CN110743009A - 鞭毛蛋白抗体在制备防治泌尿系结石及肾损伤的药物中的应用 - Google Patents

鞭毛蛋白抗体在制备防治泌尿系结石及肾损伤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治泌尿系结石及晶体引起的肾损伤的药物中的应用。本发明首次研究证明了鞭毛蛋白抗体具有抑制晶体的聚集及其对肾小管上皮细胞的粘附的作用，具备治疗泌尿系结石的潜力。本发明提供了鞭毛蛋白抗体的一种新用途，即其在制备防治泌尿系结石药物中的应用，也为泌尿系结石疾病的治疗提供了新的选择方案，具有很好的应用前景。

Description

鞭毛蛋白抗体在制备防治泌尿系结石及肾损伤的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治泌尿系结石及晶体引起的肾损伤的药物中的应用。
背景技术
泌尿系结石是一种全球性的常见疾病，也是我国最常见的泌尿外科疾病，结石在尿液中形成的一个先决条件是晶体的聚集成核。泌尿系结石的成分研究发现，草酸钙是泌尿系结石最常见的化学成分。草酸钙结石的形成大致包括晶核形成、结晶生长、结晶聚集、结晶粘附滞留直至结石形成等过程，目前已存在的草酸钙结石形成的假说包括钙斑学说、基质学说、过饱和和结晶学说、抑制物学说等。现有研究显示尿路致病性大肠埃希菌不仅是单纯尿路感染合并的最主要的致病菌，而且也是泌尿系结石患者尿路感染中常见的病原菌。草酸钙结石核心内不但沉积有蛋白、脂质等被认为是导致代谢性结石形成的物质，更沉积有大量细菌，特别是大肠埃希菌，提示尿路致病性大肠埃希菌可能在草酸钙结石的发生发展中也具有重要作用。此外，草酸钙结石的形成还与晶体生长所处环境条件有关，目前的研究认为草酸钙晶体在尿液中的聚集成核以及肾小管上皮细胞损伤之后草酸钙晶体粘附聚集是草酸钙结石形成的最主要原因之一。泌尿系结石患者和正常人的尿液中均含有大量的晶体，正常人尿液中的晶体能够被肾小管液冲走，但尿石症患者的肾小管上皮细胞膜存在损伤，可导致草酸钙等晶体的滞留和粘附，这些晶体在粘附到肾小管上皮细胞上变为固定的颗粒后，长大并形成结石。因此，减少肾小管上皮细胞膜的损伤，以及减少肾小管上皮细胞膜与晶体的粘附是防治结石形成的关键靶点之一。
目前对于结石的治疗以手术为主，临床上运用枸橼酸氢钾钠对胱氨酸结石进行治疗，此外还未见其它药物用于结石的治疗上。
因此，迫切需要寻找新的且能有效防治合并尿路致病性大肠埃希菌感染引起的泌尿系结石的药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有泌尿系结石疾病的防治技术的不足，提供了一种新的防治泌尿系结石疾病的药物选择，即鞭毛蛋白抗体及其衍生物在防治泌尿系结石及晶体引起的肾损伤中的应用。
本发明的目的是提供鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治泌尿系结石的药物中的应用。
本发明另一目的是提供鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治晶体引起的肾损伤的药物中的应用。
本发明的再一目的是提供一种防治合并尿路致病性大肠埃希菌感染引起的泌尿系结石的药物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明以一水草酸钙晶体作为实验对象，研究证明了鞭毛蛋白抗体能够抑制晶体的聚集及其对肾小管上皮细胞的粘附，抑制IκB、p-NFκB、p-P38等信号分子的表达，具备治疗泌尿系结石的潜力。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
本发明请求保护鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治泌尿系结石的药物中的应用。
具体地，所述泌尿系结石为合并尿路致病性大肠埃希菌感染引起的泌尿系结石。
更具体地，所述防治泌尿系结石是抑制晶体对肾小管细胞的粘附、降低晶体在肾脏中的沉积和/或抑制晶体引起的细胞毒性。
本发明还请求保护鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治晶体引起的肾损伤的药物中的应用。
具体地，所述晶体是草酸钙晶体。
具体地，所述肾损伤是指肾细胞损伤。
优选地，所述肾细胞为肾小管上皮细胞。
优选地，所述鞭毛蛋白抗体的衍生物包括以鞭毛蛋白抗体为母核的分子、类似物或其药物可接受的盐。
另外，一种含有鞭毛蛋白抗体和/或其类似物的防治合并尿路致病性大肠埃希菌感染引起的泌尿系结石的药物也在本发明的保护范围之内。
