CN113748123A - 用于治疗肺部炎症的组合物 - Google Patents

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CN113748123A CN202080018864.XA CN202080018864A CN113748123A CN 113748123 A CN113748123 A CN 113748123A CN 202080018864 A CN202080018864 A CN 202080018864A CN 113748123 A CN113748123 A CN 113748123A
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陈碧银·阮
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Abstract

本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78‑激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽以及编码所述多肽的可表达核酸。此类药剂的用途，以及用于诱导肺泡巨噬细胞凋亡和/或用于治疗、改善或预防炎症或肺部疾病的方法，肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、哮喘、急性肺损伤(ALI)、肺纤维化和/或急性呼吸窘迫综合征。

Description

用于治疗肺部炎症的组合物
技术领域
本发明一般地涉及炎症的治疗。更具体地，本发明涉及基于Isthmin 1(ISM1)的肺部炎症的治疗。
背景技术
肺部炎症，无论是急性还是慢性，都可能具有严重的健康后果。根据世界卫生组织(WHO)，慢性阻塞性肺疾病(COPD)是2016年第三大常见死因。它被认为是主要的社会经济和健康负担，2004年仅在美国的直接医疗保健费用就达200亿美元。在新加坡，在2010年，COPD估计每年给患者和医疗保健机构造成1.65亿新元的费用，住院人数超过10,000人，对公共卫生体系构成重大负担。COPD的特征可以是进行性肺气肿(肺泡不可逆的扩张或肺泡壁破坏)和慢性呼吸道炎症，导致肺功能严重下降。目前，没有有效的治疗可以减缓/逆转肺气肿。吸烟可能是COPD的主要风险因素，并且与COPD的进展和恶化密切相关。其他风险因素可包括空气污染。
事实上，COPD目前是全球第三大死因，估计累积的终生风险为25％，社会经济负担高(Gershon,Warner et al.,2011,Mortality&Causes of Death,2016)。COPD的发病机理被认为涉及肺稳态的扰动和对来自环境的外源性因子的失调免疫响应，香烟烟雾(CS)、生物质燃料暴露和空气污染是主要风险因素(Singh,Agusti et al.,2019)。COPD的标志性特征包括肺气肿和慢性阻塞性支气管炎(呼吸道发炎)。COPD患者呈现持续性呼吸道症状，并伴有进行性长期肺功能损害。然而，传统的药物干预只为患者提供症状缓解，并且不针对潜在的组织损伤和炎症，因此它们不能有效地阻止COPD进展或降低死亡率。因此，对新型COPD疗法的迫切需求未得到满足。
呼吸道不断暴露在含有灰尘和微生物的外部环境中。为了避免对周围环境刺激的炎症响应，健康的气道和肺具有抑制免疫响应和炎症的机制。此外，针对损伤或病原体，急性肺部炎症响应保护宿主免受全身感染并恢复组织内稳态。然而，当急性炎症在幅度或持续时间上不受限制时，它可能导致以过度或慢性炎症为特征的肺部疾病，包括哮喘和/或COPD。哮喘主要影响大气道，而COPD影响小气道和肺实质。COPD的分子机制尚知之甚少。
同时，由于感染或损伤导致的严重急性肺部炎症，如急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是严重的临床综合征，在没有有效药物治疗的情况下死亡率高达50％。开发用于急性和慢性肺部炎症的疗法的需求尚未得到满足。
需要用于炎症相关疾病或病症且特别是影响肺的那些炎症相关疾病或病症的替代性、附加的和/或改进的治疗和/或治疗方法。
发明内容
健康的成人有能力在周围环境条件下调节和维持肺部稳态，防止无菌性炎症。免疫响应可能由损伤和/或感染触发，导致急性炎症，最终消退以允许伤口愈合和恢复。未能消退急性炎症可能导致慢性炎症和/或炎症相关疾病，诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、慢性阻塞性支气管炎和/或肺纤维化。诸如急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等急性肺病也与肺部炎症有关。
如本文中详细描述的，本发明人现已开发出用于治疗炎症诸如肺部炎症的多肽、核酸、组合物和方法，它们源自Isthmin 1，这是一种分泌蛋白，本文所述的研究表明其在抑制、阻止和/或消退炎症(尤其是肺部炎症)中发挥作用。在本文所述的研究中，向肺补充外源性重组ISM1蛋白(rISM1)抑制了ISM1-缺陷肺中的肺部炎症表型，并且结果表明ISM1可能通过诱导肺泡巨噬细胞凋亡来帮助消退炎症。结果表明，ISM1可在抑制和/或消退无菌性肺部炎症和/或由感染和/或损伤引发的炎症中发挥重要作用。
在一个实施方式中，本文提供了一种组合物，包含：
多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸，该多肽或肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％
序列同一性的氨基酸序列；和
药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
该组合物被配制用于向受试者的肺部给药。
在上述组合物的另一实施方式中，组合物可以被配制用于气管内给药、鼻内给药或吸入给药。
在任何上述一种或多种组合物的又另一实施方式中，组合物可以被配制用于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。
在任何上述一种或多种组合物的还另一实施方式中，组合物可以被配制为干粉用于通过气雾化向肺部给药的，或被配制为液体用于通过雾化向肺部给药。
在任何上述一种或多种组合物的另一实施方式中，组合物可以用于在对其对其有需要的受试者中靶向细胞表面GRP78(csGRP78)中使用。
在任何上述一种或多种组合物的又另一实施方式中，组合物可以用于在对其对其有需要的受试者中诱导促炎细胞凋亡中使用。
在任何上述一种或多种组合物的还另一实施方式中，组合物可以在对其对其有需要的受试者中用于诱导肺泡巨噬细胞(AM))凋亡，或用于降低AM水平中使用。
在任何上述一种或多种组合物的另一实施方式中，组合物可以用于在对其对其有需要的受试者治疗、改善或预防肺部炎症中使用。
在任何上述一种或多种组合物的又另一实施方式中，组合物可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症中使用。
在任何上述一种或多种组合物的还另一实施方式中，组合物可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎、哮喘或肺气肿中使用。
在任何上述一种或多种组合物的另一实施方式中，组合物可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中使用。
在任何上述一种或多种组合物的又另一实施方式中，组合物可以用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖中使用。
在任何上述一种或多种组合物的还另一实施方式中，组合物可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化中使用。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸在对其有需要的受试者中用于调节GRP78活性的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中诱导促炎细胞凋亡的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸在对其有需要的受试者中用于肺泡巨噬细胞(AM)凋亡或用于降低AM水平的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎、哮喘或肺气肿的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖的用途。
在又另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化的用途。
在任何上述一种或多种用途的还另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以用于向受试者的肺部给药。
在任何上述一种或多种用途的另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以用于气管内给药、鼻内给药或吸入给药至受试者。
在任何上述一种或多种用途的又另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以作于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。
在任何上述一种或多种用途的还另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以被配制为干粉用于通过气雾化向肺部给药的，或被配制为液体用于通过雾化向肺部给药。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性、靶向和结合GRP78、或两者的方法，所述方法包含：
向对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中诱导促炎细胞凋亡的方法，该方法包括：
向对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡或降低AM水平的方法，该方法包括：
向对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症的方法，该方法包括：
向对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的方法，该方法包括：
向对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎、哮喘或肺气肿的方法，该方法包括：
向所述对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，该方法包括：
向对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖的方法，该方法包括：
向所述对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了一种在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化的方法，该方法包括：
向所述对其有需要的受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在任何上述一种或多种方法的又另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以用于向所述对其有需要的受试者的肺部给药。
在任何上述一种或多种方法的还另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以用于气管内给药、鼻内给药或吸入给药至所述受试者。
在任何上述一种或多种方法的另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以用于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。
在任何上述一种或多种方法的又另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以被配制为干粉用于通过气雾化向肺部给药，或被配制为液体用于通过雾化向肺部给药。
在任何上述一种或多种方法的还另一实施方式中，方法还可以包括以下步骤：
确定受试者中的ISM1水平，确定受试者中的GRP78蛋白水平，或两者；和
在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平降低的ISM1水平的情况下；在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的GRP78蛋白水平的情况下；或两者，进行或重复给药步骤。
在又另一实施方式中，本文提供了一种肺部药物递送装置，其包含多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸，该多肽或肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在上述肺部药物递送装置还另一实施方式中，肺部药物递送装置可以包含如本文定义的组合物。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的又另一实施方式中，肺部药物递送装置可以是气管内药物递送装置、鼻内药物递送装置或吸入药物递送装置。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的还另一实施方式中，肺部药物递送装置可以是气雾剂、吸入器或喷雾器。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的另一实施方式中，肺部药物递送装置可以是气雾剂，并且多肽或肽或核酸可以被配制为干粉，或者其中所述肺部药物递送装置可以是喷雾器并且多肽或肽或核酸可以被配制为液体。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的又另一实施方式中，肺部药物递送装置可以用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的还另一实施方式中，肺部药物递送装置可以用于在对其有需要的受试者中在促炎细胞中诱导凋亡中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的另一实施方式中，肺部药物递送装置可以用于在对其有需要的受试者中诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡或降低AM水平中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的又另一实施方式中，肺部药物装置可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的还另一实施方式中，肺部药物装置可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的另一实施方式中，肺部药物装置可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎、哮喘或肺气肿中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的又另一实施方式中，肺部药物装置可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的还另一实施方式中，肺部药物装置可以用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的另一实施方式中，肺部药物装置可以用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化中使用。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的又另一实施方式中，肺部药物递送装置可以是喷雾器、计量剂量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI)。
在任何上述一种或多种组合物的又另一实施方式中，组合物还可以包含用于预防或减少肺部炎症的药剂。
在任何上述一种或多种用途的又另一实施方式中，多肽或肽或核酸可以与用于预防或减少肺部炎症的药剂组合使用。
在任何上述一种或多种方法的另一实施方式中，方法还可以包括与多肽或肽或核酸组合、同时或顺次向受试者给药用于预防或减少肺部炎症的药剂的步骤。
在任何上述一种或多种肺部药物递送装置的又另一实施方式中，肺部药物递送装置还可以包括用于预防或减少肺部炎症的药剂。
在另一实施方式中，本文提供了一种包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸，其用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症。
在另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症的用途。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症的方法，该方法包含：
向受试者给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸在药剂制造中的用途。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的方法，所述方法包含：
向受试者的肺给药GRP78-激活剂。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于识别患有与肺部炎症相关的肺部疾病或病症或者具有发展与肺部炎症相关的肺部疾病或病症风险的受试者的方法，该方法包含：
确定受试者中的ISM1水平，确定受试者中的GRP78蛋白水平，或两者；和
在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平降低的ISM1水平的情况下；在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的GRP78蛋白水平的情况下；或两者的情况下，将所述受试者识别为患有与肺部炎症相关的肺部疾病或病症，或者具有发展与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的风险。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于识别用本文定义的方法治疗的候选受试者的方法，该方法包含：
确定受试者中的ISM1水平，确定受试者中的GRP78蛋白水平，或两者；和
在确定出相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平，所述受试者中的ISM1水平降低的情况下；在确定出相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平，GRP78蛋白水平增加的情况下；或两者的情况下，将所述受试者识别为治疗的候选受试者。
在另一实施方式中，本文提供了包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸用于在对其有需要的受试者中维持肺部稳态和/或消退肺部炎症和/或促进肺部修复同时减少重塑的用途。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中维持肺部稳态和/或消退肺部炎症和/或促进肺部修复同时减少重塑的方法，该方法包含：
向受试者的肺部给药包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸。
在任何上述组合物、用途、方法、肺部药物递送装置或多肽的另一实施方式中，多肽可以是或可以包含ISM1蛋白(前体或成熟的)。在另一实施方式中，多肽可以是或包含人类ISM1蛋白或小鼠ISM1蛋白(前体或成熟的)。
在任何上述组合物、用途、方法、肺部药物递送装置、或多肽或肽的另一实施方式中，多肽或肽可以包含以下氨基酸序列或可以由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:26)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:27)
或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在任何上述组合物、用途、方法、肺部药物递送装置、或多肽或肽的另一实施方式中，多肽或肽可以包含以下氨基酸序列或者可以由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24–小鼠ISM1 287-461)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25–人类ISM1 290-464)；
或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
以任何上述组合物、用途、方法、肺部药物递送装置、或多肽或肽的另一实施方式中，多肽或肽可以包含内源性成熟ISM1的序列或者可以由内源性成熟ISM1的序列组成。
在任何上述组合物、用途、方法、肺部药物递送装置、或多肽或肽的另一实施方式中，多肽或肽可以不是内源性前体或成熟ISM1。在某些实施方式中，多肽或肽可以长于或短于内源性前体或成熟ISM1。在某些实施方式中，多肽或肽可以包含未在内源性前体或成熟ISM1中发现的至少一个取代或突变。在某些实施方式中，多肽或肽可以在SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27中包含RKD至RAA突变、或RKD至AAA突变。
附图说明
从以下参考附图的描述，这些和其他特征将变得更加明显，其中：
图1的A-N示出了ISM1缺失导致肺部肺气肿。图1的A、B示出了1个月、2个月、6个月和9个月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠的苏木精和曙红染色的外周左肺叶的代表性显微照片(图1的A)和平均线性截距(MLI)(图1的B)。n＝3-4只小鼠/组。比例尺200μm。图1的C、D示出了6个月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠的左肺叶(图1的C)和弹性蛋白/胶原蛋白标记的左肺叶(图1的D)的代表性整装立体图像。n＝3只小鼠/组。比例尺500μm(图1的C)和200μm(图1的D)。图1的E示出了9个月年龄FVB/NTac Ism1+/Δ小鼠的苏木精和曙红染色的外周左肺叶的代表性显微照片。n＝4只小鼠/组。比例尺200μm。图1的F示出了9个月龄FVB/NTac WT、Ism1+/Δ和Ism1Δ/Δ小鼠的MLI。n＝4只小鼠/组。图1的G–N示出了2个月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠的肺活量测定。n＝4只小鼠/组。示出了总肺活量(TLC)(图1的G)、功能余气量(FRC)(图1的H)、余气量(RV)(图1的I)、静态顺应性(Cchord)(图1的J)、动态顺应性(Cdyn)(图1的K)、100ms时的用力呼气量(FEV100)(图1的L)、Tiffeneau–Pinelli指数(FEV100/FVC)(图1的M)和气道阻力(RI)(图1的N)。数据为平均值±s.e.m.并且通过未配对的双尾学生t检验(图1的B、G–N)和单因素ANOVA与Tukey事后检验(图1的F)进行分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；
图2显示Ism1Δ/Δ小鼠肺表现出上调的COPD介质。(A)示出了苏木精和曙红染色的肺的代表性显微照片，显示肺泡巨噬细胞(AM)在2-月龄FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠中积累。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm。(B)和(C)示出了来自2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺的支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞的Liu-染色的细胞离心涂片制剂(B)和定量(C)。n＝4只小鼠/组。(B)-(D)示出了支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞的离心细胞涂片和流式细胞术分析，确定与WT小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠肺中的AM增加。(E)示出了在2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中，以β-肌动蛋白作为加载对照，MMP-12、MMP-9和NF-κB p65的蛋白质印迹(顶部)和倍数变化(底部；A.U.，任意单位)。n＝4只小鼠/组。(F)示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺的AM中MMP-12和MMP-9的代表性免疫组织化学染色。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm。(G)示出了从2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠分离的NF-κB p65(绿色)和核(DAPI；蓝色)的代表性免疫荧光染色(左)以及初代AM的定量(右)。从3只小鼠/组取用n＝3平均测量值。比例尺20μm。每只小鼠定量出250-350个肺泡巨噬细胞。(H)示出了在2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中，以β-肌动蛋白作为加载对照，GM-CSF的蛋白质印迹(顶部)和倍数变化(底部；A.U.，任意单位)。n＝4只小鼠/组。(I)和(J)示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠的AM中ISM1(I)和GRP78(J)的代表性免疫组织化学染色。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm。(K)和(L)示出了使用1μM重组ISM1(rISM1)处理的WT初代AM(K)以及未处理的WT和Ism1Δ/Δ初代AM(L)的凋亡的IncuCyte定量。在一式三个或四个孔中进行分析，并且每孔拍摄4个图像进行定量。(M)示出了WT和Ism1Δ/Δ初代AM的增殖测定。在一式三个孔中进行分析。n＝4只小鼠/组。数据为平均值±s.e.m.并且通过未配对的双尾学生t检验进行分析(C、E、G、H、K、L和M)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；
图3显示外源性rISM1减轻了Ism1Δ/Δ和香烟烟雾暴露的小鼠中的肺气肿。(A)示出了在载体(PBS)、1μg rISM1、5μg rISM1和脂质体-氯膦酸盐(CLO)治疗后，2-月龄FVB/NTacIsm1Δ/Δ小鼠的AM计数。n＝4只小鼠/组。(B)示出了在载体(PBS)、5μg rISM1或脂质体-氯膦酸盐(CLO)治疗后，2-月龄FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠的苏木精和曙红染色的肺的代表性显微照片。n＝4只小鼠/组。比例尺50μm。(C)和(D)示出了与未治疗的2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠相比，(B)中经治疗的小鼠组的MLI(C)和FEV100/FVC(D)的定量。n＝3–4只小鼠/组。(E)和(F)示出了WT BALB/cAnNTac(WT BALB/c)小鼠中2-周(E)和8-周(F)香烟烟雾诱导的COPD模型的实验设计。以指定的频率和间隔使用载体(CS+PBS)或rISM1(CS+10μg rISM1)治疗室内空气暴露的WT BALB/c小鼠(Sham)、香烟烟雾暴露的WT BALB/c小鼠(CS)。n＝5只小鼠/组。(G)示出了来自(E)中实验组的支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞的定量。n＝4-5只小鼠/组。(H)示出了(F)中实验组的苏木精和曙红染色的肺的代表性显微照片，显示出免疫细胞浸润。n＝5只小鼠/组。比例尺50μm。(I)–(L)示出了(F)中实验组的AM(I)、MMP-12表达(J)、MLI(K)和FEV100/FVC(L)的定量。n＝5只小鼠/组。数据为平均值±s.e.m.并且通过未配对的双尾学生t检验(C、D，未治疗的2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠)和单因素ANOVA与Tukey事后检验(C、D、G、I至L)进行分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，#：与Sham组相比无显著差异；
图4示出了与AM凋亡有关的人类ISM1表达。(A)和(B)示出了切下的人肺组织切片的AM中人类ISM1(hISM1)(A)的代表性免疫组织化学染色以及CD68(红)、hISM1(绿)和核(DAPI,蓝)的免疫荧光染色。比例尺20μm。(C)示出了从IHC染色强度(A)和人类AM中的表达频率(B)导出的hISM1表达的矩阵表。通过矩阵分数1–3：+，4–6：++，9：+++来注释hISM1表达。(D)示出了按吸烟和COPD状态分层的患者中hISM1表达的百分比分布。(E)和(F)示出了hISM1表达和吸烟(E)以及AM凋亡(F)之间的相关性。(G)示出了非-COPD和COPD患者中GRP78的代表性免疫组织化学染色。比例尺20μm。(H)示出了按COPD状态和hISM1表达分层的COPD患者中凋亡AM的百分比。数据为平均值±s.e.m.并且通过点二列相关(E)、皮尔逊相关(F)和单因素ANOVA与Tukey事后检验(H)进行分析。*P<0.05。图表上描绘了患者样本量；
图5示出了Ism1Δ/Δ小鼠的表征。(A)和(B)示出了2-月龄FVB/NTac(A)以及C57BL/6J(B)WT和Ism1Δ/Δ小鼠中肺气肿的病理分级。n＝4只小鼠/组。(C)和(D)示出了2个月龄、6个月龄和9个月龄C57BL/6JWT和Ism1Δ/Δ小鼠的苏木精和曙红染色的外周左肺叶的代表性显微照片(C)和平均线性截距(MLI)(D)。n＝4只小鼠/组。比例尺200μm。(E)和(F)示出了2-月龄FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠中范霍夫-范吉森(Verhoeff-Van Gieson)(VVG)染色的肺的代表性显微照片，显示损失了弹性蛋白(黑)和胶原蛋白(红)(E)，以及过碘酸-希夫(PAS)染色的气道的代表性显微照片，显示粘液分泌过多(红)(F)。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm。(G)示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠中支气管上皮细胞高度(左)和细胞数(右)的测量。从8–10个小气道/小鼠采集n＝34–38个平均测量值，4只小鼠/组。(H)示出了在2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中，以β-肌动蛋白作为加载对照，TGF-β1、VEGF-A、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的蛋白质印迹(顶部)和倍数变化(底部；A.U.，任意单位)。n＝4只小鼠/组。(I)示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺的AM中TGF-β1和VEGF-A的代表性免疫组织化学染色。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm。(J)示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中相对活性氧物种(ROS)的定量。将脑组织(ISM1表达阳性)用作对照以证明肺对ISM1缺乏的特异性。n＝3只小鼠/组。(K)示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺之间的相对细胞因子表达的热图。n＝3WT小鼠和6Ism1Δ/Δ小鼠。(L)示出了P1FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中GM-CSF(红)和核(DAPI；蓝)的代表性免疫荧光染色(左)。n＝4只小鼠/组。(M)示出了在P1 FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中以β-肌动蛋白作为加载对照，GM-CSF的蛋白质印迹(顶部)和倍数变化(底部；A.U.,任意单位)。n＝8-9只小鼠/组。数据为平均值±s.e.m.并且通过未配对的双尾学生t检验进行分析(D、G、H、J和M)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。(N)显示1-月龄Ism1Δ/Δ小鼠肺中，先于GM-CSF上调，MMP-12增加；
图6示出了ISM1通过细胞表面GRP78诱导肺泡巨噬细胞凋亡。(A)示出了2-月龄FVB/NTac WT小鼠肺中表达ISM1(绿)的AM(CD68,红)和核(DAPI,蓝)的代表性免疫荧光染色。比例尺10μm。(B)示出了2-月龄WT BALB/cAnNTac小鼠肺中使用反义ism1的代表性原位杂交，在插图中描绘了支气管上皮和肺泡巨噬细胞中的ISM1表达。(C)-(E)示出了在1μMrISM1治疗后，rISM1(红)和GRP78(绿)共定位(C和D)以及裂解的半胱天冬酶-3(CCP3)(E)的初代AM的代表性共焦图像。核使用DAPI染色(蓝)。比例尺5μm。(F)和(G)示出了在毒胡萝卜素(TG)预见处理和1μM rISM1处理(F)与GRP78抗体中和(G)后MH-S细胞中凋亡的IncuCyte定量。处理条件如图所示。在一式三孔中进行分析，并且每孔拍摄4个图像以进行定量。数据为平均值±s.e.m.并且通过单因素ANOVA与Tukey事后检验进行分析(F和G)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图7显示外源性rISM1减轻Ism1Δ/Δ和香烟烟雾暴露的小鼠中的肺气肿。(A)和(B)示出了PBS和rISM1-治疗的FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠的AM中，rISM1(A)和裂解的半胱天冬酶-3(CCP3,绿)(B)的代表性免疫染色。n＝4只小鼠/组。比例尺10μm(A)和20μm(B)。(C)和(D)示出了在PBS、5μg rISM1或脂质体-氯膦酸盐(CLO)治疗后，FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠肺中表面活性蛋白C(SP-C,红)、PCNA(绿)、核(DAPI,蓝)(C)和定量(D)的代表性免疫荧光染色。n＝34–40个视野/组，每小鼠肺拍摄9-10个随机图像。比例尺20μm。(E)示出了使用载体(CS+PBS)或rISM1(CS+10μg rISM1)治疗的室内空气暴露的(Sham)、香烟烟雾暴露的WT BALB/cAnNTac(WT BALB/c)小鼠(CS)的苏木精和曙红染色的肺的代表性显微照片。n＝5只小鼠/组。比例尺100μm。(F)示出了(E)中PBS和rISM1-治疗的CS小鼠肺中CCP3(绿)的代表性免疫荧光染色。n＝5只小鼠/组。比例尺20μm。(G)–(J)示出了(E)中COPD小鼠的肺中性粒细胞计数(G)和肺活量测定(H至J)的定量。总肺活量(TLC)(H)、静态顺应性(Cchord)(I)和呼吸功(WOB)(J)。数据为平均值±s.e.m.并且通过单因素ANOVA与Tukey事后检验进行分析(D、G至J)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。#：与Sham组相比无显著差异；
图8示出了COPD患者和香烟烟雾暴露的小鼠中的ISM1表达。(A)示出了在空载体(EV)或hISM1过表达(hISM1-OE)HEK293FT细胞中，使用抗-hISM1或小鼠IgG同型对照的代表性免疫组织化学(顶图)和免疫荧光(底图)染色。比例尺20μm。(B)和(C)示出了室内空气暴露的(Sham)和香烟烟雾暴露的WT BALB/cAnNTac(WT BALB/c)小鼠(CS)的支气管上皮中，ISM1的代表性免疫组织化学染色。n＝5只小鼠/组(B)；以及非-COPD和COPD患者(C)。比例尺20μm。(D)示出了按当前吸烟状况分层的患者中hISM1表达的百分比分布。图表上描绘了患者样本量。(E)和(F)示出了室内空气暴露的(Sham)和香烟烟雾暴露的WT BALB/c小鼠(CS)的AMs(E)和非多形核白细胞或淋巴细胞(F)中ISM1的代表性免疫组织化学染色。n＝5只小鼠/组。比例尺20μm；
图9的A-F显示ISM1缺乏导致非病理条件下肺中白细胞浸润增加。图9的A显示2月龄Ism1Δ/Δ小鼠肺中免疫细胞浸润增加，如H&E染色所示。图9的B显示了Ism1Δ/Δ和野生型肺中的总白细胞定量。图9的C显示了2月龄Ism1Δ/Δ小鼠的肺中巨噬细胞和中性粒细胞增加，如分别通过CD68和NIMP-R14的IHC染色所检测。图9的D和E示出了差异免疫细胞计数，显示Ism1Δ/Δ肺中巨噬细胞和中性粒细胞增加。图9的F示出了Ism1Δ/Δ小鼠的外周血分析，显示在2个月，总白细胞(WBC)、中性粒细胞(NE)和淋巴细胞(LY)增加。*代表p<0.05；在(9的A-E)中n＝5只动物/组。(图9的F)中n＝7只动物/组；
图10的A-G示出ISM1缺乏导致肺中对气管内LPS的免疫响应增强。图10的A-E示出了对气管内LPS挑战的免疫响应时间进程：通过定量总白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞，Ism1Δ/Δ肺显示出对LPS的免疫响应增强。LPS(2mg/kg)气管内给药一次，然后在LPS给药后第1、3、5和7天从肺中分离单细胞悬液。图10的F显示在LPS挑战1天后，与野生型小鼠相比，LPS在Ism1Δ/Δ小鼠中触发了肺通透性的增强增加(更高的BAL蛋白)。图10的G示出了代表性H&E染色的肺切片，显示了在LPS挑战1天后，免疫细胞浸润到肺空域(急性炎症)中的程度(左)和NIMP-R14(一种中性粒细胞标志物)的免疫荧光染色的中性粒细胞(右)。*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；n＝3只动物/组。
图11的A-G显示气管内递送的rISM1抑制LPS-诱导的肺部炎症。图11的A是显示rISM1对小鼠中LPS-诱导的急性炎症肺的治疗的示意图。在接受单剂量LPS(2mg/kg)一天之前，经由气管内递送，使用50μg rISM1预治疗小鼠。使用50μg rISM1每天一次连续治疗小鼠，直至LPS后的第3天。然后分离BAL液并分离成BAL流体蛋白和细胞成分。图11的B显示，在LPS挑战1天后rISM1-治疗的小鼠中，总BAL流体蛋白降低。图11的C-G显示使用来自LPS挑战1天后PBS或rISM1-治疗的小鼠的BAL液的细胞进行了总白细胞和差异免疫细胞计数。rISM1显著地减少了总白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数目。T细胞和B细胞在rISM1下也减少了，尽管没有统计学意义，因为这两种细胞类型在PBS治疗的小鼠中存在很大变化。*表示p<0.05；n＝5只动物/组。
图12的A-E显示ISM1缺乏导致在从LPS引起的急性肺损伤恢复后肺组织重塑和纤维化。图12的A示出了H&E染色的肺切片的代表性图像，显示了在LPS挑战9天后野生型和Ism1Δ/Δ小鼠中的组织纤维化程度。图12的B-C显示，通过Picro-天狼星染色检测，胶原蛋白沉积在Ism1Δ/Δ小鼠肺中更高。图12的D-E显示，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色提示，与野生型小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠肺中纤维化病灶内的肌成纤维细胞增加。**表示p<0.01。使用n＝3个肺/组，2个切片/肺，5个显微视野/切片进行定量；
