CN110093455B - 一种呼吸道病毒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效快速富集呼吸道病毒的高通量检测方法。高效快速富集呼吸道病毒的高通量检测鉴定技术包括以下四个部分：呼吸道样本病毒的富集、建库、高通量测序及生物信息分析。呼吸道样本病毒富集是本技术的核心部分，首先用生物物理的方法去除样本中除病毒以外的宿主的核酸，然后提取样本病毒核酸。借助于Agilent 2100仪器的检测只用200pg的核酸用于建库，高能量测序和生物信息学分析的结果显示病毒的reads数从常规方法处理不到0.1％升高到84％以上，这种检测技术不仅可以快速检测样本感染病毒，而且提高病毒的全基因组序列的覆盖率(95‑100％以上)，大幅度的降低测序成本。

Description

一种呼吸道病毒的检测方法

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，涉及一种呼吸道病毒的检测方法。

背景技术：

病毒能引起的人类疾病种类繁多。呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道 感染。上呼吸道感染是指自鼻腔至喉部之间的急性炎症的总称，是最常见的感染 性疾病。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，治疗时必须明确引起感染的病原 体以选择有效的治疗方法。上呼吸道感染90％左右由病毒引起，细菌感染常继 发于病毒感染之后。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴， 或经污染的用具进行传播。常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况， 原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌，迅速生长繁殖，导致感染。常继发支 气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。无论是 下呼吸道感染还是上呼吸道感染，绝大部分是由病毒引起的，称为病毒性呼吸道 感染。呼吸道病毒包括DNA和RNA病毒，在细胞水平上，病毒主要的破坏作 用是导致细胞裂解，从而引起细胞死亡，一旦机体内有足够多的细胞死亡，就会 对呼吸道病毒感染的症状。临床上常常通过PCR或RT-PCR定量或定性分析病 毒核酸确证呼吸道病毒感染的种类，但需要序列特异性的引物才能进行PCR病 毒核酸的检测，也有一些常规的流感病毒检测试剂盒，但漏检率高，所以临床治 疗方面，常常以抗生素为主，这样导致抗生素的滥用。另外由于病毒的变异特别 的快，特别是在特异性引物的TaqDNA聚合酶作用下PCR反应时，对于低copy 样本产生病毒漏检，因此PCR并不适合临床常规呼吸道病毒检测，多数以科研为目的。

随着人类基因组工程的完成,对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二 代测序技术(next generation sequence,NGS)的发展。NGS新的测序平台允许 进行高通量测序,具有广泛的应用,特别是对于病毒组学的研究更具有意义。NGS 非特异性的引物PCR,对于检测出的大量病毒copy片段可以解决病毒的高变异特 性和低copy检测率，更可以解决未知病原体包括病毒的检测。

NGS病毒(DNA病毒或RNA病毒要反转录的cDNA)测序的主要包括以下流程:

1.病毒样本制备；

2.文库构建和验证：DNA碎片化现多采用酶消化法，该方法需要的样本量低， 本研究只用200pmol酶消化的方法，快速并且容易，减少样本处理时间和污 染的机会；

3.高通量测序；Miseq或Hiseq，或三代测序

4.生物信息学分析。

但在呼吸道病毒二代测序中也存在如下问题，而且对于所有的病毒二代测序 都存在同样的问题。那就是二代测序过程中，为了增加病毒核酸的覆盖率，只有 增加测序深度，即增加每个样品的测序数据量，这样的结果会产生大量的reads (测序片段)和基因信息，Hiseq测序可以达到200G的数据量，Miseq测序也可 以达到15G的数据量，但在生物信息分析这些数据时，常规方法处理样本产生的 数据，发现99％以上的为宿主的基因序列，特别是低copy的病毒样本，病毒reads 数不足0.01％，这样就导致二代测序成本的直接升高，不利于临床样本呼吸道病 毒二代测序的应用，另外海量的数据分析不仅增加了检测成本而且消耗了大量的 时间和服务器的空间。为了解决这一问题，许多科研工作者通过超速离心的方法 富集病毒，虽然病毒的通量有一定的提高，但是超高速离心至少需要六个小时，每次离心样品的数量限于6个，且对仪器要求和操作技术要求很高，因此这种方 法并不适用于高通量大量临床样品的NGS检测。本发明要解决的问题就是用物理 和生物学的方法而不是超高速离心的方法，快速富集样品病毒，在提取样本病毒 核酸和建库之前，去除样本中除病毒颗粒以外的宿主的核酸的一种方法，在建库 中，也做了很大的改进，200pg级的核酸量的酶解建库，和非模板依赖性的PCR 随机扩增，在分析时也建立了本地化的呼吸道数据库，使生物信息学分析能在一 个小时内完成。这样不仅节约了实验消耗成本，也节省了时间成本，为高通量临 床测序应用提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种呼吸道病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的。

