JP2022524370A - 肺炎症治療用イスミン１ - Google Patents

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Abstract

イスミン１（Ｉｓｔｈｍｉｎ １：ＩＳＭ１）又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸が提供される。これらの薬剤の使用、及び、肺胞マクロファージにおけるアポトーシスの誘導方法、及び／又は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、喘息、急性肺損傷（ＡＬＩ）、肺繊維症及び／又は急性呼吸窮迫症候群などの炎症又は肺疾患を治療、改善又は予防する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、全体として、炎症の治療に関する。特に、本発明は、イスミン１（Ｉｓｔｈｍｉｎ １：ＩＳＭ１）に基づく肺炎症の治療に関する。
肺の炎症は、急性であれ慢性であれ、健康上の深刻な影響をもたらすことがある。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、２０１６年において三番目に多い死因であった。これは、２００４年に米国だけで、総計２００億米ドルに上る直接的な医療費を伴う、主要な社会経済的及び健康上の負担と考えられる。シンガポールでは、ＣＯＰＤは年間１６５，０００，０００シンガポールドルもの費用が患者及び医療機関にかかり、２０１０年には１０，０００を超える入院が発生し、公的医療制度にとってかなりの負担となっていると推定される。ＣＯＰＤは、進行性肺気腫（肺胞の不可逆的な拡張又は肺胞壁の破壊）及び慢性呼吸器炎症を特徴とし、肺機能の深刻な衰えを引き起こす可能性がある。現在、肺気腫を遅らせる／逆転させる有効な治療法はない。喫煙はＣＯＰＤの主要危険因子である可能性があり、ＣＯＰＤの進行及び悪化と密接に関係している。その他の危険因子は、空気汚染を含む場合がある。
現在、ＣＯＰＤは世界で三番目に多い死因であり、２５％の推定累積生涯リスクと、高い社会経済的負担を伴う（Gershon, Warner et al., 2011, Mortality & Causes of Death, 2016）。ＣＯＰＤの病態形成は、肺の恒常性の混乱と、環境からの外因性物質に対する調節不全の免疫応答を伴うと考えられており、主な危険因子として、たばこ煙（ＣＳ）、バイオマス燃料への曝露及び空気汚染を含む（Singh, Agusti et al., 2019）。ＣＯＰＤは、肺気腫と慢性閉塞性気管支炎（気道の炎症）を特徴として含む。ＣＯＰＤ患者は、進行性の長期的な肺機能障害を伴う持続的な呼吸器症状を呈する。しかしながら、従来の薬理学的介入は、患者の症候を軽減するのみで、根底にある組織の損傷や炎症を対象としないため、ＣＯＰＤの進行を効果的に阻害したり、死亡率を減少させることができない。したがって、新しいＣＯＰＤ治療法に対する、緊急で未だ満たされていない（アンメット）ニーズがある。
気道は、ほこりや微生物を含む外的環境に常にさらされている。周囲の環境刺激に対する炎症反応を防ぐため、健康な気道と肺は、免疫応答と炎症を阻害するメカニズムを有する。さらに、外傷や病原体に対して、急性肺炎症反応は、宿主を全身感染から保護し、組織の恒常性を修復する。しかしながら、急性炎症の広さや持続期間が抑制されていない場合、喘息及び／又はＣＯＰＤを含む重度又は慢性の炎症を特徴とする肺疾患につながる可能性がある。喘息は主に大気道に影響を及ぼすが、ＣＯＰＤは小気道と肺実質に影響を及ぼす。ＣＯＰＤの分子メカニズムは、ほとんど解明されていない。
一方、感染症や外傷による急性肺損傷（ＡＬＩ）及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの重度の急性肺炎症は、有効な薬物治療法のない、最大５０％の死亡率を伴う重篤な臨床症候群である。急性及び慢性肺炎症の治療法の開発には、未だ満たされていないニーズがある。
炎症に関連する疾患や障害、特に肺を冒すものに対する代替、追加及び／又は改善された治療及び／又は治療方法が望ましい。
健康な成人は、周囲の環境条件下、肺の恒常性を調節及び維持する能力を有し、無菌性の炎症を防いでいる。免疫応答は、外傷及び／又は感染症によって引き起こされ、急性炎症を引き起こし、最終的に消退し、傷の治癒と回復を可能にする。急性炎症の消退に失敗すると、慢性炎症及び／又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性閉塞性気管支炎及び／又は肺線維症などの炎症関連疾患につながる可能性がある。急性肺損傷（ＡＬＩ）や急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの急性肺疾患も、肺の炎症に関連している。
本明細書に詳細に記載されているように、本発明者らは、肺炎症などの炎症を治療するための、イスミン１由来のポリペプチド、核酸、組成物及び方法を開発した。イスミン１は、炎症、特に肺炎症を阻害、抑制及び／又は消退させる役割を果たす分泌タンパク質であることが本明細書に記載の研究によって示されている。本明細書に記載の研究において、外因性組換えＩＳＭ１タンパク質（ｒＩＳＭ１）を肺に補給することで、ＩＳＭ１欠乏性の肺における肺炎症の表現型が阻害され、その結果は、ＩＳＭ１が肺胞マクロファージのアポトーシスを誘導することによって、炎症を消退させることに役立つ可能性があると示す。結果は、無菌性肺炎症及び／又は感染症及び／又は外傷によって引き起こされる炎症の抑制及び／又は消退に、ＩＳＭ１が重要な役割を果たすこと示す。
実施形態において、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸、及び
薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、
を含む組成物であって、
対象の肺に投与するために処方されることを特徴とする組成物が提供される。
上記組成物の別の実施形態において、前記組成物は、気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与のために処方されてもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するために処方されてもよい。また、いずれかの上記組成物の別の実施形態において、前記組成物は、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されてもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）を標的化するために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため、又は、ＡＭレベルを低下させるために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎、喘息又は肺気腫を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるために使用してもよい。
上記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため、又は、ＡＭレベルを低下させるための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎、喘息又は肺気腫を治療、改善又は予防するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
上記使用のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、対象の肺に投与するためであってもよい。
上記使用のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、対象に気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与するためであってもよい。
上記使用のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するためであってもよい。
上記使用のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されてもよい。
別の実施形態において、それを必要とする対象において、ＧＲＰ７８活性を調節するため、ＧＲＰ７８を標的化し結合するため、又はその両方のための方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため、又は、ＡＭレベルを低下させるための方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防する方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防する方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎、喘息又は肺気腫を治療、改善又は予防する方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防する方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させる方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防する方法であって、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
上記方法のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、それを必要とする対象の肺に投与するためであってもよい。
上記方法のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、対象に気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与するためであってもよい。
上記方法のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するためであってもよい。
上記方法のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されてもよい。
上記方法のいずれかの別の実施形態において、さらに
対象におけるＩＳＭ１レベルを判定する、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定する、又はその両方を行う工程と、
健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定される場合、健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定される場合、又はその両方の場合に、投与工程を行う又は繰り返す工程を含んでもよい。
別の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を含む、経肺ドラッグデリバリー（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）装置が提供される。
前記経肺ドラッグデリバリー装置の別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、本明細書に規定される組成物を含んでもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、気管内ドラッグデリバリー装置、鼻腔内ドラッグデリバリー装置又は吸入ドラッグデリバリー装置であってもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、エアゾール、吸入器又はネブライザーであってもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置はエアゾールであってもよく、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は乾燥粉末として処方されてもよい、又は、前記経肺ドラッグデリバリー装置はネブライザーであってもよく、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は液体として処方されてもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため、又は、ＡＭレベルを低下させるために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎、喘息又は肺気腫を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するために使用してもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、ネブライザー、定量噴霧吸入器（ＭＤＩ）又はドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）であってもよい。
前記組成物のいずれかの別の実施形態において、前記組成物は肺炎症を予防又は軽減するための薬剤を含んでもよい。
前記使用のいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸は、肺炎症を予防又は軽減するための薬剤と組み合わせて使用してもよい。
前記方法のいずれかの別の実施形態において、前記方法はさらに、肺炎症を予防又は軽減するための薬剤を、前記ポリペプチド又はペプチド又は核酸と組み合わせて、同時に、又は、連続して対象に投与する工程を含んでもよい。
前記経肺ドラッグデリバリー装置のいずれかの別の実施形態において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、肺炎症を予防又は軽減するための薬剤をさらに含んでもよい。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するために使用される、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、対象に投与することを含む。
別の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の、薬剤の製造における使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
ＧＲＰ７８活性剤を対象の肺に投与することを含む。
別の実施形態において、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有する、又は、発症するリスクがある対象を特定する方法が提供され、前記方法は、
対象におけるＩＳＭ１レベルを判定する、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定する、又はその両方を行うことと、
健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定される場合、健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定される場合、又はその両方の場合に、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有する、又は、発症するリスクがあると対象を特定すること、を含む。
別の実施形態において、本明細書に規定される方法で治療する候補対象を特定する方法が提供され、前記方法は
対象におけるＩＳＭ１レベルを判定する、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定する、又はその両方を行うことと、
健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定される場合、健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定される場合、又はその両方の場合に、対象を治療の候補対象として特定することを含む。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺の恒常性を維持するため、及び／又は、肺の炎症を消退させるため、及び／又は、肺の修復を促進してリモデリングを軽減するための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺の恒常性を維持する、及び／又は、肺の炎症を消退させる、及び／又は、肺の修復を促進してリモデリングを軽減するための方法が提供され、前記方法は
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、対象の肺に投与することを含む。
上記組成物、使用、方法、経肺ドラッグデリバリー装置又はポリペプチドのいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチドは、ＩＳＭ１タンパク質（前駆体又は成熟したもの）であってもよいし、それを含んでもよい。別の実施形態において、前記ポリペプチドは、ヒトＩＳＭ１タンパク質又はマウスＩＳＭ１タンパク質（前駆体又は成熟したもの）であってもよいし、それを含んでもよい。
上記組成物、使用、方法、経肺ドラッグデリバリー装置、ポリペプチド又はペプチドのいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE (配列番号２６)；又は
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE (配列番号２７)、
又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれからなるものでもよい。
上記組成物、使用、方法、経肺ドラッグデリバリー装置、ポリペプチド又はペプチドのいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY (配列番号２４：マウスＩＳＭ１ ２８７－４６１)；又は
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY (配列番号２５：ヒトＩＳＭ１ ２９０－４６４)；
又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれからなるものでもよい。
上記組成物、使用、方法、経肺ドラッグデリバリー装置、ポリペプチド又はペプチドのいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性成熟ＩＳＭ１の配列を含む、又は、それからなるものでもよい。
上記組成物、使用、方法、経肺ドラッグデリバリー装置、ポリペプチド又はペプチドのいずれかの別の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性前駆体又は成熟ＩＳＭ１でなくてもよい。特定の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性前駆体又は成熟ＩＳＭ１より長くても、短くてもよい。特定の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性前駆体又は成熟ＩＳＭ１において存在しない少なくとも一つの置換又は変異を含んでもよい。特定の実施形態において、前記ポリペプチド又はペプチドは、配列番号２４又は配列番号２５又は配列番号２６又は配列番号２７において、ＲＫＤからＲＡＡ変異、又は、ＲＫＤからＡＡＡ変異を含んでもよい。
これら及びその他の特徴は、添付の図面を参照する以下の記載から、より明確になるであろう。
図１ａ～ｎは、ＩＳＭ１の減少が肺気腫を引き起こしたことを示す。図１ａと図１ｂは、月齢１カ月、２カ月、６カ月及び９カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスのヘマトキシリン・エオジン染色された末梢左肺葉（１ａ）の代表的な顕微鏡写真と、平均肺胞径（ＭＬＩ）（１ｂ）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝３～４。スケールバー：２００μｍ。図１ｃと図１ｄは、月齢６カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの左肺葉（１ｃ）と、エラスチン／コラーゲン標識した左肺葉（１ｄ）の代表的なホールマウント立体画像である。１グループあたり、マウスｎ＝３。スケールバー：５００μｍ（１ｃ）、２００μｍ（１ｄ）。図１ｅは、月齢９カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１＋/Δマウスのヘマトキシリン・エオジン染色された末梢左肺葉の代表的な顕微鏡写真である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２００μｍ。図１ｆは、月齢９カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ、Ｉｓｍ１＋/Δ及びＩｓｍ１Δ/ΔマウスのＭＬＩを示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。図１ｇ～１ｎは、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスのスパイロメトリーを示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。全肺気量（ＴＬＣ）（１ｇ）、機能的残気量（ＦＲＣ）（１ｈ）、残気量（ＲＶ）（１ｉ）、静的コンプライアンス（Ｃｃｈｏｒｄ）（１ｊ）、動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）（１ｋ）、１００ｍｓでの努力吸気量（ＦＥＶ１００）（１ｌ）、Ｔｉｆｆｅｎｅａｕ－Ｐｉｎｅｌｌｉ指標（ＦＥＶ１００／ＦＶＣ）（１ｍ）及び気道抵抗（ＲＩ）（１ｎ）を示す。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）（１ｂ、１ｇ～１ｎ）と、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定（Ｔｕｒｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）（１ｆ）で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図２は、Ｉｓｍ１Δ/Δのマウスの肺が、アップレギュレートしたＣＯＰＤメディエーターを表すことを示す。（Ａ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける肺胞マクロファージ（ＡＭ）の集積を示す、ヘマトキシリン・エオジン染色された肺の代表的な顕微鏡写真である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｂ）及び（Ｃ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺から採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞の、Ｌｉｕ染色されたサイトスピンの標本（Ｂ）と、定量化（Ｃ）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。（Ｂ）～（Ｄ）は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞のサイトスピン及びフローサイトメトリー解析の両方によって、ＷＴマウスと比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるＡＭの増加が確認されたことを示す。（Ｅ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－９、ＮＦ－κＢ ｐ６５及びローディングコントロールとしてのβアクチンのウエスタンブロット（上）と倍率変化（下；Ａ．Ｕ．、任意単位）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。（Ｆ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺のＡＭにおけるＭＭＰ－１２とＭＭＰ－９の代表的な免疫組織化学染色である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｇ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスから分離された一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ＡＭにおける、ＮＦ－κＢ ｐ６５（緑）と核（ＤＡＰＩ；青）の代表的な蛍光免疫染色（左）と、定量化（右）を示す。１グループあたり、３匹のマウスから得られた平均測定値（ｎ＝３）。スケールバー：２０μｍ。マウス１匹あたり、２５０～３５０の肺胞マクロファージを定量化。（Ｈ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦとローディングコントロールとしてのβアクチンのウエスタンブロット（上）と倍率変化（下；Ａ．Ｕ．、任意単位）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。（Ｉ）と（Ｊ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/ΔマウスのＡＭにおける、ＩＳＭ１（Ｉ）とＧＲＰ７８（Ｊ）の代表的な免疫組織化学染色である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｋ）と（Ｌ）は、１μＭの組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）で処理されたＷＴ一次ＡＭ（Ｋ）、及び、未処理のＷＴとＩｓｍ１Δ/Δ一次ＡＭ（Ｌ）における、アポトーシスのＩｎｃｕＣｙｔｅ定量化を示す。解析は三重又は四重のウェルで行い、定量化のため１つのウェルあたり４枚の画像を撮影した。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定（Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｌ及びＭ）で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図３は、外因性ｒＩＳＭ１が、Ｉｓｍ１Δ/Δ及びたばこ煙に曝露したマウスにおける肺気腫を軽減することを示す。（Ａ）は、溶媒（ＰＢＳ）、１μｇのｒＩＳＭ１、５μｇのｒＩＳＭ１及びクロドロン酸リポソーム（ＣＬＯ）で処理された後の、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスのＡＭ数を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。（Ｂ）は、溶媒（ＰＢＳ）、５μｇのｒＩＳＭ１又はクロドロン酸リポソーム（ＣＬＯ）で処理された後の、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスのヘマトキシリン・エオジン染色された肺の代表的な顕微鏡写真である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ）と（Ｄ）は、（Ｂ）の処理されたマウスグループと、未処理の月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスとを比較した、ＭＬＩ（Ｃ）及びＦＥＶ１００／ＦＶＣ（Ｄ）の定量化を示す。１グループあたり、マウスｎ＝３～４。（Ｅ）と（Ｆ）は、ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃ（ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃ）マウスにおける、二週（Ｅ）及び八週（Ｆ）のたばこ煙誘発性ＣＯＰＤモデルの実験的設計を示す。室内空気に曝露したＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓｈａｍ）、及び、たばこ煙に曝露したＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＳ）と、示した頻度と間隔で溶媒（ＣＳ＋ＰＢＳ）又はｒＩＳＭ１（ＣＳ＋１０μｇのｒＩＳＭ１）で処理したマウス。１グループあたり、マウスｎ＝５。（Ｇ）は、（Ｅ）の実験グループから採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞の定量化を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４～５。（Ｈ）は、（Ｆ）の実験グループのヘマトキシリン・エオジン染色された肺の代表的な顕微鏡写真であり、免疫細胞湿潤物を示す。１グループあたり、マウスｎ＝５。スケールバー：５０μｍ。（Ｉ）～（Ｌ）は、（Ｆ）の実験グループのＡＭ（Ｉ）、ＭＭＰ－１２発現（Ｊ）、ＭＬＩ（Ｋ）及びＦＥＶ１００／ＦＶＣ（Ｌ）の定量化を示す。１グループあたり、マウスｎ＝５。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定（Ｃ、Ｄ、未処理の月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウス）と、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ～Ｌ）で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＃：Ｓｈａｍグループと比べて有意差なし。 図４は、ヒトＩＳＭ１発現がＡＭアポトーシスと相関することを示す。（Ａ）と（Ｂ）は、ヒトＩＳＭ１（ｈＩＳＭ１）（Ａ）の代表的な免疫組織化学染色と、切除したヒトの肺組織切片のＡＭにおけるＣＤ６８（赤）、ｈＩＳＭ１（緑）及び核（ＤＡＰＩ、青）の蛍光免疫染色である。スケールバー：２０μｍ。（Ｃ）は、ＩＨＣ染色強度（Ａ）及びヒトＡＭにおける発現頻度（Ｂ）に由来する、ｈＩＳＭ１発現のマトリックステーブルを示す。ｈＩＳＭ１発現は、マトリックススコア１～３：＋、４～６：＋＋、９：＋＋＋によって注釈を付けた。（Ｄ）は、喫煙及びＣＯＰＤステータスで層別化した患者におけるｈＩＳＭ１発現の百分率分布を示す。（Ｅ）と（Ｆ）は、ｈＩＳＭ１発現と、喫煙（Ｅ）及びＡＭアポトーシス（Ｆ）との相関を示す。（Ｇ）は、非ＣＯＰＤ患者とＣＯＰＤ患者におけるＧＲＰ７８の代表的な免疫組織化学染色である。スケールバー：２０μｍ。（Ｈ）は、ＣＯＰＤステータスとｈＩＳＭ１発現で層別化したＣＯＰＤ患者におけるアポトーシス性ＡＭの百分率を示す。データは平均値の標準誤差であり、点双列相関（Ｅ）、ピアソン相関（Ｆ）及びｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定（Ｈ）で解析した。＊Ｐ＜０．０５。患者サンプルサイズはグラフに示す。 図５は、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの特徴を示す。（Ａ）と（Ｂ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ（Ａ）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ）ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスにおける、肺気腫の病理学グレーディングを示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。（Ｃ）と（Ｄ）は、月齢２カ月、６カ月及び９カ月のＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの、ヘマトキシリン・エオジン染色された末梢左肺葉の代表的な顕微鏡写真（Ｃ）及び平均肺胞径（ＭＬＩ）（Ｄ）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）と（Ｆ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける、エラスチン（黒）とコラーゲン（赤）の減少を示すヴァーヘフ－ワンギーソン（Ｖｅｒｈｏｅｆｆ－Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ：ＶＶＧ）染色された肺（Ｅ）と、粘液分泌過多（赤）を示す過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色された気道（Ｆ）の代表的な顕微鏡写真である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｇ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスにおける、気管支上皮細胞の高さ（左）と細胞数（右）の測定値を示す。マウス１匹あたり８～１０の小気道から得られた平均測定値（ｎ＝３４～３８）、１グループあたりマウス４匹。（Ｈ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＴＧＦ－β１、ＶＥＧＦ－Ａ、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）及びローディングコントロールとしてのβアクチンのウエスタンブロット（上）と倍率変化（下；Ａ．Ｕ．、任意単位）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｉ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺のＡＭにおける、ＴＧＦ－β１及びＶＥＧＦ－Ａの代表的な免疫組織化学染色である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｊ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、相対的血中活性酸素種（ＲＯＳ）の定量化を示す。ＩＳＭ１欠乏性肺の特異性を示すため、脳組織（ＩＳＭ１発現に対して陽性）をコントロールとして用いた。１グループあたり、マウスｎ＝３。（Ｋ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、相対的サイトカイン発現のヒートマップである。ＷＴマウスｎ＝３、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスｎ＝６。（Ｌ）は、Ｐ１ ＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦ（赤）と核（ＤＡＰＩ；青）の代表的な蛍光免疫染色（左）である。１グループあたり、マウスｎ＝４。（Ｍ）は、Ｐ１ ＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦ及びローディングコントロールとしてのβアクチンのウエスタンブロット（上）と倍率変化（下；Ａ．Ｕ．、任意単位）を示す。１グループあたり、マウスｎ＝８～９。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定（Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＭ）で解析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｎ）は、月齢１カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦのアップレギュレーションを先行した、ＭＭＰ－１２の増加を示す。 図６は、ＩＳＭ１が、細胞表面ＧＲＰ７８を通じて肺胞マクロファージアポトーシスを誘導することを示す。（Ａ）は、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴマウスの肺における、ＩＳＭ１（緑）と核（ＤＡＰＩ；青）を発現するＡＭ（ＣＤ６８、赤）の代表的な蛍光免疫染色である。スケールバー：１０μｍ。（Ｂ）は、月齢２カ月のＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃマウスの肺における、アンチセンスｉｓｍ１を用いた代表的なｉｎ－ｓｉｔｕのハイブリダイゼーションを示し、挿入図として、気管支上皮と肺胞マクロファージにおけるＩＳＭ１発現を示す。（Ｃ）～（Ｅ）は、１μＭのｒＩＳＭ１処理後の、ｒＩＳＭ１（赤）とＧＲＰ７８（緑）の共局在（Ｃ及びＤ）及び切断型カスパーゼ３（ＣＣＰ３）（Ｅ）の１次ＡＭの代表的な共焦点画像である。核はＤＡＰＩ（青）で染色。スケールバー：５μｍ。（Ｆ）と（Ｇ）は、タプシガルギン（ＴＧ）前処理及び１μＭのｒＩＳＭ１処理（Ｆ）と、ＧＲＰ７８抗体中和（Ｇ）後の、ＭＨ－Ｓ細胞におけるアポトーシスのＩｎｃｕＣｙｔｅ定量化である。処理条件は示した通り。解析は三重のウェルで行い、定量化のため１つのウェルあたり４枚の画像を撮影した。データは平均値の標準誤差であり、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定（Ｆ及びＧ）で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図７は、外因性ｒＩＳＭ１が、Ｉｓｍ１Δ/Δ及びたばこ煙曝露マウスにおける肺気腫を軽減することを示す。（Ａ）と（Ｂ）は、ＰＢＳとｒＩＳＭ１で処理したＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスのＡＭにおけるｒＩＳＭ１（Ａ）と切断型カスパーゼ３（ＣＣＰ３、緑）（Ｂ）の代表的な免疫染色である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：１０μｍ（Ａ）、２０μｍ（Ｂ）。（Ｃ）と（Ｄ）は、ＰＢＳ、５μｇのｒＩＳＭ１又はクロドロン酸リポソーム（ＣＬＯ）処理後のＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ、赤）、ＰＣＮＡ（緑）、核（ＤＡＰＩ、青）の代表的な蛍光免疫染色（Ｃ）及び定量化（Ｄ）である。１グループあたり、フィールドｎ＝３４～４０。１つのマウスの肺あたり、９～１０枚のランダム画像が撮影された。スケールバー：２０μｍ。（Ｅ）は、溶媒（ＣＳ＋ＰＢＳ）又はｒＩＳＭ１（ＣＳ＋１０μｇのｒＩＳＭ１）で処理された、室内空気曝露（Ｓｈａｍ）及びたばこ煙曝露のＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃ（ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃ）マウス（ｃｓ）のヘマトキシリン・エオジン染色された肺の代表的な顕微鏡写真である。１グループあたり、マウスｎ＝５。スケールバー：１００μｍ。（Ｆ）は、（Ｅ）のＰＢＳとｒＩＳＭ１で処理されたＣＳマウスの肺におけるＣＣＰ３（緑）の代表的な蛍光免疫染色である。１グループあたり、マウスｎ＝５。スケールバー：２０μｍ。（Ｇ）～（Ｊ）は、（Ｅ）のＣＯＰＤマウスの肺好中球数（Ｇ）とスパイロメトリー（Ｈ～Ｊ）の定量化を示す。