CN113603753B - 靶向夏科-莱登结晶蛋白的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向夏科‑莱登结晶蛋白的多肽及其应用，所述的多肽包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物。本发明还涉及编码所述多肽的核酸，表达该多肽的重组载体及细胞。本发明提供了所述多肽在制备用于预防或治疗2型免疫疾病的药物中的应用。本发明还提供了一种非诊断目的的检测Gal‑10蛋白的方法。

Description

靶向夏科-莱登结晶蛋白的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及靶向夏科-莱登结晶蛋白的多肽及其应用。

背景技术

2型免疫是一种包含先天性免疫和适应性免疫并促使在黏膜表面形成免疫屏障清除病原体的特殊免疫反应。近些年的研究表明，2型炎症通路在过敏性疾病发生过程中起到重要作用。Th2细胞通过分泌2型细胞因子在2型炎症通路中起到关键作用。在抗原的刺激下，树突状细胞(DC)活化后促使T细胞分化为Th2细胞，释放2型细胞因子，继而激发IgE产生和嗜酸性粒细胞聚集等。

半乳糖凝集素是一种碳水化合物结合蛋白，参与许多生理功能，如炎症、免疫反应、细胞迁移、自噬和信号传导，它们还与纤维化、癌症疾病有关。到目前为止，在哺乳动物中总共16种半乳糖凝集素被发现，半乳糖凝集素10(Galectin-10)是Galectin超家族的成员，也称为Charcot Leyden晶体(CLC)蛋白。Galectin-10活跃地出现在各种嗜酸性粒细胞性疾病中。金黄色葡萄球菌及其外毒素可在慢性鼻-鼻窦炎鼻息肉(CRSwNP)的2型免疫中起到重要作用，并且金葡菌定植后诱导大量CLC形成，CLC的形成又可进一步促进2型免疫反应，并且可引起中性粒细胞的聚集，Galectin-10(Gal-10)与嗜酸性粒细胞的成熟分化及功能有密切联系。筛选可以靶向Gal-10蛋白的多肽有望将其应用于诊断或治疗2型免疫疾病，为诊断或治疗2型免疫疾病提供新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可应用于诊断或治疗2型免疫疾病的多肽。

本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了一种多肽，其特征在于，所述的多肽包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物。

所述的其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO.3的抑制CLCs诱导的免疫反应的活性。

进一步，所述变体包含与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了一种预防或治疗2型免疫疾病的药物组合物，所述的药物组合物包括本发明第一方面所述的多肽。

进一步，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

进一步，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

进一步，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

进一步，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

进一步，所述的药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的多肽在非诊断目的的检测Gal-10蛋白中的应用。

本发明第四方面提供了编码本发明第一方面所述的多肽的核酸。

本发明第五方面提供了包含本发明第四方面所述的核酸的重组载体。

本发明第六方面提供了包含本发明第四方面所述的核酸或本发明第五方面所述的重组载体的细胞。

进一步，所述的细胞包括原核细胞、真核细胞。

进一步，所述的原核细胞包括细菌细胞。

进一步，所述的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞。

进一步，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞。

本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第四方面所述的核酸或本发明第五方面所述的重组载体或本发明第六方面所述的细胞在制备预防或治疗2型免疫疾病的药物中的应用。

进一步，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

进一步，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

进一步，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

进一步，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

本发明第八方面提供了一种非诊断目的的检测Gal-10蛋白的方法，所述的方法包括：

(1)将样品与本发明第一方面所述的多肽接触；

(2)检测包含本发明第一方面所述的多肽的复合物的形成；

进一步，所述的检测包含本发明第一方面所述的多肽的复合物的形成的方法包括凝胶电泳、层析技术、免疫印迹分析、免疫组织化学、质谱和/或高压液相色谱。

本发明第九方面提供了本发明第一方面所述的多肽或本发明第四方面所述的核酸或本发明第五方面所述的重组载体或本发明第六方面所述的细胞在制备可用于诊断2型免疫疾病的产品中的应用。

进一步，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

进一步，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

进一步，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

进一步，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

附图说明

图1是RT-qPCR检测经不同浓度CLCs诱导的人鼻息肉黏膜上皮细胞的基因表达变化实验结果图，其中，图A是IL-1β表达变化统计图，图B是TNF-α表达变化统计图，图C是IL-6表达变化统计图，图D是GM-CSF表达变化统计图，图E是IL-8表达变化统计图；