本发明所要解决的关键问题就是用综合物理和生物学的方法快速富集样品 病毒，样本病毒核酸提取和建库之前，去除样本中除病毒以外的宿主的核酸的一 种方法。该方法可以使病毒的reads数从不到0.1％升高到84％以上，不仅可以快 速检测病毒，而且可以得到病毒的全基因组序列，大幅度的降低测序成本。

本发明所述的检测方法，包括呼吸道样本病毒富集和核酸提取、高通量测序 文库构建和验证、高通量测序、生物信息学分析等四个步骤。

其中，(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：基于呼吸道待检测样本富集、 提取病毒核酸；

其中，(2)高通量测序文库构建和验证：用酶切方法构建可用于高通量测序 的核酸库；

其中，(3)高通量测序：设定辅助基于宏基因组学技术的病毒感染检测的内 参、对照；

其中，(4)生物信息学分析：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组 成，包括远缘未知的病毒组成。

(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：针对呼吸道样本微量(≤1ml)、痕量 (≤1ul)待检测样本，本发明采用了一套呼吸道样本病毒富集方法，利用生物学 和物理学的方法先富集样品病毒，再用酶消化的方法去除宿主游离的核酸，再提 取病毒核酸的方法。

具体地，步骤(1)所述呼吸道样本病毒富集和制备部分包括以下九个步骤： 样本取样，样本细胞裂解和离心，样本浓缩、样本宿主游离核酸去除、样本宿主 细胞核酸去除、提取病毒核酸DNA或RNA、逆转录合成互补cDNA(complementary DNA)、非序列依赖性扩增、核酸纯化。

第一步，样本取样：包括人和动物呼吸道样本，新鲜样品或-80℃冻存样品。 如果是痕量的鼻咽试子，先保存于病毒采集管中，震荡30s，进行第二步处理或1 小时之内-80℃冻存，其它鼻咽分泌物抽提物，肺泡灌洗液，痰液等需要加液化 剂，进行第二步处理或1小时之内-80℃冻存，

第二步，样本细胞裂解和离心：取上述病毒采集管样本50-500ul加无RNA 酶的纯水，低渗裂解细胞，离心，取上清，

第三步，样本浓缩：取上步上清液离心浓缩，得到浓缩样品，

第四步，样本宿主游离核酸去除：上述浓缩样品用DNA和RNA磁珠吸附去 除宿主游离核酸。

第五步，样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸。

第六步，提取病毒核酸DNA或RNA:主要提取DNA或RNA病毒的核酸包括 的DNA或RNA。

第七步，逆转录合成cDNA：将第六步提取出来的病毒RNA转化成更稳定更 易保存的cDNA。

第八步，非序列依赖性扩增：基于聚合酶链反应(PCR)将第七步获得的cDNA 进行用非序列依赖性引物进行少许扩增，直到满足下一步高通量测序样本建库所 要求的上样量1pg。这一步可选，如果第七步cDNA够的话，这一步可省略。

第九步，病毒核酸纯化：纯化第七步或第八步获得的病毒核酸用于后续的测 序前的文库构建和验证准备。

二、高通量测序文库构建和验证

其中，高通量测序文库构建和验证，指上步纯化的病毒核酸酶解片段化和加 标签，构建300-700bp的文库，纯化并用Angilent2100核酸电泳验证。

具体地，包括上步纯化的病毒核酸准确定量和稀释，用Nextera酶解法使核 酸片段化和加接头过程在一个管子里面一步完成，纯化和鉴定。

第一步，纯化的病毒核酸准确定量：用Qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核 酸进行定量，并稀释到200pg/ul的核酸浓度。

