CN108220285A - 一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，具体提取方法如下：步骤一：组织样本：取适量的人或动物组织样本，并且用剪刀剪碎，转移至一个干净的1.5ml离心管，加入30ul Proteinase K和300ul Buffer ATL，剧烈震荡10秒使之混匀；步骤二：消化：温浴30‑60分钟，温浴后，如果还有未消化完全的样本，用吸头将其挑出丢弃，并且加入300ul AL，迅速震荡混匀。本发明所提供的提取方法单个样本提取时间要比常规提取时间短一些，而且也可以进行多个样本提取，且提取时间并不会增加很多，从而大大提高了DNA提取效率，且所提取的DNA分子量主片段在75kb左右，完全符合Long‑read测序技术，从而减少了因DNA片段过大，使Long‑read测序技术负担过高。
Description
技术领域
本发明涉及高通量DNA测序技术领域，特别涉及一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展，Long-read(长读长)测序技术愈发受到科学界的青睐，许多Long-read测序平台如PacBio公司的sequel系统、Oxford nanopore公司的MinION和GridION系统均在最前沿的基因测序领域如基因组de novo、变异检测、转录组、表观遗传、临床应用中均扮演了重要的角色。而这些Long-read测序平台因为测序读长长的原因，也对基因组DNA提取提出了更高的要求。研究人员不仅要保证基因组DNA的得率和纯度，还需要获得更完整的高分子量的基因组DNA以满足下游Long-read测序技术的需求，从而在基础科研及医学应用上获得更可靠的技术支持。
目前针对人组织样本基因组DNA提取主要分为试剂盒提取和传统的酚氯仿抽提。前者虽然提取便捷，但很难获得高分子量的DNA，所提取出来的DNA分子通常在20kb左右，在Long-read测序应用中差强人意。而传统的酚氯仿抽提方法不仅耗时耗力，还含有有毒成分，存在安全隐患，且也较难提取到40kb以上的高分子量的DNA。2012年，Zhang.et al(Zhang.et al.Preparation of megabase-sized DNA from a variety of organismsusing the nuclei method for advanced genomics research.[J].Nature Protocols,2012,7(3):467-78.)发表了一篇利用细胞核分离的方法进行高分子量基因组DNA的提取，但是该方法具有两个缺陷。首先，该方法可以提取出来1000kb的超高分子量DNA，但是目前的Long-read测序平台并不需要这么大的基因组DNA，100kb已是其极限，过长的DNA片段将成为目前测序技术的负担。另外，该方法提取制备DNA需要3天的时间，非常耗时耗力。因此该方法并不适合目前的测序领域。
综上，如何利用现有的DNA提取技术，优化出一个更加经济、快捷、高效且合适的人组织样本基因组高分子量基因组DNA提取技术是目前高通量测序领域迫切需要解决的问题之一。因此，发明一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，具体提取方法如下：
步骤一：组织样本：取适量的人或动物组织样本，并且用剪刀剪碎，转移至一个干净的1.5ml离心管，加入30ul Proteinase K(蛋白酶K)和300ul Buffer ATL(缓冲液ATL)，剧烈震荡10秒使之混匀，再执行步骤二；
步骤二：消化：在步骤一执行之后，温浴30-60分钟，温浴后，如果还有未消化完全的样本，用吸头将其挑出丢弃，并且加入300ul AL，迅速震荡混匀，再执行步骤三；
步骤三：细胞裂解：在步骤二执行之后，将制得的样本放到掌式离心机上短离1秒，温浴10分钟，然后加入600ul Buffer BD(缓冲液BD)和30ulMagBind Particle(粒子)，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20-30次，室温静置3分钟，期间轻轻地颠倒混匀数次，然后再将离心管短离0.5秒，再执行步骤四；
步骤四：磁珠结合：在步骤三执行之后，将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉，再执行步骤五；
步骤五：高盐溶液洗涤：在步骤四执行之后，加入800ul的BW1Buffer(缓冲器BW1)，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1Buffer(缓冲器BW1)完全清洗离心管的内部，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再执行步骤六；
步骤六：乙醇洗涤：在步骤五执行之后，加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再执行步骤七；
步骤七：DNA回溶：在步骤六执行之后，将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3次，每次0.5秒，再将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5-10分钟，再将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，放到60℃温浴5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀，将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内，分别进行Qubit和FA-50kb kit检测，再执行步骤八；
步骤八：DNA预存：在步骤七执行之后，提取后的DNA溶液需要在低温中保存，如果冻存后取用，必须待其室温溶解后轻弹混匀，不可剧烈震荡使DNA断裂。
优选的，步骤一中人或动物组织样本取量为30mg-50mg，剪刀为灭菌后干净的剪刀。
优选的，步骤二中温浴温度为55℃，并且在温浴期间每隔5分钟取出轻轻地颠倒混匀，迅速震荡混匀不得超过5秒。
优选的，步骤三中温浴温度设置为70℃，且温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3-5次，不要进行离心，然后放回继续温浴即可。
优选的，步骤四中弃掉的废液通过回收装置集中回收。
优选的，步骤五中所有的动作需要温柔，且在加液的时候不要碰到磁珠，且步骤五需重复两次。
优选的，步骤六中所有步骤重复两次。
