CN108359665A - 一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组dna的提取方法 - Google Patents

一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组dna的提取方法 Download PDF

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张哲�
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Abstract

本发明公开了一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒，步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒。本发明通过优化其提取实验步骤和流程从而获取到高纯度、高完整性的高分子量DNA片段，可以满足下游Long‑read测序的需要，DNA无RNA和蛋白污染，DNA片段完整性高，无降解，单个样本提取时间要比常规提取时间短一些，而且也可以进行多个样本的提取，且提取时间并不会增加很多，DNA分子在45kb以上，最大达到130kb左右，结果非常好，完全适合Long‑read测序技术。

Description

一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取 方法
技术领域
本发明涉及DNA提取领域，特别涉及一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展，Long-read(长读长)测序技术愈发受到科学界的青睐，许多Long-read测序平台如PacBio公司的sequel系统、Oxford nanopore公司的MinION和GridION系统均在最前沿的基因测序领域如基因组de novo、变异检测、转录组、表观遗传、临床应用中均扮演了重要的角色。而这些Long-read测序平台因为测序读长长的原因，也对基因组DNA提取提出了更高的要求。研究人员不仅要保证基因组DNA的得率和纯度，还需要获得更完整的高分子量的基因组DNA以满足下游Long-read测序技术的需求，从而在基础科研及医学应用上获得更可靠的技术支持。
目前针对人血液基因组DNA提取主要分为试剂盒提取和传统的酚氯仿抽提。前者虽然提取便捷，但很难获得高分子量的DNA，所提取出来的DNA分子通常在20kb左右，在Long-read测序应用中差强人意。而传统的酚氯仿抽提方法不仅耗时耗力，还含有有毒成分，存在安全隐患，且也较难提取到40kb 以上的高分子量的DNA。2012年，Zhang.et al(Zhang.et al.Preparation of megabase-sized DNA from a variety of organismsusing the nuclei method for advanced genomics research.[J].Nature Protocols,2012, 7(3):467-78.)发表了一篇利用细胞核分离的方法进行高分子量基因组DNA 的提取，但是该方法具有两个缺陷。首先，该方法可以提取出来1000kb的超高分子量DNA，但是目前的Long-read测序平台并不需要这么大的基因组DNA， 100kb已是其极限，过长的DNA片段反而会成为现有测序技术的负担。另外，该方法提取制备DNA需要3天的时间，非常耗时耗力。因此该方法并不适合目前的测序领域。
因此，发明一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组 DNA的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒；
步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒；(b)立即加入200ul AL，迅速震荡混匀，如果样本量过多，必须单独进行加样以及AL 的加入，尽量缩短加液和震荡混匀之间的时间间隔；(c)震荡混匀后，放到掌式离心机上短离1秒，进行温浴，温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地 180°颠倒混匀3-5次，不要进行离心，放回继续温浴即可；(d)温浴后，加入400ulbuffer BD和20ul MagBind Particle，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20-30次，室温静置3分钟，期间再轻轻地颠倒混匀数次；(e)静置后，将离心管短离0.5秒，只需要将管盖和管壁上的液体离心下去即可，尽量不要让离心机速度完全升上来；
步骤三：磁珠结合：将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉；
步骤四：高盐溶液洗涤三次：加入800ul的BW1buffer，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1buffer完全清洗离心管的内部(包括管盖)， 180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，该步骤中所有的动作需要温柔，且加液的时候不要碰到磁珠，再重复上述步骤两次；
步骤五：乙醇洗涤三次：加入800ul的乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使乙醇完全清洗离心管的内部(包括管盖)，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再重复上述步骤两次；
步骤六：DNA回溶：(a)将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3 次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响；(b)将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5-10分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发；另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干；(c) 将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，进行温浴，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀；(d)将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内。
优选的，所述步骤二的(b)中200ul AL迅速震荡时间≤5秒。
优选的，所述步骤二的(c)中温浴温度设置为70℃，所述温浴时间设置为10分钟。
优选的，所述步骤五中乙醇浓度设置为75％。
优选的，所述步骤六中温浴温度设置为60℃，所述温浴时间设置为5分钟。
本发明的技术效果和优点：通过优化其提取实验步骤和流程从而获取到高纯度、高完整性的高分子量DNA片段，可以满足下游Long-read测序的需要，该检测方法针对高分子量DNA提取的，采用此方法提取结果良好；DNA无 RNA和蛋白污染，DNA片段完整性高，无降解；单个样本提取时间要比常规提取时间短一些，而且也可以进行多个样本的提取，且提取时间并不会增加很多；DNA分子在45kb以上，最大达到130kb左右，结果非常好，完全适合Long-read测序技术。
附图说明
图1为本发明DNA提取波纹示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒；
步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒；(b)立即加入200ul AL，迅速震荡混匀，时间≤5秒，如果样本量过多，必须单独进行加样以及AL的加入，尽量缩短加液和震荡混匀之间的时间间隔；(c)震荡混匀后，放到掌式离心机上短离1秒，进行温浴，温浴温度设置为70℃，温浴时间设置为10分钟，温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3次，不要进行离心，放回继续温浴即可；(d)温浴后，加入400ul buffer BD和20ul MagBind Particle，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20次，室温静置 3分钟，期间再轻轻地颠倒混匀数次；(e)静置后，将离心管短离0.5秒，只需要将管盖和管壁上的液体离心下去即可，尽量不要让离心机速度完全升上来；
步骤三：磁珠结合：将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉；
步骤四：高盐溶液洗涤三次：加入800ul的BW1buffer，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1buffer完全清洗离心管的内部(包括管盖)， 180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，该步骤中所有的动作需要温柔，且加液的时候不要碰到磁珠，再重复上述步骤两次；
步骤五：乙醇洗涤三次：加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部(包括管盖)，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再重复上述步骤两次；
步骤六：DNA回溶：(a)将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3 次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响；(b)将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发；另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干；(c) 将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，进行温浴，温浴温度设置为60℃，温浴时间设置为5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀；(d)将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内。
实施例2：
本发明提供了一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒；
