JP2022509445A

JP2022509445A - 線維症を治療又は予防するための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2022509445A
Application number: JP2021547960A
Authority: JP
Inventors: ハン，チュンソン; ウ，ドン－フン; ジン，シオン; リ，ジェフン; アン，グン，ホ; ユ，タク，ジン; チュン，ジンウ
Original assignee: ネクセルカンパニー，リミテッド
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2022-01-20
Also published as: EP3870210A4; EP3870210A2; WO2020084344A3; CN113301914A; WO2020084344A2; US20210388041A1

Abstract

本出願は、線維症及び他の疾患の治療及び予防のための、MFG-E8由来のポリペプチドを含む組成物及び方法に関する。
【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年10月25日に出願された韓国出願第10-2018-0128033/KR号、2018年10月26日に出願された韓国出願第10-2018-0128625/KR号、及び2018年10月25日に出願された韓国出願第10-2018-0128204/KR号の利益を主張し、上記出願の各々の全内容は、この参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

創傷治癒の一部としての組織修復のプロセスには、2つの段階がある。第1の段階は再生期であり、損傷細胞を同じタイプの細胞に置き換える。第2の段階は線維組織の形成であり、線維形成又は線維化とも呼ばれ、結合組織が正常な実質組織と置き換わる。線維化段階がチェックされずに続くと、組織修復プロセスが病原的となり、広範な組織リモデリング及び永久的な瘢痕組織の形成をもたらす。

肝線維症は、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質の過剰な蓄積によって特徴付けられる。肝線維症の進行では、肝損傷による障害肝細胞及び死肝細胞が、それらの病変部位にクッパー細胞を動員する。これらのクッパー細胞は、肝臓の炎症を制御するために、トランスフォーミング増殖因子β1(TGF-β1)などの大量のサイトカインを分泌する。TGF-β1の上昇は、増殖し、細胞外マトリックス(ECM)を産生する筋線維芽細胞様細胞になる静止肝星細胞(HSC)の活性化を引き起こす。活性化されたHSCはさらに肝臓に過剰なコラーゲンに富んだECMを蓄積し、正常な肝臓構造に歪みをもたらす。

肝線維症は、慢性炎症性肝疾患又は反復性肝障害に起因する。反復性肝損傷及び線維症の原因には、ウイルス感染(B型及びC型肝炎)、アルコール乱用、及び非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が含まれる。肝線維症は、他の主要な癌(肺癌、大腸癌、胃癌、又は乳癌)よりも死亡率が高い肝硬変及び癌に進展する可能性がある。したがって、肝線維症は依然として治療戦略がほとんどない主要な死因であり、線維症を減少させ、予防するための治療が非常に必要とされる。

本発明は、少なくとも部分的には、MFG-E8の断片、以下NP-011が、限定されないが、線維症、肝硬変、脂肪症、及び非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)などの疾患を治療及び/又は予防するのに驚くほどに効果的であるという発見に基づく。

ある種の実施形態では、本明細書では、限定されないが、線維症、肝硬変、脂肪症、及びNASHなどの疾患を治療及び/又は予防するためのポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、上皮細胞増殖因子(EGF)様ドメイン、C1ドメイン、及び場合によりシグナルペプチドを含むが、機能的C2ドメインを欠失しているMFG-E8ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、上皮細胞増殖因子(EGF)様ドメイン、C1ドメイン、及び場合によりシグナルペプチドを含むが、メディンポリペプチド又はその断片を欠失しているMFG-E8ポリペプチドを含む。

ある種の実施形態では、上記MFG-E8ポリペプチドは、MFG-E8ポリペプチドのアミノ酸226～335を含むC末端ドメイン内に少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、又は105個のアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、MFG-E8ポリペプチドは、MFG-E8ポリペプチドの少なくとも180、190、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、又は280個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、MFG-E8ポリペプチドは、配列番号10又は配列番号12のアミノ酸1～225の少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99%、又は100%を含む。一部の実施形態では、MFG-E8ポリペプチドは、配列番号10又は配列番号12のアミノ酸24～225の少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99%、又は100%を含む。

好ましい実施形態では、MFG-E8ポリペプチドはグリコシル化されない。

ある種の実施形態では、上記ポリペプチドは、異種配列、例えば、FLAGタグ、HISタグ、及び/又は免疫グロブリンのFc部分をさらに含む。このような異種配列は、インビボでポリペプチドの半減期を延長させることができる。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、限定されないが、TGF-βの発現レベルの減少;TGF-βシグナル伝達の減少;SMAD、例えばSMAD2、ERK、及び/又はTGF-βの下流の任意の他のリン酸化タンパク質のリン酸化の減少;NOTCHシグナル伝達の増加;限定されないが、Col1a1、Col1a2、又はActa2などの線維症関連遺伝子発現の減少;TGF-βと1つ以上のインテグリン、例えばインテグリンβ3及び/又はインテグリンβ5との間の相互作用の減少;肝星状細胞(HSC)の増殖の減少;マトリックスメタロペプチダーゼ2(MMP2)、マトリックスメタロペプチダーゼ12(MMP12)、TMP2、ERK、及び/又はSMAD2の発現レベルの減少;コラゲナーゼ活性の増加;並びに/又はマクロファージによるコラーゲン取り込みの増加を含む1つ以上の生物活性を可能にする。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチド並びに1つ以上の薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤を含む医薬組成物中にある。

また、本明細書には、ポリペプチドを含むキットが提供される。

ある種の実施形態では、本明細書では、上記ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。一部の実施形態では、核酸は、配列番号9又は配列番号11のヌクレオチド61～735に対して、少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号9又は配列番号11のヌクレオチド130～735に対して、少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、83%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を含む。また、本明細書では、核酸分子を含むベクターが提供され、場合により、ベクターは発現ベクター又はウイルスベクターである。一部の実施形態では、核酸分子は、プロモーター及び/又は他の調節配列に機能的に連結される。一部の実施形態では、核酸分子及び/又はベクターは、対象に投与するのに適した医薬組成物中にある。このような医薬組成物は、エンドサイトーシス及び/若しくはより長い半減期をインビボで助け、並びに/又は対象における組成物に対する免疫反応を低減する1つ以上の薬剤(例えば、リポソーム、ポリマー)を含み得る。

ある種の実施形態では、本明細書では、上記ベクターを含むウイルス粒子が提供される。一部の実施形態では、ウイルス粒子はAAVである。ある種の実施形態では、ウイルスベクターを含むAAVは、疾患、例えば線維症、肝硬変、脂肪症、NASH、心筋梗塞、肺線維症、特発性肺線維症及び/又はアルツハイマー病を治療及び/又は予防するために、対象、例えばヒトに投与される。

ある種の実施形態では、本明細書では、上記ベクターを含む宿主細胞が提供される。一部のこのような実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)である。

ある種の態様では、本明細書では、宿主細胞を培地中で培養することによってポリペプチドを産生する方法が提供され、例えば、宿主細胞は培地中にポリペプチドを分泌する。一部の実施形態では、本方法は、さらに、培地からポリペプチドを単離し、所望により、ポリペプチドをさらに精製して、実質的に純粋なポリペプチドを生成することを含む。

一部の態様では、本明細書では、対象の細胞をポリペプチドと接触させることによって、対象における線維症を減少させる又は阻害する方法が提供される。また、本明細書では、HSCをポリペプチドと接触させることによって、HSCの増殖を減少させる又は阻害する方法もまた提供される。さらに、本明細書では、対象の細胞をポリペプチドと接触させることによって、対象の脂肪症を減少させる又は阻害する方法が提供される。一部の実施形態では、これらの方法における対象は、哺乳動物、例えばラット、マウス、又はヒト、好ましくはヒトである。

ある種の態様では、本明細書では、マクロファージをポリペプチドと接触させることによって、マクロファージの活性(例えば、コラーゲン又は線維組織の取り込み)を増加させる方法が提供される。マクロファージの活性のこのような増加は、種々の組織(例えば、肝臓、肺など)における線維化の逆転に寄与する。

ある種の態様では、本明細書では、ポリペプチドを対象に投与することによって、それを必要とする対象における障害を治療又は予防する方法が提供される。一部の実施形態では、障害は、線維症(慢性又は急性)、肝硬変、脂肪症、NASH、及び/又は肺線維症である。

一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、特発性肺線維症(IPF)を治療又は予防する。線維組織の減少又は除去に加えて、ポリペプチドはまた、IPFバイオマーカーの発現レベルを改変させ得る。場合によっては、ポリペプチドは、αSMA、コラーゲン(Col1a1)、TMP2、MMP2、MMP12、リン酸化ERK、ERK、リン酸化SMAD2、及びSMAD2から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの発現レベルを減少させ得る。

他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、心筋梗塞を治療又は予防する。ポリペプチドは、心筋梗塞後の心臓の機能を、例えば、対応する未処置対象で見られる改善と比較して、改善する又は増加させることができる。例えば、ポリペプチドは、左室駆出率及び/又は内径短縮率を増加させ得る。さらに、ポリペプチドは、心筋梗塞に関連する線維症を阻害する又は減少させることができる。

本発明はまた、アルツハイマー病(AD)を治療又は予防する方法を意図する。治療対象は、ADに関連する遺伝子突然変異を有し得る。例えば、対象は、(i)K670N/M671L、I716V、及びV717Iから選択されるアミロイド前駆体タンパク質(APP)における少なくとも1つの突然変異、並びに/又は(ii)M146L及びL286Vから選択されるPSEN1における少なくとも1つの突然変異を有し得る。本開示のポリペプチドは、アルツハイマー病に関連する記憶喪失及び/又は行動を改善し得る。さらに、ポリペプチドは、脳における生理学的及び組織病理学的変化を改変させることができる。例えば、ポリペプチドは、アミロイド斑の量、アミロイドベータの量、ミクログリアの数、神経炎症(又は脳の炎症)のレベル、及び/又は対象の脳、好ましくは対象の脳の海馬及び/又は脳皮質におけるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の量を減少させることができる。

対象はまた、障害を治療する追加の薬剤で治療することもできる。

一部の実施形態では、本方法は、対象においてアミロイド形成を誘導しない。

ポリペプチドは、種々の経路、例えば、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、又は筋肉内経路のいずれかを介して対象に投与することができる。