图2是CLCs(100μg/mL)诱导24h时人鼻息肉黏膜上皮细胞的基因表达变化统计图，其中，图A是IL-1β表达变化统计图，图B是TNF-α表达变化统计图，图C是IL-6表达变化统计图，图D是IL-8表达变化统计图，图E是GM-CSF表达变化统计图；

图3是在细胞水平验证8种多肽抑制CLCs诱导的免疫反应实验结果图，其中，图A是IL-1β表达量统计图，图B是IL-6表达量统计图，图C是TNF-α表达量统计图，图D是IL-8表达量统计图；

图4是在细胞水平验证本发明所涉及的多肽抑制CLCs诱导的免疫反应实验结果图，其中，图A是IL-1β表达量统计图，图B是TNF-α表达量统计图，图C是IL-6表达量统计图,图D是IL-8表达量统计图，图E是GM-CSF表达量统计图。

具体实施方式

多肽

术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码的氨基酸及其相应的“D”形式的立体异构体(与天然的“L”形式相比)、Ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规的氨基酸(例如，α,α-双取代氨基酸、N-烃基氨基酸等)和经化学衍生化的氨基酸。

在明确列举氨基酸，诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，术语指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非另有明确规定。其它非常规的氨基酸也可以是适合于本发明多肽的组分，只要多肽保留期望的功能性特性。对于显示的肽，每个编码的氨基酸残基(在适当的情况中)由对应于常规氨基酸俗名的单字母名称代表。

多肽的“变体”包括插入、缺失和取代，其或是保守的或是非保守的。例如，保守取代指将相同通用类别(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)内的氨基酸用相同类别内的另一种氨基酸取代。如此，保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的意义是本领域中公知的。特别地，包括展现出可抑制CLCs诱导的免疫反应的活性的多肽的变体。

在一些实施方案中，所述的变体包含与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的氨基酸序列。

多肽的“融合物”包括对应于与任何其它多肽融合的参照序列(例如SEQ ID NO.3，或其片段或变体)的氨基酸序列。例如，所述多肽可以与多肽诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A融合以便于纯化所述多肽。此类融合物的例子是本领域技术人员公知的。类似地，所述多肽可以与寡组氨酸标签诸如His6或被抗体识别的表位诸如公知的Myc标签表位融合。另外，可以使用包含疏水性寡肽末端标签的融合物。本发明的范围中还包括与所述多肽的任何变体或衍生物的融合物。

融合物可以包含对本发明的所述多肽赋予期望特征的别的部分；例如，所述部分可用于检测或分离多肽，或促进多肽的细胞摄取。所述部分可以例如是生物素模块、链霉亲合素模块、放射性模块、荧光模块，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团，如本领域技术人员公知的。模块可以是免疫原性标签，例如Myc标签，如本领域技术人员已知的，或者可以是能够促进多肽的细胞摄取的亲脂性分子或多肽域，如本领域技术人员已知的。

本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以包含一个或多个例如通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的氨基酸。

如本领域中领会的，PEG化的蛋白质可以展现出降低的肾清除和蛋白水解、降低的毒性、降低的免疫原性和升高的溶解度。

为了获得具有最大延长的半衰期和保留的生物学活性的成功PEG化的蛋白质，可以影响后果的几项参数是重要的，并且应当进行考虑。PEG分子可以存在不同，并且已经用于蛋白质PEG化的PEG变体包括PEG及单甲氧基-PEG。另外，它们可以或是线性的或是分支的。

已经显示了提高PEG化的程度导致体内半衰期延长。然而，本领域技术人员应当领会，PEG化过程会需要以个体为基础对特定蛋白质进行优化。

PEG可以在天然存在的二硫键处偶联，如记载于WO 2005/007197的。可以经由添加不损害多肽结构的化学桥来稳定二硫键。这允许利用构成二硫键的两个硫的缀合硫醇选择性来创建用于对PEG进行位点特异性附接的桥。由此，避开了需要将残基工程化改造到肽中以附接于靶分子。

可以以任何合适的方式制备用于本发明的多肽。这样的多肽包括分离的天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方法的组合产生的多肽。用于制备这样的多肽的方法是本领域众所周知的。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的多肽的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的多肽的序列中。

本文所用的术语“编码多肽的核酸”包括包含编码本发明多肽、尤其是具有SEQ IDNO.3中所示氨基酸序列的多肽的序列的核酸。所述术语也包括这样的核酸：所述核酸包含编码所述多肽的单个连续区或多个不连续区(例如，由于整合噬菌体、整合插入序列、整合载体序列、整合转座子序列或由于RNA编辑或基因组DNA重建而间断的多核苷酸)以及额外的区，所述额外的区也可包含编码序列和/非编码序列。