优选的，步骤七中每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发，另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干。
优选的，步骤八中低温为-20℃。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明所提供的提取方法DNA浓度和总量在200ul起始量的人血样本来说，浓度可达到110n/ul，总量可达到1.1ug，与现有的提取技术相比，大大提高了浓度和总量的百分率；
2、本发明所提供的提取方法所提取的DNA中无RNA和蛋白污染，从而大大提高了DNA纯度；
3、本发明所提供的提取方法所提取的DNA中虽有小片段降解，但在做测序前建库时会把小片段去除，并无影响，从而保证了DNA片段的完整性；
4、本发明所提供的提取方法单个样本提取时间要比常规提取时间短一些，而且也可以进行多个样本提取，且提取时间并不会增加很多，从而大大提高了DNA提取效率；
5、本发明所提供的提取方法所提取的DNA分子量主片段在75kb左右，完全符合Long-read测序技术，从而减少了因DNA片段过大，使Long-read测序技术负担过高。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，具体提取方法如下：
步骤一：组织样本：取30mg-50mg的人或动物组织样本，并且用灭菌后干净的剪刀剪碎，转移至一个干净的1.5ml离心管，加入30ul Proteinase K(蛋白酶K)和300ul BufferATL(缓冲液ATL)，剧烈震荡10秒使之混匀，再执行步骤二；
步骤二：消化：在步骤一执行之后，在温浴温度为55℃时温浴30-60分钟，并且在温浴期间每隔5分钟取出轻轻地颠倒混匀，迅速震荡混匀不得超过5秒，温浴后，如果还有未消化完全的样本，用吸头将其挑出丢弃，并且加入300ul AL，迅速震荡混匀，再执行步骤三；
步骤三：细胞裂解：在步骤二执行之后，将制得的样本放到掌式离心机上短离1秒，在温浴温度为70℃时温浴10分钟，且温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3-5次，不要进行离心，然后放回继续温浴即可，然后加入600ul Buffer BD(缓冲液BD)和30ul MagBind Particle(粒子)，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20-30次，室温静置3分钟，期间轻轻地颠倒混匀数次，然后再将离心管短离0.5秒，再执行步骤四；
步骤四：磁珠结合：在步骤三执行之后，将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉，并且通过回收装置集中回收，再执行步骤五；
步骤五：高盐溶液洗涤：在步骤四执行之后，在动作温柔，且在加液的时候不要碰到磁珠的情况下，加入800ul的BW1Buffer(缓冲器BW1)，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1Buffer(缓冲器BW1)完全清洗离心管的内部，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再执行步骤六；
步骤六：乙醇洗涤：在步骤五执行之后，加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再执行步骤七；
步骤七：DNA回溶：在步骤六执行之后，将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响，再将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5-10分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发，另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干，再将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，放到60℃温浴5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀，将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内，分别进行Qubit和FA-50kb kit检测，再执行步骤八；
步骤八：DNA预存：在步骤七执行之后，提取后的DNA溶液需要在-20℃低温中保存，如果冻存后取用，必须待其室温溶解后轻弹混匀，不可剧烈震荡使DNA断裂。
实施例2：一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，具体提取方法如下：
步骤一：组织样本：取30mg-50mg的人或动物组织样本，并且用灭菌后干净的剪刀剪碎，转移至一个干净的1.5ml离心管，加入30ul Proteinase K(蛋白酶K)和300ul BufferATL(缓冲液ATL)，剧烈震荡10秒使之混匀，再执行步骤二；
步骤二：消化：在步骤一执行之后，在温浴温度为55℃时温浴30-60分钟，并且在温浴期间每隔5分钟取出轻轻地颠倒混匀，迅速震荡混匀不得超过5秒，温浴后，如果还有未消化完全的样本，用吸头将其挑出丢弃，并且加入300ul AL，迅速震荡混匀，再执行步骤三；
步骤三：细胞裂解：在步骤二执行之后，将制得的样本放到掌式离心机上短离1秒，在温浴温度为70℃时温浴10分钟，且温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3-5次，不要进行离心，然后放回继续温浴即可，然后加入600ul Buffer BD(缓冲液BD)和30ul MagBind Particle(粒子)，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20-30次，室温静置3分钟，期间轻轻地颠倒混匀数次，然后再将离心管短离0.5秒，再执行步骤四；
步骤四：磁珠结合：在步骤三执行之后，将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉，并且通过回收装置集中回收，再执行步骤五；
步骤五：高盐溶液洗涤：在步骤四执行之后，在动作温柔，且在加液的时候不要碰到磁珠的情况下，加入800ul的BW1Buffer(缓冲器BW1)，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1Buffer(缓冲器BW1)完全清洗离心管的内部，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，而且所有步骤均重复两次，再执行步骤六；