一部の実施形態では、これらの方法における対象は、哺乳動物、例えば、ラット、マウス、又はヒト、好ましくはヒトである。

図1A-図1Fは、NP-011が肝線維症を阻害し、肝疾患を治療するためのNP-011の利点を示す図である。(図1A)肝線維症モデルにおけるヒト組換えタンパク質の有効性を試験するための全体的な概略スケジュール。 (図1B)正常マウスの肝臓に対する組織学的分析(H&E及びシリウスレッド染色)の代表的画像、TAA誘発性肝線維症モデル(シャム)、及びタンパク質(MFG-E8、NP-011、NP-012、NP-013)を投与した肝線維症モデル。スケールバー、200μm。 (図1C)マウスの肝臓における定量的な線維化領域の比較。棒グラフは、各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^*P<0.05、^**P<0.01。(図1D)正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル(シャム)、及びタンパク質(MFG-E8、NP-011、NP-012、及びNP-013)を投与された肝線維症モデルの肝臓における線維性マーカー(Col1a1、Col1a2、及びActa2)のmRNA発現の比較。棒グラフは、各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^*P<0.05、^**P<0.01。 (図1E)NP-011(500ng/mL)又はNP-013(500ng/mL)の0.5時間、1時間、2時間処理後のヒトHEK-293FT細胞からのTGF-βシグナル伝達経路転写活性を確認するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ。棒グラフは、各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^*P<0.05、^**P<0.01。(図1F)Gene Set Enrichment Assay(GSEA)データは、シャム群と比較して、NP-011投与群におけるNotchシグナル伝達遺伝子セットの有意な濃縮を示したが、MFG-E8投与群では認められなかった。図2A-図2Fは、NP-011が低投薬量で線維化を阻害することを示す図である。低投薬量でのNP-011による線維症の消失。(図2A)肝線維症モデルにおけるNP-011の有効性を試験するための全体的な概略スケジュール。(図2B)種々の用量範囲(20μg/kg～160μg/kg)での正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル、及びNP-011を投与された肝線維症モデルの肝臓の線維化領域(シリウスレッド染色領域)を比較する代表的な画像。スケールバー、200μm。(図2C)図2Bにおける試験マウスの肝臓における線維化領域の定量分析。バーは各群4匹のマウスの平均値±SDを示す。^**P<0.01。 (図2D)定量PCR及び免疫染色による、正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル、及びNP-011投与された肝線維症モデルの肝臓におけるα-SMA(Acta2)発現の比較。スケールバー、100μm。棒グラフは、各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。(図2E)ヒートマップデータは、正常マウス、TAA誘発性マウス、及びNP-011投与された肝線維症マウスの肝臓で観察された線維症関連遺伝子を示す。(図2F)進行肝線維症モデルにおけるTGF-β1 mRNA発現の比較。棒グラフは、各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。図3A-図3Eは、NP-011が肝線維症を阻害し、予防することを示す図である。種々のモデル誘導におけるNP-011の最小用量の治療効果。(図3A)進行性肝線維症モデルにおけるNP-011の有効性を試験するための全体的な概略スケジュール。(図3B)正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル、及び異なる投与頻度(1、2、4、及び6回)の40μg/kg NP-011投与肝線維症モデルの肝臓の線維化領域を分析するための代表的な画像。スケールバー、50μm。正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル、及び40μg/kg NP-011投与肝線維症モデルの肝臓の線維化領域の定量分析を左パネルに示す。バーは各群4匹のマウスの平均値±SDを示す。^**P<0.01。(図3C)進行性肝線維症モデルにおけるNP-011の有効性を試験するための全体的な概略スケジュール。 (図3D)正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル、及びNP-011の同時投与を伴うTAA注射肝線維症モデルの肝臓の線維化領域を分析するための代表的な画像。スケールバー、100μm。正常マウス、TAA誘発性肝線維症モデル、及びNP-011の同時投与を伴うTAA注射肝線維症モデルの肝線維化領域の定量分析。バーは各群5匹のマウスの平均値±SDを示す。^**P<0.01。(図3E)左パネル:グラフィック記述は、APAPで処理されたヒト胚性幹細胞(hES)由来肝細胞及びヒト初代HSCを用いたヒト肝線維症モデルを表す。中央パネル:肝細胞及び活性化筋線維芽細胞をALB(アルブミン、赤)及びα-SMA(線維症のバイオマーカー、Acta2、緑)で分析する代表的な画像。スケールバー、50μm。右図:ヒト肝線維症モデルにおけるα-SMA陽性細胞の割合の定量分析。棒グラフは各群の5回の複製からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。図4A-図4Dは、NP-011が肝硬変を阻害し、予防することを示す図である。ラットにおけるDMN誘発性肝硬変モデルの有効性試験。(図4A)DMN誘発性肝硬変モデルにおけるNP-011の有効性試験の概略図。(図4B)DMN誘発性肝硬変モデルの生存曲線を各群10例について示す。(図4C)アルファ平滑筋アクチンを標識したラット肝組織のH&E染色及び免疫組織化学分析の代表的画像。 (図4D)正常、DMN誘発性肝硬変モデル、及びNP-011投与肝硬変モデルの肝臓における線維化領域と断片壊死及び小葉壊死の定量化スコア、及びα平滑筋アクチンの陽性領域の定量化。図5A-図5Dは、NP-011がNASHを阻害し、予防することを示す図である。MCD食餌NASHモデルにおける有効性試験。(図5A)MCD飼料NASHモデルにおけるNP-011の有効性試験の全体的な概略図。(図5B)オイルレッドO染色の代表的な画像、及び(図5C)正常マウスの肝臓における相対的オイルレッドO陽性領域の定量化、MCD食餌NASHモデル、及びNP-011投与肝NASHモデルは、分泌型NP-011の有意な治療効果を示す。 (図5D)各群の肝臓における大滴性脂肪変性及び小滴性脂肪変性並びに肥大の程度の定量化。スケールバー、100μm。バーは各群5匹のマウスの平均値±SDを示す。^**P<0.01、ANOVA、続いてTukeyの多重比較検定。図6は、NP-011と活性化HSC及びマクロファージとの相互作用を示す図である。NP-011投与されたTAA誘発性肝線維症モデルの肝組織におけるヒトMFG-E8(NP-011)、マウスα-SMA、マウスF4/80(マクロファージのマーカー)の免疫染色の代表的画像。スケールバー=20μm。図7A-図7Dは、NP-011がHSCの増殖を阻害することを示す図である。NP-011のHSCに対する作用。(図7A及び図7B)TGFBRIとインテグリンαvβ3/αvβ5の間の物理的相互作用を研究するためのPLAアッセイ。赤色シグナル(白い矢頭)は、TGFBRIとインテグリンβ3(図7A)及びβ5(図7B)との相互作用を示す。各細胞における赤色シグナルの数の定量分析。棒グラフは各群の5回の複製からの平均値±SDを表す。^*P<0.05、^**P<0.01。 (図7C)TGF-β1(10ng/mL)及び/又はNP-011(500ng/mL)の存在下でのヒトHSCにおけるTGF-βシグナル伝達の調節、及びTGFBRIとインテグリンβ3/β5との物理的相互作用のウエスタンブロット(WB)及び免疫沈降(IP)分析。(図7D)TGF-β1、NP-011、及び/又はシレンギチドトリフルオロ酢酸(CT、インテグリンνβ3及びνβ5の阻害剤)の存在下におけるヒトHSCの細胞増殖のためのEdU取込みアッセイ。棒グラフは各群の5回の複製からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。図8A-図8Cは、NP-011がMMP2発現を減少させ、コラゲナーゼ活性を増加させることを示す図である。HSCにおける線維化促進MMP2及びコラゲナーゼ活性の調節。(図7A)TGF-β1、NP-011の存在下におけるヒトHSCにおけるMMP2 mRNA発現の比較。棒グラフは各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。(図7A及び7B)対照HSC、及びNP-011処置あり/なしでのTGF-β1処理されたHSCの培養からの細胞溶解物(図7B)及び馴化培地(図7C)のコラゲナーゼ活性アッセイ。棒グラフは各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。図9A-図9Eは、NP-011がマクロファージ媒介コラーゲン取り込みを増加させることを示す図である。(図9A)PMAの処理による単球からのマクロファージ分化の全体的な概略スケジュール。(図9B)分化マクロファージ(上段パネル)、及び分化マクロファージによるFITC標識ビーズ取り込み(下段パネル)の代表的な画像。スケールバー=10μm(図9C)。フローサイトメトリーの結果は、FITCビーズが分化マクロファージによって取り込まれることを示した。 (図9D)NP-011を伴う/伴わない分化マクロファージによる線維性コラーゲン取り込みアッセイのグラフィック記述。(図9E)対照及びNP-011処置に対する相対的CUI(コラーゲン取り込み指数)の定量分析。棒グラフは各群における3回の反復からの平均値±SDを表す。^**P<0.01。図10は、NP-011が活性化HSC及びマクロファージと相互作用することを示す図である。TAA誘発性肝線維症モデル及びNP-011投与されたTAA誘発性肝線維症モデルの肝組織におけるマウスコラーゲン及びマウスF4/80(マクロファージのマーカー)の免疫染色の代表的画像。矢頭はマクロファージ(F4/80陽性細胞)によるコラーゲンの飲み込みを示す。図11A-図11Cは、NP-011の生体分布及び安全性プロファイルを示す図である。(図11A)健康な雄マウスにNP-011(160μg/kg)を静脈内注射した30分後及び60分後の臓器分布。 (図11B及び図11C)雄ラット(図11B)及び雌ラット(図11C)における炎症関連細胞数及び血液生化学の定量分析を正常及び2つのNP-011投与群間で比較した。図12は特発性肺線維症(IPF)のモデルの図である。図13は、ブレオマイシン投与後3日目(D3)、5日目(D5)、7日目(D7)、及び14日目(D14)にコラーゲン及びαSMAの分布を示すために染色した肺組織の画像を示す図である。図14は、ブレオマイシン投与後3日目(D3)、5日目(D5)、7日目(D7)、及び14日目(D14)におけるIPFバイオマーカー(Col1a1、MMP2、MMP12、及びTIMP1)の発現レベルの変化を示す図である。図15は、ブレオマイシン処理後3日目(D3)、5日目(D5)、7日目(D7)、及び14日目(D14)におけるIPFに関連するシグナル伝達経路のサブファクターの発現レベルの変化を示す図である。サブファクターには、αSMA、pERK、tERK、pSMAD2(リン酸化SMAD2)、及びtSMAD2(総SMAD2)がある。アクチンはローディング対照として示される。図16A-図16Bは、NP-011のインビボ有効性を試験するためのIPFのモデルの図を示す。異なる時間点を有する2つの症例を提示する:症例1(図16A)及び症例2(図16B)。図17はNP-011がIPFに対して有効であることを示す図である。NP-011注射後、肺組織を染色し、コラーゲン及びαSMAの分布を示した。3日目にマウスにNP-011を注射した(図16Aの症例1)。図18は、NP-011がIPFに対して有効であることを示す図である。NP-011注射後、肺組織を染色し、コラーゲン及びαSMAの分布を示した。5日目にマウスにNP-011を注射した(図16Bの症例2)。図19は、NP-011がIPFに対して有効であることを示す図である。NP-011は、IPFに関連するシグナル伝達経路のサブファクターの発現レベルにおけるブレオマイシン誘発性変化を逆転させる。3日目にマウスにNP-011を注射した(図16Aの症例1)。サブファクターには、pERK、tERK、pSMAD2、及びtSMAD2が含まれる。アクチンはローディング対照として示される。右パネルのヒストグラムは、アクチンレベルに標準化されたpSMAD2の発現レベルの定量化を示す。図20は、NP-011がIPFに対して有効であることを示す図である。NP-011は、IPFに関連するシグナル伝達経路のサブファクターの発現レベルにおけるブレオマイシン誘発性変化を完全に逆転させる。5日目にマウスにNP-011を注射した(図16Bの症例1)。サブファクターには、αSMA、pERK、及びtERKが含まれる。アクチンはローディング対照として示される。右パネルのヒストグラムは、アクチンレベルに標準化されたpERKの発現レベルの定量化を示す。図21は、NP-011がIPFに対して有効であることを示す図である。NP-011は、IPFバイオマーカー(例えば、本明細書に示されるようなコラーゲン(Cola1)、MMP2、MMP12、及びTIMP1)の発現レベルを改変させる。具体的には、NP-011は、IPFバイオマーカーの発現レベルにおけるブレオマイシン誘発性増加を逆転させる。図22は、心筋梗塞に対するLAD結紮モデルの図を示す。ラットの左前下行枝(LAD)を1本の縫合糸で結紮し、ほぼ直ちに見ることができる虚血を形成する。LADを閉じることによって、その領域ではそれ以上の血流は許されないが、周囲の心筋組織はほとんど影響を受けない。この外科的処置は、梗塞関連心筋虚血で生じる病態生物学的及び病態生理学的側面を模倣する(例えば、Kolkら(2009) J Vis Exp、21:pii 1438)。LAD結紮モデルに加えて、図22はまた、図23-図26に示される研究の詳細を提示する。図23A-図23Cは、NP-011が心筋梗塞の症状を改善し、心機能を増加させることを示す図である。左室駆出率(EF)及び内径短縮率(FS)の測定値は、LAD結紮後の2週目(図23A)、4週目(図23B)、又は8週目(図23C)のマウスについて示される。測定値は、なし(AMI、急性心筋梗塞)、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、MFG-E8、又はNP-011で処置されたマウスについて示される。左室駆出率(EF)及び内径短縮率(FS)の測定値は、LAD結紮後の2週目(図23A)、4週目(図23B)、又は8週目(図23C)のマウスについて示される。測定値は、なし(AMI、急性心筋梗塞)、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、MFG-E8、又はNP-011で処置されたマウスについて示される。左室駆出率(EF)及び内径短縮率(FS)の測定値は、LAD結紮後の2週目(図23A)、4週目(図23B)、又は8週目(図23C)のマウスについて示される。測定値は、なし(AMI、急性心筋梗塞)、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、MFG-E8、又はNP-011で処置されたマウスについて示される。図24A-図24Bは、NP-011が心筋梗塞の症状を改善し、心機能を増加させることを示す図である。LAD結紮後1日目から56日目までの心臓の経時的分析を示す。特に、心臓の機能改善は、左室駆出率(EF、図24A)及び内径短縮率(FS、図24B)を測定することによって評価される。MFG-E8とは異なり、NP-011は心機能において経時的に有意な改善を示す。図25は、時間経過後の体重変化を示す図である。体重の有意な変化は、1日目から56日目まで観察されない。図26A-図26Bは、NP-011が心筋梗塞の症状を改善することを示す図である。NP-011は、心筋梗塞に関連する線維症を逆転させる。図26Aは、なし(AMI)、PBS、MFG-E8、又はNP-011で処理されたラットのH&E染色された心臓の断面の画像を示す。図26Bは、図26Aからの心臓の全断面積と比較した線維化面積の測定を示す。図27A図-27Eは、NP-011がアルツハイマー病に関連する行動及び記憶喪失を逆転させることを示す。図27Aは、アルツハイマー病(AD)モデル5XFADマウスの図及びインビボ試験の詳細を示す。5XFADマウスは、APPにおけるスウェーデン(K670N/M671L)、フロリダ(I716V)、及びロンドン(V717I)突然変異、並びにPSEN1におけるM146L及びL286V突然変異の合計5つのAD関連突然変異を有するヒトAPP及びPSEN1導入遺伝子を発現する。NP-011を5XFADに注射後、行動及び記憶試験を行った。図27Bは、NP-011注射直後(図27Aに示されるように、研究開始から3.5カ月後)のADモデルの行動分析を示す。図27Cは、NP-011の注射3カ月後(図27Aに示されるように、研究開始から6.5カ月後)のADモデルの行動分析を示す。図27Dは、NP-011の注射直後(図27Aに示されるように、研究開始から3.5カ月後)のADモデルの受動的回避試験の結果を示す。図27Eは、NP-011の注射3カ月後(図27Aに示されるように、研究開始から6.5カ月後)のADモデルの受動的回避試験の結果を示す。図28A-図28Bは、NP-011がアルツハイマー病の脳における神経病理学的変化を逆転させることを示す。具体的には、NP-011は、AD中のアミロイド斑の量を減少させる。図28Aは、アミロイド斑を検出するチオフラビンSで染色されたAD脳の海馬及び皮質を示し、図28Bは、チオフラビンSによって染色されたアミロイド斑の定量化を示す。図29A-図29Bは、NP-011がアルツハイマー病におけるアミロイドベータの量を減少させることを示す図である。図29Aは、アミロイドベータを特異的に認識する6E10抗体で染色されたAD脳の海馬及び皮質を示し、図29Bは、AD脳の海馬及び皮質におけるアミロイドベータの定量化を示す。図30A-図30Bは、NP-011がアルツハイマー病におけるミクログリア細胞数を減少させることを示す図である。図30Aは、ミクログリアを認識するIBA-1抗体で染色されたAD脳の海馬及び皮質を示し、図30Bは、AD脳の海馬及び皮質におけるミクログリア細胞の定量化を示す。図31A-図31Bは、NP-011がアルツハイマー病の星状細胞において上方制御されるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の量を減少させることを示す図である。図31Aは、GFAPについて染色されたAD脳の海馬及び皮質を示し、図30Bは、AD脳の海馬及び皮質におけるGFAPの定量化を示す。

本発明は、一部には、線維症に関連する疾患を治療及び/又は予防するための組成物及び方法に関する。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で提供される見出しは、種々の実施形態の制限ではなく、全体として本明細書を参照することによって有することができる。さらに、すぐ下に定義される用語は、明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。

冠詞の「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、本明細書では、冠詞の文法的対象物の1つ又は1を超える(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用される。例として、「1つの(an)」要素は、1つの要素又は1を超える要素を意味する。

明細書及び特許請求の範囲を通して、数値に関して使用される「約」及び「ほぼ」という用語は、当業者に親しく受け入れ可能である、精度の間隔を示す。一般的に、このような精度の間隔は±10%である。あるいは、特に生物学的システムにおいて、用語「約」及び「ほぼ」は、所与の値の一桁以内、好ましくは≦5倍、より好ましくは≦2倍の値を意味し得る。

用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、一方、用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域(例えば、5'及び3'非翻訳領域)を指す。

用語「相補的」とは、2つの核酸鎖の領域間又は同一核酸鎖の2つの領域間の配列相補性の広い概念を指す。第1の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合、第1の領域に対して逆平行である第2の核酸領域の残基と特異的な水素結合(「塩基対形成」)を形成することができることが公知である。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第1の鎖と逆平行である第2の核酸鎖の残基と塩基対形成することができることが公知である。核酸の第1の領域は、2つの領域が逆平行に配置される場合、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対形成することができる場合、同一又は異なる核酸の第2の領域に相補的である。好ましくは、第1の領域は第1の部分を含み、第2の領域は第2の部分を含み、それにより、第1の部分及び第2の部分が逆平行に配置される場合、第1の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。より好ましくは、第1の部分の全てのヌクレオチド残基は、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。

用語「治療（処置）すること」は、予防的及び/又は治療的処置を含む。用語「予防的又は治療的」処置は、技術的に認識されており、1つ以上の本発明の組成物の宿主への投与を含む。望ましくない状態(例えば、宿主動物の疾患又は他の望ましくない状態)の臨床所見前に投与される場合、処置は予防的である(すなわち、宿主を望ましくない状態の発症から保護する)。一方、望ましくない状態の所見後に投与される場合、処置は治療的である(すなわち、既存の望ましくない状態又はその副作用を減少させ、改善し、又は安定させることを意図する)。

用語「予防すること」は、技術的に認識されており、状態、例えば局所再発(例えば、疼痛)、疾患、例えば癌、複合症候群、例えば心不全、又は任意の他の医学的状態に関して使用される場合、当該技術分野において十分に理解されており、組成物を受け取らない対象と比較して、対象における医学的状態の症状の頻度を低下させる、又はその症状の発現を遅らせる組成物の投与を含む。したがって、癌の予防は、例えば、未処置の対照集団と比較して予防的処置を受けている患者集団における検出可能な癌性増殖の数を減少させること、及び/又は、例えば、統計的及び/又は臨床的に有意な量だけ、未処置の対照集団と比較して、処置集団における検出可能な癌性増殖の出現を遅らせることを含む。

(例えば、TGF-βの発現、HSCの増殖、NOTCHシグナル伝達の)量は、その量が、量を評価するために使用されたアッセイの標準誤差よりも大きく、好ましくは少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、350%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%より大きいか又はその量よりも大きい量で、対照レベルよりそれぞれ大きい又は小さい場合、対照の量よりも「高い」又は「低い」又は「増加している」又は「減少している」。このような「有意性」は、任意の所望の又は公知の比較点、例えば特定の治療後と治療前の測定比(例えば、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍など)から評価することができる。あるいは、対象における増殖因子の量は、その量が、バイオマーカーの正常量よりも、それぞれ、少なくとも約2倍、3倍、4倍、若しくは5倍高い又は低い場合、対照量よりも「有意に」高い又は低いとみなすことができる。このような「有意性」は、本明細書に記載される任意の他の測定パラメータにも適用することができる。

例えば、ポリペプチドの「治療有効量」は、治療される患者、例えば、線維症、脂肪症の減少、TGF-β発現の減少、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物において、許容可能な利益:リスク比を有する、医学的に望ましい結果を生じ得る量である。

用語「対象」は、診断、予後、又は治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物、家畜、げっ歯類などを含み、これらは特定の処置のレシピエントである。

「血清半減期の増加」又は「インビボ半減期の増加」とは、修飾された生物学的に活性な分子の、その非修飾形態に対する循環半減期の正の変化を意味する。一部の実施形態では、血清半減期は、生物学的に活性な分子の投与後の種々の時間点で血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清中濃度の経時変化を測定することにより、血清半減期を算出することができる。修飾された分子、例えば、コンジュゲートされた分子の血清半減期を未修飾分子と比較することによって、血清半減期又はt1/2の相対的な増加を決定することができる。

「キット」は、少なくとも1つの試薬、例えば、本明細書に記載されるポリペプチドを含む任意の製造物(例えば、パッケージ又は容器)である。キットはまた、追加の試薬、担体、又は希釈剤を含み得る。キットは、本発明の方法を行うためのユニットとして、促進、分配、又は販売することができる。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現させるのに必要とされる1つ以上の試薬を含み得る。ある種の実施形態では、キットは、参照標準をさらに含み得る。当業者は、このような対照の多くを想像することができる。キット内の試薬は、個々の容器内に、又は単一容器内の2つ以上の試薬の混合物として提供することができる。さらに、キット内の組成物の使用を記述する資料を含めることができる。

数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。

ポリペプチド及び代表的な生物学的活性
種々の疾患の治療のための本明細書に提供されるポリペプチドは、上皮細胞増殖因子(EGF)様ドメイン、C1ドメイン、及び場合によりシグナルペプチドを含むが、機能的C2ドメイン及び/又はメディンポリペプチド若しくはその断片を欠失しているMFG-E8ポリペプチドを含む。MFG-E8ポリペプチドは、アミノ酸226～335を含むMFG-E8のC末端ドメイン内の少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、又は105個のアミノ酸を欠失していてもよい。MFG-E8ポリペプチドは、少なくとも180、190、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、又は280個のアミノ酸を含み得る。MFG-E8ポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1～225に対して、少なくとも約75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有することができる。ポリペプチドはまた、配列番号10のアミノ酸2～225に対して、少なくとも約75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99%、又は100%の配列同一性を有することができる。MFG-E8ポリペプチドは、ヒト由来、又は任意のオルソログ、例えば、マウス、ラット、チンパンジー、ウマ由来などであり得る。

MFG-E8はまたラクタドヘリンと呼ばれる。代表的なヒトMFG-E8cDNA及びヒトBRD7タンパク質配列は、当該技術分野において周知であり、National Center for Biotechnology Information(NCBI)から公的に入手可能である。例えば、4つの異なるヒトMFG-E8アイソフォームが公知である。ヒトMFG-E8アイソフォームB(NP 0001108086.1)は、変異体1と比較して代替のインフレームエクソンを欠失している転写変異体2(NM 001114614.3)によってコードされ得る。得られたアイソフォームBは、同じN末端及びC末端を有するが、アイソフォームAと比較して短い。ヒトMFG-E8アイソフォームD(NP 001297248.1)は、転写変異体4(NM 001310319.2)によってコードされ、これは、転写変異体1と比較して5'コード領域に代替のインフレームエクソンを欠失している。コードされたアイソフォームDは、同じN末端及びC末端を有するが、アイソフォームAと比較して短い。ヒトMFG-E8アイソフォームC(NP 001297249.1)は、変異体1と比較して、代替の翻訳開始部位の使用をもたらす代替の内部エキソンを含む転写変異体3(NM 001310320.2)によってコードされ得る。コードされたアイソフォームCは、アイソフォームAと比較して、より短い明確なN末端を有する。ヒトMFG-E8アイソフォームE(NP 001297250.1)は、変異体1と比較して、下流のインフレーム翻訳開始部位の使用をもたらす代替の5'末端エキソンを含む転写変異体5(NM 001310321.2)によってコードされ得る。コード化されたアイソフォームEは、アイソフォームAよりも短いN末端を有する。ヒトMFG-E8アイソフォームA(NP 005919.2)は、最長のアイソフォームAをコードする転写変異体1(NM 005928.4)によってコード化される。ヒト以外の生物におけるMFG-E8オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジーMFG-E8(XM 016927386.2→XP 016782875.1;及びXM 001165898.6→XP 001165898.1)、イヌMFG-E8(XM 022416924.1→XP 022272632.1)、ウマMFG-E8(XM 023650241.1→XP 023506009.1; XM 023650222.1→XP 023505990.1; 及びXM 023650232.1→XP 023506000.1)、ブタMFG-E8(XM 021098306.1→XP 020953965.1; 及びXM 013996945.2→XP 013852399.1)、ネコMFG-E8(XM 011282749.2→XP 011281051.1; 及びXM 011282750.2→XP 011281052.1)、ヒツジMFG-E8(XM 027957063.1→XP 027812864.1) 、ヤギMFG-E8(XM 018065819.1→XP 017921308.1)、ラットMFG-E8(NM 001040186.2→NP 001035276.1; 及びNM 012811.3→NP 036943.1)、及びマウスMFG-E8(NM 001045489.1→NP 001038954.1; 及びNM 008594.2→NP 032620.2)が含まれる。