全肺気量（ＴＬＣ）（Ｈ）、静的コンプライアンス（Ｃｃｈｏｒｄ）（Ｉ）及び呼吸仕事量（ＷＯＢ）（Ｊ）。データは平均値の標準誤差であり、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定（Ｄ、Ｇ～Ｊ）で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｓｈａｍグループと比べて有意差なし。 図８は、ＣＯＰＤ患者とたばこ煙曝露マウスにおけるＩＳＭ１発現を示す。（Ａ）は、空ベクター（ＥＶ）又はｈＩＳＭ１過剰発現（ｈＩＳＭ１－ＯＥ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における、ａｎｔｉ－ｈＩＳＭ１又はマウスＩｇＧアイソタイプコントロールの代表的な免疫組織化学染色（上パネル）と蛍光免疫染色（下パネル）である。スケールバー：２０μｍ。（Ｂ）と（Ｃ）は、室内空気曝露（Ｓｈａｍ）とたばこ煙曝露のＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃ（ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃ）マウス（ＣＳ）の気管支上皮におけるＩＳＭ１の代表的な免疫組織化学染色である。１グループあたり、マウスｎ＝５（Ｂ）；非ＣＯＰＤ及びＣＯＰＤ患者（Ｃ）。スケールバー：２０μｍ。（Ｄ）は、現在の喫煙状況で層別化した患者のＩＳＭ１発現の百分率分布を示す。患者のサンプルサイズはグラフに示す。（Ｅ）と（Ｆ）は、室内空気曝露（Ｓｈａｍ）とたばこ煙曝露のＷT ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＳ）のＡＭ（Ｅ）と、多形核でない白血球又はリンパ球（Ｆ）におけるＩＳＭ１の代表的な免疫組織化学染色である。１グループあたり、マウスｎ＝５。スケールバー：２０μｍ。 図９Ａ～Ｆは、非病理的状況の下、ＩＳＭ１欠乏が、肺において白血球浸潤の増加を引き起こすことを示す。図９Ａは、ＨＥ染色に示すように、月齢２カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における免疫細胞浸潤の増加を示す。図９Ｂは、Ｉｓｍ１Δ/Δと野生型の肺における総白血球の定量化を示す。図９Ｃは、ＣＤ６８とＮＩＭＰ－Ｒ１４のＩＨＣ染色で検出された、月齢２カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるマクロファージと好中球の増加を示す。図９Ｄと９Ｅは、免疫細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）が、Ｉｓｍ１Δ/Δの肺におけるマクロファージと好中球の増加を示したことを示す。図９Ｆは、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの抹消血液の解析が、２カ月で総白血球（ＷＢＳ）、好中球（ＮＥ）及びリンパ球（ＬＹ）の増加を示したことを示す。＊はｐ＜０．０５；１グループあたり、動物ｎ＝５（９Ａ～９Ｅ）。１グループあたり、動物ｎ＝７（９Ｆ）。 図１０Ａ～Ｇは、ＩＳＭ１欠乏が、肺において、気管内ＬＰＳに対する免疫応答の高まりを引き起こすことを示す。図１０Ａ～１０Ｅは、気管内ＬＰＳ負荷に対する免疫応答の経時変化を示す：総白血球、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞の定量化によって、Ｉｓｍ１Δ/Δの肺はＬＰＳに対する免疫応答の高まりを示した。ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）を一回、気管内投与し、ＬＰＳ投与後１日、３日、５日及び７日目の肺から単細胞懸濁液を分離する。図１０Ｆは、ＬＰＳ負荷後１日目の野生型マウスと比較して、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおいて、ＬＰＳが肺野透過性の亢進（より高いＢＡＬタンパク質）を引き起こしたことを示す。図１０Ｇは、ＬＰＳ負荷後１日目の、肺気腔への免疫細胞浸潤（急性炎症）の程度を表す代表的なＨＥ染色された肺の切片（左）と、好中球マーカーであるＮＩＭＰ－Ｒ１４で蛍光免疫染色された好中球（右）を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１；１グループあたり、動物ｎ＝３。 図１１Ａ～Ｇは、気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１が、ＬＰＳ誘発性肺炎症を抑制することを示す。図１１Ａは、ＬＰＳ誘発性急性炎症のマウスの肺に対する、ｒＩＳＭ１処理を示す概略図である。マウスに、５０μｇのｒＩＳＭ１を気管内デリバリーして前処理し、翌日ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）を単回投与した。５０μｇのｒＩＳＭ１で１日一回、ＬＰＳ後３日目までマウスを連続的に処理した。そして、気管支肺胞洗浄液を分離し、気管支肺胞洗浄液タンパク質と細胞成分に分けた。図１１Ｂは、ＬＰＳ負荷後１日目のｒＩＳＭ１処理されたマウスにおいて、気管支肺胞洗浄液タンパク質が減少したことを示す。図１１Ｃ～Ｇは、ＬＰＳ負荷後１日目のＰＢＳ又はｒＩＳＭ１処理されたマウスから採取した気管支肺胞洗浄液の細胞を用いて、総白血球及び免疫細胞分画を行ったことを示す。ｒＩＳＭ１は、総白血球、好中球及びマクロファージの数を著しく減少させた。Ｔ細胞とＢ細胞もｒＩＳＭ１の下で減少したが、ＰＢＳ処理されたマウスにおいてこれら２つの細胞型には幅広いバリエーションがあるため、統計的な重要性はない。＊はｐ＜０．０５；１グループあたり、動物ｎ＝５。 図１２Ａ～Ｅは、ＬＰＳ誘発性急性肺損傷からの回復後、ＩＳＭ１欠乏が、肺組織のリモデリングと線維症を引き起こしたことを示す。図１２Ａは、ＬＰＳ負荷後９日目の野生型及びＩｓｍ１Δ/Δマウスにおける組織線維症の程度を示す、ＨＥ染色された肺の切片の代表図である。図１２Ｂ～Ｃは、ピクロシリウス染色によって検出されたように、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺の方がコラーゲン沈着が高かったことを示す。図１２Ｄ～Ｅは、α平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の蛍光免疫染色によって、野生型マウスと比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺における線維化病巣内の筋線維芽細胞の増加が明らかになることを示す。＊＊はｐ＜０．０１。定量化は、１グループあたり肺ｎ＝３、１つの肺あたり２つの切片、１つの切片あたり５つの顕微鏡フィールドで行った。 図１３Ａ～Ｂは、ＩＳＭ１欠乏が、肺におけるＩＩ型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ２）の増殖を増加させることを示す。図１３Ａは、ＬＰＳ負荷後９日目のＩｓｍ１Δ/Δと野生型マウスの、ＳＰ－ＣとＰＣＮＡの二重蛍光免疫染色された肺の切片の代表図である。図１３Ｂは、ＬＰＳ負荷後９日目の肺組織切片におけるＳＰ－ＣとＰＣＮＡの二重陽性細胞の定量化を示す。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺において、ＡＥＣ２の増殖数が著しく増加。＊＊＊はｐ＜０．００１。定量化は、１グループあたり肺ｎ＝３、１つの肺あたり２つの切片、１つの切片あたり５つの顕微鏡フィールドで行った。 図１４Ａ～Ｃは、ＩＳＭ１欠乏が、肺においてより高い線維化促進性サイトカインＴＧＦ－βを引き起こしたことを示す。図１４Ａは、ＬＰＳ負荷後９日目のＩｓｍ１Δ/Δと野生型マウスの、ＴＧＦ－β蛍光免疫染色された肺の切片の代表図である。図１４Ｂは、ＬＰＳ負荷後９日目のＩｓｍ１Δ/Δと野生型マウスの肺におけるＴＧＦ－βの発現レベルを、ウエスタンブロットと全肺ライセート（ｗｈｏｌｅ ｌｕｎｇ ｌｙｓａｔｅ）を用いて解析したものを示す。図１４Ｃは、ＬＰＳ負荷後９日目のＩｓｍ１Δ/Δマウスにおける肺ＴＧＦ－βタンパク質レベルの定量化を示す。＊＊はｐ＜０．０１。１グループあたり、肺ｎ＝３。 図１５Ａ～Ｃは、ＩＳＭ１欠乏が、ＬＰＳ負荷後１日目の肺の炎症性サイトカイン／ケモカインプロフィールを変化させることを示す。サイトカインとケモカインは、ＬＰＳ負荷後１日目のＩｓｍ１Δ/Δと野生型マウスの肺ホモジネートと、炎症性サイトカイン抗体アレイを用いて解析した。図１５Ａは、抗体アレイによって解析したサイトカイン／ケモカインの相対的変化を示す。＊はｐ＜０．０５。１グループあたり、肺ｎ＝４。図１５Ｂ～Ｃは、ウエスタンブロットで解析したＬＰＳ負荷後１日目のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＴＮＦ－αの発現の増加を示す。＊＊はｐ＜０．０１。１グループあたり、肺ｎ＝３。 図１６Ａ～Ｃは、ＩＳＭ１欠乏が、ｐ６５ ＮＦ－κＢの発現レベルと核移行の両方を増加させることを示す。図１６Ａは、ＬＰＳ負荷後１日目のＩｓｍ１Δ/Δと野生型マウスの肺切片における、蛍光免疫染色されたＮＦ－κＢ ｐ６５サブユニットの代表図である。ＤＡＰＩ（核、青）と共存して、増加したｐ６５ ＮＦ－κＢ（赤）信号が、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺切片に存在した。図１６Ｂは、ＬＰＳ負荷後１日目のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺ホモジネートにおけるｐ６５ ＮＦ－κＢレベルの上昇を、ウエスタンブロットによって示す。図１６Ｃは、β－アクチンに対するｐ６５ ＮＦ－κＢの定量値を示す。１グループあたり、肺ｎ＝３。 図１７Ａ～Ｃは、Ｉｓｍ１Δ/ΔＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの作製を示す。図１７ａは、ガイドＲＮＡペアであるｇＲＮＡ１とｇＲＮＡ３を介して、Ｉｓｍ１を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の概略図である。Ｐ１とＰ２は、Ｔ７Ｅ１アッセイと遺伝子型判定に使用したプライマーを示す。図１７ｂは、Ｉｓｍ１Δ/Δノックアウト線（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｌｉｎｅ）のＤＮＡ配列を示し、未成熟終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）とＩＳＭ１タンパク質が生成されないことにつながる２３ｂｐの欠失を示す。赤い矢印はＣａｓ９切断部位を示し、黄色い領域は二つの重複するｇＲＮＡの標的領域を表す。図１７ｃは、Ｃ５６ＢＬ／６Ｊ ＷＴ、Ｉｓｍ１＋/Δ及びＩｓｍ１Δ/ΔからのＩｓｍ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲを示す。図１７ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴとＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺切片における、ＩＳＭ１（茶色）と核（ヘマトキシリン、青）の代表的な免疫組織化学染色である。Ｂｒは気管支、Ａｌは肺胞。スケールバー：２０μｍ。 図１８は、正常細胞（右）とストレス下の細胞（左）を比較するモデルを示す。ストレス下の細胞（腫瘍細胞、ＥＣ、活性炎症性細胞など）において、ＩＳＭ１及び／又はその断片と相互作用することができる細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）が増加し、結果として細胞死をもたらす（例えば、治療効果への提供）。また、ｃｓＧＲＰ７８レベル及び／又はそれとのＩＳＭ１相互作用における変化は、診断及び／又は予兆情報を提供し得る。図に示すように、ｃｓＧＲＰ７８は、炎症性疾患などの疾患における治療標的及び／又は診断バイオマーカーとなり得ると考えられる。 図１９Ａ～Ｂは、ＩＳＭ１ＮではなくＩＳＭ１Ｃ（２８７～４６１）がＥＣ接着をサポートすることを示す。図１９Ａは、ＩＳＭ１におけるＡＭＯＰドメインが、ＥＣ接着を媒介する上で重要であることを示す。二つのタンパク質間の経時的コンフルエンスの見込みに有意差がなかったため、ＩＳＭ１ＣはＩＳＭ１と同等に細胞接着をサポートすることができる。経時的コンフルエンスの見込みが著しく遅く低いため、ＩＳＭ１Ｎは細胞接着をサポートする能力が低い。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３。図１９Ｂは、ＩＳＭ１Ｃよりも細胞接着率が著しく低かったため、変異体ＩＳＭ１ＲＫＤ３４１ＲＡＡ（Ｃ）とＩＳＭ１ＲＫＤ３４０ＡＡＡ（Ｃ）の細胞接着をサポートする能力が低いことを示す。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３。 図２０Ａ～Ｂは、内部移行したＩＳＭ１Ｃ（２８７～４６１）が、ＥＣアポトーシスを引き起こすことを示す。図２０Ａ～Ｂは、ＩＳＭ１ＮよりＩＳＭ１Ｃが、ＥＣアポトーシスを著しく引き起こしたことを示す。エラーバーはＳＤとしてプロットした。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎ＝３。 図２１は、ＢＳＡではなくゼラチンがＥＣ接着をサポートできることを示す。細胞コンフルエンスにおける動的変化をモニターした。時間とともにコンフルエンスの変化が増加する場合、ゼラチンはＥＣ接着をサポートすることができる。コンフルエンスが低いまま、又は時間とともに減少したため、ＢＳＡは細胞接着をサポートしない。＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎ＝３。 図２２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化及びＦＶＢ／Ｎ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの作製を示す。（Ａ）は、ガイドＲＮＡペアであるｇＲＮＡ１とｇＲＮＡ２を介してＩｓｍ１を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の概略図を示す。（Ｂ）と（Ｃ）は、ＦＶＢ／ＮＴａｃ（Ｂ）とＣ５７ＢＬ６／Ｊ（Ｃ）のＷＴ、Ｉｓｍ１＋/ΔとＩｓｍ１Δ/Δマウスの遺伝子型判定ＰＣＲを示す。（Ｄ）は、ＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴとＩｓｍ１Δ/Δマウスの呼吸上皮におけるＩＳＭ１（赤）と核（ＤＡＰＩ、青）の代表的な蛍光免疫染色である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。（Ｅ）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴとＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるＩＳＭ１の代表的な免疫組織化学染色である。１グループあたり、マウスｎ＝４。スケールバー：２０μｍ。 図２３は、ＣＯＰＤにおける肺胞マクロファージアポトーシスが、細胞表面ＧＲＰ７８発現と相関することを示す。（Ａ）は、患者コホートにおける切断型カスパーゼ３（ＣＣＰ３）の代表的な免疫組織化学染色である。スケールバー：５０μｍ。（Ｂ）は、ｈＩＳＭ１発現とＡＭアポトーシスとの相関を示し、喫煙状況によって層別化した。患者のサンプルサイズはグラフに示す。データは、ピアソン相関で解析した。（Ｃ）と（Ｄ）は、室内空気曝露（Ｓｈａｍ）とたばこ煙曝露（ＣＳ）のＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃマウスの肺における、ＧＲＰ７８（赤）、切断型カスパーゼ３（ＣＣＰ３）と核（ＤＡＰＩ、青）の代表的な蛍光免疫染色である。１グループあたり、マウスｎ＝５。スケールバー：２０μｍ（Ｃ）；非ＣＯＰＤ及びＣＯＰＤ患者。スケールバー：１０μｍ（Ｄ）。 図２４は、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＡＭアポトーシス、肺の恒常性及び炎症の制御におけるＩＳＭ１のメカニズムの提案を示す。（Ａ）左は、オートクリン／パラクリンＩＳＭ１が、高いｃｓＧＲＰ７８を有するＡＭを特に標的とし、アポトーシスを誘導することを示す。ＡＭ数は制御下に保たれ、炎症は制御され、肺の恒常性は維持される。右は、ＩＳＭ１が無い／低いと、肺胞腔におけるＡＭ集積と、肺機能の進行的な低下とともに肺気腫の発症を結果としてもたらすことを示す。（Ｂ）は、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＡＭアポトーシスと肺の恒常性の制御におけるＩＳＭ１のメカニズムの提案の概略図を示す。左は、オートクリン／パラクリンＩＳＭ１が、高いｃｓＧＲＰ７８を有するＡＭを特に標的化し、アポトーシスを誘導することを示す。ＡＭ数は制御下に保たれ、炎症は制御され、肺の恒常性は維持される。右は、ＩＳＭ１の減少が、肺胞腔におけるＡＭ集積と、肺機能の進行的な低下とともに肺気腫の発症を結果としてもたらすことを示す。ＲＯＳ、ＮＦ－κＢシグナル伝達、ＭＭＰ－１２及びＭＭＰ－９を含む肺気腫メディエーターがアップレギュレートした。 図２５は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から採取した細胞のフローサイトメトリー解析のゲーティング戦略を示す。肺胞マクロファージのフローサイトメトリー解析と定量化の代表的なゲーティング戦略と合わせて、肺胞マクロファージのゲーティング戦略を示す。 図２６は、ＨＤＭ誘発性アレルギー喘息マウスモデルにおけるアレルゲン曝露のタイムラインを示す。疾患モデルは、Hammad et al.（２００９）及びPeh et al.（２０１５）に記載のプロトコルに従って作製した。簡単に言えば、メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週）をイソフルランで麻酔し、０日、７日及び１４日目に気管内ルートを介して、４０μＬのＨＤＭ抽出物（ヤケヒョウダニ；Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）で感作した。負荷から２時間後、１５日目及び１６日目に連続して、細菌生成組換えＩＳＭ１（２ｍｇ／ｋｇ、４０μｇ／マウス）又は同量の溶媒（生理食塩水）を１日単回投与した（赤い矢印）。全ての動物を１７日目に安楽死させ、免疫細胞浸潤解析のため、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収集した。５匹の健康なマウスからなる未処理グループが、コントロールとしての役割を果たした。 図２７は、最後の処理から２４時間後の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における炎症性細胞数を示す［未処理：ｎ＝５；ＨＤＭ：ｎ＝５；食塩水：ｎ＝７；ＩＳＭ１：ｎ＝７］。（Ａ）好酸球（Ｅｏｓ）、肺胞マクロファージ（ＡＭ）、好中球（Ｎｅｕ）及びリンパ球（Ｌｙｍ）を特定するため、１０の異なる観察フィールドで細胞分画を行った。未処理グループと比べて、チリダニ（Ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ：ＨＤＭ）抽出物負荷によって、総細胞数、好酸球及び肺胞マクロファージは著しく増加し、好中球及びリンパ球はわずかに増加した。一方で、イスミン１（ＩＳＭ１）処理グループにおいて、総細胞数は７０％減少（Ｐ＝０．００５３）し、好酸球（Ｐ＝０．００６２）とリンパ球（Ｐ＝０．０３８１）は著しく減少した。肺胞マクロファージと好中球の総数に変化は見られなかった。値は平均値の標準誤差で示す。ＨＤＭとの有意差あり。（Ｂ）は、免疫細胞浸潤を示すＬｉｕ染色の代表的な顕微鏡写真である。スケールバー：４０μｍ。 図２８は、ＨＤＭ処理グループと比べて、総ＩｇＥレベルがｒＩＳＭ１処理によって著しく低下したことを示す。総ＩｇＥレベルは、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡＴＭマウス ＩｇＥ ＥＬＩＳＡキット（Ｎ＝５）を用いて解析した。値は平均値の標準誤差で示す。グループ間の平均差をｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで比較した。＊Ｐ＝０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５。 図２９は、Ｃ末端ＡＭＯＰドメインが単独で、ＩＳＭ１の完全なアポトーシス促進活性を保持することを示す。左に組換えタンパク質構築物を示し、右にアポトーシス促進活性を示す。ｍａｍ：哺乳類生成、ｂａｃ：大腸菌生成。マウスＩＳＭ１タンパク質を使用。哺乳類細胞生成及び大腸菌生成ｒＩＳＭ１ ２８７－４６１断片は、ともに、全長ＩＳＭ１の完全なアポトーシス促進活性を保持する。 図３０は、ＡＭＯＰドメイン２８７～４６１領域を介した直接結合を示す、精製されたＧＲＰ７８とＩＳＭ１タンパク質を用いた共免疫沈降アッセイを示す。 図３１は、組換えマウスＩＳＭ１タンパク質の発現と精製を示す。（Ａ）ＩＳＭ１の哺乳類発現構築物の概略図。分泌効率を上げるため、Ｎ末端にマウスＩｇκ１リーダー配列を含めた。タンパク質の検出と精製のため、Ｃ末端にｃ－Ｍｙｃタグとヘキサヒスチジンタグを含めた。（Ｂ）哺乳類ｒＩＳＭ１の発現と精製を示すワークフローの概略プレゼンテーション。（Ｃ）変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥで７０ｋＤａあたりに移動した精製哺乳類組換えＩＳＭ１タンパク質。（Ｄ）ＩＳＭ１の細菌発現構築物の概略図。タンパク質の検出及び精製のため、Ｎ末端にヘキサヒスチジンタグを含めた。Ｎ末端のＳＵＭＯタグは、タンパク質の可溶化をアシストする。（Ｅ）細菌ｒＩＳＭ１の発現と精製を示すワークフローの概略プレゼンテーション。（Ｆ）ＳＵＭＯタグが切断された最終的な精製細菌組換えＩＳＭ１タンパク質は、変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥで５５ｋＤａあたりに移動した。 図３２は、不均一なグリカンとともに、哺乳類組換えＩＳＭ１が高密度に沈着することを示す。（Ａ）ＩＳＭ１に存在する二つのＮグルコシル化部位の概略プレゼンテーション。（Ｂ）ＰＮＧａｓｅＦとともに哺乳類組換えＩＳＭ１タンパク質をインキュベートし、Ｎ結合型グリカンを取り除いた。（Ｃ）ＩＳＭ１の野生型及びＮグリカン変異体が、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ及びＨｅｌａ細胞に発現し、解析された。タンパク質の発現と分泌をウエスタンブロットで解析した。（Ｄ）ＩＳＭ１での、Ｏ結合型及びＣ結合型グリカン沈着の総括図。赤く色づけた残基は、グリカン沈着部位を表す。一番目に下線が引かれた配列はＴＳＲドメインを指し、次に下線が引かれた配列はＡＭＯＰドメインに相当する。（Ｅ）ＩＳＭ１のＯ結合型及びＣ結合型グリカン変異体がＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において発現し、解析された。 図３３は、ＩＳＭ１のＡＭＯＰドメインが、その受容体相互作用を媒介することを示す。（Ａ）共免疫沈降実験用のＩＳＭ１とＧＲＰ７８の組換えタンパク質構築物の概略プレゼンテーション。ｍａｍＩＳＭ１は哺乳類組換えＩＳＭ１タンパク質を表し、ｂａｃＧＲＰ７８は細菌組換えＧＲＰ７８タンパク質を表す。（Ｂ）精製した組換えタンパク質の質を示す、クマシーブルー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（Ｃ）共免疫沈降解析によって、ＡＭＯＰドメインがＩＳＭ１－ＧＲＰ７８相互作用を媒介したことが確認された。（Ｄ）共免疫沈降解析によって、ＡＭＯＰドメインがＩＳＭ１－インテグリンαvβ５相互作用を媒介したことが確認された。（Ｅ）共免疫沈降解析によって、ＡＭＯＰドメインを有さないＩＳＭ１が、インテグリンαvβ５との相互作用を消失させたことが確認された。 図３４は、ＡＭＯＰドメインの境界が、そのアポトーシス促進活性に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）哺乳類組換えタンパク質の生成と精製に用いたＩＳＭ１ ＡＭＯＰ構築物の概略プレゼンテーション。（Ｂ）精製した組換えタンパク質の質を示す、クマシーブルー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（Ｃ）二つの哺乳類ＡＭＯＰトランケートのアポトーシスアッセイの結果。（Ｄ）細菌組換えタンパク質の生成と精製に用いたＩＳＭ１ ＡＭＯＰ構築物の概略プレゼンテーション。（Ｅ）精製した組換えタンパク質の質を示す、クマシーブルー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（Ｆ）異なる細菌組換えＡＭＯＰトランケートのアポトーシス促進活性の比較。（Ｇ）哺乳類及び細菌組換えＡＭＯＰトランケートのアポトーシス促進活性の比較。
炎症、特に肺炎症に関連する疾患や障害を治療するためのペプチド、ポリペプチド、核酸、組成物及び方法を本明細書に記載する。実施形態及び実施例は当業者を対象とした例示の目的で提供しており、いかようにも限定する目的でないことが理解されよう。
健康な成人は、周囲環境状況の下、肺の恒常性を制御及び維持して、無菌性炎症を予防する。免疫応答は、外傷、環境的ストレッサー及び／又は感染によって引き起こされ、急性炎症へとつながる。このような炎症は、傷を治癒し回復させ、炎症誘発性障害及び／又は損傷を予防するため、最終的に消退させることが望ましい。十分に炎症の消退をさせることができない場合、慢性炎症、及び／又は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性閉塞性気管支炎及び／又は肺線維症などの炎症関連疾患につながる可能性がある。急性肺損傷（ＡＬＩ）などの急性肺疾患及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）も、肺の炎症に関連している。
本明細書に詳細に記載する通り、本発明者らは、イスミン１（ＩＳＭ１）に由来する、及び／又は、基づく肺炎症なとの炎症を治療するためのポリペプチド、核酸、組成物、経肺ドラッグデリバリー装置及び方法を開発した。イスミン１は分泌タンパク質であって、炎症、特に肺の炎症を阻害、抑制及び／又は消退する役割を果たすものとして、本明細書に記載の研究によって示される。以下の詳細に記載された研究において、外因性組換えＩＳＭ１タンパク質（ｒＩＳＭ１）の肺への補給は、ＩＳＭ１欠乏性肺における肺炎症の表現型を阻害し、その結果は、ＩＳＭ１が、肺胞マクロファージアポトーシスを誘導することによって、炎症の消退を助け得ることを示す。本明細書に記載の通り、組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）は、例えばたばこ煙誘発性ＣＯＰＤを防ぎ、ＬＰＳ誘発性急性肺炎症や損傷を抑制し得る。結果は、無菌性肺炎症、及び／又は、感染及び／又は外傷によって引き起こされる炎症の抑制及び／又は消退において、ＩＳＭ１が重要な役割を果たし得ることを示す。
炎症に関連する疾患又は障害を治療するための治療組成物、製剤及び装置
本明細書において、例えば、炎症、特に肺炎症に関連する疾患や障害の治療、改善及び予防するための治療組成物、ペプチド、ポリペプチド、核酸、製剤及び装置が提供される。
イスミン１（ＩＳＭ１、時にＩＳＭとも呼ぶ）は、様々な異なる脊髄動物種に見られる分泌タンパク質である。ＩＳＭ１タンパク質は、トロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＲ）ドメインと、ＭＵＣ４における接着関連ドメインと、その他のタンパク質（ＡＭＯＰ）ドメインを含む。ＩＳＭ１の受容体として、グルコース制御タンパク質７８ｋＤａ（ＧＲＰ７８）とαvβ５インテグリンが知られている。イスミン１（ＩＳＭ１）は、以前から、マウスにおける血管新生抑制と関連付けられていた（Xiang, W. et al., 2011, Isthmin is a novel secreted angiogenesis inhibitor that inhibits tumour growth in mice, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 15(2): 359-374参照、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。
ホモサピエンスにおける全長イスミン１の発現した配列（すなわち、Ｎ末端シグナルペプチドを含む）は以下のように示される。
イスミン１ 前駆体［ホモサピエンス］
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿５４３０１６．１
Figure 2022524370000001
（配列番号１）
マウスにおけるイスミン１の発現した全長配列（すなわち、Ｎ末端シグナルペプチドを含む）は以下ように示される。
イスミン１ 前駆体［ハツカネズミ］
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２６３４１８．１
Figure 2022524370000002
（配列番号２）
ＩＳＭ１は分泌タンパク質であるため、これらのヒト（配列番号１）及びマウス（配列番号２）のＩＳＭ１配列は、Ｎ末端シグナルペプチド配列を含む。このシグナルペプチド配列は、下線部分で示した部分であり、通常、ＩＳＭ１の成熟分泌形態において切断されている。上記配列において、ＴＳＲドメインは太字で、ＡＭＯＰドメインは斜体で示している。
シグナルペプチド配列が切断されたヒト及びマウスにおける、成熟ＩＳＭ１は以下のように示される。
イスミン１（成熟）［ホモサピエンス］
GSGAADGPDAAAGNASQAQLQNNLNVGSDTTSETSFSLSKEAPREHLDHQAAHQPFPRPRFRQETGHPSLQRDFPRSFLLDLPNFPDLSKADINGQNPNIQVTIEVVDGPDSEADKDQHPENKPSWSVPSPDWRAWWQRSLSLARANSGDQDYKYDSTSDDSNFLNPPRGWDHTAPGHRTFETKDQPEYDSTDGEGDWSLWSVCSVTCGNGNQKRTRSCGYACTATESRTCDRPNCPGIEDTFRTAATEVSLLAGSEEFNATKLFEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY
（配列番号３）
イスミン１（成熟）［ハツカネズミ］
GSGASDRQDAAAGNVSGSQLQNNLNLESDSTSETSFPLSKEAPEEHQVVHQPFPRQRFPPETGHPSLQRDGPRSFLLDLPNFPDLSKADINGQNPNIQVTIEVVDGPDSEAEKDQHPENKPSWSLPAPDWRAWWQRSLSLARTNSGDQDDKYDSTSDDSNFLSVPRGWDRPAPGHRTFETKEQPEYDSTDGEGDWSLWSVCSVTCGNGNQKRTRSCGYACIATESRTCDRPNCPGIEDTFRTAATEVSLLAGSEEFNATKLFEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY
（配列番号４）
当然のことながら、本明細書におけるイスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質に関する言及は、特定の実施形態においては全長ＩＳＭ１（すなわち、シグナルペプチドが存在するもの）又は成熟ＩＳＭ１（すなわち、シグナルペプチドが取り除かれたもの）のいずれかに言及しているものとして理解されてもよい。分泌ＩＳＭ１は、成熟形態（すなわち、シグナルペプチドがない状態）で通常発見されるため、特定の実施形態において、シグナルペプチド配列は省略されてもよい。特定の実施形態において、通常、成熟ＩＳＭ１が好適である。
当然のことながら、本明細書におけるイスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質に関する言及は、特定の実施形態において、ＩＳＭ１又はホモログ、オルソログ、パラログ又はその機能的等価物を発現する、任意の適切な種に見られるようなＩＳＭ１を含む。ＩＳＭ１は、多くの異なる種で発現されている。ＩＳＭ１配列は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ２００９／１１３９６５に更に詳しく記載されている。Xiang, W. et al., 2011, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 15(2): 359-374（参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）において、ヒト、マウス、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）及びゼブラフィッシュに見られるような、ＩＳＭ１のアミノ酸アラインメントを示す配列比較が提供されている。ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅを用いたＮＣＢＩで算出した、ヒトＩＳＭ１（前駆体）と、対応する様々な異なる種のＩＳＭ１配列のペアワイズアラインメントスコアを以下に示す。
ペアワイズアラインメントスコア
Figure 2022524370000003
以上のように、異なる種においてＩＳＭ１が幾分か類似している一方で、配列のバリエーションが認められる。タンパク質配列の観点から、上記スコアには、３０％の配列同一性と同程度のヒト配列からのバリエーションが示されている（すなわち、D. rerio配列は、ヒトＩＳＭ１と７０％の配列同一性を有する）。
特定の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチド、又はそのＧＲＰ７８活性化断片が提供される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、任意の特定の種からの任意の適切なＩＳＭ１タンパク質であってもよい、Ｎ末端シグナルペプチドを有する又は有さないイスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。特定の実施形態において、ポリペプチドは、任意の適切なポリペプチド、ペプチド、ペプチド系又はポリペプチド系分子または分子の群を含んでもよく、精製タグ、リンカー、フルオロフォア、シグナルペプチド、標的化又はデリバリー配列、細胞透過性ペプチド、追加の活性剤（肺炎症を標的化する他の薬物など）又は特定の用途に適するその他の成分などの、追加のタンパク成分又は非タンパク成分を一つ以上含むようにさらに修飾されてもよいし、修飾されなくてもよい。特定の実施形態において、ポリペプチドは一つ以上のアミノ酸側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの任意の組み合わせで修飾されてもよい。特定の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列又はそのＧＲＰ７８活性化断片に加えて、ポリペプチドは、ＩＳＭ１と同一性を有する配列に、一つ以上の追加のアミノ酸配列をＮ末端又はＣ末端のいずれかの位置に含んでもよい。
特定の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質のＧＲＰ７８活性化断片は、少なくとも一つのイスミン１の断片、部分、ドメイン又は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０又は４４０連続アミノ酸と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する任意の適切なペプチド又はポリペプチドを含んでもよく、ＩＳＭ１と実質的に同じ有効性、又はＩＳＭ１と比べて少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の有効性で、ＧＲＰ７８活性化断片はＧＲＰ７８に結合し、活性化することができる。
本明細書に記載の研究において、ＩＳＭ１は、ＧＲＰ７８のアポトーシス促進性リガンドであって、ＧＲＰ７８に結合してアポトーシスを引き起こすことが示される。したがって、ＩＳＭ１は、ＧＲＰ７８のアゴニストとして考えられてもよい。シグナル受容体として、ＧＲＰ７８は多数の異なるリガンドに結合してもよく、タンパク質の異なる領域を介して結合してもよい（ＧＲＰ７８のレビューは、Ni, et al., Biochem J., 2011, 434(2): 181-188に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。いくつかのリガンドは増殖促進性、その他はアポトーシス促進性であってもよく、それぞれ異なる細胞内シグナル経路を有してもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８とのＩＳＭ１相互作用には、ＩＳＭ１内部移行及び／又はカスパーゼ活性化と関与し得る細胞内シグナル経路が関与してもよい。したがって、特定の実施形態において、ＧＲＰ７８活性化断片は、ＧＲＰ７８のアポトーシス促進性リガンドとして機能することができる、及び／又は、ＧＲＰ７８に結合してアポトーシスを引き起こすことができる、任意の適切なペプチド又はポリペプチドを含んでもよい。特定の実施形態において、ＩＳＭ１タンパク質のＧＲＰ７８活性化断片は、ＧＲＰ７８を介してアポトーシスを引き起こすことができる任意の適切なペプチド又はポリペプチドを含んでもよく、断片の内部移行及び／又はカスパーゼ活性化は含んでも含まなくてもよい。
特定の実施形態において、ＧＲＰ７８又はＧＲＰ７８受容体に関する言及は、細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）を含むと理解されてもよい。細胞外ＩＳＭ１が相互作用するのは細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）であって、本明細書の教えに関する当業者は、ＧＲＰ７８に関する言及をｃｓＧＲＰ７８に関する言及であると必要に応じて理解するだろう（すなわち、特定の実施形態において、本明細書におけるＧＲＰ７８に関する言及は、ｃｓＧＲＰ７８に関する言及であると理解される）。
特定の実施形態において、ＡＭＯＰドメインは、ＩＳＭ１のＧＲＰ７８への結合を媒介し得る、及び／又は、ＩＳＭ１のアポトーシス促進活性を媒介し得ると考えられる。特定の実施形態において、ＩＳＭ１のＴＳＲドメインは、ＩＳＭ１のＧＲＰ７８への結合、及び／又は、ＩＳＭ１のアポトーシス促進効果における関与が小さい又はないとさらに考えられる。確かに、ＡＭＯＰドメインがＧＲＰ７８結合及びアポトーシスを引き起こす原因であり得ることを、結果が示唆している（詳細は以下の実施例３を参照）。したがって、特定の実施形態において、ペプチド又はポリペプチドは、一般に、少なくともＩＳＭ１のＡＭＯＰドメインを有する任意の適切なペプチド、ポリペプチド、ペプチド系分子又はポリペプチド系分子、又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。ポリペプチドがＩＳＭ１からのドメイン又は領域を一つ以上含む実施形態において、一般に、ドメイン又は領域はＩＳＭ１に見られるような同じＮ－Ｃ末端の順序で構築されてもよいし、ＩＳＭ１と比較して再配列されてもよい。ＩＳＭ１ドメインと断片は、国際公開ＷＯ２００９／１１３９６５（発明の名称：Isthmin Derivatives for use in Treating Angiogenesis）にさらに詳細に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、配列番号１０又は１１のいずれか一つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドが提供される。

