CN106567133A - 一种宏转录组文库的建库方法 - Google Patents
一种宏转录组文库的建库方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106567133A CN106567133A CN201610984532.2A CN201610984532A CN106567133A CN 106567133 A CN106567133 A CN 106567133A CN 201610984532 A CN201610984532 A CN 201610984532A CN 106567133 A CN106567133 A CN 106567133A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- room temperature
- pipe
- pcr
- added
- add
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，在RNA提取完成后，先用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA，mRNA产物在‑80℃保存以备后用，且将没有被Oligo(dT)的磁珠富集的其他RNA样品依次完成真核生物rRNA的去除和原核生物rRNA的去除，剩余产物‑80℃保存以备后用。将两次富集放入产物混合、纯化以及加入随机引物片段化，第一链的mix以及逆转录酶的共同作用下合成第一链(cDNA链)，然后加入第二链合成mix的完成第二链合成，再在3’加poly(A)，连接接头，进行PCR扩增，再进行凝胶片段选择，最后需要对文库进行检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种基于illumina测序平台的RNA建库方法，具体来说涉及一种宏转录文库的建库方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展，转录组测序已经成为研究基因表达调控的主要手段。在整体水平上研究某一特定环境，特定时期群体生命全部基因组转录情况以及转录调控规律，以生态环境中的全部RNA为研究对象的研究简称宏转录组(metatranscriptomics)。宏转录组避开未培养微生物的分离培养问题，能有效地扩展微生物资源的利用空间。宏基因组测序是基于DNA水平，而宏转录组是基于RNA水平也就是转录层面。对于研究基因调控的科学家来说，转录水平往往能够更直观地了解整个微生物群落内不同种群基因的表达水平。
2006年，Leininger等首次使用454测序技术对一个复杂微生物群落的宏转录组进行研究。与宏基因组学相比较，宏转录组学能从转录水平研究复杂微生物群落变化，能更好地挖掘潜在的新基因。
宏转录组学研究方法中有两个问题是比较关键：群体RNA的处理及数据的比较分析。转录组(transcriptome)广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA，狭义上指所有mRNA的集合。宏转录组中因为RNA的物种多样性，需要对其进行多次实验，去除冗余的核糖体RNA，才能得到我们需要的RNA产物，过程比较复杂。
发明内容
本发明的目的是针对现有宏转录文库建库所存在的诸多问题而提供一种过程简单的宏转录文库的建库方法。该方法主要是在总RNA中mRNA的富集。 将总RNA进行了三次处理，分别富集真核生物的mRNA和原核生物的mRNA，将其RNA混合、纯化、片段化后进行转录组文库的构建。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：
一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，在RNA提取完成后，先用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA，mRNA产物在-80℃保存以备后用，且将没有被Oligo(dT)的磁珠富集的其他RNA样品依次完成真核生物rRNA的去除和原核生物rRNA的去除，剩余产物-80℃保存以备后用。将两次富集放入产物混合、纯化以及加入随机引物片段化，第一链的mix以及逆转录酶的共同作用下合成第一链(cDNA链)，然后加入第二链合成mix的完成第二链合成，再在3’加poly(A)，连接接头，进行PCR扩增，再进行凝胶片段选择，最后需要对文库进行检测，具体包括如下步骤：(1)真核mRNA纯化步骤；(2)真核生物rRNA去除步骤；(3)原核生物rRNA去除步骤；(4)所用RNA富集以及RNA的片段化步骤；(5)第一链合成步骤；(6)第二链合成步骤；(7)加A、加接头步骤；(8)磁珠片段选择步骤；(9)PCR扩增以及片段选择步骤；(10)文库质检步骤。
在本发明的一个优选实施例中，所述真核mRNA纯化步骤，包括如下步骤：
(1.1)准备0.3mLPCR管用RNase-free水稀释RNA样品到终体积为50uL；
(1.2)蜗旋震荡RNA Purification Beads使充分混匀；
(1.3)向稀释好的RNA样品中加入25ul RNA Purification Beads,用移液器轻轻吸打10次使之充分混匀；
(1.4)放到PCR仪按预设好的程序(65℃5min,4℃hold)进行孵育；
(1.5)当PCR仪温度降到4℃，取出PCR管室温静置5min；
(1.6)室温静置于磁力架上5min或直到溶液变澄清，将上清转移到新的无酶离心管中，放置冰上备用；
(1.7)将PCR管从磁力架上取下，加100uLBead Washing Buffer用移液器上下吸打10次，使充分混匀；
(1.8)室温静置磁力架上5min或直到溶液变澄清，小心吸取上清并弃掉
将PCR管从磁力架上取下，加16.5uLElution Buffer用移液器上下吸打10次，使充分混匀；
(1.9)室温放置2min，随后置于磁力架上5min或直到溶液变澄清，小心吸取上15ul至新的离心管中，-80度冰箱保存备用。
在本发明的一个优选实施例中，所述真核生物rRNA去除步骤，包括如下步骤：
(2.1)从冰箱中拿出分装好的AgencourtRNAClean XP beads，室温放置30min；
(2.2)从冰上取出步骤(1.6)中的上清，加入1.8X the Agencourt RNA Clean XPbeads，用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置5-10min；
(2.3)将PCR管放置在磁力架上，待澄清后吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(2.4)加入200ul 70％无酶水配制的乙醇，室温放置30s，吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(2.5)重复步骤(2.5)一次；
(2.6)吸干净残留的乙醇后，室温放置3-5min，待晾干后加入32ulTE，做RNA用；
(2.7)使用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置2min，随后置于磁力架上直到溶液变澄清，小心吸取30ul到新的无酶1.5ml离心管中；
(2.8)吸取300ul binding buffer到上一步的1.5ml离心管中，震荡混匀，短暂离心；
(2.9)每5ug RNA加入2ul的Capture Oligo Mix，震荡混匀，短暂离心；
(2.10)将混合物放置70度水浴中，10min；
(2.11)随后37度水浴孵育1h；
(2.12)孵育期间准备磁珠：
(2.12.1)从装有磁珠的管子里吸出25u磁珠(每5ug RNA需要25ul磁珠)，放置在磁力架上吸附，待溶液澄清后吸弃上清
(2.12.2)加入25ul的无酶水，吸打混匀后，短暂离心；
(2.12.3)将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后吸弃上清
(2.12.4)往离心管中加入等体积的binding buffer，吹打混匀后，放置在室温备用；
(2.13)在步骤(2.12)结束前将清洗过的磁珠放置在磁力架上，待澄清后将上清弃掉，加入37度孵育后的混合物，吹打混匀，短暂离心；
(2.14)37度孵育15min；
(2.15)孵育完毕后，将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清到新的离心管中；
(2.16)加入100ul wash solution(预热到37度)到磁珠中，吸打混匀后，放置在37度，5min；
(2.17)孵育完后，将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清到步骤(2.15)的新离心管中，二者合并总体积为400-470ul；
(2.18)加入1/10体积的3M Sodium Acetate 40–47μL和4μL 5mg/mL Glycogen；
(2.19)加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，震荡混匀，置于-20度冰箱中1h；
(2.20)12000rpm，离心30min
(2.21)加入750ul 70％的无水乙醇，10000rpm，离心5min；
(2.22)重复步骤(2.21)一次；
