：

16s-F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’

16s-R：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

b.PCR扩增的反应体系为：

c.将上述30μlPCR扩增的反应体系轻轻混匀，瞬时离心后放入PCR仪内，按照下列程序运行PCR反应：

第一步：94℃预变性5min；

第二步：94℃变性10s，

第三步：65℃退火40s，

第四步：72℃延伸90s，

第五步：重复第二步至第四步30次；

第六步：72℃延伸5min，结束。

3.对上述PCR扩增产物进行Qubit定量：取1μl进行Qubit定量。

4.利用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳检测：

每管PCR产物取10μl点入上样孔，120V电压电泳30min，结束后，关闭电源，将电泳凝胶块放在凝胶成像仪中观察，拍照。

琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。在图2中，1表示阴性对照，2表示样品1，3表示样品2。从图2可以看出，样品1和样品2均在约1500bp处有明亮的PCR特异性条带，其分子量大小与目的菌株16S rDNA的理论值基本相符。

5.按DNA凝胶回收试剂盒操作说明进行目的片段回收，然后进行测序。

6.将测序得到的序列与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类是否为目的菌种，检测是否存在污染。

比对结果是，大肠杆菌来源的样品1的正向引物测序得到序列比对结果为：前10条同源性为96％的参考序列来源于大肠杆菌和芽孢杆菌属；可见该样品不纯，含芽孢杆菌属的RNA造成后续的转录组文库比对率低。将样品2双向测序得到的拼接序列进行同源序列比对，结果该样品前10条同源性为99％的参考序列来源于深海盐单胞菌，可见该样品为单一样品，不存在污染现象。

7.分析测序峰图是否有套峰现象，不纯的实验样品存在测序套峰，可以判定样品存在污染。

从图3中样品1的测序峰图来看，套峰现象严重，进一步说明样品1中存在外来菌种的污染。同时，从图4中样品2的测序峰图来看，测序峰图正常，不存在套峰现象，进一步说明该样品菌种来源单一，不存在污染。

二、质控合格样品先去除总RNA中的rRNA

1.采用Ribo-zero试剂盒去除rRNA

(1)在一个PCR管内，按照以下顺序加入：

(2)将上述体系混匀，瞬时离心，68℃孵育10min。

(3)移除反应管，室温放置10min。

2.微球反应以及rRNA的去除

(1)简短地混合振荡清洗好的磁珠，使其处于均匀的悬浮状态。

(2)用枪头吸取上述杂交的RNA样品，加入1.5ml管悬浮的微球中，迅速吹打10-15次，然后立即涡旋10s，放置于室温，可以处理下一个样品。

(3)室温孵育10min，期间每隔3～4min中速涡旋度5s。

(4)中速涡旋5s，50℃金属浴10min。

(5)立即将微球悬浮液转移到磁力架上，静置至少1min，仔细吸取含rRNA-去除的RNA的上清(85～90ul)，转移到新的1.5ml离心管中，再次置于磁力架上静止1min，收集上清液。

3.去除rRNA样品的纯化(乙醇沉淀法)

(1)使用无RNA酶水将每个样品统一调整到180μl。

(2)每个管中加入18μl的3M的醋酸钠(RNA专用)。

(3)每管加入2μl的糖原(10mg/ml)，轻微的涡旋混合。

(4)每管加入三倍体积的冰预冷的无水乙醇(600μl)，轻微的涡旋混合。

(5)在-20℃放置至少1个小时(或者-80℃放置30min以上)。

(6)>10,000g离心30min，小心吸取丢弃上清液。

(7)用预冷新鲜配置的70％乙醇，>10,000g离心5min，小心吸取丢弃上清液

(8)重复步骤7。

(9)简短离心去除管壁残留上清，小心吸取上清，置于室温，晾干RNA沉淀。

(10)用15μl 10mM tris-HCL溶解RNA沉淀。

(11)取0.5μl样品Qubit定量RNA浓度。

三、用Ultra Directional RNA Library Prep Kit建库(具体流程见图5)

为了便于比较，该实施例中对上述两个样品均进行了后续的文库构建步骤。

(一)RNA片段化

(1)取上述纯化的去除rRNA的mRNA和非编码RNA的混合物14μL，并向其中分别加入NEBNext第一链合成缓冲液(5X)4μl、随机引物1μl，总体积为19μl，将该混合物充分混匀后瞬时离心。