配列番号１０：ヒトＩＳＭ１ ＡＭＯＰドメイン
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDED

配列番号１１：マウスＩＳＭ１ ＡＭＯＰドメイン
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDED
特定の実施形態において、配列番号１～４のいずれか一つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、その１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０又は４４０連続アミノ酸を含むペプチド又はポリペプチドが提供される。
特定の実施形態において、配列番号１～４のいずれか一つを含む、又は、からなるポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、イスミン１タンパク質である、又は、イスミン１タンパク質を含むポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、ヒトＩＳＭ１タンパク質である、又は、ヒトＩＳＭ１タンパク質を含むポリペプチドが提供される。
特定の実施形態において、アミノ酸配列：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２６）；
又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチドが提供される。
実施例３に記載の結果は、配列番号２６のポリペプチド配列が、ＧＲＰ７８に結合するために十分であり得ることを示す。実施例３は、ＩＳＭ１における配列番号２６を先行するEVSLLAGSEEFNATKL配列（すなわち、位置２７１～２８６）を有さない場合の、有効な結果を示す。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、アミノ酸配列：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２６）；又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチド又はそれらのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。
特定の実施形態において、アミノ酸配列：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４）；
又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチドが提供される。
実施例３に記載の結果は、配列番号２４のポリペプチドが、ＧＲＰ７８に結合するのに十分であり得て、ＥＣ接着をサポートでき、内部移行でき、ミトコンドリア内に局在することができ、アポトーシスを誘導し得ること示す。実施例３は、ＩＳＭ１における配列番号２６を先行するEVSLLAGSEEFNATKL配列（すなわち、位置２７１～２８６）を有さない場合の、有効な結果を示す。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、アミノ酸配列：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４）；又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。
配列番号２６のアミノ酸配列は、ＡＭＯＰドメインが位置するマウスＩＳＭ１のＣ末端領域のＮ末端部分であって、ＡＭＯＰドメインのＮ末端部分からの配列を含む（ＩＳＭ１Ｃ－Ｎ、残基２２８７～３７３）。配列番号２４のアミノ酸配列は、ＴＳＲドメインではなくＡＭＯＰドメインを含むマウスＩＳＭ１のＣ末端領域である（ＩＳＭ１Ｃ、残基２８７～４６１）。配列番号２６と２４はそれぞれマウスＩＳＭ１配列に由来するが、特定の実施形態において、その他の種のＩＳＭ１からの対応する配列／領域も使用され得ると理解されるだろう。例として、特定の実施形態において、マウスＩＳＭ１の領域２８７～３７３（配列番号２６）又は領域２８７～４６１（配列番号２５）に対応するヒトＩＳＭ１に見られるアミノ酸配列、又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、又は、からなるペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片が提供される。
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２７；ヒトＩＳＭ１Ｃ－Ｎ）

FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４：マウスＩＳＭ１ ２８７～４６１）；又は

FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２５：ヒトＩＳＭ１ ２９０～４６４）
特定の実施形態において、上記ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、ＩＳＭ１のＮ末端シグナルペプチド配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。
特定の実施形態において、上記ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、全長又は成熟ＩＳＭ１でない（すなわち、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、細胞又は対象において自然に発現しない外因性ペプチド又はポリペプチドであってもよい）。特定の実施形態において、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、全長又は成熟ＩＳＭ１より長くても、短くてもよい。特定の実施形態において、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、少なくとも一つの残基に対して、自然発現したＩＳＭ１とは異なる一次アミノ酸配列を有してもよい（すなわち、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、例えば、ヒト又はその他の種から自然発現したＩＳＭ１と比較して、一つ以上のアミノ酸付加、欠失又は置換を含んでもよい）。特定の実施形態において、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、例えば、自然発現したＩＳＭ１と比較して、一つ以上の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。
特定の実施形態において、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２６）；
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４）；
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２７）；又は
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２５：ヒトＩＳＭ１ ２９０～４６４）、
又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、又は、からなるものであってもよい。
上記ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片の別の実施形態において、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、配列番号２４～２７のいずれにもアミノ酸配列：EVSLLAGSEEFNATKL Ｎ末端を含まない、又は、配列：EVSLLAGSEEFNATKLを全く含まない。別の実施形態において、ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は：
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号１２）；
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２０）；
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号１３）；又は
EVSLLAGSEEFNATKLFEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２１）
を含まない、又は、ではない。
特定の実施形態において、上記ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、分離ペプチド又はポリペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。
特定の実施形態において、ＩＳＭ１タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するものを含む本明細書に記載のポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、特定の種において自然発現した全長又は成熟ＩＳＭ１に対して少なくとも一つの変異（すなわち、アミノ酸付加、欠失又は置換）を有するポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。特定の実施形態において、少なくとも一つの変異は、アミノ酸置換を含んでも、含まなくてもよい。特定の実施形態において、少なくとも一つの変異は、アミノ酸残基が、大きさ、電荷、親水性／疎水性、水素結合、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも一つに関して、元の残基と少なくともいくらか類似する別のアミノ酸残基と置換される保存的アミノ酸置換を含んでも、含まなくてもよい。特定の実施形態において、少なくとも一つの変異は、アミノ酸残基が、例えばグリシンやアラニンなどの置換位置で、望ましい機能に対して目立たない又は非破壊的であると一般的に考えられる別のアミノ酸残基と置換される保存的アミノ酸置換を含んでも、含まなくてもよい。
実施例３の研究は、ＫＤ３４１ＡＡ及びＲＫＤ３４０ＡＡＡ変異を有するポリペプチド（ＩＳＭ１Ｃ－Ｎ変異）に関する議論を含む。これらの変異により、ＩＳＭ１のαｖβ５インテグリン受容体との結合親和性を失う可能性があるが、実施例３において議論されるように、ＧＲＰ７８との結合はこれらの変異で破壊されず、このような変異配列は、標的ＧＲＰ７８受容体のより特異的な標的化を提供し得ることを示唆している。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、ＫＤ３４１ＡＡ変異又はＲＫＤ３４０ＡＡＡ変異を含んでもよい。当然のことながら、「３４１」と「３４０」の番号付けは、マウス配列に対して提供されており、種によって異なることもある。例として、ＫＤ－ＡＡとＲＫＤ－ＡＡＡの番号付けは、ヒトＩＳＭ１配列における番号付けに言及する際、異なることがある（例えば、対応するヒト変異はＫＤ３４３ＡＡとＲＫＤ３４２ＡＡＡとなる）。
したがって、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、アミノ酸配列：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRAAFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号１４、マウスＡＭＯＰドメインを含むＣ末端領域のＮ末端部分、残基 ２８７～３７３、ＫＤ３４１ＡＡ変異あり）、又は、別の種から対応して変異した領域、又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。
特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、アミノ酸配列：FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKAAAFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号１５、マウスＡＭＯＰドメインを含むＣ末端領域のＮ末端部分、残基 ２８７～３７３、ＲＫＤ３４０ＡＡＡ変異あり）、又は、別の種から対応して変異した領域、又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。
実施例３において議論されるように、結果は、Ｃ末端ＡＭＯＰドメイン単独で、ＩＳＭ１のアポトーシス促進活性を媒介するのに十分であったことを示す。確かに、以下の実施例３で議論されるように、ＩＳＭ１タンパク質のトランケーションを用いた構造－機能の関係に関する研究は、２８７～４６１からのＣ末端ＡＭＯＰドメインが、全長ＩＳＭ１タンパク質の完全なアポトーシス促進活性を保持し、ＩＳＭ１タンパク質のアポトーシス促進活性を媒介するために、ＡＭＯＰドメインの翻訳後修飾が必要ないことを示した。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、アミノ酸配列：
FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４；マウス）；又は
FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２５；ヒト）；
又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、からなるポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含んでもよい。
配列番号２４及び２５は、それぞれマウス及びヒトＩＳＭ１配列に由来するが、特定の実施形態において、別の種のＩＳＭ１からの対応する配列／領域も使用され得ることが理解されるだろう。
特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、化学的に修飾されたポリペプチド又はペプチド、又は、ポリペプチド又はペプチドに由来する、又は、基づくペプチド模倣物を含んでもよい。例として、特定の実施形態において、ポリペプチド又はペプチド又はそのＧＲＰ７８活性化断片は、化学的に修飾されたポリペプチド又はペプチド、又は、ポリペプチド又はペプチドに由来する、又は、基づくペプチド模倣物を含んでもよく、一つ以上の環状誘導体、一つ以上の非天然アミノ酸残基を含む誘導体（Ｄアミノ酸など）、及び／又は、ペプトイドやβペプチドなどのその他の中で、ペプチド模倣物、又は、ペプチド結合以外の一つ以上の異なる化学結合又は連鎖を含むその他の構築物を含んでもよい。特定の実施形態において、ＩＳＭ１に由来するペプチド由来の薬剤の例として、ＢＣ７１などのKao et al., EBioMedicine 33 (2018) 22-32（参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドは、それを必要とする対象の肺に投与するために処方されてもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺に投与（すなわち、経肺デリバリー）するための薬剤の処方に関する様々な適切なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。薬剤、特にタンパク質を肺にデリバリーすることは、重要な研究対象であり、例えば、Bodier-Montagutelli, E., et al., 2018, Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery: what are the next steps?, Expert Opinion on Drug Delivery, 15(8): 729-736及びLabiris, N. R., et al., 2003, Pulmonary Drug Delivery. Part II: The role of inhalant delivery devices and drug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications, Br J Clin Pharmacol, 56:600-612に記載されており、それぞれ参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド又はペプチド又は核酸は、肺に局所投与するためであってもよい。例として、特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、ペプチド又は核酸は、気管内、鼻腔内又は吸入投与によって、肺に直接又は局所投与してもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドは、それを必要とする対象に気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与するために処方されてもよい。特定の実施形態において、ポリペプチドは、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するために処方されてもよい。特定の実施形態において、ポリペプチドは、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するため；肺胞マクロファージ（ＡＭ）又はその他の免疫細胞においてアポトーシスを誘導するため；それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における喘息を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するため；又はそのいずれかの組み合わせのために使用してもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドは、それを必要とする対象における肺炎症を予防又は軽減するための一つ以上の追加の薬剤と、任意で共有結合的又は非共有結合的に結合又は複合させる（例えば、任意で、生物学的に切断可能（ｂｉｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）なリンカーを介して）、又は、任意で組み合わせて、同時に、又は、連続して使用してもよいと考えられる。肺炎症を予防又は軽減するための従来の薬剤は、本明細書の教えに関する当業者にとって公知であって、例えば、ステロイドなどが含まれてもよい。
ＣＯＰＤを治療又はコントロールするための従来の薬剤は、例えば、吸入ＬＡＢＡ＋吸入ＬＡＭＡの併用を含んでもよく、ＣＯＰＤ患者の肺機能を改善し、重症化を軽減し得る。ＬＡＢＡ（長時間作用性β２刺激薬）とＬＡＭＡ（長時間作用性抗コリン薬）は、症状コントロールを提供する気管支拡張剤である。ＬＡＢＡの例として、サルメテロールやホルモテロールが挙げられる。ＬＡＭＡの例として、チオトロピウム臭化物やグリコピロニウム臭化物が挙げられる。ほとんどのＣＯＰＤにおいて、コルチコステロイドに対して患者は応答不良を示し、またその副作用プロフィールのため、非炎症性吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）は通常、単独で与えられることはない。通常、ホルモテロール＋ベクロメタソン又はサルメテロール＋フルチカゾンなど、ＬＡＢＡと組み合わせられる。特に重度のＣＯＰＤや、ＣＯＰＤ重症化を軽減するため、ＬＡＢＡ＋ＬＡＭＡ＋ＩＣＳを組み合わせる三重吸入治療も行われる。ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤である、より新しい非炎症剤ロフルミラストは、肺機能を改善し、中等又は重度の重症化を軽減し得る。しかしながら、この薬剤は主要な容量規定副作用をもたらす（オンラインで閲覧可能なＧＯＬＤガイドライン又はＮＩＣＥガイドライン参照）。
特定の実施形態において、それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症と関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するために使用される、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸が提供される。
別の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列又はそのＧＲＰ７８活性化断片を含む、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸が提供される。与えられたアミノ酸に対応するヌクレオチドコドンがよく知られており、本明細書の教えに関する当業者は、与えられたポリペプチドをコードする適切な核酸を容易に選択することが可能であろう。特定の実施形態において、核酸配列は、コーディング領域が、目的の特定の生物における発現のために最適化されたコドンを使用するように選択されてもよい（例えば、大腸菌においてポリペプチドを生成するために核酸を使用する場合、大腸菌における発現のためにコドンを最適化してもよい。又は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ発現を引き起こすために核酸をヒトに投与する場合、ヒトにおける発現のためコドンを最適化してもよい）。特定の実施形態において、核酸は発現可能な核酸であってもよい（すなわち、核酸は、与えられた細胞に導入又は存在する場合、ポリペプチドの発現という結果をもたらすよう設計されてもよい）。特定の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。特定の実施形態において、核酸は、ポリペプチドを提供するために核酸が細胞に導入されると、核酸の翻訳又は転写と翻訳が起こるような適切な上流及び／又は下流配列を有するプラスミド、発現ベクター又はｍＲＮＡであってもよい（特定の実施形態において、開始コドン、ポリＡ尾部（ｐｏｌｙ－Ａ ｔａｉｌ）、ＲＢＳ配列などの、目的の細胞における翻訳のために適切な配列を含んでもよい）。そこにポリペプチドが発現するように対象の肺細胞に核酸を導入する実施形態において、核酸によってコードされたポリペプチドは、特定の実施形態において、ポリペプチドが分泌されるようにシグナルペプチド配列を含むと考えられる。
特定のポリペプチドを細胞に過剰発現又は導入する適切な発現ベクターテクニックは、当該技術分野で周知である（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Ed.), 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。当業者にとって周知の通り、特定のポリペプチドを発現させるヌクレオチド配列は、"Genes VII", Lewin, B. Oxford University Press (2000)又は"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd edition (2001)に記載の特徴をコード又は含んでもよい。特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば市販のベクターなどの、適切なベクターに組み込まれてもよい。ベクターは、例えばSambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd edition (2001))に概説されているような、標準的な分子生物学のテクニックを用いて個々に構築又は修飾されてもよい。当業者は、ベクターが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る、望ましい要素をコードするヌクレオチド配列を含み得ることを認識するだろう。このような望ましい要素をコードするヌクレオチド配列は、転写プロモーター（例えば、構成的又は誘導性プロモーター）、転写エンハンサー、転写ターミネーター及び／又は複製起点を含んでもよい。適切なベクターの選択は様々な要因に依存し、例えばベクターに組み込まれる核酸の大きさ、望ましい転写及び翻訳コントロール要素の種類、望ましい発現レベル、望ましいコピー数、染色体組込が望ましいか、望ましい選択工程の種類、又は、形質転換するよう意図した宿主細胞又は宿主範囲などが含まれるが、これらに限定されない。
そこにポリペプチドを生成する目的で対象又は細胞に核酸を導入する実施形態において（例えば、ポリペプチドの製造、又は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ治療用途のため）、核酸は、細胞内に核酸を導入することに適する適切な核酸デリバリー溶媒又はトランスフェクション試薬と複合されてもよいと、特定の実施形態において考えられる。特定の実施形態において、核酸は、細胞内にデリバリーするためウイルスに導入されてもよく、核酸は細胞のゲノムと統合してもしなくてもよい。本明細書の教えに関する当業者は、与えられた細胞又はそれを必要とする対象に本明細書に記載の核酸をデリバリーするために選択される、様々なデリバリー溶媒、トランスフェクション試薬及び／又はウイルス性デリバリー構築物を認識しているだろう。
別の実施形態において、本明細書に記載の核酸配列のいずれかと完全又は部分的に相補的な核酸配列が提供される。
本明細書に言及した通り、特定の配列またはその特定の部分に対するパーセント（％）同一性又は％配列同一性は、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じて配列を整列してギャップを挿入した後、検索パラメータをデフォルト値に設定したプログラムＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２．０で作成された、対象配列（又はその特定の部分）におけるヌクレオチド又はアミノ酸と同一の候補配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージと定義されてもよい（Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410; website at blast.wustl.edu/blast/README.html）。例として、％同一性値は、マッチする同一のヌクレオチド又はアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告された配列の長さで割ったものによって判定してもよい。パーセント（％）アミノ酸配列類似性は、％アミノ酸配列同一性を判定するために使用した同じ計算によって判定してもよいが、例えば、算出において同一のアミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含んでもよい。例えばＢＬＡＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ；デフォルトパラメータ使用）などの、オリゴヌクレオチド又はアミノ酸の整列アルゴリズムを用いて、配列同一性％を算出してもよい。
別の実施形態において、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸；及び
薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤；
を含む組成物が提供され、
前記組成物は対象の肺に投与するために処方される。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は発現可能な核酸は、上記の、又は、本明細書のどこかに記載のポリペプチド又は発現可能な核酸を含んでもよい。
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤は、本明細書の教えに関する当業者が知っているあらゆる担体、希釈剤又は賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容可能な賦形剤の例として、セルロース誘導体、ショ糖及びデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、薬学的に許容可能な賦形剤が、当該技術分野において周知である適切な充填剤、結合剤、潤滑剤、緩衝剤、滑剤、分散剤及び／又は崩壊剤を含み得ることを認識しているだろう（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2006)参照）。薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び賦形剤の例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（2000 - 20th edition）及び米国薬局方：1999年発行の国民医薬品集(USP 24 NF19)にて発見され得る。本明細書の教えに関する当業者は、それを必要とする対象の肺への、本明細書に記載のポリペプチド又は核酸を処方するために適切な薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を認識しているだろう。特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド及び／又は核酸及び／又は組成物は、薬学的に許容可能な担体として、加圧又は無加圧のプロペラント又はキャリアガスとともに処方されてもよい。
特定の実施形態において、タンパク質及びペプチドなどの巨大分子のエアゾールデリバリーは、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）又はネブライザーなどの装置を介して行ってもよい。このような巨大分子によく使用される賦形剤は、界面活性剤、糖（例えば、ショ糖、トレハロース）及び／又はポリオール（例えば、ＰＥＧ）のいずれか一つ以上を含んでもよい。アミノ酸（例えば、グリシン、リジン）は、安定剤としてよく使用される。例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる、Expert Opin Drug Deliv (2018) 15:729-736及びAdv Drug Deliv Rev (2015), 93:79-94を参照。
特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸及び／又は組成物は、それを必要とする対象の肺に投与するために処方されてもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺に投与するための薬剤を処方するための様々な適切なアプローチやテクニックを認識しているだろう（例えば、経肺デリバリー）。薬剤、特にタンパク質を肺にデリバリーすることは、重要な研究対象であり、例えば、Bodier-Montagutelli, E., et al., 2018, Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery: what are the next steps?, Expert Opinion on Drug Delivery, 15(8): 729-736；Labiris, N. R., et al., 2003, Pulmonary Drug Delivery. Part II: The role of inhalant delivery devices and drug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications, Br J Clin Pharmacol, 56:600-612；及びIbrahim, M., et al., 2015, Inhalation drug delivery devices: technology update, Med Devices (Auckl), 8:131-9に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸及び／又は組成物は、適切なドラッグデリバリー装置を用いて肺にデリバリーされるためであってもよい。特定の実施形態において、ドラッグデリバリー装置は、吸入器、ネブライザー、エアゾール、パッファー（ｐｕｆｆｅｒ）、鼻スプレー又はその他の肺への投与に適切なデリバリー装置などの肺用の装置の形態であってもよい。肺へのデリバリー装置の例は、米国特許番号／特許出願公開番号：ＵＳ５９８３８９３号、ＵＳ６７３２７３２号、ＵＳ２００７０２９５３３２号、ＵＳ５００７４１９号、ＵＳ４８３２０１５号、ＵＳ２００４０２４４７９４号、ＵＳ２０１０００６５０４８号、ＵＳ２００３０２３５５５５号、ＵＳ２００５０２０１９５１号及びＵＳ２００９００００６１５号に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与するために処方されてもよい。特定の実施形態において、組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するために処方されてもよい。特定の実施形態において、組成物は、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するため；それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスの誘導するため；肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；それを必要とする対象におけるＡＭレベルを低下させるため；それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における喘息を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるため；それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するため；又はそれらの組み合わせのために使用してもよい。
特定の実施形態において、炎症誘発性細胞は、マクロファージ、好中球、T及びＢリンパ球、ＮＫ細胞又はその他の自然及び／又は適応免疫細胞のいずれか一つ以上を含んでもよい。肺において、マクロファージは肺胞マクロファージ、間質性マクロファージ又はその両方を含んでもよい。
特定の実施形態において、肺炎症に関連する肺疾患又は障害は、ＣＯＰＤ、突発性肺線維症（ＩＰＦ）、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、喘息、急性気管支炎、肺気腫、肺炎又はその他のいずれか一つ以上を含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象における肺炎症を予防又は軽減するための追加の薬剤の一つ以上を、さらに任意で含む、又は、それらを任意で組み合わせて、同時に、又は、連続して使用してもよいと考えられる。本明細書の教えに関する当業者にとって、肺炎症を予防又は軽減するための従来の薬剤は周知であろう。例えば、ステロイドなどが含まれてよい。従来の薬剤の例は、すでに上記に記載した。
また別の実施形態において、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を含む経肺ドラッグデリバリー装置が提供される。特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物が含まれる、又は、充填されていてもよい。特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物が充填された、交換可能又は交換可能でないカートリッジと構成されてもよい。当然のことながら、経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象の肺に、本明細書に記載のペプチド、核酸又は組成物を投与するための任意の一般的に適切な医療装置を含んでもよい。本明細書の教えに関する当業者は、本明細書に記載のペプチド、核酸又は組成物をデリバリーするために構成され得る様々な装置を認識しているだろう。特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、例えば、気管内ドラッグデリバリー装置、鼻腔内ドラッグデリバリー装置又は吸入ドラッグデリバリー装置を含んでもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺に薬剤を投与するために適切な様々な医療装置の設計を認識しているだろう（すなわち、活性剤の経肺デリバリー）。薬剤、特にタンパク質を肺にデリバリーすることは、重要な研究対象であり、例えば、Bodier-Montagutelli, E., et al., 2018, Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery: what are the next steps?, Expert Opinion on Drug Delivery, 15(8): 729-736；Labiris, N. R., et al., 2003, Pulmonary Drug Delivery. Part II: The role of inhalant delivery devices and drug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications, Br J Clin Pharmacol, 56:600-612；及びIbrahim, M., et al., 2015, Inhalation drug delivery devices: technology update, Med Devices (Aukl), 8:131-9に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、肺へのデリバリーのための任意の適切なドラッグデリバリー装置を含んでもよい。特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、エアゾール、鼻スプレー、吸入器、パッファー、ネブライザー又はその他の肺投与のための適切なデリバリー装置を非限定的な例として含んでもよい。経肺ドラッグデリバリー装置の例は、米国特許番号／特許出願公開番号：ＵＳ５９８３８９３号、ＵＳ６７３２７３２号、ＵＳ２００７０２９５３３２号、ＵＳ５００７４１９号、ＵＳ４８３２０１５号、ＵＳ２００４０２４４７９４号、ＵＳ２０１０００６５０４８号、ＵＳ２００３０２３５５５５号、ＵＳ２００５０２０１９５１号及びＵＳ２００９００００６１５号に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、例えば、経肺ドラッグデリバリー装置はエアゾールを含んでもよく、ポリペプチド又は核酸は乾燥粉末として処方されてもよいと考えられる。あるいは、経肺ドラッグデリバリー装置はネブライザーを含んでもよく、ポリペプチド又は核酸は液体として処方されてもよいと考えられる。特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、対応して処方された本明細書に記載のペプチド、核酸又は組成物で充填されたネブライザー、定量噴霧吸入器（ＭＤＩ）又はドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）を含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺炎症を予防又は軽減するための追加の薬剤を一つ以上任意でさらに含む、又は、それらと組み合わせて、同時に、又は、連続して使用するためのものであってもよいと考えられる。本明細書の教えに関する当業者にとって、肺炎症を予防又は軽減するための従来の薬剤は周知であり、例えば、ステロイドなどが含まれてもよい。従来の薬剤の例は、すでに上記に記載した。