图13的A-B显示，ISM1缺乏增加了肺中肺泡上皮2型细胞(AEC2)的增殖。图13的A示出了在LPS挑战后第9天，Ism1Δ/Δ和野生型小鼠的SP-C和PCNA双免疫荧光染色肺切片的代表性图像。图13的B示出了在PLS挑战后的第9天，肺组织切片中SP-C和PCNA双阳性细胞的定量。Ism1Δ/Δ小鼠的鼠中增殖的AEC2数量显著增加。***表示p<0.001。使用n＝3个肺/组，2/个切片/组，5个显微视野/切片进行定量；
图14的A-C显露，ISM1缺乏导致在肺中更高的促纤维化细胞因子TGF-β。图14的A为在LPS挑战9天后，Ism1Δ/Δ和野生型小鼠的TGF-β免疫荧光染色的肺切片的代表性图像。图14的B显示了使用蛋白质印迹和全肺裂解液的在LPS挑战9天后，Ism1Δ/Δ和野生型小鼠肺中TGF-β的表达水平。图14的C示职了在LPS挑战9天后，Ism1Δ/Δ小鼠中肺TGF-β蛋白水平的定量。**表示p<0.01。n＝3个肺/组；
图15的A-C示出，在LPS挑战1后天，ISM1缺乏改变肺的炎性细胞因子/趋化因子谱。使用来自LPS挑战1天后的Ism1Δ/Δ和野生型小鼠的肺匀浆和炎性细胞因子抗体阵列分析了细胞因子和趋化因子。图15的A示出了通过抗体阵列分析的细胞因子/趋化因子的相对变化。*表示p<0.05。n＝4个肺/组。图15的B-C显示，通过蛋白质印迹分析，在LPS挑战1天后，Ism1Δ/Δ肺中的TNF-α表达增加。**表示p<0.01。n＝3个肺/组；
图16的A-C显示，ISM1缺乏增强了p65 NF-κB的表达水平和核易位。图16的A为在LPS挑战1天后，Ism1Δ/Δ和野生型小鼠的肺切片中，免疫荧光染色的NF-κB p65亚基的代表性图像。在Ism1Δ/Δ小鼠的肺切片中存在增加的与DAPI(核,蓝)共定位的p65 NF-κB(红)信号。图16的B显示，在LPS挑战1天后，Ism1Δ/Δ的肺匀浆中p65 NF-κB水平增加，如蛋白质印迹所示。图16的C示出了相对于β–肌动蛋白，p65 NF-κB的定量量。n＝3个肺/组；
图17的A-D示出了生成Ism1Δ/ΔC57BL/6J小鼠。图17的A是通过引导RNA对，gRNA1和gRNA3靶向Ism1的CRISPR/Cas9的示意图。P1和P2表示用于T7E1测定和基因分型的引物。图17的B示出了Ism1Δ/Δ敲除系的DNA序列，显示了导致过早终止密码子和不产生ISM1蛋白的23bp缺失。红色箭头表示Cas9切割位点，且黄色区域是指两个重叠的gRNA靶区域。图17的C示出了来自C56BL/6J WT、Ism1+/Δ、Ism1Δ/Δ的Ism1 mRNA的RT-PCR。图17的D示出了C57BL/6JWT和Ism1Δ/Δ小鼠肺切片中ISM1(棕色)和核(苏木精，蓝)的代表性免疫组织化学染色。Br，支气管；Al，肺泡。比例尺20μm；
图18示出了比较正常细胞(右)与应激下的细胞(左)的模型，其中应激下的细胞(如肿瘤细胞、EC、活化的炎症细胞)具有增加的细胞表面GRP78(csGRP78)，其可以与ISM1和/或其片段相互作用，导致细胞死亡(提供治疗效果，例如)。同样，csGRP78水平的变化和/或ISM1与其相互作用可以提供诊断和/或预测信息。如图所示，预期csGRP78可能是诸如炎症性疾病等疾病中的治疗靶标和/或诊断生物标志物；
图19的A-B显示是ISM1C(287-461)而不是ISM1N支持EC粘附。图19的A显示ISM1中的AMOP结构域在介导EC粘附中很重要。ISM1C可以与ISM1一样支持细胞粘附，因为两种蛋白质之间汇合机会随时间推移没有显著差异。ISM1N在支持细胞粘附方面具有降低的能力，因为随时间推移，汇合的机会变得越来越慢。**p<0.01，n＝3。图19的B显示突变体ISM1RKD341RAA(C)和ISM1RKD340AAA(C)在支持细胞粘附方面具有降低的能力，因为细胞粘附速率明显低于ISM1C。**p<0.01，n＝3；
图20的A-B显示内在化的ISM1C(287-461)触发EC凋亡。图20的A-B描绘了ISM1C而不是ISM1N显著触发EC凋亡。误差线绘制为SD。*P<0.05，**P<0.01，N＝3；
图21显示明胶而不是BSA可以支持EC粘附。监测了细胞汇合的动态变化。明胶可以支持EC粘附，其中汇合变化随时间增加。BSA不支持细胞粘附，因为汇合保持较低，甚至随着时间推移而降低。**P<0.01，N＝3；
图22示出了CRISPR/Cas9靶向和生成FVB/N Ism1Δ/Δ小鼠。(A)示出了经由引导RNA对gRNA1和gRNA2靶向Ism1的CRISPR/Cas9的示意图。(B)和(C)显示了FVB/NTac(B)和C57BL6/J(C)WT，Ism1+/Δ和Ism1Δ/Δ小鼠的基因分型PCR。(D)示出了FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠呼吸道上皮中ISM1(红)和核(DAPI，蓝)的代表性免疫荧光染色。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm。(E)示出了C57BL/6J WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺ISM1的代表性免疫组织化学染色。n＝4只小鼠/组。比例尺20μm；
图23示出了与细胞表面GRP78表达相关的COPD中的肺泡巨噬细胞凋亡。(A)显示了患者群中裂解的半胱天冬酶-3(CCP3)的代表性免疫组织化学染色。比例尺50μm。(B)示出了按吸烟状况分层的hISM1表达和AM凋亡之间的相关性。图表上描绘的患者样本量。通过皮尔逊相关来分析数据。(C)和(D)示出了室内空气暴露的(Sham)和香烟烟雾暴露的(CS)WTBALB/cAnNTac小鼠肺中，GRP78(红)、裂解的半胱天冬酶-3(CCP3，绿)和核(DAPI，蓝)的代表性免疫荧光染色。n＝5只小鼠/组。比例尺20μm(C)；和非-COPD和COPD患者。比例尺10μm(D)；
图24显示了，不希望被理论束缚，提议的ISM1在调节AM凋亡和肺部稳态和炎症方面的机制。(A)左，自分泌/旁分泌ISM1特异性地靶向具有高csGRP78的AM并且诱导凋亡。AM数保持得到控制，炎症得到调节，且肺部稳态得到维持。右，无/低ISM1导致AM在肺泡腔中积聚和肺气肿发作，肺功能逐渐下降。(B)显示了，不希望被理论束缚，所提议的ISM1调节AM凋亡和肺部稳态的机制的示意图。左，自分泌/旁分泌ISM1特异性地靶向具有高csGRP78的AM并诱导凋亡。AM数保持得到控制，炎症得到调节，且肺部稳态得到维持。右，ISM1丧失导致AM在肺泡腔中累积和肺气肿发作，肺功能逐渐下降。包括ROS、NF-κB信号、MMP-12和MMP-9在内的肺气肿介质被上调；
图25示出了来自支气管肺泡灌洗液(BALF)的细胞的流式细胞术分析的门控策略。以肺泡巨噬细胞的流式细胞术分析和定量的代表性门控策略，示出了肺泡巨噬细胞的门控策略；
图26示出了在HDM-诱导的过敏哮喘小鼠模型中，过敏原暴露的时间线。根据Hammad et al.(2009)和Peh et al.(2015)中描述的协议生成疾病模型。简言之，使用异氟烷将雌性C57BL/6J小鼠(6-8周)麻醉，并且在第0、7和14天经由气管内途径使用40μL 100μgHDM提取物(屋尘螨)敏化。在挑战后2小时、第15天和第16天(红色箭头)，连续给予每日单剂量的细菌产生的重组体ISM1(2mg/kg，40μg/小鼠)或等体积的载体(生理盐水)。所有动物在第17天处以安乐死，并且收集支气管肺泡灌洗液(BALF)以用于免疫细胞浸润分析。将由五只健康小鼠组成的幼稚组作为对照；
图27示出了最后一次治疗24小时后，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞计数[幼稚，n＝5；HDM，n＝5；盐水，n＝7；ISM1，n＝7]。(A)在十个不同观察视野上进行差异细胞计数以识别嗜酸性粒细胞(Eos)、肺泡巨噬细胞(AM)、中性粒细胞(Neu)和淋巴细胞(Lym)。与幼稚组相比，屋尘螨(HDM)提取物挑战显著地增加了总细胞计数、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞，并且稍微地增加了中性粒细胞和淋巴细胞计数。另一方面，Isthmin 1(ISM1)治疗组显示出总细胞数减少了70％(P＝0.0053)，嗜酸性粒细胞(P＝0.0062)和淋巴细胞(P＝0.0381)计数显著下降。未观察到肺泡巨噬细胞和中性粒细胞的总计数的变化。数值显示为平均值±SEM。与HDM有显著差异。(B)显示免疫细胞浸润的Liu染色的代表性显微照片。比例尺40μm；
图28显示，与HDM治疗组相比，rISM1治疗显著降低了总IgE水平。使用BD OptEIATM小鼠IgE ELISA试剂盒分析了总IgE的水平(N＝5)。数值显示为平均值±SEM。使用单因素ANOVA比较了各组之间的平均差异，*P<0.05；**P<0.005；
图29显示，单独的C末端AMOP结构域保留了ISM1的全部促凋亡活性。重组蛋白构建体显示在左侧，它们的促凋亡活性显示在右侧。Mam：哺乳动物产生的，bac：大肠杆菌产生的。使用小鼠ISM1蛋白。哺乳动物细胞产生的和大肠杆菌产生的rISM1 287-461片段均保留了全长ISM1的全部促凋亡活性；
图30示出了使用纯化的GRP78和ISM1蛋白的co-IP测定，证明它们通过AMOP结构域287-461区域直接结合；
图31示出了重组小鼠ISM1蛋白的表达和纯化。(A)ISM1的哺乳动物表达构建体的示意图。小鼠Igκ1前导序列包括在N-末端，用于增强分泌效率。c-Myc标签和六组氨酸标签包括在C-末端，用于蛋白质检测和纯化。(B)表达和纯化哺乳动物rISM1的工作流程示意图。(C)纯化的哺乳动物重组ISM1蛋白在变性SDS-PAGE上迁移约70kDa。(D)ISM1的细菌表达构建体的示意图。六组氨酸标签包括在N-末端，用于蛋白质检测和纯化。N-末端的SUMO-标签有助于蛋白质溶解。(E)表达和纯化细菌rISM1的工作流程示意图。(F)最终纯化的细菌重组ISM1蛋白，SUMO-标签被切除，在变性SDS-PAGE上迁移约55kDa；
图32显示哺乳动物重组ISM1密集地沉积有异质聚糖。(A)ISM1中存在的两个N-糖基化位点的示意图。(B)哺乳动物重组ISM1蛋白与PNGaseF一起孵育以去除N-连接的聚糖。(C)在HEK293T、HEK293FT和Hela细胞中表达和分析ISM1的野生型和N-聚糖突变体。使用蛋白质印迹分析了蛋白质表达和分泌。(D)ISM1上O-和C-连接的聚糖沉积的汇总图。红色残基表示聚糖沉积位点。第一个带下划线的序列是指TSR结构域，且第二个带下划线的序列对应于AMOP结构域。(E)在HEK293FT细胞中表达和分析了ISM1的O-和C-聚糖突变体；
图33示出了介导其受体相互作用的ISM1的AMOP结构域。(A)用于Co-IP实验的ISM1和GRP78的重组蛋白构建体的示意图。mamISM1代表哺乳动物重组ISM1蛋白；bacGRP78代表细菌重组GRP78蛋白。(B)考马斯蓝染色的SDS-PAGE显示了纯化的重组蛋白的质量。(C)Co-IP分析证实，AMOP结构域介导了ISM1-GRP78相互作用。(D)Co-IP分析证实，AMOP结构域介导了ISM1-整合素αvβ5相互作用。(E)Co-IP分析证实，没有AMOP结构域的ISM1消除了与整合素αvβ5的相互作用；和
图34显示AMOP结构域的边界影响其促凋亡活性。(A)用于哺乳动物重组蛋白生产和纯化的ISM1 AMOP构建体的示意图。(B)考马斯蓝染色的SDS-PAGE显示了纯化的重组蛋白的质量。(C)两个哺乳动物AMOP截短体的凋亡测定结构。(D)用于细菌重组蛋白生产和纯化的ISM1AMOP构建体的示意图。(E)考马斯蓝染色的SDS-PAGE显示了纯化的重组蛋白的质量。(F)不同细菌重组AMOP截短体之间的促凋亡活性的比较。(G)哺乳动物和细菌重组AMOP截短体之间的促凋亡活性的比较。
具体实施方式
本文描述了用于治疗与炎症(特别是肺部炎症)相关的疾病或病症的肽、多肽、核酸、组合物和方法。应当理解的是，提供实施方式和实施例是为了用于本领域技术人员的说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。
健康成人在周围环境条件下调节和维持肺部稳态，预防无菌性炎症。免疫响应可能由损伤、环境应激源和/或感染引发，导致急性炎症。理想地，这种炎症最终得到消退以允许伤口愈合和恢复，并防止炎症诱导的病症和/或损伤。未能充分消退炎症可能导致慢性炎症和/或炎症相关疾病，诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、慢性阻塞性支气管炎和/或肺纤维化。急性肺病诸如急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)也与肺部炎症有关。
如本文详细描述的，本发明人现在已经开发了用于治疗炎症(诸如肺部炎症)的多肽、核酸、组合物、肺部药物递送装置和方法，基来源于和/或基于Isthmin 1(ISM1)，这是一种分泌蛋白，本文描述的研究表明其在抑制、阻止和/或消退炎症(特别是肺部炎症)方面发挥作用。在下文详细描述的研究中，向肺部补充外源性重组ISM1蛋白(rISM1)抑制了ISM1缺陷肺中的肺部炎症表型，并且结果表明，ISM1可通过诱导肺泡巨噬细胞凋亡而有助于消退炎症。如本文所述，例如，重组ISM1(rISM1)可以阻断香烟烟雾诱导的COPD，并且可以抑制LPS-诱导的急性肺部炎症和损伤。结果表明，ISM1在抑制和/或消退无菌性肺部炎症和/或由感染和/或损伤引发的炎症方面挥发了重要作用。
用于治疗与炎症相关的疾病或病症的治疗性组合物、配方和装置
例如，本文提供了用于治疗、改善或预防与炎症(特别是肺部炎症)相关的疾病或病症的治疗性组合物、肽、多肽、核酸、配方和装置。
Isthmin 1(ISM1，有时被称为ISM)是一种在数种不同的脊椎动物物种中发现的分泌蛋白。ISM1蛋白包括血小板反应蛋白1型重复(TSR)结构域和MUC4中的粘附相关结构域以及其他蛋白(AMOP)结构域。葡萄糖调节的蛋白78kDa(GRP78)和αvβ5整合素是ISM1的已知受体。Isthmin 1(ISM1)以前与小鼠中的血管生成抑制有关(见Xiang,W.et al.,2011,Isthmin is a novel secreted angiogenesis inhibitor that inhibits tumourgrowth in mice,Journal of Cellular and Molecular Medicine,15(2):359-374，其全部内容以引用方式并入本文)。
人类中所表达的全长Isthmin 1的序列(即包括N-末端信号肽)如下：
Isthmin-1前体[人类]
NCBI参考序列：NP_543016.1
Figure GDA0003337137240000261
(SEQ ID NO:1)
小鼠中表达的Isthmin 1的全长序列(即包括N-末端信号肽)如下：
Isthmin-1前体[小家鼠]
NCBI参考序列：NP_001263418.1
Figure GDA0003337137240000262
(SEQ ID NO:2)
由于ISM1为分泌蛋白，这些人类(SEQ ID NO:1)和小鼠(SEQ ID NO:2)ISM1序列包括N-末端信号肽序列。上面以下划线显示了此信号肽序列，并且通常在成熟分泌形式的ISM1中被切除。TSR结构域以粗体显示，并且AMOP结构域在上述序列中以斜体显示。
以下显示了切除了信号肽序列的人类和小鼠中的成熟ISM1：
Isthmin-1(成熟)[人类]
GSGAADGPDAAAGNASQAQLQNNLNVGSDTTSETSFSLSKEAPREHLDHQAAHQPFPRPRFRQETGHPSLQRDFPRSFLLDLPNFPDLSKADINGQNPNIQVTIEVVDGPDSEADKDQHPENKPSWSVPSPDWRAWWQRSLSLARANSGDQDYKYDSTSDDSNFLNPPRGWDHTAPGHRTFETKDQPEYDSTDGEGDWSLWSVCSVTCGNGNQKRTRSCGYACTATESRTCDRPNCPGIEDTFRTAATEVSLLAGSEEFNATKLFEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY
(SEQ ID NO:3)
Isthmin-1(成熟)[小家鼠]
GSGASDRQDAAAGNVSGSQLQNNLNLESDSTSETSFPLSKEAPEEHQVVHQPFPRQRFPPETGHPSLQRDGPRSFLLDLPNFPDLSKADINGQNPNIQVTIEVVDGPDSEAEKDQHPENKPSWSLPAPDWRAWWQRSLSLARTNSGDQDDKYDSTSDDSNFLSVPRGWDRPAPGHRTFETKEQPEYDSTDGEGDWSLWSVCSVTCGNGNQKRTRSCGYACIATESRTCDRPNCPGIEDTFRTAATEVSLLAGSEEFNATKLFEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY
(SEQ ID NO:4)
如将理解的，在某些实施方式中，本文中对Isthmin 1(ISM1)蛋白的引用可以被理解为引用全长ISM1(即存在信号肽)或成熟ISM1(即去除了信号肽)。因为分泌的ISM1通常以成熟形式存在(即缺少信号肽)，所以在某些实施方式中可以省略信号肽序列。通常，在某些实施方式中，成熟ISM1可能是优选的。
也如将被理解的，在某些实施方式中，本文中对Isthmin 1(ISM1)蛋白的引用可以包括可在表达ISM1或其同系物、直系同源物、旁系同源物或功能等效物的任何合适物种中发现的ISM1。ISM1由许多不同的物种表达。WO2009/113965中进一步描述了ISM1序列，其全部内容以引用方式并入本文。在Xiang,W.et al.,2011,Journal of Cellular andMolecular Medicine,15(2):359-374(其全部内容以引用方式并入本文)中，提供了序列比较，显示了在人类、小鼠、非洲爪蟾和斑马鱼中发现的ISM的氨基酸比对。以下显示了由NCBI使用HomoloGene计算的人类ISM1(前体)与数种不同物种的相应ISM1序列的成对比对分数：
成对比对分数
Figure GDA0003337137240000281
可以看到，虽然不同物种之间的ISM1有点相似，但观察到了序列变异。在蛋白质序列方面，以上分数显示了与人类序列差异高达30％的序列同一性(即斑马鱼序列与人类ISM1具有70％的序列同一性)。
在某些实施方式中，本文提供了一种肽或多肽，其包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述多肽可以包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述Isthmin 1(ISM1)蛋白可以是来自任何特定物种的任何合适的ISM1蛋白，具有或不具有N-末端信号肽。在某些实施方式中，所述多肽可以包含任何合适的多肽、肽、或基于肽或基于多肽的分子或分子组，其可以或可以不经进一步修饰以包括一个或多个额外的蛋白或非蛋白部分，诸如纯化标签、接头、荧光团、信号肽、靶向或递送序列、细胞穿透肽、附加活性剂(诸如用于靶向肺部炎症的另一药物)或适用于特定应用的其他部分。在某些实施方式中，所述多肽可以在一个或多个氨基酸侧链、N-末端、C-末端或其任何组合处被修饰。在某些实施方式中，除了所述与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列之外，所述多肽可以包括一个或多个附加氨基酸序列，其可以位于与ISM1具有同一性的序列的N-末端或C-末端。
在某些实施方式中，Isthmin 1(ISM1)蛋白的GRP78-激活片段可以包括与Isthmin1的至少一个片段、部分、结构域或连续的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430或440个氨基酸具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的任何合适的肽或多肽，其中所述GRP78-激活片段能够以与ISM1基本相同的功效结合并且激活GRP78，或者与ISM1相比，以至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的功效结合并且激活GRP78。
在本文所述的研究中，已经证明ISM1是GRP78的促凋亡配体，其结合GRP78以触发凋亡。因此，ISM1可以被认为是GRP78的激动剂。作为信号受体，GRP78可以与许多不同的配体结合，这可能通过蛋白质的不同区域发生(在Ni,et al.,Biochem J.,2011,434(2):181-188中可以找到GRP78的综述，其全部内容以引用方式并入本文)。一些配体可能是促增殖的，其他的可能是促凋亡的等，并且每个可能有不同的细胞内信号通路。在某些实施方式中，ISM1与GRP78的相互作用可能涉及细胞内信号通路，这可能涉及ISM1内在化和/或半胱天冬酶激活。因此，在某些实施方式中，GRP78-激活片段可以包括能够充当GRP78的促凋亡配体和/或能够与GRP78结合并触发凋亡的任何适合肽或多肽。在某些实施方式中，ISM1蛋白的GRP78-激活片段可以包括能够通过GRP78触发凋亡的任何适合肽或多肽，这可能包括也可能不包括片段的内在化和/或半胱天冬酶激活。
在某些实施方式中，本文中对GRP78或GRP78受体的提及可以理解为包括细胞表面GRP78(csGRP78)。细胞外ISM1正是与细胞表面GRP78(csGRP78)相互作用，因此考虑了本文教导的技术人员将理解，在适当情况下，本文中对GRP78的提及可以理解为是指csGRP78(即在某些实施方式中，本文中对GRP78的提及可以理解为提及csGRP78)。
可以预期的是，在某些实施方式中，AMOP结构域可以介导ISM1与GRP78的结合，和/或可以介导ISM1的促凋亡活性。还进一步预期的是，在某些实施方式中，ISM1的TSR结构域可能很少或不参与ISM1与GRP78的结合和/或ISM1的促凋亡作用。事实上，结果表明AMOP结构域可能负责GRP78结合，并且负责触发凋亡(进一步细节参见以下实施例3)。因此，在某些实施方式中，所述肽或多肽通常可以包含任何适合的肽或多肽或者肽基或多肽基分子，所述肽或多肽或者肽基或多肽基分子至少具有ISM1的AMOP结构域，或具有与所述ISM1的AMOP结构域具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在所述多肽包括多于一个来自ISM1的结构域或区域的实施方式中，所述结构域或区域的组织方式通常可以与ISM1中的N-C末端顺序相同，或者相对于ISM1可以重排。标题为“用于治疗血管生成的Isthmin衍生物(Isthmin Derivatives for use in Treating Angiogenesis)”的WO2009/113965中更详细地描述了ISM1结构域和片段，其全部内容以引用方式并入本文。
在某些实施方式中，本文提供了一种肽或多肽，其包含与SEQ ID NO:10或11中任一个具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:10–人类ISM1 AMOP结构域
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDED
SEQ ID NO:11–小鼠ISM1 AMOP结构域
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDED
在某些实施方式中，本文提供了一种肽或多肽，其包含与SEQ ID NO:1-4中任一个或者其连续的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430或440个氨基酸具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供了一种多肽，其包含SEQ ID NO:1-4中的任一个或者由SEQ ID NO:1-4中的任一个组成。在某些实施方式中，本文提供了一种多肽，其为Isthmin1蛋白，或者其包含Isthmin 1蛋白。在某些实施方式中，本文提供了一种多肽，其为人类ISM1蛋白，或者其包含人类ISM1蛋白。
在某些实施方式中，本文提供了一种多肽或肽，其包含或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:26)；
或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例3中描述的结构表明，多肽序列SEQ ID NO:26可足以结合GRP78。实施例3示出了在ISM1中没有在SEQ ID NO:26之前的EVSLLAGSEEFNATKL序列(即位置271-286)情况下的有效结果。因此，在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括这样的多肽或肽或其GRP78-激活片段，该多肽或肽或其GRP78-激活片段包含或由以下氨基酸序列组成：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:26)；或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段。
在某些实施方式中，本文提供了一种多肽或肽，其包含或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24)；
或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
实施例3中描述的结果表明，多肽序列SEQ ID NO:24可足以结合GRP78，或以支持EC粘附，可以被内在化，可定位在线粒体中，并且可以诱导凋亡。实施例3示出了在ISM1中没有在SEQ ID NO:26之前的EVSLLAGSEEFNATKL序列(即位置271-286)情况下的有效结果。因此，在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括这样的多肽或肽或其GRP78-激活片段，该多肽或肽或其GRP78-激活片段包含或由以下氨基酸序列组成：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24)；或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段。
SEQ ID NO:26的氨基酸序列是小鼠ISM1的C-末端区域的N-末端区域，其中定位有所述AMOP结构域，并且包含来自AMOP结构域N-末端部分的序列(ISM1C-N，残基2287-373)。SEQ ID NO:24的氨基酸序列是小鼠ISM1的C-末端区域，含有AMOP结构域但不含TSR结构域(ISM1C，残基287-461)。SEQ ID NO:26和24的每一个均衍生自小鼠ISM1序列，但应当理解的是，在某些实施方式中，可以使用来自另一物种的ISM1的相应序列/区域。例如，在某些实施方式中，本文提供了一种肽或多肽或其GRP78-激活片段，包含或由以下氨基酸序列组成：在人类ISM1中发现的与小鼠ISM1的区域287-373(SEQ ID NO:26)或区域287-461(SEQ ID NO:25)对应的氨基酸序列(见相应的人类序列，例如人类中的区域290-464)，或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段。
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:27；人类ISM1C-N)
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24–小鼠ISM1 287-461)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25–人类ISM1 290-464)
在某些实施方式中，上述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以或可以不进一步包含ISM1的N-末端信号肽序列。
在某些实施方式中，上述肽或多肽或其GRP78-激活片段不是全长的或成熟的ISM1(即，在某些实施方式中，所述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以是不是在细胞或受试者中自然表达的外源性肽或多肽)。在某些实施方式中，所述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以比全长或成熟ISM1更长或更短。在某些实施方式中，所述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以具有一级氨基酸序列，其在至少一个残基方面与自然表达的ISM1不同(即，例如，与来自人类或其他物种的自然表达的ISM1相比，所述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代)。在某些实施方式中，例如，与自然表达的ISM1相比，所述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以包含一个或多个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，上述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以包括或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:26)；
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24)；
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:27)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25–人类ISM1 290-464)；
或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段。
在上述肽或多肽或GRP78-激活片段的另一实施方式中，所述肽或多肽或GRP78-激活片段在SEQ ID No:24-27任一者的N-末端不包含氨基酸序列EVSLLAGSEEFNATKL，或者根本不包含序列EVSLLAGSEEFNATKL。在另一实施方式中，所述肽或多肽或GRP78-激活片段不包含或者不是以下序列：
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:12)；
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:20)；
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:13)；或
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:21)。
在某些实施方式中，上述肽或多肽或其GRP78-激活片段可以包含分离的肽或多肽或其GRP78-激活片段。
在某些实施方式中，如本文所述的多肽或肽或其GRP78-激活片段(包括与ISM1蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的那些)，与特定物种中自然表达的全长或成熟ISM1相比，可以包括具有至少一个突变(即氨基酸添加、缺失或取代)的多肽或肽或其GRP78-激活片段。在某些实施方式中，所述至少一个突变可以或可以不包含氨基酸取代。在某些实施方式中，所述至少一个突变可以或可以不包含保守氨基酸取代，其中氨基酸被置换为在尺寸、电荷、亲水性/疏水性、氢键或它们的任何组合中的至少一个方面与原始残基至少稍微有点类似的另一氨基酸残基。在某些实施方式中，所述至少一个突变可以或可以不包含保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被置换为通常被认为在置换位置不显眼或不干扰所需功能的另一氨基酸残基，诸如例如甘氨酸或丙氨酸。
实施例3中的研究包括讨论具有KD341AA和RKD340AAA突变的多肽(ISM1C-N突变体)。这些突变可导致ISM1丧失与αvβ5整合素受体的结合亲和力，但如实施例3中所讨论的，这些突变不会破坏与GRP78的结合，表明这种突变序列可以提供对靶GRP78受体更特异性的靶向。因此，在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括KD341AA突变或RKD340AAA突变。可以理解的是，“341”和“340”编号是相对于小鼠序列提供的，并且可以因物种而异。例如，当提及人类ISM1序列中的编号时，KD-AA和RKD-AAA的编号可以变化(例如，对应的人类突变可以是KD343AA和RKD342AAA)。
因此，在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括这样的多肽或肽或其GRP78-激活片段，其包含或由以下氨基酸序列组成：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRAAFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:14，C-末端区域的N-末端部分含有小鼠AMOP结构域，残基287-373，具有KD341AA突变)，或来自另一物种的相应突变区域，或与它们具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段。
在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括这样的多肽或肽或其GRP78-激活片段，其包含或由以下氨基酸序列组成：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKAAAFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:15，C-末端区域的N-末端部分含有小鼠AMOP结构域，残基287-373，具有RKD340AAA突变)，或来自另一物种的相应突变区域，或与它们具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段。
如实施例3中所讨论的，结果表明，单独的C-末端AMOP结构域足以介导ISM1的促凋亡活性。事实上，如以下实施例3中所讨论的，使用ISM1蛋白的截短体进行的结构-功能关系研究表明，来自287-461的C-末端AMOP结构域保留了全长ISM1蛋白的完整促凋亡活性，并且AMOP结构域不需要翻译后修饰来介导ISM1的促凋亡活性。因此，在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括这样的多肽或肽或其GRP78-激活片段，其包含或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24；小鼠)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25；人类)；
或与其具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24和25分别来源于小鼠和人类ISM1序列；然而，可以理解的是，在某些实施方式中，可以使用来自另一物种的ISM1的相应序列/区域。
在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括化学修饰的多肽或肽，或衍生自或基于所述多肽或肽的肽模拟物。例如，在某些实施方式中，多肽或肽或其GRP78-激活片段可以包括化学修饰的多肽或肽，或衍生自或基于所述多肽或肽的肽模拟物，其可以包括环化衍生物、包含一个或多个非天然氨基酸残基的衍生物(诸如D-氨基酸)、和/或肽模拟物或包含不同于肽键的一个或多个不同化学键或连接的其他构建体中的一种或多种，其中诸如类肽和β-肽。在某些实施方式中，来自ISM1的肽衍生药剂的例子可以包括Kao et al.,EBioMedicine 33(2018)22-32(其全部内容以引用方式并入本文)中描述的那些，诸如BC71。
在某些实施方式中，如本文所述的肽或多肽可以配制用于给药至在需要的受试者的肺。考虑到本文的教导，本领域技术人员将意识到多种合适的方法和技术来配制用于向肺给药(即用于肺部递送)的药剂。向肺递送药物(尤其是蛋白质)一直是重要研究的主题，如例如Bodier-Montagutelli,E.,et al.,2018,Designing inhaled proteintherapeutics for topical lung delivery:what are the next steps？,ExpertOpinion on Drug Delivery,15(8):729-736；和Labiris,N.R.,et al.,2003,PulmonaryDrug Delivery.Part II:The role of inhalant delivery devices and drugformulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications,Br JClin Pharmacol,56:600-612中的描述，其每一个都通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，本文所述的多肽、肽或核酸可以用于局部向肺部给药。例如，在某些实施方式中，本文所述的多肽、肽或核酸可以通过气管内、鼻内或吸入给药直接或局部地向肺部给药。
在某些实施方式中，本文所述的肽或多肽可以配制用于气管内给药、鼻内给药或吸入给药至对其有需要的受试者。在某些实施方式中，所述多肽可以配制用于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述多肽可以配制为用于通过气雾化向肺给药的干粉，或配制为用于通过雾化向肺给药的液体。
在某些实施方式中，本文所述的多肽可以用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性；包括诱导肺泡巨噬细胞(AM)或其他免疫细胞的凋亡；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)或肺气肿；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防哮喘；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，可以预期的是，如本文所述的肽或多肽可以任选地用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺部炎症的一种或多种附加药剂共价或非共价共轭或复合(例如可选地通过生物可切割接头)，或可以任选地与所述一种或多种附加药剂组合、同时或依次使用。考虑到本文的教导，本领域技术人员可以知道用于预防或减少肺部炎症的常规药剂，并且例如可以包括类固醇。
例如，用于治疗或控制COPD的常规药剂可以包括组合吸入的LABA+吸入的LAMA，其可以COPD患者的肺功能并减少恶化。LABA(长效的β2-激动剂)和LAMA(长效毒蕈碱拮抗剂)是提供症状控制的支气管扩张剂。LABA的例子是沙美特罗和福莫特罗。LAMA的例子是噻托溴铵和格隆溴铵。在大多数COPD中，患者对皮质类固醇显示出较差的响应，并且由于其副作用谱，通常不会单独给予抗-炎性吸入的皮质类固醇(ICS)。其通常与LABA组合，诸如福莫特罗+倍氯米松或沙美特罗+氟替卡松。也可以使用三重吸入疗法，组合LABA+LAMA+ICS用于非常严重的COPD和减少COPD恶化。一种较新的抗炎症药剂罗氟司特，一种磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂，可以改善肺功能并减少中度和重度恶化。然而，这种药物伴有主要的剂量限制性副作用(见可在线获取的GOLD指南或NICE指南)。
