CN109234270A - 一种rna提取溶液和rna提取溶液制备方法及rna试剂提取方法 - Google Patents

一种rna提取溶液和rna提取溶液制备方法及rna试剂提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RNA提取溶液和RNA提取溶液制备方法及RNA试剂提取方法，包括包含以下各组分的质量分数或摩尔浓度：相对于溶液的总量30‑50％体积的酚；相对于溶液的总量3‑10％体积的多元醇；相对于溶液的总量0.5‑2M浓度的胍盐；相对于溶液总量0.1‑1％体积的十二烷基肌氨酸钠；相对于溶液的总量0.05‑0.2M浓度的醋酸；相对于溶液的总量0.05‑0.2M的醋酸钠，所述剩余组分为超纯水，本发明中通过醋酸和醋酸钠的比例来实现控制缓冲液的pH值环境，既可以实现DNA和RNA彻底的分离，又可以避免RNA在过酸性条件下发生解体，且还结合了硅胶膜吸附柱的便捷性，简化了RNA提取后续的操作步骤，相比于之前长达一个小时以上，可以缩短至10分钟左右即可完成RNA的提取。

Description

一种RNA提取溶液和RNA提取溶液制备方法及RNA试剂提取 方法
技术领域
本发明涉及生物医药行业，特别涉及一种RNA提取溶液和RNA提取溶液制备方法及RNA试剂提取方法。
背景技术
核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。RNA是以DNA 的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。RNA可以通过种类、表达量等性质对生物体进行表型的调控，为了进行基因表达分析研究，因而从各种生物样本提取高纯度的RNA是十分重要的。目前许多方法被研究出来用于从生物材料中获取RNA，如常用的分离方法有酚提取、从离液盐溶液沉淀法及二氧化硅膜吸附等。
最为普遍应用的是基于一种胍盐和酚结合(GTC)的溶液，如TRIZol试剂等，胍盐会促使核蛋白复合体解离，使RNA和蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。然后使用氯仿等疏水性有机溶剂，将该裂解液离心而进行分离。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述 RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐。
但是应用上述溶液的方法分离的RNA中，常易混入有能通过逆转录-聚合酶链式反应分析实验(RT-PCR)检出的基因组DNA成分，会影响实验分析的准确性，在该情况下丧失RNA 的定量性问题，因此为了除去混入的DNA必须在此纯化RNA的基础上进一步进行纯化。用于除去提取的RNA样品中混入的杂质DNA的一种方法是，将RNA样品用脱氧核糖核酸酶(DNase)处理。但是，利用DNase在液体进行处理的情况下，处理后为了去除DNase，必须再次进行酚/氯仿提取或蛋白质的变性实验。此外，可以结合二氧化硅膜吸附柱进行处理，但是必须反复进行吸附柱洗涤的步骤。这些方法在去除杂质DNA时，不但增加了劳动量，而且存在RNA的损失，从而存在RNA的提取量减少这样的问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种提取的RNA可以有效避免基因组DNA的杂质存在的一种RNA提取溶液。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种RNA提取溶液，包括包含以下各组分的质量分数或摩尔浓度：相对于溶液的总量30-50％体积的酚；相对于溶液的总量3-10％体积的多元醇；相对于溶液的总量0.5-2M浓度的胍盐；相对于溶液总量0.1-1％体积的十二烷基肌氨酸钠；相对于溶液的总量0.05-0.2M浓度的醋酸；相对于溶液的总量0.05-0.2M的醋酸钠，所述剩余组分为超纯水。
进一步的是：所述胍盐为异硫氰酸胍。
进一步的是：所述多元醇为丙三醇溶液。
本发明还公开了一种RNA提取溶液制备方法，包括以下步骤：设RNA提取溶液总量为 1000ml；
(1)制备异硫氰酸胍溶液：取200ml超纯水为溶剂，缓慢加入50g-250g的异硫氰酸胍，在磁力搅拌器上搅拌均匀使其充分溶解；
(2)量取30-100ml的丙三醇溶液，加入到上述的异硫氰酸胍溶液中，进行充分的搅拌均匀；
(3)加入0.1％-1％的十二烷基肌氨酸钠至上述溶液中，进行搅拌均匀；
(4)分别加入相对于溶液总量的0.05-0.2M浓度的醋酸溶液和醋酸钠溶液，体积比为 3:1-5:1至上述的溶液中，充分搅拌均匀；