构建本发明的重组载体的载体包括(但不限于)由Celltrion Inc.(韩国)生产的MarEx表达载体；市场上可广泛买到的pCDNA载体；F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，诸如λ噬菌体、λ形噬菌体、M13噬菌体、Mu噬菌体、P1噬菌体、P22噬菌体、Qμ噬菌体、T-偶数噬菌体、T2噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体等；植物病毒。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种载体的任意一种，且载体的选择依赖于所选择的细胞的性质。细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的载体和细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。

本发明的多肽可以通过多种技术中的任一种制备。通常，多肽可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生多肽，或通过将多肽的核酸分子转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许多肽的产生，其中所述多肽可以是重组的。术语“转染”的各种形式意在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核细胞的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核细胞中表达本发明的多肽，但是优选在真核细胞中表达多肽，并且最优选在哺乳动物细胞中表达，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠的多肽。当将编码多肽的核酸分子的重组表达载体引入哺乳动物细胞时，通过将细胞培养足以允许多肽在细胞中表达的一段时间，或更优选地，将多肽分泌至培养细胞的培养基。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收多肽。

药物组合物

“药学可接受的”意指不降低活性成分的无毒性材料。此类药学可接受缓冲液、载体或赋形剂是本领域中公知的(见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.RGennaro编,Mack Publishing Company(1990)及handbook of PharmaceuticalExcipients,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press(2000))。

术语“缓冲液”意图指以稳定pH为目的的含有酸-碱混合物的水溶液。缓冲液的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

本发明所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。

赋形剂可以是下列一种或多种：碳水化合物、聚合物、脂质和矿物。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇、和环状糊精，其被添加至组合物，例如以便于冻干。聚合物的例子是不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐(alginates)、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或具有各种组成的其共聚物、及聚乙烯吡咯烷酮(它们都具有不同分子量)，其被添加至组合物，例如以控制粘性，实现生物粘着，或保护活性成分免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单、二和三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同酰基链长度和饱和度)、卵卵磷脂(egg lecithin)、大豆卵磷脂、氢化的卵磷脂和大豆卵磷脂，其出于与聚合物相似的原因被添加至组合物。矿物的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加至组合物以获得诸如降低液体积累或有利的色素特性等益处。

本发明的药物组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的组合物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。

本发明的药物组合物的最佳给药途径的选择会受到几个因素的影响，包含组合物中活性分子的物理化学性质、临床表现的紧迫性和活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，可与载剂一起制备本发明的多肽，其中载剂将保护它们以防止快速释放(诸如控释制剂)，该载剂包含植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可在本发明中使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。进一步地，多肽可包被有防止多肽失活的材料或化合物、或与这样的材料或化合物同时给药。例如，多肽可与适当的载剂(例如脂质体或稀释剂)一起给药。

本发明的药物组合物的给药途径可分成口服给药和胃肠外给药。

口服剂型可被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊、软胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶或膏剂。这些制剂可包含药学赋形剂，其中药学赋形剂包括但并不限于：成粒剂和崩解剂，结合剂，润滑剂，防腐剂，着色剂、调味剂或甜味剂，植物油或矿物油，湿润剂，和增稠剂。

由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’s solution)、汉克溶液(Hank’ssolution)、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。

其他

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明的技术领域中的本领域技术人员通常所理解的含义相同的含义。

术语“夏科-莱登晶体”、“CLCs”、“CLC晶体”、“CLC”在本文中可互换使用，是指由半乳糖凝集素-10形成的晶体。由半乳糖凝集素-10形成的晶体通常为双锥体六边形晶体，长度为大约20-40μm，宽度为大约2-4μm。

术语“半乳糖凝集素-10”(或Gal10或Gal-10)是指小的疏水性聚糖结合蛋白，其自结晶形成夏科-莱登晶体。半乳糖凝集素-10也称为夏科-莱登晶体蛋白(CLCP)、嗜酸性粒细胞溶血磷脂酶和溶血卵磷脂酰基水解酶。术语“半乳糖凝集素-10”足够宽泛，可以涵盖人蛋白质和任何物种同源物。

术语“特异性”是指结合给定靶标(例如CLC晶体)的能力。多肽可以是单特异性的并且含有一个或多个特异性结合靶标的结合位点，或者多肽可以是多特异性的并且含有两个或更多个特异性结合相同或不同靶标的结合位点。