(2)置于94℃孵育15min。立刻放置冰上，得到片段化的RNA。

(二)第一链cDNA合成

(1)取上述片段化后的mRNA和非编码RNA 19μL，并向其中分别加入鼠源RNA酶抑制剂(Murine RNase Inhibitor)0.5μl、M-MμlV RNase H逆转录酶1μl，总计20.5μl；

(2)将上述混合物轻柔的充分混匀，瞬时离心。放入PCR仪内，进行以下程序：

反应结束后立刻置于冰上，得到第一链cDNA。

(三)第二链cDNA合成

(1)取上述第一链cDNA 20μL，并向其中分别加入无RNA酶水22.5μl、第二链合成反应缓冲液(Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dNTP Mix(dUTP 10X)5μl、第二链合成反应酶预混液(Second Strand Synthesis Enzyme Mix)2.5μl，总计50μl；

(2)将上述体系置于16℃孵育1h，得到双链cDNA。

(四)双链cDNA纯化

(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠；并室温孵育30min备用。

(2)按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入90μL(1.8X)重悬好的AMPure XP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步的双链cDNA加入准备好的AMPure XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

(3)如管壁上有液体可瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(4)加入200μL 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(5)重复步骤4一次。最后使用10μL枪头吸净离心管底部残留的液体。

(6)室温干燥5min让乙醇尽量挥发干净(干而不裂开)。

(7)加入58μL无RNA酶水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。准备PCR管，并将编号写好。用枪头小心吸取56μl上清液到准备好的PCR管内。

(五)末端修复和加腺苷酸A

(1)取上述纯化好的双链cDNA56μl，并向其中分别加入末端修复缓冲液(NEBNext EndRepair Reaction Buffer(10X))6.5μl、末端修复酶预混液(NEBNext End Prep Enzyme Mix)3μl，总计65μl；

(2)将上述65μl修复体系轻柔混匀。瞬时离心后置于PCR仪上进行下列反应程序：

第一步：20℃           30min

第二步：65℃           30min

第三步：4℃            结束；

反应结束后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。

(六)接头的连接

(1)反应体系：

(2)将上述体系轻柔混匀，瞬时离心后置于20℃反应15min，得到带接头的修复加A双链cDNA。

(七)片段选择加接头的DNA(磁珠选择大小后再等体积去除小片段)

(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。

(2)准备干净的1.5ml离心管，写好对应编号，加入16.5μL无RNA酶水(使上步反应终体积为100μL)，再加入57μL(0.6X)重悬的AMPure XP磁珠。

(3)将上述接头连接产物(83.5μl)加入上步准备好的1.5ml离心管中，枪头混匀，室温孵育5min。

(4)瞬时离心。置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取上清液到另一个干净的1.5ml离心管中(上清勿弃！)，12,000rpm离心3min后置于磁力架上。准备干净的离心管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离心管中(此步磁珠上吸的为大片段DNA，离心帮助去除磁珠，防止文库含大片段)。

(5)加入25μL(0.25X)重悬好的AMPure XP磁珠，并用枪头混匀。室温孵育5min。

(6)磁力架上静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠，此步上清含偏小的片段如接头等，磁珠上吸的为目标片段DNA)。

(7)加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(8)重复步骤7一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(9)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。

(10)加入52μL无RNA酶水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

(11)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μL涡旋混匀好的AMPure XP

磁珠。吸取上步50μL上清至对应AMPure XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。于磁力架上静置5min，小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(12)加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(13)重复步骤12一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(14)室温干燥5min让乙醇尽量挥发干净。

(15)加入22.5μL无RNA酶水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μl枪头小心吸取21μl上清至干净的PCR管内。

(16)取1μl进行Qubit定量。将浓度低于0.2ng/μl的标注。用后的Qubit管置于黑暗处备用。

(八)USER酶消化和PCR富集

(1)在上述产物中加入：

(2)轻柔混匀，加index时先在记录本中写下样品对应的index号，加时一人加，一人check，并将人员记录。然后置于PCR仪上进行下列反应：

*注：当第八步后经Qubit检测浓度低于0.2ng/μl的，扩增循环增至11或12个或15个，记录下不同样品的扩增循环数(扩增过程中注意样品间的平行关系，一般这样的样品扩增循环数保持一致)。

