CN111139315A - 一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，为解决实时定量PCR法检测会导致大量“假阴性”病例出现的问题，以及流行病疫情爆发时对于大样本量检测的需求，本发明提出了一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法及其这种检测方法在呼吸道病毒感染上的应用，检测方法包括：获取样本并收集于含有RNA保护液的试管中；用RNA提取试剂盒提取RNA，利用一步法进行RNA逆转录及特定区域核酸的富集；一步法建立DNA文库并质检；进行二代测序；利用生物信息学技术对序列进行分析。检测方法具有高精度，高敏感性，高通量，快速检测的优势。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用。
背景技术
呼吸道病毒感染是引发流感的常见因素，某些病毒如SARS，MERS， 2019-nCoV等，由于其传播能力强，致病力强，甚至具有高死亡率的特点，对健康及社会公共危害性非常大。不同类型的流感病程发展不尽相同，对于不同类型的流感防治也截然不同，如何做到早发现，早诊断，早隔离，早治疗是防疫和治疫的重点。
不同流感的诊断标准是不同的，以2019-nCoV为例，目前的诊断标准是，有流行病学史，临床表现(呼吸道症状，影像学特征，白细胞数变化)，核酸检测阳性。常见的流感通过及时治愈一般不会发展为肺炎，而且传播能力相对较差，而上述恶性流感病毒的感染者往往具有很强的传播性，可以快速的发生严重的肺部病变，当CT检测已发现病灶时，患者病情往往已经比较严重，而且可能由于隔离及防护不及时，病原已大量传播。核酸检测，从原理上讲，是要比CT敏感和精确的，但是目前的实时定量PCR法由于本身的技术性限制以及其他多方面因素，会导致大量“假阴性”病例出现，其后果可导致确诊和治疗的延误，并且由于“核酸检测两次阴性”为治愈指标，很可能会导致非痊愈病人病情的反复以及更多的病原扩散。另一方面，随着疫情的发展，可疑病例也会不断增多，利用常规的RT-PCR方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。因此，如何有效利用核酸检测的手段快速高效高通量且准确判断感染情况是迫切需要解决的问题。
二代高通量测序，近年来作为一种高通量高精度的核酸检测手段，逐渐成为临床诊断的重要手段，在孕产前中期，肿瘤早筛与治疗，遗传病检测与治疗，以及其他疾病的早筛领域发挥着巨大的作用。而对于呼吸道病毒感染的诊断，目前鲜有临床应用。一方面，普通流感致病性及死亡率低，且有较好的治疗方法，另一方面，传统的PCR或一代测序成本较低，因此对于二代测序进行流感诊断的研究并不多见，也未市场化。但是在没有有效疫苗及有效治疗方法的情况下，当重大疫情的发生时，大范围的筛查就显得至关重要了，二代测序技术便能够很好的应用于该领域。
发明内容
为解决实时定量PCR法检测会导致大量“假阴性”病例出现的问题，以及流行病疫情爆发时对于大样本量检测的需求，本发明提出了一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法及其这种检测方法在呼吸道病毒感染上的应用，检测方法具有高精度，高敏感性，高通量，快速检测的优势。
本发明通过以下技术方案实现：利用PCR与二代测序相结合的办法，通过对引物的创新性设计，先富集再测序，具有高精度(可以通过吻合序列提高特异性)，高敏感性(可检测到最低1000病毒拷贝/毫升，有利于早发现早诊断)，高通量(一次性可完成5000个病例的检测，可用于早期大量筛查以及流行病大样本研究)的优势。全部设计均用96孔板进行，因此可以通过全自动手段完成从核酸提取到建库的全部过程，从而避免对操作人员的污染和对环境污染的控制。
一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，如图1所示，包括以下步骤：
1、一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，所述的检测方法为以下步骤：
(1)取样、分组、进行孔板编码，
样本选自鼻咽或口咽吸痰或冲洗液、鼻咽或口咽拭子、气管吸痰和痰液、支气管肺泡灌洗液中的一种，然后收集含有RNA保护液的试管中。
具体步骤为：
(1.1)鼻拭子：将1根拭子插入鼻腭处，转动后小心取出，取另一拭子以同样方法取另一侧鼻孔。将拭子头浸入采样管中。
咽拭子：受试者张大嘴，用拭子擦拭扁桃体及咽喉壁，将拭子头浸入含采样管中。
深咳痰液：受试者深咳，将咳出的痰液收集于含采样管中。
支气管及肺泡灌洗液：通过纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，注入灭菌生理盐水，每次10-30ml，收集抽取的粘液，反复进行两次。
(1.2)核酸提取前处理
鼻咽拭子：将拭子剪断，放入2.0ml试管中，加入400μl PBS中，剧烈震荡后取200μl上清样本进行提取。
深咳痰液及灌洗液：取200μl样本，加入200μl痰液液化剂，按照说明书要求进行操作，取200μl上清进行提取。
作为优选，孔板有n个样本，n小于等于96，孔板上记录每个样本。更优选，按照Excle表格模式建立96孔板格式记录样本名称。
(2)按组提取RNA，转移进入孔板，选用PP1引物进行富集目的片段；
富集过程用于与目的片段的结合。本发明对富集目的片段引物的改造，在完成在富集的同时，加入样本标签，完成第一次“标记”，不同样本标签的数量n 为1-96个。
作为优选，用RNA提取试剂盒提取RNA，转移进入相应的孔板。
作为优选，利用一步法进行RNA逆转录及特定区域核酸的富集。采用每组内一对一的方式，选用PP1引物进行扩增，每组使用一次孔板。富集过程如图2 所示：