(2.23)待乙醇挥发干净，加入28ul无酶水溶解沉淀。
在本发明的一个优选实施例中，所述原核生物rRNA去除步骤，包括如下步骤：
(3.1)磁珠清洗步骤；
(3.2)rRNA Removal Solution处理样品步骤；
(3.3)rRNA移除步骤；
(3.4)纯化处理RNA步骤。
在本发明的一个优选实施例中，所述磁珠清洗步骤分为单独每管清洗或批量清洗磁珠步骤，其中：
所述单独每管清洗步骤，包括如下步骤：
(3.1.1)在涡旋器上剧烈震荡混匀磁珠；
(3.1.2)对于每一个反应，轻轻的吸出225ul磁珠加入无酶管中，避免产生气泡；
(3.1.3)保持管盖打开，将无酶管放置在磁力架上，静置至少1分钟，直到溶液变得澄清为止；
(3.1.4)用移液器轻轻的将上清液吸出；
(3.1.5)从磁力架上取出无酶管，加入225ul的无酶水，彻底的悬浮磁珠；
(3.1.6)重复步骤(3.1.3)至步骤(3.1.4)；
(3.1.7)再用无酶水重新清洗一次，吸弃上清；
(3.1.8)从磁力架上取下无酶管，加入65ulMagneticBeadResuspensionSolution，震荡混匀；
(3.1.9)加入1ulRiboGuardRNaseInhibitor到每一个管中，用移液器吹打10-15次混匀，避免产生气泡，室温放置。
所述批量清洗磁珠步骤，包括如下步骤：
每个反应需要225ul的磁珠，1.5ml的无酶管每次至多加入1350ul的磁珠；
所述步骤同步骤(3.1.1)至步骤(3.1.9)。
在本发明的一个优选实施例中，所述rRNA Removal Solution处理样品步骤，包括如下步骤：
该步骤中，当total RNA总量在1-2.5ug时，且总RNA最大体积为28ul，加入8ulRibo-Zero rRNA Removal Solution；当total RNA总量在2.5-5ug时，且总RNA最大体积为26ul，加入10ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution；
(3.2.1)从-80℃拿出试剂盒，并平衡到室温；
(3.2.2)对于每一个反应，按下表给出的用量依次加入:4ul Ribo-Zero ReactionBuffer,26or 28ul RNA sample,8-10ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution,补无酶水至40ul；
(3.2.3)吹吸10-15次混匀，68℃孵育10分钟；
(3.2.4)待温育过后，立即进行离心收集管壁上的冷凝；
(3.2.5)室温放置5分钟。
在本发明的一个优选实施例中，所述rRNA移除步骤，包括如下步骤：
(3.3.1)转移探针-RNA杂交样品到清洗过的磁珠中，不用更换枪头立即吹吸10-15次混匀,加样体积为；40ulProbe-hybridized RNA sample加上65ul Washer roomtemperature Magnetic Beads；
(3.3.2)盖上管盖，高速涡旋最少10s，避免将溶液涡旋到管盖上；
(3.3.3)室温放置5分钟；
(3.3.4)50℃放置5分钟；
(3.3.5)立即放置在磁力架上至少1分钟直到溶液澄清；
(3.3.6)小心的吸出上清(约85-90ul)转移到新的无酶管中；
(3.3.7)将无酶管放置在冰上，上清液可以在-20℃中放置过夜或者在-65℃到-80℃中放置更长时间。
在本发明的一个优选实施例中，所述纯化处理RNA步骤，包括如下步骤：
(3.4.1)用无酶水将溶液体积补充到180ul；
(3.4.2)加入18ul 3M醋酸钠到每管中；
(3.4.3)加入2ul糖原(10mg/ml)，震荡混匀；
(3.4.4)加入3倍体积冰冻的无水乙醇(600ul)，混匀；
(3.4.5)-20℃沉淀至少1小时；
(3.4.6)>10000xg，4℃离心30分钟，弃上清
(3.4.7)使用1ml冰冻的70％乙醇清洗，>10000xg，4℃离心5分钟；
(3.4.8)重复步骤(3.4.7)；
(3.4.9)弃上清，短暂离心后，用移液器轻轻的吸出剩余的液体；
(3.4.10)加入15ul的无酶水溶解，-80℃保存。
在本发明的一个优选实施例中，所述RNA富集后混样纯化以及片段化步骤，包括如下步骤：
(4.1)将真核mRNA和原核mRNA(各15ul)混合，加入1.8X the AgencourtRNACleanXP beads，用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置5-10min；
(4.2)将PCR管放置在磁力架上，待澄清后吸弃上清，注意不要吸到磁 珠；
(4.3)加入200ul 70％乙醇(无酶水配制)，室温放置30s，吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(4.4)重复步骤(4.3)一次；
(4.5)吸干净残留的乙醇后，室温放置3-5min(不要放置时间太长，否则磁珠太干会严重影响RNA回收效率，待晾干后加入10.5ul FPF Mix；
(4.6)使用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置2min，随后置于磁力架上直到溶液变澄清，小心吸取8.5ul到新的无酶PCR管中。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一链合成步骤是加入4μl Strand MasterMix和Superscript iii，混合液震荡混匀，短暂离心后，按以下条件设置PCR仪并进行反转录：25℃，10min；42℃，50min；85℃，15min4℃，Hold。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二链合成步骤，包括如下步骤：
(6.1)加入10μl Second Strand Master Mix；
(6.2)加入2.5ul Resuspension Buffer，震荡混匀，短暂离心。
(6.3)按如下条件设置PCR仪：
16℃，60min；4℃，Hold；
(6.4)合成完成后进行AMPure XP Beads纯化：
(6.5)震荡AMPure XP Beads至完全混匀，加45μl珠子至二链合成的PCR管中，2*250bp加25μl；
(6.6)调枪至60μl，轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(6.7)室温孵育min；
(6.8)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(6.9)调枪至67μl，转移67μl上清液，弃掉；不能碰到珠子，如有多个样品，要更换枪头，保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(6.10)加入200μl 80％乙醇，不能碰到珠子，保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(6.11)室温孵育30S，弃掉废液，不能碰到珠子，如有多个样品，要更换枪头；
(6.12)重复(6.6)至(6.7)步骤一次；
(6.13)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架；
(6.14)加入11μl Resuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(6.15)盖上PCR管盖，室温孵育2min；
(6.16)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(6.17)转移8.75μl上清至新PCR管，如有多个样品，要更换枪头。
在本发明的一个优选实施例中，所述加A、加接头步骤，包括如下步骤：
(7.1)3＇端加A步骤；
(7.2)接头连接步骤。
在本发明的一个优选实施例中，所述(7.1)3＇端加A步骤包括如下步骤：
(7.1.1)加6.25μl A-Tailing Mix。(如有多个样品，要更换枪头)震荡混匀，短暂离心。
(7.1.2)将PCR管放入PCR仪中，盖紧热盖：37℃，30min；70℃，5min；4℃，5min；4℃，Hold；
(7.1.3)孵育结束后立刻将PCR管从PCR仪中取出，立刻进行下一步操作。
在本发明的一个优选实施例中，所述(7.2)接头连接包括如下步骤：
(7.2.1)短暂震荡离心解冻后的DNA Adapter Index，Ligase Control,StopLigation Buffer。
(7.2.2)加1.25μl Resuspension Buffer到含有加A后产物，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.3)加1.25μl Ligation Mix到各个管中，如有多个样品，要更换枪头，将Ligation Mix立刻放到-20℃冰箱中；
(7.2.4)加1.25μl DNA Adapter Index到各个管中，震荡混匀，短暂离心；
(7.2.5)设置PCR仪：
30℃，10min；4℃，Hold；
(7.2.6)孵育结束后将含样品的PCR管从PCR仪中拿出；
(7.2.7)加入2.5μl Stop Ligation Buffer，如有多个样品，要更换枪头)震荡混匀，短暂离心；
(7.2.8)接头连接完成后进行AMPure XP Beads纯化：