特定の実施形態において、経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象におけるＧＲＰ活性を調節するため；それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するため；肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；それを必要とする対象におけるＡＭレベルを低下させるため；それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における喘息を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるため；それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するため；又はそれらの組み合わせのために使用してもよい。
炎症に関連する疾患又は障害を治療するための方法及び使用
本明細書において、例えば、炎症、特に肺炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するための使用及び方法が提供される。特定の実施形態において、このような使用及び方法は、上記に記載したような、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、組成物及び／又は経肺ドラッグデリバリー装置の一つ以上を使用してもよい。
特定の実施形態において、例えば、本明細書に記載のペプチド、ポリペプチド、核酸及び／又は組成物は、対象の肺に投与又はデリバリーされるものであって、ペプチド又はポリペプチド又は核酸又は組成物は、気管内投与、鼻腔内投与又は吸入（例えば、経口吸入）投与又はデリバリーによってデリバリーされてもよい。特定の実施形態において、ペプチド、ポリペプチド、核酸又は組成物は、例えばエアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、ペプチド又はポリペプチドは、乾燥粉末として処方しエアゾール化によって肺に投与してもよく、又は、液体として処方し噴霧化によって肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺に投与（すなわち、経肺デリバリー）するための様々な適切なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。薬剤、特にタンパク質を肺にデリバリーすることは、重要な研究対象であり、例えば、Bodier-Montagutelli, E., et al., 2018, Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery: what are the next steps?, Expert Opinion on Drug Delivery, 15(8): 729-736; Labiris, N. R., et al., 2003, Pulmonary Drug Delivery. Part II: The role of inhalant delivery devices and drug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications, Br J Clin Pharmacol, 56:600-612；及びIbrahim M., et al., 2015, Inhalation drug delivery devices: technology update, Med Devices (Auckl), 8:131-9に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法の一部として記載された本明細書に記載のポリペプチド、核酸及び／又は組成物の投与は、肺への投与に適する任意のドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。特定の実施形態において、ドラッグデリバリー装置は、吸入器、ネブライザー、エアゾール、パッファー、鼻スプレー又はその他の肺への投与に適切なドラッグデリバリー装置などの肺用の装置の形態であってもよい。経肺デリバリー装置の例は、米国特許番号／特許出願公開番号：ＵＳ５９８３８９３号、ＵＳ６７３２７３２号、ＵＳ２００７０２９５３３２号、ＵＳ５００７４１９号、ＵＳ４８３２０１５号、ＵＳ２００４０２４４７９４号、ＵＳ２０１０００６５０４８号、ＵＳ２００３０２３５５５５号、ＵＳ２００５０２０１９５１号及びＵＳ２００９００００６１５号に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
簡潔にするため、ポリペプチドという用語は、本明細書において、一般的に任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は一般的な任意の長さのアミノ酸を説明するために使用される。ポリペプチドという用語は、特定の実施形態及び／又は用途に使用されるアミノ酸の長さに応じて、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに言及しているものとして理解されてもよい。例えば、ポリペプチドが３０アミノ酸より短い場合の実施形態において、ポリペプチドはペプチドとして考えられてもよい。別段の表示がない限り、本明細書におけるポリペプチドという用語の使用は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含むことを意図している。
ポリペプチドをコードする核酸を対象の肺に投与する場合の特定の実施形態において、核酸は、例えば気管内投与、鼻腔内投与又は経口投与によってデリバリーされてもよい。特定の実施形態において、核酸は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、核酸は、乾燥粉末として処方しエアゾール化によって肺に投与してもよいし、液体として処方し噴霧化によって肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺への投与（すなわち、経肺デリバリー）に適する様々なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。対象に核酸を投与する特定の実施形態において、それがコードするポリペプチドを生成することを目的として、核酸は、対象又は細胞に導入されてもよい。特定の実施形態において、核酸は、発現ベクター又は発現カセットを含んでもよい。特定の実施形態において、核酸は、ＤＮＡベクターを含んでもよい。特定の実施形態において、核酸は、細胞内に核酸を導入するために適する、適切な核酸デリバリー溶媒又はトランスフェクション試薬と複合されてもよいと考えられる。特定の実施形態において、核酸は、細胞内にデリバリーするためウイルスに組み込まれてもよく、核酸は、細胞のゲノムに統合されてもされなくてもよい。本明細書の教えに関する当業者は、与えられた細胞又はそれを必要とする対象に本明細書に記載の核酸をデリバリーするために選択され得る、様々なデリバリー溶媒、トランスフェクション試薬及び／又はウイルスデリバリー構築物を認識しているだろう。例えば、Gomes et al., 2017, Expert Opin Drug Deliv., 2017, 14(3):319-330を参照。また、これは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の通り、イスミン１（ＩＳＭ１）に由来する、及び／又は、基づく、肺炎症などの炎症を治療するための方法を本発明らは開発した。イスミン１（ＩＳＭ１）は、炎症、特に肺の炎症を阻害、抑制及び／又は消退させる役割を果たすものとして、本明細書に記載の研究によって示される分泌タンパク質である。以下に詳細に記載する研究において、補足的な外因性組換えＩＳＭ１タンパク質（ｒＩＳＭ１）を肺に提供することで、ＩＳＭ１欠乏性の肺における肺炎症表現型が阻害され、結果は、ＩＳＭ１の投与が肺胞マクロファージアポトーシスを誘導することによって、炎症の消退を助け得ることを示す。結果はさらに、ＩＳＭ１が無菌性肺炎症、及び／又は、感染及び／又は外傷によって引き起こされる炎症の抑制及び／又は消退において重要な役割を果たし得ることを示す。
したがって、一つの実施形態において、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節する方法が提供され、その方法は：
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質またはそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
特定の実施形態において、ＧＲＰ７８活性の調節は、ＧＲＰ７８活性を引き起こし（アポトーシス促進効果を提供し）、対象における炎症を緩和するように、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物を投与することを含んでもよい。通常、対象におけるＧＲＰ７８アポトーシス促進活性レベルが、炎症、特に対象の肺の炎症を適度に阻害、抑制及び／又は消退させるのに低すぎる場合、ＧＲＰ７８活性の調節は、対象におけるＧＲＰ７８活性レベルを上げる（すなわち、ＧＲＰ７８結合から生じるアポトーシス促進効果を増加させる）ことを含んでもよい。特定の実施形態において、対象におけるＧＲＰ７８活性レベルが、炎症状態を緩和するために十分な肺胞マクロファージアポトーシスを誘導するのに低すぎる場合、ＧＲＰ７８活性の調節は、対象におけるＧＲＰ７８活性レベルを上げることを含んでもよい。肺疾患又は障害を治療する特定の実施形態において、ＧＲＰ７８活性レベルに関する言及は、例えば、対象の肺胞マクロファージ（ＡＭ）などの対象の肺組織又は肺細胞におけるＧＲＰ７８の活性レベルを含んでもよい。当然のことながら、特定の実施形態において、ＧＲＰ７８活性レベル又はＧＲＰ７８活性に関する本明細書の言及は、アポトーシス促進効果を提供し得る、リガンド結合の際に細胞内にシグナルを伝達する時のＧＲＰ７８のレベル又は活性に言及していると理解されてもよい。
ＧＲＰ７８のレビューは、Ni, et al., Biochem J., 2011, 434(2): 181-188に見られ、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、ＩＳＭ１は、高いｃｓＧＲＰ７８レベルの細胞を死滅させる、又は、標的化することを支持する、又は、より選択的になると考えられる。通常環境下の健康な細胞は、ｃｓＧＲＰ７８が比較的低いレベル、又は、存在しないはずである。ＧＲＰ７８発現レベルはストレス下の細胞において上昇し、高いレベルのｃｓＧＲＰ７８を抱える細胞はＩＳＭ１に反応し、アポトーシスを引き起こし得ると考えられる。したがって、ストレスを受けた細胞は、細胞外ＩＳＭ１の好ましい標的となり得る（Chen et al., Cell Death & Differentiation, 21(5): 797-810, 2014を参照。参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、上昇したｃｓＧＲＰ７８レベルを有する細胞は、健康な細胞よりも、ＩＳＭ１誘導性アポトーシス性シグナル伝達に対してより強く反応し、特定の実施形態においては副作用を減少させ得ると考えられる。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、対象の肺に気管内投与、鼻腔内投与又は経口投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、乾燥粉末として処方しエアゾール化によって肺に投与してもよいし、液体として処方し噴霧化によって肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺への投与（すなわち、経肺デリバリー）に適する様々なアプローチ及びテクニック認識しているだろう。薬剤、特にタンパク質を肺にデリバリーすることは、重要な研究対象であり、例えば、Bodier-Montagutelli, E., et al., 2018, Designing inhaled protein therapeutics for topical lung delivery: what are the next steps?, Expert Opinion on Drug Delivery, 15(8): 729-736；及びLabiris, N. R., et al., 2003, Pulmonary Drug Delivery. Part II: The role of inhalant delivery devices and drug formulations in therapeutic effectiveness of aerosolized medications, Br J Clin Pharmacol, 56:600-612に記載されており、これらは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
別の実施形態において、それを必要とする対象における炎症誘発性細胞又は肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導する、又は、それを必要とする対象におけるＡＭレベルを低下させる方法が提供され、前記方法は：
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
特定の実施形態において、肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導することは、対象の肺における少なくともいくつかの肺胞マクロファージがアポトーシスを引き起こすように、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物を対象に投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、肺機能低下は、例えば、肺活量計を用いて非侵襲的に測定してもよい。重度の炎症は、高いＡＭの間接的な指標であり得て、気腔免疫細胞の約９５％を占めることもある。重度の炎症は、肺を損傷し、その機能を低下させ得る。臨床現場において、肺の状況が低酸素血症と呼吸困難などを伴って低下する場合、臨床医は抗炎症薬を与えることがある。したがって、特定の実施形態において、肺機能低下が認められる場合、重度の炎症が認められる場合、及び／又は、ＡＭアポトーシスレベルが低いと判定される場合、ポリペプチド又は核酸の投与を行ってもよい。
特定の実施形態において、炎症誘発性細胞におけるアポトーシスの誘導は、対象の肺における少なくともいくつかの炎症誘発性細胞がアポトーシスを引き起こすように、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物を対象に投与することを含んでもよい。炎症誘発性細胞は、ＡＭ、好中球、間質性マクロファージ、Ｔ及びＢ細胞、ＮＫ細胞などを含んでもよい。特定の実施形態において、ＩＳＭ１は、ＡＭなどの炎症誘発性細胞を標的化することを支持し、高いｃｓＧＲＰ７８選択性を抱えてもよい。例えばたばこ煙の下で、ほとんどのＡＭはストレス活性化され、高いｃｓＧＲＰ７８レベルを抱え、ＩＳＭ１の標的となり得る。
特定の実施形態において、対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルを低下させることは、対象の肺における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルの低下を引き起こすように、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物を対象に投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、健康対照者、又は、症状の軽い疾患対照者と比べて、対象におけるＡＭレベルが上昇したと判定される場合、投与を行ってもいいと考えられる。特定の実施形態において、対象から採取される気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の試料からＡＭレベルを判定し、ＢＡＬＦにおいてＡＭを測定してもよいと考えられる。代わりに、又は、加えて、ＡＭレベルの間接的な尺度として、肺機能をモニターしてもよい。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、対象の肺に気管内投与、鼻腔内投与又は経口投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド、核酸又は組成物は、乾燥粉末として処方しエアゾール化によって肺に投与してもよいし、液体として処方し噴霧化によって肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺への投与（すなわち、経肺デリバリー）に適する様々なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
特定の実施形態において、肺炎症は、無菌性肺炎症、及び／又は、感染及び／又は外傷によって引き起こされる炎症などを含む、肺のあらゆる炎症状態又は状況を含んでもよい。特定の実施形態において、肺炎症は、ＣＯＰＤ、肺気腫、気管支炎、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、ＩＰＦ、肺炎などに関連する肺炎症であってもよい。特定の実施形態において、肺炎症は、肺機能低下及び／又は低酸素血症を測定することによって測定してもよく、炎症又は炎症の重症化が確認された場合に投与を行ってもよい。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、対象の肺に気管内投与、鼻腔内投与又は経口投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、乾燥粉末として処方しエアゾール化によって肺に投与してもよく、液体として処方し噴霧化によって肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺への投与（すなわち、経肺デリバリー）に適する様々なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
特定の実施形態において、肺炎症に関連する肺疾患又は障害は、一般的に、炎症によって引き起こされる、又は、炎症を伴う肺の疾患、障害、状態又は状況のいずれかを含んでもよい。例として、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎、喘息、肺気腫、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺線維症（例えば、突発性肺線維症など）又はそのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、対象の肺に気管内投与、鼻腔内投与又は経口投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、乾燥粉末として処方しエアゾール化して投与してもよく、液体として処方し噴霧化して肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺への投与（すなわち、経肺デリバリー）に適する様々なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。
別の実施形態において、それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎、喘息又は肺気腫を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
別の実施形態において、それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象の肺に投与することを含む。
上記方法のいずれかの更なる実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、例えば上記に記載されたものなどの、本明細書に記載のポリペプチド又は核酸のいずれかを含んでもよい。前節は、適切なポリペプチド及び核酸の広範囲にわたる説明や例を提示している。特定の実施形態において、ポリペプチド及び／又は核酸は、すでに上記に詳述した組成物に提供又は処方されてもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド、核酸及び／又は組成物は、すでに上記に詳述した経肺ドラッグデリバリー装置で提供されてもよい。
上記方法のいずれかの更なる実施形態において、方法は、肺炎症を予防又は軽減するための薬剤を、ポリペプチド又は核酸と組み合わせて、同時に、又は、連続して対象に投与する工程を更に含んでもよい。
上記方法のいずれかの更なる実施形態において、方法は、肺炎症を予防又は軽減するための追加の薬剤を一つ以上、対象に投与する工程を更に含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、組成物及び／又は経肺ドラッグデリバリー装置は、それを必要とする対象における肺炎症を予防又は軽減するため追加の薬剤を、任意で更に含む、又は、任意で組み合わせて、同時に、又は、連続して使用してもよいと考えられる。本明細書の教えに関する当業者にとって、肺炎症を予防又は軽減するための従来の薬剤は周知であり、例えば、ステロイドなどを含んでもよい。従来の薬剤は、すでに上記に記載した。
上記方法のいずれかの特定の実施形態において、方法は更に、
対象におけるＩＳＭ１レベルを判定する；対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定する；対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルを判定する；対象における炎症レベルを判定する；対象における肺機能低下レベルを判定する；又はそのいずれかの組み合わせを行う工程と、
健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における炎症レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における肺機能低下のレベルの上昇が判定された場合；又はそのいずれかの組み合わせの場合に、投与工程を実行する又は繰り返す工程、を含む。
特定の実施形態において、対象のＩＳＭ１レベルは、本明細書の教えに関する当業者にとって周知であるいずれかの適切なテクニックを用いて判定してもよい。例えば、特定の実施形態において、ＩＳＭ１レベルは、対象の血液、血清、喀痰又はＢＡＬＦ試料のＥＬＩＳＡ試験によって判定してもよい。特定の実施形態において、ＩＳＭ１レベルは、例えば、血液又は喀痰の試料における質量分析定量化によって判定してもよい。特定の実施形態において、ＩＳＭ１レベルは、（例えば、ＢＡＬＦから）分離されたＡＭ試料の免疫細胞化学及び／又は蛍光免疫染色によって判定してもよい。特定の実施形態において、ＩＳＭ１レベルは、対象の肺組織におけるＩＳＭ１レベル、対象の切除された肺組織におけるＩＳＭ１レベル、又は、対象の肺胞マクロファージ（ＡＭ）におけるＩＳＭ１レベルを含んでもよい。特定の実施形態において、対象の判定されたＩＳＭ１レベルは、健康対照レベル（すなわち、健康な対照対象のグループにおいて観察されたＩＳＭ１レベル又は範囲）又は低重症度の疾患対照レベル（すなわち、疾患又は障害を持つが、重症度が低い疾患対照グループにおいて観察されたＩＳＭ１レベル又は範囲）と比較してもよい。もし対象のＩＳＭ１レベルが、健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルのＩＳＭ１レベルより低いと判定された場合、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物による治療又は追加治療を対象に施してもよい。特定の実施形態において、対照レベルに対して減少したＩＳＭ１レベルは、対照レベルから少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％減少したレベルとして特定してもよい。
特定の実施形態において、ＩＳＭ１レベルが低い対象は、ＩＳＭ又はその断片又はその誘導体による治療に対し、潜在的に特に感受性が高い対象として特定してもよい。しかしながら、特定の実施形態において、内在性ＩＳＭ１のレベルが比較的高い対象であっても、炎症が持続する場合、ＩＳＭ１レベルが重度の炎症を克服するのに依然として十分に高くない可能性もあり、追加で本明細書に記載の外因性ＩＳＭ１又はその断片又は誘導体を投与することが望ましくなることが認識されるだろう。
特定の実施形態において、対象のＧＲＰ７８タンパク質レベルは、本明細書の教えに関する当業者にとって周知である任意の適切なテクニックを用いて判定してもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８タンパク質レベルは、総細胞ＧＲＰ７８レベル、ｃｓＧＲＰ７８タンパク質レベル、又はその両方であってもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８レベルは、例えば、蛍光イメージングにおける蛍光プローブ（ペプチドリガンドなど）、又は、ＰＥＴイメージングなどにおける放射性同位体標識プローブを用いて判定してもよい。特定の実施形態において、このようなプローブは、哺乳類又はヒト対象などの生物に使用してもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８タンパク質レベルは、対象の肺組織におけるＧＲＰ７８タンパク質レベル、対象の切除された肺組織におけるＧＲＰ７８タンパク質レベル、又は、対象の肺胞マクロファージ（ＡＭ）におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを含んでもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、ウエスタンブロット、又は、その他の適切なテクニックによって判定してもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８タンパク質レベルは、生体組織診断から得られる肺組織の試料から判定してもよい。特定の実施形態において、対象の判定されたＧＲＰ７８タンパク質レベルは、健康対照レベル（すなわち、健康な対照対象のグループにおいて観察されたＩＳＭ１レベル又は範囲）、及び／又は、低重症度の疾患対照レベル（すなわち、疾患又は障害を持つが重症度の低い疾患対照グループにおいて観察されたＩＳＭ１レベル又は範囲）と比較してもよい。対象のＧＲＰ７８タンパク質レベルが、健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルのＧＲＰ７８タンパク質レベルより高いと判定された場合、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物による治療又は追加治療を対象に施してもよい。特定の実施形態において、対照レベルに対して上昇したＩＳＭ１レベルは、対照レベルから少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％上昇したレベルとして特定してもよい。特定の実施形態において、ＧＲＰ７８タンパク質レベルは、対象の肺胞マクロファージのＧＲＰ７８タンパク質レベルであってもよい。しかしながら、対象において炎症が存在する場合、特定の実施形態において、ＧＲＰ７８レベルが上昇したと判定されるか否かにかかわらず、本明細書に記載のＩＳＭ１又はその断片又は誘導体による治療が望ましいと考えられることが理解されるだろう。高いｃｓＧＲＰ７８を有する細胞はＩＳＭ１誘導性アポトーシスによって標的化されるため、対象のＡＭの一部のみが高いｃｓＧＲＰ７８を抱えたとしても、細胞死を引き起こすことでこれらの細胞を除去することは、それでも意味のあることと考えられる。
特定の実施形態において、対象の肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルは、本明細書の教えに関する当業者にとって周知である任意の適切なテクニックを用いて判定してもよい。例として、特定の実施形態において、ＡＭレベルを判定するために誘発喀痰を使用してもよい。特定の実施形態において、本明細書の教えに関する当業者にとって周知であろう誘発喀痰の手順は、例えば、肺胞マクロファージ及び／又は喀痰サイトカインレベルを含む喀痰の内容を研究するために使用してもよい。特定の実施形態において、肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルは、例えば、対象の肺組織における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベル、又は、対象の切除された肺組織における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルを含んでもよい。特定の実施形態において、ＡＭレベルは、ＢＡＬＦを採取し、細胞数を数えることで判定してもよい。特定の実施形態において、対象の判定された肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルは、健康対照レベル（すなわち、健康な対照対象のグループにおいて観察された肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベル又は範囲）、及び／又は、低重症度の疾患対照レベル（すなわち、疾患又は障害を持つが重症度の低い疾患対照グループにおいて観察された肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベル又は範囲）と比較してもよい。対象の肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルが、健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルの肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルより高いと判定された場合、対象は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物による治療又は追加治療を施されてもよい。特定の実施形態において、対照レベルに対して上昇した肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルは、対照レベルから少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％上昇したレベルとして特定してもよい。
特定の実施形態において、肺機能低下、呼吸困難、低酸素血症、又は、ＣＯＰＤなどの炎症に関連するその他の肺疾患又は障害を対象が呈する場合、投与を行う又は繰り返してもよい。
特定の実施形態において、対象の炎症レベルは、本明細書の教えに関する当業者にとって周知である任意の適切なテクニックを用いて判定してもよい。特定の実施形態において、炎症レベルは、例えば、対象の肺組織における炎症レベル、又は、対象の切除された肺組織における炎症レベルを含んでもよい。特定の実施形態において、炎症は、発熱（及びその高さ）や、低酸素血症、呼吸困難、息切れ、咳、痰、血液白血球数又はその他の炎症の尺度などの症状の重症度などによって判定又は示されてもよい。特定の実施形態において、炎症は、免疫細胞数、ＴＮＦ－αなどの炎症誘発性サイトカインのレベル、ＮＦ－κＢシグナル伝達のレベル、ＭＭＰなどのプロテアーゼのレベル、又は、その他のそのような尺度によって判定又は示されてもよい。特定の実施形態において、対象の判定された炎症レベルは、健康対照レベル（すなわち、健康な対照対象のグループにおいて観察された炎症レベル又は範囲）、及び／又は、低重症度の疾患対照レベル（すなわち、疾患又は障害を持つが重症度の低い疾患対照グループにおいて観察された炎症レベル又は範囲）と比較してもよい。対象の炎症レベルが、健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルの炎症レベルより高いと判定された場合、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物による治療又は追加治療を対象に施してもよい。特定の実施形態において、対照レベルに対して上昇した炎症レベルは、対照レベルから少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％上昇したレベルとして特定してもよい。
特定の実施形態において、対象における肺機能低下のレベルは、本明細書の教えに関する当業者にとって周知である任意の適切なテクニックを用いて判定してもよい。例えば、スパイロメトリーを用いてもよいし、上述したような呼吸困難、低酸素血症などで示される症状によって判定してもよい。特定の実施形態において、対象の判定された肺機能低下のレベルは、健康対照レベル（すなわち、健康な対照対象のグループにおいて観察された肺機能低下のレベル又は範囲）、及び／又は、低重症度の疾患対照レベル（すなわち、疾患又は障害を持つが重症度の低い疾患対照グループにおいて観察された肺機能低下のレベル又は範囲）と比較してもよい。対象の肺機能低下のレベルが、健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルの肺機能低下のレベルより高いと判定された場合、本明細書に記載のポリペプチド、核酸又は組成物による治療又は追加治療を対象に施してもよい。特定の実施形態において、対照レベルに対して上昇した肺機能低下のレベルは、対照レベルから少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％損なわれたレベルとして特定してもよい。例えば、ＣＯＰＤ臨床基準では、ＦＥＶ１／ＦＶＣが＜０．７（Ｔｉｆｆｅｎｅａｕ－Ｐｉｎｅｌｌｉ指標）とされているため、通常、肺機能低下はスパイロメトリーで少なくとも３０％の低下で、このような基準の下、ＣＯＰＤとしてみなされる。しかしながら、例えば、ＣＯＰＤの進行を予防するためには、早期治療が好ましいと考えられる。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、対象に投与することを含む。
別の実施形態において、それを必要とする対象における肺炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するための方法が提供され、前記方法は、
ＧＲＰ７８活性剤を対象の肺に投与することを含む。
別の実施形態において、それを必要とする対象において、肺の恒常性を維持するため、肺の炎症を消退させるため、及び／又は、肺の修復を促進してリモデリングを軽減するための方法が提供され、前記方法は、
イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を、対象の肺に投与することを含む。
特定の実施形態において、本明細書で言及する対象は、治療を必要とする任意の適切な対象を含んでもよい。特定の実施形態において、対象は、哺乳類を含んでもよい。特定の実施形態において、対象は、ヒトを含んでもよい。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するため；それを必要とする対象における炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するため；それを必要とする対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；それを必要とする対象におけるＡＭレベルを低下させるため；それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象において肺炎症と関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における喘息を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるため；それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺の恒常性を維持する、及び／又は、肺の炎症を消退させる、及び／又は、肺の修復を促進してリモデリングを軽減するため；又はそのいずれかの組み合わせための、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、対象の肺に投与するためであってもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、対象の肺に気管内投与、鼻腔内投与又は経口吸入投与によって投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸又は組成物は、乾燥粉末として処方しエアゾール化によって肺に投与してもよく、液体として処方し噴霧化によって肺に投与してもよい。特定の実施形態において、投与は、本明細書に記載の経肺ドラッグデリバリー装置を用いて行ってもよい。本明細書の教えに関する当業者は、肺への投与（すなわち、経肺デリバリー）に適する様々なアプローチ及びテクニックを認識しているだろう。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は核酸は、肺炎症を予防又は軽減するための追加の薬剤と組み合わせて使用してもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、組成物及び／又は経肺ドラッグデリバリー装置は、任意で更に、それを必要とする対象における肺炎症を予防又は軽減するための追加の薬剤を一つ以上含む、又は、それらを任意で組み合わせて、同時に、又は、連続して使用してもよいと考えられる。本明細書の教えに関する当業者にとって、肺炎症を予防又は軽減するための従来の薬剤は周知であり、例えば、ステロイドなどを含んでもよい。従来の薬剤は、すでに上記に記載した。