在某些实施方式中，本文提供了一种包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的肽或多肽，或编码所述多肽的可表达核酸，例如用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症。
在另一实施方式中，本文提供了一种编码肽或多肽的核酸，该肽或多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。与给定氨基酸对应的核苷酸密码子是众所周知的，并且考虑了本文教导的技术人员将能够容易地选择合适的核酸来编码给定的多肽。在某些实施方式中，可以选择所述核酸序列以便编码区使用针对在特定目标生物体中的表达进行了优化的密码子(例如，当使用核酸在大肠杆菌中生产多肽时，可以针对大肠杆菌中的表达优化密码子，或者当要将核酸给药至人类以促使多肽的体内表达时，可以针对人类中的表达进行优化)。在某些实施方式中，所述核酸可以是可表达核酸(即当引入或存在于给定细胞中时，所述核酸可以被设计为导致所述多肽的表达)。在某些实施方式中，所述核酸可以是DNA或RNA。在某些实施方式中，所述核酸可以是质料、表达载体或mRNA(在某些实施方式中，其可以包括适合在目标细胞中翻译的序列，例如起始密码子、poly-A尾、RBS序列等)，具有适当的上游和/或下游序列，使得一旦将核酸引入细胞就可以发生核酸的翻译、或转录和翻译，从而提供所述多肽。在要将核酸引入到受试者的肺细胞中以在其中表达所述多肽的实施方式中，可以预期的是，在某些实施方式中，由所述核酸编码的多肽可以包括信号肽序列，使得多肽被分泌。
用于过表达特定多肽或将特定多肽引入细胞的合适表达载体技术是本领域已知的(参见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th Ed.),2012,Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如本领域技术人员已知的，用于表达特定多肽的核苷酸序列可以编码或包括如"Genes VII",Lewin,B.Oxford University Press(2000)或"MolecularCloning:A Laboratory Manual",Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory,3rd edition(2001)中描述的特征。可以将编码特定多肽的核苷酸序列并入合适的载体，例如市售载体。也可以使用例如Sambrook et al.(Cold Spring Harbor Laboratory,3rdedition(2001))中描述的标准分子生物学技术来单独构建或修饰载体。本领域技术人员将认识到，载体可包括编码所需元件的核苷酸序列，所述元件可操作地连接至编码多肽的核苷酸序列。编码所需元件的此类核苷酸序列可包括转录启动子(例如组成型或诱导型启动子)、转录增强子、转录终止子和/或复制起点。合适载体的选择可取决于若干因素，包括但不限于要并入载体的核酸的大小、所需的转录和翻译控制元件的类型、所需的表达水平、所需的拷贝数、是否需要染色体整合、需要的选择过程类型、或打算转化的宿主细胞或宿主范围。
在要将所述核酸引入到受试者或细胞中以在其中生产所述多肽的实施方式中(例如，在多肽的制造中，或用于体外或体内治疗应用)，可以预期的是，所述核酸可以与适合将核酸引入细胞的合适核酸递送载体或转染试剂复合。在某些实施方式中，可以将所述核酸并入到病毒中以递送到细胞中，并且所述核酸可以或可以不整合到细胞的基因组中。考虑了本文教导的本领域技术人员将知道各种递送载体、转染试剂和/或病毒递送构建体，它们可以被选择以将本文所述的核酸递送至给定细胞或对其有需要的受试者。
在另一实施方式中，本文提供了一种核酸序列，其与本文所述的任何核酸序列完全或部分互补。
如本文中所引用的，相对于特定序列或其特定部分的同一性百分比(％)或％序列同一性可以定义为：在将序列进行比对并且引入间隙(如有必要)以达到最大百分比的序列同一性之后，如由程序WU-BLAST-2.0以设定为默认值的搜索参数所生成的(Altschul etal.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-410；网址为blast.wustl.edu/blast/README.html)，候选序列中与目标序列(或其指定部分)的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。例如，可以通过将匹配相同核苷酸或氨基酸的数目除以被报告百分比同一性的序列长度来确定％同一性值。氨基酸序列相似性百分比(％)可以通过用于确定％氨基酸序列同一性的相同计算来确定，但除了计算中的相同氨基酸之外，例如还可以包括保守氨基酸取代。可以使用诸如例如BLAST(GenBank；使用默认参数)等寡核苷酸或氨基酸比对算法来计算序列同一性％。
在另一实施方式中，本文提供了一种组合物，包含：
包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的可表达核酸；和
药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
所述组合物配制用于给药至受试者的肺。
在某些实施方式中，所述多肽或可表达核酸可以包含如上文所述或如本文其他位置所述的多肽或可表达核酸。
在某些实施方式中，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂可以包括本领域技术人员在考虑了本文教导之后已知的任何适合的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例可包括但不限于纤维素衍生物、蔗糖和淀粉。本领域技术人员将认识到药学上可接受的赋形剂可包括本领域公知的适合填料、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、助流剂、分散剂和/或分散剂(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2006))。可以在例如Remington's Pharmaceutical Sciences(2000-第20版)和1999年出版的美国药典：国家处方集(USP 24NF19)中找到药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的例子。本领域技术人在考虑了本文的教导之后，将了解适用于将本文所述的多肽和/或核酸配制为向对其有需要的受试者的肺施用的合适药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。在某些实施方式中，如本文所述多肽和/或核酸和/或组合物可与作为药学上可接受的载体的推进剂或载气一起配制，所述推进剂或载气可以加压也可以不加压。
在某些实施方式中，诸如蛋白质或肽等大分子的气雾剂递送可以通过如干粉吸入器(DPI)或喷雾器的装置来给予。通常用于此类大分子的赋形剂可以包括表面活性剂、糖类(例如蔗糖、海藻糖)和/或多元醇(例如PEG)中的任何一种或多种。通常将氨基酸(例如甘氨酸、赖氨酸)用作稳定剂。参见例如Expert Opin Drug Deliv(2018)15:729-736和Adv DrugDeliv Rev(2015),93:79-94，其全部内容以引用方式并入本文。
在某些实施方式中，如本文所述的多肽、核酸和/或组合物可以配制用于向对其有需要的受试者的肺给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将意识到多种合适的方法和技术来配制用于向肺部给药(即用于肺部递送)的药剂。向肺部递送药剂且特别是蛋白质一直是重要研究的主题，如例如Bodier-Montagutelli,E.,et al.,2018,Designing inhaledprotein therapeutics for topical lung delivery:what are the next steps？,Expert Opinion on Drug Delivery,15(8):729-736；Labiris,N.R.,et al.,2003,Pulmonary Drug Delivery.Part II:The role of inhalant delivery devices anddrug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications,BrJ Clin Pharmacol,56:600-612；和Ibrahim,M.,et al.,2015,Inhalaton drug deliverydevices:technology update,Med Devices(Auckl),8:131-9中的描述，它们各自均通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，可以使用合适的药物递送装置将如本文所述的多肽、核酸和/或组合物递送至肺部。在某些实施方式中，药物递送装置可以采用肺部装置的形式，诸如吸入器、喷雾器、气雾剂、粉扑剂(puffer)、喷鼻剂或用于向肺部给药的其他适合递送装置。例如，US5983893、US6732732、US20070295332、US5007419、US4832015、US20040244794、US20100065048、US20030235555、US20050201951和US20090000615中描述了肺部递送装置的例子，它们各自均通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，本文所述的组合物可以配制用于气管内给药、鼻内给药或吸入给药至对其有需要的受试者。在某些实施方式中，所述组合物可以配制用于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述组合物可以配制为用于通过气雾化向肺部给药的干粉，或配制为用于通过雾化向肺部给药的液体。
在某些实施方式中，如本文所述的组合物可以用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性；在对其有需要的受试者中诱导促炎细胞的凋亡；诱导肺泡巨噬细胞(AM)的凋亡；在对其有需要的受试者中降低AM水平；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防哮喘；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，促炎细胞可以包括先天和/或适应性免疫细胞的任何一种或多种，诸如巨噬细胞、中性粒细胞、T和B淋巴细胞、NK细胞等。在肺中，巨噬细胞可以包括肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞或两者。
在某些实施方式中，与肺部炎症相关的肺疾病或病症可以包括COPD、特发性肺纤维化(IPF)、ALI、ARDS、哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、肺炎等中的任何一种或多种。
在某些实施方式中，可以预期的是，如本文所述的组合物可以任选地进一步包含一种或多种附加药剂，或可以任选地与一种或多种附加药剂组合、同时或依次使用，所述一种或多种附加药剂用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺部炎症。用于预防或减少肺部炎症的常规药剂对于考虑了本文教导的本领域技术人员将是已知的，并且可以包括例如类固醇。上文已经描述了常规药剂的例子。
在又另一实施方式中，本文提供了一种肺部药物递送装置，包含多肽或编码所述多肽的可表达核酸，该多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肺部药物递送装置可以含有或以其他方式加载有如本文所述的多肽、核酸或组合物。在某些实施方式中，所述肺部药物递送装置可以配置为具有加载有如本文所述的多肽、核酸或组合物的可更换或不可更换的药筒。如可以理解的，所述肺部药物递送装置通常可以包含任何适合用于向对其有需要的受试者的肺给药如本文所述的多肽、核酸或组合物的医疗装置。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解可以被配置为递送本文所述多肽、核酸和/或组合物的各种装置。在某些实施方式中，所述肺部药物递送装置可以包含例如气管内药物递送装置、鼻内药物递送装置或吸入药物递送装置。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解各种适合用于向肺部给药(即用于活性剂的肺部递送)的医疗装置设计。向肺递送药剂且特别是蛋白质一直是重要研究的主题，如例如Bodier-Montagutelli,E.,et al.,2018,Designing inhaled proteintherapeutics for topical lung delivery:whatare the next steps？,Expert Opinionon Drug Delivery,15(8):729-736；Labiris,N.R.,et al.,2003,Pulmonary DrugDelivery.Part II:The role of inhalant delivery devices and drug formulationsin therapeutic effectiveness of aerosolized medications,Br J Clin Pharmacol,56:600-612；和Ibrahim,M.,et al.,2015,Inhalation drug delivery devices:technology update,Med Devices(Aukl),8:131-9中的描述，它们各自通过引用以其整体并入本文。在某些实施方式中，肺部药物递送装置可以包含用于递送至肺部的任何合适的药物递送装置。作为非限制性示例，在某些实施方式中，所述肺部药物递送装置可以包含气雾剂、喷鼻剂、吸入器、粉扑剂、喷雾器或另一适合用于各肺部给药的递送装置。例如，US5983893、US6732732、US20070295332、US5007419、US4832015、US20040244794、US20100065048、US20030235555、US20050201951和US20090000615中描述了肺部递送装置的示例，它们各自通过引用以其整体并入本文。在某些实施方式中，可以预期的是，例如，所述肺部药物递送装置可以包含气雾剂并且所述多肽或核酸可以被配制为干粉，或者所述肺部药物递送装置可以包含喷雾器并且所述多肽或核酸可以被配制为液体。在某些实施方式中，所述肺部药物递送装置可以包含喷雾器、计量剂量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI)，它们加载有相应配制的本文所述的多肽、核酸或组合物。
在某些实施方式中，可以预期的是，如本文所述的肺部药物递送装置可以任选地进一步包含一种或多种附加药剂，或者可以任选地与一种或多种附加药剂组合、同时或依次使用，所述一种或多种附加药剂用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺部炎症。用于预防或减少肺部炎症的常规药剂对于考虑了本文教导的本领域技术人员将是已知的，并且可以包括例如类固醇。上文已经描述了常规药剂的示例。
在某些实施方式中，例如，本文所述的肺部药物递送装置可以用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性；在对其有需要的受试者中诱导促炎细胞凋亡；诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡；在在对其有需要的受试者中降低AM水平；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防哮喘；在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖；或在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化，或它们的组合。
用于治疗与炎症有关的疾病或病症的方法和用途
例如，本文还提供了用于治疗、改善或预防与炎症且特别是肺部炎症有关的疾病或病症的用途和方法。在某些实施方式中，此类用途和方法可以利用如本文所述的多肽、核酸、组合物和/或肺部药物递送装置的一种或多种，诸如以上描述的那些。
在如本文所述的肽、多肽、核酸和/或组合物要给药或递送至受试者的肺部的某些实施方式中，所述肽或多肽或核酸或组合物可以通过例如气管内给药、鼻内给药、或吸入(例如经口吸入)给药或递送来递送。在某些实施方式中，例如，所述肽、多肽、核酸或组合物可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述肽或多肽可以配制为干粉并通过气雾化给药至肺部，或可以配制为液体并通过雾化给药至肺部。在某些实施方式中，可以使用如本文所述的肺部药物递送装置来进行给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解各种适合用于向肺部给药(即用于肺部递送)的方法和技术。向肺部递送药剂且特别是蛋白质一直是重要研究的主题，如例如Bodier-Montagutelli,E.,et al.,2018,Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery:what are thenext steps？,Expert Opinion on Drug Delivery,15(8):729-736；Labiris,N.R.,etal.,2003,Pulmonary Drug Delivery.Part II:The role of inhalant deliverydevices and drug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolizedmedications,Br JClin Pharmacol,56:600-612；和Ibrahim M.,et al.,2015,Inhalationdrug delivery devices:technology update,Med Devices(Auckl),8:131-9中的描述，它们各自通过引用以其整体并入本文。在某些实施方式中，可以使用用于向肺部给药的任何适合肺部药物递送装置来执行作为本文所述方法一部分的本文所述的多肽、核酸和/或组合物的给药。在某些实施方式中，药物递送装置可以采用肺部装置的形式，诸如吸入器、喷雾器、气雾剂、粉扑剂、喷鼻剂或用于向肺部给药的其他适合递送装置。例如，US5983893、US6732732、US20070295332、US5007419、US4832015、US20040244794、US20100065048、US20030235555、US20050201951和US20090000615中描述了肺部递送装置的示例，它们各自通过引用以其整体并入本文。
为简单起见，术语多肽在本文中一般地用来描述通常任何长度的任何蛋白质、多肽、肽或其他氨基酸序列。术语多肽可以理解为引用蛋白质、多肽或肽，这取决于在特定实施方式和/或应用中使用的氨基酸序列的长度。例如，在多肽的长度小于约30个氨基酸的实施方式中，所述多肽可以被认为是肽。除非另有说明，本文中使用术语多肽旨在包括肽、多肽和蛋白质。
在要将编码多肽的核酸给药至受试者的肺部的某些实施方式中，所述核酸可以通过例如气管内给药、鼻内给药或经口吸入给药来递送。在某些实施方式中，所述核酸可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述核酸可以配制为干粉并通过气雾化给药至肺部，或者可以配制为液体并且通过雾化给药至肺部。在某些实施方式中，可以使用如本文所述的肺部药物递送装置来进行所述给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解用于向肺部给药(即用于肺部递送)的各种适合方法和技术。在要将核酸给药至受试者的某些实施方式中，可以将所述核酸引入受试者或细胞以在其中生产其编码的多肽。在某些实施方式中，所述核酸可以包含表达载体或表达盒。在某些实施方式中，所述核酸可以包含DNA载体。在某些实施方式中，可以预期的是，所述核酸可以与适用于将核酸引入细胞的适合核酸递送载体或转染试剂复合。在某些实施方式中，所述核酸可以参入到用于递送至细胞的病毒，并且所述核酸可以或可以不整合到细胞的基因组中。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解各种递送载体、转染试剂和/或病毒递送构建体，它们可以经选择以将本文所述的核酸递送至给定细胞或对其有需要的受试者。参见例如Gomes et al.,2017,Expert Opin Drug Deliv.,2017,14(3):319-330，其全部内容以引用方式并入本文。
如本文中详细描述的，本发明人现在已经开发了用于治疗炎症(诸如肺部炎症)的方法，其来源于和/或基于Isthmin 1(ISM1)，这是一种分泌蛋白，本文所述的研究表明其在抑制、阻止和/或消退炎症且特别是肺部的炎症方面发挥作用。在下文详述的研究中，向肺部抑制补充外源性重组ISM1蛋白(rISM1)抑制了ISM1-缺陷型肺中的肺部炎症表型，并且结果表明，施用于ISM1可通过诱导肺泡巨噬细胞凋亡而有助于消退炎症。结果进一步表明，ISM1可在无菌性肺部炎症和/或由感染和/或损伤引发的炎症的抑制和/或消退方面发挥重要作用。
因此，在一个实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性的方法，所述方法包含：
向对其有需要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，调节GRP78活性可以包括向所述受试者给药如本文所述的多肽、核酸或组合物，从而触发GRP78活性(提供促凋亡作用)并由此减轻受试者的炎症。典型地，调节GRP78活性可以包括，当受试者中的GRP78促凋亡活性水平太低而不能充分抑制、阻止和/或消退受试者的炎症且特别是肺部炎症时，增加受试者中的GRP78活性水平(即增加GRP78结合引起的促凋亡作用)。在某些实施方式中，调节GRP78活性可以包括当受试者中的GRP78水平太低而无法诱导充分的肺泡巨噬细胞凋亡以减轻炎症状态时，增加受试者中的GRP78水平。在某些实施方式中，当要治疗肺部疾病或病症时，提及GRP78活性水平可以包括例如受试者的肺组织或肺细胞(诸如受试者的肺泡巨噬细胞(AM))中的GRP78的活性水平。可以理解的是，在某些实施方式中，本文中提及GRP78活性水平或GRP78活性可以理解为提及在配体结合(这可以提供促凋亡作用)后GRP78在将信号传输到细胞中的水平或活性。
在Ni,et al.,Biochem J.,2011,434(2):181-188中可以找到GRP78的综述，其全部内容以引用方式并入本文。
在某些实施方式中，可以预期的是，ISM1可能有利于或更有选择性地杀死或靶向具有高csGRP78水平的细胞。正常环境下的健康细胞应该具有相对较低水平的或不存在csGRP78。GRP78表达水平在应激下的细胞中会增加，并且可以预期的是，含有高水平csGRP78的细胞可以对ISM1进行响应并被触发凋亡。因此，应激的细胞可能是细胞外ISM1的首选靶(还参见Chen et al.,Cell Death&Differentiation,21(5):797-810,2014，通过引用并入本文)。不希望被理论束缚，可以预期的是，具有提高csGRP78水平的细胞将比健康细胞更强烈地响应ISM1-诱导的凋亡信号，这在某些实施方式中可以减少副作用。
在某些实施方式中，可以通过气管内给药、鼻内给药或口腔吸入给药向受试者的肺部给药所述多肽或核酸。在某些实施方式中，所述多肽或核酸或组合物可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述多肽、核酸或组合物可以被配制为干粉并通过气雾化以向肺部给药，或者可以被配制为液体并且通过雾化以向肺部给药。在某些实施方式中，如以使用如本文所述的肺部药物递送装置来进行所述给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解用于向肺部给药(即用于肺部递送)的各种适合的方法和技术。向肺递送药剂且特别是蛋白质一直是重要研究的主题，如例如Bodier-Montagutelli,E.,et al.,2018,Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery:whatare the next steps？,Expert Opinion on Drug Delivery,15(8):729-736；和Labiris,N.R.,et al.,2003,Pulmonary Drug Delivery.Part II:The role of inhalantdelivery devices and drug formulations in therapeutic effectiveness ofaerosolized medications,Br J Clin Pharmacol,56:600-612中的描述，它们各自通过引用以其整体并入本文。
在又另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中诱导促炎细胞凋亡或肺泡巨噬细胞(AM)凋亡、或者用于在对其有需要的受试者中降低AM水平的方法，所述方法包含：
向所述对其有需要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡可以包括向所述受试者给药如本文所述的多肽、核酸或组合物，从而触发所述受试者肺部中的至少一些肺泡巨噬细胞(AM)经历凋亡。在某些实施方式中，例如，可以使用肺活量计非侵入性地测量肺功能下降。高度炎症可能间接指示高AM，它可能占空域免疫细胞的约95％。高度炎症可能会损害肺并降低其功能。在临床环境中，当肺状况下降并伴有低氧血症和呼吸困难等时，临床医生可能会给予抗炎症药物。因此，在某些实施方式中，在观察到肺功能下降的情况下、在观察到高度炎症的情况下和/或在确定AM凋亡水平较低的情况下，可以进行所述多肽或核酸的给药。
在某些实施方式中，诱导促炎细胞凋亡可以包括向所述受试者给药如本文所述的多肽、核酸或组合物，从而触发所述受试者肺中的至少一些促炎细胞经历凋亡。促炎细胞可以包括AM、中性粒细胞、间质巨噬细胞、T和B细胞、NK细胞等。在某些实施方式中，ISM1可能有利于选择性地地靶向促炎细胞，诸如携带高csGRP78的AM。例如，在香烟烟雾下，大多数AM可能被应激激活，并具有高csGRP78水平，并因此可能成为ISM1的靶。
在某些实施方式中，降低受试者中的肺泡巨噬细胞(AM)水平可以包括向所述受试者给药如本文所述的多肽、核酸或组合物，从而触发所述受试者肺中的肺泡巨噬细胞(AM)水平降低。在某些实施方式中，可以预期的是，在与健康对照或症状较轻的疾病对照相比，确定受试者中的AM水平升高的情况下，进行给药。在某些实施方式中，可以预期的是，可以从可采集自受试者的支气管肺泡灌洗液(BALF)的样品中确定AM水平，并且可以在BALF中测量AM。替代地或附加地，可以监测肺功能作为AM水平的间接测量。
在某些实施方式中，所述多肽或核酸可以通过气管内给药、鼻内给药或口腔吸入给药以向受试者的肺给药。在某些实施方式中，所述多肽或核酸或或组合物可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述多肽、核酸或组合物可以配制为干粉并且通过气雾化以向肺部给药，或者可以配制为液体并且通过雾化以向肺部给药。在某些实施方式中，可以使用如本文所述的肺部药物递送装置来进行所述给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解用于向肺部给药(即用于肺部递送)的各种适合方法和技术。
在又另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症的方法，所述方法包含：
向所述对其有需要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，肺部炎症通常可以包括肺部的任何炎症状态或状况，包括但不限于无菌性肺部炎症和/或由感染和/或损伤引发的炎症。在某些实施方式中，肺部炎症可以是与COPD、肺气肿、支气管炎、ALI、ARDS、IPF、肺炎等有关的肺部炎症。在某些实施方式中，可以通过测量肺功能下降和/或低氧血症来测量肺部炎症，并且在识别了炎症或升高的炎症的情况下进行给药。
在某些实施方式中，所述多肽或核酸可以通过气管内给药、鼻内给药或口腔吸入给药来向受试者的肺部给药。在某些实施方式中，所述多肽或核酸或组合物可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述多肽、核酸或组合物可以配制为干粉并且通过气雾化向肺部给药，或者可以配制为液体并且通过雾化向肺部给药。在某些实施方式中，可以使用如本文所述的肺部药物递送装置来进行所述给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解用于向肺部给药(即用于肺部递送)的各种适合方法和技术。
在又另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的方法，所述方法包含：
向所述有城要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，与肺部炎症相关的肺部疾病或病症通常可以包括由炎症引起或伴随炎症的肺的任何疾病、病症、状态或状况。示例可以包括但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎、哮喘、肺气肿、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺纤维化(诸如例如特发性肺纤维化)或它们的任何组合。
在某些实施方式中，所述多肽或核酸可以通过气管内给药、鼻内给药或口腔吸入给药来向受试者的肺部给药。在某些实施方式中，所述多肽或核酸或可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述多肽、核酸或组合物可以配制为干粉并且通过气雾化向肺部给药，或者可以配制为液体并且通过雾化向肺部给药。在某些实施方式中，可以使用如本文所述的肺部药物递送装置进行所述给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解用于向肺部给药(即用于肺部递送)的各种适合方法和技术。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎、哮喘或肺气肿的方法，所述方法包含：
向所述对其有需要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在又另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，所述方法包含：
向所述对其有需要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖的方法，所述方法包含：
向所述对其有需要的受试者给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在还另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化的方法，所述方法包含：
向所述对其有需要的受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在任何一种或多种上述方法的进一步实施方式中，所述多肽或核酸可以包含任何如本文所述的多肽或核酸，诸如上述的那些。前一节陈述了适合多肽和核酸的广泛描述和示例。在某些实施方式中，所述多肽和/或核酸可以提供或配制在组合物中，如上文已经详细描述的。在某些实施方式中，所述多肽、核酸和/或组合物可以提供在肺部药物递送装置中，如上文已经详细描述的。
在任何一种或多种上述方法的进一步实施方式中，所述方法可以进一步包含步骤：与所述多肽或核酸组合、同时或顺次向所述受试者给药用于预防或减少肺部炎症的药剂。
在任何一种或多种上述方法的进一步实施方式中，所述方法可以进一步包含步骤：向所述受试者给药用于预防或减少肺部炎症的一种或多种附加药剂。在某些实施方式中，可以预期的是，如本文所述的多肽、核酸、组合物和/或肺部药物递送装置可以任选地进一步包含用于预防或减少肺部炎症的一种或多种附加药剂，或者可以任选地与用于预防或减少肺部炎症的一种或多种附加药剂组合、同时或依次在对其有需要的受试者中使用。用于预防或减少肺部炎症的常规药剂对于考虑了本文教导的本领域技术人员是公知的，并且可以包括例如类固醇。上文已经描述了常规药剂的示例。
在任何一种或多种上述方法的某些实施方式中，方法还可以包括以下步骤：
确定受试者中的ISM1水平；确定受试者中的GRP78蛋白水平；确定受试者中的肺泡巨噬细胞(AM)水平；确定受试者中的痰症水平；确定受试者中的肺功能下降水平；或它们的任何组合；和
在以下情况下，执行或重复给药步骤：在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平降低的ISM1水平的情况下；在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的GRP78蛋白水平的情况下；在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的肺泡巨噬细胞(AM)水平的情况下；在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的炎症水平的情况下；在确定出受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的肺功能下降水平的情况下；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，可以使用本领域技术人员考虑了本文教导之后已知的任何合适技术来确定受试者中的ISM1水平。例如，在某些实施方式中，例如，可以通过来自受试者的血液、血清、痰液或BALF样品的ELISA测试来确定ISM1水平。在某些实施方式中，例如，可以通过在血液或痰样品中的质谱定量来确定ISM1水平。在某些实施方式中，可以通过分离的AM样品(例如来自BALF)的免疫细胞化学和/或免疫荧光染色来确定ISM1水平。在某些实施方式中，所述ISM1水平可以包含受试者肺组织中的ISM1水平、切下的受试者的肺组织中的ISM1水平或受试者肺泡巨噬细胞(AM)中的ISM1水平。在某些实施方式中，可以将所确定的受试者的ISM1水平与健康对照水平(即所观察到的健康对照受试者组的ISM1水平或范围)进行比较，和/或可以与低严重度疾病对照水平(即所观察至的患有疾病或病症但严重程度较低的疾病对照组的ISM水平或范围)进行比较。如果确定受试者的ISM1水平低于健康对照水平或低严重度疾病对照水平的ISM1水平，则可以使用如本文所述的多肽、核酸或组合物对所述受试者进行治疗或附加治疗。在某些实施方式中，相对于对照水平降低的ISM1水平可以识别为与所述对照水平相比降低了至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的水平。
在某些实施方式中，具有低ISM1水平的受试者可被识别为潜在特别易受ISM或其片段或其衍生物治疗影响的受试者。然而，应该认识到，在某些实施方式中，即使具有相对高水平内源性ISM1的受试者，如果炎症持续，则ISM1水平可能仍不足够高以克服严重的炎症并且可取的是给药额外如本文所述的外源性ISM1或其片段或衍生物。
在某些实施方式中，可以使用考虑了本文教导的本领域技术人员已知的任何适合技术来确定受试者的GRP78蛋白水平。在某些实施方式中，GRP78蛋白水平可以是总细胞GRP78水平、csGRP78蛋白水平或两者。在某些实施方式中，例如，可以在荧光在像中使用荧光探针(诸如肽配体)或诸如在PET成像中使用放射性同位素标记探针确定GRP78水平。在某些实施方式中，可以在活生物体诸如哺乳动物或人类受试者中使用此类探针。在某些实施方式中，所述GRP78蛋白水平可以包含受试才肺组织中的GRP78蛋白水平、切下的受试者肺组织中的GRP78蛋白水平、或受试者肺泡巨噬细胞(AM)中的GRP78蛋白水平。在某些实施方式中，可以通过ELISA、免疫染色、蛋白质印迹或其他适合技术来确定GRP78蛋白水平。在某些实施方式中，可以从活检中获得的肺组织样品来确定GRP78蛋白水平。在某些实施方式中，可以将所确定的受试者的GRP78蛋白水平与健康对照水平(即从健康对照受试者组观察到的GRP78蛋白水平或范围)进行比较，和/或可以与低严重度疾病对照水平(即从患有疾病或病症但严重程度较低的疾病对照组观察到的GRP78蛋白水平或范围)进行比较。如果确定受试者的GRP78蛋白水平高于健康对照水平或低严重度疾病对照水平的GRP78蛋白水平，则可以使用如本文所述的多肽、核酸或组合物对所述受试者进行治疗或进行附加治疗。在某些实施方式中，相对于对照水平增加的GRP78蛋白水平可以识别为与所述对照水平相比增加了至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的水平。在某些实施方式中，所述GRP78蛋白水平可以是受试者肺泡巨噬细胞的GRP78蛋白水平。然而，可以理解的是，在受试者存在炎症的情况下，可以预期的是，在某些实施方式中，无论是否确定GRP78水平升高，使用如本文所述的ISM1或其片段或衍生物进行治疗均是可取的。由于具有高csGRP78的细胞被ISM1-诱导的凋亡所靶向，则即使仅有一部分受试者的AM具有高csGRP78，可以预期通过触发细胞死亡来去除这些细胞仍然是有意义的。
在某些实施方式中，可以使用考虑了本文教导的本领域技术人员已知的任何适合技术来确定受试者的肺泡巨噬细胞(AM)水平。例如，在某些实施方式中，诱导痰可用于确定AM水平。在某些实施方式中，例如，可以使用考虑了本文教导的本领域技术人员已知的诱导痰程序来确定痰液的含量，包括肺泡巨噬细胞和/或痰液的细胞因子水平。在某些实施方式中，例如，肺泡巨噬细胞(AM)水平可以包含受试者肺组织中的肺泡巨噬细胞(AM)水平、或切下的受试者肺组织中的肺泡巨噬细胞(AM)水平。在某些实施方式中，可以通过收集BALF并计数细胞数来确定AM水平。在某些实施方式中，可以将所确定的受试者的肺泡巨噬细胞(AM)水平与健康对照水平(即从健康对照受试者组观察到的肺泡巨噬细胞(AM)水平或范围)进行比较，和/或可以与低严重度疾病对照水平(即从患有疾病或病症但严重程度较低的疾病对照组观察到的肺泡巨噬细胞(AM)水平或范围)进行比较。如果确定受试者的肺泡巨噬细胞(AM)水平高于健康对照水平或低严重度疾病对照水平的肺泡巨噬细胞(AM)水平，则可以使用如本文所述的多肽、核酸或组合物对所述受试者进行治疗或进行附加治疗。在某些实施方式中，相对于对照水平升高的肺泡巨噬细胞(AM)水平可以识别为与所述对照水平相比增加了至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的水平。
在某些实施方式中，在受试者表现出肺功能下降、呼吸困难、低氧血症、或与炎症诸如COPD有关的肺疾病或病症的另一症状的情况下，则可以进行或重复给药。
在某些实施方式中，可以使用考虑了本文教导的本领域技术人员已知的任何适合技术来确定受试者的炎症水平。在某些实施方式中，例如，炎症水平可以包含受试者肺组织中的炎症水平、切下的受试者肺组织中的炎症水平。在某些实施方式中，可以通过发烧(及其高度)、症状的严重程度诸如低氧血症、呼吸困难、呼吸急促、咳嗽、咳痰、血白细胞计数或其他此类炎症量度来确定或指示炎症。在某些实施方式中，可以通过免疫细胞数、促炎细胞因子诸如TNF-α的水平、NF-kB信号水平、蛋白酶诸如MMP的水平或其他此类量度来确定或指示炎症。在某些实施方式中，可以将所确定的受试者的炎症水平与健康对照水平(即从健康对照受试者组观察到的炎症水平或范围)进行比较，和/或可以与低严重度疾病对照水平(即从患有疾病或病症但严重程度较低的疾病对照组观察到的炎症水平或范围)进行比较。如果确定受试者的炎症水平高于健康对照水平或低严重度疾病对照水平的炎症水平，则可以使用如本文所述的多肽、核酸或组合物对所述受试者进行治疗或进行附加治疗。在某些实施方式中，相对于对照水平升高的炎症可以识别为与所述对照水平相比增加了至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的水平。