代表的なポリペプチドはNP-011である。NP-011及び本明細書中に記載される他のポリペプチドは、線維症を阻害するのに有用な多数の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、例えばNP-011は、TGF-β1、MMP2、及び/又は線維症関連遺伝子、例えば、Col1a1、Col1a2、Acta2などの多数の遺伝子の発現を減少させる。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、シグナル伝達経路を調節し、例えば、TGF-βシグナル伝達を減少させ、又はNOTCHシグナル伝達を増加させる。TGF-βシグナル伝達は、ハエ及び線虫から哺乳動物に及ぶ種において、胚形成の間並びに成熟組織において、細胞増殖、認識、分化、アポトーシス、及び発生的運命の特異化を含む多様な一連の細胞プロセスを制御する。TGF-βリガンドは、I型及びII型受容体のセリン/スレオニンキナーゼに結合し、それらを細胞表面にもたらすことによってシグナル伝達を開始する。これにより、受容体IIは受容体Iキナーゼドメインをリン酸化することができ、受容体IキナーゼドメインはSmadタンパク質のリン酸化を介してシグナルを伝える。活性化されたSmad複合体は核内に移行し、他の核内補助因子とともに標的遺伝子の転写を調節する。

TGF-βとそのシグナル伝達経路は細胞増殖を調節する。肝線維症の進行では、肝障害による損傷肝細胞及び死肝細胞が、その病変部位にクッパー細胞を動員する。これらのクッパー細胞は、肝臓の炎症を制御するために、トランスフォーミング増殖因子β1(TGF-β1)などの大量のサイトカインを分泌する。TGF-β1の上昇は、増殖し、細胞外マトリックス(ECM)産生の筋線維芽細胞様細胞になる静止HSCの活性化を引き起こす。活性化されたHSCはさらに肝臓に過剰なコラーゲンに富んだECMを蓄積し、正常な肝臓構造に歪みをもたらす。したがって、TGF-β1の発現を減少させるか、又はTGF-βシグナル伝達を減少させることは、HSCの活性化及び/又は増殖を阻害し、線維化の阻害をもたらす。同様に、NOTCHシグナル伝達は肝再生に重要であり、NOTCHシグナル伝達の増加は、肝再生の促進におけるNP-011の役割を実証する。

TGF-βシグナル伝達の減少は、当該技術分野において公知である多数の方法を介してモニターすることができる。例えば、下流の標的遺伝子(例えば、ATF4、CDKN1A(p21CIP1、WAF1)、CDKN1B(P27KIP1)、CDKN2B(p15INK4b)、COL1A1、COL1A2、DCN、EMP1、FOS、GADD45B、GSC、HERPUD1、IFRD1、IGF1、IGFBP3、IL6、JUN、JUNB、MYC、PDGFB、SERPINE1(PAI-1)、TGFB1I1、TNFSF10(TRAIL)、TSC22D1(TGFB1I4)、TGFBI、TGIF1)の発現レベル、及び/又は下流のタンパク質(例えば、SMAD)のリン酸化のレベルをモニターすることができる。さらに、TGF-βシグナル伝達経路のモニタリングを可能にする多数の市販のキット、例えば、Qiagen Cat# PAHS-035Z、PAMM-035Z、PARN-035Z、PAHS-235Z、PAMM-235Z、PARN-235Z、CRHS-00035Z-100、CRHS-00245Z-100、CRMM-00035Z-100、CRMM-00235Z-100、CCS-017L、CCS-017G、CLS-017L、EAHS-251Z、GH-035A、SEH00508A、SEM02991Aがある。同様に、下流標的遺伝子(例えば、CDKN1A(p21CIP1、WAF1)、CFLAR(Casper)、FOSL1(fra-1)、ID1、IL2RA(CD25)、NFKB1、PTCRA、CD44、ERBB2(HER-2、NEU)、DTX1、HES1、HES5、HEY1、HEY2、HEYL、JAG1、KRT1、LFNG、LOR、NOTCH1、PPARG、CHUK(IKKα)、IFNG、IL17B、IL2RA(CD25)、NFKB1、NFKB2、STAT6)のレベル、及び/又は下流タンパク質のリン酸化のレベルは、Notchシグナル伝達経路を評価するためにモニターされ得る。例えば、Notchシグナル伝達経路のモニタリングを可能にする多数の市販のキット、例えば、Qiagen Cat# PAHS-059Z、PAMM-059Z、PARN-059Z、CRHS-00059Z-100、CRMM-00059Z-100、CCS-014L、CCS-1014G、CLS-014L、CLS-014G、EAHS-611Z、GH-059Aがある。

一部の実施形態では、上記されるように、本明細書に記載されるポリペプチドは、TGF-βシグナル伝達経路におけるタンパク質であるSMADのリン酸化を減少させる。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、TGF-β受容体1(TGFBR1)と1つ以上のインテグリン、例えばインテグリンβ3及び/又はインテグリンβ5との間の相互作用を破壊及び/又は減少させる。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、HSCの増殖を減少させる。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、マクロファージによるコラゲナーゼ活性及び/又はコラーゲン取り込みを増加させる。

アミロイド形成
本明細書に提供されるある種のポリペプチドは、C2ドメインの約50アミノ酸を表すメディンポリペプチド又はその断片を欠失している。メディン（Medin）は大動脈にみられるアミロイドの主成分である。メディン及びアミロイドは、アルツハイマー病及び2型糖尿病などの疾患の病因に関係している。メディンポリペプチドを含むポリペプチドの反復投与は、アミロイド形成を誘導するリスクを増加させ得る。メディンポリペプチド又はその断片を欠失している本明細書に提供されるポリペプチドは、アミロイド形成を誘導するリスクを低減させる。

ポリペプチドの修飾
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドが、異種ポリペプチド及び/又は1つ以上の化学部分とインフレームで融合された修飾ポリペプチドをさらに提供する。このような修飾は、例えば、ポリペプチドの血清半減期を延長し、タンパク質精製中にタグとして働き、又はポリペプチドに対する抗体の産生中に免疫原性を増強するのに有用であり得る。

本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、本発明のポリペプチドの全部又は一部(好ましくは生物学的に活性な部分)を含み、それぞれのポリペプチドと実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する異種ポリペプチドに連結される。融合タンパク質内では、本発明のポリペプチド及び異種ポリペプチドは、好ましくは、融合から独立して発現された場合に示されるそれぞれの機能を維持するような方法で互いに融合される。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に融合することができる。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列、免疫グロブリン融合タンパク質、タグ(例えば、FLAG、GSTなど)、毒素、又は他の有用なタンパク質配列を含む。本発明のキメラ及び融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって製造することができる。他の実施形態では、融合遺伝子は、自動化DNAシンセサイザーを含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続した遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて行うことができ、その後、アニーリング及び再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる。さらに、融合部分(例えば、GSTポリペプチド)を既にコードする多数の発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明のポリペプチドにインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングすることができる。

異種ペプチドは、場合により、ポリペプチド(例えば、NP-011)の溶解性、親和性、安定性又は価を改変させる部分に対応し得る。例えば、ポリペプチド、例えばNP-011は、免疫グロブリン定常領域、例えばヒトC1ドメイン又はC4ドメイン(例えば、ヒトIgC1又はヒトIgC4のヒンジ、CH2及びCH3領域、例えば、参照により本明細書に組み込まれるCaponら、米国特許第5,116,964号、第5,580,756号、第5,844,095号を参照されたい)に機能的に連結され得る。このような定常領域は、エフェクター機能(例えば、Fc受容体結合)を媒介する領域を保持し得るか又はエフェクター機能を低減させるように改変され得る。このような定常領域はまた、融合タンパク質の血清半減期を延長することができる。得られた融合タンパク質は、独立して発現された第1のペプチドと比較して、溶解性、結合親和性、安定性及び/又は価(すなわち、ポリペプチドあたりに利用可能な結合部位の数)が改変され得、タンパク質精製の効率を増加させることができる。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチドの生物学的活性を保持する。

他の実施形態では、ポリペプチドは、1つ以上の化学部分、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、脂質、又はPEG修飾された脂質で共有結合的又は非共有結合的に修飾され得る。このような修飾は、例えば、ポリペプチドの溶解性、安定性、及び/又は血清半減期を増加させ得る。

治療方法-例示的な状態
本明細書に提供される組成物及び方法は、以下に示すものを含む障害を治療及び/又は予防するのに特に有用である。

肝線維症
肝線維症では、過剰な結合組織が肝臓に蓄積する。この組織は慢性的で繰り返される肝細胞障害に反応して瘢痕化を示す。一般的に、線維症は進行し、肝構造を破壊し、最終的には再生肝細胞が損傷組織を置換及び修復しようとするときに機能する。このような破壊が広範囲に及ぶ場合、肝硬変と診断される。

種々のタイプの慢性肝障害が線維症の原因となり得る。劇症であっても、自己限定性の急性肝障害(例えば、急性ウイルス性A型肝炎)は、必ずしも足場構造を歪めず、したがって肝細胞の喪失にもかかわらず線維化を引き起こさない。初期段階では、原因が可逆的であれば(例えば、ウイルスクリアランスを伴う)、肝線維症は退縮し得る。数カ月から数年にわたって慢性的な損傷を受けるか又は損傷を繰り返すと、線維化は永続的に起こる。機械的な胆道閉塞では、線維化がさらに急速に進行する。

肝血管周囲星状細胞(脂肪を貯蔵する伊藤細胞)の活性化は線維症を開始する。これらの細胞及び隣接する細胞は増殖し、筋線維芽細胞と呼ばれる収縮性の細胞になる。これらの細胞は、過剰量の異常なマトリックス(コラーゲン、他の糖タンパク質、及びグリカンからなる)及びマトリックス細胞タンパク質を産生する。クッパー細胞(常在マクロファージ)、損傷した肝細胞、血小板、及び白血球が凝集する。結果として、活性酸素種及び炎症性メディエーター(例えば、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、結合組織増殖因子)が放出される。したがって、星細胞の活性化は、量及び組成の両方において、異常な細胞外マトリックスをもたらす。

エンドセリン-1によって刺激される筋線維芽細胞は、門脈抵抗の増加に寄与し、異常マトリックスの密度を増加させる。線維路（fibrous tract）は、求心性門脈及び遠心性肝静脈の枝に接続し、肝細胞をバイパスしてそれらの血液供給を制限する。したがって、線維症は肝細胞虚血(肝細胞機能障害を引き起こす)と門脈圧亢進症の両方に寄与する。虚血及び門脈圧亢進の程度によって、肝臓がどのように影響されるかが決定される。例えば、先天性肝線維症は門脈枝に影響を及ぼし、主に実質を温存する。その結果は、肝細胞機能を温存する門脈圧亢進症である。

肝硬変
肝硬変は、肝線維症の後期段階であり、正常な肝構造の広範な変形をもたらす。肝硬変は、密な線維組織に囲まれた再生性結節によって特徴付けられる。症状は何年も現れないことがあり、しばしば非特異的である(例えば、食欲不振、疲労、体重減少)。後期症状には、門脈圧亢進症、腹水、及び代償不全が起こった場合の肝不全がある。診断にはしばしば肝生検が必要である。肝硬変は、通常、不可逆的と考えられる。治療は対症的である。

米国国立糖尿病及び消化器及び腎臓病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)(NIDDK)によれば、肝硬変は米国で7番目に多い死因である。肝硬変は、線維症(すなわち、感染、炎症、損傷、又はさらには治癒に起因する瘢痕組織の増殖)及び結節再生を伴う正常な顕微鏡的小葉構造の喪失によって病理学的に定義される。肝臓が慢性的に損傷を受けるため、正常に機能している肝組織に瘢痕組織が徐々に置き換わり、肝臓を通る血流が徐々に減少する。正常な肝組織が失われると、栄養素、ホルモン、薬物及び毒素は、肝臓によって効果的に処理されない。さらに、肝臓で生成されるタンパク質及び他の物質が阻害される。

肝硬変の症状は、重症度及び個人によって異なる。症状には、神経機能異常、腹水(腹腔内の体液の蓄積)、男性の乳房の肥大、喀血又は吐血、指のカール(手のひらのデュプイトレン収縮)、胆石、脱毛、かゆみ、黄疸、腎不全、肝脳症、筋肉喪失、食欲不振、門脈圧亢進症、手のひらの発赤、頬の唾液腺肥大、精巣の収縮、皮膚の小さなクモ状静脈、脱力感、体重減少などが含まれ得る。肝硬変の症状は、他の状態又は医学的問題に類似し得る。軽度の肝硬変では、症状が全く現れないことがある。

肝硬変の最も一般的な原因はアルコール乱用である。他の原因には、肝炎及び他のウイルス(例えば、以下のセクション2.2に記載されるHCV)、ある種薬物の使用、化学物質への曝露、胆管閉塞、自己免疫疾患、肝臓からの血液流出の閉塞(すなわち、バッドキアリ症候群)、心臓及び血管障害、アルファ1-アンチトリプシン欠乏症、高血中ガラクトースレベル、高血中チロシンレベル、糖原病、糖尿病、栄養失調、過剰な銅(ウィルソン病)又は鉄(ヘモクロマトーシス)の遺伝的蓄積が含まれる。

肝硬変は進行性の肝疾患であり、肝臓によって持続される損傷は不可逆的である。しかしながら、適切な栄養摂取、ある種毒素(すなわち、アルコール)の回避、ビタミン補給、及び肝硬変合併症の管理により、さらなる肝障害の進行が遅延又は停止することが多い。肝硬変の重症例では、肝移植を考慮し得る。

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、非アルコール性脂肪性肝疾患としても公知であり、典型的には、アルコール摂取を伴わないアルコール性病因によって特徴付けられる肝障害を表す。肝細胞の脂肪沈着は主にトリグリセリドであり、NASHの重症度は肝臓における脂肪量に直接関係している。組織学的には、肝細胞の50%が脂肪症(脂肪肝の蓄積)である場合、又は脂肪の総重量が肝全体の5%を超える場合は、脂肪性肝炎と診断され得る。NASHは、肝脂肪症、炎症、ときに肝硬変に進行する線維症を伴う血清アミノトランスフェラーゼ活性の上昇によってさらに特徴付けられる。

NASHの有病率は、世界のほとんどの地域で3～19%である。NASHには多くの可能性のある原因があるが、明確な発生源はない。原因として最も可能性が高いのは、粗末な食事、糖尿病、ステロイドの長期使用、及びテトラサイクリンの使用による肥満である。一部の研究では、体重減少後に脂肪症が回復する徴候が示されている。

現在のところ、この潜在的に重篤な障害に対して存在する確立された治療法はない。非アルコール性脂肪肝の患者の治療は、典型的には、関連状態、例えば肥満、真性糖尿病、及び高脂血症の管理、並びに潜在的に肝毒性のある薬物の中止に焦点があてられてきた。

線維症関連疾患
本明細書で提供される方法による治療に適している可能性のある線維症関連障害には、限定されないが、コラーゲン疾患、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患(例えば、閉塞性気管支炎、特発性肺線維症、公知の病因からの肺線維症、肺疾患における腫瘍ストロマ、肺に影響を与える全身性硬化症、ヘルマンスキー・パドラック(Hermansky-Pudlak)症候群、石炭労働者の肺炎、アスベスト症、珪質症、慢性肺高血圧症、AIDS関連肺高血圧症、サルコイドーシス、中等度から重度の喘息など)、線維性血管疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、静脈瘤、冠状動脈梗塞、脳梗塞、心筋線維症、筋骨格線維症、術後癒着、ヒト腎疾患(例えば、腎炎症候群、アルポート症候群、HIV関連腎症、多嚢胞性腎疾患、ファブリー病、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、全身性ループスに関連する腎炎など)、進行性全身性硬化症(PSS)、原発性硬化性胆管炎(PSC)、肝線維症、肝硬変、腎線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性移植片対宿主疾患、硬化性皮膚症(局所及び全身)、グレーブス眼症、糖尿病性網膜症、緑内障、ペイロニー病、陰茎線維症、膀胱鏡検査後の尿道狭窄、手術後の内部付着、瘢痕化、骨髄線維症、特発性後腹膜線維症、公知の病因による腹膜線維症、薬物誘発性エルゴチン中毒、良性又は悪性癌に付随する線維症、微生物感染に付随する線維症(例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌など)、アルツハイマー病、炎症性腸疾患に付随する線維症(クローン病及び顕微鏡的大腸炎の狭窄形成を含む)、間質細胞腫瘍、粘膜炎、化学的又は環境的傷害によって誘発される線維症(例えば、癌化学療法、農薬、放射線(例えば、癌放射線療法)など)などが含まれる。一部の実施形態では、線維症関連障害は、全身性又は局所性の強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺の炎症及び線維症、特発性肺線維症、肝硬変、慢性B型又はC型肝炎感染の結果としての線維症、腎疾患、瘢痕組織に起因する心疾患、黄斑変性、並びに網膜及び硝子体網膜症から選択される。一部の実施形態では、線維症関連障害は、化学療法薬、放射線誘発性線維症、並びに損傷及び熱傷に起因する。