步骤六：乙醇洗涤：在步骤五执行之后，加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，而且所有步骤均重复两次，再执行步骤七；
步骤七：DNA回溶：在步骤六执行之后，将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响，再将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5-10分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发，另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干，再将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，放到60℃温浴5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀，将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内，分别进行Qubit和FA-50kb kit检测，再执行步骤八；
步骤八：DNA预存：在步骤七执行之后，提取后的DNA溶液需要在-20℃低温中保存，如果冻存后取用，必须待其室温溶解后轻弹混匀，不可剧烈震荡使DNA断裂。
结合实施例1和实施例2可知，当在所有条件相同的情况下，高盐溶液和乙醇溶液在对样本进行三次洗涤时，所提取的DNA质量和纯度均比进行一次洗涤效果好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，具体提取方法如下：
步骤一：组织样本：取适量的人或动物组织样本，并且用剪刀剪碎，转移至一个干净的1.5ml离心管，加入30ul Proteinase K(蛋白酶K)和300ul Buffer ATL(缓冲液ATL)，剧烈震荡10秒使之混匀，再执行步骤二；
步骤二：消化：在步骤一执行之后，温浴30-60分钟，温浴后，如果还有未消化完全的样本，用吸头将其挑出丢弃，并且加入300ul AL，迅速震荡混匀，再执行步骤三；
步骤三：细胞裂解：在步骤二执行之后，将制得的样本放到掌式离心机上短离1秒，温浴10分钟，然后加入600ul Buffer BD(缓冲液BD)和30ul MagBind Particle(粒子)，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20-30次，室温静置3分钟，期间轻轻地颠倒混匀数次，然后再将离心管短离0.5秒，再执行步骤四；
步骤四：磁珠结合：在步骤三执行之后，将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉，再执行步骤五；
步骤五：高盐溶液洗涤：在步骤四执行之后，加入800ul的BW1 Buffer(缓冲器BW1)，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1 Buffer(缓冲器BW1)完全清洗离心管的内部，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再执行步骤六；
步骤六：乙醇洗涤：在步骤五执行之后，加入800ul的75％乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使75％乙醇完全清洗离心管的内部，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再执行步骤七；
步骤七：DNA回溶：在步骤六执行之后，将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3次，每次0.5秒，再将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5-10分钟，再将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，放到60℃温浴5分钟，温浴期间，每隔1-2分钟取出轻弹混匀，将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内，分别进行Qubit和FA-50kb kit检测，再执行步骤八；
步骤八：DNA预存：在步骤七执行之后，提取后的DNA溶液需要在低温中保存，如果冻存后取用，必须待其室温溶解后轻弹混匀，不可剧烈震荡使DNA断裂。
2.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤一中人或动物组织样本取量为30mg-50mg，剪刀为灭菌后干净的剪刀。
3.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤二中温浴温度为55℃，并且在温浴期间每隔5分钟取出轻轻地颠倒混匀，迅速震荡混匀不得超过5秒。
4.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤三中温浴温度设置为70℃，且温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3-5次，不要进行离心，然后放回继续温浴即可。
5.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤四中弃掉的废液通过回收装置集中回收。
6.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤五中所有的动作需要温柔，且在加液的时候不要碰到磁珠，且步骤五需重复两次。
7.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤六中所有步骤重复两次。
8.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤七中每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发，另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干。
9.根据权利要求1所述的一种基于试剂盒的针对人组织中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤八中低温为-20℃。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180629 |