(7.2.9)震荡AMPure XP Beads至完全混匀，加28.5μl Resuspension Buffer，至mix总体积到50μl。
(7.2.10)加50μl珠子至接头连接产物的PCR管中。
(7.2.11)调枪至90μl，轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.12)室温孵育5min；
(7.2.13)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(7.2.14)调枪至97μl，转移97μl上清液，弃掉，不能碰到珠子；如有多个样品，要更换枪头，保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(7.2.15)加入200μl 80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(7.2.16)室温孵育30S，弃掉废液；不能碰到珠子，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.17)重复步骤(7.2.15)和步骤(7.2.16)一次；
(7.2.18)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架；
(7.2.19)加入52.5μlResuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.20)盖上PCR管盖，室温孵育2min；
(7.2.21)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；转移50μl上清至新PCR管，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.22)震荡AMPure XP Beads至完全混匀；
(7.2.23)加50μl珠子至第一次珠子纯化产物的PCR管中做二次珠子纯化；
(7.2.24)调枪至90μl，轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换 枪头)；
(7.2.25)室温孵育5min；
(7.2.26)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(7.2.27)调枪至97μl，转移97μl上清液，弃掉；不能碰到珠子；如有多个样品，要更换枪头；保持PCR管在磁力架上不要掉落。
(7.2.28)加入200μl80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(7.2.29)室温孵育30S，弃掉废液，不能碰到珠子；如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.30)步骤(7.2.28)和步骤(7.2.29)一次；
(7.2.31)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架；
(7.2.31)加入12.5μlResuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀；如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.32)盖上PCR管盖，室温孵育2min；
(7.2.33)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(7.2.34)转移10μl上清至新PCR管；如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.35)样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR扩增以及片段选择步骤，包括如下步骤：
(9.1)加入2.5μl PCR Primer Cocktail到含有接头连接产物的PCR管中；
(9.2)加入12.5μl PCR Master Mix到含有接头连接产物的PCR管中。震荡混匀，短暂离心；
(9.3)盖紧管盖，放入PCR仪，设定下面的程序：
98℃ for 30seconds
15 cycles of:
98℃ for 10seconds
60℃ for 30seconds
72℃ for 30seconds
72℃ for 5minutes
Hold at 4℃
(9.4)样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤；
(9.5)准备：2％琼脂糖凝胶(含EB)，100bp DNA ladder，6×loding buffer，
1.7ml EP管，爱思进凝胶纯化试剂盒；
(9.6)加入5μl 6×loding buffer到含有接头连接产物的PCR管中，震荡混匀；
(9.7)将电泳仪槽中加入新鲜1×TAE Buffer，放入2％含EB的琼脂糖凝胶；
(9.8)将30μl样品加入凝胶点样孔中；
(9.9)点入10μl 100bp DNA ladder；
(8.8)120V电泳60min；
(9.10)电泳结束后，在凝胶成像系统下拍照，保存至项目文件夹中；
(9.11)在紫外灯下切胶，选择300bp～400bp的片段范围，转移胶块至新的1.7mlEP管中，称取重量；
(9.12)用爱思进凝胶纯化试剂盒纯化含有样品的胶块：
(8.13)加入胶块重量3倍体积的DE A溶液(100mg：100μl)，置70℃干式加热器中融化胶块；
(9.14)加入DEA溶液1.5倍体积的DE B溶液，混匀后转入过滤柱，放置新的2ml收集管上，每次不超过700μl；
(9.15)12000rpm离心1min，弃去收集管中废液，重复步骤(9.2)至步骤(9.3)至所有溶液完全过柱为止；
(9.16)加入500μl W1溶液至柱子中，12000rpm离心1min，弃去废液；
(9.17)加入700μl W2溶液至柱子中，12000rpm离心1min。弃去废液。
(9.18)重复步骤(9.13)一次；
(9.19)将柱子置离心机中12000rpm离心2min；
(9.20)将柱子放在新的1.7ml EP管中，打开柱子管盖，室温晾干3min；
(9.21)加入25μl Elute溶液，盖紧管盖，室温孵育2min；
(9.22)12000rpm离心2min，去掉柱子，盖紧1.7ml EP管盖；
(9.23)样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
在本发明的一个优选实施例中，所述文库质检步骤，包括如下步骤：
(10.1)凝胶电泳检测：将待建库文库放置在冰盒上解冻，完全融解后短暂震荡离心；取3μl样品加1μl 6×loding buffer，用枪吸打混匀；调枪至4μl，吸取全部样品加入1％琼脂糖胶胶孔中，点3μl 100bp Maker；120V电泳25分钟；电泳结束后，将胶块放入凝胶成像系统中拍照。
(10.2)文库浓度检测：取1μl文库样品，稀释30倍，取30μl稀释后样品，加入等体积稀释后PicoGreen荧光染料，短暂震荡离心后转移50μl混合溶液至TBS380定量管中，用手轻甩两下，放入TBS380，按下Read键,记下读数，代入标曲，计算文库浓度。
本发明是通过三种不同的方法提取了微生物的mRNA产物，再将所得RNA纯化，用改进后truseq系列链特异性的RNA建库试剂盒构建转录组文库，最后在Nextseq500测序仪上测序。通过三种不同处理方法，能得到足够的能分析微生物的RNA产物，能更好更直观更全面地了解整个微生物群落内不同种群基因的表达水平。
附图说明
图1为本发明PCR产物电泳图。
图2为本发明片段选择后胶图。
图3为本发明文库电泳图。
具体实施方式
本发明公开的一种宏转录文库的建库方法，其在RNA提取完成后，先用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA，mRNA产物在-80℃保存以备后用，且将没有被Oligo(dT)的磁珠富集的其他RNA样品依次完成真核生物rRNA的去除和原核生物rRNA的去除，剩余产物-80℃保存以备后用。将两次富集 放入产物混合、纯化以及加入随机引物片段化，第一链的mix以及逆转录酶的共同作用下合成第一链(cDNA链)，然后加入第二链合成mix的完成第二链合成，再在3’加poly(A)，连接接头，进行PCR扩增，再进行凝胶片段选择，最后需要对文库进行检测，具体包括如下步骤：(1)真核mRNA纯化步骤；(2)真核生物rRNA去除步骤；(3)原核生物rRNA去除步骤；(4)所用RNA富集以及RNA的片段化步骤；(5)第一链合成步骤；(6)第二链合成步骤；(7)加A、加接头步骤；(8)磁珠片段选择步骤；(9)PCR扩增以及片段选择步骤；(10)文库质检步骤。
一、真核生物mRNA获取
1.准备0.3mLPCR管用RNase-free水稀释RNA样品到终体积为50uL(共5ug)。
2.蜗旋震荡RNA Purification Beads使充分混匀。
3.向稀释好的RNA样品中加入25ul RNA Purification Beads,用移液器轻轻吸打10次使之充分混匀；
4.放到PCR仪按预设好的程序(65℃5min,4℃hold)进行孵育。
5.当PCR仪温度降到4℃，取出PCR管室温静置5min.