肝線維症に関連する遺伝性疾患には、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、非HFE遺伝性ヘモクロマトーシスフェロポルチン、トランスフェリン受容体2、ヘプシジン、ヘモジュベリン、シトステロール血症/肝胆道コレステロールトランスポーター5及び8、進行性家族性肝内胆汁うっ滞3型、遺伝性フルクトース不耐性、高チロシン血症I型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、シトリン欠乏症、コレステリルエステル蓄積症及びウォルマン病、α1アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症、アルストロム症候群、及び先天性肝線維症が含まれる。

肺線維症
肺線維症(「肺の瘢痕化」)は、肺組織に瘢痕が形成される呼吸器疾患であり、深刻な呼吸障害をもたらす。瘢痕形成、過剰な線維性結合組織の蓄積(線維症と呼ばれる過程)は、壁の肥厚をもたらし、血液中の酸素供給の低下を引き起こす。その結果は、永続的な息切れである。

肺線維症は、線維組織による正常な肺実質の緩徐な交換を伴う。正常肺を瘢痕組織で置換すると、酸素拡散能が不可逆的に低下し、その結果として生じる強張り又はコンプライアンスの低下は、肺線維症を拘束性肺疾患にする。肺線維症は、慢性炎症ではなく、創傷治癒の異常により持続する。それは、肺実質に内因性である拘束性肺疾患の主な原因である。一部の例では、肺線維症は喫煙と関連している。肺線維症の治療選択肢は限られており、免疫抑制療法、例えばコルチコステロイドが含まれる。

特発性肺線維症
特発性間質性肺炎の最も一般的な形態である特発性肺線維症(IPF)は、原因不明の慢性、進行性、不可逆性、通常は致死性の肺疾患である。IPFは中年及び高齢成人(診断時年齢中央値66歳、55～75歳の範囲)に発症し、肺に限定され、通常の間質性肺炎に典型的である組織病理学的又は放射線学的パターンに関連する。

通常の間質性肺炎の主な組織病理学的特徴は、低倍率陽イオンで最もよくみられる不均一な外観であり、胸膜下及び傍中隔線維症及び蜂巣肺の領域(すなわち、細気管支上皮によって裏打ちされ、しばしばムチン及び可変数の炎症細胞によって満たされる嚢胞性線維性気腔)が、影響が少ないか又は正常な実質の領域と交互になっている不均一な外観(空間的不均一性)を伴う。コラーゲン沈着の背景には活動性線維症(線維芽細胞病巣)の小さな領域が存在し、それらはこの過程の時間的不均一性を反映しており、現在進行中の疾患を示している。炎症は通常軽度であり、斑状のリンパ形質細胞性間質性浸潤からなる。高解像度CTでの通常の間質性肺炎パターンの存在は、しばしば牽引性気管支拡張症に関連する網状陰影によって特徴付けられ、すりガラス様陰影はほとんどないか又は全くない。蜂巣状化は、十分に画定された壁(典型的には直径3～10mm)を有する胸膜下のクラスター化した嚢胞性気腔として発現し、一般的であり、明確な診断を下すのに重要である。

IPFの患者は、慢性であり、進行性の労作性呼吸困難及び咳嗽に悩まされているため、通常、医師の診察を受ける。両肺底部の吸気性断続性ラ音が胸部聴診で聴取され、しばしばばち状指が認められる。IPFの自然経過は、持続性又は緩徐進行性の肺障害として特徴付けられており、ほとんどの患者はこのパターンに従う。しかしながら、最近の知見は、IPFが不均一な疾患であることを示しており、生存の異なるパターンを有する新たな臨床表現型が報告されている。病因機序は不明であるが、この疾患が線維芽細胞及び筋線維芽細胞の形成を伴う間葉細胞の遊走、増殖及び活性化を誘発する肺胞上皮細胞の異常な挙動の結果であることを示す証拠が増えている。活性化された筋線維芽細胞は、過剰量の細胞外マトリックス分子を分泌し、続いて肺構造を破壊する。生存期間を延長することを明らかに示す治療法はない。

心筋梗塞
心筋梗塞は、通常、心臓発作としても公知であり、心臓の一部が冠動脈の閉塞により酸素を奪われた場合に起こる。冠動脈は、酸素に富む血液を心筋(heart muscle)(心筋(myocardium))に供給する。酸素がなければ、閉塞した動脈の筋細胞は死に始める(梗塞)。

心筋梗塞の最も一般的な原因は、心筋に供給する動脈のアテローム硬化性プラークの破裂である。プラークは不安定になり、破裂し、さらに動脈を閉塞する血塊の形成を促進する。これは数分で起こる。動脈が閉塞すると、その動脈から組織が供給されて組織死に至ることがある。アテローム性プラークは、症状が現れるまで数十年間存在することが多い。

典型的には数十年にわたって、冠動脈又は他の動脈の壁内のプラークにおけるコレステロール及び線維組織の漸進的な蓄積は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれる。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の進行性炎症によって特徴付けられる。炎症細胞、特にマクロファージは、侵された動脈壁に移動する。経時的に、それらはコレステロール生成物、特にLDLを積層し、泡沫細胞になる。泡沫細胞が死滅するにつれてコレステロールコアが形成される。マクロファージにより分泌された増殖因子に応答して、平滑筋や他の細胞はプラーク内に移動し、それを安定化するように作用する。安定したプラークは、石灰化を伴う厚い線維性被膜を有することがある。炎症が続いている場合は、キャップが薄くなっているか潰瘍化していることがある。血流に関連する血圧に曝露されると、プラーク、特に薄い内層を有するプラークが破裂し、血塊(血栓)の形成が誘発されることがある。

アルツハイマー病
アルツハイマー病は、記憶及び認知の進行性障害によって特徴付けられる認知障害である。典型的には、後年に発症し、認知及び記憶に関係する脳領域を含む多種多様な構造的、化学的及び機能的異常と関連する。疫学研究によると、認知症は現在65歳以上の人の最大10%に発症しており、米国だけでも400万人もの人がアルツハイマー病に罹患している可能性があると示唆する。このような人の世話にかかる費用は年間800億ドルをはるかに超え、急速に増加している。

アルツハイマー病の原因は、十分に判明していない。リスクの約70%は、多くの遺伝子が通常関与する親から遺伝すると考えられている。他のリスク因子には、頭部外傷、うつ病、及び高血圧の病歴が含まれる。この疾患の経過は、脳内のプラーク及び神経原線維変化と関連する。可能性のある診断は、病気の病歴、並びに他の可能性のある原因を除外するための医用画像及び血液検査による認知検査に基づく。初期症状は、しばしば正常な老化と間違えられる。確定診断には脳組織の検査が必要である。リスクを減少させることが示されている薬剤又はサプリメントはない。

細胞外アミロイドベータ(Aβ)沈着がこの疾患の根本原因であると仮定されている。この仮説についての支持は、21番染色体上のアミロイド前駆体タンパク質(APP)の遺伝子の位置と、余分な遺伝子コピーを有する21番トリソミー(ダウン症候群)の者が、40歳までに少なくとも最も初期のAD症状をほとんど普遍的に示すという事実から生じる。また、アポリポタンパク質の特異的アイソフォームであるAPOE4は、ADの主要な遺伝的リスク因子である。アポリポタンパク質はベータアミロイドの分解を促進するが、アイソフォームの中には、このタスクにあまり効果的でないものもあり(例えばAPOE4)、脳内に過剰なアミロイドが蓄積される。さらなる証拠は、ヒトAPP遺伝子の突然変異型を発現するトランスジェニックマウスが、空間学習障害を伴う原線維性アミロイド斑及びアルツハイマー様脳病理を発現するという知見から生じる。

追加の薬剤
本明細書に提供される組成物は、障害、例えば肝線維症を治療する任意の公知の薬剤と組み合わせて対象に投与することができる。同様に、本明細書に提供される方法は、本明細書に開示される組成物(例えば、NP-011)と組み合わせて障害を治療する任意の公知の薬剤を対象に投与することができる。線維症関連障害に対する種々の治療は、当業者に公知である。

線維性疾患の治療には、抗炎症薬、コルチコステロイド、ペニシラミン、及びコルヒチンが含まれる。例えば、The Merck Manual. 第20版 Merck Research Laboratories、2018を参照されたい。

線維症は肝障害に対する反応であるため、一次治療は原因(肝障害の原因を取り除くこと)に焦点を当てるべきである。このような治療には、慢性ウイルス性肝炎におけるB型肝炎ウイルス又はC型肝炎ウイルスの除去、アルコール性肝疾患におけるアルコールからの離脱、ウィルソン病におけるヘモクロマトーシスにおける重金属、例えば鉄又は銅の除去、及び胆道閉塞における胆管の減圧(decompressing)が含まれる。このような治療は線維化の進行を止め、一部の患者では、線維化の変化を逆転させることもある。

線維症を回復させることを目的とした治療は、通常、長期使用には毒性が強すぎるか(例えば、コルチコステロイド、ペニシラミン)、又は効果が証明されていない(例えば、コルヒチン)。他の抗線維化治療もまた研究中である。シリマリンはオオアザミに存在し、肝線維症の治療に使用される一般的な代替の医薬である。それは、(C型肝炎を治療するある種の薬と併用した場合を除き)安全と思われるが、有効性に欠ける。

一部の実施形態では、抗線維化療法は、線維化促進因子アンタゴニスト及び/又は抗線維化剤の投与を含む。

線維化促進因子アンタゴニスト
抗線維化療法は、線維化促進因子を阻害又は拮抗する薬剤、例えば線維化組織の形成及び維持に関与する1つ以上の増殖因子又はサイトカインに拮抗する薬剤を包含する。このようにして、抗線維化療法は、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、並びに/又は造血単球前駆体分化及び線維組織の形成及び維持を標的とする。

本発明の治療法の一部としてアンタゴニストにより標的とすることができる線維化促進因子には、限定されないが、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β、例えばTGF-β1-5)、VEGF、EGF、RANTES、インターロイキンファミリーのメンバー(例えば、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8及びIL-13)、腫瘍壊死因子タイプアルファ(TNF-a)、血小板由来増殖因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、単球走化性タンパク質タイプ1(MCP-1)、マクロファージ炎症性タンパク質(例えば、MIP-1a、MIP-2)、結合組織増殖因子(CTGF)、エンドセリン-1、アンジオテンシン-11、レンニン、レプチン、ケモカイン(例えば、CCL2、CCL12、CXCL12、CXCR4、CCR3、CCR5、CCR7)、SLC/CCL21、及び線維性組織の形成、増殖若しくは維持を促進又は関連することが公知である他の因子が含まれる。

抗線維化療法は、1つ以上の線維化促進因子の対応する受容体のアンタゴニストを含み得る。このようなアンタゴニストは、1つ以上の線維化促進因子及び/又はサイトカイン、例えばそれらの断片の不活性形態を含み得る。適切な濃度のこのような形態は、その受容体への結合について、その対応する線維化促進因子及び/又はサイトカインと競合し得る。同様に、受容体に対するある種の抗体を用いて、対応する線維化促進因子及び/又はサイトカインのそれへの結合を妨げるか又は阻止することができる。

抗線維化療法はまた、可溶性受容体が標的リガンドに対するその対応する天然細胞受容体と競合するように、1つ以上の線維化促進因子及び/又はサイトカインの受容体の可溶性形態を含み得る。治療は、さらに、1つ以上の線維化促進因子及び/又はサイトカインとその受容体の結合と競合するか、又は他には妨げる化合物を含み得る。例えば、プロテオグリカンデコリンは、TGF-βに結合することが公知であり、それによって、その受容体への結合のためのその利用可能性を低減させる。マンノース-6-リン酸はまた、対応する受容体への結合に関してTGF-βと競合することが公知である。TGF-βの他の公知の結合阻害剤には、潜在性トランスフォーミング増殖因子-β結合タンパク質(LTBP)及び潜在性関連ペプチド(LAP)が含まれ、これらはいずれもTGF-βの細胞内前駆体に自然に結合する。

ある種の実施形態では、抗線維化療法は、1つ以上の線維化促進因子及び/又はサイトカインに関してアンチセンスである少なくとも1つの配列を含む1つ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。このような成分はまた、アンチセンス配列を生じる適切な転写制御配列を有する1つ以上の発現プラスミドを含み得る。他の選択された実施形態では、抗線維化療法は、RNA媒介干渉を介して1つ以上の線維化促進因子及び/又はサイトカインの転写物を分解するのに適した、1つ以上の二本鎖オリゴヌクレオチド、又はそれらをコードする発現プラスミドを含むことができる。他の選択された実施形態では、抗線維化療法は、線維化促進因子のそれらの同族受容体への結合を阻害又は干渉するのに適した、1つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドアプタマー、又はそれらをコードする発現プラスミドを含み得る。

適切な線維化促進因子アンタゴニストは、その対応する受容体に結合する際に、1つ以上の線維化促進因子によって活性化される細胞内シグナル伝達経路の1つ以上の成分を阻害する、減弱する、又は妨げることが公知である成分を含み得る。例えば、抗線維化療法は、下流シグナル経路分子、例えばSMADファミリーメンバー及びSARAを阻害又は減弱させる成分を含み得る。適切な抗線維化療法は、線維化に必要な細胞接着を阻害するか又は妨げるのに適した1つ以上の分子を含み得る。例えば、適切な成分は、ICAM-1及び/又はCD11、CD49若しくはCD18分子に対する干渉抗体を含み、それによって、それらの間の接着相互作用と干渉することができる。

他の選択された実施形態では、適切な線維化促進因子拮抗剤は、コラーゲン合成の阻害剤、例えばコラーゲン前駆体の翻訳後プロセッシングを妨げるプロリン類似体を含み得る。例えば、ピルフェニドンは、コラーゲン合成を阻害し、複数のサイトカインの生成を下方制御し、線維芽細胞増殖を遮断し得る経口活性低分子薬物である。

TGF-βアンタゴニスト
トランスフォーミング増殖因子(TGF)ベータファミリーのサイトカインは、創傷治癒及び組織修復において中心的な役割を果たし、すべての組織に見出される。TGF-βは、多くの実質細胞型、並びに浸潤細胞、例えばリンパ球、単球/マクロファージ、及び血小板によって産生される。創傷又は炎症の後、このような細胞はTGF-βの潜在的供給源である。一般的に、TGF-βは、種々の細胞外マトリックスタンパク質の産生を刺激し、これらのマトリックスタンパク質の分解を阻害し、組織線維化を促進し、これらは全て、罹患組織の修復及び回復に寄与する。多数の疾患において、過剰なTGF-βは、正常な臓器機能を損なう可能性のある、病的な過剰な組織線維症の一因となる。

TGF-βアンタゴニストの例は、限定されないが、TGF-βの1つ以上のアイソフォームに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体(Daschら、米国特許第5,571,714号;国際公開第97/13844号及び国際公開第00/66631号も参照されたい);TGF-β受容体、このような受容体の可溶形態(好ましくは可溶性TGF-PタイプIII受容体)又はTGF-受容体に対する抗体(Segariniら、米国特許第5,693,607号; Linら、米国特許第6,001,969号、米国特許第6,010,872号、米国特許第6,086,86号、米国特許第6,201,108号; 国際公開第98/48024号; 国際公開第95/10610号; 国際公開第93/09228号; 国際公開第92/00330第);潜在性関連ペプチド(国際公開第91/08291号);大潜在性TGF-β(国際公開第94/09812号);フェチュイン(米国特許第5,821,227号);デコリン及び他のプロテオグリカン、例えばビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン及びエンドグリン(国際公開第91/110727号; Ruoslahtiら、米国特許第5,654,270号、米国特許第5,705,609号、米国特許第5,726,149号; Border、米国特許第5,824,655号; 国際公開第91/04748号; Letarteら、米国特許第5,830,847号、米国特許第6,015,693号; 国際公開第91/110727号; 国際公開第93/09800号; 及び国際公開第94/110187号);ソマトスタチン(国際公開第98/08529号);マンノース-6-リン酸又はマンノース-1-リン酸(Fergusonら、米国特許第5,520,926号);プロラクチン(国際公開第97/40848号);インスリン様増殖因子II (国際公開第98/117304号); IP-10 (国際公開第97/00691号);arg-gly-asp含有ペプチド(Pfeffer、米国特許第5,958,411号; 国際公開第93/10808号);植物、真菌及び細菌の抽出物(欧州特許出願公開第813 875号; 特許8119984; 及びMatsunagaら、米国特許第5,693,610号);アンチセンスオリゴヌクレオチド(Chung、米国特許第5,683,988号; Fakhraiら、米国特許第5,772,995号; Dzau、米国特許第5,821,234号、米国特許第5,869,462号; 及び国際公開第94/25588号);TGF-βシグナル伝達に関与するタンパク質、例えば、SMAD及びMAD(欧州特許出願公開第874 046号; 国際公開第97/31020号; 国際公開第97/38729号; 国際公開第98/03663号; 国際公開第98/07735号; 国際公開第98/07849号; 国際公開第98/45467号; 国際公開第98/53068号; 国際公開第98/55512号; 国際公開第98/56913号; 国際公開第98/53830号; 国際公開第99/50296号; Falb、米国特許第5,834,248号; Falbら、米国特許第5,807,708号; 及びGimenoら、米国特許第5,948,639号)、Ski及びSno(Vogel, 1999, Science, 286:665; 及びStroscheinら、1999、Science、286:771～774頁); TGF-βの同族受容体への結合を阻害又は妨害するのに適した、1つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドアプタマー又はそれをコードする発現プラスミド、及びTGF-βの活性を阻害する能力を保持する上記で定義された分子の任意の突然変異体、断片又は誘導体が含まれる。