(九)PCR产物纯化(等体积纯化两次)

(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。

(2)按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入50μL(等体积)重悬好的AMPureXP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

(3)置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(4)加入200μL80％乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(5)重复步骤4一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(6)敞开盖子5min让乙醇尽量挥发干净，直至磁珠干燥。

(7)加入52μL无RNA酶水，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

(8)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μL涡旋混匀好的AMPure XP磁珠。吸取上步50μL上清至对应AMPure XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静置5min；于磁力架上小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(9)加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(10)重复步骤9一次，最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(11)室温干燥5min让乙醇尽量挥发干净。

(12)加入22.5μL无RNA酶水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL枪头小心吸取21μl上清至干净的离心管内；当第八步的Qubit浓度低于0.2ng/μl的，最后文库溶于12μl无RNA酶水中，吸出10μl上清至干净的离心管内。

(13)取1μl进行Qubit定量。记下文库浓度，写上文库编号。准备干净的0.5ml离心管，写好对应文库编号，取1μl文库按照Qubit浓度稀释至1.5-2ng/μl，交至上机组做库检。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：基于16SrDNA全长特异性扩增和测序方法，增加了RNA样品质控过程，利用GenBank数据库比对可准确鉴定细菌的种属特性，进而检测RNA样品是否存在污染，通过鉴定增加对总RNA进行质控的步骤，使得所构建的文库测序所得的数据的比对率大大提高，所构建的文库的比对率率均高于90％。

由此可见，通过利用16SrDNA两端的引物PCR扩增菌株的16SrRNA基因，并进行测序，然后与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类是否为目的菌种，检测是否存在污染，对RNA样品进行质控检测，无污染样品进行后续建库，可以有效避免因样品污染导致的测序数据比对率低的问题。该方法具有良好的再现性、准确性。而且，在构建文库之前对RNA样品进行检测，是否存在污染，减少因样品污染对建库测序工作造成的人力财力巨大浪费和不必要的麻烦，及对后续的各种数据分析工作产生的影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种转录组文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

S1，对待测菌种中总RNA是否存在污染进行鉴定；

S2，从未受污染的待测菌种的所述总RNA中去除rRNA，得到mRNA和非编码RNA；以及

S3，对所述mRNA和非编码RNA进行转录组文库的构建，得到所述转录组文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S1中，利用rRNA对待测菌种中的所述总RNA是否存在污染进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述总RNA中的所述rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA。

4.根据权利要求2或3中所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：

S11，对所述待测菌种的总RNA进行反转录，得到cDNA；

S12，以所述cDNA为模板，对所述待测菌种的所述rRNA进行扩增并测序，得到测序序列；

S13，将所述测序序列与NCBI核苷酸数据库中的参考序列进行同源性比对，得到比对结果；以及

S14，根据所述比对结果判断所述总RNA是否存在污染。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述rRNA为16S rRNA、18S rRNA或ITS rRNA的全长序列。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S13中，所述比对结果为：

(1)所述测序序列与至少前10条同源性高的所述参考序列来源于同一菌种，且所述菌种为目的菌种；或者

(2)所述测序序列与至少前10条同源性高的所述参考序列来源于两种或两种以上的菌种。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，

当所述比对结果为(1)时，所述步骤S14包括：

根据所述比对结果，查看所述测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若不存在，则判断所述总RNA不存在污染；

当所述比对结果为(2)时，所述步骤S14包括：

根据所述比对结果，查看所述测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若存在，则判断所述总RNA存在污染。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2采用Ribo-zero试剂盒从所述总RNA中去除所述rRNA。

9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：

S31，对所述mRNA和非编码RNA进行反转录，得到双链cDNA；

S32，对所述双链cDNA依次进行末端修复、加A和连接头，得到带接头修复双链cDNA；

S33，对所述带接头修复双链cDNA进行USER酶消化及PCR富集，得到所述转录组文库。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S32之后以及所述步骤S33之前，还包括对所述带接头修复双链cDNA进行片段大小选择的步骤，优选采用磁珠对所述带接头修复双链cDNA进行片段大小选择。