(5)在上述的溶液中加入30-50％体积的热饱和酚溶液，然后加入超纯水定容至1000ml, 充分搅拌均匀之后移入至棕色的玻璃瓶中，于4度条件下保存。
本发明还公开了一种RNA试剂提取方法，包括使用上述所述的RNA提取溶液制备方法制成的RNA提取溶液，步骤为：
a.各种材料样本的匀浆处理
(1)贴壁培养的细胞：吸去培养基，在培养板中直接加入上述RNA提取溶液，每10cm2生长的培养细胞中加入1ml的RNA提取溶液，水平放置片刻，便于裂解液均匀分布细胞表面裂解，再使用移液器吹打细胞并移至收集管中；
(2)悬浮培养细胞：将悬浮培养的细胞和培养基一起倒入离心管中，离心收集细胞，每 5X106动植物、酵母或细菌细胞加入上述1ml RNA提取溶液；
(3)动物、植物组织：取新鲜或-70℃冷冻的动植物组织在液氮中充分剪碎研磨，将研磨成粉状的样品转移至离心管中，每20-50mg组织加入1ml上述RNA提取溶液，接着使用匀浆仪进行匀浆处理。
b.向上述a步骤中的溶液中加入氯仿，每使用1ml RNA提取液中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒；
c.在12,000转每分钟转速,4-25℃条件下离心1分钟，此时样品会分为三层：红色有机相、中间层和上层无色水相，其中RNA主要在水相中，将水相(约500ul)转移至一个新的RNase-Free的离心管中；
d.在得到的无色水相的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀，将得到溶液转入硅胶膜吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心30秒，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱，分两次转入吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心 30秒，弃掉收集管中的废液；
e.向吸附柱中加入500μl 80％乙醇漂洗液，在12,000转每分钟转速条件下离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤一次；
f.将吸附柱放入收集管中，在12,000转每分钟转速条件下离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置2分钟，彻底晾干；
g.加入30-50ul的洗脱液RNase-Free dd2HO，室温静置2分钟，在温度4-25℃，12,000 转每分钟转速条件下离心1分钟，样品保存于-70℃以备长期使用。
本发明的有益效果是：本发明中通过醋酸和醋酸钠的比例来实现控制缓冲液的pH值环境，既可以实现DNA和RNA彻底的分离，又可以避免RNA在过酸性条件下发生解体，且本发明相比于目前市场上常见的RNA提取试剂而言，是一种提取高纯度RNA的溶液，对于现有的RNA提取用的溶液组分进行了研究，特别地发现了醋酸钠和醋酸的配比对防止DNA的混入的效果有关，在该体系中，优化的配比不仅可以有效防止RNA的酸解，亦可以避免基因组DNA的杂质混入。此外，还结合了硅胶膜吸附柱的便捷性，简化了RNA提取后续的操作步骤，相比于之前长达一个小时以上，可以缩短至10分钟左右即可完成RNA的提取。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
本发明公开了一种RNA提取溶液，包括包含以下各组分的质量分数或摩尔浓度：相对于溶液的总量30-50％体积的酚；相对于溶液的总量3-10％体积的多元醇；所述多元醇可以为丙三醇溶液，乙二醇，丙二醇等，相对于溶液的总量0.5-2M浓度的胍盐；所述胍盐可以为异硫氰酸胍，盐酸胍，磷酸胍等，相对于溶液总量0.1-1％体积的十二烷基肌氨酸钠；相对于溶液的总量0.05-0.2M浓度的醋酸；相对于溶液的总量0.05-0.2M的醋酸钠，所述剩余组分为超纯水。
苯酚和胍盐的结合可以有效地促使核蛋白复合体解离，使RNA和蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中，其中胍盐常用的是异硫氰酸胍，是一种强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核算分离。同时在提取 RNA时容易被核糖核酸酶(RNase)所降解，而异硫氰酸胍可以有效抑制RNase酶的活性，避免在提取过程中RNA的降解。多元醇，比如丙三醇，可以防止在单一的溶液中导致苯酚和其他试剂发生分层现象。十二烷基肌氨酸钠是一种表面活性剂，会促使蛋白质变性和解离，更易释放出RNA分子。由于RNA和DNA的等电点不同，利用该特点发现在酸性环境下RNA和DNA 会分离，加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于上样层中，本发明中通过醋酸和醋酸钠的比例来实现控制缓冲液的pH值环境，既可以实现DNA和RNA彻底的分离，又可以避免RNA在过酸性条件下发生解体。