引物PP1用于第一轮PCR，即对目的核酸片段的富集，以及添加测序和分析所需的必要序列，PP1引物结构如下所示，将R1，BCT，FPT组合即可形成 PP1上游引物，将R2，RPT组合即可形成PP1下游引物。R1与R2为固定序列，不论病毒种类或是不同样本，都是通用的；BCT为样本标签，一个样本用一个标签，共96个标签，一次可用于1-96个样本；根据待测病毒的不同，FPT与 RPT设计为所检测病毒核酸序列中的特异性片段，需要单独设计的。该设计可省略常规文库制备中的全场cDNA构建，加A尾以及酶连接的步骤，大大节省了时间及试剂成本。
上游引物如图3所示，
下游引物如图4所示，
R1的序列选用：5′-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′，
BCT为组内对各样本的特异性标记，用于分析时区分组内样本；每个标签都不一样，只要满足8个碱基即可，序列顺序都是5’-3’。BCT功能类似于常规二代测序文库中的接头标签(index)，但由于在PP1引物中位置的设计位于R1 的3’端，而非5’端，使组内样本的预混合成为可能，大大减少文库扩增时的样本数量，从而节约了引物合成成本，反应试剂成本，时间成本，以及样本错配的可能。
FPT为目的片段的上游引物，与下游引物RPT结合可扩增出目的片段，长度为60-200碱基对。该目的片段为所检测病毒核酸序列中的某一具有特异性片段(即不会与其他病毒或物种吻合)。作为优选，FPT为目的片段的上游引物与下游引物设计多对，可提高准确性。
更优选，当检测2019-nCoV时，举例，选自以下3对FPT与RPT，
FPT-1 5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’
RPT-1 5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’
FPT-2 5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’
RPT-2 5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
FPT-3 5’-CACATTGGCACCCGCAATC-3’
RPT-3 5’-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3’
当检测SARS时，举例，选自以下3对FPT与RPT，
FPT-1 5’-CATGTGTGGCGGCTCACTATAT-3’
RPT-1 5’-GACACTATTAGCATAAGCAGTTGTAGCA-3’
FPT-2 5’-GGAGCCTTGAATACACCCAAAG-3’
RPT-2 5’-GCACGGTGGCAGCATTG-3’
FPT-3 5’-CAAACATTGGCCGCAAATT-3’
RPT-3 5’-CAATGCGTGACATTCCAAAGA-3’
当检测MERS-CoV时，举例，选自以下2对FPT与RPT，
FPT-1 5’-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3’
RPT-1 5’-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3’
FPT-2 5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’
RPT-2 5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’
R2的序列选用：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3’，
一个样本可使用2-3对用于富集的引物一次性完成扩增，一组内每个样本使用不同的BCT。
(3)分组纯化，定量，混合样本，形成样本池，再次纯化浓缩；
一组可完成n个样本的富集(n＜＝96)，每个富集的产物里有2-3个特异性片段，一组混合成一个样本池。经过纯化浓缩后的样本池体积变小，更适合于进入下一步反应。
作为该方法的优选方案一：在完成富集纯化后，做浓度检测，若浓度大于 1ng/μl，可在核酸片段检测仪器上检测片段大小，若片段大小符合预测大小，可初步判定受试者有感染可能，可在第一时间隔离。待后续进一步确认。从样本处理到获得浓度，最快可在12小时内完成。
作为该方法的优选方案二：建议使用全自动化液体工作站，对于大样本量的检测，以一台96样本的自动化液体工作站为例，对于200-500个样本，可在72 小时内完成全部分析。
(4)纯化后的样本池选用PP2引物进行扩增，再纯化，定量，混合所有样本池为一个终文库；
作为优选，一个样本池对应使用一对PP2引物。引物PP2用于文库扩增。PP2结构如下所示，将P5，R1P组合即可形成PP2上游引物，将P7，BCL，R2P 组合即可形成PP2下游引物。除BCL(文库标签)需要根据不同的样本池(目的片段富集后将一组样本混合所形成的样本池)更换外，其他部分为固定序列。不同的病毒检测，不需要重新设计该引物。
上游引物如图5所示，
下游引物如图6所示，
P5的序列选用：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3’
R1P的序列选用：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3’
P7的序列选用：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’
BCL为文库标签，可为8-96个，每个标签都不一样，只要满足6-8个碱基即可，