在某些实施方式中，可以使用考虑了本文教导的本领域技术人员已知的任何适合技术来确定受度者中的肺功能下降水平。例如，可以使用肺活量测定，或者可以通过如上所述的表现出的诸如呼吸困难、低氧血症等症状来进行确定。在某些实施方式中，可以将所确定的受试者的肺功能下降水平与健康对照水平(即从健康对照受试者组观察到的水平或范围)进行比较，和/或可以与低严重度疾病对照水平(即从患有疾病或病症但严重程度较低的疾病对照组观察到的水平或范围)进行比较。如果确定受试者的肺功能下降水平高于健康对照水平或低严重度疾病对照水平的肺功能下降水平，则可以使用如本文所述的多肽、核酸或组合物对所述受试者进行治疗或进行附加治疗。在某些实施方式中，相对于对照水平升高的肺功能下降水平可以识别为与所述对照比水相比受损了至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的肺功能下降水平。例如，COPD临床标准是使得FEV1/FVC<0.7(Tiffeneau-Pinelli指数)，因此通过肺活量测定，肺功能下降通常为至少30％，从而在这些标准下来确定是否满足COPD的条件。然而，例如，可以预期的是，早期治疗可能是预防COPD进展的首选。
在又另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症的方法，所述方法包含：
向所述受试者给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在还另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的方法，所述方法包含：
向所述受试者的肺部给药GRP78-激活剂。
在又另一实施方式中，本文提供了一种用于在对其有需要的受试者中维持肺部稳态和/或消退肺部炎症和/或以减少的重塑促进肺修复的方法，所述方法包含：
向所述受试者的肺部给药多肽或编码所述多肽的可表达核酸，所述多肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所指的受试者可以包括需要治疗的任何适合受试者。在某些实施方式中，所述受试者可以包含哺乳动物。在某些实施方式中，所述受试者可以包含人类。
在另一实施方式中，本文提供了一种包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或编码所述多肽的可表达核酸的用途，其用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性；用于在对其有需要的受试者中诱导促炎细胞凋亡；用于在对其有需要的受试者中诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡；用于在对其有需要的受试者中降低AM水平；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防哮喘；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；用于在对其有需要的受试者中预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症；用于在对其有需要的受试者中维持肺部稳态和/或消退肺部炎症和/或以减少的重塑促进肺修复；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，所述多肽或核酸可以用于向受试者的肺部给药。在某些实施方式中，所述多肽或核酸可以通过气管内给药、鼻内给药或口腔吸入给药以向受试者的肺部给药。在某些实施方式中，所述多肽或核酸或组合物可以作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。在某些实施方式中，所述多肽、核酸或组合物可以配制为干粉并且通过气雾化向肺部给药，或者可以配制为液全并且通过雾化向肺部给药。在某些实施方式中，可以使用如本文所述的肺部药物递送装置来进行所述给药。考虑了本文教导的本领域技术人员将了解用于向肺部给药(即用于肺部递送)的各种适合方法和技术。
在某些实施方式中，所述多肽或核酸可以与用于预防或减少肺部炎症的附加药剂组合使用。在某些实施方式中，可以预期的是，如本文所述的多肽、核酸、组合物和/或肺部药物递送装置可以任选地进一步包含用于预防或减少肺部炎症的一种或多种加附药剂，或者可以任选地在对其有需要的受试者中与用于预防或减少肺部炎症的一种或多种附加药剂组合、同时或依次使用。用于预防或减少肺部炎症的常规药剂对于考虑了本文教导的本领域技术人员是已知的，并且可以包括例如类固醇。上文已经描述了常规药剂的示例。
在又另一实施方式中，本文提供了一种包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽或编码所述多肽的可表达核酸在制造药物中的用途，所述药物用于在对其有需要的受试者中调节GRP78活性；用于在对其有需要的受试者中诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺部炎症；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防哮喘；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防肺纤维化；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防与巨噬细胞介导的炎症相关的疾病或病症；用于在对其有需要的受试者中维持肺部稳态和/或消退肺部炎症和/或以减少的重塑促进肺修复；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，如本文所述的多肽、核酸和/或组合物可以用于有向需要的受试者给药每天1次、2次或更多次；每1、2、3天或更多天一次；或例如基于症状按需给药。在某些实施方式中，例如，如本文所述的多肽、核酸和/或组合物可以通过喷雾器进行给药。在使用小鼠模型的下述研究中，每2天一次，以5ug/剂经由气管内给药是有效的。
对治疗敏感的受试者的诊断和/或识别方法
在又另一实施方式中，本文提供了一种识别患有与肺部炎症相关的肺部疾病或病症或者有发展与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的风险的受试者的方法，所述方法包含：
确定受试者中的ISM1水平；确定受试者中的GRP78蛋白水平；
确定受试者中的肺泡巨噬细胞(AM)水平；确定受试者中的炎症水平；或它们的组合；和
在以下情况下，将所述受试者识别为患有与肺部炎症相关的肺部疾病或病症，或者具有发展与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的风险：相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定受试者中的ISM1水平降低；相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定受试者中的GRP78蛋白水平增加；相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定受试者中的肺泡巨噬细胞(AM)水平升高；相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定受试者中的炎症水平升高；或它们的任何组合。
在上述方法的某些实施方式中，所述方法可以进一步包含进行一项或多项常规测定或技术以进一步确认或支持将所述受试者识别为患有与肺部炎症相关的肺部疾病或病症或者具有发展与肺部炎症相关的肺部疾病或病症相关的风险。在某些实施方式中，例如，可以使用血液总白细胞计数和/或分类计数。在某些实施方式中，例如，常规测定或技术可以包括测量肺功能的主要结果(FEV1/FVC、FRC、PEFR等)和/或用于生活质量(咳嗽、痰、呼吸急促、喘息等)和/或恶化次数的COPD患者(SGRQ-C)的圣乔治呼吸问卷。
在又另一实施方式中，本文提供了一种识别用于使用本文详述的治疗方法进行治疗的候选受试者的方法，所述方法包含：
确定所述受试者中的ISM1水平；确定所述受试者中的GRP78蛋白水平；确定所述受试者中的肺泡巨噬细胞(AM)水平；确定所述受试者中的炎症水平；或它们的任何组合；和
在以下情况下，将所述受试者识别为治疗候选受试者：相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定所述受试者中的ISM1水平降低；相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定所述受试者中的GRP78蛋白水平增加；相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，确定所述受试者中的肺泡巨噬细胞(AM)水平升高；相对于健康对照水平，或相对于低严重度疾病对照水平，所述受试者中的炎症水平升高；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，所述将受试者识别为患有如本文所述的与肺部炎症相关的肺部疾病或病症或者具有发展如本文所述的与肺部炎症相关的肺部疾病或病症的风险的方法，可以进一步包含步骤：治疗所识别的受试者的与肺部炎症相关的肺部疾病或病症。在某些实施方式中，治疗所识别的受试者的步骤可以包含使用本文详述的任何治疗方法来治疗所述受试者。
在某些实施方式中，所述识别使用本文详述的治疗方法进行治疗的候选受试者的方法可以进一步包含步骤：治疗所识别的受试者。在某些实施方式中，治疗所识别的受试者的步骤可以包含使用本文详述的任何治疗方法治疗所述受试者。
实施例
在下述实施例中，通过基因靶向方法从小鼠去除分泌的蛋白质ISM1，导致自发性肺部炎症和渐进性肺气肿，其特性类似于人类COPD。另外，去除ISM1导致针对脂多糖(LPS)-诱导的急性肺损伤(ALI)的增强炎症响应。此外，气管内补充(即局部向肺给药)外源性重组ISM1蛋白(rISM1)在小鼠中的ISM1-缺陷型肺和香烟烟雾诱导的COPD中抑制了肺部炎症表型。这些研究表明，ISM1可能通过诱导肺泡巨噬细胞凋亡而有助于消退炎症。这些结果表明，ISM1可能是肺部炎症的抑制剂和/或亲消退介导剂，并且可能在抑制和/或消退无菌性肺部炎症和/或由环境破坏(诸如香烟烟雾、感染和/或损伤)引发的炎症中发挥作用。因此，ISM1可能代表了肺部炎症性疾病诸如ALI和COPD的治疗剂和/或靶。
实施例1：Isthmin 1-保护肺部稳态和对COPD的治疗效果
慢性阻塞性肺疾病(COPD)目前是第三大死因。慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征在于由于肺气肿(肺泡壁破坏和肺泡扩大)和小气道的慢性阻塞性支气管炎引起的进行性且在很大程度上不可逆的气道阻塞1。肺泡巨噬细胞(AM)显著增加已经广泛地牵涉到COPD发病机制2。然而，业内对COPD的分子机制和病理生理学知之甚少，并且一直缺乏能够阻断或降低COPD进展的药物。
肺部炎症对于COPD发病机制和肺泡巨噬细胞(AM)是不可或缺的，最丰富的肺常驻免疫细胞是这种疾病的关键效应细胞。COPD患者的疾病严重程度与AM积累直接相关，特别是在发炎的外周气道和肺泡腔中(Finkelstein,Fraser et al.,1995)。这些观察得到了小鼠研究的认同，在靶向的AM耗竭(Ueno,Maeno et al.,2015)或敲除强效巨噬细胞弹性蛋白酶MMP-12(Hautamaki,Kobayashi et al.,1997)后，所述小鼠表现出对抗实验性COPD的完全防护。然而，许多COPD患者耐受皮质类固醇治疗，正在探索用于COPD治疗开发的一些抗炎药剂(Vogelmeier,Criner et al.,2017)。
在本项研究中，作为抗炎症药剂和在维持肺部稳态中，开发并研究了细胞外促凋亡蛋白ISTHMIN 1(ISM1)。rISM1被指定为COPD的治疗剂。在这些研究中，Ism1敲除(Ism1Δ/Δ)小鼠呈现增加的AM并且发展为自发性慢性肺部炎症，具有渐进性肺气肿。作为ISM1的高亲和力受体的细胞表面GRP78(csGRP78)主要存在于AM上并且其水平Ism1Δ/Δ和香烟烟雾(CS)诱导的COPD小鼠以及在人类COPD肺中被高度上调。在小鼠中的Ism1Δ/Δ和CS诱导的COPD肺，气管内递送重组ISM1(rISM1)耗尽的AM阻断了肺气肿进展并且恢复了肺功能。一贯地，COPD患者中的高ISM1表达与高AM凋亡水平和低AM数相关。例如，这些结果支持，ISM1可能是肺部稳态的保护剂并且可以在阻止COPD进展方面提供治疗益处。本文提供的数据表明，Isthmin 1可防止COPD。
下列研究表明，分泌蛋白Isthmin 1(ISM1)为一种抗炎蛋白，其可以通过细胞表面GRP78(csGRP78)受体诱导AM凋亡而发挥作用。结果表明，ISM1丧失导致Ism1Δ/Δ小鼠中AM累积和自发性肺气肿。本文的结果表明，csGRP78在Ism1Δ/Δ小鼠、香烟烟雾诱导的COPD小鼠和人类COPD肺的AM中被高度上调。在Ism1Δ/Δ和COPD小鼠中，气管内递送重组ISM1耗尽的AM阻断了肺气肿和肺功能下降。一贯地，人类COPD肺中的ISM1表达与增加的AM凋亡相关。因此，本文的结果表明ISM1为肺部稳态的保护剂并且支持通过靶向AM上的csGRP78对COPD的治疗用途。
肺不断暴露在外部环境中，内稳态对于限制免疫反应和炎症很重要。CS是COPD的主要危险因素，COPD目前是第三大死因，估计累积终生风险为25％3。尽管支气管扩张剂药物可以缓解患者的症状，但它们并不能减少COPD的进展或死亡率。
ISM1先前已被识别为一种分泌蛋白，其通过某些细胞诸如一些癌症细胞和激活的内皮细胞上的csGRP78和αvβ5整合素发挥作用，抑制小鼠的血管生成和实验性癌症4-7。
重组ISM1(rISM1)结合αvβ5整合素并且激活半胱天冬酶-8，或者结合csGRP78，在此处被内吞并运输到线粒体，抑制ATP产生并且触发凋亡。Ism1基因存在于从鱼类到人类的脊椎动物中(Osório,Wu et al.,2014,Xiang et al.,2011)；然而，Ism1的生理功能仍然未知。
本文描述的研究表明，ISM1可通过csGRP78-介导的凋亡调节AM数量，从而在维持小鼠肺部稳态中发挥关键作用。结果表明，rISM1的肺部递送可以通过凋亡诱导耗尽AM来有效地淬灭肺部炎症，在所研究的CS-诱导的COPD小鼠中导致肺气肿堵塞和肺功能恢复。相应地，人类COPD患者肺中的ISM1表达与增加的AM凋亡相关。这些结果表明，rISM1可以为COPD提供治疗方法，例如，靶向AM上的csGRP78以通过诱导AM凋亡并且阻断肺气肿中的肺组织损伤来抑制炎症。
Ism1Δ/Δ小鼠在环境空气下发展自发性肺气肿
在小鼠中，Ism1在胎儿和成人肺中均以最高水平表达，比其第二高表达器官(大脑)高出近30倍，并且远高于其他器官(Osório et al.,2014)。为了进一步研究Ism1的生理功能及作用，在两个不同的小鼠品系FVB/Ntac和C57BL/6J中使用CRISPR/Cas9方法生成了Ism1敲除(Ism1Δ/Δ)小鼠(图22的A–E)。在两种遗传背景下的Ism1Δ/Δ小鼠是有活力的，没有明显的形态异常或行为表型，尽管与Ism1+/Δ和野生型(WT)FVB/N小鼠相比产生更小的窝产仔数(数据未示出)。所有主要器官的组织病理学检查显示，Ism1Δ/Δ小鼠肺在两种遗传背景下均发展了自发性肺气肿(图1的A和图5的A–C)以及肺泡腔的进行性肿大，具有通过平均线性截距(MLI)量化的年龄(图1的B和图5的D)。在长达9个月龄的Ism1Δ/Δ小鼠的其他主要器官中未观察到明显的病理。这些结果表明，ISM1对鼠肺部稳态很重要，与肺中的最高表达一致。对于本文的后续研究，主要使用FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠。胶原蛋白和弹性蛋白的整装立体显微和荧光染料标记显示，Ism1Δ/Δ小鼠的肺中存在明显的空气截留(图1的C)和整体肺泡网络的恶化(图1的D)。使用修改的范霍夫-范吉森(VVG)染色剂以及破裂隔膜的检测，还可视化了Ism1Δ/Δ小鼠肺中肺泡弹性蛋白纤维的丧失(图5的E)。此外，Ism1+/Δ小鼠发展了轻度肺气肿，在野生型(WT)和Ism1Δ/Δ小鼠之间只有中等MLI(图1的E和F)，表明Ism1是小鼠中的单倍体不足基因。
为了确定ISM1的缺乏是否会损害肺生理机能，使用强制肺机动系统(Buxco)在2-月龄Ism1Δ/Δ小鼠上进行了一系列肺功能测试。Ism1Δ/Δ小鼠表现出增加的总肺容量(TLC)(图1的G)，与在COPD患者中观察到的高度肿胀肺同义(Gagnon,Guenette et al.,2014)。增加的体积隔室也示出了Ism1Δ/Δ小鼠肺的高度肿胀，诸如由于与肺气肿相关的弹性回位和空气滞留的丧失导致的功能余气量(FRC)(图1的H)和余气量(RV)(图1的I)。这些变化也反映在压力体积测量中，借此静态和动态顺应性(Cchord和Cdyn)在Ism1Δ/Δ小鼠中均增加(图1的J和K)。重要的是，Ism1Δ/Δ小鼠表现出较低的用力呼气量(FEV100)(图1的L)并且具有小于0.7的FEV100/FVC均值(相当于人类COPD中的FEV1/FVC指数)(图1的M,Ism1Δ/Δ:0.63±0.05)，0.7是常用于患者COPD诊断的标准(Singh et al.,2019)。Ism1Δ/Δ小鼠中增加的气道阻力(RI)可能归因于粘液分泌过多和气道壁炎症变化，包括气道上皮增生和增厚(图1的N、图5的F和G)(Barnes,2016)。总的来说，这些数据表明，Ism1Δ/Δ小鼠表现出的肺部病变与小鼠模型中的实验性肺气肿/COPD和人类COPD患者相似。
图5的L和M显示，Ism1Δ/Δ小鼠肺中增加的AM不是异常胚胎肺发育的结果。AM在胚胎发育过程中由胎肝单核细胞形成，其中胎肝单核细胞迁移到肺中并在围产期和产后期分化为AM。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是AM形成和分化的重要细胞因子。结果显示，当GM-CSF在发育中的肺中处于最高水平时，GM-CSF水平在产生P1和P7没有显著差异。因此，成年肺(8周龄)中较高数目的AM不是肺发育过程中AM形成改变的结果。图5的L和M示出了P1 FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中GM-CSF(红)和核(DAPI；蓝)的代表性免疫荧光染色(左)(n＝4只小鼠/组。P1 FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中以β-肌动蛋白作为加载对照的GM-CSF的蛋白质印迹(图5的M)和倍数变化(A.U.，任意单位)。n＝8-9只小鼠/组。数据为平均值±s.e.m.并通过未配对的双尾学生t检验进行分析)。
在成年小鼠肺(8-周龄)中，Ism1Δ/Δ小鼠拥有改变的细胞因子微环境。使用多重ELISA测定，发现在8周龄成年小鼠中，与WT肺相比，Ism1Δ/Δ肺拥有改变的细胞因子微环境。多种细胞因子上调超过1.5倍，包括GM-CSF、G-CSF、IL-1α、Rantes、MIP-1α、IL-2、IP-10和MCP-2(见图5的K)。图5的K示出了2-月龄FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺之间的相对细胞因子表达的热图(n＝3只WT小鼠和6只Ism1Δ/Δ小鼠)。
事实上，蛋白质印迹证实了与WT小鼠相比，具有更高水平的GM-CSF。这种更高的GM-CSF水平可能是由于Ism1Δ/Δ小鼠中的无菌性肺部炎症引起的。较高的GM-CSF水平可能刺激AM增殖，因此促成了Ism1Δ/Δ肺中更高数目的AM。图2的H示出了在2-月龄FVB/N WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺中，以β-肌动蛋白作为加载对照，GM-CSF的蛋白质印迹(左)和倍数变化(右；A.U.，任意单位)(n＝4只小鼠/组。数据为平均值±s.e.m.并通过未配对的双尾学生t检验进行分析。***P<0.001)。
肺气肿随着小鼠年龄的增长而逐渐恶化(图1)。这些症状与人类COPD患者类似。引人注目的是，肺气肿的严重程度也是ISM1剂量依赖性的，Ism1Δ/Δ小鼠呈现出比Ism1Δ/+小鼠更严重的肺气肿表型。似乎肺微环境中存在的ISM1对于肺部稳态和预防无菌性炎症(无感染或损伤的炎症)很重要。一贯地，在所有检查的器官中，成年小鼠肺中的ISM1表达水平最高，支持这种蛋白质在肺功能中的重要作用。
肺泡巨噬细胞累积驱动Ism1Δ/Δ肺中的肺气肿
Ism1Δ/Δ小鼠中的肺气肿伴随有肺泡腔中的AM的多焦点聚集体(图2的A)，并且支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞的离心细胞涂片和流式细胞术分析均确定，与WT小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠肺中的AM增加(图2的B–D)。显著地，来自Ism1Δ/Δ小鼠的AM展示出不同的形态，类似于COPD患者中描述的巨噬细胞亚群(Dewhurst,Lea et al.,2017)。通过全肺裂解液的蛋白质印迹分析检查已知的COPD相关蛋白酶和介质显示，与WT肺相比，Ism1Δ/Δ肺中的MMP-12、MMP-9和NF-κB p65水平增加(图2的E)。肺组织切片的免疫组化(IHC)染色显示了Ism1Δ/Δ小鼠的AM中的MMP-12和MMP-9表达增加(图2的F)，与肺气肿的其他小鼠模型和人类COPD病理一致(Woodruff,Koth et al.,2005)。另外，从Ism1Δ/Δ小鼠分离的初代AM显示NF-κBp65的核易位增加，表明了这些细胞中的NF-κB激活(图2的G)。此外，TGF-β1和VEGF-A在Ism1Δ/Δ小鼠的肺和AM中被中度上调(图5的H和I)，与COPD患者中的AM累积和基因表达模式一致(de Boer,van Schadewijk et al.,1998,Kranenburg,de Boer et al.,2005)。Ism1Δ/Δ肺还生产了更高水平的活性氧物种(ROS)(图5的J)。相比之下，与WT小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠肺中的中性粒细胞弹性蛋白酶和α-1-抗胰蛋白酶水平均未显示出任何变化(图5的H)。微阵列分析显示，Ism1Δ/Δ小鼠肺中的炎症性细胞因子上调，包括IL-1a、G-CSF、GM-CSF、MIP-1a、RANTES、IP-10和MCP-2(图5的K)。由于GM-CSF驱动AM发育(Guilliams,De Kleer et al.,2013)并且GM-CSF-过表达小鼠发展肺气肿和AM累积(Suzuki,McCarthy et al.,2020)，试图阐明GM-CSF在Ism1Δ/Δ小鼠中被组成型上调。P1小鼠肺的免疫染色和蛋白质印迹未显示出Ism1Δ/Δ和WT小鼠之间的GM-CSF表达差异(图5的L和M)。另外，1-月龄Ism1Δ/Δ小鼠肺中的MMP-12增加先于GM-CSF上调(图5的N)。因此，可以推测，2-月龄Ism1Δ/Δ小鼠肺中增加的GM-CSF(图2的H)反而是链接到肺气肿发作以及主要是由过度AM积累和激活造成的炎症。
图2的B和C示出了基于Ism1敲除小鼠(Ism1Δ/Δ小鼠)的作用机制研究的结果。基于支气管肺泡灌洗液(BALF)分析，小鼠肺中缺乏ISM1导致气道炎症和肺泡巨噬细胞(AM)增加。来自支气管肺泡灌洗液(BALF)的细胞的分析证实，与WT小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠肺的肺泡巨噬细胞(AM)增加(图2)。相比之下，在气道中未发现中性粒细胞浸润。值得注意的是，来自Ism1Δ/Δ小鼠的AM展示出不同的形态，类似于COPD患者中描述的巨噬细胞亚群(Dewhurst,Lea et al.,2017)。在BALF中还观察到显著增加的淋巴细胞，类似于全肺分析。如图2的B和C所示，BALF分析证明了Ism1Δ/Δ小鼠中的气道免疫细胞上调。示出了来自2-月龄WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺的支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞的Liu-染色的细胞离心涂片制剂(图2的B)和定量(图2的C)(n＝4只小鼠/组。数据为平均值±s.e.m.并且通过未配对的双尾学生t检验进行分析。*P<0.05，***P<0.001)。
先前报道了小鼠支气管和肺泡上皮中的ISM1表达(Osório et al.,2014,Venugopal,Chen et al.,2015)。此处，已经表明AM是ISM1的新来源(图2的I、图6的A和B)，尽管很明显并非所有的AM在健康肺中都以相似的水平组成性表达ISM1。值得注意的是，AM也对GRP78染色强烈，与WT小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠肺呈现更多具有不同周质GRP78的AM(图2的J)。先前已经在小鼠腹膜巨噬细胞(Misra,Gonzalez-Gronow et al.,2005)和人类单核细胞(Lu,Lai et al.,2010)上检测到了细胞表面GRP78(csGRP78)。使用重组ISM1(rISM1)处理初代AM以确定是否存在csGRP78以及其是否用作AM上的ISM1受体。观察到，rISM1结合非渗透的AM上的csGRP78(图6的C)并且与GRP78在细胞内共定位(图6的D)，导致AM凋亡(图2的K和图6的E)。类似地，在毒胡萝卜素(TG)预处理后，rISM1诱导永生小鼠AM细胞(MH-S)凋亡(图6的F)，毒胡萝卜素(TG)是一种已知促进GRP78易位到细胞表面的ER应激诱导剂(Li,Ni et al.,2008)。此外，抗-GRP78抗体中和有效地阻断了rISM1-诱导的凋亡(图6的G)。这些结果证明，rISM1-诱导的凋亡是通过AM上的csGRP78介导的。同时，与WT AM相比，从Ism1Δ/Δ小鼠分离的初代AM表现出减少的凋亡，增殖没有变化(图2的L和M)，表明缺乏内源性ISM1-介导的自分泌/旁分泌凋亡可能是Ism1Δ/Δ肺中AM累积的基础。Ism1Δ/Δ肺中增加的AM有助于蛋白酶-抗蛋白酶失衡，由此在环境空气下导致Ism1Δ/Δ小鼠中的自发性COPD。
图6的B中的结果表明，Ism1 mRNA在支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞中表达。事实上，使用小鼠肺组织切片的原位杂交显示，Ism1基因在支气管上皮细胞和一些AM中表达，与IHC数据一致。这也表明，显示ISM1在AM中表达的IHC数据是可靠的。
图6的C、F和G显示rISM1通过靶向csGRP78来诱导AM凋亡。rISM1与新分离的初代AM的细胞表面上的csGRP78相互作用，如共聚焦显微镜所展示的(图6的C)。这一数据支持rISM1靶向AM表面上的csGRP78以触发它们的凋亡。在图6的C中，示出了在1μM rISM1处理1小时后，rISM1(红)和GRP78(绿)共定位的初代AM的代表性共焦图像(核使用DAPI染色(蓝))。另外，当用诱导ER应激并上调csGRP78的毒胡萝卜素(TG)预处理细胞时，小鼠AM细胞系MH-S细胞经历ISM1诱导的凋亡。变性的ISM1(煮熟的)丧失了这种促凋亡活性，表明这种促凋亡活性是ISM1蛋白的功能。抗-GRP78抗体干扰了rISM1诱导的凋亡，支持ISM1靶向MH-SAM细胞表面上的csGRP78以触发凋亡。需要注意的是，较高浓度的抗-GRP78抗体本身可以导致细胞死亡，所以仅使用本身对细胞没有任何影响的浓度来阻断csGRP78和ISM1-诱导的凋亡。图6的F和G示出了50nM毒胡萝卜素(TG)预处理24小时以及1μM rISM1处理(左)与GRP78抗体中和(右)16小时后，小鼠AM细胞系MH-S细胞的凋亡定量。处理条件如所示。在三个平行孔中进行分析，并且每孔拍摄4个图像用于使用IncuCyte活细胞分析系统进行定量。
rISM1救援Ism1Δ/Δ和香烟烟雾诱导的COPD小鼠中的肺气肿
由于AM在小鼠中肺气肿/COPD的发病机制上发挥关键作用11,18,19，评估了外源供应的rISM1是否可以通过诱导/促进AM凋亡和/或抑制炎症来阻断Ism1Δ/Δ小鼠中肺气肿的发展/进展。rISM1每周两次气管内递送至1-月龄Ism1Δ/Δ小鼠，持续4周，并且与使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或脂质体-氯膦酸盐(一种确立的AM耗尽药剂)治疗的小鼠进行比较。免疫染色表明，rISM1被AM内在化并且诱导凋亡(图7的A和B)，显著地以剂量依赖性方式降低了AM数，与氯膦酸盐类似(图3的A)。rISM1和氯膦酸盐治疗的Ism1Δ/Δ小鼠肺均表现出肺气肿的显著下降(图3的B和C)。rISM1或氯膦酸盐对AM的耗尽可能有助于炎症消退后的肺泡再生，如两个治疗组中增加的增殖型2肺泡上皮细胞所证明的(图7的C和D)。更重要的是，肺功能测试表明rISM1和氯膦酸盐治疗的Ism1Δ/Δ小鼠中具有相当的气流恢复(图3的D)。总之，这些结果表明，过多的AM是Ism1Δ/Δ小鼠中自发性肺气肿和肺功能下降的核心。如图所示，肺部递送的rISM1可以通过AM耗尽来援救Ism1Δ/Δ肺气肿表型。
接下来，因为慢性AM炎症与肺组织损伤有关，因此评估了rISM1是否可以缓解小鼠中香烟烟雾(CS)-诱导的COPD。使WT BALB/cAnNTac小鼠经受2周和8周的室内空气(sham)或CS暴露并且气管内使用PBS或rISM1进行治疗(图3的E和F)。来自2周CS暴露小鼠的BALF细胞的细胞离心涂片分析显示，rISM1有效地抑制了炎症并且减少了AM和中性粒细胞数(图3的G)。8-周CS-暴露的小鼠的组织学分析呈现出靠近末端细支气管的肺气肿，伴有大量累积的主要包含AM的免疫细胞，类似于吸烟的COPD患者(图3的H和图7的E)。使用rISM1治疗的小鼠产生了更多凋亡的AM(图7的F)，从全肺裂解物中显著降低了AM(图3的I)和MMP-12水平(图3的J)。在rISM1治疗后也显著降低了中性粒细胞(图7的G)，可能是AM耗尽后趋化性降低的结果(Murugan&Peck,2009)。因此，肺部递送的rISM1通过AM耗尽有效地阻断了CS-诱导的COPD鼠中的肺气肿(图3的K)并且保留了肺功能(图3的L和图7的H至J)。
如图3所示，rISM1抑制了香烟烟雾(CS)诱导的急性肺部炎症。已知的是，CS通过诱导中性粒细胞和AM而在肺中诱导急性炎性。在小鼠中使用2周CS模型，气管内递送的rISM1有效地抑制了CS-诱导的肺部炎症响应，如总BALF细胞减少所示。AM和中性粒细胞均被抑制，而未影响淋巴细胞(图3的E、G)。这一结果与来自小鼠中8周慢性CS-诱导的肺气肿(COPD)模型的数据一致，其中气管内递送的rISM1有效地淬火了肺部炎症并且通过触发AM凋亡而减少了AM数。图3的E示出了WT BALB/c小鼠中2-周香烟烟雾-诱导的COPD模型的实验设计。以所指示的频率和间隔使用载体(CS+PBS)或rISM1(CS+10μg rISM1)治疗室内空气暴露的(Sham)、香烟烟雾暴露的(CS)(n＝5只小鼠/组)。图3的G示出了来自2-周香烟烟雾-诱导的COPD小鼠中实验组的支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞的定量(n＝4-5只小鼠/组)。
人类ISM1表达与肺泡巨噬细胞凋亡相关
由于Ism1Δ/Δ小鼠发展了自发性肺气肿并且外源供应的rISM1保留了小鼠免受CS-诱导的COPD发病机制的影响，假设人类肺中内源性ISM1水平的变化也可以影响COPD的发展。我们首先使用hISM1-过表达细胞验证了我们的抗体对人类ISM1(hISM1)的特异性(图8的A)，并且随后检查了来自60位COPD和18位非-COPD患者的肺组织切片中的hISM1表达(表A)。
表A：患者人口统计(1秒内用力呼气量(FEV1)，用力肺活量(FVC)。数据为平均值±s.e.m.)
Figure GDA0003337137240000721
Figure GDA0003337137240000731
与小鼠类似，hISM1也主要在AM中表达(图4的A和B)。然而，虽然小鼠的支气管上皮中也表达ISM1，特别是在CS暴露之后(图8的B)，但在COPD或非-COPD人类肺中的支气管上皮均未检测到hISM1(图8的C)。然后，通过AM中的IHC染色强度和hISM1表达频率的评分对hISM1表达进行了分级(图4的A–C)。在hISM1表达与吸烟者之间发现了正相关性(图4的D和E)，同时在当前吸烟者中观察到了比戒烟者更高的hISM1表达(图8的D)。这些发现与ISM1在特别是CS暴露后的小鼠AM中被大幅上调一致(图8的E)，而ISM1染色仍然无法检测到其他免疫细胞诸如多形核白细胞和淋巴细胞(图8的F)。重要的是，hISM 1表达与AM凋亡显著正相关，而与吸烟状况无关(图4的F，图23的A和B)。值得注意的是，与非-COPD患者相比，COPD患者的AM上的csGRP78被上调(图4的G)，使得AM能够为ISM1-csGRP78介导的免疫做好准备。事实上，与具有相似hISM1表达的非-COPD患者相比，在COPD患者中观察到了更多凋亡的AM(图4的H)，并且在COPD患者和CS-暴露的小鼠中只有csGRP78-阳性AM凋亡(图23的C和D)。
基于这些结果，假设生理ISM1可能通过csGRP78调节AM凋亡而维持成年肺部稳态很重要。ISM1丧失可以导致来自减弱的凋亡的AM积累，由此甚至在环境空气下确保Ism1Δ/Δ小鼠中的肺部炎症和肺气肿(图24)。
图4的E、F和H显示，人类COPD肺和非-COPD肺中的ISM1表达与香烟烟雾和AM凋亡相关。使用来自60位COPD和18位非-COPD人类肺组织样品的免疫组织化学(IHC)的ISM1表达分析显示，人类ISM1(hISM1)蛋白的表达水平与香烟烟雾相关，吸烟者显示了更高的ISM1表达(图4的E)。此外，AM凋亡的水平与肺组织中的hISM1水平相关，肺中更高的hISM1水平呈现出更高的AM凋亡(图4的F)。在COPD和非-COPD肺中，更高的hISM1水平呈现出更高的AM凋亡(图4的H)。的确是，图4的E、F和H示出了COPD和非-COPD肺中的hISM1表达。示出了(图4的E)吸烟状况与hISM1之间以及(图4的F)hISM1表达与AM凋亡之间的相关性。图上描绘了患者样本大小。通过点二列相关(图4的E)和皮尔逊相关(图4的F)分析了数据。通过COPD状态和hISM1表达分层的非-COPD和COPD患者中凋亡AM的百分比。图上描绘了患者样本大小(数据为平均值±s.e.m.并通过单因素ANOVA与杜克的事后检验进行分析。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。
不希望被理论束缚，图24提供了ISM1调节AM凋亡和肺部稳态的提议机制。在图24(左)中，自分泌/旁分泌ISM1特异性地靶向具有高csGRP78的AM并且诱导凋亡。AM数保持受到控制，炎症得到调节并且肺部稳态得以维持。在图24(右)中，无/低ISM1导致肺泡腔中AM累积以及肺气肿发作，肺功能逐渐下降。
如所讨论的，慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球第三大死因，吸烟、长期暴露于环境污染和衰老是主要危险因素。其主要特征是由于肺气肿(破坏肺泡壁)、小气道的慢性阻塞性支气管炎(气道炎症)导致的空气流的不可逆阻塞。患者出现反复出现的呼吸道症状，诸如咳嗽和呼吸困难。另外，运动不耐受导致COPD患者的肌肉无力和肌肉减少症。目前的治疗方法主要是支气管扩张剂，只能缓解症状，并且没有药物可以阻断疾病进展。在本文所述的研究中，使用遗传和病理小鼠模型，结果显示促凋亡ISTHMIN 1(ISM1)蛋白是肺组织内稳态的保护剂。ISM1的丧失导致由于肺泡巨噬细胞(AM)累积引起的自发性COPD。在小鼠和人类肺中，AM同时表达ISM1及其高亲和力受体csGRP78，由此使得能够自调节凋亡。在香烟烟雾诱导的COPD小鼠中，局部肺递送的重组ISM1(rISM1)减少了AM数，抑制了炎症并且保留了肺功能。另外，肺中的人类ISM1表达显著与AM凋亡正相关。
本文所述的结果将ISM1识别为抗炎蛋白，其保护正常的肺功能并且阻断CS-诱导的COPD发展。不希望被理论束缚，这项工作支持使用rISM1作为通过靶向病理性AM上的csGRP78以猝灭肺部炎症的蛋白质治疗剂。结果表明，ISM1-csGRP78介导的AM靶向可以在例如AM起病理性作用的广泛炎症性肺部疾病中提供治疗策略。
巨噬细胞清除已被证明主要是通过炎症消退期间的局部凋亡来介导的26，并且AM凋亡在消退感染相关的急性肺部炎症中很重要27-29。AM是COPD发病机制和肺恶化的基础2,20,25，并且众所周知地耐受凋亡23和皮质类固醇治疗30。本文的发现显示，自分泌/旁分机制通过促凋亡蛋白ISM1控制AM数并维持肺部稳态。ISM1靶向AM上的csGRP78以诱导凋亡并且限制肺部炎症，而丧失ISM1导致Ism1Δ/Δ小鼠中的AM累积和自发性肺气肿(图24的B)。顺便提及，AM累积与吸烟者中的肺气肿发展相关2。气管内滴注rISM1防止了AM在CS-暴露的小鼠中累积并且有效阻断了COPD进展，与之前证明AM耗尽的功效的小鼠研究一致18,19。一致地，高hISM1-表达患者呈现出更多的AM凋亡，更低的AM数和更低的严重COPD频率。COPD患者中hISM1表达的不均匀性可能为COPD患者的早期干预提供更好的见解。目前的发现强调了受调节的AM凋亡在维持肺部稳态中的重要作用，并且确定了ISM1在肺部稳态中作为炎症抑制剂的保护作用。例如，rISM1可以通过猝灭AM-驱动的肺部炎症来阻止COPD进展。
COPD是一种日益严重的全球流行病，具有巨大的社会经济负担，但没有任何有效的药物来阻断疾病进展和/或恢复肺功能。本文描述的研究证明，分泌的50kDa蛋白ISM1是一种抗炎蛋白，在小鼠中可以有效地猝灭肺部炎症并阻止CS-诱导的COPD进展。局部肺部递送的rISM1经由其高亲和力受体csGRP78特异性地靶向AM以使其凋亡。
AM构成超过95％的肺免疫细胞，是COPD的主要炎症协调者，同时对凋亡有抵抗力，因此即使在戒烟后也会导致慢性肺部炎症(Barnes,2016,
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Maskey-Warzechowska et al.,2003,Kojima,Araya et al.,2013)。气管内递送的rISM1在CS-诱导的COPD小鼠中有效地阻断了AM累积并防止了肺功能下降，与先前证明AM耗尽在肺气肿预防中的功能的小鼠研究一致。因此，例如，本文描述的结果支持rISM1作为COPD的治疗剂以阻断疾病进展和/或维持肺功能。通过诱导AM凋亡，可以预期的是，rISM1不仅可以阻碍AM分泌的蛋白酶诸如MMP-12引起的直接蛋白水解损伤，而且还可以防止MMP-12驱动的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相关的内皮细胞活化、中性粒细胞趋化性和进一步的巨噬细胞活化，前述活化是一种估计占CS-诱导的肺损伤高达70％的过程(Churg,Wang et al.,2004)。因此，AM是并且应该继续作为新型抗炎COPD疗法的重要靶点。然而，AM已知对类固醇无响应(Barnes,2013a)并且在小鼠模型和人类临床试验之间的差可译性在靶向离散促炎分子方面仍然是COPD药物开发的主要挑战(Barnes,2013b)。在这种情况下，rISM1具有明显的优势，因为它能够特异性靶向AM上的csGRP78。顺便提及，COPD中的病理性AM含有高水平的csGRP78(图4的G)，使它们成为rISM1介导的凋亡的理想候选物。因此，rISM1可以有效抑制AM炎症，并同时扼杀多种促炎因子。不希望受理论束缚，可以预期的是，rISM1可以诱导促炎AM凋亡而不损伤不表达csGRP78的免疫抑制性间质巨噬细胞(Quesada Calvo,Fillet et al.,2011)，因此允许它们在肺中执行稳态功能。
在这项工作中，结果揭示了ISM1在维持肺部稳态方面的新型生理功能，与相比于其他器官在小鼠肺中的表达水平最高一致。结果显示，小鼠中丧失ISM1导致在环境空气下的自发性肺气肿发展，并伴有肺泡腔中的过量AM累积。结果表明，除了先前报道的支气管上皮细胞和内皮细胞之外，AM是小鼠肺中ISM1的新来源。另外，在正常小鼠肺中，AM以异质水平同时表达ISM1及其高亲和力细胞表面受体GRP78(图2的I和J)。ISM1可以特异地靶向具有高水平csGRP78的细胞以进行凋亡(Chen et al.,2014)。本文描述的结果支持这样的模型，其中ISM1选择性地靶向具有高csGRP78的AM以进行凋亡，而不具有/具有低csGRP78的AM完好无损，由此控制用于肺部稳态的AM数(图24)。从Ism1Δ/Δ小鼠新分离的AM与来自WT小鼠的AM相比表现出更低的凋亡水平，表明了鼠肺中内源性ISM1对AM凋亡的自分泌/旁分泌调节。气管内递送的rISM1在Ism1Δ/Δ小鼠中耗尽了AM并且救援了肺气肿，类似于氯膦酸盐治疗。来自Ism1Δ/Δ的这些结果证明，即使没有环境攻击的情况下，由失调凋亡引起的AM积累对于肺气肿发展至关重要且足够，与AM作为COPD发病机制的主要协调者一些。