第二步，Nextera酶解法使核酸片段化和加接头：取上述第一步稀释到 200pg/ul的核酸1ul加Nextera酶使核酸片段化和加接头

第三步，带标签的片段化核酸纯化：上述带标签的片段化核酸纯化构建文库。

第四步，构建文库的验证：上述纯化的文库用Angilent2100电泳进行验证， 使文库在300-700bp之间。

三、高通量测序

其中，步骤(3)所述高通量测序：根据病毒检测长度的需求，可选择二代 测序或三代测序，如果进行二代测序选步骤(2)片段化文库直接进行测序，如 果进行三代测序，可直接用步骤(1)样本直接进行三代测序。

以二代测序为例，具体地，步骤(3)所述高通量测序包括二个步骤：高通 量测序、将图像测序信号转换为核酸序列信息。

四、生物信息学分析

其中，步骤(4)所述生物信息学分析参照我们以前的生物信息分析系统， 只是数据库限制在呼吸道病毒库系统，这样我们缩小了库的容量，分析时间从原 来的72小时缩小到1小时，可以快速完成得到高通量分析结果。

呼吸道病毒库构建系统：从公共生物信息数据库中下载并整理呼吸道病毒 (包括病毒但不限于病毒)的核酸、蛋白质的序列信息、结构信息、进化信息；

优选的，本发明所述的检测方法，包括以下步骤：

(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：

1.样本取样：首先从住院病人分别诊断为慢阻肺病人(cya)和过敏病人(cyb)， 肺出血病人(cyc)及肺癌病人(cyd)取咽试子快速保存在病毒采集管中 (约3ml)，震荡30s。

2.样本细胞裂解和离心：取样本cya1和cyb1各400ul，15000rpm，4℃，离 心10min，取上清到另一1.5ml的EP管中，沉淀中加500ul无RNA酶的纯水， 15000rpm，4℃，离心10min，取上清与第一次上清合并，

3.样本浓缩：取上清约800-850ul，用0.22μm滤膜过滤至洁净EP管中，再加 入到2ml超滤管中，4000g，4℃，离心10min，离心浓缩样品约40-50ul，

4.样本宿主游离核酸去除：上述40-50ul浓缩样品管中加入DNA clean XP和 RNAclean XP磁珠各50ul，冰上5min，用磁力架吸弃磁珠，取上清114ul，

5.样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸

然后在37℃，消化30min，其中，Turbo Dnase是一种名为Turbo的脱氧 核糖核酸酶；Nuclease是核酸酶；RNase one是核糖核酸酶；Turbo DNase Buffer是Turbo脱氧核糖核酸酶的缓冲液，

6.提取病毒核酸DNA或RNA:用QIAGEN公司的QIamp viral RNA mini Kit提取 DNA或RNA病毒的核酸包括的DNA或RNA,用30μl AVE洗脱样品中的病 毒RNA，操作方法如下：

1)取560μL Buffer AVL-carrier RNA加入到140μL/管的样液中，涡旋15s，

2)室温(15-25℃)静置10min，瞬时离心，便于盖上液体回流到管底，

3)加入560μL无水乙醇(96-100％)，涡旋15s，瞬时离心，

4)取630μL样液加入column中，离心1min，8000rpm，将柱子column 放入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管，

5)再取余下630μL样液加入column中，离心1min，8000rpm，将柱子 column放入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管，

6)加入AW1，500μL/管，离心1min，8000rpm，将柱子column放入洁 净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管，

7)加入AW2，500μL/管，离心3min，13000rpm，

8)空离1min，13000rpm，

9)将柱子column放入洁净1.5ml EP管中，加入AVE 30μL/管，离心1min， 8000rpm，于-80℃低温保存样品，

7.逆转录合成cDNA：将第上步提取出来的病毒RNA转化成更稳定更易保 存的cDNA，用superscript^TM IV First-strand synthesis system合成cDNA， 方法如下：