別の実施形態において、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するため；それを必要とする対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；それを必要とする対象における肺炎症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象において肺炎症と関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における喘息を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺線維症を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象におけるマクロファージ媒介性炎症に関連する疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；それを必要とする対象における肺の恒常性を維持する、及び／又は、肺の炎症を消退させる、及び／又は、肺の修復を促進してリモデリングを軽減するため；又はそのいずれかの組み合わせための薬剤の製造における、イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする発現可能な核酸の使用が提供される。
特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸及び／又は組成物は、それを必要とする対象に、例えば、１日１回、２回又はそれ以上；１日、２日、３日又はそれ以上毎に１回；又は症状に応じて必要な回数、投与するためであってもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸及び／又は組成物は、例えば、ネブライザーによって投与するためであってもよい。マウスモデルを用いた以下に記載の研究において、２日に１回、５ｕｇ／用量の気管内デリバリーによる投与が有効であった。
治療に対する感受性が高い対象の診断及び／又は特定の方法
別の実施形態において、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有する、又は、発症するリスクがある対象を特定する方法が提供され、前記方法は、
対象におけるＩＳＭ１レベルを判定すること；対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定すること；対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルを判定すること；対象における炎症レベルを判定すること；又はそのいずれかの組み合わせと、
健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における炎症レベルの上昇が判定された場合；又はそのいずれかの組み合わせの場合に、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有する、又は、発症するリスクがあると、対象を特定することを含む。
上記方法の特定の実施形態において、方法は、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有する、又は、発症するリスクがあると対象の特定を更に確認又は支持するため、従来のアッセイ又はテクニックを一つ以上行うことを更に含んでもよい。特定の実施形態において、例えば、血液総白血球数及び／又は白血球百分率を用いてもよい。特定の実施形態において、従来のアッセイ又はテクニックは、例えば、肺機能の主要評価項目（ＦＥＶ１／ＦＶＣ、ＦＲＣ、ＰＥＦＲなど）及び／又は生活の質のためのＣＯＰＤ患者用Ｓｔ． Ｇｅｏｒｇｅ‘ｓ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＧＲＱ－Ｃ）（咳、痰、息切れ、喘鳴など）及び／又は増悪の数を含んでもよい。
別の実施形態において、本明細書に詳細に記載の治療方法による治療の候補対象を特定する方法が提供され、前記方法は、
対象におけるＩＳＭ１レベルを判定すること；対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定すること；対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルを判定すること；対象における炎症レベルを判定すること；又はそのいずれかの組み合わせと、
健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における肺胞マクロファージ（ＡＭ）レベルの上昇が判定された場合；健康対照レベル又は低重症度の疾患対照レベルに対して、対象における炎症レベルの上昇が判定された場合；又はそのいずれかの組み合わせの場合に、対象を治療の候補対象として特定すること、を含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載の、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有する、又は、発症するリスクがあると対象を特定する方法は、肺炎症に関連する肺疾患又は障害を有すると特定された対象を治療する工程を更に含んでもよい。特定の実施形態において、特定された対象を治療する工程は、本明細書に記載のいずれかの治療方法によって対象を治療することを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の治療方法によって治療する候補対象を特定する方法は、特定された対象を治療する工程を更に含んでもよい。特定の実施形態において、特定された対象を治療する工程は、本明細書に記載の治療方法のいずれかの方法によって対象を治療することを含んでもよい。
実施例。
以下に記載の実施例において、遺伝子標的化アプローチによってマウスから分泌タンパク質ＩＳＭ１の除去したところ、ヒトＣＯＰＤに似た特徴を持つ突発性肺炎症及び進行性肺気腫を引き起こした。さらに、ＩＳＭ１を除去したところ、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性急性肺損傷（ＡＬＩ）に対する炎症反応の高まりを引き起こした。さらに、外因性組換えＩＳＭ１タンパク質（ｒＩＳＭ１）を気管内補給（すなわち、肺への局所的投与したところ、マウスにおけるＩＳＭ１欠乏性の肺とたばこ煙誘発性ＣＯＰＤにおける肺炎症表現型を阻害した。これらの研究は、おそらく肺胞マクロファージアポトーシスを誘導することで、ＩＳＭ１が炎症の消退を助けたことを示す。これらの結果は、ＩＳＭ１が肺炎症の阻害剤及び／又は炎症消退メディエーターであり得ること、及び、ＩＳＭ１がたばこ煙、感染症及び／又は外傷などの環境的損傷によって引き起こされる無菌性肺炎症及び／又は炎症の抑制及び／又は消退において役割を果たし得ることを示唆する。したがって、ＩＳＭ１は、ＡＬＩやＣＯＰＤなどの肺の炎症性疾患のための治療薬及び／又は標的を表してもよい。
実施例１：イスミン１ － 肺の恒常性の保護とＣＯＰＤに対する治療効果
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、現在３番目に多い死因である。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、肺気腫による進行性でほとんど不可逆的な気道閉塞（肺胞壁の破壊と肺胞の拡大）と、小気道の慢性気管支炎を特徴とする１。肺胞マクロファージ（ＡＭ）の顕著な増加は、ＣＯＰＤの病態形成において、広く関係があるとされている２。しかしながら、ＣＯＰＤの分子構造と病態生理は、この分野でほとんど解明されておらず、ＣＯＰＤの進行を阻止又は低減させる薬剤が不足していた。
肺の炎症はＣＯＰＤの病態形成にとって不可欠であり、肺に最も多く常在する免疫細胞である肺胞マクロファージ（ＡＭ）は、この疾患に対する主要なエフェクター細胞である。ＣＯＰＤ患者の疾患の重症度は、特に、炎症を起こした末梢気道と肺胞腔におけるＡＭ集積に直接関連している（Finkelstein, Fraser et al., 1995）。これらの観察は、標的化したＡＭ枯渇の際の実験的ＣＯＰＤに対する完全な保護（Ueno, Maeno et al., 2015）又は強力なマクロファージエラスターゼであるＭＭＰ－１２のノックアウト（Hautamaki, Kobayashi et al., 1997）を示したマウスの研究と一致する。多くのＣＯＰＤ患者は、副腎皮質ステロイド治療に対して耐性があるが、いくつかの抗炎症薬がＣＯＰＤ療法開発のために調査されている（Vogelmeier, Criner et al., 2017）。
本研究において、細胞外アポトーシス促進性タンパク質イスミン１（ＩＳＭ１）は、抗炎症薬として、及び、肺の恒常性維持において開発及び研究されている。ｒＩＳＭ１は、ＣＯＰＤの治療薬として示されている。これらの研究において、Ｉｓｍ１ノックアウト（Ｉｓｍ１Δ/Δ）マウスは、ＡＭの増加を示し、突発性慢性肺炎症と進行性肺気腫を発症した。ＩＳＭ１に対する高親和性受容体である細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）は、ＡＭに主に存在する。そのレベルは、ヒトＣＯＰＤの肺だけでなく、Ｉｓｍ１Δ/Δ及びたばこ煙（ＣＳ）誘発性ＣＯＰＤマウスにおいても高くアップレギュレートされる。組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）の気管内デリバリーは、Ｉｓｍ１Δ/Δ及びたばこ煙（ＣＳ）誘発性ＣＯＰＤの両方のマウスの肺において、ＡＭを枯渇させ、肺気腫の進行を阻止し、肺機能を修復した。一貫して、ＣＯＰＤ患者における高いＩＳＭ１発現は、ＡＭアポトーシスレベルの高さ及びＡＭ数の低さと相関する。これらの結果は、ＩＳＭ１が、例えば、肺の恒常性のプロテクターであり得ること、及び、ＣＯＰＤの進行を止めることにおいて治療効果を提供し得ることを支持する。本明細書のデータは、イスミン１がＣＯＰＤから保護することを示す。
以下の研究は、分泌タンパク質イスミン１（ＩＳＭ１）が、抗炎症性タンパク質であって、細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）受容体を通じてＡＭアポトーシスを誘導することで機能し得ることを示す。結果は、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおいて、ＩＳＭ１の減少が、ＡＭ集積と突発性肺気腫を引き起こすことを示す。本明細書の結果は、Ｉｓｍ１Δ/Δマウス、たばこ煙誘発性ＣＯＰＤマウス及びヒトＣＯＰＤの肺のＡＭにおいて、ｃｓＧＲＰ７８が高くアップレギュレートされることを示す。組換えＩＳＭ１の気管内デリバリーは、Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスとＣＯＰＤマウスの両方においてＡＭを枯渇させ、肺気腫と肺機能低下を阻止した。一貫して、ヒトＣＯＰＤの肺におけるＩＳＭ１の発現は、ＡＭアポトーシスの増加と相関した。したがって、本明細書の結果は、肺の恒常性のプロテクターとしてＩＳＭ１を示し、ＡＭのｃｓＧＲＰ７８を標的化することによるＣＯＰＤ用の治療的使用を支持する。
肺は常に外的環境に曝されており、免疫応答及び炎症を制限するために恒常性が重要である。ＣＳはＣＯＰＤの主な危険因子であり、ＣＯＰＤは現在２５％の推定累積生涯リスクを伴う、３番目に多い死因である３。気管支拡張剤は患者の症状を軽減するが、ＣＯＰＤの進行又は死亡率を減少させない。
ＩＳＭ１は、いくつかの癌細胞及び活性内皮細胞などのいくつかの細胞で、ｃｓＧＲＰ７８とαｖβ５インテグリンを通じて機能する分泌タンパク質であることがすでに特定されており、マウスにおける血管形成及び実験的癌を抑制する４－７。
組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）は、αｖβ５インテグリンに結合してカスパーゼ８を活性化、又は、ミトコンドリアに取り込まれて輸送されるｃｓＧＲＰ７８に結合して、ＡＴＰ生成を阻害しアポトーシスを引き起こす。Ｉｓｍ１遺伝子は、魚からヒトまでの脊椎動物に存在するが（Osorio, Wu et al., 2014, Xiang et al., 2011）、Ｉｓｍ１の生理学的機能はまだ解明されていない。
本明細書に記載の研究は、ｃｓＧＲＰ７８媒介性アポトーシスを介してＡＭ数を制御することによってマウスの肺の恒常性を維持する上で、ＩＳＭ１が重要な役割を果たし得ることを示す。結果は、ｒＩＳＭ１の経肺デリバリーが、アポトーシス誘導を介してＡＭを枯渇させることによって肺炎症を効果的に和らげることができ、研究されたＣＳ誘発性ＣＯＰＤマウスにおける肺気腫の阻止及び肺機能の回復につながることを示す。同様に、ヒトＣＯＰＤ患者の肺におけるＩＳＭ１発現は、ＡＭアポトーシスの増加と相関する。これらの結果は、ｒＩＳＭ１が、ＣＯＰＤ用の治療アプローチを提供し得ることを示し、例えば、ＡＭのｃｓＧＲＰ７８を標的化して、ＡＭアポトーシスを誘導し、肺気腫における肺組織損傷を阻止することによって炎症を抑制してもよい。
周囲空気下でＩｓｍ１Δ/Δマウスが突発性肺気腫を発症
マウスにおいて、Ｉｓｍ１は、胎児及び成体の肺で最も高いレベルで発現し、発現が二番目に高い器官である脳の約３０倍高く、その他の器官よりもはるかに高く発現する（Osorio et al., 2014）。Ｉｓｍ１の生理学的機能及び効果を更に研究するため、二つの異なる系統のマウスにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アプローチを用いて、Ｉｓｍ１ノックアウト（Ｉｓｍ１Δ/Δ）マウスを作製した：ＦＶＢ／ＮＴａｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ（図２２Ａ～Ｅ）。両方の遺伝的背景のＩｓｍ１Δ/Δマウスは生存可能であり、肉眼的形態異常又は行動表現型を示さないが、Ｉｓｍ１＋/Δ及び野生型（ＷＴ）ＦＶＢ／Ｎマウスと比べると産仔数が少ない（データは表示せず）。すべての主要器官の病理組織診断の検査は、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺において、両方の遺伝的背景において突発性肺気腫（図１Ａ及び図５Ａ～Ｃ）と、平均肺胞径（ＭＬＩ）によって定量化した年齢に伴う肺胞腔の進行性拡張の発生を明らかにした（図１Ｂ及び図５Ｄ）。月齢９カ月までのＩｓｍ１Δ/Δマウスのその他主要な器官において、明らかな病態は認められなかった。これらの結果は、ＩＳＭ１が、マウスの肺の恒常性のために重要であることを示し、肺において最も高く発現することと一致する。本明細書の次の研究のため、ＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスを主に使用した。コラーゲン及びエラスチンのホールマウント立体顕微鏡及び蛍光色素ラベリング（ｄｙｅ－ｌａｂｅｌｉｎｇ）は、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺において、注目すべき空気とらえ込み現象（図１Ｃ）と、全体的な肺胞ネットワークの悪化（図１Ｄ）を示した。改変されたヴァーヘフ－ワンギーソン（ＶＶＧ）染色を用いて、破裂性中隔の検出とともに、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺における肺胞エラスチン繊維の損失も視覚化した（図５Ｅ）。さらに、Ｉｓｍ１＋/Δマウスは、野生型（ＷＴ）とＩｓｍ１Δ/Δマウスの中間のＭＬＩとともに、軽度の肺気腫を発症し（図１Ｅ及びＦ）、Ｉｓｍ１がマウスにおいてハプロ不全遺伝子であることを示唆した。
ＩＳＭ１の欠如が肺の生理機能を損なうかどうかを判定するため、強制肺操縦システム（Ｂｕｘｃｏ）を用いて、月齢２カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスに一連の肺機能試験を行った。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは、ＣＯＰＤ患者に見られる過膨張の肺と同じ意味を持つ、全肺気量（ＴＬＣ）の増加を示した（図１Ｇ）（Gagnon, Guenette et al., 2014）。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺の過膨張は、肺気腫に関連する弾性収縮力の減少及び空気とらえ込み現象による、機能的残気量（ＦＲＣ）（図１Ｈ）及び残気量（ＲＶ）（図１Ｉ）などの室の容積の増加にも表れた。これらの変化は、圧力－容量測定にも反映され、それによってＩｓｍ１Δ/Δマウスの静的及び動的コンプライアンス（Ｃｃｈｏｒｄ及びＣｄｙｎ）がともに増加した（図１Ｊ及びＫ）。重要なことに、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは、低い努力吸気量（ＦＥＶ１００）を示し（図１Ｌ）、０．７より低いＦＥＶ１００／ＦＶＣ平均値（ヒトＣＯＰＤにおけるＦＥＶ１／ＦＶＣ指標と同等）を有し（図１Ｍ、Ｉｓｍ１Δ/Δ：０．６３±０．０５）、これは患者のＣＯＰＤ診断で規定通り使用される基準である（Singh et al., 2019）。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける気道抵抗（ＲＩ）の増加は、粘液分泌過多、及び気道上皮過形成及び肥厚を含む、気道壁における炎症性変化に原因があり得る（図１Ｎ、図５Ｆ及びＧ）（Barnes, 2016）。まとめて、これらのデータは、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスが、マウスモデル及びヒトＣＯＰＤ患者における実験的肺気腫／ＣＯＰＤと同様の肺の病態を呈したことを示した。
図５Ｌ及び５Ｍは、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるＡＭの増加が、異常な胎児肺発育の結果ではないことを示す。ＡＭは胎児肝臓単球から胚発育中に形成され、胎児肝臓単球は肺に移動し、周産期及び出生後の期間にＡＭに分化する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、ＡＭ形成及び分化にとって必須のサイトカインである。結果は、肺の発育においてＧＭ－ＣＳＦが最も高いレベルである場合、出生後Ｐ１及びＰ７でのＧＭ－ＣＳＦレベルに有意差がないことを示す。つまり、成体（週齢８週）の肺においてＡＭ数が高いことは、肺の発育期間中に変化したＡＭ形成の結果ではない。図５Ｌ及び５Ｍは、Ｐ１ ＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦ（赤）と核（ＤＡＰＩ、青）の代表的な免疫蛍光染色（左）である（１グループあたり、マウスｎ＝４。Ｐ１ ＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦ及びローディングコントロールとしてのβアクチンのウエスタンブロット（５Ｍ）と倍率変化（Ａ．Ｕ．、任意単位）。１グループあたり、マウスｎ＝８～９。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定で解析した。）。
成体マウスの肺（週齢８週）において、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは変化したサイトカイン微小環境を抱える。マルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用したところ、週齢８週の成体マウスにおいて、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺は、ＷＴ肺と比べて変化したサイトカイン微小環境を抱えることが分かった。ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ランテス、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－２、ＩＰ－１０及びＭＣＰ－２を含む複数のサイトカインが、１．５倍より大きくアップレギュレートされた（図５Ｋ参照）。図５Ｋは、月齢２カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺の間の相対的サイトカイン発現のヒートマップである（ＷＴマウスｎ＝３、Ｉｓｍ１Δ/Δマウス：６）。
確かに、ウエスタンブロットによって、ＷＴマウスと比べて、より高いＧＭ－ＣＳＦのレベルを確認した。このより高いレベルのＧＭ－ＣＳＦは、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの無菌性肺炎症の結果であり得る。より高いレベルＧＭ－ＣＳＦは、ＡＭ増殖を刺激し、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺におけるより高いＡＭ数に寄与し得る。図２Ｈは、月齢２カ月のＦＶＢ／Ｎ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺における、ＧＭ－ＣＳＦ及びローディングコントロールとしてのβアクチンのウエスタンブロット（左）と倍率変化（Ａ．Ｕ．、任意単位）。（１グループあたり、マウスｎ＝４。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定で解析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
肺気腫は、マウスの年齢とともに進行的に悪化する（図１）。これらの症状は、ヒトＣＯＰＤ患者と同様である。際立ったことに、肺気腫の重症度もＩＳＭ１の投与量依存性であり、Ｉｓｍ１Δ/＋マウスよりもＩｓｍ１Δ/Δマウスの方がより重度の肺気腫表現型を示す。肺の微小環境におけるＩＳＭ１の存在は、肺の恒常性と、無菌性肺炎症（感染症又は外傷のない炎症）を予防するために重要であると思われる。一貫して、ＩＳＭ１は、検査したすべての器官のうち、成体マウスの肺で最も高いレベルで発現し、肺機能におけるこのタンパク質の重要な役割を支持する。
Ｉｓｍ１Δ/Δ肺において、肺胞マクロファージ集積が肺気腫を駆り立てる。
Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける肺気腫は、肺胞腔におけるＡＭの多発性凝集体を伴い（図２Ａ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞のサイトスピン及びフローサイトメトリー解析の両方によって、ＷＴマウスと比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるＡＭの増加が確認された（図２Ｂ～Ｄ）。特に、Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスからのＡＭは、ＣＯＰＤ患者に記載のマクロファージサブポピュレーションと同様の変化する形態を示す（Dewhurst, Lea et al., 2017）。全肺ライセートのウエスタンブロット解析による周知のＣＯＰＤ関連プロテアーゼ及びメディエーターの検査によって、ＷＴ肺と比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺におけるＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－９及びＮＦ－κＢ ｐ６５のレベルの上昇が明らかとなった（図２Ｅ）。肺組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって、Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスのＡＭにおけるＭＭＰ－１２とＭＭＰ－９発現の増加が示され（図２Ｆ）、その他の肺気腫マウスモデルとヒトＣＯＰＤ病態と一致する（Woodruff, Koth et al., 2005）。さらに、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスから分離された一次ＡＭは、ＮＦ－κＢの核移行の増加を示し、これらの細胞におけるＮＦ－κＢ活性を示す（図２Ｇ）。さらに、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺及びＡＭにおいてＴＧＦ－β１及びＶＥＧＦ－Ａが適度にアップレギュレートされ（図５Ｈ及びＩ）、ＣＯＰＤ患者におけるＡＭ集積及び遺伝子発現パターンに即する（de Boer, van Schadewijk et al., 1998, Kranenburg, de Boer et al., 2005）。Ｉｓｍ１Δ/Δ肺は、高いレベルの活性酸素種（ＲＯＳ）も生成した（図５Ｊ）。その一方で、ＷＴマウスの肺と比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺において、好中球エラスターゼ及びα－１－アンチトリプシンレベルの変化はともに見られなかった（図５Ｈ）。マイクロアレイ解析は、ＩＬ－１ａ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１ａ、ランテス、ＩＰ－１０及びＭＣＰ－２を含むＩｓｍ１Δ/Δマウスにおける炎症性サイトカインのアップレギュレーションを示す（図５Ｋ）。ＧＭ－ＣＳＦはＡＭ発育を駆り立て（Guilliams, De Kleer et al., 2013）、ＧＭ－ＣＳＦ過剰発現マウスはＡＭ集積とともに肺気腫を発症する（(Suzuki, McCarthy et al., 2020）ため、ＧＭ－ＣＳＦがＩｓｍ１Δ/Δマウスにおいて恒常的にアップレギュレートされているかどうかを明確にしようとした。Ｐ１マウスの肺の免疫染色及びウエスタンブロットでは、Ｉｓｍ１Δ/ΔとＷＴマウスとの間で、ＧＭ－ＣＳＦ発現の違いは示されなかった（図５Ｌ及びＭ）。さらに、月齢１カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるＭＭＰ－１２の増加は、ＧＭ－ＣＳＦのアップレギュレーションを先行した（図５Ｎ）。したがって、月齢２カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺におけるＧＭ－ＣＳＦの増加（図２Ｈ）は、代わりに、過剰なＡＭ集積と活性が主に寄与した肺気腫の発症及び炎症と関連していたと仮定する。
図２Ｂ及び２Ｃは、Ｉｓｍ１ノックアウトマウス（Ｉｓｍ１Δ/Δ）に基づく作用メカニズムの研究結果を示す。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）解析に基づいて、マウスの肺におけるＩＳＭの欠如は、気道炎症と肺胞マクロファージ（ＡＭ）の増加につながった。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から採取した細胞の解析によって、ＷＴマウスの肺と比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺における肺胞マクロファージ（ＡＭ）が増加したことを確認した（図２）。それと比べて、気道における好中球の浸潤は見られなかった。特に、Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスからのＡＭは、ＣＯＰＤ患者に記載のマクロファージサブポピュレーションと同様の変化する形態を示す（Dewhurst, Lea et al., 2017）。全肺解析と同様に、ＢＡＬＦにおいて、リンパ球の顕著な増加も観察された。図２Ｂと２Ｃに示されるように、ＢＡＬＦ解析によって、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける気道免疫細胞アップレギュレーションが示された。月齢２カ月のＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺から採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞の、Ｌｉｕ染色されたサイトスピンの標本（２Ｂ）及び定量化（２Ｃ）を示す（１グループあたり、マウスｎ＝４。データは平均値の標準誤差であり、対応がない両側のスチューデントのｔ検定で解析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
以前、ＩＳＭ１発現は、マウスの気管支及び肺胞上皮において報告された（Osorio et al., 2014, Venugopal, Chen et al., 2015）。ここで、ＡＭは、ＩＳＭ１の新規の供給源であると示されるが（図２Ｉ、図６Ａ及びＢ）、すべてのＡＭが、健康な肺と同様のレベルでＩＳＭ１を恒常的に発現するかは明らかでない。特に、ＡＭはＧＲＰ７８を強く染色し、ＷＴマウスと比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺は、明瞭な周辺質ＧＲＰ７８と多くのＡＭを示す（図２Ｊ）。細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８）は、以前、マウスの腹膜マクロファージ（Misra, Gonzalez-Gronow et al., 2005）及びヒト単球（(Lu, Lai et al., 2010）で検出された。一次ＡＭを組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）で処理して、ＡＭにｃｓＧＲＰ７８が存在し、ＩＳＭ１受容体として機能するかを判定した。ｒＩＳＭ１が、非透過性ＡＭでｃｓＧＲＰ７８と結合し（図６Ｃ）、細胞内でＧＲＰ７８と共存し（図６Ｄ）、ＡＭアポトーシスを引き起こす（図２Ｋ及び図６Ｅ）ことが観察された。同様に、ＧＲＰ７８の細胞表面への移行を促進することで知られるＥＲストレス誘導因子であるタプシガルジン（ＴＧ）前処理（図６Ｆ）の際に、ｒＩＳＭ１は、不死化したマウスのＡＭ細胞（ＭＨ－Ｓ）においてアポトーシスを誘導した（Li, Ni et al., 2008）。さらに、抗ＧＲＰ７８抗体中和は、ｒＩＳＭ１誘導性アポトーシスを効果的に阻止した（図６Ｇ）。これらの結果は、ｒＩＳＭ１誘導性アポトーシスが、ＡＭのｃｓＧＲＰ７８を通じて媒介したことを示した。付随して、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスから分離された一次ＡＭは、ＷＴ ＡＭと比べて、増殖に変化はなく、アポトーシスの減少を示し（図２Ｌ及びＭ）、内因性ＩＳＭ１媒介性オートクリン／パラクリンアポトーシスの欠如が、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺におけるＡＭ集積の根底にあることを示唆した。Ｉｓｍ１Δ/Δ肺におけるＡＭの増加が、プロテアーゼ－アンチプロテアーゼの不均衡に寄与したため、周囲空気下で、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおいて突発性ＣＯＰＤが引き起こされる。
図６Ｂの結果は、Ｉｓｍ１ ｍＲＮＡが気管支上皮細胞及び肺胞マクロファージにおいて発現することを示す。確かに、マウスの肺組織切片を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、気管支上皮細胞及びいくつかのＡＭにおいてＩｓｍ１遺伝子が発現したことを示し、ＩＨＣデータと一致した。これは、ＡＭにおけるＩＳＭ１発現を示すＩＨＣデータに信頼性があることを示す。
図６Ｃ、６Ｆ及び６Ｇは、ｃｓＧＲＰ７８を標的化することによって、ｒＩＳＭ１がＡＭアポトーシスを誘導することを示す。共焦点顕微鏡によって示されるように、ｒＩＳＭ１は、新たに分離された一次ＡＭの細胞表面で、ｃｓＧＲＰ７８と相互作用する（図６Ｃ）。このデータは、ｒＩＳＭ１がＡＭの表面上のｃｓＧＲＰ７８を標的化し、そのアポトーシスを引き起こすことを支持する。図６Ｃにおいて、１μＭのｒＩＳＭ１処理から１時間後の、ｒＩＳＭ１（赤）とＧＲＰ７８（緑）共局在化の一次ＡＭの代表的な共焦点画像を示す（核はＤＡＰＩ（青）で染色）。さらに、マウスＡＭ細胞株ＭＨ－Ｓ細胞は、ＥＲストレスを誘導しｃｓＧＲＰ７８をアップレギュレートするタプシガルジン（ＴＧ）で前処理された場合、ＩＳＭ１誘導性アポトーシスを起こす。変性ＩＳＭ１（煮沸した）は、このアポトーシス促進機能を失い、このアポトーシス促進活性がＩＳＭ１タンパク質の機能であることを示した。抗ＧＲＰ７８抗体はｒＩＳＭ１誘導性アポトーシスを妨害し、ＩＳＭ１がＭＨ－Ｓ ＡＭ細胞表面でｃｓＧＲＰ７８を標的化してアポトーシスを引き起こすことを支持する。なお、より高い濃度の抗ＧＲＰ７８抗体は自身で細胞死を起こすことができるので、その細胞自体に影響がなかった濃度のものだけがｃｓＧＲＰ７８とＩＳＭ１誘導性アポトーシスを阻止するために使用された。図６Ｆ及び６Ｇは、マウスＡＭ細胞株ＭＨ－Ｓ細胞におけるアポトーシスの定量化を示し、５０ｎＭのタプシガルジン（ＴＧ）前処理及び１μＭのｒＩＳＭ１処理から２４時間後（左）と、１６時間のＧＲＰ７８抗体中和（右）である。処理条件は示す通り。解析は三重のウェルで行った。１ウェルあたり４つの画像を撮影し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析システムを用いて定量化した。
ｒＩＳＭ１は、Ｉｓｍ１Δ/Δ及びたばこ煙誘発性ＣＯＰＤマウスにおける肺気腫を救助する。ＡＭは、マウスにおける肺気腫／ＣＯＰＤの病態形成において重量な役割を果たすため１１、１８、１９、ＡＭアポトーシスを誘導／促進、及び／又は、炎症を抑制することによって、外から補給されたｒＩＳＭ１が、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺気腫の発達／進行を阻止することができるか評価した。月齢１カ月のＩｓｍ１Δ/Δマウスに週２回、４週にわたって気管内ｒＩＳＭ１をデリバリーし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はＡＭ枯渇のために確立された薬剤であるクロドロン酸リポソームで処理されたマウスと比較した。免疫染色は、ｒＩＳＭ１がＡＭによって内部移行し、アポトーシスを誘導したことを示し（図７Ａ及びＢ）、クロドロン酸と同様に（図３Ａ）、投与量依存的にＡＭ数が著しく減少した。ｒＩＳＭ１及びクロドロン酸処理されたＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺はともに、肺気腫の著しい減少を示した（図３Ｂ及びＣ）。両方の処理グループにおける増殖するＩＩ型肺胞上皮細胞の増加によって示されるように、ｒＩＳＭ１又はクロドロン酸によるＡＭの枯渇は、炎症の回復に続いて肺胞の再生をおそらく促進した（図７Ｃ及びＤ）。より重要なことに、ｒＩＳＭ１及びクロドロン酸処理されたＩｓｍ１Δ/Δマウスの両方において、気道の同等な回復が肺機能検査によって示された（図３Ｄ）。また、これらの結果は、過剰なＡＭは、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおいて突発性肺気腫及び肺機能低下の中核を担うことを示す。ｒＩＳＭ１の経肺デリバリーは、示されるように、ＡＭ枯渇を通じてＩｓｍ１Δ/Δ肺気腫表現型を救助することができる。
次に、慢性ＡＭ炎症は肺組織損傷に関係しているため、ｒＩＳＭ１がマウスにおけるたばこ煙（ＣＳ）誘発性ＣＯＰＤを軽減できるか評価した。ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃマウスを、２週及び８週、室内空気（ｓｈａｍ）又はＣＳに曝露し、ＰＢＳ又はｒＩＳＭ１のいずれかで気管内処理した（図３Ｅ及びＦ）。２週間ＣＳに曝露したマウスから採取したＢＡＬＦ細胞のサイトスピン解析は、ｒＩＳＭ１が、炎症を効果的に抑制し、ＡＭ及び好中球数を減少させたことを明らかにした（図３Ｇ）。８週間ＣＳに曝露したマウスの組織学的解析は、喫煙ＣＯＰＤ患者と同様に、主にＡＭを含む免疫細胞の大量集積とともに、終末細気管支の近位に肺気腫を呈した（図３Ｈ及び図７Ｅ）。ｒＩＳＭ１で処理されたマウスは、よりアポトーシス促進性のＡＭ（図７Ｆ）を生成し、ＡＭ（図３Ｉ）及び全肺ライセートからのＭＭＰ－１２レベルの両方において顕著な減少を示した（図３Ｊ）。好中球もｒＩＳＭ１処理によって顕著に減少し（図７Ｇ）、これはＡＭ枯渇の際の走化性の低下の結果である可能性がある（Murugan & Peck, 2009）。したがって、ｒＩＳＭ１の経肺デリバリーは、ＡＭ枯渇を通じて、ＣＳ誘発性ＣＯＰＤマウスにおいて肺気腫を効果的に阻止し（図３Ｋ）、肺機能を保った（図３Ｌ及び図７Ｈ～Ｊ）。
図３に示すように、ｒＩＳＭ１はたばこ煙（ＣＳ）誘発性急性肺炎症を抑制する。ＣＳは、好中球とＡＭの両方を誘導することによって肺の急性炎症を誘導すると知られる。２週のＣＳモデルマウスを使用したところ、気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１は、総ＢＡＬＦ細胞の減少に示されるように、ＣＳ誘発性肺炎症反応を効果的に抑制した。リンパ球に影響を及ぼすことなく、ＡＭと好中球は共に抑制された（図３Ｅ及び３Ｇ）。この結果は、アポトーシスを引き起こすことによって気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１が、肺炎症を効果的に和らげＡＭ数を減少させた、８週の慢性ＣＳ誘発性肺気腫（ＣＯＰＤ）モデルのマウスから得られたデータと一致する。図３Ｅは、ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、２週のたばこ煙誘発性ＣＯＰＤモデルの実験的設計を示す。室内空気曝露（Ｓｈａｍ）、たばこ煙曝露（ＣＳ）と溶媒（ＣＳ＋ＰＢＳ）又はｒＩＳＭ１（ＣＳ＋１０μｇ ｒＩＳＭ１）処理を、示した頻度と間隔で行った（１グループあたり、マウスｎ＝５）。図３Ｇは、２週のたばこ煙誘発性ＣＯＰＤマウスの実験グループから採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞の定量化を示す（１グループあたり、マウスｎ＝４～５）。
ヒトＩＳＭ１発現は、肺胞マクロファージアポトーシスと相関する。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスが突発性肺気腫を発生し、外から補給されたｒＩＳＭ１がＣＳ誘発性ＣＯＰＤ病態形成からマウスを守ったため、ヒトの肺における外因性ＩＳＭ１レベルの変動は、ＣＯＰＤの発生にも影響を与えると仮定した。我々はまず、ｈＩＳＭ１過剰発現細胞を用いてヒトＩＳＭ１（ｈＩＳＭ１）の抗体特異性を検証し（図８Ａ）、続いて、６０のＣＯＰＤ及び１８の非ＣＯＰＤ患者から採取した肺組織切片におけるｈＩＳＭ１発現を検査した（表１）。
Figure 2022524370000004