在上述基础上，本发明还公开了一种RNA提取溶液制备方法，包括以下步骤：设RNA提取溶液总量为1000ml；
(1)制备异硫氰酸胍溶液：取200ml超纯水为溶剂，缓慢加入50g-250g的异硫氰酸胍，在磁力搅拌器上搅拌均匀使其充分溶解；
(2)量取30-100ml的丙三醇溶液，加入到上述的异硫氰酸胍溶液中，进行充分的搅拌均匀；
(3)加入0.1％-1％的十二烷基肌氨酸钠至上述溶液中，进行搅拌均匀；
(4)分别加入相对于溶液总量的0.05-0.2M浓度的醋酸溶液和醋酸钠溶液，体积比为 3:1-5:1至上述的溶液中，充分搅拌均匀；
(5)在上述的溶液中加入30-50％体积的热饱和酚溶液，然后加入超纯水定容至1000ml, 充分搅拌均匀之后移入至棕色的玻璃瓶中，于4度条件下保存。
此外，本发明还公开了一种RNA试剂提取方法，包括使用上述所述的RNA提取溶液制备方法制成的RNA提取溶液，步骤为：
a.各种材料样本的匀浆处理
(1)贴壁培养的细胞：吸去培养基，在培养板中直接加入上述RNA提取溶液，每10cm2生长的培养细胞中加入1ml的RNA提取溶液，水平放置片刻，便于裂解液均匀分布细胞表面裂解，再使用移液器吹打细胞并移至收集管中；
(2)悬浮培养细胞：将悬浮培养的细胞和培养基一起倒入离心管中，离心收集细胞，每 5X106动植物、酵母或细菌细胞加入上述1ml RNA提取溶液；
(3)动物、植物组织：取新鲜或-70℃冷冻的动植物组织在液氮中充分剪碎研磨，将研磨成粉状的样品转移至离心管中，每20-50mg组织加入1ml上述RNA提取溶液，接着使用匀浆仪进行匀浆处理。
b.向上述a步骤中的溶液中加入氯仿，每使用1ml RNA提取液中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒；
c.在12,000转每分钟转速,4-25℃条件下离心1分钟，此时样品会分为三层：红色有机相、中间层和上层无色水相，其中RNA主要在水相中，将水相(约500ul)转移至一个新的RNase-Free的离心管中；
d.在得到的无色水相的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀，将得到溶液转入硅胶膜吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心30秒，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱，分两次转入吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心 30秒，弃掉收集管中的废液；
e.向吸附柱中加入500μl 80％乙醇漂洗液，在12,000转每分钟转速条件下离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤一次；
f.将吸附柱放入收集管中，在12,000转每分钟转速条件下离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置2分钟，彻底晾干；
g.加入30-50ul的洗脱液RNase-Free dd2HO，室温静置2分钟，在温度4-25℃，12,000 转每分钟转速条件下离心1分钟，样品保存于-70℃以备长期使用。
本方法相比于目前市场上常见的RNA提取试剂而言，是一种提取高纯度RNA的溶液，对于现有的RNA提取用的溶液组分进行了研究，特别地发现了醋酸钠和醋酸的配比对防止DNA 的混入的效果有关。在该体系中，优化的配比不仅可以有效防止RNA的酸解，亦可以避免基因组DNA的杂质混入。此外，还结合了硅胶膜吸附柱的便捷性，简化了RNA提取后续的操作步骤，相比于之前长达一个小时以上，可以缩短至10分钟左右即可完成RNA的提取。
下述为一些具体的实施例：
实施案例1：
高纯度RNA提取溶液的制备：
高纯度RNA提取溶液总量为1000ml；
(1)制备异硫氰酸胍溶液：取200ml超纯水为溶剂，缓慢加入250g的异硫氰酸胍，在磁力搅拌器上搅拌均匀使其充分溶解；
(2)量取50ml的丙三醇溶液，加入到上述的异硫氰酸胍溶液中，进行充分的搅拌均匀；
(3)加入相对于溶液总量0.5％的十二烷基肌氨酸钠至上述溶液中，进行搅拌均匀；
(4)分别加入相对于溶液总量0.1M浓度的醋酸溶液和醋酸钠溶液，体积比为4:1至上述的溶液中，充分搅拌均匀
(5)在上述的溶液中加入对于溶液总量35％体积的热饱和酚溶液，然后加入超纯水定容至 1000ml,充分搅拌均匀之后移入至棕色的玻璃瓶中，于4度条件下保存。