术语“分离的”是指天然状态的“人为”改变。如果一种“分离的”组合物或物质存在于自然中，那么它的原始环境已改变、或已从其原始环境中取出、或者两者兼而有之。作为本文使用的此术语，例如在活的动物中天然存在的多肽并不是“分离的”，但与其天然状态共存的物质分开的所述多肽是“分离的”。

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实验材料：

一、质粒：将Gal-10蛋白序列进行人源化密码子优化后，在其N末端加上促溶片段，通过NcoI/XhoI双酶切位点克隆到pET-28a载体质粒上形成pET-28a-Gal10-TEV-6XHis。Gal-10蛋白序列如表1所示，带促溶片段的Gal-10蛋白序列如表2所示。

表1 Gal-10蛋白序列

表2带促溶片段的Gal-10序列

二、试剂材料和仪器设备

1、化学试剂：卡那霉素(Kanamycin)和氨苄青霉素(Ampicillin)购自天根生物技术有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)和大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金公司；SDS、Trizol和咪唑购自Sigma公司；TEV酶购自北京义翘神州有限公司；考马斯亮蓝染液(自制)；cDNA逆转录试剂购自Takara公司；实时荧光定量PCR试剂购自爱博泰克生物；多肽合成于国平药业有限公司，序列如表2所示。

表2多肽序列

2、耗材和仪器设备：10cm细胞培养皿、12孔细胞培养板购自CORNING公司；细胞培养用BEGM培养基购于Lonza公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS、消化液(2.5g/L胰酶，0.02g/L EDTA，pH＝8.0，0.22μm过滤)、青霉素(20mg/mL)、链霉素(20000U/mL)购自GIBCO公司；Ni-NTA亲和层析柱购自GE公司；10kDa浓缩管购自Millipore公司。电热恒温培养箱(XMTD HH.B11-600)；PCR仪(Biometra Tgradient)；台式离心机(eppendorf，Centrifuge5415D)；电热恒温水箱(SHHW21600)；微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000)；电子天平(Sartorius 2000S)；电子分析天平(Sartorius，BS110S)；光学倒置显微镜(XDS-1B)；微量移液器(eppendorfResearchplus)；细胞CO2培养箱(SANYO)；-80℃超低温冰箱(SANYO，MDF-382E)；pH计(Thermo Orion 868)；磁力搅拌器(IKARH-KT/C)；酶标仪(Bio-Rad，680)；超声波破碎仪；

pure25蛋白质纯化系统(superdex 75,GE Healthcare)；SDS-PAGE电泳仪(Bio-Rad)；凝胶成像仪(Molecular Imager Gel Doc XR,Bio-Rad)；ABI PCR仪器(ABI7500)。

实施例1构建CLCs诱导人鼻黏膜上皮细胞的天然免疫因子激活的体外模型

一、实验方法：

1、Gal-10重组蛋白的表达与纯化和CLCs的产生

(1)转化：

A.取一支BL21(DE3)感受态细胞至于冰上融化；

B.将pET-28a-gal10-TEV-6His重组质粒0.5μL加入其中，冰上孵育15-20min；C.热激：42℃水浴热激90s；

D.快速置于冰上，冰浴5min；

E.加入500μL无抗性LB，于37℃恒温培养箱培养40-50min；

F.取40μL菌液，接种于Kanamycin(25mg/mL)的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱培养过夜。

(2)细菌培养：

以Kanamycin(25mg/mL)作为选择标记，挑取上步平板上的阳性单克隆BL21(DE3)/pET-28a-gal10-TEV-6His，接种于20mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，于37℃、210r/min摇床振荡培养12h。将菌液按1∶100的比例接种含卡那霉素的1LLB液体培养基，37℃、210r/min振荡条件下培养。

(3)目的蛋白的诱导表达和获得：

A.当大肠杆菌的600nm(OD 600)的光密度为0.6-0.8h，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃下摇床培养过夜，诱导目的蛋白的表达；

B.将过夜表达的细菌培养液富集，6000×g、4℃离心20min，弃上清。用缓冲液Lysis Buffer重悬，将其集中于一个烧杯中，体积约为75-100mL，即可按1：100的比例加入PMSF(终浓度为1mM)，保护目的蛋白；

C.超声破碎细菌：功率25％，工作时间25min，超声开时间3s，超声关时间9s；离心(4℃、13,000×g、30min)除去细胞碎片，同时将细胞破碎后释放的核酸打碎，离心沉淀，使细胞裂解液不粘稠，有利于后续处理。收集上清液，可溶性目的蛋白即存在于上清液中。