一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、その受容体へのTGF-β結合を遮断するヒト又はヒト化モノクローナル抗体(又はその断片、例えばF(ab)2断片、Fv断片、一本鎖抗体、及びTGF-βに結合する能力を保持する抗体の他の形態又は断片、例えば、ハイブリドーマ1D 11.16(Daschら、米国特許第5,783,185号に記載されるATCC受託番号HB 9849)由来のモノクローナル抗体)である。

抗線維化剤
ある種の実施形態では、線維化促進因子アンタゴニストは、抗線維化作用を有することが知られているサイトカイン、例えばIL-12、IL-10、IFN-g又はBMP-7(OP-1)と置き換えられ得るか又はそれによって増強され得る。IFN-yポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、公的のデータベース、例えば、Genbank、雑誌刊行物などからアクセスすることができる。種々の哺乳動物IFN-gポリペプチドが対象であるが、ヒト疾患の治療のためには、一般的に、ヒトタンパク質が使用される。ヒトIFN-gコード配列は、Genbank、受託番号P01579及びCAA00375に見出され得る。対応するゲノム配列は、Genbank、受託番号100219、M37265及びV00536に見出され得る。例えば、Grayら、(1982) Nature 295:501頁(Genbank Xl3274); 及びRinderknechtら、(1984) J. Biol. Chern. 259:6790頁を参照されたい。IFN-g1b(Actimmune(登録商標)、ヒトインターフェロン)は、140個のアミノ酸からなる一本鎖ポリペプチドである。大腸菌(E. coli)では組換えにより作製され、グリコシル化されない。Rinderknechtら、 (1984) J. Biol. Chern. 259:6790～6797頁。抗線維化療法に用いられるIFN-gは、IFN-g活性、特にヒトIFN-g活性を有する限り、天然IFN-g、組換えIFN-g及びそれらの誘導体のいずれかであり得る。

抗線維化療法は、1つ以上の血清アミロイドP(SAP)アゴニスト、1つ以上のC-反応性タンパク質(CRP)アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを含む。SAPアゴニストは、種々の線維性疾患の治療に有用である。SAPアゴニストは、SAP活性を増加させる化合物を含む、内因性SAPシグナル伝達を増加させるか又は他には模倣するすべての化合物及び組成物を包含する。

ペントラキシンファミリーの一員である血清アミロイドP(SAP)又はペントラキシン-2は、肝臓によって生成され、血液中に分泌され、安定な135kDaの五量体として循環する27kDaのタンパク質である。SAPは、ECMタンパク質への好中球の接着を低減させ、単球の線維細胞への分化を阻害し、線維化促進性マクロファージを減少させ、補体経路を活性化し、細胞残渣の食作用を促進する。SAPは、ブレオマイシン誘発性肺線維症を低減する。SAPの代表的なアゴニストには、ヒトSAPタンパク質又はその活性断片、抗FcyR抗体、凝集抗体、SAPペプチド模倣物、FcyR架橋剤、及びアプタマーが含まれる。CRPアンタゴニストは、CRPシグナル伝達を減少、遮断、又は阻害するすべての化合物及び組成物を包含する。代表的なアンタゴニストは、CRP、RNA干渉分子、例えば、低分子干渉RNA、dsRNA、及びロックド核酸(LNA)の発現を標的とするアンチセンス核酸を含む。

核酸分子、ベクター、ホスト細胞
本明細書に開示されるポリペプチド、例えばNP-011タンパク質をコードする核酸分子が提供される。

本明細書に開示される核酸分子は、RNAの形態であり得、又はDNAの形態であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAを含み、並びに二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖/又は非コード(アンチセンス)鎖であり得る。ある種の実施形態では、核酸分子は単離される。さらなる実施形態では、核酸分子は、実質的に純粋である。一部の実施形態では、核酸は、cDNAであるか又はcDNAに由来する。一部の実施形態では、核酸は、組換え的に生成される。

本発明の核酸分子は、鋳型としてのcDNA、mRNA、又はゲノムDNA、及び標準的なPCR増幅技術に従って適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。このようにして増幅された核酸分子は、適切なベクターにクローニングされ、DNA配列分析によって特徴付けられる。さらに、本発明の核酸分子の全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば自動DNAシンセサイザーを用いて調製することができる。

一部の実施形態では、核酸分子は、宿主細胞又はインビトロにおけるコード配列の発現を制御する制御配列に機能的に連結されたタンパク質コード配列を含む(下記参照)。特定の実施形態では、コード配列はcDNAである。本開示はまた、宿主細胞又はインビトロにおけるコード配列の発現を制御する制御配列に機能的に連結されたタンパク質(例えば、NP-011)コード配列を含む核酸分子を含有するベクターに関する。

一部の実施形態では、核酸分子は、異種ポリヌクレオチド配列に対して同じリーディングフレームで融合されたタンパク質のコード配列を含む。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド(例えば、NP-011)をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を促進するリーダーペプチド配列をコードする。リーダー配列を含むタンパク質はプレタンパク質と呼ばれ、プロセッシングされた形態のタンパク質を形成するために、宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することができる。このようなリーダーペプチド配列、及び宿主細胞における組換えタンパク質の分泌を促進するそれらの使用は、当該技術分野において一般的に公知である。さらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、精製を促進し、タンパク質の安定性及び/又は組換え発現タンパク質の治療特性を付加又は改善するために機能し得る追加の5'アミノ酸残基をコードする。好ましい実施形態では、NP-011及び/又は類似のタンパク質は、宿主細胞から分泌される。ある種の好ましい実施形態では、NP-011及び/又は類似のタンパク質は、N末端メチオニンを欠失しており、異種配列を含まない。他の好ましい実施形態では、NP-011は、インビボで半減期を延長する異種配列を含む。

一部の実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列、又は該核酸配列を含むベクターは、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて化学合成によって構築される。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列及び宿主細胞の選択に基づくコドン最適化に基づいて設計することができる。ポリペプチド(例えば、NP-011)をコードするポリヌクレオチド配列を合成及び単離するために、標準的な方法を日常的に適用することができる。

ベクターは、宿主細胞内に1つ以上の目的の遺伝子又は配列を送達することができ、一部の実施形態では、発現させることができる構築物であり得る。ベクターの例としては、限定されないが、ウイルスベクター、裸のDNA又はRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン縮合剤に関連するDNA又はRNA発現ベクター、リポソームに封入されたDNA又はRNA発現ベクター、及びある種の真核細胞、例えば産生細胞が挙げられる。

一旦アセンブルされると(合成又は別の方法によって)、ポリペプチドをコードする核酸配列は、所望の宿主における発現に適した制御配列に日常的に機能的に連結され得る。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸配列は、1つ以上の発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した制御配列に機能的に連結される。宿主においてトランスフェクトされたコード配列の高発現レベルを得るために、コード配列は、選択された発現宿主において機能的である転写及び翻訳発現制御配列に機能的に連結され得るか又は関連し得る。

ある種の実施形態では、組換え発現ベクターは、ポリペプチドをコードするDNAを増幅し、発現するために使用される。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来する適切な転写又は翻訳調節要素に機能的に連結されたポリペプチド(例えば、NP-011)をコードする合成又はcDNA由来のDNA断片を有する複製可能なDNA構築物である。転写単位は、一般的に、(1)遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝要素又は複数の要素、例えば転写プロモーター又はエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造又はコード配列、及び(3)以下に詳細に記載されるように、適切な転写及び翻訳開始及び終結の配列、のアセンブリーを含む。このような調節要素は、転写を制御するオペレーター配列を含むことができる。宿主内で複製する能力、通常は複製起点によって付与される能力、及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、それらが互いに機能的に関連している場合、機能的に連結される。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のためのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合には、ポリペプチドのためのDNAに機能的に連結され、プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合には、コード配列に機能的に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように配置される場合には、コード配列に機能的に連結される。酵母発現系で使用することが意図された構造要素は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしで発現される場合、タンパク質は、N末端メチオニン残基を含むことができる。その後、この残基は、発現された組換えタンパク質から切断され、最終的なタンパク質を提供することができる。ある種の実施形態では、本開示は、場合により1つ以上の担体、希釈剤、賦形剤、又は他の添加剤をさらに含む、本明細書中の上記又は他の箇所に記載される核酸又はベクターを含む、組成物、例えば医薬組成物を提供する。

また、本明細書に開示される核酸分子又はcDNA分子及び/又はベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。本開示はまた、開示される核酸分子、又は制御配列に機能的に連結され、場合によりベクターに挿入された分子で形質転換された宿主細胞を提供する。

さらなる実施形態では、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチドを作製する方法を提供し、それは、ポリペプチドの生成に適した条件下で、本明細書において形質転換された宿主細胞を培養することを含む。本開示は、場合により、宿主細胞から分泌されたポリペプチドを単離することを提供する。本開示はまた、場合により、この方法を用いて製造されたポリペプチド、並びにポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主/ベクターの組合せを用いることができる(さらなる例については下記も参照されたい)。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターを含む。細菌宿主のための有用な発現ベクターには、pCR1、pBR322、pMB9及びそれらの誘導体を含む、公知の細菌プラスミド、例えば大腸菌由来のプラスミド、並びにより広い宿主域プラスミド、例えばM13及び繊維状一本鎖DNAファージも含まれる。

宿主細胞は、組換え核酸を保持するか若しくは保持することができる細胞又は細胞集団であり得る。宿主細胞は、原核細胞(例えば、大腸菌)であり得るか又は真核細胞であり得る。原核生物には、グラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば大腸菌又は桿菌が含まれる。宿主細胞は、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス、又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)を含む真菌細胞であり得る。宿主細胞はまた、種々の動物細胞のいずれか、例えば昆虫細胞(例えば、Sf-9)又は哺乳動物起源の確立された細胞系であり得る。適切な哺乳動物宿主細胞株の例としては、HEK-293、HEK293F、及びHEK-293T、Gluzman(Cell 23:175頁(1981))により記載されるサル腎細胞のCOS-7株、並びに、例えば、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLa、及びBHK細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写要素、例えば複製起点、発現される遺伝子に連結された適切なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の5'又は3'隣接非転写配列、及び5'又は3'非翻訳配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位及び受容部位、並びに転写終結配列を含むことができる。昆虫細胞において異種タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers、BioTechnology 6:47頁に概説される。無細胞翻訳系もまた使用することができる。好ましい実施形態では、宿主細胞はピキア・パストリスである。

核酸分子、ベクター及び宿主の送達
一部の実施形態では、核酸分子、ベクター、及び宿主細胞は、医薬組成物に提供される。一部の実施形態では、医薬組成物の成分は、意図されたレシピエントへの核酸の送達を助ける。

一部の実施形態では、DNA構築物は、トランスフェクションによって、すなわち、「裸の」DNAの送達によって、又はコロイド分散系との複合体中で細胞に送達される。コロイド系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合化又はリポソーム製剤化されたDNAである。前者のアプローチでは、例えば脂質を用いてDNAを製剤化する前に、所望のDNA構築物を有する導入遺伝子を含むプラスミドを、最初に、発現のために実験的に最適化することができる(例えば、5'非翻訳領域へのイントロンの含有及び不必要な配列の除去(Felgnerら、Ann NY Acad Sci 126～139頁、1995))。次に、例えば種々の脂質又はリポソーム材料を用いたDNAの製剤化は、公知の方法及び材料を用いて行い、レシピエント哺乳動物に送達することができる。例えば、Canonicoら、Am J Respir Cell Mol Biol 10:24～29頁、1994; Tsanら、Am J Physiol 268; Altonら、Nat Genet 5:135～142頁、1993、及びCarsonらによる米国特許第5,679,647号を参照されたい。

リポソームの標的指向性は、解剖学的及びメカニズム的因子に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、及び細胞小器官特異的に基づく。機序的標的指向性は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的指向性は、類洞毛細血管を含む臓器の細網内皮系(RES)の細胞にリポソームが分布する自然な傾向を利用する。一方、能動的標的指向性は、天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への標的指向性を達成するために、リポソームを特定のリガンド、例えばモノクローナル抗体、糖、糖脂質、若しくはタンパク質に結合させることによって、又はリポソームの組成若しくはサイズを変化させることによって、リポソームを改変させることを伴う。

標的化送達系の表面は、様々な方法で修飾され得る。リポソーム標的化送達系の場合、リポソームの脂質二重層に脂質基を組み込んで、標的指向性リガンドをリポソーム二重層と安定に会合させることができる。脂質鎖を標的指向性リガンドに接続させるために、種々の連結基を用いることができる。送達ビヒクル、例えばリポソームと関連する裸のDNA又はDNAを対象のいくつかの部位に投与することができる。

核酸は、任意の所望のベクターで送達することができる。これらには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びプラスミドベクターなどのウイルス又は非ウイルスベクターが含まれる。ウイルスの例示的なタイプとしては、HSV(単純ヘルペスウイルス)、AAV(アデノ随伴ウイルス)、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、BIV(ウシ免疫不全ウイルス)、及びMLV(マウス白血病ウイルス)が挙げられる。核酸は、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、及びポリマーへの複合体化を含む、十分に効率的な送達レベルを提供する任意の所望のフォーマットで投与することができる。

目的のタンパク質又は核酸をコードする核酸は、プラスミド又はウイルスベクター、又は当該技術分野において公知である他のベクター中にあり得る。このようなベクターは周知であり、特定の用途に対していずれかを選択することができる。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーター及び脱メチル化酵素コード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーター、及び、細胞増殖によって活性化されるプロモーター、例えばチミジンキナーゼ及びチミジル酸シンターゼプロモーターである。他の好ましいプロモーターとしては、ウイルス感染により活性化可能なプロモーター、例えばα-及びβ-インターフェロンプロモーター、並びにエストロゲンなどのホルモンにより活性化可能なプロモーターが挙げられる。使用することができる他のプロモーターとしては、モロニーウイルスLTR、CMVプロモーター、及びマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。プロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。

別の実施形態では、裸のポリヌクレオチド分子は、国際公開第90/11092号及び米国特許第5,580,859号に記載される遺伝子送達ビヒクルとして使用される。このような遺伝子送達ビヒクルは、増殖因子DNA又はRNAのいずれかであり得、ある種の実施形態では、死滅したアデノウイルスに連結される。Curielら、Hum. Gene. Ther. 3:147～154頁、1992。場合により使用され得る他のビヒクルは、誘導性DNA-リガンド(Wuら、J. Biol. Chem. 264:16985～16987頁、1989)、リガンド-DNAコンビネーション(Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413～7417頁、1989)、リポソーム(Wangら、Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851～7855頁、1987)及びマイクロプロジェクタイル(microprojectile)(Williamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2726～2730頁、1991)を含む。

遺伝子送達ビヒクルは、場合により、ウイルス配列、例えばウイルス複製起点又はパッケージングシグナルを含むことができる。これらのウイルス配列は、ウイルス、例えばアストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス又はアデノウイルスから選択することができる。好ましい実施形態では、増殖因子遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルス及びそれらの種々の使用は、多数の参考文献に記載され、例えば、Mannら、Cell 33:153頁、1983, Cane and Mulligan、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6349頁、1984, Millerら、Human Gene Therapy 1:5～14頁、1990、米国特許第4,405,712号、米国特許第4,861,719号、及び米国特許第4,980,289号、PCT国際公開第89/02468号、国際公開第89/05349号、及び国際公開第90/02806号が挙げられ得る。多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを本発明において使用することができ、例えば、欧州特許第0415731号; 国際公開第90/07936号; 国際公開第94/03622号; 国際公開第93/25698号; 国際公開第93/25234号;米国特許第5,219,740号; 国際公開第93/11230号; 国際公開第93/10218号; Vile and Hart、Cancer Res. 53:3860～3864頁、1993; Vile and Hart、Cancer Res. 53:962～967頁、1993; Ramら、Cancer Res.53:83～88、1993; Takamiyaら、J. Neurosci. Res.33:493～503頁、1992; Babaら、J. Neurosurg. 79:729～735頁、1993 (米国特許第4,777,127号, 英国特許第2200651号、欧州特許第0345242号、及び国際公開第91/02805号)に記載されているものが含まれる。

本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(1997年5月20日に発行されたWooらによる米国特許第5,631,236号、及びNeurovexによる国際公開第00/08191号)、ワクシニアウイルス(1997年5月20日に発行されたWooらによる米国特許第5,631,236号、及びNeurovexによる国際公開第00/08191号)、ワクシニアウイルス(Ridgeway (1988) Ridgeway、「Mammalian expression vectors」、In: Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth,; Baichwal and Sugden (1986) 「Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes」、In: Kucherlapati R, ed. New York: Plenum Press; Couparら、(1988) Gene, 68:1～10頁、)、及びいくつかのRNAウイルス由来である。好ましいウイルスには、アルファウイルス、ポキシウイルス、アリーナウイルス、ワクシニアウイルス、及びポリオウイルスなどが含まれる。それらは、種々の哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する(Friedmann (1989) Science、244:1275～1281頁; Ridgeway、1988、前掲; Baichwal and Sugden、1986、前掲; Couparら、1988; Horwichら、(1990) J.Virol., 64:642～650頁)。

ポリペプチドの製造方法
一部の実施形態では、ポリペプチド(例えば、NP-011)をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。本明細書に開示されるように、宿主細胞を培地中で培養して、ポリペプチドを生成することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、培地中に分泌される。ポリペプチドは、任意の適切な技術を用いて培地から単離することができる。

形質転換宿主細胞によって産生される本発明のポリペプチド(例えば、NP-011)は、任意の適切な方法に従って精製することができる。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度、又はタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術が含まれる。アフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザ外皮配列及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼをタンパク質に結合させて、適切なアフィニティーカラム上を通過することにより容易に精製することができる。ポリペプチドはまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びX線結晶解析などの技術を用いて物理的に特徴付けることができる。

例えば、培地中にポリペプチドを分泌する系からの上清は、最初に、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮することができる。濃縮工程の後、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はタンパク質精製に一般的に使用される他のタイプであり得る。あるいは、カチオン又はアニオン交換工程を用いることができる。適切なカチオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。最後に、疎水性RP-HPLC媒体、例えばペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する1つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)工程を用いて、ポリペプチドをさらに精製することができる。