鞭毛蛋白抗体是针对大肠埃希菌的鞭毛蛋白这一抗原而产生的蛋白分子。它具有抑制草酸钙晶体聚集等多种生物学功能。在本发明之前，鞭毛蛋白抗体在防治泌尿系结石疾病方面还未见有报道，本发明首次研究并公开了鞭毛蛋白抗体在防治泌尿系结石疾病方面的应用。本发明证明了鞭毛蛋白抗体及其衍生物在草酸钙晶体刺激引起的肾小管上皮细胞损伤中具有保护作用；还证明了鞭毛蛋白抗体及其衍生物对于肾小管上皮细胞损伤后的晶体粘附具有抑制作用。
由于鞭毛蛋白抗体性质不稳定，因此在本发明的方案中，鞭毛蛋白抗体及其衍生物可以通过一种药学可接受的盐或药物复合物的形式对病人给药，与适当载体或赋形剂混合形成药物组合物从而保证达到有效治疗，所述剂型包括固体剂型、半固体剂型、液体制剂和气雾制剂。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次研究发现鞭毛蛋白抗体具有抑制晶体聚集及其对肾小管上皮细胞的粘附的作用，可用于开发泌尿系结石抑制剂。
2、本发明提供了鞭毛蛋白抗体及其衍生物的一种新用途，即其在防治泌尿系结石及晶体引起的肾损伤中的应用，为泌尿系结石疾病的治疗提供了新的选择方案。
附图说明
图1是△PPK-CFT073菌株构建的PCR验证图；
图2是△PPK-CFT073及其培养液对COM的聚集能力的影响结果；
图3是不同孵育时间下△PPK-CFT073及其培养液对COM的聚集能力的影响结果；
图4是SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测COM晶体粘附细菌蛋白的结果；
图5是差异蛋白的蛋白质谱图；
图6是鞭毛蛋白抗体抑制WT-CFT073培养液对COM的聚集作用图；
图7是PCR、Western blot验证△Flic-CFT073菌株成功构建的结果；
图8是△Flic-CFT073及其培养液对COM的聚集能力的影响结果；
图9是WT-CFT073、△PPK-CFT073、△Flic-CFT073细菌对肾小管上皮细胞-COM粘附作用图；
图10是不同浓度鞭毛蛋白对肾小管上皮细胞晶体粘附能力的影响结果；
图11是WT-CFT073、△PPK-CFT073、△Flic-CFT073细菌对肾小管上皮细胞蛋白IκB/NF-κB/P38-MAPK信号分子表达的影响结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1、主要试剂：
Terrific Broth培养基购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)；野生型尿路致病性大肠埃希菌CFT073(ATCC700928)菌株从美国模式菌种收集中心ATCC购买；磷酸缓冲盐溶液(PBS)从博士德生物工程有限公司购买；0.22um除菌过滤器购自Millipore(Tullagreen，Carrigtwohil，Co.Cork，IRL)；Taq DNA聚合酶、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒及DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；考马斯亮蓝染色液购自碧云天生物技术公司(Beyotime，上海)；鞭毛蛋白抗体从艾博抗(上海)贸易有限公司(Abcam)购买；草酸钠、氯化钙均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；其它常用的实验室试剂均为国产分析纯级。
2、仪器及设备
超净工作台(Thermo)；水浴箱(Shelllab)；电子天平(AB204-S，Mettler Toledo)；pH计(InLab413，Mettler Toledo)；除热源型超纯水仪(PURELGA classis UF，ELGA)；Nucleic acid and protein analyzer(DU 640，Beckman Coulter)；Bio Imaging system(Gene Genius)；倒置显微镜(LW200-27XB，上海光电)；荧光显微镜(IX51，Olympus)；多功能微孔板检测仪(Synergy H1，BioTek Instruments)；超速离心机(BECKMAN L-100XP)；SC12型浸没式水平电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司)；TGreen Monitor plus蓝光电泳监测仪(天根生化科技有限公司，北京)；垂直电泳系统(Bio-Rad Laboratories,Inc)。