(4)Gal-10蛋白的纯化：

A.Ni-NTA亲和柱层析

a.平衡Ni柱：用Lysis Buffer穿出Ni柱约2-3个柱体积的容量，即可开始洗脱蛋白；

b.离心得到的上清上样，穿出Ni柱2-3遍；

c.用含20mM咪唑和0.1％Empigen洗涤剂的Lysis Buffer洗柱子，洗脱杂蛋白；

d.用含500mM咪唑的Lysis Buffer洗柱子，使目的蛋白与镍柱去结合；

e.浓缩：将洗脱收集的目的蛋白置入10kDa浓缩管中，4℃，2000×g离心10min，浓缩过程中加入少量Lysis Buffer或PBS对咪唑进行稀释，防止目的蛋白聚集沉淀。

B.

pure 25蛋白纯化

a.清洗层析柱：使用无菌水对层析柱进行清洗，约清洗8mL。再将泵头放在PBS溶液中，重复上述步骤并执行，约清洗36mL；

b.参数：System flow:0.5mL/min；Column position:3；Alarm deltacolumnpressure enabled:1.5；Alarmpre columnpressure enabled:5；

c.上样：先用PBS冲洗两三次上样环，再将2mL浓度约为6.35mg/mL的样品打入上样环，最后稍微吸取PBS再打入上样环中，避免样品残留。将收集管摆好，选择inject valve:inject；

d.收集：至代表蛋白含量的UV 280标识线出现上升时，利用样品自动收集器收集目标蛋白，设置每管的收集量为0.3mL；

e.清洗层析柱：待收集完样品后，将泵头置于PBS中，继续运行至通过20mL，替换为无菌水进行清洗，运行10ml，后替换为20％的乙醇溶液运行20mL，即可关机；

f.蛋白处理：将收集好的蛋白测出每管浓度并标记，置于液氮中速冻，于-80℃冰箱冷冻保存。实验前室温静置缓慢融化。

C.表达产物的SDS-PAGE鉴定

a.样品准备：全菌样品，离心后上清样品，蛋白上清穿出层析柱后样品，20mM咪唑穿出样品，500mM咪唑穿出样品，分子筛中峰头、峰尖和峰尾三处收集的蛋白样品；

b.配胶：5％浓缩胶；根据蛋白的大小，选择15％的分离胶；

c.制样：2×Loading Buffer与样品1:1混合；

d.上样：全菌样品5μL，marker 3μL，其余样品10μL；

e.染色：将蛋白胶置于考马斯亮蓝染液中，微波中高火，2min；

f.脱色：将染色完成后的蛋白胶置于自来水中，微波高火，20-40min。

(5)CLCs的产生与浓度测定：

A.TEV酶和pET-28a-gal10-TEV-6His重组蛋白按质量比1:10的比例混合，4℃摇床酶切孵育过夜；

B.600×g、4℃条件下离心10min，离心完成后吸去上清，并加入适量PBS重悬，重复三次，即得到纯净的CLCs。

C.BCA法检测CLCs的浓度。

2、人鼻息肉组织上皮细胞的获取

(1)组织酶切消化：

A.将手术取下的粘膜标本放入无菌生理盐水。

B.将标本取出用5mL组织冲洗液(含有青链霉素200μg/mL的生理盐水)浸泡4℃1小时。

C.将浸泡好的标本放入6cm的培养皿上，用PBS+双抗反复冲洗(可多冲洗几遍，一般≥10遍)，洗净标本上的血块和污物，可以放置在解剖显微镜下将标本上的粘液以及血管剔除。