步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒；(b)立即加入200ul AL，迅速震荡混匀，时间≤5秒，如果样本量过多，必须单独进行加样以及AL的加入，尽量缩短加液和震荡混匀之间的时间间隔；(c)震荡混匀后，放到掌式离心机上短离1秒，进行温浴，温浴温度设置为70℃，温浴时间设置为10分钟，温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀4次，不要进行离心，放回继续温浴即可；(d)温浴后，加入400ul buffer BD和20ul MagBind Particle，轻轻缓慢地180°颠倒混匀25次，室温静置 3分钟，期间再轻轻地颠倒混匀数次；(e)静置后，将离心管短离0.5秒，只需要将管盖和管壁上的液体离心下去即可，尽量不要让离心机速度完全升上来；
步骤三：磁珠结合：将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉；
步骤四：高盐溶液洗涤三次：加入800ul的BW1buffer，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1buffer完全清洗离心管的内部(包括管盖)，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，该步骤中所有的动作需要温柔，且加液的时候不要碰到磁珠，再重复上述步骤两次；
步骤五：乙醇洗涤三次：加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部(包括管盖)，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再重复上述步骤两次；
步骤六：DNA回溶：(a)将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3 次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响；(b)将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干7.5分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发；另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干；(c) 将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，进行温浴，温浴温度设置为60℃，温浴时间设置为5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀；(d)将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的 1.5ml离心管内。
实施例3：
本发明提供了一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒；
步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒；(b)立即加入200ul AL，迅速震荡混匀，时间≤5秒，如果样本量过多，必须单独进行加样以及AL的加入，尽量缩短加液和震荡混匀之间的时间间隔；(c)震荡混匀后，放到掌式离心机上短离1秒，进行温浴，温浴温度设置为70℃，温浴时间设置为10分钟，温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀5次，不要进行离心，放回继续温浴即可；(d)温浴后，加入400ul buffer BD和20ul MagBind Particle，轻轻缓慢地180°颠倒混匀30次，室温静置 3分钟，期间再轻轻地颠倒混匀数次；(e)静置后，将离心管短离0.5秒，只需要将管盖和管壁上的液体离心下去即可，尽量不要让离心机速度完全升上来；
步骤三：磁珠结合：将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉；
步骤四：高盐溶液洗涤三次：加入800ul的BW1buffer，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1buffer完全清洗离心管的内部(包括管盖)， 180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，该步骤中所有的动作需要温柔，且加液的时候不要碰到磁珠，再重复上述步骤两次；
步骤五：乙醇洗涤三次：加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部(包括管盖)，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再重复上述步骤两次；
步骤六：DNA回溶：(a)将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3 次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响；(b)将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干10分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发；另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干；(c) 将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，进行温浴，温浴温度设置为60℃，温浴时间设置为5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀；(d)将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的 1.5ml离心管内。
根据实施例1-3得知：对于200ul起始量的人血液样本来说，该得率并不高，但考虑到该方法是针对高分子量DNA提取的，因此提取结果良好，DNA 无RNA和蛋白污染，DNA片段完整性高，无降解，DNA提取时间为40-50分钟，单个样本提取时间要比常规提取时间短一些，而且也可以进行多个样本的提取，且提取时间并不会增加很多，DNA分子在45kb以上，最大达到130kb左右，结果非常好，完全适合Long-read测序技术，参照图1。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒；
步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒；(b)立即加入200ul AL，迅速震荡混匀，如果样本量过多，必须单独进行加样以及AL的加入，尽量缩短加液和震荡混匀之间的时间间隔；(c)震荡混匀后，放到掌式离心机上短离1秒，进行温浴，温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3-5次，不要进行离心，放回继续温浴即可；(d)温浴后，加入400ul buffer BD和20ul MagBind Particle，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20-30次，室温静置3分钟，期间再轻轻地颠倒混匀数次；(e)静置后，将离心管短离0.5秒，只需要将管盖和管壁上的液体离心下去即可，尽量不要让离心机速度完全升上来；
步骤三：磁珠结合：将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉；
步骤四：高盐溶液洗涤三次：加入800ul的BW1buffer，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1buffer完全清洗离心管的内部(包括管盖)，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，该步骤中所有的动作需要温柔，且加液的时候不要碰到磁珠，再重复上述步骤两次；
步骤五：乙醇洗涤三次：加入800ul的乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使乙醇完全清洗离心管的内部(包括管盖)，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再重复上述步骤两次；
步骤六：DNA回溶：(a)将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响；(b)将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5-10分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发；另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干；(c)将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，进行温浴，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀；(d)将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内。
2.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤二的(b)中200ul AL迅速震荡时间≤5秒。
3.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤二的(c)中温浴温度设置为70℃，所述温浴时间设置为10分钟。
4.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤五中乙醇浓度设置为75％。
5.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤六中温浴温度设置为60℃，所述温浴时间设置为5分钟。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106567133A (zh) * 2016-11-09 2017-04-19 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种宏转录组文库的建库方法
CN106701740A (zh) * 2016-12-06 2017-05-24 上海芯超生物科技有限公司 一种基因组dna提取试剂盒及提取方法

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Title
MAGEN公司: "MagPure Tissue&Blood DNA LQ Kit说明书", 《MAGPURE TISSUE&BLOOD DNA LQ KIT说明书》 *

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