細胞培養物中で産生されたポリペプチドは、例えば、細胞ペレットからの初期抽出、続く、1つ以上の濃度、塩析、水性イオン交換、又はサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離することができる。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製工程に用いることができる。組換えタンパク質の発現に使用される細胞は、凍結-解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な方法によって破壊することができる。

「単離された」若しくは「精製された」タンパク質又はその生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する細胞又は組織源由来の細胞材料又は他の汚染タンパク質を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、タンパク質が単離され又は組換え的に生成される細胞の細胞成分から分離されるタンパク質の調製物を含む。したがって、実質的に細胞物質を含まないタンパク質は、約30%、20%、10%、又は5%未満(乾燥重量)の異種タンパク質(本明細書では「汚染タンパク質」とも呼ばれる)を有するタンパク質の調製物を含む。タンパク質又はその生物学的に活性な部分が組換え的に生成される場合、それはまた、好ましくは、培地を実質的に含まない、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約20%、10%、又は5%未満の体積を表す。タンパク質が化学合成によって生成される場合、それは、好ましくは、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、タンパク質のこのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学的前駆体又は化合物の約30%、20%、10%、5%未満(乾燥重量)を有する。

医薬組成物
別の態様では、本発明は、1つ以上の薬学的に許容される担体(添加剤)及び/又は希釈剤とともに製剤化された、治療有効量の本明細書に開示されるポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明に包含される本発明の精製剤と薬学的に許容されるビヒクル(例えば、担体又は賦形剤)とを組み合わせることによって、保存及び使用のために特異的に製剤化することができる。当業者は、一般的に、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び/又は安定化剤を、製剤又は医薬組成物の不活性成分であるとみなす。

適切な薬学的に許容されるビヒクルには、限定されないが、非毒性緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸;塩、例えば、塩化ナトリウム;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン;保存剤、例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼンメトニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール又はベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾール;低分子量ポリペプチド(例えば、約10個未満のアミノ酸残基);タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン;炭水化物、例えば単糖、二糖、グルコース、マンノース、又はデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム; 金属錯体、例えばZn-タンパク質複合体; 非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN(登録商標)又はポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版、2012、Pharmaceutical Press、London)。インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。

薬学的に許容される担体の例としては、(1)糖、例えばラクトース、グルコース及びスクロース;(2)スターチ、例えばコーンスターチ及びポテトスターチ;(3)セルロース、及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース;(4)粉末トラガカント;(5)モルト;(6)ゼラチン;(7)タルク;(8)賦形剤、例えばカカオバター及び坐剤ワックス;(9)油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油及び大豆油;(10)グリコール、例えばプロピレングリコール;(11)ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール;(12)エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル;(13)寒天;(14)緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム;(15)アルギン酸;(16)発熱物質を含まない水;(17)等張食塩水;(18)リンゲル液;(19)エチルアルコール;(20)リン酸緩衝液;並びに(21)医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。

薬学的に許容される塩は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の一部であり得る。塩は、製剤に比較的非毒性の無機酸及び有機酸の添加であり得る。塩は、精製の任意の段階(精製後を含む)でポリペプチドに添加することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが含まれる(例えば、Bergeら、(1977)「Pharmaceutical Salts」、J. Pharm. Sci. 66:1～19頁を参照されたい)。

湿潤剤、エマルジョン及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに放出(遊離)剤、保存剤及び抗酸化剤もまた組成物中に存在させることができる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、(1)水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、(2)油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロールなど、並びに(3)金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。

非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再構成することができ、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質を含み、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にさせるか、又は懸濁化剤若しくは増粘剤を含むことができる、1つ以上の薬学的に許容される無菌の等張性水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液若しくはエマルジョン、又は無菌粉末を含むことができる。

微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含有することによって確実にすることができる。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含むことが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの含有によってもたらすことができる。

ある種の実施形態では、医薬製剤は、リポソームと複合体化されたポリペプチドを含む。リポソームを製造する方法は当業者に公知である。例えば、一部のリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するために、所定の孔径のフィルターを通して押し出され得る。

ある種の実施形態では、本発明のポリペプチドを含む徐放性製剤を製造することができる。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは成形品(例えば、フィルム又はマイクロカプセル)の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル、例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド、L-グルタミン酸と7エチル-L-グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸共重合体、例えばLUPRON DEPOT(乳酸-グリコール酸共重合体と酢酸リュープロリドで構成される注射用ミクロスフェア)、酢酸イソ酪酸スクロース、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。

本明細書に記載される組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内などの任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注射には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。さらに、組成物は、パルス注入によって適切に投与することができる。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、望ましい生物学的活性、例えば生物学的利用能の増加及びタンパク質分解の減少をさらに増強するために、当該技術分野において周知の薬理学的方法(例えば、PEG化、グリコシル化、オリゴマー化など)に従ってコンジュゲート又は修飾することができる。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、凍結乾燥され、及び/又は凍結乾燥形態で保存される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを含む製剤は凍結乾燥される。

キット
「キット」は、本発明の少なくとも1つの組成物、例えば、ポリペプチドを含む任意の製造物(例えば、パッケージ又は容器)である。キットはまた、追加の希釈剤を含み得る。キットは、凝集体を除去するために凍結乾燥組成物及び/又は濾過ユニットを再懸濁するのに必要な1つ以上の薬剤を含み得る。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、促進、分配、又は販売することができる。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現するのに必要な1つ以上の試薬を含み得る。キット内の試薬は、個々の容器内に、又は単一容器内の2つ以上の試薬の混合物として提供することができる。さらに、キット内での組成物の使用を記述する資料を含むことができる。

配列
用語「配列同一性又は相同性」とは、2つのポリペプチド分子間又は2つの核酸分子間の配列類似性を指す。2つの比較された配列の両方の位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば、2つのDNA分子の各々の位置がアデニンによって占有されている場合、分子は、その位置で相同又は配列同一である。2つの配列間の相同性又は配列同一性のパーセントは、2つの配列で共有された一致又は相同な位置の数を、比較された位置の数で割り、×100とする関数である。例えば、2つの配列中の6/10の位置が同じである場合、2つの配列は60%の相同性を有するか又は60%の配列同一性を有する。例として、DNA配列ATTGCC及びTATGGCは、50%の相同性又は配列同一性を共有する。一般的に、2つの配列を整列させて最大の相同性を与える場合に比較が行われる。別段の指定がない限り、「ループアウト領域」、例えば、配列の1つにおける欠失又は挿入から生じるものは、ミスマッチとしてカウントされる。配列の比較、及び2つの配列間の相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。

集団中に存在し得る本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、配列変化が突然変異によって導入され得、それによってコードされるタンパク質の生物学的活性を改変させることなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることをさらに認識する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を作製することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変させることなく、野生型配列から改変させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要である。例えば、種々の種の相同体の間で保存されていないか、又は半保存のみであるアミノ酸残基は、活性に必須ではなく、したがって、改変の標的となり得る。あるいは、種々の種(例えば、マウス及びヒト)の相同体の間で保存されるアミノ酸残基は、活性に必須であり、したがって、改変のための標的とはなり得ない。

したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このようなポリペプチドは、本発明のマーカーに対応する天然に存在するタンパク質とアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性をなおも保持する。一実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約40%同一、50%、60%、70%、75%、80%、83%、85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を有する。

核酸変異体は、コード領域、非コード領域、又はその両方における改変を含み得る。一部の実施形態では、核酸変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を改変させない改変を含む。一部の実施形態では、核酸変異体は、遺伝暗号の縮重によるサイレント置換によって生成される。核酸変異体は、種々の理由、例えば、特定の宿主のためのコドン発現を最適化する(ヒトmRNA中のコドンを細菌宿主、例えば大腸菌によって好まれるコドンに変化させる)ために生成され得る。本明細書に記載される核酸を含むベクター及び細胞もまた提供される。

変異体タンパク質をコードする単離された核酸分子は、1つ以上のアミノ酸残基の置換、付加、又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、本発明の核酸のヌクレオチド配列に1つ以上のヌクレオチドの置換、付加、又は欠失を導入することによって作製することができる。突然変異は、標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、荷電していない極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。あるいは、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発により、コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされたタンパク質を組換え的に発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。

非保存的置換には、(a)正電荷残基を有する残基(例えば、Arg、His、又はLys)が負電荷残基(例えば、Glu又はAsp)に又はそれによって置換され、(b)親水性残基(例えば、Ser又はThr)が疎水性残基(例えば、Ala、Leu、Ile、Phe、又はVal)に又はそれによって置換され、(c)Cys又はProが他の残基に又はそれによって置換され、あるいは(d)かさ高い疎水性又は芳香族側鎖を有する残基(例えば、Val、His、Ile、又はTrp)がより小さな側鎖を有するもの(例えば、Ala又はSer)に又はそれによって置換される置換が含まれる。

他の置換は容易に同定することができる。例えば、アミノ酸アラニンについて、置換は、D-Ala、Gly、ベータ-Ala、L-Cys、及びD-Cysのいずれか1つから行うことができる。リシンについては、置換は、D-Lys、Arg、D-Arg、ホモ-Arg、Met、D-Met、オルニチン、又はD-オルニチンのいずれか1つであり得る。一般的に、単離されたポリペプチドの特性に変化を誘発することが予想される機能的に重要な領域における置換は、(a)極性残基(例えば、Ser又はThr)が疎水性残基(例えば、Leu、Ile、Phe、又はAla)に(又はそれによって)置換される置換、(b)Cys残基が任意の他の残基に(又はそれによって)置換される置換、(c)正電荷側鎖(例えば、Lys、Arg、又はHis)を有する残基が負電荷側鎖(例えば、Glu又はAsp)を有する残基に(又はそれによって)置換される置換、あるいは(d)かさ高い側鎖を有する残基(例えば、Phe)がこのような側鎖を有しないもの(例えば、Gly)に(又はそれによって)置換される置換である。上述の非保存的置換の1つがタンパク質の機能的特性を改変させ得る可能性はまた、タンパク質の機能的に重要な領域に関する置換の位置にも相関する。したがって、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性にほとんど又は全く影響を及ぼさないことがある。

特定のタンパク質のアミノ酸配列と、そのタンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列の間には、遺伝暗号(下記に示される)によって定義されるように公知であり、明確な対応関係がある。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、その核酸によってコードされるアミノ酸配列の間には、遺伝暗号によって定義されるように公知であり、明確な対応関係がある。

遺伝暗号
アラニン(Ala、A) GCA、GCC、GCG、GCT
アルギニン(Arg、R) AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT
アスパラギン(Asn、N) AAC、AAT
アスパラギン酸(Asp、D) GAC、GAT
システイン(Cys、C) TGC、TGT
グルタミン酸(Glu、E) GAA、GAG
グルタミン(Gln、Q) CAA、CAG
グリシン(Gly、G) GGA、GGC、GGG、GGT
ヒスチジン(His、H) CAC、CAT
イソロイシン(Ile、I) ATA、ATC、ATT
ロイシン(Leu、L) CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG
リジン(Lys、K) AAA、AAG
メチオニン(Met、M) ATG
フェニルアラニン(Phe、F) TTC、TTT
プロリン(Pro、P) CCA、CCC、CCG、CCT
セリン(Ser、S) AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT
スレオニン(Thr、T) ACA、ACC、ACG、ACT
トリプトファン(Trp、W) TGG
チロシン(Tyr、Y) TAC、TAT
バリン(Val、V) GTA、GTC、GTG、GTT
終結シグナル(終止) TAA、TAG、TGA

遺伝暗号の重要であり、周知の特徴は、その縮重性であり、それによって、タンパク質を作るために使用されるほとんどのアミノ酸について、1を超えるコードヌクレオチドトリプレットが使用され得る(上述)。したがって、多数の異なるヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列をコードし得る。このようなヌクレオチド配列は、すべての生物において同じアミノ酸配列の生成をもたらすため、機能的に同等であると考えられる(ある種の生物は、いくつかの配列を翻訳するが、それらが他の配列よりも効率的に翻訳し得る)。さらに、時には、プリン又はピリミジンのメチル化された変異体が、所定のヌクレオチド配列中に見出され得る。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと、対応するアミノ酸の間のコード関係に影響を及ぼさない。

前述の観点から、本発明のポリペプチドをコードするDNA又はRNAのヌクレオチド配列(又はそのいずれかの部分)を使用して、DNA又はRNAをアミノ酸配列に翻訳するための遺伝暗号を用いて、融合タンパク質又はポリペプチドアミノ酸配列を誘導することができる。同様に、ポリペプチドアミノ酸配列については、融合タンパク質又はポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列を遺伝暗号から推定することができる(その縮重のために、任意の所定のアミノ酸配列について複数の核酸配列を生成する)。したがって、融合タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書中の記載及び/又は開示は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記載及び/又は開示も含むと考えられるべきである。同様に、本明細書中の融合タンパク質又はポリペプチドアミノ酸配列の記載及び/又は開示は、アミノ酸配列をコードし得る全ての可能なヌクレオチド配列の記載及び/又は開示も含むと考えられるべきである。

最後に、本発明において有用な核酸及びポリペプチド分子のための核酸及びアミノ酸配列情報は、当該技術分野において周知であり、公的に利用可能なデータベース、例えばNational Center for Biotechnology Information(NCBI)で容易に入手可能である。例えば、公的に利用可能な配列データベースから誘導された例示的な核酸配列及びアミノ酸配列は、下記の表1に提供される。

別段の指示がない限り、本開示の実施は、当業者の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来技術を使用する。

以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。

[実施例]
特定の実施形態の前述の記載は、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、当業者の範囲内の知識を適用することにより、過度の実験なしに、このような特定の実施形態を容易に修飾し、及び/又は種々の用途に適合させることができる、本開示の一般的な性質を十分に明らかにする。したがって、このような適合及び修飾は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、開示された実施形態の同等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書中の言い回し又は用語は、説明の目的であり、限定の目的ではないことを理解されたい。したがって、本明細書の用語又は言い回しは、教示及びガイダンスに照らして当業者によって解釈されるべきである。

本開示の幅及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの同等物に従ってのみ定義されるべきである。

本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び/又は他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願、及び/又は他の文献の各々が、全ての目的のために参照により組み込まれることが示されているのと同じ範囲で、全ての目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。

[実施例1]
材料及び方法
げっ歯類線維症モデル誘発及びNP-011の有効性試験
MFG-E8の種々の誘導体(NP-011、NP-012、及びNP-013)及び全長タンパク質MFG-E8の有効性を比較するために、200mg/kgのTAA(チオアセタミド、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA)を5～6週齢の雄C57BL/6マウス(各群n=4、3回/週、8週間)に投与し、各160μg/kgのタンパク質を腹腔内に投与した。分析のために、タンパク質の投与後3日目にマウスを屠殺した。種々の用量のNP-011(20μg/kg～160μg/kg、各群n=5)を、同TAA誘発性肝線維症モデルにおいてさらに試験した。NP-011の複数回投与の抗線維化作用を試験するために、TAAを12週間マウスに注射し、次に、40μg/kgのNP-011をTAA誘発性肝線維症モデルに5日間隔で1～6回腹腔内投与した(各群n=4)。進行性肝線維症モデルでは、TAAを4週間マウスに注射し、次に、40μg/kgのNP-011及びTAAを、別の4週間、週3回、マウスに腹腔内に同時投与した(各群n=5)。全ての動物実験において、マウスは最後のNP-011投与の3日後に屠殺され、全ての実験手順は韓国大学の動物実験使用委員会(KOREA-2016-0254)により承認された。

DMN誘発性肝硬変モデル誘導及びNP-011の有効性試験
肝硬変の動物モデルを設計し、National Center of Efficacy Evaluation for the Development of Health Products Targeting Digestive Disorders (NCEED、Incheon、Korea)により行った。6週齢の雄Sprague-Dawleyラット(Orient Bio、Gapyeong、Korea)を用いて、ジメチルニトロソアミン(生理食塩水中のDMN、10mg/ml/kg)を6週間にわたって毎週3日連続して腹腔内注射することにより、肝硬変を誘発した。群間の体重偏差を最小にするために、実験の最初の日と3週目に、ラットを無作為に7つの群:G1(ビヒクル対照、n=10)、G2(線維症対照、n=12)、G3(NP-011処置、週1回、n=10)、G4(NP-011処置、週2回、n=10)、G5(NP-011処置、週3回、n=10)、及びG6(NP-011処置、毎日、n=10)に2回分けた。NP-011の投与は、静脈内に40μg/kgで静脈(G3-G6)を用いて第3週から開始された。一般状態を毎日観察し、体重を週2回測定した。第6週の終わりに、生存ラットの全群を剖検のために屠殺し、各群の生存率を計算した。ラットをイソフルランで麻酔し、血液試料及び主要臓器を回収した。10%中性緩衝ホルマリン溶液中で肝組織を固定した後、組織学的評価及び免疫組織化学をヘマトキシリン及びエオシン染色及びPostBio Inc.(Guri、Korea)のα-平滑筋アクチン抗体を用いて行った。

MCD食餌で誘発したNASHマウス
6週齢の雄C57BL/6マウスに標準食又はメチオニン及びコリン欠乏(MCD)食餌を10週間与えた。動物の取扱い及びケアに用いる手順は、韓国大学動物実験委員会(KUIACUC-2018-3)の承認を得た。5週間後、マウスにMCD食餌でさらに5週間、生理食塩水又はNP-011(20μg、40μg、80μg、又は160μg/kg体重、週1回、n=5)を腹腔内に注射した。実験期間中、体重を週1回測定した。