D.将清理后的标本放入15mL离心管中，加入10mL人蛋白酶原溶液(collagenasetype 2和Dnase I)。

E.取人胎盘胶原(Collagen I)包被10cm培养皿，2mL/孔，37℃过夜。

(2)鼻黏膜上皮细胞接种：

A.在消化好的组织管中加入2mL全血清培养液，反复震荡20s。

B.取出上清，再次加入5mL全血清培养液，反复震荡20s，再次取出上清。

C.将取出的上清，800r 5min离心，去上清。

D.加入1mL全血清培养液，放入6cm培养皿预贴壁1h。

E.将包被的培养皿的人胎盘胶原吸出(包被≤3次的回收)，蒸馏水冲洗≥10遍(宁多不少)。紫外灯照射消毒20min。

F.6cm培养皿吸取上清，加入5mL全血清培养液，800r 5min离心。弃上清(尽量吸取干净)。

G.加入3mL红细胞裂解液混匀细胞，室温裂解5min，800r 5min离心，弃上清。

H.3mL无菌PBS清洗后，800r 5min离心，弃上清，用BEGM重悬。

I.取1μL，加9μLPBS，混匀后加入细胞计数板计数。

J.细胞计数：(细胞悬液细胞数)/mL＝(n个格细胞数/n)×16×10⁴

K.计数后按照2×10⁶加入至包被好的10cm培养皿中，加入12mLBEGM上皮培养基。

3、CLCs刺激人鼻黏膜上皮细胞

(1)鼻黏膜上皮细胞接种：

A.鼻息肉的原代鼻黏膜上皮细胞长至85-90％左右，弃去培养基，用2mL无菌PBS清细后用2mL 0.25％的胰蛋白酶37℃消化4-5min后加入1mL含有FBS的完全培养基终止。

B.将细胞吹打至单细胞悬液后，800r 5min离心，弃上清。

C.细胞计数后将2×10⁵个细胞铺至12孔板/孔，用1mLBEGM培养基培养。

(2)CLCs刺激鼻黏膜上皮细胞模型：

A.12孔板培养约2天，待原代鼻黏膜上皮细胞长至80％左右，弃去培养基，用含有不同CLC浓度的BEGE培养基继续培养24h。

B.收取细胞上清，4℃800r 5min离心后取上层液体-80℃冰箱冻存备用。

C.用1mL无菌PBS清洗细胞后加入1mLTrizol/孔裂解细胞，用于RNA提取。

4、RNA的提取和cDNA逆转录

(1)RNA提取：

A.将冻存于-80℃冰箱的细胞或组织保存在Trizol中的裂解液置于冰上缓慢解冻。

B.待RNA样品完全解冻后，将样品拿到室温放置10min，使RNA充分溶解。

C.按200μL氯仿/mLTrizol的体积比加入氯仿，并用力振荡使其充分混匀，室温放置15min。

D.4℃12000r·min^-1离心15min。

E.将上层水相转移至新的无RNase的1.5mL离心管中。

F.按800μL异丙醇/mL水相的体积比加入预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10-15min。

G.4℃12000r·min^-1离心10min，弃上清后可见离心管底部有RNA沉淀。

H.加入1mL 750mL/L用DEPC处理的H₂O配置的乙醇，温和振荡离心管，使沉淀重悬。

I.4℃12000r·min^-1离心5min，尽量弃上清。

J.重复步骤8-9。

K.室温晾干5-10min，待750mL/L乙醇蒸发完后即可。

L.根据RNA沉淀的大小用25-100μLDEPC处理过的H₂O来溶解RNA沉淀。

M.取1μLRNA样品用微量紫外分光光度计NanoDrop2000(Thermo Scientific)测定RNA浓度和纯度。并取1μL(大于100ng即可)混合7μLDEPC处理过的H₂O和2μL的5×RNALoading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。若RNA完整性很好，其28S与18S的亮度比约为2:1。

(2)RNA逆转录成cDNA：

根据Takara公司的cDNA Reverse Transcription Kits(cat.no RR036A)的说明书进行cDNA的逆转录。

1)5×PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time):2μL

1×Total RNA:0.5μg

RNase Free dH₂O up to 10μL

2)轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:

37℃15min(反转录反应)

85℃5sec(反转录酶的失活反应)

4℃短期保存。

5、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测基因表达变化

实时荧光定量PCR实验步骤按照ABclonal SYBGreen Mix的说明书进行。

(1)在每个反应体系中加入的组分如下：

表3 RT-qPCR反应体系

(2)将反应体系加入到384孔板中，并在384孔板上平整贴好封膜，1500r·min^-1离心2min。

(3)将384孔板按照仪器的说明放入到反应托架上，并设置如下的反应程序。

(4)反应结束后，设置好样品顺序和检测的基因等信息，使用系统软件分析数据。系统程序将根据目的基因和内参基因的Ct值自动计算出该检测基因基因的相对表达值。

(5)使用的算法为：基因相对表达量值＝2^{(-(Ct目的基因-Ct内参))}，最后将对照达量设为

1，即可算出其它样品该基因的相对表达值。

二、实验结果

如图1所示，不同浓度的CLC晶体可引起人鼻黏膜上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-8的表达增加，且呈浓度梯度依赖。如图2所示，CLCs(100μg/mL)诱导24h后，人鼻黏膜上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-8的表达显著增加，差异具有统计学意义。该实验结果证明成功构建CLCs诱导人鼻黏膜上皮细胞的天然免疫因子激活的体外模型。