1)先合成一链：

2)混合并短暂离心，

3)RNA-引物混合物在65℃加热5分钟，然后在冰上孵育至少1分钟，

4)涡旋并短暂离心5×SSIV缓冲液，

5)将以下组分混合在上述反应管中，共计20μL

6)盖上管子，混合，然后短暂离心内容物，

7)反应混合物在23℃下孵育10分钟，50-55℃孵育10分钟，80℃下 孵育10分钟使反应失活，4℃冷却1分钟，

8)采用Klenow完成上述cDNA第二链的合成。

95℃,2min,4℃2分钟，在上述体系加入1μl 3’-5’exo-Klenow DNA 聚合酶,混匀，执行下列程序：37℃,60敏；75℃,10min。

8.非序列依赖性扩增：

PCR反应体系:用Takala的green MIX,

将上述PCR反应体系放入PCR仪，执行下列PCR反应程序：

*依据核酸的量，决定循环次数，第7获得的cDNA进行用非序列依 赖性引物进行少许扩增，直到满足下一步高通量测序样本建库所要 求的上样量200pg，

9.病毒核酸纯化：纯化第7步或第8步获得的病毒核酸用于后续的测 序前的文库构建和验证准备，使用QIAGEN-PCR回收试剂盒，按说 明进行。

(2)高通量测序文库构建和验证

上述PCR产物用Qubit荧光定量，上机测序前稀释成200pg/ul纯化样品， 使用Agilent 2100跑胶，初步判定目标片段的浓度及量的大小，并调整至适宜 的二代测序浓度范围，

Agilent 2100芯片加样步骤：

1)使用前，让凝胶—染料混合物平衡至室温30分钟，

2)在卡位C处放置一个新的高灵敏度DNA芯片，

3)移取9μL凝胶染料混合物在标记的孔中，

4)确保柱塞位于1mL处，然后关闭芯片灌注器，

5)按下柱塞，直至其被夹子固定，

6)等待60秒然后释放，

7)等待5秒钟，然后慢慢将柱塞拉回1mL位置，

8)打开芯片灌注器，在标记的孔中加入9μL凝胶染料混合物，

9)在所有样品和梯孔中加入5μL标记物，

10)移取1μL高灵敏度DNA梯在标记的孔中，

11)在11个样品孔的每一个中，加入1μL样品，未使用的标记孔 加入1μLMarker，

12)将芯片水平放入适配器中，并在指定的设置(2400rpm)下涡 旋1分钟，

13)在5分钟内在Agilent 2100生物分析仪中运行芯片，

取1ul约200pg上述样本，Illumina公司的试剂盒，NexteraXT DNA样本kit， 和NexteraXT index kit使核酸片段化和加接头：操作按说明书，

上述纯化的文库用Angilent2100电泳进行验证，使文库在300-700bp之间。

(3)高通量测序：

用Illumina公司的测序仪进行深度测序，测序试剂盒为MiniSeq High OutputKit (150cycle),进行深度测序，片段读长150bp。

(4)生物信息分析：

利用MEGAN将BLAST的结果转换成物种组成信息，提取病毒的核酸信息进一步 分析。

本发明与现有检测方法相比较，其优点在于：

1)它适用于但不限于人和动物呼吸病毒的检测与鉴定；2)去除宿主以后的 病原体reads数从现有技术不到0.1％提高到84％；3)阳性病毒的reads数能达 到现代技术约268倍；4)全基因组覆盖率能达到97-99.51％；5)直接检测至少 五种混合已知和未知远缘病毒感染的检测(包括致病和不致病病毒和噬菌体)；6) 它用于多样本(群体)的检测，以Miseq(15G数据量)为例，原始方法最多检 测5个样本也得不到很好的结果，但本方法可以检测至少72个样本；7)检测灵 敏度远远高于以前的高通量检测；6)对初始样本量要求非常低；8)不用超速离 心和快速生物信息分析系统使检测时间大大缩短；9)可以很容易获得阳性样本 病毒基因组的全部序列；10)可以获得病毒的核酸多态性。鉴于本发明的这些优点，它可被用于但不限于临床样本的精准医学分析、新发突发传染病的病原的快 速鉴定，高通量测序时间和成本的大大降低以及生物信息学分析的简化加速高通 量测序在临床的应用，可以解决病毒感染。

附图说明

图1为两种方法的reads数占总reads数的百分比图(去除人源基因组后)