6.室温静置于磁力架上5min或直到溶液变澄清，将上清转移到新的无酶离心管中，放置冰上备用。
7.将PCR管从磁力架上取下，加100uLBead Washing Buffer用移液器上下吸打10次，使充分混匀。
8.室温静置磁力架上5min或直到溶液变澄清，小心吸取上清并弃掉。
9.将PCR管从磁力架上取下，加16.5uLElution Buffer用移液器上下吸打10次，使充分混匀。
10.室温放置2min，随后置于磁力架上5min或直到溶液变澄清，小心吸取上15ul至新的离心管中，-80度冰箱保存备用。
二、真核生物rRNA去除(MICROBEnrich kit)
1.从冰箱中拿出分装好的AgencourtRNAClean XP beads，室温放置30min。从冰上取出步骤一6中的上清，加入1.8X the Agencourt RNA Clean XP beads，用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置5-10min；
2.将PCR管放置在磁力架上，待澄清后吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
3.加入200ul 70％乙醇(无酶水配制)，室温放置30s，吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
4.重复清洗一次；
5.吸干净残留的乙醇后，室温放置3-5min(不要放置时间太长，否则磁珠太干会严重影响RNA回收效率)，待晾干后加入32ulTE(RNA用)。
6.使用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置2min，随后置于磁力架上直到溶液变澄清，小心吸取30ul到新的无酶1.5ml离心管中。
7.吸取300ul binding buffer到上一步的1.5ml离心管中，震荡混匀，短暂离心。
8.每5ug RNA加入2ul的Capture Oligo Mix，震荡混匀，短暂离心。
9.将混合物放置70度水浴中，10min。
10.随后37度水浴孵育1h。
11.孵育期间准备磁珠：
11.1从装有磁珠的管子里吸出25u磁珠(每5ug RNA需要25ul磁珠)，放置在磁力架上吸附，待溶液澄清后吸弃上清
11.2加入25ul的无酶水，吸打混匀后，短暂离心
11.3将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后吸弃上清
11.4往离心管中加入等体积的binding buffer，吹打混匀后，放置在室温备用
12.在步骤10结束前将清洗过的磁珠放置在磁力架上，待澄清后将上清弃掉，加入37度孵育后的混合物，吹打混匀，短暂离心
13. 37度孵育15min
14.孵育完毕后，将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清到新的离心管中
15.加入100ul wash solution(预热到37度)到磁珠中，吸打混匀后，放置在37度，5min
16.孵育完后，将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清到步骤14的新离心管中(二者合并总体积约400-470ul)
17.加入1/10体积的3M Sodium Acetate(40–47μL)和4μL Glycogen(5mg/mL)
18.加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，震荡混匀，置于-20度冰箱中1h
19.12000rpm，离心30min
20.加入750ul 70％的无水乙醇，10000rpm，离心5min
21.重复清洗一次
22.待乙醇挥发干净，加入28ul无酶水溶解沉淀
三、原核生物rRNA去除
第一步：磁珠清洗
(重要：不要冷冻或把磁珠放置在冰上，否则会影响rRNA去除效率！)
1A.单独每管清洗
1A.1在涡旋器上剧烈震荡混匀磁珠；
1A.2对于每一个反应，轻轻的吸出225ul磁珠加入无酶管中，避免产生气泡；
1A.3保持管盖打开，将无酶管放置在磁力架上，静置至少1分钟，直到溶液变得澄清为止；
1A.4用移液器轻轻的将上清液吸出；
1A.5从磁力架上取出无酶管，加入225ul的无酶水，彻底的悬浮磁珠；
1A.6重复步骤1A.3-1A.4；
1A.7再用无酶水重新清洗一次，吸弃上清；
1A.8从磁力架上取下无酶管，加入65ulMagneticBeadResuspension Solution，震荡混匀；
1A.9加入1ulRiboGuardRNaseInhibitor到每一个管中，用移液器吹打10-15次混匀，避免产生气泡，室温放置。
1B.批量清洗磁珠
每个反应需要225ul的磁珠，1.5ml的无酶管每次至多加入1350ul的磁珠(6个反应用量)。
清洗步骤同上。
第二步：rRNA Removal Solution处理样品
(重要：在这一步，rRNA Removal Solution(探针)会杂交到样品的rRNA上，一定要保证样品被DNase处理过，且RNA一定要经过纯化！)
样品和各试剂的用量按下依次加入：
当total RNA总量在1-2.5ug时，且总RNA最大体积为28ul，加入8ul Ribo-ZerorRNA Removal Solution；当total RNA总量在2.5-5ug时，且总RNA最大体积为26ul，加入10ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution.
2.1从-80℃拿出试剂盒，并平衡到室温；
2.2对于每一个反应，按下表给出的用量依次加入:4ul Ribo-Zero ReactionBuffer,26or 28ul RNA sample,8-10ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution,补无酶水至40ul。
2.3吹吸10-15次混匀，68℃孵育10分钟；
2.4待温育过后，立即进行离心收集管壁上的冷凝；
2.5室温放置5分钟。
第三步：rRNA移除
3.1转移探针-RNA杂交样品到清洗过的磁珠中，不用更换枪头立即吹吸10-15次混匀,加样体积为；40ulProbe-hybridized RNA sample加上65ul Washer room temperatureMagnetic Beads.
3.2盖上管盖，高速涡旋最少10s，避免将溶液涡旋到管盖上；
3.3室温放置5分钟；
3.4 50℃放置5分钟；
3.5立即放置在磁力架上至少1分钟直到溶液澄清；
3.6小心的吸出上清(约85-90ul)转移到新的无酶管中；
3.7将无酶管放置在冰上(上清液可以在-20℃中放置过夜或者在-65℃到-80℃中放置更长时间)。
第四步：纯化处理过的RNA(乙醇沉淀的方法)
4.1用无酶水将溶液体积补充到180ul；
4.2加入18ul 3M醋酸钠到每管中；
4.3加入2ul糖原(10mg/ml)，震荡混匀；
4.4加入3倍体积冰冻的无水乙醇(600ul)，混匀；
4.5-20℃沉淀至少1小时；
4.6>10000xg，4℃离心30分钟，弃上清
4.7使用1ml冰冻的70％乙醇清洗，>10000xg，4℃离心5分钟；
4.8重复步骤4.7；
4.9弃上清，短暂离心后，用移液器轻轻的吸出剩余的液体；
4.10加入15ul的无酶水溶解，-80℃保存。
四、RNA富集后混样纯化以及片段化
1.将真核mRNA和原核mRNA(各15ul)混合，加入1.8X the AgencourtRNAClean XPbeads，用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置5-10min；
2.将PCR管放置在磁力架上，待澄清后吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
3.加入200ul 70％乙醇(无酶水配制)，室温放置30s，吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
4.重复清洗一次；
5.吸干净残留的乙醇后，室温放置3-5min(不要放置时间太长，否则磁珠太干会严重影响RNA回收效率)，待晾干后加入10.5ul FPF Mix。
6.使用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置2min，随后置于磁力架上直到溶液变澄清，小心吸取8.5ul到新的无酶PCR管中。
五、第一条cDNA合成
1.加入4μl Strand Master Mix和Superscript iii(不同的酶要设置不同延长温度)混合液震荡混匀，短暂离心。
2.按以下程序设置PCR仪并进行反转录：
25℃ 10min
42℃ 50min
85℃ 15min
4℃ Hold。
第二条cDNA合成
1.加入10μl Second Strand Master Mix。
2.加入2.5ul Resuspension Buffer，震荡混匀，短暂离心。
3.设置PCR仪：
16℃ 60min
4℃ Hold
4.合成完成后进行AMPure XP Beads纯化：
5.震荡AMPure XP Beads至完全混匀，加45μl珠子至二链合成的PCR管中。(2*250bp加25μl)
6.调枪至60μl，轻柔吸打10次混匀(如有多个样品，要更换枪头)。
7.室温孵育5min。
8.将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清。
9.调枪至67μl，转移67μl上清液，弃掉。不能碰到珠子。(如有多个样品，要更换枪头)保持PCR管在磁力架上不要掉落。
10.加入200μl 80％乙醇(新鲜配置)，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落。
11.室温孵育30S，弃掉废液。不能碰到珠子。(如有多个样品，要更换枪头)
12.重复6-7步骤一次。
13.室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架。
14.加入11μl Resuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀。(如有多个样品，要更换枪头)
15.盖上PCR管盖，室温孵育2min。
16.将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清。
17.转移8.75μl上清至新PCR管。(如有多个样品，要更换枪头)