实施例2可与CLC晶体或与Gal-10蛋白结合的多肽序列的筛选

一、实验方法

1、利用多肽芯片筛选可与CLCs结合的多肽：

实验室自制多肽芯片(含有400条不同的多肽序列)，通过分别将对照组-EGFP荧光蛋白和实验组-EGFP蛋白标记的CLCs与芯片孵育，筛选出可与CLCs作用的多肽序列。

(1)将多肽芯片用5％的BSA摇床孵育1h。

(2)弃去BSA，并用TBST清洗3次。

(3)分别对两块相同的多肽阵列加入EGFP荧光蛋白标记的Gal-10和EGFP蛋白，摇床室温孵育1h。

(4)用TBST清洗4次，每次摇床摇10min。

(5)使用Fluorescence Detection FLA9500进行荧光检测。

2、利用噬菌体展示技术筛选与Gal-10蛋白结合的多肽：

(1)淘洗：

A.以0.1M NaHCO₃(PH 8.6)稀释靶点蛋白(带促溶标签的Gal10蛋白)至100μg/mL，铺1.5mL在6cm的塑料培养皿中置于湿盒中，4℃震荡过夜。

B.将蛋白包被的平皿反扣在洁净的纸巾上，靶点蛋白，加1.5mLBlocking buffer(现用现配)至少1h。去除Blocking buffer，用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。反扣在洁净纸巾上，洗涤要迅速，避免平皿干燥。

C.用1mL TBS稀释噬菌体(10μLphage+1mLTBS)，加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。

D.(4)1mL洗脱缓冲液(含BSA，现用现配)洗脱结合的噬菌体，轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μL 1M Tris-HCL(PH 9.1)中和。

E.测滴度以确定下一轮淘洗的稀释倍数。

(2)扩增噬菌体：

A.将洗脱物加入20mL ER2738培养物中(对数早期，按1：100的比例稀释过夜培养的大肠杆菌)，37℃剧烈振摇孵育4.5h。

B.将培养物转入微量离心管中，4℃，12000g，10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。

C.将80％的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体过夜。

D.4℃，12000g，15min离心上清，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。

E.用1mLTBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃，14000rpm离心5min使残留的细胞沉淀，弃沉淀。

F.将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃，14000rpm离心10min，弃上清，再次短暂离心，吸去残留的上清。

G.用200μLTBS，悬浮沉淀物，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。(扩增的洗脱液用于下一轮淘洗)

(3)滴度测定：

A.微波炉融化上层琼脂，分成3mL等份于灭菌试管中，保存于45℃水浴锅中备用。37℃预温LB/IPTG/Xgal平板。

B.在LB中准备梯度稀释的噬菌体。

C.取OD6000.5时的ER2738，分成200μL等份于微量离心管中，每管加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。

D.将感染大肠杆菌加入45℃预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

E.待平板冷却后，倒置于37℃培养过夜。

F.次日计数有1-100个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。或用于挑取单克隆。

(4)提噬菌体DNA：

A.用200μL的枪头刺取单个蓝加入到OD0.05的菌液中，摇4.5h。

B.将培养物4℃，14000rpm，30s，转移上清，再次离心。转移80％的上清(可在4℃保存数周)。

C.转移500μL在新的微量离心管中，加入200μL的PEG，室温下静置10-20min。

D.4℃，14000rpm，10min，弃上清，再次离心。

E.加入100μL碘化物溶液，使沉淀物完全溶解，加入250μL的乙醇，室温10-20min。

F.4℃，14000rpm，10min，弃上清，加入70％的乙醇，再次离心，弃上清，真空干燥，使用30μLPCR级的纯水溶解DNA，即可送去测序。

G.根据测序结果即可获得与带促溶标签的Gal-10可能存在相互作用的多肽。

3、在细胞水平验证多肽抑制CLCs诱导的免疫反应

将多肽(50μM)与CLCs(100μg/ml)共同刺激实施例1中步骤3的第(1)步所培养起来的细胞，24h后收集细胞RNA并进行逆转录和qPCR。

二、实验结果

基于上述方法，本发明共筛选了8种可能与Gal10蛋白结合的多肽，本发明所涉及的多肽(#8)可与CLCs结合。在细胞水平验证这8种多肽抑制CLCs诱导的免疫反应的实验结果，如图3所示(图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001)。如图4所示，本发明所涉及的多肽(#8)可以有效抑制CLC晶体(100μg/mL)导致的人鼻黏膜上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和GM-CSF的表达升高。上述实验结果证明，本发明所涉及的多肽能够有效抑制CLC晶体激活的天然免疫反应。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