R2P的序列选用：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’
扩增的方法如下所示：R1与PP2中的R1P组合，该序列为二代测序过程中测序引物Read1的结合部位；R2与PP2中的R2P组合，该序列为二代测序过程中测序引物Read2的结合部位，同样也是二代测序过程中接头测序引物的结合部位，P5为二代测序时与测试仪芯片5端探针结合的序列，P7为二代测序时与测试仪芯片7端探针结合的序列，如图7所示：
BCL为各样本池的特异性标记，用于分析时区分各个样本池，功能与常规二代测序中的接头标签(index)相似，每个样本池用一个特异的BCL进行扩增。一次可完成m个样本池的扩增，每个样本池内有n个样本，混合m个样本池，最终产物有n乘以m个样本。
(5)对终文库进行测序，分析。
作为优选，利用生物信息学技术对序列进行分析。
本发明通过获取样本并收集于含有RNA保护液的试管中；用RNA提取试剂盒提取RNA，利用一步法进行RNA逆转录及特定区域核酸的富集；一步法建立DNA文库并质检；进行二代测序；利用生物信息学技术对序列进行分析。检测方法具有高精度，高敏感性，高通量，快速检测的优势。所述的利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法在呼吸道病毒检测上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通常情况下，常规的RNA文库构建的时间为8-10小时。本法为快速文库构建的方法，不需要酶切及末端修复，只需要两次PCR和纯化，从RNA到文库构建完成可在4小时内完成文库构建；
(2)通常情况下，常规文库标签可达到386个，即一次性测序386个样本。本法通过对引物的改造，可一次完成5000个样本的大样本量测序，从而大大节省时间及成本；
(3)对富集目的片段引物的改造，使得本方法可以灵活应用于不同的病毒检测，即只需为目的病毒重新设计引物，其他部分及条件可不做改变，可大量节省设计和合成成本；
(4)将多对特异性引物组合形成引物池，进行一次性PCR，在增加准确性的同时，节约人力，试剂及时间成本；
(5)简化定量后的文库归一(normalization)步骤，大大节省了人力及时间成本；
(6)对文库扩增引物的创新性改造，使得大量样本可以预先混合再进行扩增，而不必一一扩增文库，可以极大的简化操作流程，节约时间。扩增的同时加入第二次标签。根据第一次标签的数量n，选择第二次标签的数量m，保证n乘以m 不大于5000。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为本发明中富集过程示意图；
图3为引物PP1中上游引物示意图；
图4为引物PP1中下游引物示意图；
图5为引物PP2中上游引物示意图；
图6为引物PP2中下游引物示意图；
图7为本发明终文库构建示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料、材料、设备均可市购。
样本采集管选用任何已获得批准上市的临床样品采集管，如麦瑞科林；
RNA保护液选用任何已获得批准上市的，如Life technologies，RNAlater；
痰液液化剂选用任何已获得批准上市的，如博日公司；
RNA提取试剂盒选用任何已获得批准上市的，如Qiagen，
Viral RNAMicro Kit，
MinElute Virus Spin Kit or
Micro Kit；
一步法RT-PCR试剂盒选用任何已获得批准上市的，如ThermoFisher，SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System；
PCR仪选用如Bio-Rad，C1000；
引物可在引物公司合成，如Invitrogen，根据不同病例选择下列不同的引物池。
纯化磁珠选用如Beckman，AMPure XP beads；
75％乙醇选用如Sigma，Reagent Alcohol；
96孔板磁力架选用如Alpaqua，96孔超强力磁力架；
文库扩增酶选用如KPAP，2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix；
核酸片段检测仪器及配套试剂选用如Agilent，Bioanalyzer2100或
Tapestation4200；
文库定量仪器及配套试剂选用如ThermoFisher，VarioskanTMLUX多功能微孔板读数仪以及Quant-iTTMPicoGreenTMdsDNA Assay Kit；
PCR产物纯化试剂盒选用如OMEGA，PCR纯化试剂盒；
二代测序仪及配套试剂选用如Illumina，MiSeq或MiniSeq；
其他生化实验常备设备及耗材，如移液枪，试管等。
全自动化文库构建，可使用全自动化液体处理系统，如Beckman自动化液体处理工作站。
实施例1：以2019-nCoV为例
(1)采集标本及分组，每组96个样本(包括阳性及阴性对照)，在Excel表格内记录样本名称及其他信息。
鼻拭子：将1根拭子插入鼻腭处，转动后小心取出，取另一拭子以同样方法取另一侧鼻孔。将拭子头浸入采样管中。然后进行核酸提取前处理：将拭子剪断，放入2.0ml试管中，加入400μl PBS中，剧烈震荡后取200μl上清样本进行提取。
(2)RNA的提取：根据产品说明书进行提取。将RNA样本分装进入96孔板，每孔20μl。然后一步法富集核酸目的片段(以SuperScriptTMIII One-Step RT-PCR System试剂盒为例)：
(2.1)在PCR仪上设定如下程序。
| 程序 | 温度 | 时间 |
| 1 | 55℃ | 30min |
| 2 | 90℃ | 2min |
| 3 | 94℃ | 15s |
| 4 | 55℃ | 30s |