ISM1在肺部稳态中的关键作用在哺乳动物中是独一无二的，因为先前在低等脊椎动物中的Ism1功能丧失研究导致了对比表型，诸如非洲爪蟾中的颅面缺陷(Lansdon,Darbro et al.,2018)和斑马鱼中伴随造血功能改变的血管生成缺陷(Berrun,Harris etal.,2018,Xiang et al.,2011)。ISM1的高度分化且本质上无序的N-末端区域可能有助于不同物种的不同生物学功能(Babu,2016)。另一方面，小鼠和人类ISM1之间的高序列相似性(93.5％同一性)表明，ISM1在这些物种之间具有保守的功能(Joshi&Xu,2007)。
这项工作的结果揭示了内源性ISM1和csGRP78之间在诱导AM凋亡和维持肺部稳态方面的自分泌/旁分泌信号轴。局部巨噬细胞凋亡和清除有助于炎症消退(Hamidzadeh,Christensen et al.,2017)并且这在早期动脉粥样硬化(Arai,Shelton et al.,2005)、实验性腹膜炎(Gautier,Ivanov et al.,2013)和感染相关的急性肺部炎症(Aberdein,Coleet al.,2013)中已有描述。小鼠和人类的COPD肺中ISM1的上调可能是生物响应地，类似于在多种肺部疾病中被上调并且可以经由自分泌信号诱导AM凋亡的多效性TNF-α和I型干扰素(Wei,Sun et al.,2006,Xaus,Comalada et al.,2000)。的确，hISM1表达与AM凋亡强相关，还观察至其在COPD患者中升高(图4)。
尽管之前的全基因组关联研究(GWAS)尚未将Ism1基因座与COPD相关联，但了解hISM1表达在较大COPD患者群体中的异质性以揭示对Ism1及其调控基因的潜在表观遗传或遗传影响将是有意义的。此外，hISM1表达是否与导致COPD高死亡率的多种合并症有任何相关性是令人感兴趣的。
应当注意的是，已经报道在肺内皮和气道上皮细胞上存在αvβ5整合素(ISM1的低亲和力受体)(Teoh,Tan et al.,2015)。然而，当气管内递送rISM1时，我们在小鼠中未观察到这些细胞的任何明显靶向(图7)，本来由于这些肺结构细胞的示期望凋亡，这会加重肺气肿。因此，rISM1治疗在Ism1Δ/Δ小鼠中缓解了肺气肿并改善了肺功能。
rISM1(～50kDa)的相对大尺寸表明，ISM1不会从肺中迅速清除并吸收到血流中(Labiris&Dolovich,2003,Patton,Fishburn et al.,2004)。在各种临床试验中出现了用于局部肺递送的蛋白质疗法雾化的重大进展。例如，已针对α-1抗胰蛋白酶缺乏和囊性纤维化进行了α-1抗胰蛋白酶(52kDa)作为吸入治疗剂的多期II/III临床试验(Bodier-Montagutelli,Mayor et al.,2018)。在某些实施方式中，例如，由于与α-1抗胰蛋白酶的同等尺寸，ISM1可以与经由雾化的肺部递送一起使用。
总之，本文描述的结果强调了AM凋亡调节在维持肺部稳态中的关键作用以及ISM1在生理和病理条件下在此功能中发挥的重要作用。结果支持Ism1作为与肺气肿/COPD发病机制和AM凋亡相关的新型基因，并且证明rISM1在小鼠的慢性CS-诱导的COPD中衰减了肺气肿、抑制炎症并且保留了肺功能。结果表明，rISM1可通过特异性靶向AM上的csGRP78而用于治疗COPD，AM是COPD的主要病理免疫细胞。可以预期的是，本文描述的发现也可能暗示了由AM驱动或促成的广泛呼吸系统病症，诸如肺缺血再灌注损伤(Naidu,Krishnadasan etal.,2003)、急性肺损伤(Dagvadorj,Shimada et al.,2015)、肺纤维化(Misharin,Morales-Nebreda et al.,2017)和哮喘(Nabe,Matsuda et al.,2018)。在某些实施方式中，其他非-癌症疾病，诸如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(Lu et al.,2010,Weber,Haslbeck et al.,2010)，中的csGRP78病理表达也可为rISM1调节炎症提供治疗机会。
已经通过实施例描述了一个或多个说明性实施方式。本领域技术人员可以理解的是，在不脱离权利要求限定的本发明范围的情况下，可以做出许多变化和修改。
方法
研究设计。本研究的主要目的是在两种遗传背景下(FVB/Ntac和C57BL/6J小鼠)使用内部生成的CRISPR/Cas9-介导的Ism1敲除来确定哺乳动物Ism1的生理功能。表型表征和救援实验的样本量保持在每组至少三只动物以进行统计分析，并且每个实验的相应图和图例中示出了n数字。将年龄和性别匹配的小鼠随机分配到实验组中，并且没有异常值被排除动物研究之外。Ism1Δ/Δ小鼠的救援实验重复两次并且分别分析肺功能参数和组织学。救援慢性CS-诱导的COPD小鼠实验进行一次，测量肺功能参数并固定左肺叶用于组织学分析，并且将右肺叶均质化用于生化分析。所有小鼠实验的免疫细胞定量均以盲法进行。将去识别化的人类肺样品用于免疫细胞定量、染色和hISM1表达分级。在人类群组研究中未排除数据。
小鼠。所有动物实验均按照新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行(IACUC协议BR15-1100和R18-0588)。野生型小鼠(FVB/Ntac、C57BL/6J和BALB/cAnNTac；6至8周龄)购自InVivos Pte Ltd,Singapore。Ism1Δ/Δ小鼠(FVB/Ntac和C57BL/6J)是使用重组Cas9原核显微注射法以及靶向Ism1外显子1的5’-CTGCACATCACGGTTCTGCGCGG-3’(gRNA1，SEQ ID NO:5带下划线的PAM序列)和5’-GCGGATCCGGAGCCTCCGACCGG-3’(gRNA2，SEQ ID NO:6带下划线的PAM序列)的导向RNA内部生成的。通过基因分型引物对P1(5’-CAGCTCCTGGGATTGCTCCG-3’)(SEQ ID NO:7)和P2(5’-CCTTCTGCAATGTACCAAGCTCT-3’)(SEQ ID NO:8)(对于FVB/NTac)以及5’-cgcgcgactcaagaggatgg-3’(SEQ ID NO:22)和5’-actgggacccgctgacgttg-3’(SEQ ID NO:23)(对于C57BL/6J)和测序识别Ism1Δ/Δ小鼠的杂交后代，之后进行选择用于随后的繁殖和集落维持(IACUC协议BR15-1100)。将所有小鼠安置在标准的12小时光暗循环下，随意提供食物和水。在进行所有气管滴注之前，使用异氟醚将小鼠麻醉。
细胞。MH-S(CRL-2019TM)购自ATCC，并且在补充有10％热灭活的FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-140培养基中进行培养。按描述从2-月龄野生型和Ism1Δ/ΔFVB/NTac小鼠收获初代肺泡巨噬细胞(Chavez-Santoscoy,Huntimer et al.,2012)，并且在补充有10％热灭活的FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-140培养基中进行培养。将细胞保持在37℃下在5％CO2培养箱中。按描述从2-月龄野生型和Ism1Δ/ΔFVB/NTac小鼠收获原代肺泡巨噬细胞32，并且在补充有10％热灭活的FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中培养。将原代肺泡巨噬细胞保持在37℃下在5％CO2培养箱中。
试剂。用于蛋白质印迹的初级抗体：抗-MMP-12(ab52897,Abcam)，抗-MMP-9(ab38898,Abcam)，抗-p65(10745-1-AP,Proteintech)，抗-β-肌动蛋白抗体(C4,SantaCruz Biotechnology)，抗-TGF-β1(V,Santa Cruz Biotechnology)，抗-VEGF-A(A-20,Santa Cruz Biotechnology)，抗-中性粒细胞弹性蛋白酶(ab68672,Abcam)，抗-Α-1-抗胰蛋白酶(16382-1-AP,Proteintech)。用于免疫组织化学的初级抗体：抗-MMP-12(ab66157,Abcam)，抗-MMP-9(ab38898,Abcam)，抗-TGF-β1(V,Santa Cruz Biotechnology)，抗-VEGF-A(A-20,Santa Cruz Biotechnology)，抗-ISM1(对于小鼠肺：E-20,Santa CruzBiotechnology；对于人类肺：定制抗体3M8,AbMart)，抗-GRP78(A-10,Santa CruzBiotechnology)，抗-His-探针(H-15,Santa Cruz Biotechnology)，抗-裂解的半胱天冬酶-3(Asp175,Cell Signaling Technology)。用于免疫荧光的初级抗体：抗-ISM1(E-20,Santa Cruz Biotechnology)，抗-p65(10745-1-AP,Proteintech)，抗-CD68(M-20,SantaCruz Biotechnology)，抗-His-探针(H-15,Santa Cruz Biotechnology)，抗-GRP78(A-10,Santa Cruz Biotechnology)，抗-裂解的半胱天冬酶-3(Asp175,Cell SignalingTechnology)，抗-SP-C(FL-197,Santa Cruz Biotechnology)，抗-PCNA(PC10,Santa CruzBiotechnology)，抗-GRP78(A-10,Santa Cruz Biotechnology)，中性粒细胞标志物(NIMP-R14,Santa Cruz Biotechnology)。使用OxiSelectTM体外ROS/RNS测定(STA-347,CellBiolabs)根据制造商的协议测量活性氧物种。使用用于微滴板的Click-iTTMEdU增殖测定(Invitrogen,C10499)根据制造商的协议测量细胞增殖。按先前描述生产重组ISM1(rISM1)(Xiang et al.,2011)。脂质体包裹的氯膦酸盐购自Liposoma。
使用载体pET-M在大肠杆菌中表达小鼠rISM(成熟形式，无信号肽)并且纯化为6xHis-标记的蛋白质(如Xiang et al.,2011,JCMM所述，通过引用以其整体并入本文)。这些实验中使用小鼠rISM1。成熟的ISM1(无信号肽)在测试条件下具有生物活性。使用的ISM1序列包含NP_001263418.1，并且如下：
Figure GDA0003337137240000811
(SEQ ID NO:9；下划线表示天然ISM1序列，粗体表示载体序列和His标签，斜体表示N-末端M残基)
脂质体包裹的氯膦酸盐购自Liposoma。
肺组织学和成像。将来自各实验的小鼠肺充气并且在10％中性缓冲福尔马林中固定，石蜡包埋并且切片成5μm厚度。在染色之前，在
Figure GDA0003337137240000812
清净剂(Sigma-Aldrich)中将小鼠和人类肺切片脱蜡，用乙醇和PBS连续稀释。由兽医病理学家进行FVB/NTac WT和Ism1Δ/Δ小鼠中肺气肿的组织学和病理评分。病理评分：0＝不存在；1＝最小(>1％)；2＝轻微(1–25％)；3＝中度(26–50％)；4＝中度严重/高度(61–75％)；和5＝严重/高(76–100％)。如描述进行平均线性截距(MLI)的定量34(Knudsen,Weibel et al.,2010)。使用ImageJ软件(NIH)进行支气管上皮细胞计数和测量的定量。为了免疫荧光和免疫组织化学染色，在脱蜡合，通过在柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠，0.05％Tween 20，pH 6.0)中加压蒸煮对肺切片进行抗原修复。将载玻片冷却至室温并用PBS冲洗，然后用PBS中的3％BSA封闭1小时。对用于免疫组织化学的肺切片进行附加30分钟3％过氧化氢猝灭。然后在室温下在加湿室中使用相应的初级抗体将肺切片温育过夜，使用0.1％PBST洗涤三次以去除未结合的抗体，使用相应的二级抗体在室温下温育1小时并且再次使用0.1％PBST洗涤三次。在安装盖玻片之前使用DAPI将免疫荧光染色的载玻片复染，同时在液体DAB+显色底物(Dako)中将免疫组织化学染色的载玻片温育5至15分钟，然后用苏木精复染并且安装盖玻片。使用过碘酸-希夫(87007,Thermo Fisher)和弹性蛋白染色试剂盒(ab150667,Abcam)根据制造商的协议进行肺切片染色。使用Zeiss Axiovert 200和Zeiss LSM-510Meta共聚焦显微镜采集图像，使用ImageJ软件(NIH)分析和调整亮度和对比度。
BALF免疫细胞定量。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并且通过流式细胞术使用标准程序对细胞进行分析。图25示出了用于选择AM的门控策略。
凋亡确定。使用IncuCyte ZOOM活细胞成像系统(Essen Bioscience)测量凋亡。以50,000个细胞每96-孔的密度接种MH-S细胞或被代肺泡巨噬细胞，并且使用IncuCyte半胱天冬酶-3/7绿凋亡检测试剂(Cat.No.4440,Essen Bioscience)根据制造商的指示每小时测量一次凋亡。在补充有1％热灭活的FBS的RPMI-140培养基中使用50nM毒胡萝卜素(Sigma-Aldrich)将MH-S细胞预处理25小时，然后在相同的培养条件下，在具有和不具有抗-GRP78(A-10,Santa Cruz Biotechnology)抗体中和的情况下使用1μM rISM1处理16小时。在三个平行孔中进行处理，并且每孔拍摄4个图像以用于定量。在相同的培养条件下使用1μM rISM1将原代肺泡巨噬细胞处理16小时。在四个平行孔中进行实验组，并且每孔采集4个独立视野用于定量。
肺功能测试。如先前描述在FVB/NTac野生型和Ism1Δ/Δ小鼠以及实验COPD WTBalb/cAnNTac小鼠上进行肺活量测定35(Peh,Tan et al.,2017)。简言之，使用氯胺酮(75mg/kg)和美托咪定(1mg/kg)混合物将小鼠麻醉并且将气管切开。将小鼠插管并放置在与计算机控制的呼吸机(强制肺机动系统,Buxco Research System)相连的全身体积描记器中。使用FinePointeTM数据采集和分析软件(Buxco)记录总肺活量(TLC)、功能余气量(FRC)、余气量(RV)、静态顺应性(Cchord)、动态顺应性(Cdyn)、100ms时的用力呼气量(FEV100)、Tiffeneau–Pinelli指数(FEV100/FVC)和气道阻力(RI)。使用压力-容积图下的面积计算呼吸功。
肺整装成像。通过胸廓切开术从6-月龄FVB/NTac野生型和Ism1Δ/Δ小鼠收获小鼠肺，并且保持在冷PBS中直至在成像或处理。使用Olympus MXV10 Macro Zoom在1.26x放大倍率下采集外周左肺叶的图像。对于肺弹性蛋白和胶原蛋白的免疫荧光染色，在补充有1％热灭活的FBS、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和1μM Col-F荧光探针(Immunochemistry Technologies)的DMEM中，在4℃轻轻摇动将各收获的肺温育过夜。之后，使用三遍PBS将肺彻底清洗并且使用Olympus MXV10 Macro Zoom在5x放大倍率下以荧光激发拍摄外周肺叶的图像。使用ImageJ软件(NIH)调整图像的亮度和对比度。
FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠中的肺气肿救援。向4-周龄雌性FVB/NTac Ism1Δ/Δ小鼠气管内给予50μl PBS、1μg或5μg在50μl PBS中的rISM1、或350μg在50μl PBS中的脂质体包裹的氯膦酸盐，每周两次，持续4周。在治疗的最后一天的24小时之后记录肺功能测试，并且将肺固定用于组织学分析。
香烟烟雾-诱导的COPD小鼠模型。如先前描述使8-周龄雌性Balb/cAnNTac小鼠经历8-周慢性香烟烟雾暴露35(Peh et al.,2017)。简言之，以三支3R4F参考卷烟的频率(University of Kentucky,Lexington)，每2小时一次，每天总共九支烟，使小鼠全身暴露于4％香烟烟雾中。这种吸烟制度每周连续进行5天，共8周。将Sham小鼠旋转在单独的通风室中并且暴露于相同的室内空气中。在前4周的香烟烟雾暴露后，对于附加4周，相应治疗组给予50μl PBS或10μg在50μl PBS中的rISM1。在每周的第1、3和5天，在最后一轮每日香烟烟雾暴露后，气管内滴注PBS和rISM1治疗。在最后一天香烟烟雾暴露后的24小时，记载肺功能测试，并且将肺固定用于组织学分析。
急性香烟烟雾诱导的肺部炎症小鼠模型。如上所述，使8-周龄雌性Balb/cAnNTac小鼠经历2周慢性香烟烟雾暴露。以与上述类似的方式，在第2周香烟烟雾期间，在最后一轮每日香烟烟雾暴露后气管内滴注PBS和rISM1治疗，连续五天。
人类肺组织。人类样本的使用得到了新加坡国立大学机构审查委员会的批准(NUS-IRB参考号No.N-18-057E)。福尔马林固定和石蜡包埋的去识别肺切片由肺组织研究联盟(Lung Tissue Research Consortium)(LTRC)、国家心肺血液研究所(NationalHeart,Lung,and Blood Institute)(NHLBI)、美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)(NIH)提供。基于患有临床诊断的肺气肿以及支气管扩张剂后/前肺活量测定标准FEV1/FVC<0.7和FEV％预测≤80来选择COPD患者。基于支气管扩张剂后/前肺活量测定标准FEV1/FVC≥0.7和FEV％预测≥80识别非-COPD患者。提供了患者吸烟史和状态。由两个独立的研究人员对非-COPD和COPD患者的hISM1表达进行盲分级。每个人类肺切片选择六至十个随机视野。
统计分析。使用Prism(Graphpad)软件进行统计分析。使用未配对的双尾学生t检验进行两组之间的比较，并且使用单因素ANOVA与杜克事后检验进行多组比较。分别使用点二列和皮尔逊相关确定hISM1表达与吸烟或AM凋亡之间的相关性。结果示出了平均值±s.e.m.并且在图或图例中相应地示出了各个实验的样本大小。P值<0.05被认为是显著的。图例中相应地示出了额外注释。
实施例2：Isthmin 1抑制脂多糖-诱导的急性肺损伤和肺部炎症
Isthmin 1(ISM1)在小鼠肺中在支气管和肺泡上皮细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞和NKT细胞中高度表达。响应于气管内脂多糖(LPS)滴注，ISM1在肺中被上调(Venugopal etal 2015,Cardiovas.Res.)。在本项研究中，在FVB/N和C57BL/6J背景下使用Ism1敲除小鼠(Ism1Δ/Δ)，我们的结果证明，ISM1缺乏在小鼠肺中导致轻微的无菌性炎症。在呼吸LPS挑战后，与野生型小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠表现出增大的肺炎症响应，其特征在于增加的白细胞募集，包括中性粒细胞、巨噬细胞、T和B细胞。尽管先天免疫细胞在LPS损伤后第7天消退到基线水平，但Ism1Δ/Δ小鼠在第9天呈现出升高的肺纤维化，伴有增加的肌成纤维细胞、过多的胶原蛋白累积和TGF-β上调。气管内滴注的重组ISM1(rISM1)可以抑制肺中LPS-诱导的炎症。这些结果揭示了ISM1在保护肺免受过度炎症响应的影响以及在LPS触发的ALI后促进受伤的肺恢复内稳态方面的治疗益处。
在传染性或非传染性呼吸道侵害后，宿主在肺中产生急性炎症响应以进行自我保护。健康宿主也有办法限制这种肺部炎症，最终消退炎症以防止周围组织的附带损伤。在多种肺部疾病中观察到了普遍的急性肺部炎症，包括急性肺损伤(ALI)及其更严重的表现、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。这些是严重的临床综合征，在没有有效药物治疗的情况下，死亡率高达50％36。ALI的特征在于血管通透性增加、炎症细胞浸润(主要是中性粒细胞)、浸润的白细胞以及肺实质细胞释放促炎介质37。
LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的糖脂成分，可在小鼠和人类中引起严重的炎症效应。小鼠内的短期鼻内LPS挑战通常会刺激气道和肺中的混合炎症反应。这包括破坏肺内皮和上皮屏障，增加炎症细胞浸润以及释放促炎和细胞毒性介质38-40。这些表型与ALI和ARDS具有临床相关性。在LPS挑战时启动多个细胞内信号事件。大多数LPS与Toll样受体4(TLR-4)复合物结合并发出信号以激活核因子κB(NF-κB)41-43。活化的NF-κB易位进入细胞核并通过直接结合其增强子/启动子区域中的共有靶序列，刺激许多促炎细胞因子的转录，包括白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)44,45。重要的是，NF-κB在ARDS患者的肺泡巨噬细胞具有活性46，暗示NF-κB信号参与了ALI和ARDS的发展和进展。
ISM1首先被确定为一种分泌抗血管生成和促凋亡蛋白，并且还在血管通透性诱导中进行了研究47,48,49。全身输注针对78kDa的葡萄糖调节蛋白(GRP78)(为ISM1的高亲和力受体)的抗体，减弱了由LPS诱导的肺通透性过高49。
在本项研究中，使用Ism1敲除小鼠(Ism1Δ/Δ)调查了ISM1在LPS-诱导的急性肺部炎症中的作用。数据支持ISM1是一种炎症抑制剂，保护肺免受在无菌性肺中以及LPS-诱导的ALI期间过度炎症响应的影响。肺中ISM1的存在也促进了肺在急性损伤后恢复内稳态。
ISM1缺乏在无菌条件下导致肺中白细胞浸润增加
使用CRISPR/Cas9基因编辑方法，产生了Ism1敲除(Ism1Δ/Δ)C57BL/6J小鼠(图17)。在环境空气下，Ism1Δ/Δ小鼠在肺中表现出自发性炎症。8-周龄敲除小鼠的冠状肺切片的组织学检查揭示了多灶性的非分界的炎性细胞簇，包括肺泡巨噬细胞、多形核细胞和淋巴细胞(图9的A)。全肺单细胞匀浆的差异免疫细胞计数以及免疫组织化学(IHC)染色表明，总白细胞、巨噬细胞和中性粒细胞显著增加(图9的B-E)。在所述敲除小鼠中也观察到肺泡壁增生的焦点区域和肺气肿(图9的A和C)。同时，Ism1Δ/Δ小鼠的外周血分析也显示，与野生型小鼠相比，白细胞总数显著增加。在白细胞亚群中，Ism1Δ/Δ小鼠中淋巴细胞和中性粒细胞数量明显更高，而其他细胞类型在敲除和野生型小鼠中保持较低(图9的F)。
图17示出了Ism1-/-(Ism1Δ/Δ)小鼠的生成细节。图17的A示出了经由导向RNA对gRNA1和gRNA3而靶向Ism1的CRISPR/Cas9示意图。P1和P2表示用于T7E1测定和基因分型的引物。图17的B示出了Ism1Δ/Δ敲除系的DNA序列，显示了23bp缺失，其导致过早终止密码子且未产生ISM1蛋白。图17的C示出了C56BL/6J WT、Ism1+/Δ和Ism1Δ/Δ的RT-PCR的凝胶图像。参见图17的D，示出了C57BL/6J WT和Ism1Δ/Δ小鼠肺切片中ISM1(棕)和核(苏木精，蓝)的代表性免疫组织化学染色。Br,细运气管；Al,肺泡。比例尺20μm。
ISM1缺乏在肺中导致对LPS的急性免疫响应增强
为了检查ISM1在急性肺部炎症中的作用，向Ism1Δ/Δ和野生型小鼠的肺中气管内滴注2mg/kg LPS。两组小鼠均存活并产生了对LPS的急性炎症响应。与野生型小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠在7天急性响应期内显示出总肺白细胞显著增加(图10的A)。在Ism1Δ/Δ小鼠中，从第1天开始，观察到了更高数目的中性粒细胞(图10的B)、T-细胞(图10的D)和B-细胞(图10的E)，而从第3天观察到了增加的巨噬细胞募集(图10的C)。到第7天，野生型和Ism1Δ/Δ小鼠中的中性粒细胞均下降到基础水平，但在Ism1Δ/Δ肺中仍可观察到更高数目的肺泡巨噬细胞、T和B细胞。相应地，在Ism1Δ/Δ小鼠中观察到了远更高的总支气管肺泡灌洗(BAL)蛋白，反映了与过度肺部炎症相关的渗透性过高(图10的F)。一致地，LPS挑战后的第1天收获的肺的组织学分析显示，与野生型肺相比，Ism1Δ/Δ肺的肺泡腔中的免疫细胞大幅增加，在这一时间点，伴随有中性粒细胞的显著增加(图10的G)。
因此，ISM1缺乏在小鼠中导致对呼吸LPS挑战更严重的炎症响应，支持了ISM1在调节肺部炎症中的作用。
外源性rISM1抑制了肺中LPS-诱导的炎症响应
基于上述结果，我们假设ISM1可能会抑制LPS诱导的炎症。为了测试这一假设，我们在LPS滴注之前的一天，我们用气管内50μg rISM1预治疗野生型小鼠。在LPS滴注当天和之后再持续三天继续进行rISM1治疗(图11的A)。然后收集BAL液并且经rISM1治疗的小鼠确实显示出总BAL蛋白显著减少(图11的B)。白细胞向肺泡腔的浸润减少到几乎基础水平(无LPS挑战)(图11的C)。中性粒细胞(图11的D)和肺泡巨噬细胞(图11的E)在rISM1治疗下均大幅减少。虽然在rISM1治疗下T和B细胞有减少的趋势(图11的F-G)，由于PBS治疗的小鼠组中的高变异性，这些变化在统计上并不显著。总之，这些发现支持ISM1可起到肺部炎症抑制剂的作用，并且局部递送的rISM1猝灭了小鼠中LPS诱导的肺部炎症。
ISM1缺乏在LPS-诱导的急性肺损伤后导致缺陷型肺修复和重构
炎症对外部攻击的正确响应很重要，但它也会对组织造成损害。受影响的组织会尝试修复此类炎症触发的损伤并且恢复组织内稳态。过度的炎症响应会使修复机制不堪重负，导致组织重构。由于Ism1Δ/Δ小鼠显示出对LPS挑战的增强免疫响应，试图确定这种增大的炎症响应是否会影响肺修复和恢复至内稳态。在LPS挑战后第9天检查肺组织的组织学。如图12的A所示，Ism1Δ/Δ肺显示出肺结构的严重变形，伴有肺泡臂的广泛增厚。通过Picro-天狼星红染色也观察到胶原蛋白沉积的显著增加(图12的B-C)。此外，可注意到肌成纤维细胞(α-平滑肌肌动蛋白阳性)丰度增加，特别是在小纤维簇中(图12的D-E)。细胞外基质(ECM)和肌成纤维细胞的过度积累是肺纤维化的特征50。
在LPS挑战后，炎症响应通常会导致对上皮的损伤/损害。存在两种类型的肺泡上皮细胞：类型I(AE1)细胞是终末分化的、扁平的、鳞状的并且覆盖90％的肺泡壁表面；类型II(AE2)细胞在数量上较少但具有类似干细胞的特性51。AE2细胞对于损伤后的肺修复和再生很重要。为了维持内稳态和肺泡上皮的完整性，AE2细胞增殖并分化为AE1细胞以使肺泡壁再上皮化52,53。AE1细胞被增生性AE2细胞的异常替代是纤维化的促成因素之一54。在LPS挑战后的第9天，Ism1Δ/Δ肺显著出比野生型肺显著更多增殖的AE2细胞，如PCNA(增殖标志物)和SP-C(AE2标志物)的双免疫荧光染色所示(图13)。这一结果表明，AE2过度增殖可能导致Ism1Δ/Δ肺中的纤维化增加。
TGF-β是迄今为止表征的最有效的促纤维化介质55。在LPS挑战后的第9天，与野生型肺相比，Ism1Δ/Δ肺中的TGF-β水平显著增加(图14)。
总而言之，这些结果表明，ISM1缺乏在小鼠中激发了对LPS挑战的增强免疫响应，导致异常的肺修复和纤维化。
ISM1缺乏在LPS挑战后改变肺中的急性炎症细胞因子/趋化因子谱
为了破解ISM1缺乏是否会导致响应于LPS的炎症性细胞因子/趋化因子的改变，使用细胞因子抗体阵列检查了细胞因子和趋化因子谱。在LPS挑战后的第1天，与对照小鼠相比，Ism1Δ/Δ肺中的七种趋化因子和细胞因子大幅升高(图15的A)(≥1.5倍)。所有上调的细胞因子/趋化因子均是已知的促炎介质，诸如IL-1α、IL-1β；白细胞化学引诱物，诸如γ干扰素诱导的单核因子(MIG)，C-X-C趋化因子诸如CXCL10/IP-10、MIP-1a和MIP-2；以及可溶性ICAM-1。此外，Ism1Δ/Δ肺中的TNF-α也显著增加(图15的B-C)。这些结果表明，肺中缺乏ISM1导致多种促炎细胞因子增加，可能是导致对LPS挑战肺部炎症响应增强的原因。
ISM1缺乏激活肺中的NF-κB信号
先前的研究已经表明，LPS通过诱导的NF-κB的核易位来在鼠肺中激活NF-κB信号45,56。为了确定ISM1是否在体内调节LPS-诱导的NF-κB易位中起作用，针对NF-κB(p65亚基)将LPS处理后的Ism1Δ/Δ和野生型小鼠的肺组织固定并染色。与野生型小鼠相比，Ism1Δ/Δ小鼠的肺切片中的核p65 NF-κB(红)显著增加(图16的A)。另外，Ism1Δ/Δ肺中的p65NF-κB水平也更高(图16的B-C)。这些数据表明，存在响应于LPS的Ism1Δ/Δ肺中的NF-κB增加，这是激活多种促炎细胞因子/趋化因子和增强的炎症的可能机制。
使用LPS-诱导的ALI模型，本项研究表明，ISM1缺乏在小鼠肺中导致过度炎症。另外，当气管内给药至小鼠中时，rISM1可以猝灭LPS-诱导的肺部炎症。这些发现支持ISM1作为抗炎蛋白。
一些血管生成抑制剂先前已报道，除了它们的抗血管生成能力外，还可以抑制肺部炎症。例如，血小板反应蛋白-1(TSP-1)报道在肺中的生理炎症和内稳态中很重要57。早在1月龄时，Tsp1-/-小鼠开始在他们的肺实质中显示出不完整的炎症位点。中性粒细胞浸润表现在肺泡和血管周围结缔组织中。此外，TSP-1缺陷型小鼠对LPS-诱导的肺损伤更敏感58。TSP-1通过调节IL-10的产生来抑制炎症响应，IL-10是肺损伤消退阶段的关键抗炎症细胞因子。血管抑制素是另一种可以在小鼠中抑制LPS-诱导的急性肺损伤的血管生成抑制剂59。血管抑制素的治疗有效地减少了BAL液中的蛋白质积累和白细胞浸润到肺中。在本项研究中，ISM1显示以与TSP-1功能有些相关的方式起作用，因为敲除小鼠在非病理状况下在肺中表现出增强的炎症响应；并且在LPS-诱导的急性肺损伤中表现出高响应性。同时，外源性血管抑制素和ISM1在LPS挑战后均可抑制急性肺部炎症。
尽管Ism1Δ/Δ肺对LPS表现出更严重的炎症响应，但炎症在第3天达到峰值后开始消退并且在第7天时几冬夜达到基础水平，类似于野生型小鼠。然而，Ism1Δ/Δ肺表现出广泛的纤维化样表型，伴有增加的胶原蛋白沉积、肌成纤维细胞积累和更高的TGF-β表达水平。另外，观察到增殖的肺泡上皮II型(AE2)细胞数目增加。这些数据指向一种“高响应性”肺，它对以过度炎症对LPS响应，这是通常诱导组织重构的条件60。ISM1可能在肺中起到抑制由LPS诱导的过度炎症的作用，从而保护肺免受过度损伤和伤害。Ism1Δ/Δ肺中的过度炎症可能压倒修复机制，导致结构改变和纤维化。
NF-κB路径在LPS-诱导的炎症中发挥作用45,56,61。NF-κB的活化导致其活性形式p65易位到细胞核中。LPS可以增强NF-κB p65从细胞质到细胞核的易位61,62。已知LPS-诱导的NF-κB活化会增加诸如IL-1、MIP-2和TNF-α等促炎细胞因子的表达，导致过度炎症响应56,63,64。在ISM1缺乏条件下，NF-κB活性形式的丰度增加和核易位增加表明NF-κB信号通路参与了多种促炎细胞因子的上调。
ALI/ARDS的特征是肺中大量存在激活的中性粒细胞与积液，导致肺功能受损和高死亡率65。ALI和ARDS是人类人群中常见的肺部疾病66。不幸的是，本领域之前没有报道过针对这两种疾病的新疗法的重大突破和发现60。本文描述的这一发现表明，气管内递送的rISM1足以有效减少LPS挑战的小鼠中的白细胞浸润。重要的是，已对证明，ISM1治疗也抑制了LPS-诱导的肺渗透性过高(图11)。
结果支持ISM1可以提供针对肺部炎症原抑制剂/促消退介质。其通过诱导凋亡来抑制肺泡巨噬细胞的过度累积。局部递送的rISM1救援了不鼠中的肺气肿表型并且协助保存了肺部稳态。因此，这些结果支持ISM1-基治疗方法用于治疗、改善和/或预防炎症性肺部疾病，诸如ALI和COPD。
材料和方法
动物。在本项研究中使用成年(7-至8-周龄)雌性ISM1-缺限型(Ism1Δ/Δ)小鼠。年龄和性别匹配的野生型C57BL/6J小鼠获自Jackson Laboratory。动物护理和实验程序按照NUS机构动物护理和使用委员会批准的机构指南进行(IACUC；协议066/12和R16/0632；育种协议BR15/1100)。用于T7E1测定和基因分型的引用如下：
用于T7E1测定以筛选突变小鼠的PCR引物：
正向5’cagctcctgggattgctccg 3’(SEQ ID NO:16)和反向5’taagacttcttcctggtgccaaa 3’(SEQ ID NO:17)；
用于小鼠基因分型的PCR引物：
正向5’gacagctcctgggattgctcc 3’(SEQ ID NO:18)和反向5’ttctgcaatgtaccaagctctct 3’(SEQ ID NO:19)；
(见图17)。
重组蛋白。在大肠杆菌中表达重组ISM，并且使用Ni-NTA亲和色谱法进行纯化，随后使用反相HPLC纯化。确认所述重组蛋白无内毒素。在救援实验中，将rISM1溶解于过滤的PBS中，向肺中气管内给药每小鼠50μg rISM1。使用载体pET-M(如Xiang et al.,2011中所述,JCMM,通过引用以其整体并入本文)，在大肠杆菌中表达小鼠rISM(成熟形式，无信号肽)，并且纯化为His-标记的蛋白。在这些实验中使用小鼠rISM1。成熟ISM1(无信号肽)在测试条件下可能具有生物学显著性。所使用的ISM1序列包含NP_001263418.1，并且如下：
Figure GDA0003337137240000911
(SEQ ID NO:9；下划线表示天然ISM1序列，粗体表示载体序列和His-标签，斜体表示N-末端M残基)
气管内滴注。如Liao et al67先前的描述，使用5％异氟醚(Baxter)将小鼠麻醉，随后气管内递送来自E.coli O111:B4(L2630；Sigma Aldrich)的LPS(2mg/kg LPS)或盐水。对照动物接收单独的盐水。使小鼠恢复直至为后续分析而在LPS滴注后的第1、3、5和7天的支气管肺泡灌洗(BAL)采集时间。
支气管肺泡灌洗(BAL)采集。将新鲜安乐死的小鼠解剖以暴露出肺和心脏。将气管插管并用1ml冰冷的PBS灌洗肺两次。将BAL样品在4℃下以500x g离心5分钟。收集上清液，在-80℃下保存备用。使用Bradford试剂来定量BAL蛋白。向细胞沉淀中加入1mL红细胞裂解缓冲液以裂解所有红细胞，然后离心。在FACS缓冲液中回收活细胞，并且使用Nucleocounter NC-100(Chemometec,Denmark)计数，随后进行差异免疫细胞计数。
差异免疫细胞计数。使用NovoCyte流式细胞仪研究差异免疫细胞计数并且使用NovoExpress软件(AceaBiosciences,USA)分析。如先前所述进行差异免疫细胞计数68。免疫细胞被识别为CD45+，肺泡巨噬细胞为CD11c+Siglec-F+，嗜酸性粒细胞为CD11c-Siglec-F+，中性粒细胞为GR-1+CD11b+，B细胞为CD3-/CD19+且T细胞为CD3+/CD19-细胞。
外周血白细胞计数。从麻醉小鼠的下颌下静脉采集血液。使用Hemavet H950FS血液分析仪(Drew Scientific Group,USA)分析新鲜血液样品。
组织学。在10％中性缓冲福尔马林中固定完全充气的肺，然后石蜡包埋，切片并且使用苏木精和曙红或Picro-天狼星红染色(ab150681,Abcam,USA)进行染色。在histoclear中将切片(5μm)脱蜡，随后在从100％乙醇的一系列醇等极中进行缓慢再水化。水化至水中之后，将切片放置在PBS中进行后续染色。
免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)。使用抗-CD68(sc-7084,Santa CruzBiotechnology)、抗-NIMP-R14(sc-59338,Santa Cruz Biotechnology)、抗-α-SMA(SantaCruz Biotechnology)、抗-TGF-β(sc-146,Santa Cruz Biotechnology)、抗-SP-C(sc-13979,Santa Cruz Biotechnology)、抗-p65NFKB(107450-1-AP,Proteintech)和抗-PCNA(sc-56,Santa Cruz Biotechnology)在4℃将组织切片染色过夜。使用苏木精和曙红(DAKO)将组织切片染色。所有图像均使用Zeiss Axiovert获得。
免疫印迹和蛋白质阵列。将新鲜组织均质并离心，并将可溶性上清液作为全组织裂解物。使用β-肌动蛋白作为加载对照进行标准蛋白质印迹。所使用的抗体是抗-TGF-β(sc-146,Santa Cruz Biotechnology)、抗-TNF-α(107590-1-AP,Proteintech)、抗-p65NF-κB(10745-1-AP,Proteintech)。使用小鼠细胞因子蛋白质组分析器阵列(ARY028,R&DSystems,USA)检查了多种40种细胞因子的相对丰度。使用每组中4只小鼠的全组织裂解物。将每个样品200μg等量总蛋白与阵列杂交并比较相对表达。通过使用Image J软件测量斑点印迹强度来量化相对表达。
统计分析。数据表示为均值的标准误差(±SEM)。使用学生t检测确定统计学显著性。*P<0.05；**P<0.01，n≥3。
实施例3–单独的C-末端AMOP结构域足以介导ISM1的促凋亡活性。
在本实施例中，研究了ISM1的结构-功能关系。首先开发了用于表达和纯化细菌和哺乳动物重组ISM1(rISM1)蛋白的方法。两个rISM1之间15kDa的质量差异促使我们对哺乳动物rISM1的糖基化谱进行研究，这揭示了密实且高度异质的聚糖沉积。接着，通过使用含有单个结构域的各种rISM1截断蛋白进行共免疫沉淀测定和凋亡测定，进一步证明，MUC4中的粘附相关结构域和ISM1的其他蛋白(AMOP)结构域介导了两种受体相互作用(即整合素αvβ5和细胞表面GRP78(csGRP78))。相应地，ISM1的AMOP结构域呈现出全长蛋白的完整促凋亡活性。
重组ISM1蛋白的表达和纯化。
为了阐明ISM1的结构-功能关系，我们首先着手生成和纯化重组ISM1(rISM1)。由于ISM1是一种分泌蛋白，我们首先利用了哺乳动物表达宿主。为了建立哺乳动物表达构建体，使用小鼠Igκ1前导序列替换小鼠ISM1的天然信号肽以提高分泌效率(图31的A)。随后将表达构建体转染到Expi293F细胞中，并且经由一步IMAC(固定化金属亲和色谱)纯化条件培养基中的重组蛋白(图31的B)。纯化的哺乳动物rISM1在变性SDS-PAGE上迁移约70kDa(图31的C)。
为了从细菌宿主中表达可溶性rISM1，将SUMO(小泛素样修饰蛋白)标签融合至不具有信号肽序列的小鼠ISM1的N-末端(图31的D)。将细胞表达构建体转化至Shuffle T7细胞中，并且通过IMAC和SEC(尺寸排阻色谱)进一步纯化可溶性蛋白(图31的E)。在SUMO标签裂解后，细菌rISM1在变性SDS-PAGE上迁移约55kDa(图31的F)。
哺乳动物rISM1密集沉积有异质聚糖。
令人惊讶的是，哺乳动物和细菌rISM1之间具有约15kDa的大小差异，表明哺乳动物rISM1上存在翻译后修饰(PTM)。然后我们专注于蛋白质糖基化，因为它可以显著增加蛋白质质量。序列分析揭示了小鼠ISM1上的两个潜在N-连接的粘基化位点，即Asn39和Asn282(图32的A)。使用PNGaseF(肽-N-糖苷酶F)温育哺乳动物rISM1将蛋白质质量减少了约10kDa，确认存在N-聚糖(图32的B)。进一步生成了N-糖基化突变构建体(N39Q,N282Q,N39/282Q)以破坏一个或两个N-聚糖位点，并且在三个细胞系(HEK293T,HEK293FT,HeLa)中评估了效果(图32的C)。每个单突变体在全细胞裂解物(WCL)部分中均表现出减少的蛋白质大小(～5kDa)，而双突变体的总大小减少了～10kDa，确认两个位点都被N-聚糖修饰。有趣的是，WT/N282Q在WCL部分均呈现双峰带，而N39Q和N39/282Q仅呈现单峰带(图32的C)。来自先前报道的类似观察表明，这是由于Asn39(8)上的核心糖基化效率低下引起的。在HEK293T细胞中，N-聚糖位点的破坏消除了条件培养基中的蛋白质分泌(图32的C)；尽管如此，仅在HEK293FT和Hela细胞中的Asn282突变体中，蛋白质分泌被消除。结果表明，Asn282上的N-糖基化是调节ISM1分泌的关键，而Asn39上的N-糖基化在某些细胞系中至关重要。