首都医科大学附属北京同仁医院

<120> 靶向夏科-莱登结晶蛋白的多肽及其应用

<141> 2021-08-31

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Leu Leu Pro Val Pro Tyr Thr Glu Ala Ala Ser Leu Ser Thr

1 5 10 15

Gly Ser Thr Val Thr Ile Lys Gly Arg Pro Leu Ala Cys Phe Leu Asn

20 25 30

Glu Pro Tyr Leu Gln Val Asp Phe His Thr Glu Met Lys Glu Glu Ser

35 40 45

Asp Ile Val Phe His Phe Gln Val Cys Phe Gly Arg Arg Val Val Met

50 55 60

Asn Ser Arg Glu Tyr Gly Ala Trp Lys Gln Gln Val Glu Ser Lys Asn

65 70 75 80

Met Pro Phe Gln Asp Gly Gln Glu Phe Glu Leu Ser Ile Ser Val Leu

85 90 95

Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val Asn Gly Gln Ser Ser Tyr Thr Phe

100 105 110

Asp His Arg Ile Lys Pro Glu Ala Val Lys Met Val Gln Val Trp Arg

115 120 125

Asp Ile Ser Leu Thr Lys Phe Asn Val Ser Tyr Leu Lys Arg

130 135 140

<210> 2

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Thr Thr His His His His His His Asp Thr Asp Ile Pro

1 5 10 15

Thr Thr Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Asp Asp Asp Asp Lys Glu Asn

20 25 30

Leu Tyr Phe Gln Gly His Met Met Ser Leu Leu Pro Val Pro Tyr Thr

35 40 45

Glu Ala Ala Ser Leu Ser Thr Gly Ser Thr Val Thr Ile Lys Gly Arg

50 55 60

Pro Leu Ala Cys Phe Leu Asn Glu Pro Tyr Leu Gln Val Asp Phe His

65 70 75 80

Thr Glu Met Lys Glu Glu Ser Asp Ile Val Phe His Phe Gln Val Cys

85 90 95

Phe Gly Arg Arg Val Val Met Asn Ser Arg Glu Tyr Gly Ala Trp Lys

100 105 110

Gln Gln Val Glu Ser Lys Asn Met Pro Phe Gln Asp Gly Gln Glu Phe

115 120 125

Glu Leu Ser Ile Ser Val Leu Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val Asn

130 135 140

Gly Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Asp His Arg Ile Lys Pro Glu Ala Val

145 150 155 160

Lys Met Val Gln Val Trp Arg Asp Ile Ser Leu Thr Lys Phe Asn Val

165 170 175

Ser Tyr Leu Lys Arg

180

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Ser Gln Phe Pro Gln Thr Pro Arg Leu Tyr Glu

1 5 10

Claims (30)

1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种预防或治疗2型免疫疾病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

7.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的缓冲液包括Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。

11.权利要求1所述的多肽在非诊断目的的检测Gal-10蛋白中的应用。

12.编码权利要求1所述的多肽的核酸。

13.包含权利要求12所述的核酸的重组载体。

14.包含权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的重组载体的细胞。

15.根据权利要求14所述的细胞，其特征在于，所述的细胞包括原核细胞、真核细胞。

16.根据权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述的原核细胞包括细菌细胞。

17.根据权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞。

18.根据权利要求17所述的细胞，其特征在于，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞。

19.权利要求1所述的多肽或权利要求2-10任一项所述的药物组合物或权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的重组载体或权利要求14所述的细胞在制备预防或治疗2型免疫疾病的药物中的应用。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

24.一种非诊断目的的检测Gal-10蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将样品与权利要求1所述的多肽接触；

(2)检测包含权利要求1所述的多肽的复合物的形成。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的检测包含权利要求1所述的多肽的复合物的形成的方法包括凝胶电泳、层析技术、免疫印迹分析、免疫组织化学、质谱和/或高压液相色谱。

26.权利要求1所述的多肽或权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的重组载体或权利要求14所述的细胞在制备可用于诊断2型免疫疾病的产品中的应用。

27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

29.根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

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