| 5 | 68℃ | 30s |
| 6 | 重复步骤3-5 | 49cycles |
| 7 | 68℃ | 5mm |
| 8 | 4℃ | 保持(直至下一步反应) |
(2.2)按照下表配置反应液于0.2ml PCR试管中，然后放入PCR仪中运行全部程序。
其中，引物PP1用于第一轮PCR，即对目的核酸片段的富集。引物结构如下，将R1，BCT，FPT组合即可形成上游引物，将R2，RPT组合即可形成下游引物。
R1的序列选用：5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
BCT为如下所示：
引物池中的3对FPT与RPT：
FPT-1 5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’
RPT-1 5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’
FPT-2 5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’
RPT-2 5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
FPT-3 5’-CACATTGGCACCCGCAATC-3’
RPT-3 5’-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3’
R2的序列选用：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
第一次富集后：
在样本1的引物池为以下引物的混合物，加粗部分为该样本区别于其他样本的标志。
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-TATAGCCT-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-TATAGCCT-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-TATAGCCT-CACATTGGCACCCGCAATC-3’
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3’
样本2的引物池为以下引物的混合物，加粗部分为该样本区别于其他样本的标志。
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-CTGAAGCT-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-CTGAAGCT-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-CTGAAGCT-CACATTGGCACCCGCAATC-3’
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3’
以此类推，用BCT序列一一更替上述引物池中的加粗部分，就可以合成为用于其他样本的引物池。按照上述方法，为了便于手动以及全自动化文库制备的使用，将该引物池储存于96孔板中。一个孔为一组特定BCT的引物池。
(3)产物纯化
将室温的纯化磁珠与上述产物按照1∶1的体积比混匀，室温静置5分钟。将试管放于96孔板磁力架上，静置5分钟。小心吸出上清，丢弃，避免触及磁珠，然后加入75％酒精，静置30秒；小心吸出上清，丢弃，避免触及磁珠，再次加入 75％酒精，静置30秒；小心吸出上清，避免触及磁珠，风干10分钟。加入22μl 水(无核酸酶)，室温静置5分钟。然后将试管放于96孔板磁力架上，静置5 分钟。小心吸出上清20μl，避免触及磁珠，将上清转移至新的96孔板中。
(3.1)产物浓度检测：以VarioskanTM LUX多功能微孔板读数仪以及 Quant-iTTMPicoGreen TM dsDNAAssay Kit为例，按照使用说明检测文库浓度。
检测时，若浓度大于1ng/μl，可在核酸片段检测仪器上检测片段大小，若片段大小符合预测大小，可初步判定受试者有感染可能，可在第一时间隔离。待后续进一步确认。
(3.2)若浓度大于1ng/μl，将该样本进行稀释，使其终浓度达到0.01ng/μl左右。稀释后，将每一组产物混合，每个产物取10μl加入1.5μl EP管中，用PCR产物试剂盒进行纯化，最后洗脱至50μl。
可在该步骤将所有产物储存于-20℃，待收集其所有待测样本后，一起进行下一步骤。
(4)文库扩增(以Kapa试剂为例)
(4.1)在PCR仪上设定如下程序。
(4.2)按照下表配置反应液，然后放入PCR仪中运行全部程序。
其中，引物PP2中将P5，R1P组合形成上游引物，将P7，BCL，R2P组合即可形成下游引物。
P5的序列选用：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3’
R1P的序列选用：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3’
P7的序列选用：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’
BCL为
R2P的序列选用：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’
结合上述序列，同一个样本池的BCL都是相同的。当对另一个样本池进行扩增时，则需要用另一个BCL。
样本池1的引物池为以下引物的混合物，加粗部分为该样本池区别于其他样本池的标志。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3’