随后，我们利用了蛋白质组学方法进一步识别哺乳动物rISM1上存在的O-和C-连接的聚糖。引人注目的是，发现30个附加氨基酸被糖基化(图32的D)。虽然一些残基仅用简单结构的单个聚糖修饰，但某些残基诸如Ser184和Ser188被多个不同结构的聚糖修饰，表明了这些位置上聚糖沉积的微异质性。聚焦于糖基化位点分布，21个聚糖位点位于N-末端非结构化区域，2个位点位于TSR结构域并且7个位点位于AMOP结构域(图32的D)。由于大多数聚糖沉积和聚糖复杂性存在于非结构化区域，这可能表明糖基化对非结构化区域折叠的稳定作用。另外，据报道，在TSR结构域上存在两种非常规糖基化并具有保守性，即O-岩藻糖基化(O-岩藻糖-葡萄糖)识别Cxx(S/T)CG基序，和具有识别基序WxxW的C-甘露糖基化(C-甘露糖)。在ISM1-TSR结构域上，两个识别的聚糖修饰是Thr229(226-CSVTCG-231)上的O-连接的二糖(脱氧己糖-己糖)以及Trp220(220-WSLW-223)上的C-连接的单糖(己糖)(表S1)，它们可能分别对应于假定的O-岩藻糖基化和C-甘露糖基化。
在这30个糖基化位点中，进一步选择4个候选位点进行突变分析以评估其效果：Trp220和Thr229，因为它们是TSR结构域上假定的C-甘露糖基化和O-岩藻糖基化位点；Ser184和Ser188，因为它们是具有聚糖沉积的高度异质点。使用蛋白质印迹的初步分析显示，这些糖基化位点的破坏不影响ISM1表达或分泌(图32的E)。总之，我们的分析表明，哺乳动物rISM1密集地沉积有异质聚糖。
ISM1的AMOP结构域介导其受体相互作用。
先前我们已经识别整合素αvβ5和细胞表面GRP78为ISM1的细胞表面受体。为了阐明ISM1的哪个结构域介导受体相互作用，产生了以下哺乳动物rISM1蛋白：含有两个结构域的mamISM126-461，含有TSR结构域的mamISM126-286以及含有AMOP结构域的mamISM126-286(图33的A、B)。从细胞中表达并纯化了仅含有ATPase结构域的重组GRP78截短体(图33的A、B)。仅具有胞外域的哺乳动物重组整合素αvβ5异二聚体是商业购得的。使用这些纯化的重组蛋白的共免疫沉淀测定表明，单独的AMOP结构域能够介导ISM1-GRP78和ISM1-αvβ5相互作用(图33的C、D)。相比之下，不具有AMOP结构域的ISM1截短体消除了与两种受体的结合(图33的E)。总之，ISM1-AMOP结构域介导其与两种受体的相互作用。
AMOP结构域边界影响其促凋亡活性。
为了研究AMOP结构域的促凋亡活性，首先我们生成了两个AMOP截短体，即具有不同长度的mamISM1271-461和mamISM1287-461，因为AMOP的确切边界尚不清楚且只是一个估计(图34的A、B)。令人惊讶的是，虽然mamISM1287-461在相似于饥饿状态水平下诱导EC凋亡，而mamISM1271-461完全不诱导EC凋亡(图34的C)。似乎N-末端的16个额外氨基酸完全消除了AMOP结构域的促凋亡作用。
为了进一步研究这16个额外氨基酸的影响，我们在该区域中生成了以下不同长度的AMOP截短体：bacISM1271-461、bacISM1282-461、bacISM1283-461、bacISM1287-461。它们是经由融合至SUMO-标签从细菌表达系统生产的(图34的D、E)。有趣的是，随着额外序列变短，AMOP截短体变得更加具有活性(图34的F)。因此，所述结构表明，AMOP结构域的边界可以影响其促凋亡活性。
当密切比较细菌与哺乳动物重组AMOP截短体的促凋亡活性时，可以注意到，bacAMOP展示出了与mamAMOP相似的活性。虽然bacISM1271-461和mamISM1271-461没有表现出活性，但bacISM1287-461和mamISM1287-461显示出了相似水平的促凋亡活性(图34的G)。因此，结果表明，AMOP活性不受翻译后修饰的影响(PTM)。
事实上，使用截短的小鼠ISM1蛋白的结构-功能关系研究表明，来自287-461的C-末端AMOP结构域保留了全长ISM1蛋白的完整促进凋亡性质(图29)。此外，结果表明，与哺乳动物细胞产生的mamISM1287-461片段相比，大肠杆菌产生的bacISM1287-461片段(单独的AMOP结构域)具有相同的促凋亡活性水平，表明AMOP结构域不需要翻译后修饰来介导ISM1的促凋亡活性。这也与co-IP结合测定结果一致，表明ISM1287-461对于其直接结合GRP78受是足够的(图30)。因此，GRP78受体结合和促凋亡功能均是通过来自氨基酸残基287-461(人类ISM1等同物为290-464处的氨基酸残基)的C-末端AMOP结构域来介导的。
ISM1287-461(C)而非ISM126-277(N)支持EC粘附
先前表明，表面涂覆的rISM1可以支持EC粘附和附着。为了研究ISM1在支持EC附着中的作用，使用
Figure GDA0003337137240000961
活细胞分析成像系统进行了细胞粘附测定，该系统可以监测细胞附着的动态变化。
将明胶用作阳性对照，因为它是一种细胞外基质蛋白并支持EC粘附。可以通过汇合度随时间变化的增加看出明胶支持的EC粘附(图21)。相反，将血清蛋白BSA用作阴性对照。BSA涂覆的孔中EC的汇合度保持较低或甚至随着时间的推移而降低，表明BSA不支持细胞粘附(图21)。
在ISM1与其截短体的比较中，观察到含有AMOP结构域(287-461)的ISM1C可以支持与ISM1FL相当的细胞粘附，因为两者在支持细胞附着方面没有显著差异(图19的A)。相比之下，缺失了AMOP结构域的ISM1N在支持细胞粘附方面显示出降低的能力(图19的A)。这一结果表明，ISM1中的AMOP结构域在介导EC粘附中很重要。此外，发现ISM1C的RKD基序(RKD341RAA,RKD340AAA)中的突变导致细胞附着显著减少(图19的B)。
内在化的ISM1287-461(C)诱导EC凋亡
为了进一步研究内在化的ISM1C对EC是否具有与ISM1FL相同的促凋亡作用，使用
Figure GDA0003337137240000971
活细胞分析成像系统进行了EC凋亡测定。简言之，将HUVEC接种在96-孔板中(6,000个细胞/孔)并且使用1μM rISM1蛋白(包括rISM1N、rISM1C和rISM1FL)处理长达24小时。从相应的凋亡曲线(图20的A)，发现ISM1C和ISM1FL诱导了EC凋亡。相比之下，ISM1N不具有促凋亡效应。这一结果与ISM1C而非ISM1N被内化至EC的内在化测定结果一致。因此，基于这些结果，AMOP结构域可能承担了ISM1的促凋亡功能。
与这些研究相关的序列(哺乳动物和细菌)如下：
SEQ ID NO:28:bacISM126-461
Figure GDA0003337137240000972
Figure GDA0003337137240000981
(重组小鼠ISM1全长)
(带下划线：天然小鼠ISM1序列；粗体：His-标签和载体序列；斜体：SUMO-标签)
SEQ ID NO:29:bacISM1287-461
Figure GDA0003337137240000982
Figure GDA0003337137240000983
(重组小鼠 ISM1 AMOP结构域)
(带下划线：天然小鼠ISM1序列；粗体：His-标签和载体序列；斜体：SUMO-标签)
SEQ ID NO:30:mamISM126-461
Figure GDA0003337137240000984
(重组小鼠ISM1全长)
(带下划线：天然小鼠ISM1序列；粗体：载体序列和His-标签；斜体：Myc-标签)
SEQ ID NO:31:mamISM1287-461
Figure GDA0003337137240000985
Figure GDA0003337137240000991
Figure GDA0003337137240000992
(重组小鼠ISM1 AMOP结构域)
(带下划线：天然小鼠ISM1序列；粗体：载体序列和His标签；斜体：Myc-标签)
SEQ ID NO:32:mamISM126-464
Figure GDA0003337137240000993
Figure GDA0003337137240000994
(重组人类ISM1全长)
(带下划线：天然人类ISM1序列；粗体：载体序列和His-标签；斜体：Myc-标签)
SEQ ID NO:33:bacISM126-464
Figure GDA0003337137240000995
Figure GDA0003337137240001001
Figure GDA0003337137240001002
(重组人类ISM1全长)
(带下划线：天然人类ISM1序列；粗体：载体序列和His-标签；斜体：FLAG-标签)
SEQ ID NO:34:bacISM1290-464
Figure GDA0003337137240001003
Figure GDA0003337137240001004
(重组人类ISM1 AMOP结构域)
(带下划线：天然人类ISM1序列；粗体：载体序列和His-标签；斜体：FLAG-标签)
SEQ ID NO:35:mamISM1290-464
Figure GDA0003337137240001005
(重组人类ISM1 AMOP结构域)
(带下划线：天然人类ISM1序列；粗体：载体序列和His-标签；斜体：Myc-标签)
这些结果支持ISM1287-461(22kDa)(人类ISM1等同物是290-464处的氨基酸残基)在小鼠中抑制CS-诱导的肺部炎症方面，可以以与全长rISM1蛋白相似的方式起作用。例如，rISM1和rISM1287-461(人类ISM1等同物为290-464处的氨基酸残基)可以提供用于COPD的疗法。
在这一实施例中，使用哺乳动物和细菌表达系统来生成可溶性的功能活性重组ISM1蛋白。该方法不仅有助于结构-功能研究，而且还可用于生产用于各种应用的ISM1。
哺乳动物和细菌rISM1之间的表观尺寸差异促使我们研究ISM1上的蛋白质糖基化谱。我们意外地发现哺乳动物rISM1是一种高度异质的糖蛋白，并且聚糖的大量沉积对蛋白质质量有显著贡献。尽管如此，应该注意到蛋白质糖基化受细胞类型的影响。不同的细胞表达不同类型和水平的糖基化酶，因此导致聚糖谱的变化。例如，CHO细胞与HEK293细胞中产生的蛋白质之间的聚糖谱存在显著差异。HEK293产生的蛋白质通常含有更复杂的聚糖结构，而CHO衍生的蛋白质具有更高的唾液酸化水平。在另一例子中，分析了12种不同组织来源的人类细胞系的O-糖基化谱，其揭示了每个细胞系内独特的O-糖蛋白组(Steentoft,C.,Vakhrushev,S.Y.,Joshi,H.J.,Kong,Y.,Vester-Christensen,M.B.,Schjoldager,K.T.,Lavrsen,K.,Dabelsteen,S.,Pedersen,N.B.,Marcos-Silva,L.,Gupta,R.,Bennett,E.P.,Mandel,U.,Brunak,S.,Wandall,H.H.,Levery,S.B.,和Clausen,H.(2013)Precisionmapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCelltechnology.EMBO J 32,1478-1488)。超过一半的已识别的糖位点仅在一个细胞系中发现，而每个细胞系也贡献了过多的独特糖蛋白。因此，对由Expi293F细胞产生的哺乳动物rISM1进行的蛋白质糖基化分析可作为参考，但在其他情况下可能有所不同。
出乎意料的是，这一实施例显示，ISM1-OP，而不是TSR，正在介导受体结合以及促凋亡活性。由于不同的ISM1-AMOP构建体表现出不同的活性，似乎活性可能至少部分受边界序列调节。
方法和材料
构建体建造
为了生成ISM1的哺乳动物表达构建体，小鼠ISM1的cDNA经PCR扩增并且通过BamHI和XhoI限制酶位点克隆到pSECtag-2B载体(Invitrogen)中。该载体含有来自小鼠Igκ1前导序列的N-末端信号肽以允许高效蛋白质分泌，以及含有C-末端六组氨酸标签和Myc标签以协助蛋白质检测和纯化。
为了生成ISM1的细菌表达构建体，首先将SUMO-标签的cDNA经由重叠PCR连接至小鼠ISM1 cDNA的N-末端，经由BamHI和XhoI限制酶位点将其进一步克隆到pRSFDuet-1载体(Novagen)中。该载体含有N-末端六组氨酸标签以允许蛋白质检测和纯化。
细胞系和细胞培养
在补充有HyClone抗真菌溶液(GE Healthcare)至最终浓度100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B的EndoGROLS完全培养基(Merck,SCME001)中培养来自Merck的HUVEC(SCCE001)。将第4代和第8代之间的HUVEC用于实验。
人类胚胎肾293T细胞(HEK293T)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；人类胚胎肾293FT细胞(HEK293FT)受赠自Adam Yuan博士实验室(新加坡国立大学生物科学系)；人类宫颈癌细胞系(HeLa CCL-2)获自ATCC。在补充有10％牛胎儿血清(GE healthcare)和HyClone抗真菌溶液(GE Healthcare)至最终浓度100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)(GE healthcare)中培养所有上述细胞系。
抗体和试剂：
用于免疫沉淀和免疫印迹的抗体如下：抗-His(A00186,GenScript)；抗-Myc(ab9106,Abcam)；抗-GRP78(LS-C165064,LSBio)；抗-整合素αvβ5(P1F76,SantaCruz)；抗-整合素αv(ab179475,Abcam)；抗-整合素β5(ab184312,Abcam)。
使用了如下试剂：半胱天冬酶-3/7绿检测试剂(C10423,Invitrogen)；PNGaseF(P0704S,New England Biolabs)；SUMO蛋白酶(SAE0067,Sigma)。
瞬时转染
为了在HEK293T/HEK293FT/HeLa细胞中进行瞬时转染，遵循制造商的说明使用lipofectamine 3000(Invitrogen)。转染后二十四小时，将培养基更换为新鲜的无血清培养基。再温育24小时之后，收集条件培养基和全细胞裂解物，并且使用蛋白质印迹进行分析。
哺乳动物重组ISM1表达和纯化
为了表达和纯化哺乳动物重组ISM1蛋白，使用与Expifectamine 293(Gibco)转染试剂复合的1μg/mL表达质粒根据制造商协议，瞬时转染处于ExPi293培养基(Gibco)中的五十毫升Expi293F悬浮细胞培养物。在轨道直径为25mm、振动速度为120rpm下，在37℃、8.0％CO2下温育培养物。16小时后加入表达增强剂。使用Countess II(Invitrogen)监测细胞活力。当细胞活力低于70％时，在3000×g下离心将废培养基与细胞分离，并用条件缓冲液(5x条件缓冲液：100mM HEPES、150mM NaCl、25mM咪唑、2.5％(v/v)甘油，pH 7.5，1x蛋白酶抑制剂混合物)进行调整。向条件培养基中添加在条件缓冲液中平衡的两毫升Smart Ni-NTA树脂(BioBasic)50％浆料并且在温和搅拌下温育至少一小时。然后收集树脂并用含有逐渐增加咪唑浓度的IMAC缓冲液(50mM HEPES，300mM NaCl，10％(v/v)甘油，pH 7.5)洗涤。最后用含有500mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。将PD10脱盐柱(GE Healthcare)在存储缓冲液(20mMHEPES，300mM NaCl，10％(v/v)甘油，pH 7.5)中平衡并且用于缓冲交换IMAC洗脱级分。然后使用30KDa截留分子量的Vivaspin离心浓缩机(Sartorius)浓缩蛋白质。使用Nanodrop(ThermoFisher)测量最终蛋白质浓度。将蛋白质等分，液氮速冻并且-80℃下保存。
细菌重组ISM1表达和纯化
为了表达和纯化细胞重组ISM1蛋白，首先遵循制造商的说明，将SUMO-ISM1细菌表达构建体转化到Shuffle T7细胞(New England Biolabs)中。将单个菌落接种到发酵剂培养物(10ml)，并且在30℃摇床培养器，220RPM下生长过夜。次日，将所有的发酵剂培养物倒入1L培养基中，使细胞在30℃摇床培养器，220RPM下生长直至OD 600nm达到约0.4-0.6。为了诱导蛋白质表达，然后添加IPTG至最终浓度0.25mM。在16℃摇床培养器，180RPM下进行诱导16-20小时。最后，通过在5,000×g,4℃下离心10分钟来收集细菌丸粒。
在开始细菌裂解之前，进行渗透休克以从大肠杆菌中去除周质蛋白(19)。首先将细胞丸粒重悬于蔗糖缓冲液(50mM HEPES，20％蔗糖，1mM EDTA，pH 7.4；10mL每升培养物)中，随后在7000×g,4℃下离心30分钟。将丸粒进一步重悬于5mM MgSO4(10mL每升培养物)中并且在冰上温育10分钟，然后继续在4500×g,4℃下离心20分钟。弃去上清液，将细菌丸粒置于冰上直至裂解。
为了开始细菌裂解，将溶菌酶(最终浓度为1mg/mL)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)新鲜加入细菌裂解缓冲液(50mM Tris，250mM NaCl，40mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)中。然后将细胞丸粒重悬于裂解缓冲液(10mL/L培养物)中并且在冰上温育至少10分钟。之后，以20％振幅、1秒开/关间隔进行超声处理10分钟以帮助裂解。裂解液在13,000×g、4℃下离心20分钟以澄清。含有可溶性重组蛋白的上清液通过0.45μm注射器过滤器装置(Sartorius)过滤，并且转移至新管中。
为了进行固定化金属离子亲和色谱(IMAC)纯化，首先用5倍柱体积的IMAC洗脱缓冲液(50mM Tris，250mM NaCl，250mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)洗涤HisTrap柱(GEHealthcare)，随后使用10倍柱体积的IMAC结合缓冲液(50mM Tris，250mM NaCl，40mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)洗涤。然后通过
Figure GDA0003337137240001041
纯25M色谱系统(GE Healthcare)将澄清的细菌裂解液加载到色谱柱中。施用至少10倍柱体积的IMAC结合缓冲液以洗去未结合的蛋白质。结合的蛋白质最终用20倍柱体积线性梯度的IMAC洗脱缓冲液洗脱。
进行尺寸排险色谱(SEC)作为最终精制的第二步。合并来自IMAC的具有相对较高纯度的先前洗脱级分并且加载到已经使用SEC缓冲液(50mM Tris，250mM NaCl，10％甘油，pH 7.5)预平衡的Superdex200 10/300柱(GE Healthcare)中。收集来自SEC的峰级分，用Amicon超离心过滤器(Millipore)浓缩，并用Bradford测定法测量蛋白质浓度。最后将纯化的蛋白质等分，液氮速冻，并且在-80℃下保存。
免疫共沉淀
为了在纯化的重组ISM1和GRP78蛋白质之间进行Co-IP测定法，首先通过在PBS中与20μL珠在4℃下温育2小时，将2μg GRP78抗体(LS-C165064,LSBio)缀合至蛋白质A/G琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology)。然后将抗体缀合的珠子在5,000x g、4℃下离心3分钟以去除未结合的抗体。接下来，将4μg rGRP78和2μg rISM1添加到1mL Co-IP结合缓冲液(PBS,pH 7.4)中的珠中，并且在旋转器上在4℃下温育过夜。次日，用Co-IP洗涤缓冲液(含有0.1％Tween20的PBS)将珠进一步洗涤3次，每次洗涤间隔10分钟。最终用20μL 2xSDS加载染料从珠上洗脱下抗体-蛋白质复合物，并且使用蛋白质印迹进行分析。
凋亡测定
为了测量由重组ISM1诱导的内皮细胞凋亡，使用IncuCyte ZOOM活细胞成像系统(Essen Bioscience)进行测定。HUVEC以5500个细胞/孔的密度接种于96-孔板过夜。次日，HUVEC首先在2％FBS培养基中饥饿3小时，随后在存在或不存在VEGF(293-VE-010,R&DSystems)的条件下进行重组蛋白质处理。还以1:1000稀释度包括半胱天冬酶-3/7绿凋亡检测试剂(C10423,Invitrogen)以测量凋亡事件。每小时进行一次凋亡测量，总计24小时。最终的汇总统计是从至少三个单独的生物重复汇编而成的。
统计
使用GraphPad Prism软件进行统计分析和结果绘图。使用未配对的双尾学生t检验进行两个实验组之间的比较。结果绘制为平均值±sem。小于0.05的P值被认为是显著的。
实施例4-重组ISM1抑制小鼠中屋尘螨(HDM)诱导的哮喘的炎症
哮喘是大气道的疾病并且哮喘免疫响应主要由嗜酸性粒细胞介导，而非AM或中性粒细胞介导。HDM-诱导的哮喘模型是研究过敏性哮喘广泛使用的哮喘模型。
根据Hammad et al.(2009)和Peh et al.(2015)以及图26中描述的协议生成小鼠哮喘模型。简言之，用异氟烷麻醉雌性C57BL/6J小鼠(6-8周)并且通过气管内途径在第0、7和14天使用40μL的100μg HDM提取物(屋尘螨)致敏。在HDM挑战后2小时、第15天和第16天，连续地给予每日单剂量的细菌生产的重组ISM1(2mg/kg，40μg/小鼠)或等体积载体(生理盐水)。在第17天将所有小鼠安乐死，并且收集支气管肺泡灌洗液(BALF)用于免疫细胞浸润分析。使用由五只健康小鼠组成的幼稚组作为对照。
如图27所示，气管内递送的rISM1有效地抑制了HDM-诱导的哮喘气道炎症，如rISM1治疗的小鼠中总白细胞、嗜酸性粒细胞以及淋巴细胞显著减少所示。与先前的报道一致，气管内HDM主要触发嗜酸性粒细胞介导的气道炎症，中性粒细胞很少涉及。在rISM治疗下，嗜酸性粒细胞被抑制超过70％。在HDM挑战后也增加了肺泡巨噬细胞(AM)，并且rISM治疗在这种治疗方案下显示出AM减少，尽管没有统计学意义。结果表明，气道递送的ISM1能够抑制小鼠哮喘中HDM-诱导的气道炎症。这些结果支持rISM1用于治疗哮喘和制备抗-哮喘药物。
血清免疫球蛋白E(IgE)水平的升高是Th2免疫响应的标志。在最后的rISM治疗后24小时，收集小鼠血清。与HDM治疗组相比，rISM1治疗显著地降低了血液总IgE水平，表明ISM1抑制了Th2免疫响应(图28)。
已通过实施例描述了一个或多个说明性实施方式。本领域技术人员可以理解的是，在不脱离权利要求所限定的本发明范围的情况下，可以进行许多变化和修改。
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<211> 464
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Met Val Arg Leu Ala Ala Glu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu His Ile Thr Val Leu Arg Gly Ser Gly Ala Ala Asp Gly
20 25 30
Pro Asp Ala Ala Ala Gly Asn Ala Ser Gln Ala Gln Leu Gln Asn Asn
35 40 45
Leu Asn Val Gly Ser Asp Thr Thr Ser Glu Thr Ser Phe Ser Leu Ser
50 55 60
Lys Glu Ala Pro Arg Glu His Leu Asp His Gln Ala Ala His Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Arg Pro Arg Phe Arg Gln Glu Thr Gly His Pro Ser Leu Gln
85 90 95
Arg Asp Phe Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Pro Asn Phe Pro Asp
100 105 110
Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn Pro Asn Ile Gln Val Thr
115 120 125
Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu Ala Asp Lys Asp Gln His
130 135 140
Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Val Pro Ser Pro Asp Trp Arg Ala
145 150 155 160
Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg Ala Asn Ser Gly Asp Gln
165 170 175
Asp Tyr Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp Ser Asn Phe Leu Asn Pro
180 185 190
Pro Arg Gly Trp Asp His Thr Ala Pro Gly His Arg Thr Phe Glu Thr
195 200 205
Lys Asp Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp Gly Glu Gly Asp Trp Ser
210 215 220
Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Asn Gln Lys Arg
225 230 235 240
Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Thr Ala Thr Glu Ser Arg Thr Cys
245 250 255
Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp Thr Phe Arg Thr Ala Ala
260 265 270
Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys
275 280 285
Leu Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys
290 295 300
Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro
305 310 315 320
Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp
325 330 335
Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser
340 345 350
Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys
355 360 365
Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His
370 375 380
Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala
385 390 395 400
Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr
405 410 415
Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg
420 425 430
Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser
435 440 445
Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
450 455 460
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Met Val Arg Leu Ala Ala Glu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu His Ile Thr Val Leu Arg Gly Ser Gly Ala Ser Asp Arg
20 25 30
Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn Val Ser Gly Ser Gln Leu Gln Asn Asn
35 40 45
Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser Thr Ser Glu Thr Ser Phe Pro Leu Ser
50 55 60
Lys Glu Ala Pro Glu Glu His Gln Val Val His Gln Pro Phe Pro Arg
65 70 75 80
Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Gly
85 90 95
Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys
100 105 110
Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn Pro Asn Ile Gln Val Thr Ile Glu Val
115 120 125
Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu Ala Glu Lys Asp Gln His Pro Glu Asn
130 135 140
Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro Ala Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln
145 150 155 160
Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg Thr Asn Ser Gly Asp Gln Asp Asp Lys
165 170 175
Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp Ser Asn Phe Leu Ser Val Pro Arg Gly
180 185 190
Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Glu Gln
195 200 205
Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser
210 215 220
Val Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser
225 230 235 240
Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro
245 250 255
Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val
260 265 270
Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu
275 280 285
Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe
290 295 300
Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro
305 310 315 320
Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp
325 330 335
Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys
340 345 350
Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser
355 360 365
Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr
370 375 380
Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro
385 390 395 400
Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp
405 410 415
Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu
420 425 430
Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp
435 440 445
Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
450 455 460
<210> 3
<211> 439
<212> PRT
<213> 人类
<400> 3
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Gly Pro Asp Ala Ala Ala Gly Asn Ala Ser
1 5 10 15
Gln Ala Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Val Gly Ser Asp Thr Thr Ser
20 25 30
Glu Thr Ser Phe Ser Leu Ser Lys Glu Ala Pro Arg Glu His Leu Asp
35 40 45
His Gln Ala Ala His Gln Pro Phe Pro Arg Pro Arg Phe Arg Gln Glu
50 55 60
Thr Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Phe Pro Arg Ser Phe Leu Leu
65 70 75 80
Asp Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln
85 90 95
Asn Pro Asn Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser
100 105 110
Glu Ala Asp Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Val
115 120 125
Pro Ser Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala
130 135 140
Arg Ala Asn Ser Gly Asp Gln Asp Tyr Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ser Asn Phe Leu Asn Pro Pro Arg Gly Trp Asp His Thr Ala Pro
165 170 175
Gly His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Asp Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr
180 185 190
Asp Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys
195 200 205
Gly Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Thr
210 215 220
Ala Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu
225 230 235 240
Asp Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser
245 250 255
Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys
260 265 270
Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His
275 280 285
Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu
290 295 300
Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp
305 310 315 320
Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr
325 330 335
Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser
340 345 350
Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu
355 360 365
Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu
370 375 380
Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile
385 390 395 400
Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn
405 410 415
Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln
420 425 430
Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
435
<210> 4
<211> 436
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Gly Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn Val Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser Thr Ser
20 25 30
Glu Thr Ser Phe Pro Leu Ser Lys Glu Ala Pro Glu Glu His Gln Val
35 40 45
Val His Gln Pro Phe Pro Arg Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr Gly His
50 55 60
Pro Ser Leu Gln Arg Asp Gly Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Pro
65 70 75 80
Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn Pro Asn
85 90 95
Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu Ala Glu
100 105 110
Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg Thr Asn
130 135 140
Ser Gly Asp Gln Asp Asp Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp Ser Asn