マウスと同様に、ｈＩＳＭ１もＡＭに主に発現した（図４Ａ及びＢ）。しかしながら、特にＣＳ曝露後のマウスの気管支上皮においてＩＳＭ１が発現した一方（図８Ｂ）、ＣＯＰＤ又は非ＣＯＰＤのヒトの肺の両方の気管支上皮においてｈＩＳＭ１は検出されなかった（図８Ｃ）。その後、ＡＭにおけるｈＩＳＭ１発現のＩＨＣ染色強度と頻度をスコア化することによって、ｈＩＳＭ１発現を段階分けした（図４Ａ～Ｃ）。ｈＩＳＭ１発現と喫煙者との間に、正の相関が見られた（図４Ｄ及びＥ）一方で、元喫煙者よりも、喫煙者の方が、ｈＩＳＭ１発現が高かった（図８Ｄ）。これらの知見は、ＣＳ曝露の際、ＩＳＭ１が特にマウスＡＭでかなりアップレギュレートされ（図８Ｅ）、その一方、多形核白血球やリンパ球などのその他の免疫細胞がＩＳＭ１染色で検出できないままであった（図８Ｆ）ことと一致する。重要なことに、ｈＩＳＭ１発現は、喫煙ステータスに依存しないＡＭアポトーシスと著しく正に相関した（図４Ｆ、図２３Ａ及びＢ）。特に、ｃｓＧＲＰ７８は、非ＣＯＰＤ患者と比べて、ＣＯＰＤ患者のＡＭでアップレギュレートされ（図４Ｇ）、ＡＭがＩＳＭ１－ｃｓＧＲＰ７８媒介性アポトーシスの準備を整えることを可能にする。確かに、同様のｈＩＳＭ１発現を示す非ＣＯＰＤ患者と比べて、ＣＯＰＤ患者において、よりアポトーシス性のＡＭが観察され（図４Ｈ）、ＣＯＰＤ患者及びＣＳ曝露マウスにおいては、ｃｓＧＲＰ７８陽性ＡＭのみがアポトーシス性であった（図２３Ｃ及びＤ）。
これらの結果に基づき、生理的ＩＳＭ１は、ｃｓＧＲＰ７８を通じてＡＭアポトーシスを制御することによって、成人の肺の恒常性を維持することにおいて重要であると仮定する。ＩＳＭ１の減少は、減少したアポトーシスからＡＭ集積を引き起こし、その結果、周囲空気の下であってもＩｓｍ１Δ/Δマウスにおいて肺炎及び肺気腫を生じる（図２４）。
図４Ｅ、４Ｆ及び４Ｈは、ヒトＣＯＰＤ肺と非ＣＯＰＤ肺におけるＩＳＭ１発現が、たばこ煙とＡＭアポトーシスと相関することを示す。６０のＣＯＰＤ及び１８の非ＣＯＰＤヒト肺組織サンプルからの免疫組織化学染色（ＩＨＣ）によるＩＳＭ１発現解析は、ヒトＩＳＭ１（ｈＩＳＭ１）タンパク質の発現レベルがたばこ煙と相関し、喫煙者がより高いＩＳＭ１発現を示したことを明らかした（図４Ｅ）。さらに、ＡＭアポトーシスレベルは、肺組織のｈＩＳＭ１レベルと相関し、より高いｈＩＳＭ１レベルは、肺においてより高いＡＭアポトーシスを示す（図４Ｆ）。ＣＯＰＤ及び非ＣＯＰＤ肺の両方において、より高いｈＩＳＭ１レベルは、より高いＡＭアポトーシスを示す（図４Ｈ）。確かに、ＣＯＰＤ及び非ＣＯＰＤ肺におけるｈＩＳＭ１発現は、図４Ｅ、４Ｆ及び４Ｈに示される。喫煙ステータスとｈＩＳＭ１の相関（４Ｅ）及びｈＩＳＭ１発現とＡＭアポトーシスの相関（４Ｆ）が示される。患者サンプルサイズは、グラフに示す。データは、点双列相関（４Ｅ）及びピアソン相関（４Ｆ）によって解析した。非ＣＯＰＤ及びＣＯＰＤ患者のアポトーシス性ＡＭのパーセンテージは、ＣＯＰＤステータスとｈＩＳＭ１発現で層別化した。患者サンプルサイズはグラフに示す（データは平均値の標準誤差であり、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定で解析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、図２４は、ＡＭアポトーシスと肺の恒常性の制御における、ＩＳＭ１のメカニズムの提案を提供する。図２４（左）において、オートクリン／パラクリンＩＳＭ１が、高いｃｓＧＲＰ７８を有するＡＭを特に標的化して、アポトーシスを誘導する。ＡＭ数はコントロール下に保たれ、炎症は制御され、肺の恒常性は維持されている。図２４（右）において、ＩＳＭ１がない／低いことは、肺胞腔におけるＡＭ集積と、進行性の肺機能低下を伴う肺気腫の発病という結果をもたらす。
議論したように、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、世界的死因の第３位であり、喫煙、環境汚染への長期曝露、および加齢が主要な危険因子である。肺気腫（肺胞壁の破壊）、小気道の慢性及び閉塞性気管支炎（気道炎症）による、不可逆的な気流の遮断を特徴とする。患者は、咳や呼吸困難などの再発する呼吸器症状を呈する。さらに、運動不耐性は、ＣＯＰＤ患者の筋力低下とサルコペニアを引き起こす。現在の治療法は、主に気管支拡張薬であり、症状の軽減のみを提供し、疾患の進行を阻止する薬はない。遺伝的及び病理的マウスモデルを使用した本明細書に記載の研究において、結果は、アポトーシス促進性イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質が、肺組織の恒常性のプロテクターであることを明らかにした。ＩＳＭ１の減少は、肺胞マクロファージ（ＡＭ）集積の結果としての突発性ＣＯＰＤを引き起こす。マウス及びヒトの肺において、ＡＭはＩＳＭ１及び高親和性受容体ｃｓＧＲＰ７８の両方を発現し、その結果、自己制御性アポトーシスを可能にする。組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）の局所的経肺デリバリーは、たばこ煙誘発性ＣＯＰＤマウスにおいて、ＡＭ数を減少させ、炎症を抑制し、肺機能を保持した。さらに、肺におけるヒトＩＳＭ１発現は、著しく且つ正にＡＭアポトーシスと相関した。
本明細書に記載の結果は、正常な肺機能を守り、ＣＳ誘発性ＣＯＰＤ発達を阻止する抗炎症性タンパク質として、ＩＳＭ１を特定する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、この研究は、ｃｓＧＲＰ７８を標的化することによって肺炎症を和らげるタンパク質治療としての、ｒＩＳＭ１の使用を支持する。結果は、ＩＳＭ１－ｃｓＧＲＰ７８媒介性ＡＭ標的化が、例えばＡＭが病理的役割を果たす炎症性肺疾患の広い範囲において、治療戦略を提供し得ることを示す。
マクロファージクリアランスは、炎症の消退中に、局所的アポトーシスを通じて主に媒介すると示され２６、ＡＭアポトーシスは、感染症関連の急性肺炎症の回復において重要である２７－２９。ＡＭは、ＣＯＰＤ病態形成と肺の悪化の根底にあり２、２０、２５、アポトーシス２３及びコルチコステロイド治療３０に耐性を示すことで悪名高い。本明細書の知見は、アポトーシス促進性タンパク質ＩＳＭ１を通じてＡＭ数をコントロールし肺の恒常性を維持する、オートクリン／パラクリンメカニズムを明らかにする。ＩＳＭ１は、ＡＭのｃｓＧＲＰ７８を標的化して、アポトーシスを誘導し肺炎症を制限する。その一方で、ＩＳＭ１の減少は、Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスにおいてＡＭ集積と突発性肺気腫を結果としてもたらした（図２４Ｂ）。ちなみに、ＡＭ集積は、喫煙者における肺気腫の発症と関係がある２。ｒＩＳＭ１の気管内注入は、ＣＳ曝露マウスにおいてＡＭ集積を防ぎ、ＣＯＰＤの進行を効果的に阻止した。これは、ＡＭ枯渇の有効性を示すマウスの先の研究と一致する１８、１９。一貫して、ｈＩＳＭ１発現が高い患者において、ＡＭアポトーシスはより多く、ＡＭ数はより低く、重症のＣＯＰＤの頻度はより低かった。ＣＯＰＤ患者におけるｈＩＳＭ１発現の不均一性は、ＣＯＰＤ患者への早期介入のためのより良い見識を提供し得る。本明細書の知見は、肺の恒常性維持における制御されたＡＭアポトーシスの重要な役割を強調し、炎症抑制剤としての肺の恒常性におけるＩＳＭ１の保護的役割を特定する。ｒＩＳＭ１は、例えば、ＡＭ駆動型（ＡＭ－ｄｒｉｖｅｎ）肺炎症を和らげることを通じて、ＣＯＰＤの進行停止において治療効果を提供し得る。
ＣＯＰＤは、疾患の進行を阻止、及び／又は、肺機能を回復するための効果的な薬剤がなく、大きな社会経済的負担を伴って世界的に蔓延している。本明細書に記載の研究は、分泌５０ｋＤａタンパク質ＩＳＭ１が、マウスにおける肺炎症を効果的に和らげ、ＣＳ誘発性ＣＯＰＤの進行を阻止することができる抗炎症性タンパク質であることを示す。ｒＩＳＭ１の局所的経肺デリバリーは、アポトーシスのため、その高親和性受容体ｃｓＧＲＰ７８を介して特にＡＭを標的化した。
ＡＭは、肺免疫細胞の９５％より多くを構成し、アポトーシスに耐性を示しながらも主要な炎症オーケストレーター（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｏｒ）であるため、禁煙後であっても慢性肺炎症に寄与する（Barnes, 2016, Domagala-Kulawik, Maskey-Warzechowska et al., 2003, Kojima, Araya et al., 2013）。気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１は、ＣＳ誘発性ＣＯＰＤマウスにおいて、ＡＭ集積を効果的に阻止し、肺機能低下を予防した。これは、肺気腫予防におけるＡＭ枯渇の有効性を示した先の研究と一致する。したがって、本明細書に記載の結果は、例えば疾患の進行を阻止、及び／又は、肺機能を維持するためのＣＯＰＤ治療薬としてのｒＩＳＭ１を支持する。ＡＭアポトーシスを誘導することで、ｒＩＳＭ１はＭＭＰ－１２などのＡＭ分泌プロテアーゼによって直接的なタンパク質損傷を妨害するだけでなく、ＭＭＰ－１２駆動型腫瘍怪死因子アルファ（ＴＮＦ－α）関連内皮細胞活性、好中球走化性、及び、ＣＳ誘発性肺損傷の７０％を占めると推定される工程である更なるマクロファージ活性を予防し得ると考えられる（Churg, Wang et al., 2004）。したがって、ＡＭは、新規な抗炎症性ＣＯＰＤ治療の重要な標的であり、そうあり続けるべきである。しかしながら、ＡＭはステロイドに対し無応答性であることが知られており（Barnes, 2013a）、別々の炎症誘発性分子の標的化におけるマウスモデルとヒト臨床試験の間の翻訳可能性の低さは、ＣＯＰＤ薬剤の開発において主要な課題として残る（Barnes, 2013b）。この場合、ｒＩＳＭ１は、ＡＭのｃｓＧＲＰ７８を特に標的化する能力を通じ、明確なアドバンテージを有する。ちなみに、ＣＯＰＤにおける病理的ＡＭは、高いレベルのｃｓＧＲＰ７８を抱え（図４Ｇ）、ｒＩＳＭ１媒介性アポトーシスの理想的な候補となる。その結果、ｒＩＳＭ１はＡＭ炎症を効果的に抑制し、同時に複数の炎症誘発性因子を消滅させることができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ｒＩＳＭ１は、ｃｓＧＲＰ７８を発現しない免疫抑制的間質性マクロファージを損傷することなく、炎症誘発性ＡＭにおいてアポトーシスを誘導し得ると考えられ（(Quesada Calvo, Fillet et al., 2011）、肺において恒常的機能を行うことを可能にする。
この研究の結果は、肺の恒常性維持におけるＩＳＭ１の新規な生理的機能を明らかにし、その発現レベルがその他の器官よりもマウスの肺で最も高いことと一致する。結果は、マウスにおけるＩＳＭ１の減少が、肺胞腔における過剰なＡＭ発現とともに、周囲空気下で突発性肺気腫の発症につながることを示した。結果は、すでに報告された上皮細胞及び内皮細胞に加えて、ＡＭがマウスの肺におけるＩＳＭ１の新規の供給源であることを特定した。さらに、ＡＭは、正常なマウスの肺において、ＩＳＭ１と、その高親和性細胞表面受容体ＧＲＰ７８を不均一なレベルで発現する（図２Ｉ及びＪ）。アポトーシスのため、ＩＳＭ１は、高いレベルのｃｓＧＲＰ７８を抱える細胞を特に標的化し得る（Chen et al., 2014）。本明細書に記載の結果は、アポトーシスのため、ＩＳＭ１が高いｃｓＧＲＰ７８を抱えるＡＭを選択的に標的化する一方で、ｃｓＧＲＰ７８がない／低いＡＭは未変化のまま残されることで、肺の恒常性のためにＡＭ数をコントロールするモデルを支持する（図２４）。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスから新たに分離されたＡＭは、ＷＴマウスからのＡＭと比べて、低いアポトーシスレベルを示し、マウスの肺における外因性ＩＳＭ１によるＡＭアポトーシスのオートクリン／パラクリン制御を示唆する。クロドロン酸処理と同様に、気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１は、Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスにおいてＡＭを枯渇させ、肺気腫を救助した。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスから得られたこれらの結果は、調節不全アポトーシスの結果として起こるＡＭ集積が、環境的攻撃がなくとも、肺気腫の発達において重要且つ十分であることを示し、ＣＯＰＤの病態形成の主要なオーケストレーターとしてのＡＭと一致する。
下等脊髄動物におけるＩｓｍ１機能喪失に関する先の研究が、ゼノパスにおける頭蓋顔面異常などの対照的な表現型（Lansdon, Darbro et al., 2018）、及び、ゼブラフィッシュにおける変性造血を伴う血管形成異常（Berrun, Harris et al., 2018, Xiang et al., 2011）という結果になったように、肺の恒常性におけるＩＳＭ１の重要な役割は、哺乳類特有である可能性がある。ＩＳＭ１の高度で多岐にわたる天然変性Ｎ末端領域は、異なる種において、異なる生物学的機能に寄与する可能性がある（Babu, 2016）。その一方、マウスとヒトのＩＳＭ１の間の高い配列同一性（同一性９３．５％）は、ＩＳＭ１がこれらの種の間に保存的機能を有することを示唆する（Joshi & Xu, 2007）。
この研究の結果は、ＡＭアポトーシスの誘導及び肺の恒常性維持において、外因性ＩＳＭ１及びｃｓＧＲＰ７８の間の、オートクリン／パラクリンシグナル伝達軸（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ）を明らかにする。局所的マクロファージアポトーシスとクリアランスは、炎症の消退に寄与し（Hamidzadeh, Christensen et al., 2017）、これは先のアテローム性動脈硬化症（Arai, Shelton et al., 2005）、実験的腹膜炎（Gautier, Ivanov et al., 2013）及び感染症関連の急性肺炎（Aberdein, Cole et al., 2013）に記載されている。マウスとヒトのＣＯＰＤ肺におけるＩＳＭ１のアップレギュレーションは、生物学的反応であり、これは、複数の肺疾患でアップレギュレートされ、オートクリンシグナル伝達を介してＡＭアポトーシスを誘導できる多面的ＴＮＦ－α及びＩ型インターフェロンと同様である（Wei, Sun et al., 2006, Xaus, Comalada et al., 2000）。確かに、ｈＩＳＭ１発現は、ＡＭアポトーシスと強く相関し、これはＣＯＰＤ患者においてより高められたことが観察された（図４）。
先のゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）はＩｓｍ１座位をＣＯＰＤと関連付けなかったが、Ｉｓｍ１とその調節遺伝子に対する潜在的な後成的又は遺伝的影響を明らかにするためには、ｈＩＳＭ１の不均一性をより大きい数のＣＯＰＤ患者で理解することに意味があるだろう。また、ＣＯＰＤにおける高い死亡率に寄与する多様な依存疾患と、ｈＩＳＭ１発現が相互関連性を有するかどうかは興味深い。
ＩＳＭ１の低親和性受容体であるαｖβ５インテグリンは、肺の内皮細胞及び気道の内皮細胞に存在するとも報告されている（Teoh, Tan et al., 2015）。しかしながら、ｒＩＳＭ１が気管内にデリバリーされた時（図７）、マウスにおけるこれらの細胞の明らかな標的化は観測されず、さもなければこれらの肺構造細胞の望まれないアポトーシスによって肺気腫が悪化したであろう。したがって、ｒＩＳＭ１治療は、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける肺気腫を回復させ、肺機能を改善した。
比較的大きいサイズのｒＩＳＭ１（～５０ｋＤａ）は、ＩＳＭ１が肺から急激に除去されず、血流に吸収されることを示唆する（Labiris & Dolovich, 2003, Patton, Fishburn et al., 2004）。局所的経肺デリバリー用のタンパク質治療薬の中和における著しい進歩は、様々な臨床試験に現れた。例えば、吸入治療薬としてのアルファ－１アンチトリプシン（５２ｋＤａ）のいくつかの第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験が、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症及び嚢胞性線維症のために行われた（Bodier-Montagutelli, Mayor et al., 2018）。特定の実施形態において、ＩＳＭ１は、例えば、アルファ－１アンチトリプシンと同程度の大きさであるため、ネブライザーを介する経肺デリバリーで使用してもよい。
要するに、本明細書に記載の結果は、肺の恒常性維持におけるＡＭアポトーシス制御の重要な役割と、生理的及び病理的状況の両方でこの機能においてＩＳＭ１が果たした重要な役割を強調する。結果は、肺気腫／ＣＯＰＤの病態形成及びＡＭアポトーシスと関連する新規な遺伝子としてのＩｓｍ１を支持し、ｒＩＳＭ１が、慢性ＣＳ誘発性ＣＯＰＤマウスにおいて、肺気腫を減弱させ、炎症を抑制し、肺機能を守ったことを示す。結果は、ＣＯＰＤにおける主要な病理的免疫細胞であるＡＭのｃｓＧＲＰ７８を特に標的化することによって、ｒＩＳＭ１をＣＯＰＤの治療法として使用することができることを示す。本明細書に記載の知見は、肺の虚血再灌流傷害（Naidu, Krishnadasan et al., 2003）、急性肺損傷（Dagvadorj, Shimada et al., 2015）、肺線維症（Misharin, Morales-Nebreda et al., 2017）及び喘息（Nabe, Matsuda et al., 2018）などの、ＡＭが駆動又は寄与する呼吸器系障害の広い範囲わたって、意義を持ってもよい。特定の実施形態において、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデス（Lu et al., 2010, Weber, Haslbeck et al., 2010）などのその他の非癌性疾患におけるｃｓＧＲＰ７８の病理的発現は、ｒＩＳＭ１が炎症を調節するための治療の機会を提供し得る。
一つ以上の説明的実施形態を、例として記載した。請求項に規定される発明の範囲から逸脱することなく、多数の変更及び修正を行うことができると当業者は理解するだろう。
方法
研究設計。この研究の第一の目標は、二つの遺伝的背景（ＦＶＢ／ＮＴａｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）におけるＩｓｍ１の室内（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）生成されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウトを用いた、哺乳類Ｉｓｍ１の生理学的機能を判定することであった。表現型特徴及びレスキュー実験のサンプルサイズは、統計解析のため１グループあたり動物３匹の最小に保たれ、ｎ数は各実験の各図及び図説明文に示す。年齢と性を一致させたマウスを実験グループにランダムに割り当てた。動物研究から異常値は排除しなかった。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスのレスキュー実験は２回繰り返し行い、肺機能パラメータと組織学で別々に解析した。慢性ＣＳ誘発性ＣＯＰＤマウスのレスキュー実験は、肺機能パラメータで１回行い、左の肺葉は組織学解析のため固定し、右の肺葉は生化学解析のため均質化した。すべてのマウス実験の免疫細胞定量化は、盲検様式（ｂｌｉｎｄ－ｆａｓｈｉｏｎ）で行った。匿名化されたヒトの肺サンプルは、免疫細胞定量化、ｈＩＳＭ１発現の染色及びグレーディングに使用した。ヒトのコホート研究において、除外されたデータはなかった。
マウス。シンガポール国立大学 動物実験委員会（ＩＡＣＵＣプロトコル ＢＲ１５－１１００及びＲ１８－０５８８）によって承認されたプロトコルに従って、すべての動物実験を行った。野生型マウス（ＦＶＢ／ＮＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃ；週齢６～８週）は、ＩｎＶｉｖｏｓ社（シンガポール）から購入した。Ｉｓｍ１Δ/Δマウス（ＦＶＢ／ＮＴａｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ）は、組換えＣａｓ９、及びＩｓｍ１エクソン１の5’-CTGCACATCACGGTTCTGCGCGG-3’（ｇＲＮＡ１、ＰＡＭ配列に下線した配列番号５）及び5’-GCGGATCCGGAGCCTCCGACCGG-3’（ｇＲＮＡ２、ＰＡＭ配列に下線した配列番号６）を標的化するガイドＲＮＡの前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ）微量注入法を用いて、室内で作製した。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの雑種世代は、プライマーペア Ｐ１（5’-CAGCTCCTGGGATTGCTCCG-3’）（配列番号７）及びＰ２（5’-CCTTCTGCAATGTACCAAGCTCT-3’）（配列番号８）（ＦＶＢ／ＮＴａｃ用）及び5’-cgcgcgactcaagaggatgg-3’（配列番号２２）及び5’-actgggacccgctgacgttg-3’（配列番号２３）（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ用）の遺伝子型を判定して配列決定し、その後、次の繁殖及びコロニーメンテナンスのために選択した（ＩＡＣＵＣプロトコル ＢＲ１５－１１００）。すべてのマウスを標準的な１２時間の明暗周期で収容し、食物と水は自由に与えた。すべての気管内注入に先立って、マウスをイソフルランで麻酔した。
細胞。ＭＨ－Ｓ（ＣＲＬ－２０１９ＴＭ）はＡＴＣＣから購入し、１０％熱失活したＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を追加したＲＰＭＩ－１４０培地で培養した。一次肺胞マクロファージを、月齢２カ月の野生型及びＩｓｍ１Δ/ΔＦＶＢ／ＮＴａｃマウスから収集し（Chavez-Santoscoy, Huntimer et al., 2012に記載の通り）、１０％熱失活したＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を追加したＲＰＭＩ－１４０培地で培養した。５％ＣＯ２インキュベーターで、細胞を３７°Ｃに保った。一次肺胞マクロファージを、記載された通りに月齢２カ月の野生型及びＩｓｍ１Δ/ΔＦＶＢ／ＮＴａｃマウスから収集し３２、１０％熱失活したＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を追加したＤＭＥＭ培地で培養した。５％ＣＯ２インキュベーターで、一次肺胞マクロファージを３７°Ｃに保った。
試薬。ウエスタンブロットに使用した一次抗体：ａｎｔｉ－ＭＭＰ－１２（ａｂ５２８９７、アブカム）、ａｎｔｉ－ＭＭＰ－９（ａｂ３８８９８、アブカム）、ａｎｔｉ－ｐ６５（１０７４５－１－ＡＰ、プロテインテック）、ａｎｔｉ－βアクチン抗体（Ｃ４、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＴＧＦ－β１（Ｖ、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａ（Ａ－２０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－好中球エラスターゼ（ａｂ６８６７２、アブカム）、ａｎｔｉ－アルファ－１アンチトリプシン（１６３８２－１－ＡＰ、プロテインテック）。免疫組織化学に使用した一次抗体：ａｎｔｉ－ＭＭＰ－１２（ａｂ６６１５７、アブカム）、ａｎｔｉ－ＭＭＰ－９（ａｂ３８８９８、アブカム）、ａｎｔｉ－ＴＧＦ－β１（Ｖ、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａ（Ａ－２０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＩＳＭ１（マウスの肺用：Ｅ－２０、サンタクルーズバイオテクノロジー；ヒトの肺用：カスタム抗体３Ｍ８、ＡｂＭａｒｔ）、ａｎｔｉ－ＧＲＰ７８（Ａ－１０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｐｒｏｂｅ（Ｈ－１５、サンタクルーズバイオテクノロジー）、aｎｔｉ－Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３（Ａｓｐ１７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。免疫蛍光に使用した一次抗体：ａｎｔｉ－ＩＳＭ１（Ｅ－２０サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ｐ６５（１０７５４－１－ＡＰ、プロテインテック）、ａｎｔｉ－ＣＤ６８（Ｍ－２０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｐｒｏｂｅ（Ｈ－１５、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＧＲＰ７８（Ａ－１０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３（Ａｓｐ１７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－ＳＰ－Ｃ（ＦＬ－１９７、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＰＣＮＡ（ＰＣ１０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＧＲＰ７８（Ａ－１０、サンタクルーズバイオテクノロジー）、好中球マーカー（ＮＩＭＰ－Ｒ１４、サンタクルーズバイオテクノロジー）。製造業者のプロトコルに従って、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔＴＭＩｎ Ｖｉｔｒｏ ＲＯＳ／ＲＮＳアッセイ（ＳＴＡ－３４７、セルバイオラボ）を用いて、活性酸素種を測定した。製造業者のプロトコルに従って、マイクロプレート用のＣｌｉｃｋ－ｉＴＴＭＥｄＵ細胞増殖測定アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ１０４９９）を用いて、細胞増殖を測定した。先に記載された通り（Xiang et al., 2011）、組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）を作製した。リポソーム被包性クロドロン酸（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）は、Ｌｉｐｏｓｏｍａから購入した。
マウスｒＩＳＭ１（成熟型、シグナルペプチドなし）を発現させ、ベクターｐＥＴ－Ｍを用いて大腸菌において６ｘＨｉｓタグ付けしたタンパク質として精製した（Xiang et al., 2011に記載、ＪＣＭＭ、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。マウスｒＩＳＭ１を、これらの実験に使用した。成熟ＩＳＭ１（シグナルペプチドなし）は、試験された条件で生物学的に活性である。使用したＩＳＭ１配列は、ＮＰ＿００１２６３４１８．１を含み、以下の通りである：
Figure 2022524370000005
（配列番号９；下線部は天然ＩＳＭ１配列を示し、太字はＶｅｃｔｏｒ配列とＨｉｓタグを示し、斜体はＮ末端Ｍ残基を示す。）
リポソーム被包性クロドロン酸は、Ｌｉｐｏｓｏｍａから購入した。
肺の組織学及びイメージング。各実験のマウスの肺を、１０％中性緩衝ホルマリンで膨張させ固定し、パラフィンに包理して、厚さ５μｍの薄片を作成した。染色する前に、マウス及びヒトの肺切片を、エタノールとＰＢＳの段階希釈であるＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ（登録商標）Ｃｌｅａｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（シグマアルドリッチ）で脱パラフィン処理した。ＦＶＢ／ＮＴａｃ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺気腫の組織学的及び病理学的スコア化は、獣医病理学者が行った。病理学的スコア：０＝存在しない、１＝最小（＞１％）、２＝わずか（１～２５％）、３＝中等（２６～５０％）、４＝ほどほどに重症／高い（６１～７５％）及び５＝重症／高い（７６～１００％）。平均肺胞径（ＭＬＩ）は、記載の通りに定量化した３４（Knudsen, Weibel et al., 2010）。気管支上皮細胞数及び測定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて定量化した。免疫蛍光及び免疫組織化学染色のため、肺切片は、脱パラフィン処理後、クエン酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）において、圧力調理（ｐｒｅｓｓｕｒｅ－ｃｏｏｋｉｎｇ）による抗原賦活化を施された。スライドを、室温まで冷めるよう放置し、ＰＢＳで洗浄して、一時間、ＰＢＳにおいて３％ＢＳＡで遮断した。免疫組織化学染色用の肺切片は、さらに３０分間、３％過酸化水素で冷却した。その後、肺切片は、各一次抗体とともに、加湿したチャンバーにおいて一晩室温でインキュベートし、０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄し、非結合抗体を除去した。そして、各二次抗体とともに一時間室温でインキュベートし、０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄した。免疫蛍光染色されたスライドは、カバーガラスを取り付ける前にＤＡＰＩで対比染色した。一方、免疫組織化学染色されたスライドは、ヘマトキシリン対比染色及びカバーガラスを取り付ける前に５～１５分間、液体ＤＡＢ＋発色気質（Ｄａｋｏ）でインキュベートした。肺切片を、過ヨウ素酸シッフ（８７００７、サーモフィッシャー）で染色し、製造業者のプロトコルに従って、エラスチン染色キット（ａｂ１５０６６７、アブカム）を行った。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００及びＺｅｉｓｓ ＬＳＭ－５１０Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡で画像を撮影して解析し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて明るさ及びコントラストを調整した。
ＢＡＬＦ免疫細胞定量化。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取し、標準的な手順を用いたフローサイトメトリーによって細胞を解析した。ＡＭを選択するゲーティング戦略は、図２５に示す。
アポトーシス判定。アポトーシスは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ＺＯＯＭ 生細胞イメージングシステム（エッセンバイオサイエンス）を用いて測定した。ＭＨ－Ｓ細胞又は一次肺胞マクロファージを９６ウェルあたり５０，０００細胞の密度で播種し、製造業者の説明書に従ってＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４４４０、エッセンバイオサイエンス）を用いてアポトーシスを毎時測定した。ＭＨ－Ｓ細胞を、１％熱失活したＦＢＳを追加したＲＰＭＩ－１４０培地で５０ｎＭタプシガルジン（シグマアルドリッチ）で２４時間、前処理し、その後、同様の培養条件の下、１６時間、ａｎｔｉ－ＧＲＰ７８（Ａ－１０、サンタクルーズバイオテクノロジー）抗体有り・無しの両方で、１μＭ ｒＩＳＭ１で処理した。三重のウェルで処理を行い、定量化のため１ウェルあたり４枚の画像を撮影した。一次肺胞マクロファージは、同様の培養条件の下、１６時間、１μＭ ｒＩＳＭ１で処理した。実験グループは四重のウェルで行い、定量化のため１ウェルあたり４つの別々のフィールドをとった。
肺機能検査。先に記載された３５（Peh, Tan et al., 2017）通り、実験的ＣＯＰＤ ＷＴ Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃマウスだけでなく、ＦＶＢ／ＮＴａｃ野生型及びＩｓｍ１Δ/Δマウスにスパイロメトリーを行った。簡単に言えば、マウスをケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）とメデトミジン（１ｍｇ／ｋｇ）カクテルで麻酔し、気管切開した。マウスをカニューレ処理し、コンピュータ制御されたベンチレーターに接続した全身プレスチモグラフィー（ｗｈｏｌｅ－ｂｏｄｙ ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ）に置いた（強制肺操縦システム、Ｂｕｘｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ）。ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅＴＭデータ取得及び解析ソフトウェア（Ｂｕｘｃｏ）を用いて、全肺気量（ＴＬＣ）、機能的残気量（ＦＲＣ）、残気量（ＲＶ）、静的コンプライアンス（Ｃｃｈｏｒｄ）、動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）、１００ｍｓでの努力吸気量（ＦＥＶ１００）、Ｔｉｆｆｅｎｅａｕ－Ｐｉｎｅｌｌｉ指標（ＦＥＶ１００／ＦＶＣ）及び気道抵抗（ＲＩ）を記録した。呼吸仕事量は、圧力－体積グラフの下のエリアを使用して算出した。
肺のホールマウントイメージング。月齢６カ月のＦＶＢ／ＮＴａｃ野生型及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺を開胸して回収し、イメージング又は処理するまで冷たいＰＢＳに保存した。左の末梢肺葉の画像は、オリンパスＭＸＶ１０Ｍａｃｒｏ Ｚｏｏｍを用いて、拡大率１．２６倍で撮影した。肺エラスチン及びコラーゲンの免疫蛍光染色のため、回収したそれぞれの肺を、１％熱失活したＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び１μM Ｃｏｌ－Ｆ蛍光プローブ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＤＭＥＭ培地で、軽く揺すりながら一晩、４°Ｃでインキュベーションした。その後、ＰＢＳを３回交換して肺を洗浄し、末梢肺葉の画像を、オリンパスＭＸＶ１０Ｍａｃｒｏ Ｚｏｏｍを用いて蛍光励起し拡大率５倍で撮影した。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて明るさ及びコントラストを調整した。
ＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおける肺気腫レスキュー。週齢４週ＦＶＢ／ＮＴａｃ Ｉｓｍ１Δ/Δマウス（メス）に、５０μｌのＰＢＳ、５０μｌのＰＢＳにおける１μｇ又は５μｇのｒＩＳＭ１、又は、５０μｌのＰＢＳにおける３５０μｇのリポソーム被包性クロドロン酸を週２回、４週にわたって気管内投与した。処理最終日から２４時間後の肺機能検査を記録し、肺を組織学解析のため固定した。
たばこ煙誘発性ＣＯＰＤマウスモデル。週齢８週のＢａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃマウス（メス）を、先に記載された通り３５（Peh et al., 2017）、８週間、慢性的にたばこ煙曝露した。簡単に言えば、３本の３Ｒ４Ｆ標準たばこ（ケンタッキー大学、レキシントン）を２時間毎の頻度、一日あたり合計９本のたばこで、４％たばこ煙にマウスを全身曝露した。この喫煙レジメンを、５日間連続で、合計８週にわたって行った。Ｓｈａｍマウスは、別の換気されたチャンバーに入れ、同じ室内空気に曝露した。最初の４週のたばこ煙曝露の後、各処理グループに、追加で４週間、５０μｌのＰＢＳ、又は、５０μｌのＰＢＳにおける１０μｇのｒＩＳＭ１を投与した。ＰＢＳ及びｒＩＳＭ１処理は、毎日のたばこ煙曝露の最終ラウンドの後、各週の１、３及び５日目に気管内注入によって行った。たばこ煙曝露最終日から２４時間後の肺機能検査を記録し、肺を組織学解析のため固定した。
急性たばこ煙誘発性肺炎症マウスモデル。週齢８週のＢａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃマウス（メス）を、上記に記載された通りに、２週間、慢性的にたばこ煙曝露した。上記と同様の様式で、たばこ煙曝露の第２週の間、５日間連続で毎日、毎日のたばこ煙曝露の最終ラウンドの後、ＰＢＳ及びｒＩＳＭ１処置を気管内注入で行った。
ヒト肺組織。ヒトサンプルの使用は、シンガポール国立大学 治験審査委員会（ＮＵＳ－ＩＲＢ Ｒｅｆ Ｎｏ． Ｎ－１８－０５７Ｅ）によって承認された。匿名化されたホルマリン固定及びパラフィン包理されたヒト肺組織は、Ｌｕｎｇ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ （ＬＴＲＣ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ， Ｌｕｎｇ， ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＮＨＬＢＩ）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ）（米国）によって提供された。ＣＯＰＤ患者は、肺気腫の臨床診断と合わせて、ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜０．７、ＦＥＶ％予想：８０以下の事後／事前（ｐｏｓｔ／ｐｒｅ）気管支拡張剤スパイロメトリー基準に基づいて選択した。非ＣＯＰＤ患者は、ＦＥＶ１／ＦＶＣ：０．７以上、ＦＥＶ％予想：８０以上の事後／事前気管支拡張剤スパイロメトリー基準に基づいて特定した。患者の喫煙歴及びステータスが提供された。非ＣＯＰＤ患者とＣＯＰＤ患者におけるｈＩＳＭ１発現は、２人の研究者が盲目的に段階分けした。１つのヒト肺組織あたり、６から１０のフィールドがランダムに選ばれた。
統計解析。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを用いて行った。２つのグループの比較は、対応のない両側のスチューデントｔ検定で行い、複数のグループの比較は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡとチューキーの事後検定で行った。ｈＩＳＭ１発現と、喫煙又はＡＭアポトーシスとの相関関係は、それぞれ点双列相関及びピアソン相関を用いて判定した。結果は平均値の標準誤差で示し、各実験のサンプルサイズは図及び図の説明文において示した通りである。＜０．０５というＰ値は、有意であると考えられた。追加の注釈は、図の説明文において示される通りである。
実施例２：イスミン１がリポ多糖誘発急性肺損傷及び肺炎症を抑制した。