免疫蛍光アッセイ
肝組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で固定し、勾配エタノールシリーズ中で脱水した。次に、組織をキシレン中で除去し、パラフィン中に包埋した。パラフィン包埋した組織切片をシリウスレッド(American MasterTech Scientific、Lodi、CA、USA)で染色し、肝線維症の評価を行った。免疫蛍光染色のために、切片組織をクエン酸で抗原回収を行い、10%ロバ血清含有PBSでブロッキングした組織を、α-平滑筋アクチン(α-SMA)又はアルブミン(ALB)に対する一次抗体で4℃にて一晩プロービングした。染色の可視化のために、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で切片を洗浄し、蛍光標識した二次抗体(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、Carlsbad、CA、USA)で染色した。デジタル画像は顕微鏡(Nikon、Tokyo、Japan)を用いて撮像し、ImageJソフトウェアを用いて分析した。

組織病理学的分析及びNASスコア
標準的な手順に従って、肝組織を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。肝臓病変の組織学的スコアリングは、げっ歯類NAFLDの評価システムによって評価された(1):大滴性脂肪変性(0～3)、小滴性脂肪変性(0～3)、肥大(0～3)、炎症巣数/視野(0～3)。無作為に抽出した5つの画像のすべての細胞を各組織学的特徴についてカウントし、計算した。オイルレッドO染色では、OCT包埋した凍結肝臓を4μmで切片化し、オイルレッドO染色キット(Lifeline cell technology、Frederick、MD、USA、Cat.LL-0052)で染色した。Image JでオイルレッドO染色面積を測定し、凍結切片の免疫染色では、OCT包埋した凍結肝を4μmで切片化し、スライドを透過化し、0.1%Triton X-100及び10%ロバ血清でマスキングした。肝切片を表2で特定した一次抗体及び二次抗体とともにインキュベートした。

TGF-βルシフェラーゼシグナル伝達レポーターアッセイ
ルシフェラーゼシグナル伝達レポーターアレイは、製造業者のプロトコール(Qiagen、Hilden、Germany)に従って行われた。全トランスクリプトーム分析のための詳細な方法を補足の材料及び方法に記載した。

マウス肝臓の全トランスクリプトーム解析
正常マウス肝臓(n=3)、TAA誘発性線維性肝臓(n=3)、及びNP-011投与された肝臓(n=3)を冷Trizol(Sigma、USA)中でホモジナイズし、次世代シークエンシング(NGS)分析をBGI Tech Solutions(Hong Kong)によって行った。遺伝子集合増幅分析(GSEA)をGSEAv17(Broad Institute、Cambridge、MA、USA)を用いて行った。全トランスクリプトーム分析のための詳細な方法を補足の材料及び方法に記載した。

定量的逆転写PCR(RT-qPCR)
定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、iQ(商標) SYBR(登録商標) Green Supermix(Bio-Rad)によるCFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad、Hercules、CA、USA)を用いて行われた。使用した特異的プライマーを表3に示す。mRNAレベルは、GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)レベルに正規化された。

細胞培養及び試薬
ヒト肝星細胞(HSC)株hTERT-HSCは、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco/Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)、100U/mLペニシリン、及び100mg/mLストレプトマイシン(Gibco)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、GE Healthcare Life Sciences、Marlborough、MA、USA)中で培養された。ヒトHEK-293FT細胞は、Prof. Hyunggee Kim(韓国大学)から好意的に提供され、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco、NY、USA)、100U/mLペニシリン及び100mg/mLストレプトマイシン(Gibco)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、GE Healthcare Life Sciences、Marlborough、MA、USA)中で培養された。

ウエスタンブロット及び免疫沈降(IP)分析
タンパク質試料は、プロテイナーゼ阻害剤(Roche、Basel、Switzerland)を含有するRIPA溶解緩衝液(LPS溶液)中でHSCを可溶化することによって調製された。細胞からの合計40μgのタンパク質をSDS-PAGE(Bio-Rad)によって分離し、PVDF転写膜(Pall Corporation, Port Washington、NY、USA)に転写した。膜は、TBS-T(10mM Tris-HCl pH7.9、150mM NaCl、及び0.05%Tween(登録商標)-20)中の5%スキムミルクとともに60分間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロッキングした。ブロッキング後、膜を一次抗体で一晩、4℃でイムノブロットした。本研究で使用した抗体を表2に示す。免疫沈降(IP)分析では、合計400μgのタンパク質を、プロテインA/Gセファロースビーズ(Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Dallas、TX、USA)にコンジュゲートさせた1μgのTGFβRI抗体とともに4℃で12時間インキュベートし、溶解緩衝液中で洗浄し、次に、SDS-PAGEゲル上で分離した。ウエスタンブロット及びIP分析における各バンドを検出するために、膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をコンジュゲートした二次抗体(Thermo Fisher Scientific)とともに室温で2時間インキュベートした。TBS-Tでリンスした後、化学発光イメージングシステム(GE Healthcare Life Sciences)を用いてバンドを検出するために、Pierce(商標) ECLウエスタンブロッティング基質(Thermo Fisher Scientific)を使用して膜を発色させた。

3Dヒト肝線維症モデルにおけるNP-011の有効性試験
ヒト肝線維症モデルを確立するために、肝スフェロイドは細胞密度比がそれぞれ2対1の超低接着96ウェルプレート(Corning)において、肝細胞(Hepatosight-S(登録商標)、NEXEL、Seoul、South Korea)とhTert-HSC(Dr. David Brenner、University of California at San Diego、Ca、USAから好意的に提供された)の混合物によって形成された。肝スフェロイドを21日間培養し、50mMのアセトアミノフェン(APAP)を処理して線維症を誘発した。APAP誘発性3D肝線維症モデルに対するNP-011の有効性を試験するために、500ng/mlのNP-011を48時間処理した。

HSC活性化に関するインビトロ試験
TGF-β1媒介性HSC活性化におけるNP-011の効果を調べるために、ヒトHSC株(hTERT-HSC)を血清の存在下で増殖させ、TGF-β1処理の24時間前に0.2%FBSを含むDMEM中で飢餓状態にした。血清欠乏HSCを10ng/mLのTGF-β1で1時間前処理し、HSCを100～1500ng/mLのNP-011に6時間曝露した。HSC中のインテグリンavβ3/β5を遮断するために、HSCを1μMのCT(Selleck Chemicals、Houston、TX、USA)で2時間前処理した後、TGF-β1で処理した。HSCの活性化及び不活性化は、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)アッセイにより定量的に決定した。

近接ライゲーションアッセイ(PLA)
PLA取り込みアッセイでは、12ウェルプレート中の18mm円形カバーガラス上に、1ウェルあたり2×10⁴細胞でヒトHSCを播種し、24時間培養した。24時間の血清飢餓後、細胞を10ng/mlのTGF-β1及び/又は500ng/mlのNP-011で処理し、次に、さらに30分間インキュベートした。製造者の指示に従って、Duolink In Situ Red Starter Kit (Merck)を使用してPLAの取り込みを評価した。PLA陽性細胞のデジタル画像を顕微鏡(ニコン)を用いて捕獲し、ImageJソフトウェア<https://imagej.nih.gov/ij/>を用いて分析した。

EdU取り込みアッセイ
EdU取り込みアッセイでは、12ウェルプレート中で1ウェルあたり2×10⁴細胞でヒトHSCを播種し、24時間培養した。TGF-β1及び/又はNP-011で処理した後、血清欠乏HSCをEdU(10μM)とともにさらに6時間インキュベートし、製造業者の指示に従って、Click-iT EdUイメージングキット(Thermo Fisher Scientific)を用いてEdU取り込みを評価した。EdU陽性細胞のデジタル画像を顕微鏡(Nikon)を用いて捕捉し、ImageJソフトウェアを用いて分析した。

コラゲナーゼ活性アッセイ
コラゲナーゼ活性アッセイは、製造業者のプロトコール(Chondrex、WA、USA)に従って行われた。酵素源を180μlの溶液Bと混合した。200μlの1.0mg/mLのFITC標識されたウシコラーゲンI基質と混合し、次に37℃で1時間インキュベートすることにより酵素反応を開始した。陰性対照については、酵素反応は、コラーゲン基質又は酵素源なしで行われた。酵素反応を停止させるために、10μlの10mM o-フェナントロリン及び10μlの38.5μMエラスターゼを各試料に添加し、その後、37℃で10分間インキュベートした。最後に、抽出緩衝液の400μlアリコートを反応溶液と十分に混合し、次に、10,000rpmで5分間遠心分離した。上清(200μl)を用いて、黒色96ウェルプレートにおける490nm励起中に分光蛍光度計を用いて520nmでのFL強度を測定した。

THP-1分化及び蛍光ビーズ食作用アッセイ
THP-1細胞をATCCから購入し、10%の熱不活化ウシ胎児血清(Gibco、16000-044)及び50μMのβ-メルカプトエタノールを含有するRPMI-1640(Gibco、31800-022)中、37℃、5%CO₂インキュベーター中で培養した。THP-1細胞は、48時間、200ng/mlのホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA、Sigma、P8139)、続いてPMA不含培地中で72時間を用いてマクロファージに分化された。食作用試験では、THP-1細胞を1.05×10⁵細胞/cm²で播種した。カルボキシレート修飾されたミクロスフェア、2.0μm、黄緑色蛍光ビーズ(Invitrogen、F8827)をTHP-1細胞培養培地中で洗浄し、無血清RPMI-1640中で1:500の最終希釈で再懸濁した。細胞を蛍光ビーズとともに4時間、37℃、5%CO₂インキュベーター中でインキュベートした。細胞をTrypLE(Gibco、12604-021)で分離し、フローサイトメトリー(Accuri C6 Plus)により測定した。

生体内分布試験
6週齢の雄C57BL/6マウスを、対照群(生理食塩水)とNP-011処置群(生理食塩水中のNP-011、160μg/kg体重)の2群に無作為に割り付け、各時間点で3匹の動物を用いた。マウスに静脈内注射し、異なる時間点で維持した。マウスをCO₂吸入により屠殺し、臓器(脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、及び脾臓)をPBS中に直接回収し、脂肪及び血中痕跡を除去した。臓器を直ちに-80℃で保存した。動物の取扱い及びケアに用いる手順は、韓国大学動物実験委員会(KUIACUC-2018-0027及びKUIACUC-2018-0040)の承認を得た。全臓器は、cOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich Cat.11697498001)を用いて4℃でLysis緩衝液(RayBiotech、Norcross、GA、USA、Cat.EL-LYSIS)によりホモジナイズされた。ホモジナイズ後、試料を13,000rpm、4℃で20分間遠心分離し、上清をELISA分析用に回収した。Bio-Rad Bradfordを用いて、各試料のタンパク質濃度を計算した。NP-011を検出するために、ヒトMFG-E8 Quantikine ELISAキット(R&D. Cat.DFGE80)を製造者の指示に従って行った。結果は、SpectraMax(登録商標)iD3(Molecular Devices. San Jose、CA、USA)により450nm、540nm及び570nmで測定した。

28日間の反復投薬慢性毒性試験
NP-011の4週間の反復毒性試験はChemOn Inc.(非臨床CRO会社、Korea、Gyeonggi-DO)が実施した。合計30匹のSDラット(15匹の雄及び15匹の雌、6週齢)を無作為に3群、G1(ビヒクル対照)、G2(NP-011 0.2mg/kg、毎日)、及びG3(NP-011 2.2mg/kg、毎日)に分け、各々、群あたり5匹の雄ラット及び5匹の雌ラットであった。ビヒクル及びNP-011は、ラットの尾静脈を介して投与された。全群において、試験開始前と試験期間中の毎週1回、体重、摂餌量及び摂水量を測定した。試験終了後、全ラットを屠殺し、眼科、尿、血液学、生化学、及び組織病理学の検査のために採血した。組織病理学的評価は、すべての主要な臓器及び領域(脳、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、骨髄-胸骨、注射部位、精巣/子宮、及び胸腺)で行われた。

統計解析
数値は、インビトロ試験のために3回反復して行った少なくとも3回の独立した実験の平均値±SEMで表した。インビボでのNP-011の抗線維化作用を評価するために、各実験において、1群あたり少なくとも3匹の動物を使用し、指示されない限り、2～3回の独立した実験からデータを得た。総画像面積のシリウスレッド染色又は免疫染色の陽性領域のパーセンテージをImageJソフトウェアを用いて測定し、任意に1として設定した正常肝臓又は対照細胞培養物におけるものと比較した相対値で表した。スチューデントt検定を用いて、対応する群間の差の統計的有意性を分析した。一元配置分散分析(ANOVA)を用いて、複数群(2群を超える)間の差の統計的有意性を検定した。データは平均値と95%信頼区間(CI)で表した。統計学的検定はすべて両側検定であり、P<0.05又はP<0.01のデータは統計学的に有意であると仮定した。

[実施例2]
NP-011は肝線維症を阻害する
ヒトMFG-E8は3つのドメイン:N末端のシグナルペプチド、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)モチーフを有する上皮細胞増殖因子(EGF)様ドメイン、及びCドメイン(C1及びC2)を含む。MFG-E8が免疫細胞へのRGDモチーフ媒介結合及びホスファチジルセリン(PS)発現アポトーシス細胞の飲み込みにより炎症反応を調節することは周知であるが、MFG-E8が抗線維化作用にどのように関与しているかは不明である。最近の報告は、MFG-E8のC2ドメインがアポトーシス細胞においてPSを認識する際に重要な役割を果たすことを示し、C2ドメインがその抗線維化作用を含むMFG-E8の全般的な機能にとって重要であり得ることを示唆した。これを試験するために、細胞結合のためのRGDモチーフを維持するために、EGFドメインとともに2つの異なる切断型MFG-E8(NP-011:EGF-C1ドメイン及びNP-012:EGF-C2ドメイン)を本実施例において合成した。対照として、全長MFG-E8(NP-013)もまた合成した。

チオアセトアミド(TAA)誘発性肝線維症マウスモデル(図1A)におけるその後の有効性試験は、市販のMFG-E8又はNP-013の投与が線維化領域(シリウスレッド染色領域、図1B及び図1C)を効果的に低減させ、肝線維症関連遺伝子(Col1a1、Col1a2及びActa2)の発現レベルを下方制御することを明らかにした(図1D)。しかしながら、NP-011の投与は、MFG-E8及びNP-013の投与よりも、線維化領域を実質的に除去し、損傷肝臓における線維化遺伝子の発現レベルを有意に下方制御したことは、説得力がある(図1B～図1C)。これは驚くべきことであり、それは、NP-011が、MFG-E8の抗線維化作用を含む、MFG-E8の機能に重要であると考えられていたC2ドメインを欠失しているためである。NP-011の強力な有効性とは異なり、NP-012の投与は、MFG-E8及びNP-013よりも線維化領域を低減させる効果が低く(図1B及び図1C)、損傷肝臓におけるActa2(アルファ平滑筋アクチン、α-SMA)の発現を有意に上方制御した(図1D)。シグナル伝達レポーターアッセイは、NP-011が30分以内にTGF-βシグナル伝達を急速に抑制するのに対し、MFG-E8は処置2時間後にTGF-βシグナル伝達を抑制し得ることを明らかにした(図1E)。GSEAはさらに、NP-011の投与が損傷肝臓の全トランスクリプトーム分析においてNotchシグナル伝達を有意に増強することを同定した(図1F)。これは損傷肝臓の再生過程と関連する(15)。これらの結果は、MFG-E8のC2ドメインの欠失が、全長タンパク質と比較して、予想外に強力な抗線維化作用をもたらすことを示す。

[実施例3]
NP-011は最小用量で肝線維症を有意に逆転させる
NP-011の有効投薬量を検討するために、TAA誘発性肝線維症モデルにおいて、NP-011の異なる用量(20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、及び160μg/kg)を投与し、NP-011投与3日後に線維化因子を分析した(図2A)。TAAの投与は、マウス肝臓における線維化領域を有意に増加させた(図2B及び図2C、シャム)。シャム処置された肝組織とは対照的に、20～160μg/kgの範囲のNP-011投与群は全て線維化領域が顕著に減少した(図2B及び図2C)。線維症の減少と一致して、重要な線維症マーカーであるActa2(HSCから分化した筋線維芽細胞様細胞のマーカーであるα-SMA)、及び他の線維症関連遺伝子は、NP-011投与後、mRNAとタンパク質のレベルの両方で顕著に及び有意に下方制御された(図2D及び図2E)。注目すべきは、40μg/kgより高い用量の投与は、わずかな個体差を伴うTGF-β mRNA発現の安定な及び顕著な抑制をもたらしたことである(図2F)。まとめると、これらの結果は、NP-011が低い投薬量範囲で大きな治療効果を示すことを意味し、最も効果的には、NP-011の40μg/kgの投与が最小有効量であり、損傷肝臓におけるTGF-β発現の一定の低減をもたらす可能性がある。

[実施例4]
NP-011の最低用量は線維症に関連する異なるモデルにおいて治療効果を示す
NP-011の最小有効量(40μg/kg)は、異なる肝線維症モデルでさらに試験された。第一に、NP-011の反復投与の有効性を肝線維症の慢性モデルで試験した。このため、TAA注射を8～12週間(週3回)に延長し、その後40μg/kgのNP-011を5日間隔でマウスに1～6回投与した(図3A)。TAA注射を30日前に中止したにもかかわらず、12週間のTAA注射は肝臓における持続性線維化領域の発生をもたらし、その後、マウスを屠殺した(図3B、シャム)。対照的に、NP-011の投与は損傷肝臓の線維化領域を有意に消失させ、線維化の退縮は投与時間と正の相関を示した(図3B)。

肝線維症は進行性疾患であり、したがって、進行性肝線維症におけるNP-011の有効性の評価は、動物研究の臨床領域へのより良好な換算を提供するであろう。進行性肝線維症におけるNP-011の治療効果を確認するため、NP-011(40μg/kg、週3回)をTAAと併用し、モデル誘導の最終4週間投与した(図3C)。予想通り、TAAとNP-011の同時投与は、TAAのみを受けた肝臓と比較して、肝臓の線維化領域を顕著に減少させた(図3D)。また、本発明者らは、APAP誘発したインビトロのヒト線維症モデルを用いて、NP-011が、肝細胞及び肝星細胞からなる3D肝スフェロイドにおいてAPAP誘発性HSC活性化を有意に低減させることを見出した(図3E)。