145 150 155 160
Phe Leu Ser Val Pro Arg Gly Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly His Arg
165 170 175
Thr Phe Glu Thr Lys Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp Gly Glu
180 185 190
Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly
195 200 205
Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala Thr Glu
210 215 220
Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp Thr Phe
225 230 235 240
Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe
245 250 255
Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp
260 265 270
Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile
275 280 285
Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr
290 295 300
Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp
305 310 315 320
Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr
325 330 335
Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu
340 345 350
Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg
355 360 365
Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala
370 375 380
Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly
385 390 395 400
Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys
405 410 415
Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu
420 425 430
Ala Arg Glu Tyr
435
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA1
<400> 5
cugcacauca cgguucugcg cgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA2
<400> 6
gcggauccgg agccuccgac cgg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P1
<400> 7
cagctcctgg gattgctccg 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P2
<400> 8
ccttctgcaa tgtaccaagc tct 23
<210> 9
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 His 标签的小鼠 rISM1
<400> 9
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Asp Arg Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn Val Ser Gly Ser
20 25 30
Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser Thr Ser Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Pro Leu Ser Lys Glu Ala Pro Glu Glu His Gln Val Val His
50 55 60
Gln Pro Phe Pro Arg Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr Gly His Pro Ser
65 70 75 80
Leu Gln Arg Asp Gly Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Pro Asn Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn Pro Asn Ile Gln
100 105 110
Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu Ala Glu Lys Asp
115 120 125
Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro Ala Pro Asp Trp
130 135 140
Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg Thr Asn Ser Gly
145 150 155 160
Asp Gln Asp Asp Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Ser Val Pro Arg Gly Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly His Arg Thr Phe
180 185 190
Glu Thr Lys Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp Gly Glu Gly Asp
195 200 205
Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Asn Gln
210 215 220
Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala Thr Glu Ser Arg
225 230 235 240
Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp Thr Phe Arg Thr
245 250 255
Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala
260 265 270
Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser
275 280 285
Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp
290 295 300
Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr
305 310 315 320
Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp
325 330 335
Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg
340 345 350
Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala
355 360 365
Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys
370 375 380
Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu
385 390 395 400
His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp
405 410 415
Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr
420 425 430
Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg
435 440 445
Glu Tyr Leu Glu His His His His His His
450 455
<210> 10
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 ISM1 AMOP 结构域
<400> 10
Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser
20 25 30
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
35 40 45
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
65 70 75 80
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
85 90 95
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
115 120 125
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
130 135 140
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Asp
<210> 11
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ISM1 AMOP结构域
<400> 11
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
20 25 30
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
35 40 45
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
65 70 75 80
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
85 90 95
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
115 120 125
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
130 135 140
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Asp
<210> 12
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有HIS标签的 ISM1FL
<400> 12
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn
20 25 30
Val Ser Gly Ser Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser
35 40 45
Thr Ser Glu Thr Ser Phe Pro Leu Ser Lys Glu Ala Pro Glu Glu His
50 55 60
Gln Val Val His Gln Pro Phe Pro Arg Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr
65 70 75 80
Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Gly Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp
85 90 95
Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn
100 105 110
Pro Asn Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu
115 120 125
Ala Glu Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro
130 135 140
Ala Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg
145 150 155 160
Thr Asn Ser Gly Asp Gln Asp Asp Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp
165 170 175
Ser Asn Phe Leu Ser Val Pro Arg Gly Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly
180 185 190
His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp
195 200 205
Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly
210 215 220
Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala
225 230 235 240
Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp
245 250 255
Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu
260 265 270
Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu
275 280 285
Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys
290 295 300
Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe
325 330 335
Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys
340 345 350
Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr
355 360 365
Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile
370 375 380
Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe
385 390 395 400
Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys
405 410 415
Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly
420 425 430
Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe
435 440 445
Gln Glu Ala Arg Glu Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile
450 455 460
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
465 470 475 480
<210> 13
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 His标签的 ISM1N
<400> 13
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn
20 25 30
Val Ser Gly Ser Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser
35 40 45
Thr Ser Glu Thr Ser Phe Pro Leu Ser Lys Glu Ala Pro Glu Glu His
50 55 60
Gln Val Val His Gln Pro Phe Pro Arg Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr
65 70 75 80
Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Gly Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp
85 90 95
Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn
100 105 110
Pro Asn Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu
115 120 125
Ala Glu Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro
130 135 140
Ala Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg
145 150 155 160
Thr Asn Ser Gly Asp Gln Asp Asp Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp
165 170 175
Ser Asn Phe Leu Ser Val Pro Arg Gly Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly
180 185 190
His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp
195 200 205
Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly
210 215 220
Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala
225 230 235 240
Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp
245 250 255
Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Pro Arg
260 265 270
Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala
275 280 285
Val Asp His His His His His His
290 295
<210> 14
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有His标签的 ISM1C
<400> 14
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met
35 40 45
Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn
50 55 60
Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys
85 90 95
Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala
100 105 110
Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala
115 120 125
Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly
130 135 140
Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu
145 150 155 160
Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp
165 170 175
Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys
180 185 190
Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala
195 200 205
Arg Glu Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
210 215 220
Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
225 230 235
<210> 15
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有His标签的 ISM1C-N
<400> 15
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met
35 40 45
Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn
50 55 60
Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys
85 90 95
Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala
100 105 110
Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Pro Arg Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 16
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有His标签的ISM1C-M
<400> 16
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val
20 25 30
Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe
35 40 45
Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys
50 55 60
Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr
65 70 75 80
Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile
85 90 95
Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe
100 105 110
Ser Ala Glu Leu His Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile
115 120 125
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
130 135 140
<210> 17
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有His标签的ISM1C-C
<400> 17
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr
20 25 30
Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr
35 40 45
Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser
50 55 60
Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys
65 70 75 80
Gly Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln
85 90 95
Lys Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln
100 105 110
Glu Ala Arg Glu Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser
115 120 125
Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
130 135 140
<210> 18
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 KD341AA 突变的 ISM1C-N
<400> 18
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met
35 40 45
Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn
50 55 60
Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Ala Ala Phe Arg Trp Lys
85 90 95
Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala
100 105 110
Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Pro Arg Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 19
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 RKD340AAA 突变的 ISM1C-N
<400> 19
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met
35 40 45
Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn
50 55 60
Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Ala Ala Ala Phe Arg Trp Lys
85 90 95
Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala
100 105 110
Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Pro Arg Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 20
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 ISM1 C-末端区域的 N-末端部分
<400> 20
Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu
100
<210> 21
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有 AMOP 但不含 TSR 的小鼠 ISM1 的 C-末端区域
<400> 21
Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
100 105 110
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
130 135 140
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
165 170 175
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
180 185 190
<210> 22
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 KD341AA 突变的 ISM1C-N
<400> 22
Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Ala Ala Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu
100
<210> 23
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 RKD340AAA 突变的 ISM1C-N
<400> 23
Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Ala Ala Ala Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu
100
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7E1 正向 PCR 引物
<400> 24
cagctcctgg gattgctccg 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7E1反向PCR引物
<400> 25
taagacttct tcctggtgcc aaa 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于小鼠基因分型的正向PCR引物
<400> 26
gacagctcct gggattgctc c 21
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于小鼠基因分型的反向PCR引物
<400> 27
ttctgcaatg taccaagctc tct 23
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamH1-mISM1-N-F
<400> 28
cgcggatccg gagcctccga ccggcag 27
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xhol-mISM1-N-R
<400> 29
ccgctcgagg tcccgcaagc agactcactt c 31
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamH1-mISM1-C-F
<400> 30
cgcggatccg aagtgagtct gcttgcgg 28
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xhol-mISM1-C-R
<400> 31
ccgctcgagg gtactctctg gcttcttgg 29
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamH1-mISM1-C-N-F
<400> 32
cgcggatccg aagtgagtct gcttgcgg 28
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xhol-mISM1-C-N-R
<400> 33
ccgctcgagg ctccagggac agcatagagc 30
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamH1-mISM1-C-M-F
<400> 34
cgcggatccc tgcccagctg cccctgctcc tac 33
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xhol-mISM1-C-M-R
<400> 35
ccgctcgagg gtagtggagt tcagcagaga actcgg 36
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamH1-mISM1-C-C-F
<400> 36
cgcggatcct gcatccgctc tatgctgtcc ctgg 34
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xhol-mISM1-C-C-R
<400> 37
ccgctcgagg gtactctctg gcttcttgg 29
<210> 38
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kpnl-hGRP78-1-18-FLAG-19-F
<400> 38
cggggtacca tgaagctctc cctggtggcc gcgatgctgc tgctgctcag cgcggcgcgg 60
gccgactaca aggacgacga tgataaggag gaggaggaca agaaggagga ctgggc 116
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Xbal-hGRP78-654-R
<400> 39
gctctagact acaactcatc tttttctgct gtatc 35
<210> 40
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类ISM1C-N
<400> 40
Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu
100
<210> 41
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类ISM1C
<400> 41
Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
100 105 110
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
130 135 140
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
165 170 175
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
180 185 190
<210> 42
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组ISMC' (rISMC')
<400> 42
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
20 25 30
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
35 40 45
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
65 70 75 80
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
85 90 95
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
100 105 110
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
130 135 140
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
165 170 175
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
180 185 190
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因分型引物1
<400> 43
cgcgcgactc aagaggatgg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因分型引物2
<400> 44
actgggaccc gctgacgttg 20
<210> 45
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-末端 AMOP 结构域 aa 287-461 小鼠
<400> 45
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
20 25 30
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
35 40 45
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
65 70 75 80
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
85 90 95
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
115 120 125
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
130 135 140
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
165 170 175
<210> 46
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-末端AMOP结构域aa 287-461 人类
<400> 46
Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser
20 25 30
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
35 40 45
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
65 70 75 80
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
85 90 95
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
115 120 125
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
130 135 140
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
165 170 175
<210> 47
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 ISM1 C-末端区域的 N-末端亚部分
<400> 47
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
20 25 30
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
35 40 45
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
65 70 75 80