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-CGCTACAT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’
样本池2的引物池为以下引物的混合物，加粗部分为该样本池区别于其他样本池的标志。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3’
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-AATCCAGC-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’
以此类推，用BCL序列一一更替上述引物中的加粗部分，就可以合成为用于其他样本池的引物对。
按照上述方法，为了便于手动以及全自动化文库制备的使用，将该引物池储存于96孔板中。一个孔为一个特定BCL的引物池。将该板命名为PP2。
(4.3)产物纯化
将室温的纯化磁珠与上述产物按照1∶1的体积比混匀，室温静置5分钟。将试管放于96孔板磁力架上，静置5分钟。小心吸出上清，丢弃，避免触及磁珠，然后加入75％酒精，静置30秒；小心吸出上清，丢弃，避免触及磁珠，再次加入 75％酒精，静置30秒；小心吸出上清，避免触及磁珠，风干10分钟。加入22μl 水(无核酸酶)，室温静置5分钟。然后将试管放于96孔板磁力架上，静置5 分钟。小心吸出上清20μl，避免触及磁珠，将上清转移至0.2ml PCR试管中。
(4.4)文库浓度检测：以VarioskanTM LUX多功能微孔板读数仪以及 Quant-iTTMPicoGreen TM dsDNAAssay Kit为例，按照使用说明检测文库浓度。
(4.5)文库片段大小检测：按照Agilent Bioanalyzer 2100或Tapestation 4200使用说明检测文库片段大小。
(4.6)稀释文库至测序要求浓度。
(5)测序，按照Illumina MiSeq或MiniSeq使用说明进行。
数据分析：利用BCL序列，先解离出每组样本池数据。再利用BCT序列，解离出每组样本池中每个样本的数据。每个样本应获得20000000/(n*m)的序列读数量，以5000个样本为例，每个样本将获得平均4000个序列。但由于每个样本的病毒拷贝数不同，其序列数会有不同。
实施例1利用二代测序高通量检测2019新型冠状病毒等呼吸道病毒的方法具有高精度(可以通过吻合序列提高特异性)，高敏感性(有利于早发现早诊断)，高通量(一次性可完成5000个左右病例的检测，可用于早期大量筛查以及流行病大样本研究)的优势，并可以通过全自动手段从核酸提取到建库的全部过程，从而避免对操作人员的污染和对环境污染的控制。
Claims (10)
1.一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，所述的检测方法为以下步骤：
(1)取样、分组、孔板编码；
(2)按组提取RNA，转移进入孔板，选用PP1引物进行富集目的片段；
(3)分组纯化，定量，混合样本，形成样本池，再次纯化浓缩；
(4)纯化后的样本池选用PP2引物进行扩增，再纯化，定量，混合所有样本池为一个终文库；
(5)对终文库进行测序，分析。
2.根据权利要求1所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，步骤(1)样本选自鼻咽或口咽吸痰或冲洗液、鼻咽或口咽拭子、气管吸痰和痰液、支气管肺泡灌洗液中的一种，然后收集含有RNA保护液的试管中。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，分组中每组小于等于96个样本，建立孔板与样本相对应进行编码。
4.根据权利要求1所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，步骤(2)利用一步法进行RNA逆转录及特定区域核酸的富集。
5.根据权利要求1或4所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，PP1引物结构包括：将R1，BCT，FPT组合形成的上游引物，将R2，RPT组合形成的下游引物。
6.根据权利要求5所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，FPT、RPT设计为所检测病毒核酸序列中的特异性片段。
7.根据权利要求1所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，步骤(3)在完成富集纯化后，做浓度检测，若浓度大于1ng/μl，可在核酸片段检测仪器上检测片段大小，若片段大小符合预测大小，判定受试者有感染可能。
8.根据权利要求1所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，步骤(4)中引物PP2结构包括：P5，R1P组合形成的上游引物，P7，BCL，R2P组合形成的下游引物。
9.根据权利要求1或8所述的一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，其特征在于，步骤(4)扩增的方法：将R1与PP2中的R1P组合，R2与PP2中的R2P组合，P5为二代测序时与测试仪芯片5端探针结合的序列，P7为二代测序时与测试仪芯片7端探针结合的序列。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法在呼吸道病毒检测上的应用。
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