七、3＇端加A
1.加6.25μl A-Tailing Mix。(如有多个样品，要更换枪头)震荡混匀，短暂离心。
2.将PCR管放入PCR仪中，盖紧热盖：
37℃ 30min
70℃ 5min
4℃ 5min
4℃ Hold
3.孵育结束后立刻将PCR管从PCR仪中取出。
立刻进行下一步操作。
八.接头连接
1.短暂震荡离心解冻后的DNA Adapter Index，Ligase Control,Stop LigationBuffer。
2.加1.25μl Resuspension Buffer到含有加A后产物(如有多个样品，要更换枪头)。
3.加1.25μl Ligation Mix到各个管中(如有多个样品，要更换枪头)，将LigationMix立刻放到-20℃冰箱中。
4.加1.25μl DNA Adapter Index(每个样品Index不能重复)到各个管中。
5.震荡混匀，短暂离心。
6.设置PCR仪：
30℃ 10min
4℃ Hold
7.孵育结束后将含样品的PCR管从PCR仪中拿出。
8.加入2.5μl Stop Ligation Buffer。(如有多个样品，要更换枪头)震荡混匀，短暂离心。
9.接头连接完成后进行AMPure XP Beads纯化：
10.震荡AMPure XP Beads至完全混匀，加28.5μl Resuspension Buffer，至mix总体积到50μl。
11.加50μl珠子至接头连接产物的PCR管中。
12.调枪至90μl，轻柔吸打10次混匀(如有多个样品，要更换枪头)。
13.室温孵育5min。
14.将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清。
15.调枪至97μl，转移97μl上清液，弃掉。不能碰到珠子。(如有多 个样品，要更换枪头)保持PCR管在磁力架上不要掉落。
16.加入200μl 80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落。
17.室温孵育30S，弃掉废液。不能碰到珠子。(如有多个样品，要更换枪头)
18.重复15-16步骤一次。
19.室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架。
20.加入52.5μlResuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀。(如有多个样品，要更换枪头)
21.盖上PCR管盖，室温孵育2min。
22.将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清。
23.转移50μl上清至新PCR管。(如有多个样品，要更换枪头)
24.震荡AMPure XP Beads至完全混匀。
25.加50μl珠子至第一次珠子纯化产物的PCR管中做二次珠子纯化。
26.调枪至90μl，轻柔吸打10次混匀(如有多个样品，要更换枪头)。
27.室温孵育5min。
28.将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清。
29.调枪至97μl，转移97μl上清液，弃掉。不能碰到珠子。(如有多个样品，要更换枪头)保持PCR管在磁力架上不要掉落。
30.加入200μl 80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落。
31.室温孵育30S，弃掉废液。不能碰到珠子。(如有多个样品，要更换枪头)
32.重复29-30步骤一次。
33.室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架。
34.加入12.5μlResuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀。(如有多个样品，要更换枪头)
35.盖上PCR管盖，室温孵育2min。
36.将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清。
37.转移10μl上清至新PCR管。(如有多个样品，要更换枪头)
38.样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
九、PCR扩增以及片段选择
1.加入2.5μl PCR Primer Cocktail到含有接头连接产物的PCR管中。
2.加入12.5μl PCR Master Mix到含有接头连接产物的PCR管中。震荡混匀，短暂离心。
3.盖紧管盖，放入PCR仪，设定下面的程序：
98℃ for 30seconds
15 cycles of:
98℃ for 10seconds
60℃ for 30seconds
72℃ for 30seconds
72℃ for 5minutes
Hold at 4℃。
样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
准备：2％琼脂糖凝胶(含EB)，100bp DNA ladder，6×loding buffer，1.7ml EP管，爱思进凝胶纯化试剂盒。
1.加入5μl 6×loding buffer到含有接头连接产物的PCR管中。震荡混匀。
2.将电泳仪槽中加入新鲜1×TAE Buffer，放入2％琼脂糖凝胶(含EB)。
3.将30μl样品加入凝胶点样孔中。
4.点入10μl 100bp DNA ladder。
5. 120V电泳60min。
6.电泳结束后，在凝胶成像系统下拍照，保存至项目文件夹中。
7.在紫外灯下切胶，选择需要的片段范围(300bp～400bp)，转移胶块至新的1.7mlEP管中，称取重量。
8.用爱思进凝胶纯化试剂盒纯化含有样品的胶块：
9.加入胶块重量3倍体积的DE A溶液(100mg：100μl)，置70℃干式加热器中融化胶块。
10.加入DE A溶液1.5倍体积的DE B溶液，混匀后转入过滤柱，放置新的2ml收集管上(每次不超过700μl)
11.12000rpm离心1min，弃去收集管中废液，重复2-3步至所有溶液完全过柱为止。
12.加入500μl W1溶液至柱子中，12000rpm离心1min。弃去废液。
13.加入700μl W2溶液至柱子中，12000rpm离心1min。弃去废液。
14.重复步骤13一次。
15.将柱子置离心机中12000rpm离心2min。
16.将柱子放在新的1.7ml EP管中，打开柱子管盖，室温晾干3min。
17.加入25μl Elute溶液，盖紧管盖，室温孵育2min。
18.12000rpm离心2min，去掉柱子，盖紧1.7ml EP管盖。
样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
十、文库检测定量
1.凝胶电泳检测：将待建库文库放置在冰盒上解冻，完全融解后短暂震荡离心。取3μl样品加1μl 6×loding buffer，用枪吸打混匀。调枪至4μl，吸取全部样品加入1％琼脂糖胶胶孔中，点3μl 100bp Maker。120V电泳25分钟。电泳结束后，将胶块放入凝胶成像系统中拍照。
2.文库浓度检测：取1μl文库样品，稀释30倍，取30μl稀释后样品，加入等体积稀释后PicoGreen荧光染料，短暂震荡离心后转移50μl混合溶液至TBS380定量管中(使用旧管)，用手轻甩两下，放入TBS380，按下Read键,记下读数，代入标曲，计算文库浓度。
Claims (18)
1.一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，在RNA提取完成后，先用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA，mRNA产物在-80℃保存以备后用，且将没有被Oligo(dT)的磁珠富集的其他RNA样品依次完成真核生物rRNA的去除和原核生物rRNA的去除，剩余产物-80℃保存以备后用。将两次富集放入产物混合、纯化以及加入随机引物片段化，第一链的mix以及逆转录酶的共同作用下合成第一链(cDNA链)，然后加入第二链合成mix的完成第二链合成，再在3’加poly(A)，连接接头，进行PCR扩增，再进行凝胶片段选择，最后需要对文库进行检测，具体包括如下步骤：(1)真核mRNA纯化步骤；(2)真核生物rRNA去除步骤；(3)原核生物rRNA去除步骤；(4)所用RNA富集以及RNA的片段化步骤；(5)第一链合成步骤；(6)第二链合成步骤；(7)加A、加接头步骤；(8)磁珠片段选择步骤；(9)PCR扩增以及片段选择步骤；(10)文库质检步骤。
2.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述真核mRNA纯化步骤，包括如下步骤：
(1.1)准备0.3mLPCR管用RNase-free水稀释RNA样品到终体积为50uL；
(1.2)蜗旋震荡RNA Purification Beads使充分混匀；
(1.3)向稀释好的RNA样品中加入25ul RNA Purification Beads,用移液器轻轻吸打10次使之充分混匀；
(1.4)放到PCR仪按预设好的程序(65℃5min,4℃hold)进行孵育；
(1.5)当PCR仪温度降到4℃，取出PCR管室温静置5min；
(1.6)室温静置于磁力架上5min或直到溶液变澄清，将上清转移到新的无酶离心管中，放置冰上备用；
(1.7)将PCR管从磁力架上取下，加100uLBead Washing Buffer用移液器上下吸打10次，使充分混匀；
(1.8)室温静置磁力架上5min或直到溶液变澄清，小心吸取上清并弃掉将PCR管从磁力架上取下，加16.5uLElution Buffer用移液器上下吸打10次，使充分混匀；
(1.9)室温放置2min，随后置于磁力架上5min或直到溶液变澄清，小心吸取上15ul至新的离心管中，-80度冰箱保存备用。
3.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述真核生物rRNA去除步骤，包括如下步骤：
(2.1)从冰箱中拿出分装好的AgencourtRNAClean XP beads，室温放置30min；
(2.2)从冰上取出步骤(1.6)中的上清，加入1.8X the Agencourt RNA Clean XPbeads，用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置5-10min；