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu
85
<210> 48
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类ISM1C-N亚部分
<400> 48
Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser
20 25 30
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
35 40 45
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
65 70 75 80
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu
85
<210> 49
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> bacISM126-461
<400> 49
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Gly Ser Met Ser
1 5 10 15
Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val
20 25 30
Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu
35 40 45
Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu
50 55 60
Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp
85 90 95
Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn Val Ser
115 120 125
Gly Ser Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Thr Ser Phe Pro Leu Ser Lys Glu Ala Pro Glu Glu His Gln Val
145 150 155 160
Val His Gln Pro Phe Pro Arg Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr Gly His
165 170 175
Pro Ser Leu Gln Arg Asp Gly Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Pro
180 185 190
Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn Pro Asn
195 200 205
Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu Ala Glu
210 215 220
Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg Thr Asn
245 250 255
Ser Gly Asp Gln Asp Asp Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp Ser Asn
260 265 270
Phe Leu Ser Val Pro Arg Gly Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly His Arg
275 280 285
Thr Phe Glu Thr Lys Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp Gly Glu
290 295 300
Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly
305 310 315 320
Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala Thr Glu
325 330 335
Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp Thr Phe
340 345 350
Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu Glu Phe
355 360 365
Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp
370 375 380
Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile
385 390 395 400
Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr
405 410 415
Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp
420 425 430
Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr
435 440 445
Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu
450 455 460
Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala
485 490 495
Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly
500 505 510
Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys
515 520 525
Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu
530 535 540
Ala Arg Glu Tyr
545
<210> 50
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> bacISM1287-461
<400> 50
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Gly Ser Met Ser
1 5 10 15
Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val
20 25 30
Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu
35 40 45
Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu
50 55 60
Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp
85 90 95
Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100 105 110
Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser
115 120 125
Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser
130 135 140
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
145 150 155 160
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
165 170 175
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
180 185 190
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
195 200 205
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
210 215 220
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
225 230 235 240
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
245 250 255
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
260 265 270
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr
275 280 285
<210> 51
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mamISM126-461
<400> 51
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gln Asp Ala Ala Ala Gly Asn
20 25 30
Val Ser Gly Ser Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Leu Glu Ser Asp Ser
35 40 45
Thr Ser Glu Thr Ser Phe Pro Leu Ser Lys Glu Ala Pro Glu Glu His
50 55 60
Gln Val Val His Gln Pro Phe Pro Arg Gln Arg Phe Pro Pro Glu Thr
65 70 75 80
Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Gly Pro Arg Ser Phe Leu Leu Asp
85 90 95
Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln Asn
100 105 110
Pro Asn Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro Asp Ser Glu
115 120 125
Ala Glu Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp Ser Leu Pro
130 135 140
Ala Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala Arg
145 150 155 160
Thr Asn Ser Gly Asp Gln Asp Asp Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp Asp
165 170 175
Ser Asn Phe Leu Ser Val Pro Arg Gly Trp Asp Arg Pro Ala Pro Gly
180 185 190
His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr Asp
195 200 205
Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys Gly
210 215 220
Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Ile Ala
225 230 235 240
Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu Asp
245 250 255
Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser Glu
260 265 270
Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu
275 280 285
Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys
290 295 300
Val Ile Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe
325 330 335
Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys
340 345 350
Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr
355 360 365
Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile
370 375 380
Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe
385 390 395 400
Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys
405 410 415
Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly
420 425 430
Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe
435 440 445
Gln Glu Ala Arg Glu Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile
450 455 460
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
465 470 475 480
<210> 52
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mamISM1287-461
<400> 52
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Phe Glu Val Asp Met Asp Ser Cys Glu Arg Trp Met
20 25 30
Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His Lys Val Ile Asn
35 40 45
Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser
50 55 60
Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys
65 70 75 80
Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala
85 90 95
Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala
100 105 110
Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly
115 120 125
Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu
130 135 140
Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp
145 150 155 160
Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys
165 170 175
Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala
180 185 190
Arg Glu Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
195 200 205
Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
210 215 220
<210> 53
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mamISM126-464
<400> 53
Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ser Gly Ala Ala Asp Gly Pro Asp Ala Ala Ala Gly Asn
20 25 30
Ala Ser Gln Ala Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Val Gly Ser Asp Thr
35 40 45
Thr Ser Glu Thr Ser Phe Ser Leu Ser Lys Glu Ala Pro Arg Glu His
50 55 60
Leu Asp His Gln Ala Ala His Gln Pro Phe Pro Arg Pro Arg Phe Arg
65 70 75 80
Gln Glu Thr Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Phe Pro Arg Ser Phe
85 90 95
Leu Leu Asp Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn
100 105 110
Gly Gln Asn Pro Asn Ile Gln Val Thr Ile Glu Val Val Asp Gly Pro
115 120 125
Asp Ser Glu Ala Asp Lys Asp Gln His Pro Glu Asn Lys Pro Ser Trp
130 135 140
Ser Val Pro Ser Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser
145 150 155 160
Leu Ala Arg Ala Asn Ser Gly Asp Gln Asp Tyr Lys Tyr Asp Ser Thr
165 170 175
Ser Asp Asp Ser Asn Phe Leu Asn Pro Pro Arg Gly Trp Asp His Thr
180 185 190
Ala Pro Gly His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Asp Gln Pro Glu Tyr Asp
195 200 205
Ser Thr Asp Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val
210 215 220
Thr Cys Gly Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala
225 230 235 240
Cys Thr Ala Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly
245 250 255
Ile Glu Asp Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala
260 265 270
Gly Ser Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Thr Asp
275 280 285
Ser Cys Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr
290 295 300
Met His Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg
325 330 335
Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu
340 345 350
Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu
355 360 365
Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met
370 375 380
Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser
385 390 395 400
Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp
405 410 415
Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Pro Pro
420 425 430
Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asp Glu Asp Tyr Ile
435 440 445
Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln
450 455 460
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His
465 470 475 480
His His His
<210> 54
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> bacISM126-464
<400> 54
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Gly Ser Met Ser
1 5 10 15
Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val
20 25 30
Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu
35 40 45
Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu
50 55 60
Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp
85 90 95
Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Gly Pro Asp Ala Ala Ala Gly Asn Ala Ser
115 120 125
Gln Ala Gln Leu Gln Asn Asn Leu Asn Val Gly Ser Asp Thr Thr Ser
130 135 140
Glu Thr Ser Phe Ser Leu Ser Lys Glu Ala Pro Arg Glu His Leu Asp
145 150 155 160
His Gln Ala Ala His Gln Pro Phe Pro Arg Pro Arg Phe Arg Gln Glu
165 170 175
Thr Gly His Pro Ser Leu Gln Arg Asp Phe Pro Arg Ser Phe Leu Leu
180 185 190
Asp Leu Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Asp Ile Asn Gly Gln
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ser Pro Asp Trp Arg Ala Trp Trp Gln Arg Ser Leu Ser Leu Ala
245 250 255
Arg Ala Asn Ser Gly Asp Gln Asp Tyr Lys Tyr Asp Ser Thr Ser Asp
260 265 270
Asp Ser Asn Phe Leu Asn Pro Pro Arg Gly Trp Asp His Thr Ala Pro
275 280 285
Gly His Arg Thr Phe Glu Thr Lys Asp Gln Pro Glu Tyr Asp Ser Thr
290 295 300
Asp Gly Glu Gly Asp Trp Ser Leu Trp Ser Val Cys Ser Val Thr Cys
305 310 315 320
Gly Asn Gly Asn Gln Lys Arg Thr Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Thr
325 330 335
Ala Thr Glu Ser Arg Thr Cys Asp Arg Pro Asn Cys Pro Gly Ile Glu
340 345 350
Asp Thr Phe Arg Thr Ala Ala Thr Glu Val Ser Leu Leu Ala Gly Ser
355 360 365
Glu Glu Phe Asn Ala Thr Lys Leu Phe Glu Val Asp Thr Asp Ser Cys
370 375 380
Glu Arg Trp Met Ser Cys Lys Ser Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Met His
385 390 395 400
Lys Val Met Asn Asp Leu Pro Ser Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu
405 410 415
Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp
420 425 430
Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr
435 440 445
Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser
450 455 460
Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu
465 470 475 480
Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu
485 490 495
Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile
500 505 510
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545 550 555
<210> 55
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> bacISM1290-464
<400> 55
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Gly Ser Met Ser
1 5 10 15
Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val
20 25 30
Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
Cys Pro Cys Ser Tyr Pro Thr Glu Val Ala Tyr Ser Thr Ala Asp Ile
145 150 155 160
Phe Asp Arg Ile Lys Arg Lys Asp Phe Arg Trp Lys Asp Ala Ser Gly
165 170 175
Pro Lys Glu Lys Leu Glu Ile Tyr Lys Pro Thr Ala Arg Tyr Cys Ile
180 185 190
Arg Ser Met Leu Ser Leu Glu Ser Thr Thr Leu Ala Ala Gln His Cys
195 200 205
Cys Tyr Gly Asp Asn Met Gln Leu Ile Thr Arg Gly Lys Gly Ala Gly
210 215 220
Thr Pro Asn Leu Ile Ser Thr Glu Phe Ser Ala Glu Leu His Tyr Lys
225 230 235 240
Val Asp Val Leu Pro Trp Ile Ile Cys Lys Gly Asp Trp Ser Arg Tyr
245 250 255
Asn Glu Ala Arg Pro Pro Asn Asn Gly Gln Lys Cys Thr Glu Ser Pro
260 265 270
Ser Asp Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Phe Gln Glu Ala Arg Glu Tyr Asp
275 280 285
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
290 295

Claims (29)

1.一种用于治疗肺部炎症的组合物，包含：
多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸，所述多肽或肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和
药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
所述组合物被配制用于向受试者的肺部给药。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于气管内给药、鼻内给药或吸入给药。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物被配制为干粉以用于通过气雾化向肺部给药，或被配制为液体以用于通过雾化向肺部给药。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，所述组合物在对其有需要的受试者中，用于在靶向csGRP78中使用；用于在促炎细胞中诱导凋亡中使用；用于在肺泡巨噬细胞(AM)中诱导凋亡中使用；用于降低AM水平；用于治疗、改善或预防肺部炎症；用于维持肺部稳态；用于消退肺部炎症；用于促进肺部修复，同时减少重塑；用于在治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；用于治疗、改善或预防哮喘中使用；用于在治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿中使用；用于在治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中使用；用于在预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖中使用；用于在治疗、改善或预防肺纤维化中使用；或它们的任何组合。
6.一种方法，所述方法在对其有需要的受试者中用于调节GRP78活性；用于靶向并且结合至GRP78；用于诱导促炎细胞凋亡；用于诱导肺泡巨噬细胞(AM)凋亡；用于降低AM水平；用于治疗、改善或预防肺部炎症；用于维持肺部稳态；用于消退肺部炎症；用于促进肺部修复，同时减少重塑；用于治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症；用于治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿；用于在对其有需要的受试者中治疗、改善或预防哮喘；用于治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；用于预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖；用于治疗、改善或预防肺纤维化；或它们的任何组合，所述方法包括：
向对其有需要的受试者给药多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸，所述多肽或肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述多肽或肽或核酸用于向对其有需要的受试者的肺部给药。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述多肽或肽或核酸用于向所述受试者气管内给药、鼻内给药或吸入给药。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中，所述多肽或肽或核酸用于作为气雾剂、吸入器或喷雾器给药。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中，所述多肽或肽或核酸被配制为干粉以用于通过气雾化向肺部给药，或被配制为液体以用于通过雾化向肺部给药。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
确定所述受试者中的ISM1水平，确定所述受试者中的GRP78蛋白水平，或两者；和
在以下情况下，进行或重复所述给药步骤：在确定出所述受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平降低的ISM1水平的情况下；在确定出所述受试者中相对于健康对照水平或相对于低严重度疾病对照水平升高的GRP78蛋白水平的情况下，或两者。
12.一种肺部药物递送装置，包含多肽或肽、或编码所述多肽或肽的可表达核酸，所述多肽或肽包含与Isthmin 1(ISM1)蛋白或其GRP78-激活片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的肺部药物递送装置，其中，所述肺部药物递送装置包含权利要求1至5中任一项定义的组合物。
14.根据权利要求12或13所述的肺部药物递送装置，其中，所述肺部药物递送装置为气管内药物递送装置、鼻内药物递送装置或吸入药物递送装置。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述肺部药物递送装置为气雾剂、吸入器或喷雾器。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述肺部药物递送装置为气雾剂，并且所述多肽或肽或核酸被配制为干粉，或者
其中，所述肺部药物递送装置为喷雾器，并且所述多肽或肽或核酸被配制为液体。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的肺部药物递送装置，所述肺部药物递送装置在对其有需要的受试者中，用于在调节GRP78活性中使用；用于在促炎细胞中诱导凋亡中使用；用于在肺泡巨噬细胞(AM)中诱导凋亡中使用；用于降低AM水平；用于在治疗、改善或预防肺部炎症中使用；用于维持肺部稳态；用于消退肺部炎症；用于促进肺部修复，同时减少重塑；用于在治疗、改善或预防与肺部炎症相关的肺部疾病或病症中使用；用于在治疗、改善或预防哮喘中使用；用于在治疗、改善或预防慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性阻塞性支气管炎或肺气肿中使用；用于在治疗、改善或预防急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中使用；用于在预防或减少肺泡壁表面II型(AE2)细胞过度增殖中使用；用于在治疗、改善或预防肺纤维化中使用；或它们的任何组合。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述肺部药物递送装置为喷雾器、计量剂量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI)。
19.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，根据权利要求6至11中任一项所述的方法，或根据权利要求12至18中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述多肽为ISM1蛋白或包含ISM1蛋白。
20.根据权利要求19所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽为人类ISM1蛋白或小鼠ISM1蛋白，或包含人类ISM1蛋白或小鼠ISM1蛋白。
21.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，根据权利要求6至11中任一项所述的方法，或根据权利要求12至18中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:26)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:27)；
或与所述氨基酸序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25)；
或与所述氨基酸序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求21或22所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽包含内源性成熟ISM1的序列。
24.根据权利要求21或22所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽不是内源性前体或成熟的ISM1。
25.根据权利要求21或22所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽长于或短于内源性前体或成熟的ISM1。
26.根据权利要求21或22所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽包含在内源性前体或成熟ISM1中未发现的至少一个取代或突变。
27.根据权利要求26所述的组合物、方法或肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽在SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27中包含RKD至RAA突变或RKD至AAA突变。
28.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，根据权利要求6至11中任一项所述的方法，或根据权利要求12至18中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25)；
或与所述氨基酸序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，根据权利要求6至11中任一项所述的方法，或根据权利要求12至18中任一项所述的肺部药物递送装置，其中，所述多肽或肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:26)；
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:24)；
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE(SEQ ID NO:27)；或
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY(SEQ ID NO:25)；
或与所述氨基酸序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其GRP78-激活片段；并且
其中，所述肽或多肽在SEQ ID No:24-27任一个的N-末端不包含氨基酸序列EVSLLAGSEEFNATKL，或者完全不包含序列EVSLLAGSEEFNATKL。
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