イスミン１（ＩＳＭ１）は、マウスの肺の気管支及び肺胞上皮細胞、内皮細胞、肺胞マクロファージ及びＮＫＴ細胞において高く発現する。ＩＳＭ１は、リポ多糖（ＬＰＳ）の気管内注入に反応して肺でアップレギュレートされる（Venugopal et al 2015, Cardiovas. Res.）。ＦＶＢ／Ｎ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景の両方のＩｓｍ１ノックアウトマウス（Ｉｓｍ１Δ/Δ）を使用した本研究において、我々の結果は、ＩＳＭ１欠乏は、マウスの肺において軽度の無菌性炎症を引き起こすことを示す。呼吸器ＬＰＳ負荷の際、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは、野生型と比べて悪化した肺炎反応を呈し、好中球、マクロファージ、Ｔ及びＢ細胞を含む白血球動員の増加を特徴とする。自然免疫細胞はＬＰＳ侵襲後７日目でベースラインに沈静したが、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは９日目に、筋線維芽細胞の増加、コラーゲンの過剰蓄積及びＴＧＦ－βアップレギュレーションとともに、肺線維症の高まりを示した。組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）の気管内注入は、肺におけるＬＰＳ誘発性炎症を抑制することができた。これらの結果は、過剰炎症反応からの肺の保護、及び、ＬＰＳによって引き起こされたＡＬＩ後の恒常性を損傷した肺に取り戻すことにおける、ＩＳＭ１の治療効果を明らかにする。
感染性又は非感染性呼吸器侵襲の際、宿主は、自己防御のため肺において急性炎症反応を開始する。健康な宿主は、この肺炎を制限する手段も有しており、最終的に炎症を消退させ、周囲組織の付帯的損傷を予防する。広範な急性肺炎が、急性肺損傷（ＡＬＩ）とそのより重度の症状である急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む複数の肺疾患に見られる。これらは、有効な薬物治療法のない、死亡率が５０％に及ぶ深刻な臨床症候群である３６。ＡＬＩは、血管透過性の増加、炎症性細胞浸潤（主に好中球）、肺実質細胞だけでなく白血球浸潤による炎症誘発性メディエーターの解放を特徴とする３７。
ＬＰＳは、マウスとヒトにおいて、重度の炎症効果を誘発することができるグラム陰性菌細胞壁の糖脂質成分である。マウスにおける短期間鼻腔内ＬＰＳ負荷は、気道と肺の両方において混合炎症反応をしばしば刺激する。これは、肺の内皮性及び上皮性関門の破壊、炎症性細胞浸潤の増加、炎症誘発静及び細胞障害性メディエーターの解放を含む３８－４０。これらの表現型は、ＡＬＩ及びＡＲＤＳの両方と臨床的に関連がある。複数の細胞内シグナル伝達現象が、ＬＰＳ負荷に際して開始される。多くの場合、ＬＰＳはトル様受容体４（ＴＬＲ－４）複合体を通じて結合及びシグナルを伝達し、核内因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）を活性化する４１－４３。活性化されたＮＦ－κＢは、核に移行し、それぞれのエンハンサー／プロモーター領域で共通標的配列に直接結合することによって、インターロイキン１（ＩＬ－１）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）４４、４５を含む多数の炎症誘発性サイトカインの転写を刺激する。重要なことに、ＮＦ－κＢは、ＡＲＤＳ患者の肺胞マクロファージにおいて活性であり４６、ＡＬＩ及びＡＲＤＳの発達及び進行におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の関与を関連付ける。
ＩＳＭ１は、初め、血管新生抑制及びアポトーシス促進性の分泌タンパク質として特定され、血管透過性誘導においても研究された４７、４８、４９。ＩＳＭ１の高親和性受容体であるグルコース調節タンパク質７８ｋＤａ（ＧＲＰ７８）に対する抗体の全身注入は、ＬＰＳによって誘発された肺の透過性亢進を弱めた４９。
本研究において、ＬＰＳ誘発性急性肺炎症におけるＩＳＭ１の役割を、Ｉｓｍ１ノックアウトマウス（Ｉｓｍ１Δ/Δ）を使用して研究した。データは、ＩＳＭ１が炎症抑制剤であって、無菌の肺及びＬＰＳ誘発性ＡＬＩの間において、肺を過剰な炎症反応から守ることを支持する。ＩＳＭ１の存在は、急性損傷後の肺に恒常性を取り戻すことをも促進した。
ＩＳＭ１欠乏が、無菌状態の肺において白血球浸潤の増加を引き起こした。
Ｉｓｍ１ノックアウト（Ｉｓｍ１Δ/Δ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集法で作製した（図１７）。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは、周囲空気の下、肺において突発性炎症を呈した。週齢８週のノックアウトマウスの肺の冠状切片の組織学的検査によって、肺胞マクロファージ、多形核細胞及びリンパ球を含む炎症性細胞の多発性で境界が画定されていない（ｎｏｎ－ｄｅｍａｒｃａｔｅｄ）クラスターが明らかとなった（図９Ａ）。全肺単細胞ホモジネートの免疫細胞分画と、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色は、総白血球、マクロファージ及び好中球の著しい増加を示した（図９、９Ｂ～９Ｅ）。肺胞壁過形成及び肺気腫の限局的エリアも、ノックアウトマウスに観察された（図９、９Ａ及び９Ｃ）。一方、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの末梢血液鑑定も、野生型のものと比べて、総白血球数の著しい増加を示した。白血球細胞のサブポピュレーションの中で、リンパ球及び好中球数はＩｓｍ１Δ/Δマウスにおいて特に高く、その他の細胞種はノックアウト及び野生型マウスにおいて低いままであった（図９Ｆ）。
図１７は、Ｉｓｍ１－/－（Ｉｓｍ１Δ/Δ）マウスの作製の詳細を示す。図１７Ａは、ガイドＲＮＡペアであるｇＲＮＡ１及び３による、Ｉｓｍ１標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の概略図を示す。Ｐ１及びＰ２は、Ｔ７Ｅ１アッセイ及び遺伝子型判定に使用するプライマーを示す。図１７Ｂは、Ｉｓｍ１Δ/ΔノックアウトラインのＤＮＡ配列を示し、未成熟終止コドン及びＩＳＭ１タンパク質が生成されないことにつながる２３ｂｐの欠失を示す。図１７Ｃは、Ｃ５６ＢＬ／６Ｊ ＷＴ、Ｉｓｍ１＋/Δ及びＩｓｍ１Δ/ΔのＲＴ－ＰＣＲのゲルイメージを示す。図１７Ｄを参照すると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴ及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの肺切片における、ＩＳＭ１（茶色）及び核（ヘマトキシリン、青）の代表的な免疫組織化学染色が示されている。Ｂｒ：気管支；Ａｌ：肺胞。スケールバー：２０μｍ。
ＩＳＭ１欠乏は、肺において、ＬＰＳに対する急性免疫応答の高まりを引き起こした。
急性肺炎症におけるＩＳＭ１の役割を調べるため、２ｍｇ／ｋｇのＬＰＳをＩｓｍ１Δ/Δ及び野生型マウスの肺に気管内注入した。両グループのマウスが生存し、ＬＰＳに対して急性炎症反応を起こした。野生型マウスに比べると、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスは、７日間の急性反応期間中、総肺白血球の顕著な増加を示した（図１０Ａ）。Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおいて、１日目以降、より高い数の好中球（図１０Ｂ）、Ｔ細胞（図１０Ｄ）及びＢ細胞（図１０Ｅ）が観察された一方、３日目からマクロファージ動員の増加が観察された（図１０Ｃ）。野生型及びＩｓｍ１Δ/Δマウスの両方において、７日目までに好中球は基礎レベルに鎮静したが、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺においては、肺胞マクロファージ、Ｔ及びＢ細胞の数は著しく高いままであった。同様に、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスにおいて、より高い数の総気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）タンパク質が観察され、これは過剰な肺炎症と関連する透過性亢進を反映している（図１０Ｆ）。一貫して、ＬＰＳ負荷後１日目に収集された肺の組織学解析は、野生型の肺よりもＩｓｍ１Δ/Δの肺の肺胞腔において免疫細胞の大幅な増加と、この時点での好中球の顕著な増加を示した（図１０Ｇ）。
したがって、ＩＳＭ１の欠如は、マウスにおいて、呼吸器ＬＰＳ負荷に対するより重度の炎症反応を引き起こし、肺炎症の調節におけるＩＳＭ１の役割を支持する。
外因性ｒＩＳＭ１が肺におけるＬＰＳ誘発性炎症反応を抑制した。
上記結果に基づき、我々は、ＩＳＭ１がＬＰＳによって誘発された炎症を抑制するかもしれないと仮定した。この仮定を検証するため、我々は、ＬＰＳ注入の１日前に、野生型マウスの気管内に５０μｇのｒＩＳＭ１を注入して前処理した。ｒＩＳＭ１処理は、ＬＰＳ注入した日と以後３日間続けた（図１１Ａ）。そして、ＢＡＬ液を採取したところ、ｒＩＳＭ１処理されたマウスは、総ＢＡＬタンパク質の著しい減少を確かに示した（図１１Ｂ）。白血球の肺胞腔への浸潤は、ほぼ基礎レベルまで減少した（ＬＰＳ負荷なし）（図１１Ｃ）。好中球（図１１Ｄ）及び肺胞マクロファージ（図１１Ｅ）はともに、ｒＩＳＭ１処理下で大幅に減少した。ｒＩＳＭ１処理下、Ｔ及びＢ細胞において減少の傾向が見られるが（図１１Ｆ～１１Ｇ）、ＰＢＳ処理されたマウスのグループにおける高い変動のため、これらの変化は統計的に有意でない。これらの知見は、ＩＳＭ１が、肺の炎抑制剤として機能し得ることを支持し、局所的にデリバリーしたｒＩＳＭ１が、マウスにおいてＬＰＳ誘発性肺炎症を和らげたことを支持する。
ＩＳＭ１欠乏が、ＬＰＳ誘発性急性肺損傷後の肺の不完全な回復及びリモデリングを引き起こした。
炎症は、外的攻撃に対する適切な反応にとって重要であるが、組織の損傷を誘発することもある。影響を受けた組織は、このような炎症によって引き起こされた損傷を回復し、組織の恒常性を修復しようと試みる。過剰な炎症反応は、回復メカニズムを圧倒することができ、組織のリモデリングを引き起こす。Ｉｓｍ１Δ/ΔマウスがＬＰＳ負荷に対し免疫反応の高まりを示したため、この悪化した炎症反応が肺の修復及び恒常性の回復に影響を及ぼすかどうかを判定しようとした。肺組織の組織学を、ＬＰＳ負荷後９日目に検査した。図１２Ａに示す通り、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺は、肺組織の重度の歪みと肺胞壁の広範な肥厚を示した。ピクロシリウスレッド染色によって、コラーゲン沈着の著しい増加も観察された（図１２、１２Ｂ～Ｃ）。また、特に小さな線維性クラスターにおける筋線維芽細胞（α平滑筋アクチン陽性）の存在量の増加も注目に値する（図１２、１２Ｄ～１２Ｅ）。細胞外基質（ＥＣＭ）と筋線維芽細胞の過剰な集積は、肺線維症の特徴である５０。
ＬＰＳ負荷に際し、炎症反応は通常、上皮の外傷／損傷を誘発する。肺胞上皮細胞には二つの型がある。Ｉ型（ＡＥ１）細胞は、高分化型で、平坦で扁平な細胞であり、肺胞壁表面の９０％を覆っている。ＩＩ型（ＡＥ２）細胞は、数は少ないが、幹細胞のような性質を持つ５１。ＡＥ２細胞は、外傷後の肺の回復と再生にとって重要である。肺胞上皮の恒常性と完全性を維持するため、ＡＥ２細胞は増殖してＡＥ１細胞に分化し、肺胞壁を再上皮化（ｒｅ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚｅ）する５２、５３。過形成性ＡＥ２細胞によるＡＥ１細胞の異常な置換は、線維症の要因の一つである５４。ＰＣＮＡ（細胞増殖マーカー）及びＳＰ－Ｃ（ＡＥ２マーカー）の免疫蛍光二重染色（図１３）に示す通り、ＬＰＳ負荷後９日目に、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺は、野生型の肺よりもＡＥ２細胞のより著しい増殖を示した。この結果は、ＡＥ２過剰増殖が、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺における線維症の増加に寄与した可能性を示唆する。
ＴＧＦ－βは、現在までに特徴づけられた最も強力な線維化促進メディエーターである５５。ＬＰＳ負荷後９日目に、野生型の肺と比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺におけるＴＧＦ－βレベルが著しく増加した（図１４）。
まとめると、これらの結果は、ＩＳＭ１欠乏がＬＰＳ負荷に対する免疫反応の高まりをマウスにおいて誘発し、異常な肺の回復と線維症を引き起こしたことを示す。
ＩＳＭ１欠乏が、ＬＰＳ負荷後の肺において急性炎症性サイトカイン／ケモカインのプロフィールを変化させた。
ＩＳＭ１欠乏がＬＰＳに反応して炎症性サイトカイン／ケモカインを変化させたかを解読するため、サイトカイン抗体アレイを用いて、サイトカインとケモカインのプロフィールを検証した。ＬＰＳ負荷後１日目に、対照マウスと比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺において７つのケモカインとサイトカインが実質的に上昇した（１．５倍以上）（図１５Ａ）。アップレギュレートされたサイトカイン／ケモカインの全ては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βなどの既知の炎症促進性メディエーター；ガンマインターフェロンによって誘導されたモノカイン（ＭＩＧ）などの白血球走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１ａ及びＭＩＰ－２などのＣ－Ｘ－Ｃケモカイン；及び可溶性ＩＣＡＭ－１である。さらに、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺においてＴＮＦ－αの著しい増加が見られた（図１５、１５Ｂ～１５Ｃ）。これらの結果は、肺におけるＩＳＭ１の欠如が、複数の炎症性サイトカインの増加を引き起こし、ＬＰＳ負荷に対する肺の炎症反応の高まりの原因である可能性を示す。
ＩＳＭ１欠乏が、肺におけるＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化した。
先の研究は、ＮＦ－κＢの核移行を誘導することによって、ＬＰＳがマウスの肺におけるＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化することを示した。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＬＰＳ誘発性ＮＦ－κＢ移行を制御する役割をＩＳＭ１が果たすかどうかを判定するため、ＬＰＳ侵襲後のＩｓｍ１Δ/Δ及び野生型マウスの肺組織を固定し、ＮＦ－κＢを染色した（ｐ６５サブユニット）。野生型マウスのものと比べて、Ｉｓｍ１Δ/Δマウスの肺組織において、核ｐ６５ ＮＦ－κＢ（赤）の著しい増加が見られた（図１６Ａ）。また、ｐ６５ ＮＦ－κＢレベルも、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺の方が高かった（図１６Ｂ～Ｃ）。これらのデータは、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺においてＮＦ－κＢシグナル伝達がＬＰＳに反応して増加することを示し、これは複数の炎症促進性サイトカイン／ケモカインの活性化、及び、炎症の高まりのメカニズムである可能性がある。
ＬＰＳ誘発性ＡＬＩモデルを用いて、本研究は、ＩＳＭ１欠乏がマウスの肺において過剰な炎症を引き起こしたことを示す。さらに、ｒＩＳＭ１は、マウスに気管内投与した場合、ＬＰＳ誘発性肺炎症を和らげることができた。これらの知見は、抗炎症性タンパク質としてのＩＳＭ１を支持する。
いくつかの血管新生阻害剤に関して、その血管新生抑制力に加えて、肺の炎症を抑制することがすでに報告されている。例えば、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ－１）は、肺における生理的炎症と恒常性にとって重要であると報告されている５７。早ければ月齢１カ月で、Ｔｓｐ１－/－マウスは、その肺実質においてまだらな炎症部位を示すようになった。好中球浸潤が、肺胞及び血管周囲の結合組織において現れた。また、ＴＳＰ－１欠乏性マウスは、ＬＰＳ誘発性肺損傷になりやすかった５８。ＴＳＰ－１は、肺損傷の回復段階に重要な抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の生成を制御することによって、炎症反応を抑える。アンジオスタチンも、マウスにおけるＬＰＳ誘発性急性肺損傷を抑制できる血管新生阻害剤である５９。アンジオスタチン処理は、ＢＡＬ液におけるタンパク質集積と、肺への白血球浸潤を強力に減少させた。本研究において、ＩＳＭ１は、ＴＳＰ－１機能といくらか関連する様式で機能すると示される。なぜならば、両方のノックアウトマウスが非病理性状況の下、肺における炎症反応の高まり、及びＬＰＳ誘発性急性肺損傷における過敏反応性を示すからである。一方、外因性アンジオスタチンとＩＳＭ１はともに、ＬＰＳ負荷に際し、急性肺炎症を抑制し得る。
Ｉｓｍ１Δ/Δ肺はＬＰＳに対しより重度の炎症反応を示したが、野生型マウスと同様に、炎症は３日目にピークを迎えた後鎮静し始め、７日目にはほぼ基礎レベルに達した。しかしながら、Ｉｓｍ１Δ/Δ肺は、コラーゲン沈着の増加、繊維芽細胞の集積、及び、より高いＴＧＦ－β発現レベルとともに、広範に線維症のような表現型を示した。さらに、増殖する肺胞上皮ＩＩ型（ＡＥ２）細胞数の増加も観察された。これらのデータは、過剰炎症とともに、ＬＰＳに反応する“過敏反応性”の肺を指し、これは通常、組織のリモデリングを誘導する状況である６０。ＩＳＭ１は、肺においてＬＰＳによって誘発される過剰な炎症を阻害する役割を果たし、過剰な損傷及び外傷から肺を守る。Ｉｓｍ１Δ/Δ肺における過剰な炎症は、回復メカニズムを圧倒することもあり、構造変化及び線維症を引き起こす。
ＮＦ－κＢ経路は、ＬＰＳ誘発性炎症において重要な役割を果たす４５、５６、６１。ＮＦ－κＢの活性化は、その活性型ｐ６５の核への移行を結果としてもたらす。ＬＰＳは、細胞質から核へのＮＦ－κＢ ｐ６５の移行を高めることができた６１、６２。ＬＰＳ誘発性ＮＦ－κＢ活性化は、ＩＬ－１、ＭＩＰ－２及びＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの発現を増加させることで知られ、過剰な炎症反応を引き起こす５６、６３、６４。ＩＳＭ１欠乏状況下において、ＮＦ－κＢ活性型の存在量の増加及び核移行の増加は、複数の炎症促進性サイトカインのアップレギュレーションにおけるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の関与を示唆する。
ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、活性化した好中球の重大な存在と、肺における液体の貯留を特徴とし、肺機能低下と高死亡率をもたらす６５。ＡＬＩとＡＲＤＳは、人間社会に蔓延している肺疾患の一つである６６。残念ながら、この分野において、両方の疾患に対する新しい治療法の大きな進歩や発見は、まだ報告されていない６０。本明細書に記載の知見は、ＬＰＳ負荷マウスにおいて、気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１が白血球浸潤を減少させるのに十分強力であったことを示す。重要なことに、ＬＰＳ誘発性の肺の透過性亢進も、ＩＳＭ１処理によって抑制されたことが示された（図１１）。
結果は、ＩＳＭ１が、肺の炎症の抑制剤／炎症消退メディエーターを提供し得ることを支持する。そのアポトーシスを誘導することによって、肺胞マクロファージの過剰な集積を抑制した。局所的にデリバリーされたｒＩＳＭ１は、マウスにおける肺気腫表現型を救助し、肺の恒常性を保持することを助けた。したがって、これらの結果は、ＡＬＩやＣＯＰＤなどの炎症性肺疾患を治療、改善及び／又は予防するためのＩＳＭ１に基づく治療アプローチを支持する。
材料及び方法
動物。成体（週齢７～８週）のメスのＩＳＭ１欠乏性（Ｉｓｍ１Δ/Δ）マウスをこの研究に使用した。週齢及び性別が一致する野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ジャクソン研究所（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。動物の飼育及び実験の手順は、ＮＵＳ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ；プロトコル０６６／１２及びＲ１６／０６３２；飼育プロトコルＢＲ１５／１１００）によって承認された以下の制度的ガイドラインに従った。Ｔ７Ｅ１アッセイ及び遺伝子型判定に使用したプライマーは以下の通りである：
変異マウスをスクリーンするためのＴ７Ｅ１アッセイのＰＣＲプライマー：
Forward 5’ cagctcctgggattgctccg 3’（配列番号１６）及びReverse 5’ taagacttcttcctggtgccaaa 3’（配列番号１７）；
マウス遺伝子型判定用ＰＣＲプライマー：
Forward 5’ gacagctcctgggattgctcc 3’（配列番号１８）及びReverse 5’ ttctgcaatgtaccaagctctct 3’（配列番号１９）
（図１７参照）
組換えタンパク質。組換えＩＳＭを大腸菌に発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製し、逆相ＨＰＬＣを行った。組換えタンパク質は、エンドトキシンフリーであることが確認された。レスキュー実験において、ｒＩＳＭ１をろ過したＰＢＳに溶解し、マウス１匹あたり５０μｇのｒＩＳＭ１を肺に気管内投与した。マウスｒＩＳＭ１（成体、シグナルペプチドなし）が発現し、ベクターｐＥＴ－Ｍを用いて、大腸菌においてＨｉｓタグ付けしたタンパク質として精製した（Xiang et al., 2011に記載、ＪＣＭＭ、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。マウスｒＩＳＭ１をこれらの実験で使用した。成熟ＩＳＭ１（シグナルペプチドなし）は、検査された状況において、生物学的に有意であってもよい。ＩＳＭ１配列はＮＰ＿００１２６３４１８．１を含み、以下の通りである：
Figure 2022524370000006
（配列番号９；下線部は天然ＩＳＭ１配列を示し、太字はベクター配列及びＨｉｓタグを示し、斜体はＮ末端Ｍ残基を示す）
気管内注入。マウスを５％イソフルラン（バクスター）で麻酔し、その後、Liao et al６７に記載の通りに、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４（Ｌ２６３０；シグマアルドリッチ）からのＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳ）又は生理食塩水を気管内デリバリーした。対照動物には、生理食塩水のみを注入した。マウスは、次の解析のため、ＬＰＳ注入後１、３、５及び７日目の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を採取する時まで回復させた。
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）採取。新たに安楽死させたマウスを解剖し、肺と心臓を露出させた。気管にカニューレを挿入し、肺を１ｍｌの冷たいＰＢＳで２回洗浄した。ＢＡＬサンプルを４°Ｃで５分間、５００ｘｇで遠心分離した。上澄みは採取し、使用するまで－８０°Ｃで保存した。ブラッドフォード試薬を用いてＢＡＬタンパク質を定量化した。１ｍＬの赤血球溶解バッファーを細胞ペレットに添加してすべての赤血球を溶解し、その後遠心分離した。生細胞はＦＡＣＳバッファーで回復させ、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－１００（ケモメテック、デンマーク）を用いて計数し、その後免疫細胞分画を行った。
免疫細胞分画（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）。免疫細胞分画は、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターを用いて判定し、ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｃｅａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）で解析した。免疫細胞分画は、先に記載された通りに行った６８。免疫細胞はＣＤ４５＋として特定し、肺胞マクロファージはＣＤ１１ｃ＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋として、好酸球はＣＤ１１ｃ－Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋として、好中球はＧＲ－１＋ＣＤ１１ｂ＋として、Ｂ細胞はＣＤ３－／ＣＤ１９＋として、Ｔ細胞はＣＤ３＋／ＣＤ１９－細胞として特定した。
末梢血白血球数。麻酔したマウスの顎下血管から、血液を採取した。新鮮な血液サンプルを、Ｈｅｍａｙｅｔ Ｈ９５０ＦＳ血液解析装置（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ、米国）を用いて解析した。
組織学。完全に膨張した肺を、１０％中性緩衝ホルマリンに固定した後、パラフィン包理し、薄片にし、ヘマトキシリン及びエオシン染色又はピクロシリウスレッド染色（ａｂ１５０６８１、アブカム、米国）した。切片（５μｍ）はｈｉｓｔｏｃｌｅａｒで脱パラフィン処理した後、１００％エタノールから始まる一連のアルコールグレードにて、ゆっくりと再水和を行った。水に再水和した後、次の染色のため、切片はＰＢＳに入れた。
免疫組織化学（ＩＨＣ）及び免疫蛍光（ＩＦ）。組織切片を、ａｎｔｉ－ＣＤ６８（ｓｃ－７０８４、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＮＩＭＰ－Ｒ１４（ｓｃ－５９３３８、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－α－ＳＭＡ（サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＴＧＦ－β（ｓｃ－１４６、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＳＰ－Ｃ（ｓｃ－１３９７９、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ｐ６５ＮＦκＢ（１０７４５０－１－ＡＰ、プロテインテック）及びａｎｔｉ－ＰＣＮＡ（ｓｃ－５６、サンタクルーズバイオテクノロジー）で一晩、４°Ｃで染色した。組織切片は、ヘマトキシリン及びエオシン（ＤＡＫＯ）で染色した。すべての画像は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔで撮影した。
免疫ブロット法及びタンパク質アレイ。新しい組織はホモジナイズして遠心分離し、可溶性の上澄みは全組織ライセートとして採取した。βアクチンをローディングコントロールとして使用して、標準的なウエスタンブロットを行った。抗体として、ａｎｔｉ－ＴＧＦ－β（ｓｃ－１４６、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（１０７５９０－１－ＡＰ、プロテインテック）、ａｎｔｉ－ｐ６５ＮＦ－κＢ（１０７４５－１－ＡＰ、プロテインテック）を使用した。マウスサイトカインプロテオームプロファイラーアレイ（ＡＲＹ０２８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用して、４０の様々なサイトカインの相対的存在量を検査した。１グループあたり４匹のマウスの全組織ライセートを使用した。１サンプルあたり２００μｇの総タンパク質と同量をアレイにハイブリダイズし、相対的発現のため比較した。相対的発現は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、ドットブロット強度を測定することによって定量化した。
統計解析。データは、平均値の標準誤差として表した（±ＳＥＭ）。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定を用いて判定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ：３以上。
実施例３：ＩＳＭ１のアポトーシス促進活性の媒介には、Ｃ末端ＡＭＯＰドメインのみで十分である。
この実施例において、ＩＳＭ１の構造－機能関係を調査した。最初に、細菌及び哺乳類組換え（ｒＩＳＭ１）タンパク質の両方を発現し精製する方法を開発した。二つのｒＩＳＭ１の間の１５ｋＤａの質量差が、哺乳類ｒＩＳＭ１のグリコシル化プロフィールの調査を促し、高密度で不均一なグリカンの沈着を明らかにした。次に、個別ドメインを含む様々なｒＩＳＭ１短縮タンパク質を用いた共免疫沈降アッセイ及びアポトーシスアッセイによって、ＭＵＣ４における接着関連ドメイン及びＩＳＭ１のその他タンパク質（ＡＭＯＰ）ドメインが、両方の受容体相互作用（すなわち、インテグリンαｖβ５及び細胞表面ＧＲＰ７８（ｃｓＧＲＰ７８））を媒介したことがさらに示された。同様に、ＩＳＭ１のＡＭＯＰドメインは、全長タンパク質の完全なアポトーシス促進活性を示した。
組換えＩＳＭ１タンパク質の発現及び精製。
ＩＳＭ１の構造－機能関係を明確にするため、我々はまず組換えＩＳＭ１（ｒＩＳＭ１）を作製し、精製した。ＩＳＭ１は分泌タンパク質であるため、我々はまず哺乳類発現宿主を利用した。哺乳類発現構築物を構築するため、マウスＩＳＭ１の天然シグナルペプチドをマウスＩｇκ１リーダー配列と置換して、分泌効率を高めた（図３１ａ）。次に、発現構築物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に遺伝子導入し、条件培地中の組換えタンパク質をワンステップＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）によって精製した（図３１ｂ）。精製された哺乳類ｒＩＳＭ１は、変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で７０ｋＤａあたりに移動した（図３１ｃ）。
可溶性ｒＩＳＭ１を細菌宿主から発現させるため、シグナルペプチド配列のないマウスＩＳＭ１のＮ末端に、ＳＵＭＯ（ユビキチン様タンパク質）タグを融合させた（図３１ｄ）。細菌発現構築物はシャッフルＴ７細胞に形質転換させ、可溶性タンパク質はＩＭＡＣ及びＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）によって更に精製した（図３１ｅ）。ＳＵＭＯタグを切断後、細菌ｒＩＳＭ１は、変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で５５ｋＤａあたりに移動した（図３１ｆ）。
哺乳類ｒＩＳＭ１は、不均一なグリカンとともに高密度に沈着する。
驚くことに、哺乳類と細菌ｒＩＳＭ１の間には約１５ｋＤａのサイズ差があり、哺乳類ｒＩＳＭ１には翻訳後修飾（ＰＴＭ）が存在することを示唆する。そして我々は、タンパク質のグリコシル化がタンパク質質量に大いに寄与するため、タンパク質のグリコシル化に着目した。配列解析によって、マウスＩＳＭ１の二つの潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位、すなわち、Ａｓｎ３９及びＡｓｎ２８２が明らかになった（図３２ａ）。哺乳類ｒＩＳＭ１をＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｎ－Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ）とともにインキュベートしたことで、タンパク質質量が約１０ｋＤａ減少し、Ｎグリカンの存在を確認した（図３２ｂ）。Ｎグリコシル化変異構築物（Ｎ３９Ｑ、Ｎ２８２Ｑ、Ｎ３９／２８２Ｑ）を更に作製して、Ｎグリカン部位のどちらか又は両方を破壊し、３つの細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨｅＬａ）でその効果を評価した（図３２ｃ）。各単一変異体は、全細胞ライセート（ＷＣＬ）画分においてタンパク質サイズが減少（～５ｋＤａ）した一方、二重変異体は、全体として～１０ｋＤａまでサイズが減少し、両部位がＮグリカンで変性したことが確認された。興味深いことに、ＷＴ／Ｎ２８２ＱはともにＷＣＬ画分において二重バンドを示したが、Ｎ３９Ｑ及びＮ３９／２８２Ｑは一重バンドのみを示した（図３２ｃ）。先の報告からの同様の観察は、これがＡｓｎ３９（８）における非効率的なコアグリコシル化によるものであると示唆する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、どちらのＮグリカン部位の破壊も、条件培地においてタンパク質の分泌を消失させた（図３２ｃ）が、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びＨｅｌａ細胞のＡｓｎ２８２変異体においてのみタンパク質の分泌が消失した。この結果は、Ａｓｎ２８２でのＮグリコシル化が、ＩＳＭ１の分泌の制御において重要であった一方、Ａｓｎ３９でのＮグリコシル化が、特定の細胞株において重要であったことを示した。
次に、我々は、哺乳類ｒＩＳＭ１に存在するＯ及びＣ結合型グリカンをさらに特定するため、プロテオミクスのアプローチを利用した。際立ったことに、３０のアミノ酸が追加でグリコシル化したことが明らかになった（図３２ｄ）。いくつかの残基はシンプルな構造で一つのグリカンで変性された一方、Ｓｅｒ１８４及びＳｅｒ１８８などのいくつかの残基は独特な構造で複数のグリカンで変性され、これらの位置でのグリカンの沈着の微小不均一性を示唆する。グリコシル化部位の分布に着目すると、２１のグリカン部位がＮ末端不定形領域に位置し、２の部位がＴＳＲドメインに位置し、７の部位がＡＭＯＰドメインに位置する（図３２ｄ）。グリカンの沈着の大部分及びグリカンの複雑性は、不定形領域に存在するため、不定形領域のフォールディングにおけるグリコシル化の安定化を担う役割を示唆し得る。また、ＴＳＲドメインには二種類の特殊なグリコシル化、すなわち、Ｏ－フコシル化（Ｏ－フコース－グルコース）認識Ｃｘｘ（Ｓ／Ｔ）ＣＧモチーフ、及び、ＷｘｘＷの認識モチーフを有するＣ－マンノシル化（Ｃ－マンノース）が存在し保存されていることが報告されている。ＩＳＭ１－ＴＳＲドメインにおいて、二つの特定されたグリカン修飾は、Ｔｈｒ２９９のＯ結合型二糖（デオキシ糖－ヘキソース）及びＴｒｐ２２０（２２０－ＷＳＬＷ－２２３）のＣ結合型単糖（ヘキソース）であり（表Ｓ１）、推定上のＯ－フコシル化及びＣ－マンノシル化とそれぞれ対応し得る。
これら３０のグリコシル化部位のうち、変異解析のため４つの候補部位をさらに選択し、その効果を評価した：Ｔｒｐ２２０及びＴｈｒ２２９は、ＴＳＲドメインにおける推定上のＣ－マンノシル化及びＯ－フコシル化部位であるため；Ｓｅｒ１８４及びＳｅｒ１８８は、グリカン沈着したとても不均一なスポットであるため。ウエスタンブロットによる予備解析は、これらのグリコシル化部位の破壊は、ＩＳＭ１発現又は分泌に影響を及ぼさなかったことを示した（図３２e）。まとめると、我々の解析は、哺乳類ｒＩＳＭ１が不均一なグリカンとともに高密度に沈着することを明らかにする。
ＩＳＭ１のＡＭＯＰドメインはその受容体相互作用を媒介する。
以前、我々は、インテグリンαｖβ５及び細胞表面ＧＲＰ７８を、ＩＳＭ１の細胞表面受容体として特定した。ＩＳＭ１のどのドメインが受容体相互作用を媒介するのかを明確にするため、次の哺乳類ｒＩＳＭ１タンパク質を作製した：両方のドメインを含むｍａｍＩＳＭ１２６－４６１、ＴＳＲドメインを含むｍａｍＩＳＭ１２６－２８６及びＡＭＯＰドメインを含むｍａｍＩＳＭ１２６－２８６（図３３ａ、ｂ）。ＡＴＰａｓｅドメインのみを含む組換えＧＲＰ７８トランケートが発現し、細菌から精製した（図３３ａ、ｂ）。細胞外ドメインのみを有する哺乳類組換えインテグリンαｖβ５ヘテロ二量体は、商業的に入手した。これらの精製された組換えタンパク質を用いた共免疫沈降アッセイは、ＡＭＯＰドメイン単独で、ＩＳＭ１－ＧＲＰ７８及びＩＳＭ１－αｖβ５相互作用の両方を媒介することが可能であることを示した（図３３ｃ、ｄ）。対照的に、ＡＭＯＰドメインのないＩＳＭ１トランケートは両方の受容体への結合を消失した（図３３ｅ）。まとめると、ＩＳＭ１－ＡＭＯＰドメインは、両方の受容体に対する相互作用を媒介する。
ＡＭＯＰドメインの境界がそのアポトーシス促進活性に影響を及ぼす。
ＡＭＯＰドメインのアポトーシス促進活性を調査するため、我々は、まず二つのＡＭＯＰトランケート、すなわち、異なる長さのｍａｍＩＳＭ１２７１－４６１及びｍａｍＩＳＭ１２８７－４６１を作製した。なぜならば、ＡＭＯＰの正確な境界は明らかでなく、推測に過ぎないためである（図３４ａ、ｂ）。驚くことに、ｍａｍＩＳＭ１２８７－４６１が飢餓状況と同様のレベルでＥＣアポトーシスを誘導した一方で、ｍａｍＩＳＭ１２７１－４６１はＥＣアポトーシスをまったく誘導しなかった（図３４ｃ）。Ｎ末端の１６の余分なアミノ酸が、ＡＭＯＰドメインからアポトーシス促進活性を完全に消失させたようである。
これらの１６の余分なアミノ酸の効果をさらに調査するため、我々は、この領域において長さの異なる次のＡＭＯＰトランケートを作製した：ｂａｃＩＳＭ１２７１－４６１、ｂａｃＩＳＭ１２８２－４６１、ｂａｃＩＳＭ１２８３－４６１、ｂａｃＩＳＭ１２８７－４６１。ＳＵＭＯタグへの融合を介して、細菌発現系からこれらを作製した（図３４ｄ、ｅ）。興味深いことに、余分な配列が短くなるほどに、ＡＭＯＰトランケートはより活動的になった（図３４ｆ）。したがって、この結果は、ＡＭＯＰドメインの境界がそのアポトーシス促進活性に影響し得ることを示す。
細菌と哺乳類組換えＡＭＯＰトランケートのアポトーシス促進活性を詳細に比較したところ、ｂａｃＡＭＯＰがｍａｍＡＭＯＰと同様の活性を示したことに気が付いた。ｂａｃＩＳＭ１２７１－４６１とｍａｍＩＳＭ１２７１－４６１の両方が活性を示さなかった一方で、ｂａｃＩＳＭ１２８７－４６１とｍａｍＩＳＭ１２８７－４６１の両方が同様のレベルでアポトーシス促進活性を示した（図３４ｇ）。したがって、この結果は、ＡＭＯＰ活性が翻訳後修飾（ＰＴＭ）の影響を受けないことを示す。
確かに、マウスＩＳＭ１タンパク質のトランケーションを使用した構造－機能関係の研究は、２８７－４６１からのＣ末端ＡＭＯＰドメインが、全長ＩＳＭ１タンパク質の完全なアポトーシス促進活性を保持することを示した（図２９）。さらに、結果は、大腸菌作製ｂａｃＩＳＭ１２８７－４６１断片（ＡＭＯＰドメイン単独）が、哺乳類細胞作製ｍａｍＩＳＭ１２８７－４６１断片と比較して同レベルのアポトーシス促進活性を有し、ＩＳＭ１のアポトーシス促進活性を媒介するために、ＡＭＯＰドメインが翻訳後修飾を必要としないことを示す。これは、免疫沈降結合アッセイの結果と一致し、ＧＲＰ７８受容体への直接的な結合のためにはＩＳＭ１２８７－４６１が十分であることを示す（図３０）。したがって、ＧＲＰ７８受容体結合及びアポトーシス促進活性の両方は、アミノ酸残基２８７－４６１からのＣ末端ＡＭＯＰドメインを通じて媒介する（ヒトＩＳＭ１等価物は２９０－４６４のアミノ酸残基）。
ＩＳＭ１２６－２７７（Ｎ）ではなくＩＳＭ１２８７－４６１（Ｃ）がＥＣ接着を支持する。
表面被覆ｒＩＳＭ１がＥＣ接着及び付着を支持できることは、すでに示されている。ＩＳＭ１のＥＣ接着を支持する効果を調査するため、細胞付着における動的変化をモニターできるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞解析システムを用いて細胞接着アッセイを行った。