图2为两种方法检测的冠状病毒对参考病毒序列的reads覆盖率

具体实施方式：

下面通过具体的例子说明本发明的实施方式。本领域技术人员可由本说明书 所披露的内容在没有背离本发明的精神下根据具体实例的不同进行分析路径的 选择与调整和具体参数的调试都属于本发明的保护范围。

实施例1、

我们以2018年6月采集的4例人肺部疾病的呼吸道样本的病毒检测为例按 顺序来说明本发明的具体实施方式。

一、样本采集和贮存条件：

1、首先从住院病人分别诊断为慢阻肺病人(cya)和过敏病人(cyb)，肺出血病人(cyc) 及肺癌病人(cyd)取咽试子快速保存在病毒采集管中(约3ml)，震荡30s。其它痕量样品 也可保存到病毒采集管中，为便于比较，每份样本采用两种方法处理，按本发明方法处理， 样本命名为cya1、cyb1、cyc1和cyd1，按现代方法处理样本命名为cya2cyb2、cyc2和cyd2， 不经过本方法的富集过程，直接提取核酸。

2、取样量可根据样品多少而定，样本不够可加生理盐水稀释，本方法取样本cya1和cyb1 各400ul，15000rpm，4℃，离心10min，取上清到另一1.5ml的EP管中，沉淀中加500ul无RNA酶的纯水，15000rpm，4℃，离心10min，取上清与第一次上清合并，此低渗裂解细 胞的方法取代以前反复冻融三次(时间至少为1.5小时，37℃会对细胞释放的酶会对病毒有 破坏)方法，此低渗裂解细胞方法的好处是震荡30s即可(时间短，冰上进行，保护病毒颗 粒)。

3、样本浓缩：取上清约800-850ul，用0.22μm滤膜过滤至洁净EP管中，再加入到2ml超滤管中，4000g，4℃，离心10min，离心浓缩样品约40-50ul，此步是我们的富集样品的 关键步骤。

4、样本宿主游离核酸去除：上述40-50ul浓缩样品管中加入DNA clean XP和RNAclean XP 磁珠各50ul，冰上5min，用磁力架吸弃磁珠，取上清114ul。

5、样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸

然后在37℃，消化30min。其中，Turbo Dnase是一种名为Turbo的脱氧 核糖核酸酶；Nuclease是核酸酶；RNase one是核糖核酸酶；Turbo DNase Buffer是Turbo脱氧核糖核酸酶的缓冲液。

6、提取病毒核酸DNA或RNA:这一步包括样品cya2和cyb2，一起用QIAGEN 公司的QIamp viral RNA mini Kit提取DNA或RNA病毒的核酸包括的DNA或RNA, 用30μl AVE洗脱样品中的病毒RNA。操作方法如下：

1)取560μL Buffer AVL-carrier RNA加入到140μL/管的样液中，涡旋15s

2)室温(15-25℃)静置10min，瞬时离心，便于盖上液体回流到管底

3)加入560μL无水乙醇(96-100％)，涡旋15s，瞬时离心

4)取630μL样液加入column中，离心1min，8000rpm，将柱子column放 入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管

5)再取余下630μL样液加入column中，离心1min，8000rpm，将柱子column 放入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管

6)加入AW1，500μL/管，离心1min，8000rpm，将柱子column放入洁净 2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管

7)加入AW2，500μL/管，离心3min，13000rpm

8)空离1min，13000rpm

9)将柱子column放入洁净1.5ml EP管中，加入AVE 30μL/管(AVE量可 变动)，离心1min，8000rpm，于-80℃低温保存样品

7、逆转录合成cDNA：将第7步提取出来的病毒RNA转化成更稳定更易保 存的cDNA。用superscript^TM IV First-strand synthesis system合成cDNA，方法如下：