实施案例2：
高纯度RNA提取溶液的制备：
高纯度RNA提取溶液总量为1000ml；
(1)制备异硫氰酸胍溶液：取200ml超纯水为溶剂，缓慢加入100g的异硫氰酸胍，在磁力搅拌器上搅拌均匀使其充分溶解；
(2)量取50ml的丙三醇溶液，加入到上述的异硫氰酸胍溶液中，进行充分的搅拌均匀；
(3)加入相对于溶液总量0.8％的十二烷基肌氨酸钠至上述溶液中，进行搅拌均匀；
(4)分别加入相对于溶液总量0.1M浓度的醋酸溶液和醋酸钠溶液，体积比为3:1至上述的溶液中，充分搅拌均匀；
(5)在上述的溶液中加入对于溶液总量40％体积的热饱和酚溶液，然后加入超纯水定容至1000ml,充分搅拌均匀之后移入至棕色的玻璃瓶中，于4度条件下保存。
实施案例3：
高纯度RNA提取溶液的制备：
高纯度RNA提取溶液总量为1000ml；
(1)制备异硫氰酸胍溶液：取200ml超纯水为溶剂，缓慢加入150g的异硫氰酸胍，在磁力搅拌器上搅拌均匀使其充分溶解；
(2)量取50ml的丙三醇溶液，加入到上述的异硫氰酸胍溶液中，进行充分的搅拌均匀；
(3)加入相对于溶液总量0.5％的十二烷基肌氨酸钠至上述溶液中，进行搅拌均匀；
(4)分别加入相对于溶液总量0.1M浓度的醋酸溶液和醋酸钠溶液，体积比为4.5:1至上述的溶液中，充分搅拌均匀；
(5)在上述的溶液中加入相对于溶液总量38％体积的热饱和酚溶液，然后加入超纯水定容至1000ml,充分搅拌均匀之后移入至棕色的玻璃瓶中，于4度条件下保存。
实施案例4：
使用实施例1、2和3的制备方法获得的RNA提取液提取大肠杆菌的RNA，取1ml的109数量的菌液,每分钟转速12000转离心一分钟之后，弃去上清，分别加入上述制备的RNA提取液1ml，室温静置5分钟，加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒。12,000转每分钟转速,4-25℃离心1分钟，此时样品会分为三层：红色有机相、中间层和上层无色水相。其中RNA主要在水相中，将水相(约500ul)转移至一个新的RNase-Free的离心管中。在得到的无色水相的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀。将得到溶液转入硅胶膜吸附柱中，4-25℃12,000 转每分钟转速离心30秒，弃掉收集管中的废液。向吸附柱中加入500μl 80％乙醇漂洗液， 12,000转每分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。重复此步骤一次。将吸附柱放入收集管中，12,000转每分钟转速离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置2分钟，彻底晾干。加入30的洗脱液RNase-Free dd2HO，室温静置2分钟，4-25℃，12,000转每分钟转速离心1分钟。
将上述的提取的RNA使用紫外分光光度计进行浓度的测定，案例1,2,3制备的提取液分别浓度为427ng/ul；494ng/ul和512ng/ul；260/280的OD值分别为1.93；1.96和1.95；说明上述的提取液获得的RNA浓度较高，从OD比值来看，RNA的纯度较高，不含有基因组DNA 和蛋白质等杂质的污染。
实施案例5：
使用案例1制备的方法获得RNA提取溶液分别提取HEK293，Hela和MDCK细胞，将培养上述的6孔板中的细胞，分别弃去培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗之后，加入1ml RNA 提取溶液进行裂解，室温静置5分钟之后，转移至1.5ml的离心管中。后续的实验参照案例4 实施的步骤收集RNA。
将上述的提取的RNA使用紫外分光光度计进行浓度的测定，其中HEK293,Hela和MDCK细胞获得RNA浓度为319ng/ul,468ng/ul和352ng/ul；260/280的OD值分别是1.98,1.90和1.92；说明上述的提取液获得RNA浓度较高的，从OD比值分析RNA的纯度高，不含有基因组DNA和蛋白质等杂质的污染。
实施案例6：
使用案例2制备方法获得RNA提取溶液，与某公司商业化的RNA提取试剂经行比较。分别提取拟南芥的50mg新鲜的花为样本，在液氮条件下研磨成粉末，转移至上述的RNA提取溶液，室温静置5分钟之后，后续的实验参照案例4实施的步骤收集RNA。
将上述的提取的RNA使用紫外分光光度计进行浓度的测定，本发明的RNA提取溶液，测定浓度为589ng/ul，260/280的OD值为1.95；对照商业化的RNA提取试剂，测定浓度为561ng/ul,260/280的OD值为2.13；说明本发明的RNA提取溶液和对照的RNA提取试剂，获得浓度相差不大，但是从260/280的OD比值分析，对照RNA提取试剂OD值大于2.0以上，高达2.13，说明其含有基因组DNA的污染等杂质存在。
本方法相比于目前市场上常见的RNA提取试剂而言，是一种提取高纯度RNA的溶液，对于现有的RNA提取用的溶液组分进行了研究，特别地发现了醋酸钠和醋酸的配比对防止DNA 的混入的效果有关。在该体系中，优化的配比不仅可以有效防止RNA的酸解，亦可以避免基因组DNA的杂质混入。此外，还结合了硅胶膜吸附柱的便捷性，简化了RNA提取后续的操作步骤，相比于之前长达一个小时以上，可以缩短至10分钟左右即可完成RNA的提取。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种RNA提取溶液，其特征在于：包括包含以下各组分的质量分数或摩尔浓度：相对于溶液的总量30-50％体积的酚；相对于溶液的总量3-10％体积的多元醇；相对于溶液的总量0.5-2M浓度的胍盐；相对于溶液总量0.1-1％体积的十二烷基肌氨酸钠；相对于溶液的总量0.05-0.2M浓度的醋酸；相对于溶液的总量0.05-0.2M的醋酸钠，所述剩余组分为超纯水。
2.如权利要求1所述的一种RNA提取溶液，其特征在于：所述胍盐为异硫氰酸胍。
3.如权利要求1所述的一种RNA提取溶液，其特征在于：所述多元醇为丙三醇溶液。
4.一种RNA提取溶液制备方法，包括以下步骤：设RNA提取溶液总量为1000ml；
(1)制备异硫氰酸胍溶液：取200ml超纯水为溶剂，缓慢加入50g-250g的异硫氰酸胍，在磁力搅拌器上搅拌均匀使其充分溶解；
(2)量取30-100ml的丙三醇溶液，加入到上述的异硫氰酸胍溶液中，进行充分的搅拌均匀；
(3)加入0.1％-1％的十二烷基肌氨酸钠至上述溶液中，进行搅拌均匀；
(4)分别加入相对于溶液总量的0.05-0.2M浓度的醋酸溶液和醋酸钠溶液，体积比为3:1-5:1至上述的溶液中，充分搅拌均匀；
(5)在上述的溶液中加入30-50％体积的热饱和酚溶液，然后加入超纯水定容至1000ml,充分搅拌均匀之后移入至棕色的玻璃瓶中，于4度条件下保存。
5.一种RNA试剂提取方法，其特征在于：包括使用权利要求4中所述的RNA提取溶液制备方法制成的权利要求1中所述的RNA提取溶液，步骤为：
a.各种材料样本的匀浆处理
(1)贴壁培养的细胞：吸去培养基，在培养板中直接加入上述RNA提取溶液，每10cm2生长的培养细胞中加入1ml的RNA提取溶液，水平放置片刻，便于裂解液均匀分布细胞表面裂解，再使用移液器吹打细胞并移至收集管中；
(2)悬浮培养细胞：将悬浮培养的细胞和培养基一起倒入离心管中，离心收集细胞，每5X106动植物、酵母或细菌细胞加入上述1ml RNA提取溶液；
(3)动物、植物组织：取新鲜或-70℃冷冻的动植物组织在液氮中充分剪碎研磨，将研磨成粉状的样品转移至离心管中，每20-50mg组织加入1ml上述RNA提取溶液，接着使用匀浆仪进行匀浆处理。
b.向上述a步骤中的溶液中加入氯仿，每使用1ml RNA提取液中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒；
c.在12,000rpm,4-25℃条件下离心1分钟，此时样品会分为三层：红色有机相、中间层和上层无色水相，其中RNA主要在水相中，将水相500ul转移至一个新的RNase-Free的离心管中；
d.在得到的无色水相的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀，将得到溶液转入硅胶膜吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心30秒，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱，分两次转入吸附柱中，在4-25℃，12,000转速的条件下离心30秒，弃掉收集管中的废液；
e.向吸附柱中加入500μl 80％乙醇漂洗液，在12,000转每分钟转速条件下离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤一次；
f.将吸附柱放入收集管中，在12,000转每分钟转速条件下离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置2分钟，彻底晾干；
g.加入30-50ul的洗脱液无RNase酶的超纯水室温静置2分钟，在温度4-25℃，12,000转每分钟转速条件下离心1分钟，样品保存于-70℃以备长期使用。
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