(2.3)将PCR管放置在磁力架上，待澄清后吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(2.4)加入200ul 70％无酶水配制的乙醇，室温放置30s，吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(2.5)重复步骤(2.5)一次；
(2.6)吸干净残留的乙醇后，室温放置3-5min，待晾干后加入32ulTE，做RNA用；
(2.7)使用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置2min，随后置于磁力架上直到溶液变澄清，小心吸取30ul到新的无酶1.5ml离心管中；
(2.8)吸取300ul binding buffer到上一步的1.5ml离心管中，震荡混匀，短暂离心；
(2.9)每5ug RNA加入2ul的Capture Oligo Mix，震荡混匀，短暂离心；
(2.10)将混合物放置70度水浴中，10min；
(2.11)随后37度水浴孵育1h；
(2.12)孵育期间准备磁珠：
(2.12.1)从装有磁珠的管子里吸出25u磁珠(每5ug RNA需要25ul磁珠)，放置在磁力架上吸附，待溶液澄清后吸弃上清
(2.12.2)加入25ul的无酶水，吸打混匀后，短暂离心；
(2.12.3)将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后吸弃上清
(2.12.4)往离心管中加入等体积的binding buffer，吹打混匀后，放置在室温备用；
(2.13)在步骤(2.12)结束前将清洗过的磁珠放置在磁力架上，待澄清后将上清弃掉，加入37度孵育后的混合物，吹打混匀，短暂离心；
(2.14)37度孵育15min；
(2.15)孵育完毕后，将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清到新的离心管中；
(2.16)加入100ul wash solution(预热到37度)到磁珠中，吸打混匀后，放置在37度，5min；
(2.17)孵育完后，将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清到步骤(2.15)的新离心管中，二者合并总体积为400-470ul；
(2.18)加入1/10体积的3M Sodium Acetate 40–47μL和4μL 5mg/mL Glycogen；
(2.19)加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，震荡混匀，置于-20度冰箱中1h；
(2.20)12000rpm，离心30min
(2.21)加入750ul 70％的无水乙醇，10000rpm，离心5min；
(2.22)重复步骤(2.21)一次；
(2.23)待乙醇挥发干净，加入28ul无酶水溶解沉淀。
4.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述原核生物rRNA去除步骤，包括如下步骤：
(3.1)磁珠清洗步骤；
(3.2)rRNA Removal Solution处理样品步骤；
(3.3)rRNA移除步骤；
(3.4)纯化处理RNA步骤。
5.如权利要求4所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述磁珠清洗步骤分为单独每管清洗或批量清洗磁珠步骤。
6.如权利要求5所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述单独每管清洗步骤，包括如下步骤：
(3.1.1)在涡旋器上剧烈震荡混匀磁珠；
(3.1.2)对于每一个反应，轻轻的吸出225ul磁珠加入无酶管中，避免产生气泡；
(3.1.3)保持管盖打开，将无酶管放置在磁力架上，静置至少1分钟，直到溶液变得澄清为止；
(3.1.4)用移液器轻轻的将上清液吸出；
(3.1.5)从磁力架上取出无酶管，加入225ul的无酶水，彻底的悬浮磁珠；
(3.1.6)重复步骤(3.1.3)至步骤(3.1.4)；
(3.1.7)再用无酶水重新清洗一次，吸弃上清；
(3.1.8)从磁力架上取下无酶管，加入65ulMagneticBeadResuspension Solution，震荡混匀；
(3.1.9)加入1ulRiboGuardRNaseInhibitor到每一个管中，用移液器吹打10-15次混匀，避免产生气泡，室温放置。
7.如权利要求5所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述批量清洗磁珠步骤，包括如下步骤：
每个反应需要225ul的磁珠，1.5ml的无酶管每次至多加入1350ul的磁珠；
所述步骤同步骤(3.1.1)至步骤(3.1.9)。
8.如权利要求4所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述rRNA RemovalSolution处理样品步骤，包括如下步骤：
该步骤中，当total RNA总量在1-2.5ug时，且总RNA最大体积为28ul，加入8ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution；当total RNA总量在2.5-5ug时，且总RNA最大体积为26ul，加入10ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution；
(3.2.1)从-80℃拿出试剂盒，并平衡到室温；
(3.2.2)对于每一个反应，按下表给出的用量依次加入:4ul Ribo-Zero ReactionBuffer,26or 28ul RNA sample,8-10ul Ribo-Zero rRNA Removal Solution,补无酶水至40ul；
(3.2.3)吹吸10-15次混匀，68℃孵育10分钟；
(3.2.4)待温育过后，立即进行离心收集管壁上的冷凝；
(3.2.5)室温放置5分钟。
9.如权利要求4所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述rRNA移除步骤，包括如下步骤：
(3.3.1)转移探针-RNA杂交样品到清洗过的磁珠中，不用更换枪头立即吹吸10-15次混匀,加样体积为；40ulProbe-hybridized RNA sample加上65ul Washer room temperatureMagnetic Beads；
(3.3.2)盖上管盖，高速涡旋最少10s，避免将溶液涡旋到管盖上；
(3.3.3)室温放置5分钟；
(3.3.4)50℃放置5分钟；
(3.3.5)立即放置在磁力架上至少1分钟直到溶液澄清；
(3.3.6)小心的吸出上清(约85-90ul)转移到新的无酶管中；
(3.3.7)将无酶管放置在冰上，上清液可以在-20℃中放置过夜或者在-65℃到-80℃中放置更长时间。
10.如权利要求4所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述纯化处理RNA步骤，包括如下步骤：
(3.4.1)用无酶水将溶液体积补充到180ul；
(3.4.2)加入18ul 3M醋酸钠到每管中；
(3.4.3)加入2ul糖原(10mg/ml)，震荡混匀；
(3.4.4)加入3倍体积冰冻的无水乙醇(600ul)，混匀；
(3.4.5)-20℃沉淀至少1小时；
(3.4.6)>10000xg，4℃离心30分钟，弃上清
(3.4.7)使用1ml冰冻的70％乙醇清洗，>10000xg，4℃离心5分钟；
(3.4.8)重复步骤(3.4.7)；
(3.4.9)弃上清，短暂离心后，用移液器轻轻的吸出剩余的液体；
(3.4.10)加入15ul的无酶水溶解，-80℃保存。
11.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述RNA富集后混样纯化以及片段化步骤，包括如下步骤：
(4.1)将真核mRNA和原核mRNA(各15ul)混合，加入1.8X the AgencourtRNAClean XPbeads，用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置5-10min；
(4.2)将PCR管放置在磁力架上，待澄清后吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(4.3)加入200ul 70％乙醇(无酶水配制)，室温放置30s，吸弃上清，注意不要吸到磁珠；
(4.4)重复步骤(4.3)一次；
(4.5)吸干净残留的乙醇后，室温放置3-5min(不要放置时间太长，否则磁珠太干会严重影响RNA回收效率，待晾干后加入10.5ul FPF Mix；
(4.6)使用移液器轻柔吹打混匀10次，室温放置2min，随后置于磁力架上直到溶液变澄清，小心吸取8.5ul到新的无酶PCR管中。
12.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述第一链合成步骤是加入4μl Strand Master Mix和Superscript iii，混合液震荡混匀，短暂离心后，按以下条件设置PCR仪并进行反转录：25℃，10min；42℃，50min；85℃，15min；4℃，Hold。
13.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述第二链合成步骤，包括如下步骤：
(6.1)加入10μl Second Strand Master Mix；
(6.2)加入2.5ul Resuspension Buffer，震荡混匀，短暂离心。
(6.3)按如下条件设置PCR仪：
16℃，60min；4℃，Hold；
(6.4)合成完成后进行AMPure XP Beads纯化：
(6.5)震荡AMPure XP Beads至完全混匀，加45μl珠子至二链合成的PCR管中，2*250bp加25μl；
(6.6)调枪至60μl，轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(6.7)室温孵育min；
(6.8)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(6.9)调枪至67μl，转移67μl上清液，弃掉；不能碰到珠子，如有多个样品，要更换枪头，保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(6.10)加入200μl 80％乙醇，不能碰到珠子，保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(6.11)室温孵育30S，弃掉废液，不能碰到珠子，如有多个样品，要更换枪头；