1)先合成一链：

2)混合并短暂离心

3)RNA-引物混合物在65℃加热5分钟，然后在冰上孵育至少1分钟。

4)涡旋并短暂离心5×SSIV缓冲液

5)将以下组分混合在上述反应管中，共计20μL

6)盖上管子，混合，然后短暂离心内容物。

7)反应混合物在23℃下孵育10分钟，50-55℃孵育10分钟，80℃下孵育 10分钟使反应失活，4℃冷却1分钟。

8)采用Klenow完成上述cDNA第二链的合成。

95℃,2min,4℃2分钟，在上述体系加入1μl 3’-5’exo-Klenow DNA 聚合酶,混匀，执行下列程序：37℃,60敏；75℃,10min。

8、双链DNA的非依赖性扩增

PCR反应体系:用Takala的green MIX,

将上述PCR反应体系放入PCR仪，执行下列PCR反应程序：

*依据核酸的量，决定循环次数。第7获得的cDNA进行用非序列依赖性 引物进行少许扩增，直到满足下一步高通量测序样本建库所要求的 上样量200pg。这一步可选，如果第8步cDNA够的话，这一步可省 略。

9、病毒核酸纯化：纯化第7步或第8步获得的病毒核酸用于后续的测序前 的文库构建和验证准备。使用QIAGEN-PCR回收试剂盒，按说明进行。

二、高通量测序文库构建和验证

上述PCR产物用Qubit荧光定量，上机测序前稀释成200pg/ul纯化 样品，使用Agilent 2100跑胶，初步判定目标片段的浓度及量的大小， 并调整至适宜的二代测序浓度范围。

Agilent 2100芯片加样步骤：

1)使用前，让凝胶—染料混合物平衡至室温30分钟。

2)在卡位C处放置一个新的高灵敏度DNA芯片。

3)移取9μL凝胶染料混合物在标记的孔中。

4)确保柱塞位于1mL处，然后关闭芯片灌注器。

5)按下柱塞，直至其被夹子固定。

6)等待60秒然后释放。

7)等待5秒钟，然后慢慢将柱塞拉回1mL位置。

8)打开芯片灌注器，在标记的孔中加入9μL凝胶染料混合物。

9)在所有样品和梯孔中加入5μL标记物(绿色)。

10)移取1μL高灵敏度DNA梯(黄色)在标记的孔中。

11)在11个样品孔的每一个中，加入1μL样品(使用的孔)，未使用的标 记孔加入1μLMarker。

12)将芯片水平放入适配器中，并在指定的设置(2400rpm)下涡旋1分钟。

13)在5分钟内在Agilent 2100生物分析仪中运行芯片。

取1ul约200pg上述样本，Illumina公司的试剂盒，NexteraXT DNA样本kit， 和NexteraXT index kit使核酸片段化和加接头：操作按说明书。

上述纯化的文库用Angilent2100电泳进行验证，使文库在300-700bp之间。

三、高通量测序

上述文库应用Illumina公司的测序仪(名称为MiniSeq)进行深度测序，测 序试剂盒为MiniSeq High Output Kit(150cycle),进行深度测序，片段读长150bp；

四、生物信息分析

按本所已购建的标准运行程序分析，利用MEGAN将BLAST的结果转换成物 种组成信息，提取病毒的核酸信息进一步分析。图1可见常规方法去除完人的 reads后只有不到1％的数量，用本专利方法后得到的80％左右。图2显示，本专 利方法可以得到很高的病毒的覆盖率。

Claims (3)

1.一种呼吸道病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：基于呼吸道待检测样本富集、提取病毒核酸；

(2)高通量测序文库构建和验证：用酶切方法构建可用于高通量测序的核酸库；

(3)高通量测序：设定辅助基于宏基因组学技术的病毒感染检测的内参、对照；

(4)生物信息学分析：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成；

其中，(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：

a.样本取样：首先从住院病人分别诊断为慢阻肺病人和过敏病人，肺出血病人及肺癌病人取咽试子快速保存在3ml病毒采集管中，震荡30s，

b.样本细胞裂解和离心：取步骤a样本各400μl，15000rpm，4℃，离心10min，取上清到另一1.5ml的EP管中，沉淀中加500μl无RNA酶的纯水，15000rpm，4℃，离心10min，取上清与第一次上清合并，

c.样本浓缩：取上清800-850μl，用0.22μm滤膜过滤至洁净EP管中，再加入到2ml超滤管中，4000g，4℃，离心10min，离心浓缩样品40-50μl，

d.样本宿主游离核酸去除：上述40-50μl浓缩样品管中加入DNA clean XP和RNA cleanXP磁珠各50μl，冰上5min，用磁力架吸弃磁珠，取上清114μl，

e.样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸

然后在37℃，消化30min，

f.提取病毒核酸RNA：用QIAGEN公司的QIamp viral RNA miniKit提取RNA病毒的核酸包括RNA，用30μl AVE洗脱样品中的病毒RNA，操作方法如下：

1)取560μL Buffer AVL-carrier RNA加入到140μL/管的样液中，涡旋15s，

2)室温静置10min，瞬时离心，便于盖上液体回流到管底，

3)加入560μL无水乙醇，涡旋15s，瞬时离心，

4)取630μL样液加入column中，离心1min，8000rpm，将- column放入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管，

5)再取余下630μL样液加入column中，离心1min，8000rpm，将- column放入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管，

6)加入AW1，500μL/管，离心1min，8000rpm，将- column放入洁净2ml收集管中，弃去含滤液旧收集管，

7)加入AW2，500μL/管，离心3min，13000rpm，

8)空离1min，13000rpm，

9)将- column放入洁净1.5ml EP管中，加入AVE 30μL/管，离心1min，8000rpm，于-80℃低温保存样品，

g.逆转录合成cDNA：将上步提取出来的病毒RNA转化成更稳定更易保存的cDNA，用superscript^TM IV First-strand synthesis system合成cDNA，方法如下：

1)先合成一链：

2)混合并短暂离心，

3)RNA-引物混合物在65℃加热5分钟，然后在冰上孵育至少1分钟，

4)涡旋并短暂离心5×SSIV缓冲液，

5)将以下组分混合在上述反应管中，共计20μL

6)盖上管子，混合，然后短暂离心内容物，

7)反应混合物在23℃下孵育10分钟，50-55℃孵育10分钟，80℃下孵育10分钟使反应失活，4℃冷却1分钟，

8)采用Klenow完成上述cDNA第二链的合成，

95℃，2min，4℃2分钟，在上述体系加入1μl 3’-5’exo-Klenow DNA聚合酶，混匀，执行下列程序：37℃，60s；75℃，10min，

h.非序列依赖性扩增：

PCR反应体系：用Takala的green MIX，

将上述PCR反应体系放入PCR仪，执行下列PCR反应程序：

*依据核酸的量，决定循环次数，第g步获得的cDNA- 用非序列依赖性引物进行少许扩增，直到满足下一步高通量测序样本建库所要求的上样量200pg，

I.病毒核酸纯化：纯化第g步或第h步获得的病毒核酸用于后续的测序前的文库构建和验证准备，使用QIAGEN-PCR回收试剂盒，按说明进行。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(3)高通量测序：

根据病毒检测长度的需求，选择二代测序或三代测序，a、进行二代测序选步骤(2)片段化文库直接进行测序，b、进行三代测序，直接用步骤(1)样本直接进行三代测序。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(3)高通量测序：

上述PCR产物用Qubit荧光定量，上机测序前稀释成200pg/μl纯化样品，使用Agilent2100跑胶，初步判定目标片段的浓度及量的大小，并调整至适宜的二代测序浓度范围，

Agilent 2100芯片加样步骤：

1)使用前，让凝胶—染料混合物平衡至室温30分钟，

2)在卡位C处放置一个新的高灵敏度DNA芯片，

3)移取9μL凝胶染料混合物在标记的孔中，

4)确保柱塞位于1mL处，然后关闭芯片灌注器，

5)按下柱塞，直至其被夹子固定，

6)等待60秒然后释放，

7)等待5秒钟，然后慢慢将柱塞拉回1mL位置，

8)打开芯片灌注器，在标记的孔中加入9μL凝胶染料混合物，

9)在所有样品和梯孔中加入5μL标记物，

10)移取1μL高灵敏度DNA梯在标记的孔中，

11)在11个样品孔的每一个中，加入1μL样品，未使用的标记孔加入1μL Marker，

12)将芯片水平放入适配器中，并在2400rpm下涡旋1分钟，

13)在5分钟内在Agilent 2100生物分析仪中运行芯片，

取1μl 200pg上述样本，Illumina公司的试剂盒，NexteraXT DNA样本kit，和NexteraXTindex kit使核酸片段化和加接头：操作按说明书，

上述纯化的文库用Angilent2100电泳进行验证，使文库在300-700bp之间。

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