ゼラチンは細胞外マトリックスタンパク質であり、ＥＣ接着を支持するため、ポジティブコントロールとして使用した。ゼラチンに支持されたＥＣ接着は、コンフルエンスの経時変化の増加によって見ることができる（図２１）。対照的に、血清タンパク質ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。ＢＳＡ被覆ウェルにおけるＥＣのコンフルエンスは、時間がたっても低いままで保たれた、又は、減少し、ＢＳＡが細胞接着を支持しないことを示した（図２１）。
ＩＳＭ１とそのトランケーションとの比較において、細胞付着の支持に両者の間で有意差がなかったため、ＡＭＯＰドメイン（２８７－４６１）を含むＩＳＭ１Ｃは、ＩＳＭ１ＦＬと同等に細胞接着を支持することができると観察された（図１９Ａ）。対照的に、ＡＭＯＰドメインが欠失したＩＳＭ１Ｎは、細胞接着の支持能力の低さを示した（図１９Ａ）。この結果は、ＩＳＭ１におけるＡＭＯＰドメインが、ＥＣ接着を媒介する上で重要であることを示した。また、ＩＳＭ１ＣのＲＫＤモチーフ（ＲＫＤ３４１ＲＡＡ、ＲＫＤ３４０ＡＡＡ）が、細胞付着において著しい減少を引き起こしたことがわかった（図１９Ｂ）。
内部移行したＩＳＭ１２８７－４６１（Ｃ）がＥＣアポトーシスを誘導する。
内部移行したＩＳＭ１Ｃが、ＥＣでＩＳＭ１ＦＬと同じアポトーシス促進効果を有するかどうかをさらに調査するため、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞解析システムを使用してＥＣアポトーシスアッセイを行った。簡単に言えば、ＨＵＶＥＣを９６ウェルプレート（６，０００細胞／ウェル）に播種し、ｒＩＳＭ１Ｎ、ｒＩＳＭ１Ｃ及びｒＩＳＭ１ＦＬを含む１μＭのｒＩＳＭ１タンパク質で２４時間まで処理した。対応するアポトーシス曲線（図２０Ａ）より、ＩＳＭ１Ｃ及びＩＳＭ１ＦＬはともにＥＣアポトーシスを誘導したことがわかった。対照的に、ＩＳＭ１Ｎはアポトーシス促進効果を有さなかった。この結果は、ＩＳＭ１ＮでなくＩＳＭ１ＣがＥＣに内部移行したことを示した内部移行アッセイの結果と一致する。したがって、これらの結果に基づくと、ＡＭＯＰドメインはＩＳＭ１のアポトーシス促進機能の原因となり得る。
これらの研究に関連する配列（哺乳類及び細菌）は以下の通り：
配列番号２８：ｂａｃＩＳＭ１２６－４６１
Figure 2022524370000007
（下線：天然マウスＩＳＭ１配列；太字：Ｈｉｓタグ及びベクター配列；斜体：ＳＵＭＯタグ）
配列番号２９：ｂａｃＩＳＭ１２８７－４６１
Figure 2022524370000008
（下線：天然マウスＩＳＭ１配列；太字：Ｈｉｓタグ及びベクター配列；斜体：ＳＵＭＯタグ）
配列番号３０：ｍａｍＩＳＭ１２６－４６１
Figure 2022524370000009
（下線：天然マウスＩＳＭ１配列；太字：ベクター配列及びＨｉｓタグ；斜体：Ｍｙｃタグ）
配列番号３１：ｍａｍＩＳＭ１２８７－４６１
Figure 2022524370000010
（下線：天然マウスＩＳＭ１配列；太字：ベクター配列及びＨｉｓタグ；斜体：Ｍｙｃタグ）
配列番号３２：ｍａｍＩＳＭ１２６－４６４
Figure 2022524370000011
（下線：天然ヒトＩＳＭ１配列；太字：ベクター配列及びＨｉｓタグ；斜体：Ｍｙｃタグ）
配列番号３３：ｂａｃＩＳＭ１２６－４６４
Figure 2022524370000012
（下線：天然ヒトＩＳＭ１配列；太字：ベクター配列及びＨｉｓタグ；斜体：ＦＬＡＧタグ）
配列番号３４：ｂａｃＩＳＭ１２９０－４６４
Figure 2022524370000013
（下線：天然ヒトＩＳＭ１配列；太字：ベクター配列及びＨｉｓタグ；斜体：ＦＬＡＧタグ）
配列番号３５：ｍａｍＩＳＭ１２９０－４６４
Figure 2022524370000014
（下線：天然ヒトＩＳＭ１配列；太字：ベクター配列及びＨｉｓタグ；斜体：Ｍｙｃタグ）
これらの結果は、ＩＳＭ１２８７－４６１（２２ｋＤａ）（ヒトＩＳＭ１等価物は２９０－４６４のアミノ酸残基）が、マウスにおけるＣＳ誘発性肺炎症の抑制において、全長ｒＩＳＭ１タンパク質と同様の様式で機能し得ることを支持する。例えば、ｒＩＳＭ１及びｒＩＳＭ１２８７－４６１（ヒトＩＳＭ１等価物は２９０－４６４のアミノ酸残基）はともに、ＣＯＰＤの治療法を提供し得る。
この実施例において、哺乳類及び細菌発現系はともに、可溶性及び機能的に活性な組換えＩＳＭ１タンパク質を作製するために使用した。方法論は、構造－機能関係の調査を助けただけでなく、様々な用途のためのＩＳＭ１の作製に使用され得る。
我々は、哺乳類と細菌ｒＩＳＭ１との見かけ上のサイズ差に促され、ＩＳＭ１でのタンパク質グリコシル化プロフィールを調査した。我々は、哺乳類ｒＩＳＭ１がとても不均一な糖タンパク質であり、グリカンの大量沈着がタンパク質質量に著しく貢献することを、予期せず発見した。それにもかかわらず、タンパク質のグリコシル化が、細胞の種類によって影響されることに注意しなければならない。異なる細胞は、異なる種類及びレベルのグリコシル化酵素を発現するため、様々なグリカンプロフィールとなる。例えば、ＣＨＯ細胞対ＨＥＫ２９３細胞で作製されたタンパク質の間には、グリカンプロフィールに有意差がある。ＨＥＫ２９３で作製されたタンパク質は、一般的により複雑なグリカン構造を含む一方で、ＣＨＯ由来のタンパク質は高いレベルのシアリル化を有した。別の実施例において、異なる組織起源の１２のヒト細胞株のＯ－グリコシル化プロフィールを解析し、各細胞株中に独特のＯ－グリコプロテオーム（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）が明らかになった（Steentoft, C., Vakhrushev, S. Y., Joshi, H. J., Kong, Y., Vester-Christensen, M. B., Schjoldager, K. T., Lavrsen, K., Dabelsteen, S., Pedersen, N. B., Marcos-Silva, L., Gupta, R., Bennett, E. P., Mandel, U., Brunak, S., Wandall, H. H., Levery, S. B., and Clausen, H. (2013) Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO J 32, 1478-1488）。特定されたグリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｉｔｅ）の半分以上が、一つの細胞株においてのみ見られたが、各細胞株は多量の独特な糖タンパク質にも寄与した。したがって、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から作製された哺乳類ｒＩＳＭ１に行われたタンパク質のグリコシル化解析は、基準としての役割を果たすが、その他の内容においては異なる場合もある。
この実施例は、ＴＳＲよりＩＳＭ１－ＡＭＯＰの方が、アポトーシス促進活性だけでなく受容体結合を媒介することを予期せず示す。異なるＩＳＭ１－ＡＭＯＰ構築物が異なる活性を示したため、境界配列によって活性の少なくとも一部が制御され得ることが明らかになった。
材料及び方法。
構築物の構築。
ＩＳＭ１用の哺乳類発現構築物を作製するため、マウスＩＳＭ１のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を介してｐＳＥＣｔａｇ－２Ｂベクター（インビトロジェン）にクローン化した。ベクターは、効率的なタンパク質分泌を可能にするため、マウスＩｇκ１リーダー配列からのＮ末端シグナルペプチドを含み、タンパク質の検出及び精製をアシストするため、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ及びＭｙｃタグも含む。
ＩＳＭ１用の細菌発現構築物を作製するため、まず、ＳＵＭＯタグのｃＤＮＡを、オーバーラップＰＣＲによってマウスＩＳＭ１ ｃＤＮＡのＮ末端に連結し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位によってｐＲＳＦＤｕｅｔ－１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。タンパク質の検出及び精製を可能にするため、ベクターはＮ末端ヘキサヒスチジンタグを含む。
細胞株及び細胞培養。
メルク（ＳＣＣＥ００１）のＨＵＶＥＣを、ＨｙＣｌｏｎｅ抗真菌溶液（ＧＥヘルスケア）を追加した、最終濃度がペニシリン：１００ユニット／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００μｇ／ｍＬ及びアムホテリシンＢ：０．２５μｇ／ｍＬの、ＥｎｄｏＧＲＯＬＳ完全培養培地（メルク、ＳＣＭＥ００１）で培養した。継代数４と８の間のＨＵＶＥＣを実験に使用した。
ヒト胎児腎細胞２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、ヒト胎児腎細胞２９３ＦＴ（ＨＥＫ２９３ＦＴ）はＤｒ．Ａｄａｍ Ｙｕａｎ研究室（生物科学学科、シンガポール国立大学）から贈与され、ヒト子宮頸がん細胞株（ＨｅＬａ ＣＣＬ－２）はＡＴＣＣから入手した。上記の細胞株は全て、１０％ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア）及びＨｙＣｌｏｎｅ抗真菌溶液（ＧＥヘルスケア）を追加した、最終濃度がペニシリン：１００ユニット／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００μｇ／ｍＬ及びアムホテリシンＢ：０．２５μｇ／ｍＬの、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＥヘルスケア）で培養した。
抗体及び試薬：
免疫沈降及び免疫ブロッティングに用いた抗体は以下の通りである：ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（Ａ００１８６、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）；ａｎｔｉ－Ｍｙｃ（ａｂ９１０６、アブカム）；ａｎｔｉ－ＧＲＰ７８（ＬＳ－Ｃ１６５０６４、ＬＳＢｉｏ）；ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ（Ｐ１Ｆ７６、サンタクルーズ）；ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖ（ａｂ１７９４７５、アブカム）；ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ β５（ａｂ１８４３１２、アブカム）。
次の試薬を使用した：カスパーゼ３／７緑検出試薬（Ｃ１０４２３、インビトロジェン）；ＰＮＧａｓｅＦ（Ｐ０７０４Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ）；ＳＵＭＯプロテアーゼ（ＳＡＥ００６７、シグマ）。
一過性トランスフェクション。
ＨＥＫ２９３Ｔ／ＨＥＫ２９３ＦＴ／ＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクションを行うため、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００（インビトロジェン）を、製造業者の説明書に従って使用した。トランスフェクションの２４時間後、培養培地を新しい血清フリー培地に変更した。さらに２４時間のインキュベーションの後、条件培地及び全細胞溶解液を採取し、ウエスタンブロットで解析した。
哺乳類組換えＩＳＭ１発現及び精製。
哺乳類組換えＩＳＭ１タンパク質を発現させるため、ＥｘＰｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ）における５０ミリリットルのＥｘｐｉ２９３Ｆ浮遊細胞培養液を、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（Ｇｉｂｃｏ）トランスフェクション試薬で複合化した１μｇ／ｍＬの発現プラスミドで、製造業者のプロトコルに従って一過性トランスフェクションを行った。培地は、３７°Ｃ、８．０％ ＣＯ２、軌道径２５ｍｍの振盪速度１２０ｒｐｍでインキュベートした。１６時間後、発現エンハンサーを添加した。細胞生存率は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ（インビトロジェン）を用いてモニタリングした。細胞生存率が７０％よりも低い場合、３０００ｘｇの遠心分離によってスペント培地を細胞から分離し、条件バッファー（５ｘ条件バッファー：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾール、２．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）で調整した。条件バッファーで平衡した２ミリリットルのＳｍａｒｔ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（ＢｉｏＢａｓｉｃ）５０％スラリーを条件培地に添加し、少なくとも１時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。その後、樹脂を採取し、徐々に増加するイミダゾール濃度のＩＭＡＣバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５）で洗浄した。最後に、タンパク質を５００ｍＭ イミダゾールを含むバッファーで溶出させた。ＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア）を保存バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５）で平衡化し、ＩＭＡＣ溶出画分をバッファー交換するために使用した。その後、タンパク質を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮機（ザルトリウス）を用いて、３０ＫＤａ分画分子量で濃縮した。タンパク質の最終濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー）を用いて測定した。タンパク質は、分割し、液体窒素で急速冷凍し、－８０°Ｃで保存した。
細菌組換えＩＳＭ１発現及び精製。
細菌組換えＩＳＭ１タンパク質を発現させ精製するため、まず、製造業者の説明書に従って、ＳＵＭＯ－ＩＳＭ１細菌発現構築物をシャッフルＴ７細胞（ニューイングランドバイオラボ）に形質転換した。一つのコロニーをスターターカルチャー（１０ｍｌ）に植菌し、２２０ＲＰＭで一晩、３０°Ｃのシェイカーインキュベーターで育てた。翌日、すべてのスターターカルチャーを１Ｌのカルチャー培地に注ぎ、細菌を、２２０ＲＰＭ、３０°ＣのシェイカーインキュベーターでＯＤ ６００ｎｍが０．４～０．６付近に達するまで育てた。タンパク質発現を誘導するため、その後、最終濃度が０．２５ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加した。１６°Ｃのシェイカーインキュベーターを１８０ＲＰＭで使用して、１６～２０時間誘導を行った。最後に、５，０００ｘｇ、４°Ｃで１０分間の遠心分離を行って、細菌ペレットを採取した。
細菌溶解を開始する前に、大腸菌（１９）からペリプラズムタンパク質を取り除くため、浸透圧衝撃を行った。まず、細菌ペレットをスクロースバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０％スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、１０ｍＬ／リットル培養液）で再懸濁させ、７０００ｘｇ、４°Ｃで３０分間、遠心分離を行った。ペレットを５ｍＭのＭｇＳＯ４（１０ｍＬ／リットル培養液）でさらに再懸濁させ、氷の上で１０分インキュベートし、４５００ｘｇ、４°Ｃで２０分、遠心分離を行った。上澄みは処分し、細菌ペレットは溶解するまで氷の上に置いた。
細菌溶解を開始するため、リゾチーム（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ）を、細菌溶解バッファー（５０ｍM Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール、１０％グリセロール、ｐＨ７．５）に新たに添加した。そして、細菌ペレットを溶解バッファー（１０ｍＬ／Ｌ培養液）で再懸濁させ、少なくとも１０分、氷の上でインキュベートした。そして、溶解をアシストするため、２０％振幅、１秒オン／オフ間隔で１０分間、超音波処理を行った。溶解液は、１３，０００ｘｇ、４°Ｃで２０分間、遠心分離して透明化した。可溶性組換えタンパク質を含む上澄みを、０．４５μｍシリンジフィルターユニット（ザルトリウス）でろ過し、新しいチューブに移した。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製を行うため、まず、ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア）を５カラム体積のＩＭＡＣ溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、１０％グリセロール、ｐＨ７．５）で洗浄し、１０カラム体積のＩＭＡＣ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール、１０％グリセロール、ｐＨ７．５）で洗浄した。そして、透明化した細菌溶解液を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｍ クロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）によってカラムに充填した。少なくとも１０カラム体積のＩＭＡＣ結合バッファーを用いて、非結合タンパク質を洗い流した。最後に、結合したタンパク質を、２０カラム体積の直線勾配のＩＭＡＣ溶出バッファーで溶出させた。
最終研磨のため、第二工程としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＩＭＡＣからの比較的良い純度の先の溶出画分を貯蔵し、ＳＥＣバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．５）で予備的に平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。ＳＥＣからのピーク画分を採取し、アミコンウルトラ遠心式フィルター（ミリポア）で濃縮し、ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を測定した。最後に、精製したタンパク質を分割し、液体窒素で急速冷凍し、－８０°Ｃで保存した。
共免疫沈降。
精製組換えＩＳＭ１とＧＲＰ７８の間の共免疫沈降アッセイを行うため、まず、２μｇのＧＲＰ７８抗体（ＬＳ－Ｃ１６５０６４、ＬＳＢｉｏ）を、２時間、４°ＣのＰＢＳで２０μＬビーズを用いてインキュベートすることによって、タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（サンタクルーズバイオテクノロジー）に結合させた。そして、抗体に結合したビーズを、５０００ｘｇ、４°Ｃで３分間、スピンダウンし、非結合の抗体を取り除いた。次に、１ｍＬの共免疫沈降結合バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）のビーズに、４μｇのｒＧＲＰ７８と２μｇのｒＩＳＭ１を添加し、ローテーターの上で一晩、４°Ｃでインキュベートした。翌日、共免疫沈降洗浄バッファー（ＰＢＳ含有０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、ビーズを１回あたり１０分間隔でさらに３回洗浄した。最後に、ビーズから抗体－タンパク質複合体を、２０μＬ ２ｘＳＤＳローディングダイで溶出させ、ウエスタンブロットで解析した。
アポトーシスアッセイ。
組換えＩＳＭ１で誘導した内皮細胞アポトーシスを測定するため、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ 生細胞解析システム（エッセンバイオサイエンス）を用いてアッセイを行った。ＨＵＶＥＣを、一晩、５５００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、ＨＵＶＥＣを３時間、２％ＦＢＳ培地で飢餓させ、ＶＥＧＦ（２９３－ＶＥ－０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ）の存在下又は非存在下で組換えタンパク質処理を行った。アポトーシス現象を測定するため、カスパーゼ３／７緑アポトーシス検出試薬（Ｃ１０４２３、インビトロジェン）も１：１０００希釈で含めた。アポトーシス測定は、計２４時間、毎時行われた。最終要約統計量は、少なくとも３の個別生物学的反復（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）から収集された。
統計。
統計解析及び結果プロッティングは、ＧｒａｐｈＰａｔ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。二つの実験グループの比較は、対応がない両側のスチューデントのｔ検定で行った。結果は、平均値の標準誤差としてプロットした。０．０５より低いＰ値が、有意であると認められた。
実施例４：組換えＩＳＭ１は、マウスにおけるチリダニ（ＨＤＭ）誘発性喘息の炎症を抑制する。
喘息は大気道の疾患であり、ＡＭや好中球ではなく好酸球によって主に媒介される喘息性免疫反応である。ＨＤＭ誘発性喘息モデルは、アレルギー性喘息の研究に広く用いられる喘息モデルである。
図２６に示す通り、Hammad et al. (2009)及びPeh et al. (2015)に記載のプロトコルに従って、マウス喘息モデル作製した。簡単に言えば、メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢６～８週）をイソフルランで麻酔し、０日目、７日目及び１４日目に気管内ルートを介して４０μＬの１００μｇ ＨＤＭ抽出物（ヤケヒョウダニ）で感作した。ＨＤＭ負荷後２時間、１５日目、及び１６日目に、細菌作製組換えＩＳＭ１（２ｍｇ／ｋｇ、４０μｇ／マウス）又は同量の溶媒（生理食塩水）を恒常的に一日単回投与した。すべてのマウスを１７日目に安楽死させ、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を免疫細胞浸潤解析のため採取した。５匹の健康なマウスを含む薬剤未投与のグループは、対照として使用した。
図２７に示す通り、ｒＩＳＭ１処理マウスにおける総白血球、好酸球及びリンパ球の著しい減少が示すように、気管内デリバリーされたｒＩＳＭ１は、ＨＤＭ誘発性喘息性気道炎症を強力に抑制した。先の報告と一致して、気管内ＨＤＭは、好酸球媒介性気道炎症を主に引き起こし、少しの好中球が関与した。好酸球は、ｒＩＳＭ１処理の下、７０％より大きく抑制された。肺胞マクロファージ（ＡＭ）もＨＤＭ負荷で増加した。ｒＩＳＭ１処理は、この処理計画の下ＡＭの減少を示したが、統計的に有意でない。結果は、ＩＳＭ１の気道デリバリーが、マウスの喘息におけるＨＤＭ誘発性気道炎症を抑制できることを示す。これらの結果は、喘息の治療及び抗喘息薬を調製するためのｒＩＳＭ１を支持する。
血清免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）レベルの上昇は、Ｔｈ２免疫反応の特徴である。最後のｒＩＳＭ１処理から２４時間後に、マウス血清を採取した。ｒＩＳＭ１処理は、ＨＤＭ処理グループと比べて、血液全ＩｇＥレベルを著しく低下させ、ＩＳＭ１がＴｈ２免疫反応を抑制したことを示した（図２８）。
一つ以上の実施形態を例として記載した。請求項に規定する発明の範囲から逸脱することなく様々な変更及び修正を行うことができると、当業者は理解するだろう。
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［７９］ 米国特許出願公開第２００４０２４４７９４号

［８０］ 米国特許出願公開第２０１０００６５０４８号

［８１］ 米国特許出願公開第２００３０２３５５５５号

［８２］ 米国特許出願公開第２００５０２０１９５１号

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本明細書および本明細書の他の箇所に引用されている全ての参考文献は、それら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。

Claims (29)

  1. イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸、及び
    薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、
    を含む組成物であって、
    対象の肺に投与するために処方されることを特徴とする組成物。
  2. 請求項１に記載の組成物において、前記組成物は、気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与のために処方されることを特徴とする組成物。
  3. 請求項１又は２に記載の組成物において、前記組成物は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するために処方されることを特徴とする組成物。
  4. 請求項１～３のいずれかに記載の組成物において、前記組成物は、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されることを特徴とする組成物。
  5. 請求項１～４のいずれかに記載の組成物において、前記組成物は、それを必要とする対象におけるｃｓＧＲＰ７８を標的化するため；炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するため；肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；ＡＭレベルを低下させるため；肺炎症を治療、改善又は予防するため；肺の恒常性を維持するため；肺の炎症を消退させるため；肺の修復を促進してリモデリングを軽減させるため；肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；喘息を治療、改善又は予防するため；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるため；肺線維症を治療、改善又は予防するため；又はこれらのいずれかの組み合わせのために使用されることを特徴とする組成物。
  6. それを必要とする対象において、ＧＲＰ７８活性を調節するため；ＧＲＰ７８を標的化し結合するため；炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するため；肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；ＡＭレベルを低下させるため；肺炎症を治療、改善又は予防するため；肺の恒常性を維持するため；肺の炎症を消退させるため；肺の修復を促進してリモデリングを軽減させるため；肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；喘息を治療、改善又は予防するため；急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるため；肺線維症を治療、改善又は予防するため；又はこれらのいずれかの組み合わせのための方法であって、
    前記方法は、
    イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を、それを必要とする対象に投与することを含むことを特徴とする方法。
  7. 請求項６に記載の方法において、前記ポリペプチド、ペプチド又は核酸は、それを必要とする対象の肺に投与するためであることを特徴とする方法。
  8. 請求項６又は７に記載の方法において、前記ポリペプチド、ペプチド又は核酸は、対象に気管内投与、鼻腔内投与又は吸入投与するためであることを特徴とする方法。
  9. 請求項６～８のいずれかに記載の方法において、前記ポリペプチド、ペプチド又は核酸は、エアゾール、吸入器又はネブライザーで投与するためであることを特徴とする方法。
  10. 請求項６～９のいずれかに記載の方法において、前記ポリペプチド、ペプチド又は核酸は、エアゾール化によって肺に投与するための乾燥粉末として、又は、噴霧化によって肺に投与するための液体として処方されることを特徴とする方法。
  11. 請求項６～１０のいずれかに記載の方法において、前記方法はさらに、
    対象におけるＩＳＭ１レベルを判定する、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルを判定する、又はその両方を行う工程、及び
    健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＩＳＭ１レベルの低下が判定される場合、健康対照レベル又は重症度の低い疾患対照レベルに対して、対象におけるＧＲＰ７８タンパク質レベルの上昇が判定される場合、又はその両方の場合に、投与工程を行う又は繰り返す工程を含むことを特徴とする方法。
  12. イスミン１（ＩＳＭ１）タンパク質又はそのＧＲＰ７８活性化断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド、又は、前記ポリペプチド又はペプチドをコードする発現可能な核酸を含むことを特徴とする、経肺ドラッグデリバリー装置。
  13. 請求項１２に記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、請求項１～５のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする経肺ドラッグデリバリー装置。
  14. 請求項１２又は１３に記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、気管内ドラッグデリバリー装置、鼻腔内ドラッグデリバリー装置又は吸入ドラッグデリバリー装置であることを特徴とする経肺ドラッグデリバリー装置。
  15. 請求項１２～１４のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、エアゾール、吸入器又はネブライザーであることを特徴とする経肺ドラッグデリバリー装置。
  16. 請求項１２～１５のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、
    前記経肺ドラッグデリバリー装置はエアゾールであって、前記ポリペプチド、ペプチド又は核酸は乾燥粉末として処方される、又は、
    前記経肺ドラッグデリバリー装置はネブライザーであって、前記ポリペプチド、ペプチド又は核酸は液体として処方されることを特徴とする経肺ドラッグデリバリー装置。
  17. 請求項１２～１６のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、それを必要とする対象におけるＧＲＰ７８活性を調節するため；炎症誘発性細胞においてアポトーシスを誘導するため；肺胞マクロファージ（ＡＭ）においてアポトーシスを誘導するため；ＡＭレベルを低下させるため；肺炎症を治療、改善又は予防するため；肺の恒常性を維持するため；肺の炎症を消退させるため；肺の修復を促進してリモデリングを軽減させるため；肺炎症に関連する肺疾患又は障害を治療、改善又は予防するため；喘息を治療、改善又は予防するため；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫を治療、改善又は予防するため；急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療、改善又は予防するため；肺胞壁表面のＩＩ型（ＡＥ２）細胞の過剰増殖を予防又は低減させるため；肺線維症を治療、改善又は予防するため；又はこれらのいずれかの組み合わせのために使用されることを特徴とする経肺ドラッグデリバリー装置。
  18. 請求項１２～１７のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、、前記経肺ドラッグデリバリー装置は、ネブライザー、定量噴霧吸入器（ＭＤＩ）又はドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）であることを特徴とする経肺ドラッグデリバリー装置。
  19. 請求項１～５のいずれかに記載の組成物、請求項６～１１のいずれかに記載の方法、又は、請求項１２～１８のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチドは、ＩＳＭ１タンパク質である、又は、を含むことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  20. 請求項１９に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチドは、ヒトＩＳＭ１タンパク質又はマウスＩＳＭ１タンパク質である、又は、を含むことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  21. 請求項１～５のいずれかに記載の組成物、請求項６～１１のいずれかに記載の方法、又は、請求項１２～１８のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：
    FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２６）；又は
    FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２７）；
    又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、又は、からなることを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  22. 請求項２１に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：
    FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４）；又は
    FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２５）；
    又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、又は、からなることを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  23. 請求項２１又は２２に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性成熟ＩＳＭ１の配列を含むことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  24. 請求項２１又は２２に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性前駆体又は成熟ＩＳＭ１でないことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  25. 請求項２１又は２２に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性前駆体又は成熟ＩＳＭ１より長い、又は、短いことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  26. 請求項２１又は２２に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、内在性前駆体又は成熟ＩＳＭ１において存在しない少なくとも一つの置換又は変異を含むことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  27. 請求項２６に記載の組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６又は配列番号２７において、ＲＫＤからＲＡＡ変異、又は、ＲＫＤからＡＡＡ変異を含むことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  28. 請求項１～５のいずれかに記載の組成物、請求項６～１１のいずれかに記載の方法、又は、請求項１２～１８のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：
    FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４）；又は
    FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２５）；
    又は、それとそれと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、又は、からなることを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。
  29. 請求項１～５のいずれかに記載の組成物、請求項６～１１のいずれかに記載の方法、又は、請求項１２～１８のいずれかに記載の経肺ドラッグデリバリー装置において、前記ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列：
    FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２６）；
    FEVDMDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVINDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２４）；
    FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLE（配列番号２７）；又は
    FEVDTDSCERWMSCKSEFLKKYMHKVMNDLPSCPCSYPTEVAYSTADIFDRIKRKDFRWKDASGPKEKLEIYKPTARYCIRSMLSLESTTLAAQHCCYGDNMQLITRGKGAGTPNLISTEFSAELHYKVDVLPWIICKGDWSRYNEARPPNNGQKCTESPSDEDYIKQFQEAREY（配列番号２５）；
    又は、それと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、又は、からなり、
    前記ポリペプチド又はペプチドは、配列番号２４～２７のいずれかにアミノ酸配列：EVSLLAGSEEFNATKL Ｎ末端を含まない、又は、配列：EVSLLAGSEEFNATKLを全く含まないことを特徴とする組成物、方法又は経肺ドラッグデリバリー装置。

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