(6.12)重复(6.6)至(6.7)步骤一次；
(6.13)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架；
(6.14)加入11μl Resuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(6.15)盖上PCR管盖，室温孵育2min；
(6.16)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(6.17)转移8.75μl上清至新PCR管，如有多个样品，要更换枪头。
14.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述加A、加接头步骤，包括如下步骤：
(7.1)3＇端加A步骤；
(7.2)接头连接步骤。
15.如权利要求14所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述(7.1)3＇端加A步骤包括如下步骤：
(7.1.1)加6.25μl A-Tailing Mix。(如有多个样品，要更换枪头)震荡混匀，短暂离心。
(7.1.2)将PCR管放入PCR仪中，盖紧热盖：37℃，30min；70℃，5min；4℃，5min；4℃，Hold；
(7.1.3)孵育结束后立刻将PCR管从PCR仪中取出，立刻进行下一步操作。
16.如权利要求14所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述(7.2)接头连接包括如下步骤：
(7.2.1)短暂震荡离心解冻后的DNA Adapter Index，Ligase Control,Stop LigationBuffer。
(7.2.2)加1.25μl Resuspension Buffer到含有加A后产物，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.3)加1.25μl Ligation Mix到各个管中，如有多个样品，要更换枪头，将LigationMix立刻放到-20℃冰箱中；
(7.2.4)加1.25μl DNA Adapter Index到各个管中，震荡混匀，短暂离心；
(7.2.5)设置PCR仪：
30℃，10min；4℃，Hold；
(7.2.6)孵育结束后将含样品的PCR管从PCR仪中拿出；
(7.2.7)加入2.5μl Stop Ligation Buffer，如有多个样品，要更换枪头)震荡混匀，短暂离心；
(7.2.8)接头连接完成后进行AMPure XP Beads纯化：
(7.2.9)震荡AMPure XP Beads至完全混匀，加28.5μl Resuspension Buffer，至mix总体积到50μl。
(7.2.10)加50μl珠子至接头连接产物的PCR管中。
(7.2.11)调枪至90μl，轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.12)室温孵育5min；
(7.2.13)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(7.2.14)调枪至97μl，转移97μl上清液，弃掉，不能碰到珠子；如有多个样品，要更换枪头，保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(7.2.15)加入200μl 80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(7.2.16)室温孵育30S，弃掉废液；不能碰到珠子，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.17)重复步骤(7.2.15)和步骤(7.2.16)一次；
(7.2.18)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架；
(7.2.19)加入52.5μlResuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.20)盖上PCR管盖，室温孵育2min；
(7.2.21)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；转移50μl上清至新PCR管，如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.22)震荡AMPure XP Beads至完全混匀；
(7.2.23)加50μl珠子至第一次珠子纯化产物的PCR管中做二次珠子纯化；
(7.2.24)调枪至90μl，轻柔吸打10次混匀，如有多个样品，要更换枪头)；
(7.2.25)室温孵育5min；
(7.2.26)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(7.2.27)调枪至97μl，转移97μl上清液，弃掉；不能碰到珠子；如有多个样品，要更换枪头；保持PCR管在磁力架上不要掉落。
(7.2.28)加入200μl80％乙醇，不能碰到珠子。保持PCR管在磁力架上不要掉落；
(7.2.29)室温孵育30S，弃掉废液，不能碰到珠子；如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.30)步骤(7.2.28)和步骤(7.2.29)一次；
(7.2.31)室温晾干10-15分钟。在观察到珠子出现裂纹后，将PCR管移下磁力架；
(7.2.31)加入12.5μlResuspension Buffer，用枪轻柔吸打10次混匀；如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.32)盖上PCR管盖，室温孵育2min；
(7.2.33)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min或直到溶液变澄清；
(7.2.34)转移10μl上清至新PCR管；如有多个样品，要更换枪头；
(7.2.35)样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
17.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述PCR扩增以及片段选择步骤，包括如下步骤：
(9.1)加入2.5μl PCR Primer Cocktail到含有接头连接产物的PCR管中；
(9.2)加入12.5μl PCR Master Mix到含有接头连接产物的PCR管中。震荡混匀，短暂离心；
(9.3)盖紧管盖，放入PCR仪，设定下面的程序：
98℃for 30 seconds
15 cycles of:
98℃ for 10 seconds
60℃ for 30 seconds
72℃ for 30 seconds
72℃ for 5 minutes
Hold at 4℃
(9.4)样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤；
(9.5)准备：2％琼脂糖凝胶(含EB)，100bp DNA ladder，6×loding buffer，1.7ml EP管，爱思进凝胶纯化试剂盒；
(9.6)加入5μl 6×loding buffer到含有接头连接产物的PCR管中，震荡混匀；
(9.7)将电泳仪槽中加入新鲜1×TAE Buffer，放入2％含EB的琼脂糖凝胶；
(9.8)将30μl样品加入凝胶点样孔中；
(9.9)点入10μl 100bp DNA ladder；
(8.8)120V电泳60min；
(9.10)电泳结束后，在凝胶成像系统下拍照，保存至项目文件夹中；
(9.11)在紫外灯下切胶，选择300bp～400bp的片段范围，转移胶块至新的1.7ml EP管中，称取重量；
(9.12)用爱思进凝胶纯化试剂盒纯化含有样品的胶块：
(8.13)加入胶块重量3倍体积的DE A溶液(100mg：100μl)，置70℃干式加热器中融化胶块；
(9.14)加入DEA溶液1.5倍体积的DE B溶液，混匀后转入过滤柱，放置新的2ml收集管上，每次不超过700μl；
(9.15)12000rpm离心1min，弃去收集管中废液，重复步骤(9.2)至步骤(9.3)至所有溶液完全过柱为止；
(9.16)加入500μl W1溶液至柱子中，12000rpm离心1min，弃去废液；
(9.17)加入700μl W2溶液至柱子中，12000rpm离心1min。弃去废液。
(9.18)重复步骤(9.13)一次；
(9.19)将柱子置离心机中12000rpm离心2min；
(9.20)将柱子放在新的1.7ml EP管中，打开柱子管盖，室温晾干3min；
(9.21)加入25μl Elute溶液，盖紧管盖，室温孵育2min；
(9.22)12000rpm离心2min，去掉柱子，盖紧1.7ml EP管盖；
(9.23)样品保存在-20℃过夜或进行下一步骤。
18.如权利要求1所述的一种宏转录文库的建库方法，其特征在于，所述文库质检步骤，包括如下步骤：
(10.1)凝胶电泳检测：将待建库文库放置在冰盒上解冻，完全融解后短暂震荡离心；取3μl样品加1μl 6×loding buffer，用枪吸打混匀；调枪至4μl，吸取全部样品加入1％琼脂糖胶胶孔中，点3μl 100bp Maker；120V电泳25分钟；电泳结束后，将胶块放入凝胶成像系统中拍照。
(10.2)文库浓度检测：取1μl文库样品，稀释30倍，取30μl稀释后样品，加入等体积稀释后PicoGreen荧光染料，短暂震荡离心后转移50μl混合溶液至TBS380定量管中，用手轻甩两下，放入TBS380，按下Read键,记下读数，代入标曲，计算文库浓度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610984532.2A CN106567133A (zh) | 2016-11-09 | 2016-11-09 | 一种宏转录组文库的建库方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610984532.2A CN106567133A (zh) | 2016-11-09 | 2016-11-09 | 一种宏转录组文库的建库方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106567133A true CN106567133A (zh) | 2017-04-19 |