实施例1构建PPK敲除的UPEC标准株(△PPK-CFT073)
1、利用大肠埃希菌噬菌体来源的Red重组系统，将pKD46质粒转化进入野生型大肠埃希菌CFT073菌株(WT-CFT073)，PCR构建PPK打靶序列(两端为PPK上下游同源臂，中间为卡那霉素抗性基因)，具体步骤如下：
(1)pKD46质粒的提取：
S1.将转化有pKD46的菌种(BW25113/pKD46，耶鲁大学菌种保藏中心来源)接种4mLLB培养基(含Amp 100μg/mL)，30℃，220rpm培养过夜；
S2.菌液倒入两支2mL离心管，3000rpm离心3分钟沉淀细菌，弃液体，沉淀用200μL溶液I(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)充分悬浮；加入400μL溶液II(1％SDS、0.2N NaOH)，盖上管盖，上下颠倒5次，室温静置5min；打开管盖，加入300μL溶液III(3M NaoAc，pH＝4.5)，盖上管盖，上下颠倒5～10次，冰上静置30min；
S3. 4℃，12000rpm离心15min；转移900μL上清入新的2mL离心管，加入0.7Vol(630μL)异丙醇，盖上管盖，颠倒混匀；4℃放置15min；
S4. 4℃，12000rpm离心15min，弃上清；加入500μL 70％乙醇，4℃，12000rpm离心5min，弃上清；沉淀用200μL含50μg/mLRNaseA的TE(10mM Tris,1mM EDTA，pH＝8.0)溶解，37℃放置30min；
S5.两管合并，总体积400μL，加入1Vol(400μL)酚，Votex混匀，4℃，12000rpm离心5min，转移上层水相入一支新的离心管；加入1Vol(400μL)酚/氯仿，Votex混匀，4℃，12000rpm离心5min，转移上层水相入一支新的离心管；加入1Vol(400μl)氯仿，Votex混匀，4℃，12000rpm离心5min，转移上层水相入一支新的离心管，加入1/10Vol(40μL)3M NaoAc(pH＝4.5)和0.7Vol(320μL)的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min；
S6. 4℃，12000rpm离心15min，弃上清，加入500μL 70％乙醇，4℃，12000rpm离心5min，弃上清；沉淀(pKD46质粒DNA)用30μL三蒸水充分溶解，取1μL跑1％琼脂糖电泳估计浓度，其余置-20℃保存备用。
(2)大肠杆菌CFT073电转化感受态细胞的制备及pKD46质粒的转化：
S1.从-80℃冰箱中取出CFT073菌种，划线接种LB平板(不含抗生素)，37℃培养过夜；
S2. 24小时后，挑单克隆接种2mL LB(不含抗生素)，37℃培养过夜；
S3.吸取0.5mL过夜菌加入50m LB(250mL摇瓶)，37℃培养至OD600达到0.5；
S4.摇瓶，置冰浴30min；在预冷的50mL圆底离心管中倒入25mL菌液，于4℃、1000g离心15min沉淀细菌，弃上清；
S5.细菌沉淀用25mL冰冷的三蒸水悬浮；于4℃、1000g离心15min沉淀细菌，弃液体；
S6.重复步骤S5一次；
S7.细菌沉淀用10mL冰冷的10％甘油(三蒸水配制)悬浮，于4℃、1000g离心15min沉淀细菌，弃液体，小心保留沉淀；
S8.细菌沉淀用50μL 10％甘油(三蒸水配制)充分悬浮，转移入一支预冷的0.5mL离心管即为可以使用的电转化感受态细胞；
S9.取1μL pKD46质粒(～50ng)加入CFT073感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置1min，转移入预冷的2mm电转杯(Eppendorf)，迅速擦干电转杯外表水分，放入电极进行电击转化(电击参数：电压＝2.5kV，电容＝25μF，电阻＝200Ω)；
S10.电击后立即向电转杯中加入1mL LB，吹打悬浮，全部转移入新的无菌1.5mL离心管，30℃、160rpm培养复苏3小时；
S11.取20μL转化菌铺LB平板(含50μg/mL Amp)，置30℃培养箱培养至单克隆形成，即为E.coli CFT073/pKD46。
(3)打靶片段的纯化(生工生物工程(上海)有限公司胶回收试剂盒提取)：
S1.取25μl PCR产物加入1％琼脂糖凝胶的加样孔，100V、0.5×TBE缓冲液中电泳分离1小时，紫外灯下迅速切割取下1602bp长度的ppk打靶片段，装入1.5mL Ep管；
S2. 700μl溶胶液，65℃溶胶15min，吸取融化的胶加入离心管，室温放置2min，室温、9000rpm离心1min；
S3.弃漏出液，向柱中加入700μL洗涤液，室温、9000rpm离心1min；
S4.重复步骤S3一次；
S5.弃漏出液，空柱在室温、10000rpm离心2min，去除残余乙醇；
S6.向硅胶膜中央加入20μL 65℃预热的无菌三蒸水，立即在室温、10000rpm离心1min洗脱DNA；
S7.取1μL回收的DNA跑电泳，估计回收的DNA片段浓度；其余回收的DNA片段置-20℃冰箱冷冻保存。
(4)大肠杆菌CFT073/pKD46电转化感受态细胞的制备和打靶片段的电转化：
S1.挑大肠杆菌CFT073/pKD4单克隆接种2mL LB(含50μg/mL Amp)，30℃培养过夜；
S2.吸取0.5mL过夜菌加入50m LB(250mL摇瓶，不含抗生素)，同时加入100μl 1ML-(+)-Arabinose(终浓度达到2mM)，30℃、220rpm培养至OD600达到0.5；
S3.取出摇瓶，置冰浴15min；在预冷的50mL圆底离心管中倒入25mL菌液，于4℃、1000g离心15min沉淀细菌，弃液体；
S4.细菌沉淀用25mL冰冷的三蒸水悬浮，于4℃、1000g离心15min沉淀细菌，弃液体；
S5.重复步骤S4一次；
S6.细菌沉淀用10mL冰冷的10％甘油(三蒸水配制)悬浮，于4℃、1000g离心15min沉淀细菌，弃液体，小心保留沉淀；
S7.细菌沉淀用50μL10％甘油(三蒸水配制)充分悬浮，转移入一支预冷的0.5mL离心管即为可以使用的电转化CFT073/pKD46电转化感受态细胞；
S8.取400ng纯化的打靶片段加入CFT073/pKD46感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置1min，转移入预冷的2mm电转杯(Bio-Rad)，迅速擦干电转杯外表水分，放入电极进行电击转化(电击参数：电压＝2.5kV，电容＝25μF，电阻＝200Ω)；
S9.电击后立即向电转杯中加入1mL LB，吹打悬浮，全部转移入新的无菌1.5mL离心管，37℃、200rpm培养复苏2小时；
S10.取500μL转化菌铺LB平板(含50μg/mL卡那霉素)，置37℃培养箱培养至单克隆形成。
2、实验结果
实验结果如图1所示，PCR验证并获得了正确重组(PPK基因正确敲除)的细菌克隆△PPK-CFT073，图中A为PPK敲除阳性克隆的PCR验证结果，其中1和2为PPK基因外部引物的PCR条带，3和4为PPK基因内部引物PCR结果；B为PPK基因内部引物在PPK敲除株△PPK-CFT073和野生型WT-CFT073的PCR结果，其中1和2为△PPK-CFT073扩增结果，3和4为WT-CFT073扩增结果，5和6为无模板扩增阴性对照组。
实施例2△PPK-CFT073菌液及其培养液对一水草酸钙晶体(COM)的聚集作用分析
1、实验方法
将△PPK-CFT073和WT-CFT073等量接种于Terrific-Broth培养基，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，之后在室温，4500rpm条件下，离心5min，用注射器吸取上清液，通过0.22um过滤器分离得到无菌培养液。收集菌株以及离心、过滤后得到无细菌的培养液，将无细菌的培养液与一水草酸钙晶体(COM)混合(200ug/mL)孵育，并在显微镜下观察一水草酸钙晶体(COM)聚集程度；△PPK-CFT073和WT-CFT073(106个/mL)菌液分别在新鲜培养液中混合重悬后与一水草酸钙晶体(COM)(200ug/mL)孵育，并在显微镜下观察一水草酸钙晶体(COM)聚集程度。
所有实验至少重复三次。实验数据以SPSS16.0软件统计分析，两组的组间比较采用Student test比较，三组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*表示与新鲜培养基组比较，P<0.05；#表示与△PPK-CFT073组比较，P<0.05。图中柱状图的结果以均值和标准误差表示。
2、实验结果
实验结果如图2所示，结果显示一水草酸钙晶体(COM)在新鲜培养基中不会发生聚集，WT-CFT073及其培养液均可以明显促进COM的聚集，而△PPK-CFT073及其培养液对COM的聚集能力则明显减弱。
实施例3△PPK-CFT073及其培养液不同孵育时间对COM聚集的影响分析
1、实验方法
将△PPK-CFT073和WT-CFT073等量接种于Terrific-Broth培养基，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，之后在室温，4500rpm条件下，离心5min，用注射器吸取上清液，通过0.22um过滤器分离得到无菌培养液。收集菌株以及离心、过滤后得到无细菌的培养液，将无细菌的培养液与一水草酸钙晶体(COM)混合(200ug/mL)分别孵育5min、15min、45min，并在显微镜下观察一水草酸钙晶体(COM)聚集程度；△PPK-CFT073和WT-CFT073(106个/mL)菌液分别在新鲜培养液中混合重悬，将一水草酸钙晶体(COM)(200ug/mL)分别孵育5min、15min、45min，并在显微镜下观察一水草酸钙晶体(COM)聚集程度。
所有实验至少重复三次。实验数据以SPSS16.0软件统计分析，两组的组间比较采用Student test比较，三组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*表示与新鲜培养基组比较，P<0.05；#表示与△PPK-CFT073培养液组比较，P<0.05。图中柱状图的结果以均值和标准误差表示。
2、实验结果
实验结果如图3所示，其中A是△PPK-CFT073和WT-CFT073细菌菌液对COM的聚集作用，B显示的是△PPK-CFT073和WT-CFT073细菌的培养液对COM的聚集作用。从结果可知，与WT-CFT073及其培养液相比，△PPK-CFT073及其培养液对COM的聚集能力明显降低(P＜0.05)，但无论是△PPK-CFT073还是WT-CFT073大肠埃希菌COM的聚集作用均不随时间延长而改变。
实施例4SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测COM晶体粘附的细菌蛋白
1、实验方法
将△PPK-CFT073和WT-CFT073等量接种于Terrific-Broth培养基，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，之后在室温，4500rpm条件下，离心5min，用注射器吸取上清液，通过0.22um过滤器分离得到无菌培养液。收集菌株以及离心、过滤后得到无细菌的培养液，将无细菌的培养液与一水草酸钙晶体(COM)混合(1500ug/mL)分别孵育12h后，再次离心，并弃去上清液得到孵育后的COM晶体。洗涤COM晶体后，加RIPA裂解液(强)洗脱晶体表面蛋白。将各组蛋白洗脱液进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分离，并用考马斯亮蓝进行染色。
2、实验结果
实验结果如图4所示，其中A为新鲜培养液孵育的COM晶体的蛋白洗脱液；B为△PPK-CFT073孵育的COM晶体的蛋白洗脱液；C为WT-CFT073孵育的COM晶体的蛋白洗脱液；D为△PPK-CFT073培养液孵育的COM晶体的蛋白洗脱液；E为WT-CFT073培养液孵育的COM晶体的蛋白洗脱液。染色结果显示，无论是菌液还是过滤后的无菌培养液，WT-CFT073与△PPK-CFT073相比在60～75KDa分子区间具有表达差异的蛋白条带。
实施例5蛋白质谱检测COM晶体粘附的细菌蛋白
1、实验方法
将△PPK-CFT073和WT-CFT073等量接种于Terrific-Broth培养基，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，之后在室温，4500rpm条件下，离心5min，用注射器吸取上清液，通过0.22um过滤器分离得到无菌培养液。收集菌株以及离心、过滤后得到无细菌的培养液，将无细菌的培养液与一水草酸钙晶体(COM)混合(1500ug/mL)分别孵育12h后，再次离心，并弃去上清液得到孵育后的COM晶体。洗涤COM晶体后，加RIPA裂解液(强)洗脱晶体表面蛋白。将各组蛋白洗脱液进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分离，并用考马斯亮蓝进行染色。对60～75KDa分子区间具有差异性表达的蛋白条带进一步进行分离，并提取其中的蛋白分子，应用QE质谱仪及串联质谱技术对目的蛋白进行鉴定分析。
2、实验结果
实验结果如图5所示，WT-CFT073组共鉴定出118种肽段得分＞20的蛋白质，WT-CFT073的培养液组共鉴定出21种肽段得分＞20的蛋白质。蛋白质谱检测结果显示对晶体有聚集作用的未知蛋白为细菌分泌的鞭毛蛋白。
实施例6鞭毛蛋白抗体抑制WT-CFT073培养液对COM的聚集作用分析
1、实验方法
将WT-CFT073接种于Terrific-Broth肉汤，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，离心、过滤后得到无细菌的培养液。将COM(200ug/mL)与新鲜培养液、WT-CFT073培养液、及加入不同稀释比例(1:50、1:100、1:500、1:1000)的鞭毛蛋白抗体与WT-CFT073培养液混合后的培养液孵育。并在显微镜下观察COM聚集程度。
所有实验至少重复三次。实验数据以SPSS16.0软件统计分析，两组的组间比较采用Student test比较，三组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异。*代表与Control组相比，具有统计学差异P<0.05。#代表与WT-CFT073培养液组相比，具有统计学差异P<0.05，§代表与鞭毛蛋白抗体(1:1000)与WT-CFT073培养液混合组相比，具有统计学差异P<0.05。※代表与鞭毛蛋白抗体(1:500)与WT-CFT073培养液混合组相比，具有统计学差异P<0.05。
2、实验结果
实验结果如图6所示，其中A为新鲜培养液组；B为WT-CFT073培养液组；C为鞭毛蛋白抗体(1:1000)与WT-CFT073培养液混合组；D为鞭毛蛋白抗体(1:500)与WT-CFT073培养液混合组；E为鞭毛蛋白抗体(1:100)与WT-CFT073培养液混合组；F为鞭毛蛋白抗体(1:50)与WT-CFT073培养液混合组。结果表明，预先加入鞭毛蛋白抗体能有效降低WT-CFT073培养液对晶体的聚集，且随着抗体浓度升高，鞭毛蛋白抗体对培养液聚集晶体的抑制作用越明显(P<0.05)。
实施例7构建Flic敲除的UPEC标准株(△Flic-CFT073)
1、实验方法
利用大肠埃希菌噬菌体来源的Red重组系统，将pKD46质粒转化进入WT-CFT073。PCR构建Flic打靶序列(两端为Flic上下游同源臂，中间为卡那霉素抗性基因)进一步将构建好的菌株和WT-CFT073等量接种于Terrific-Broth肉汤，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，离心,收集菌株提取细菌的总蛋白后，Western blot检测检测各组鞭毛蛋白表达。
2、实验结果
结果如图7所示，其中A为Flic基因内部引物在Flic敲除株△Flic-CFT073和野生型WT-CFT073的PCR结果(1为WT-CFT073扩增结果；2为△Flic-CFT073扩增结果)；B为Western blot检测鞭毛蛋白表达图，可看出到UPEC在敲除了Flic基因后，鞭毛蛋白的表达下降。
实施例8△Flic-CFT073及其培养液聚集COM的能力分析
1、实验方法
将△Flic-CFT073和WT-CFT073等量接种于Terrific-Broth培养基，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使得菌液OD600＝1，之后在室温，4500rpm条件下，离心5min，用注射器吸取上清液，通过0.22um过滤器分离得到无菌培养液。收集菌株以及离心、过滤后得到无细菌的培养液，将无细菌的培养液与一水草酸钙晶体(COM)混合(200ug/mL)孵育0，1，2，4，8小时，并在显微镜下观察一水草酸钙晶体(COM)聚集程度；△Flic-CFT073和WT-CFT073(106个/mL)菌液分别在新鲜培养液中混合重悬，分别与一水草酸钙晶体(COM)(200ug/mL)孵育0，1，2，4，8小时，并在显微镜下观察一水草酸钙晶体(COM)聚集程度。
所有实验至少重复三次。实验数据以SPSS16.0软件统计分析，两组的组间比较采用Student test比较，三组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*表示与Control组相比，具有统计学差异，P<0.05，#代表与WT-CFT073菌液/培养液组相比，具有统计学差异P<0.05。
2、实验结果
实验结果如图8所示，结果显示，UPEC在敲除了Flic基因后，无论细菌本身还是细菌培养液其对晶体聚集作用均降低。
实施例9△Flic-CFT073对肾小管上皮细胞对晶体粘附能力的影响
1、实验方法
分别将WT-CFT073、△PPK-CFT073、△Flic-CFT073等量接种于Terrific-Broth肉汤，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使细菌处于对数生长期。以细菌：细胞＝10：1的感染比例将各细菌加入肾小管上皮细胞(NRK-52E)中，37℃，5％CO2共同孵育1、2、3h，用无菌PBS缓冲液冲洗5遍以除去细胞外细菌，按20μg/cm2加入COM处理5min并用PBS洗去未粘附的COM。用显微镜观察比较WT-CFT073组、△PPK-CFT073组、△Flic-CFT073组的细胞-COM粘附情况。
所有实验至少重复三次。实验数据以SPSS16.0软件统计分析，两组的组间比较采用Student test比较，三组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*代表与Control组相比，具有统计学差异P<0.05。
2、实验结果
实验结果如图9所示，结果显示，与WT-CFT073组相比，△PPK-CFT073组、△Flic-CFT073组的细胞-COM粘附显著下降。
实施例10不同浓度鞭毛蛋白对肾小管上皮细胞晶体粘附能力的影响
1、实验方法
在37℃，5％CO2条件下，分别以浓度为0、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的鞭毛蛋白处理肾小管上皮细胞(NRK-52E)，然后用无菌PBS缓冲液冲洗，更换新鲜培养基后按20μg/cm2加入COM处理5min并用PBS洗去未粘附的COM。用显微镜观察比较不同浓度的鞭毛蛋白对细胞-COM粘附的影响。
实验至少重复三次。实验数据以SPSS16.0软件统计分析，两组的组间比较采用Student test比较，三组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*代表与Control组(0ng/mL组)相比，具有统计学差异P<0.05；#代表与其它组相比，具有统计学差异P<0.05。
2、实验结果
实验结果如图10所示，结果显示，与Control组(0ng/mL组)相比，50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的鞭毛蛋白处理组的细胞-COM粘附显著增加。
实施例11各组细菌对肾小管上皮细胞蛋白IκB/NF-κB/P38-MAPK信号分子表达的影响
1、实验方法
分别将WT-CFT073、△PPK-CFT073、△Flic-CFT073等量接种于Terrific-Broth肉汤，置于恒温摇床中，在37℃，250rpm条件下振荡8～9h，使细菌处于对数生长期。以细菌：细胞(NRK-52E)＝10：1的感染比例将各细菌加入肾小管上皮细胞中，37℃，5％CO2共同孵育5min，除去上清培养基，用预冷PBS缓冲液洗3遍；将细胞置于冰上，加入细胞裂解液，提取蛋白。用Western Blot方法检测IκB、NF-κB和p-P38等蛋白的表达情况。
2、实验结果
实验结果如图11所示，结果显示，与WT-CFT073菌液组相比，△Flic-CFT073菌液组的IκB、p-NFκB、p-P38等信号分子的表达显著下降。
以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治泌尿系结石的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述泌尿系结石为合并尿路致病性大肠埃希菌感染引起的泌尿系结石。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述防治泌尿系结石是抑制晶体对肾小管细胞的粘附、降低晶体在肾脏中的沉积和/或抑制晶体引起的细胞毒性。
4.鞭毛蛋白抗体及其衍生物在制备防治晶体引起的肾损伤的药物中的应用。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述晶体是草酸钙晶体。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肾损伤是指肾细胞损伤。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述肾细胞为肾小管上皮细胞。
8.根据权利要求1或4所述应用，其特征在于，所述鞭毛蛋白抗体为针对鞭毛蛋白的抗原设计的单克隆抗体或其多克隆抗体。
9.根据权利要求1或4所述应用，其特征在于，所述鞭毛蛋白抗体的衍生物包括以鞭毛蛋白抗体为母核的分子、类似物或其药物可接受的盐。
10.一种防治合并尿路致病性大肠埃希菌感染引起的泌尿系结石的药物，其特征在于，所述药物含有鞭毛蛋白抗体和/或其类似物。
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