NP-011の有効性は、ジメチルニトロソアミン(DMN)誘発性肝硬変モデルにおいてさらに試験された(図4A)(16)。ラットにDMNを6週間注射したところ、75%の致死率が得られ、肝臓に重度の線維化が認められた(図4B及び図4C)。組織病理学的分析は、DMN誘発性肝硬変モデルの肝臓で有意な壊死性(ピースミール及び小葉性)及び線維性イベントが発生することが示された(図4D)。重要なことに、NP-011を毎日投与すると、動物の致死率が50%まで低下し、肝線維症が顕著に軽減し(図4B及び図4C)、断片壊死(約20%)、小葉壊死(約30%)、線維症スコア(約24.3%)、及びHSC活性化(約17.7%)も減少した(図4D)。

最後に、メチオニン-コリン欠乏(MCD)食餌誘発したNASHモデルにおけるNP-011の有効性を評価した(図5A)。種々の研究で報告されているように、MCD食餌は肝臓に脂肪蓄積をもたらしたが、NP-011の投与は、試験した全用量で脂肪蓄積を有意に低減させた(図5B及びC)。さらに、NP-011投与後、大滴/小滴性脂肪症及び肥大の有意な減少が観察された(図5D)。まとめると、NP-011は、重度肝線維症だけでなく、最低用量でNASHにおいても治療効果を示した。

[実施例5]
NP-011は、損傷肝臓における肝星細胞(HSCS)及びマクロファージとの相互作用により肝線維症を消失させる。
本実施例では、疾患肝臓で観察されたNP-011の迅速であり、効果的な抑制TGF-βシグナル伝達に対する作用機序を検討した(図1E及び2F)。TAA誘発性線維性肝臓におけるNP-011の投与1日後、NP-011はα-SMA陽性HSCに優先的に結合し、NP-011の一部は肝臓のマクロファージと相互作用した(図6)。HSC表面上のインテグリンαvβ3及びαvβ5は、線維症の調節に以前から関与している。さらに、インテグリンとTGF-βシグナル伝達の間のクロストークは、病的上皮から間葉移行(EMT)及び筋線維芽細胞分化の調節において重要である場合がある。近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、TGFBRIとインテグリンβ3/β5の間の直接的な物理的相互作用を明らかにし、HSCにおけるTGF-β1処理により相互作用はより強くなった(図7A及び図7B)。しかしながら、TGF-β1処理されたHSCにおけるNP-011処理は、TGFBRIとインテグリンβ3/β5の間の相互作用を有意に減少させた(図7A及び図7B)。ウエスタンブロット分析は、NP-011処理が、TGF-β1処理されたHSCにおけるTGF-βシグナル伝達の下流分子であるSmad2のリン酸化を有意に減弱させたことを示し、TGFBRIとインテグリンβ3/β5の間の相互作用が免疫沈降アッセイによってさらに確認された(図7C)。TGF-β1処理されたHSCにおけるNP-011処理の結果として、増殖性HSCは静止状態に戻った(図7D)。しかしながら、NP-011の存在下でインテグリンβ3/β5阻害剤を処理すると、TGF-β1処理されたHSCの増殖におけるNP-011の抑制的役割が破棄された(図7D)。したがって、これらの結果は、NP-011がインテグリンβ3/β5に直接結合し、TGFβRIとのその相互作用を妨げ、結果としてTGF-βカスケードの抑制及びHSC増殖の減少をもたらすことを示す。

HSCにおける線維化促進性MMP2の発現及びコラゲナーゼ活性におけるNP-011の効果は、ラットHSCにおける線維化促進性MMP2の分泌及びコラゲナーゼmRNAの発現を示す以前の知見に基づいてさらに試験された。HSCにおけるMMP2 mRNAの発現は、TGF-β1処理後のHSCで増加した。しかしながら、TGF-β1処理されたHSCにおけるNP-011処理は、MMP2の発現増加を有意に下方制御した(図8A)。対照的に、コラゲナーゼ活性は、TGF-β1処理後にHSCにおいて下方制御され、減少したコラゲナーゼ活性は、細胞溶解物と馴化培地の両方でNP-011処理後にTGF-β1処理されたHSCにおいて回復した(図8B及びC)。

免疫応答による蓄積したコラーゲンの除去は、肺線維症モデルで見られるように、線維症を解決するためのもう1つの重要な因子である。これを評価するために、PMA処理によりTHP-1単球をマクロファージに分化させ(図9A)、蛍光分析及びフローサイトメトリー分析により分化したマクロファージの食作用能を確認した(図9B及びC)。コラーゲン取り込みアッセイは、緑色蛍光標識コラーゲンが、対照培養物とは異なり、NP-011の存在下で分化したマクロファージによって有意に取り込まれることを明らかにした(図9D及びE)。実際、マクロファージによるコラーゲンの飲み込みは、TAA誘発性肝線維症モデルにおけるNP-011投与後のコラーゲン及びF4/80の免疫染色によって示された(図10、下段パネルの矢じり)。まとめると、これらの結果は、NP-011が損傷肝臓におけるTGF-βシグナル伝達を抑制し、活性HSCを不活性化し、マクロファージと相互作用することにより肝線維症を阻害し、消失させることを示す。

[実施例6]
NP-011の生物学的分布及び安全性プロファイル
NP-011の生体内分布及び安全性試験をげっ歯類モデルでさらに評価した。NP-011をマウスに静脈内投与した場合、投与されたNP-011は肝臓に優先的に送達され、投与されたNP-011の約48%及び58%が、それぞれ30分及び60分以内に肝臓において検出された(図11)。さらに、ラットに0.2mg/kg及び2mg/kgのNP-011を4週間毎日、静脈内投与した場合、雌雄ともに血液学的検査と血液生化学的検査において副作用は観察されなかった(図11)。したがって、これらの結果は、NP-011が投与後に肝臓を優先的に標的とし、優れた安全性プロフィールを有することを示す。

NP-011は、肝線維症を阻害、予防、及び逆転させる強力な抗線維化作用を示す。NP-011は、以下の理由で、C2ドメインを切断することにより、全長MFG-E8(ラクトアドヘリン)と比較して臨床応用に優れている:1)MFG-E8の構造的切断によりNP-011中のメディン部位が除去される。メディンは、60歳以上に発症する大動脈内側アミロイドであり、蓄積されたメディンは、アルツハイマー病と2型糖尿病に関与する。MFG-E8(ラクタドヘリン)はその成分にメディンを有し、C2ドメイン内に位置している。したがって、NP-011は、MFG-E8からのC2ドメインの構造的切断を介して、投与時に患者のアミロイド形成を誘導する懸念、並びに患者への反復投与時にアルツハイマー病及び糖尿病を引き起こす可能性のある副作用に対する懸念を排除する。最も一般的な肝疾患である非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は2型糖尿病と密接に関連しているため、肝疾患を治療するための重要な因子である。2)NP-011は、MFG-E8のグリコシル化部位を除去することにより、コラーゲンに対してより良好な結合親和性を示す。MFG-E8は、C2ドメイン内にグリコシル化部位を含む。C2ドメインを除去することにより、NP-011は、肝線維症において蓄積されたコラーゲンへのMFG-E8のジスコイジンドメイン(C1ドメイン)の結合を妨げる可能性のあるグリコシル化を有さない。周知のジスコイジンドメイン受容体(DDR)は、その構造において、ジスコイジンドメイン、ストーク領域、及び膜貫通ドメインを有する。DDRのコラーゲン結合のメカニズムは同定されていないが、DDRのジスコイジンドメインのコラーゲンへの結合が報告されている。興味深いことに、DDRのジスコイジンドメインはグリコシル化を有さず(グリコシル化部位はDDRのストーク領域にのみ位置する)、したがって、NP-011のジスコイジンドメインはDDRのジスコイジンドメインと類似している可能性があり、NP-011の肝臓中に蓄積したコラーゲンへの結合を促進する可能性がある。

NP-011は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を含む種々の肝疾患モデルにおいて治療効果を有する。臨床的には、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、NASH患者が線維症及び肝硬変に進行する可能性が高く、NASH患者が単純脂肪症患者よりも肝疾患関連死亡のリスクがほぼ10倍高いため、肝線維症患者に頻繁に見られる。したがって、NASHと線維症の両方におけるNP-011の治療能力は、複雑な進行性の肝疾患を抑制し、逆転させるための新しい治療法を示す。

高い製造性は、臨床応用のためのNP-011のもう1つの利点である。NP-011は酵母系を用いて生成され、この系は、容易な遺伝子操作及び急速増殖、並びに正しいタンパク質プロセシング及び翻訳後修飾のための分泌経路を含む真核生物の特徴を含むいくつかの利点を有する。現在、酵母からのNP-011の生成収率は40mg/Lであり、この収率は臨床応用のための信頼できる製造を提供する。例えば、200LのGMP(General Good Manufacturing Practice)のランスケールでNP-011を生成することにより、成人60kgに40μg/kgの有効投薬量で約3,400回の注射を行うことができる。さらに、NP-011は、タンパク質のN-末端にメチオニン、任意のタグ(例えば、FLAG-タグ又はそのタグ)、又はランダムグリコシル化（これは、医薬品の投与時に重大な問題を導入し得る）を伴わない分泌型タンパク質(真正のNP-011)として生成される。したがって、結論として、NP-011は、肝線維症並びに本明細書に開示される他の肝疾患を治療し、阻害し、予防し、及び逆転させるための非常に有効であり、信頼性の高い新規なタンパク質療法を提供する。

[実施例7]
NP-011は特発性肺線維症(IPF)を逆転、阻害、及び予防する
図12～図21に示されるように、NP-011はIPFに対して非常に有効であり、インビボでIPFを逆転及び阻害する。IPFのモデルは、ブレオマイシンの注射によって誘導された。NP-011によるIPFの逆転は、肺組織の組織学的研究において明らかである(図17及び図18、図13との比較)。さらに、NP-011は、IPFバイオマーカー、例えばαSMA、コラーゲン(Col1a1)、TMP2、MMP2、MMP12、pERK、tERK、pSMAD2(リン酸化SMAD2)、及びtSMAD2(総SMAD2)の発現レベルにおけるブレオマイシン誘発による変化を逆転する(図12～図21)。したがって、NP-011は、IPFの治療、阻害、予防、及び逆転に非常に効果的な治療法を提供する。

[実施例8]
NP-011は心筋梗塞の症状を逆転、阻害、予防し、心機能を改善する
図22～図26に示されるように、NP-011はインビボで心筋梗塞に対して非常に有効である。心筋梗塞のラットモデルをLAD結紮により誘発した。NP-011の注射は、心筋梗塞に罹患したラットにおける左室駆出率(EF)及び内径短縮率(FS)の増加によって証明されるように、心機能を増加させる(図23A～24B)。対照ラットと比較したNP-011を注射したラットの同様の体重は、NP-011の安全性を実証する(図25)。心臓断面の組織学的研究は、NP-011がまた、心筋梗塞に関連する線維症を逆転させ、阻害することを示す(図26A～図26B)。したがって、NP-011は、心筋梗塞の治療、阻害、予防、及び逆転のための非常に効果的な治療法を提供する。

[実施例9]
NP-011はアルツハイマー病を逆転、阻害、及び予防する
図27～図31に示されるように、NP-011はインビボでアルツハイマー病に対して非常に有効である。合計5つのADにリンクした突然変異体:APPにおけるスウェーデン(K670N/M671L)、フロリダ(I716V)及びロンドン(V717I)突然変異、並びにPSEN1におけるM146L及びL286V突然変異を伴うヒトAPP及びPSEN1導入遺伝子を発現する5XFADマウスをアルツハイマー病のモデルとして用いた。NP-011は、アルツハイマー病に関連する行動及び記憶喪失を逆転させる(図27A～図27E)。NP-011はまた、AD脳における神経病理学的変化を逆転させ、阻害する。例えば、NP-011はアミロイド斑(図28A～図28B)、及びアミロイドベータ(図29A～図29B)の量を特異的に減少させる。さらに、NP-011は脳の先天性免疫系であるミクログリア細胞の数を減少させ、その存在は神経炎症を示唆する(図30A～図30B)。さらに、NP-011は、アルツハイマー病の星状細胞において上方制御されるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の量を減少させる(図31A～図31B)。したがって、NP-011は、アルツハイマー病を治療し、阻害し、予防し、及び逆転させるための非常に効果的な治療法を提供する。

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Claims

上皮細胞増殖因子(EGF)様ドメイン、C1ドメイン、及び場合によりシグナルペプチドを含むMFG-E8ポリペプチドを含むポリペプチドであって、
(a)機能的C2ドメインを欠失している、及び/又は
(b)メディンポリペプチド又はその断片を欠失している、ポリペプチド。
(a)ポリペプチドが、MFG-E8ポリペプチドのアミノ酸226～335を含むC末端ドメイン内で少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、又は105個のアミノ酸を欠失しており、
(b)ポリペプチドが、MFG-E8ポリペプチドの少なくとも180、190、200、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、又は280個のアミノ酸を含み、
(c)ポリペプチドは、配列番号10又は配列番号12のアミノ酸1～225の少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%を含み、及び/又は
(d)ポリペプチドが、配列番号10又は配列番号12のアミノ酸24～225の少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
異種配列をさらに含み、場合により異種配列は、FLAGタグ、HISタグ、及び/又は免疫グロブリンのFc部分を含む、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
異種配列が、インビボでポリペプチドの半減期を増加させる、請求項3に記載のポリペプチド。
ポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項1～4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
ポリペプチドが、
(a)TGF-β1の発現レベルを減少させることができる、
(b)TGF-βシグナル伝達を減少させることができる、
(c)SMAD2及び/又はERKのリン酸化を減少させることができる、
(d)NOTCHシグナル伝達を増加させることができる、
(e)線維症関連遺伝子発現を減少させることができ、場合により線維症関連遺伝子がCol1a1、Col1a2、及び/又はActa2を含む、
(f)TGF-β受容体1(TGFBR1)と1つ以上のインテグリンの間の相互作用を減少させることができ、場合によりインテグリンはインテグリンβ3及び/又はインテグリンβ5を含む、
(g)肝星細胞(HSC)の増殖を減少させることができる、
(h)マトリックスメタロペプチダーゼ2(MMP2)、マトリックスメタロペプチダーゼ12(MMP12)、TMP2、ERK、SMAD2の発現レベルを減少させることができる、
(i)コラゲナーゼ活性を増加させることができる、及び/又は
(j)マクロファージによるコラーゲン取り込みを増加させることができる、請求項1～5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチド、並びに1つ以上の薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤を含む医薬組成物。
請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
核酸分子が、
(i)配列番号9又は配列番号11のヌクレオチド61～735、及び/又は
(ii)配列番号9又は列番号11のヌクレオチド130～735
に対して、少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する、請求項8に記載の核酸分子。
請求項8又は9に記載の核酸分子を含むベクターであって、場合により発現ベクターである、ベクター。
請求項10に記載のベクターを含む宿主細胞。
宿主細胞がピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項11に記載の宿主細胞。
ポリペプチドの製造方法であって、培地中で請求項11又は12に記載の宿主細胞を培養して、ポリペプチドを製造する工程を含む、方法。
マクロファージの活性を増加させる方法であって、マクロファージを請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含み、場合により活性はコラーゲン又は線維組織の取り込みを含む、方法。
HSCを請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、HSCの増殖を減少させる又は阻害する方法。
対象の細胞を請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、対象における線維症を減少させる又は阻害する方法。
対象の細胞を請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、対象における脂肪症を減少させる又は阻害する方法。
請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における障害を治療又は予防する方法。
障害が、線維症(慢性又は急性)、肝硬変、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、及び/又は肺線維症である、請求項18に記載の方法。
障害が特発性肺線維症(IPF)である、請求項18に記載の方法。
ポリペプチドがIPFバイオマーカーの発現レベルを改変させ、場合により、ポリペプチドが、αSMA、コラーゲン(Col1a1)、TMP2、MMP2、MMP12、リン酸化ERK、ERK、リン酸化SMAD2、及びSMAD2から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの発現レベルを減少させる、請求項20に記載の方法。
障害が心筋梗塞である、請求項18に記載の方法。
ポリペプチドが、心臓の機能を増加させ、場合により、ポリペプチドが、左室駆出率及び/又は内径短縮率を増加させる、請求項22に記載の方法。
ポリペプチドが、心筋梗塞に関連する線維症を阻害する又は減少させる、請求項22又は23に記載の方法。
障害がアルツハイマー病である、請求項18に記載の方法。
対象が、(i)K670N/M671L、I716V、及びV717Iから選択されるアミロイド前駆体タンパク質(APP)における少なくとも1つの突然変異、並びに/又は(ii)M146L及びL286Vから選択されるPSEN1における少なくとも1つの突然変異を有する、請求項25に記載の方法。
ポリペプチドが、アルツハイマー病に関連する記憶喪失及び/又は行動を改善する、請求項25又は26に記載の方法。
ポリペプチドが、対象の脳、場合により対象の海馬及び/又は脳皮質において、
(i)アミロイド斑の量、
(ii)アミロイドベータの量、
(iii)ミクログリアの数、
(iv)神経炎症、及び/又は
(v)グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の量
を減少させる、請求項25、26又は27に記載の方法。
ポリペプチドが、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、又は筋肉内経路を介して投与される、請求項16～28のいずれか一項に記載の方法。
対象が哺乳動物であり、場合により、哺乳動物がヒト、マウス、又はラットである、請求項16～29のいずれか一項に記載の方法。
障害を治療する追加の薬剤を対象に投与することをさらに含む、請求項16～30のいずれか一項に記載の方法。
方法が対象においてアミロイド形成を誘導しない、請求項16～31のいずれか一項に記載の方法。
請求項1～6のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むキット。