Family
ID=58540806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610984532.2A Pending CN106567133A (zh) | 2016-11-09 | 2016-11-09 | 一种宏转录组文库的建库方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106567133A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058540A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-08-18 | 山东大学 | 磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法 |
| CN107828857A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-03-23 | 南宁科城汇信息科技有限公司 | 一种转录组测序及RNAseq数据分析方法 |
| CN108359665A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-08-03 | 安徽微分基因科技有限公司 | 一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组dna的提取方法 |
| CN115354398A (zh) * | 2022-09-27 | 2022-11-18 | 北京金匙医学检验实验室有限公司 | 一种使宏基因组测序文库片段大小集中的文库构建方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104630206A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-05-20 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 转录组文库的构建方法 |
| CN105200531A (zh) * | 2015-10-27 | 2015-12-30 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种针对特定大小rna片段的高通量测序文库构建方法 |
| CN105297144A (zh) * | 2015-10-27 | 2016-02-03 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种原核生物小rna的高通量文库构建方法 |
| CN105907747A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-08-31 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法 |
-
2016
- 2016-11-09 CN CN201610984532.2A patent/CN106567133A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104630206A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-05-20 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 转录组文库的构建方法 |
| CN105200531A (zh) * | 2015-10-27 | 2015-12-30 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种针对特定大小rna片段的高通量测序文库构建方法 |
| CN105297144A (zh) * | 2015-10-27 | 2016-02-03 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种原核生物小rna的高通量文库构建方法 |
| CN105907747A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-08-31 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CORALIE DAMON等: "Metatranscriptomics Reveals the Diversity of Genes Expressed by Eukaryotes in Forest Soils", 《PLOS ONE》 * |
| DESPINA TSEMENTZI等: "Evaluation of metatranscriptomic protocols and application to the study of freshwater microbial communities", 《ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY REPORTS》 * |
| 李晓晖 等: "宏转录组学在微生物生态学研究中的应用", 《中国农业科技导报》 * |
| 马述 等: "宏转录组技术及其研究进展", 《生物技术通报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058540A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-08-18 | 山东大学 | 磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法 |
| CN107828857A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-03-23 | 南宁科城汇信息科技有限公司 | 一种转录组测序及RNAseq数据分析方法 |
| CN108359665A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-08-03 | 安徽微分基因科技有限公司 | 一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组dna的提取方法 |
| CN115354398A (zh) * | 2022-09-27 | 2022-11-18 | 北京金匙医学检验实验室有限公司 | 一种使宏基因组测序文库片段大小集中的文库构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110093455B (zh) | 一种呼吸道病毒的检测方法 | |
| CN106567133A (zh) | 一种宏转录组文库的建库方法 | |
| CN105002569A (zh) | 转录组文库及其构建方法 | |
| CN108611398A (zh) | 通过新一代测序进行基因分型 | |
| CN106754904A (zh) | 一种cDNA的特异性分子标签及其应用 | |
| CN106987905A (zh) | 一种brca1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒 | |
| JP2002507121A (ja) | Ｒｎａの単離方法 | |
| CN107557450A (zh) | 一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用 | |
| CN110241178B (zh) | 一种单细胞转录组测序高通量快速文库制备方法及检测试剂盒 | |
| CN107893100A (zh) | 一种单细胞mRNA逆转录与扩增的方法 | |
| CN112680797B (zh) | 一种去除高丰度rna的测序文库及其构建方法 | |
| CN107893068A (zh) | 一种构建人TCRbetaCDR3区文库的方法 | |
| CN107893260A (zh) | 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒 | |
| CN110343754A (zh) | 一种用于造血干细胞移植供体病原微生物快速检测的方法 | |
| CN108531475A (zh) | 一种高通量转录组文库构建方法 | |
| CN113463202B (zh) | 一种新的rna高通量测序的方法、引物组和试剂盒及其应用 | |
| CN111549025B (zh) | 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 | |
| CN111748637A (zh) | 一种用于亲缘关系分析鉴定的snp分子标记组合、多重复合扩增引物组、试剂盒及方法 | |
| CN113308514A (zh) | 微量m6A的检测文库构建方法和试剂盒、高通量检测方法 | |
| CN104480217A (zh) | 一种简化基因组测序方法 | |
| CN106434911A (zh) | 一种165基因靶区域富集测序方法 | |
| CN107747134A (zh) | 一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法 | |
| Tomezsko et al. | DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vitro and in vivo | |
| CN109929911A (zh) | 一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法 | |
| CN116904568A (zh) | 一种在RNA-seq中去除核糖体RNA的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170419 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |