TW202122414A - 治療性融合蛋白 - Google Patents

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達柯 斯克葛羅
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Abstract

本發明關於適合用作藥物或研究工具的融合蛋白。該融合蛋白的治療用途可包括預防或治療急性或慢性炎性和免疫系統驅動的器官和微血管障礙，例如急性腎損傷、急性呼吸窘迫症候群、敗血症、急性心肌梗塞、組織纖維化和其他由組織創傷引起的器官損傷。

Description

治療性融合蛋白
序列表
本申請含有已經以ASCII格式電子遞交之序列表並且該序列表藉由引用以其整體特此併入。所述ASCII副本創建於2020年8月31日，名為PAT058332_SL.txt，大小為653,193位元組。
本發明關於融合蛋白，該融合蛋白包含整聯蛋白結合能力和磷脂醯絲胺酸結合能力兩者。該融合蛋白可用作治療劑，特別是用於預防或治療急性或慢性炎性障礙以及免疫系統驅動的或凝血驅動的器官和微血管障礙。
急性炎症性器官損傷(AOI)從歷史上講係具有挑戰性的疾病，其發病率高，死亡率高且醫療需求顯著未得到滿足。典型的AOI包括心肌梗塞(MI)和中風，全球每年在3240萬患者中發生。先前患有MI和中風的患者被世界衛生組織視為發生進一步冠狀動脈和腦事件的最高風險組，該等事件在發達國家中是發病率的排名靠前之原因之一。另一個AOI係急性腎損傷(AKI)，每年在約1330萬人中發生。在高收入國家，AKI發生率係3-5/1000，並與高死亡率(14%-46%)相關(Metha等人，(2015)Lancet[柳葉刀]，385(9987)：2616-43)。與MI和中風相似，AKI倖存者通常無法完全康復，並且罹患慢性腎臟疾病或終 末期腎臟疾病的風險增加。迄今為止，尚無FDA批准的藥物可預防或治療AKI。開發用於AKI的新治療已被證明具有挑戰性，到目前為止臨床試驗還沒有成功結果。這很可能是由於AKI的多因素和多方面的病理生理學，包括化膿、缺血/再灌注和/或腎毒性損傷引起的炎症、微血管功能障礙和腎毒性病理機理。該等驅動因子可以同時或連續地起作用，從而引起大部分腎小管還有腎小球細胞受損，腎功能儲備喪失並最終導致腎衰竭。
AOI的一個常見共同特徵係由於組織損傷引起的細胞死亡增加、細胞碎片的產生增加以及可以進入循環和受傷組織的促血栓形成性/促炎性微粒。在中性粒細胞組織浸潤以抵抗感染後，中性粒細胞在受影響的組織中發生凋亡或其他形式的細胞死亡。中性粒細胞含有有害物質，包括蛋白水解酶和與危險相關之分子模式(DAMP)，該DAMP可促進宿主組織損傷並傳播炎症。有效攝取瀕死的細胞會觸發傳訊事件，該事件導致巨噬細胞(MΦ)重新程式設計為非炎性促消退表型，並釋放關鍵介質以成功消退和修復受影響的組織。該重程式設計最近已歸因於代謝傳訊，該代謝傳訊激活巨噬細胞中的吞噬抗炎反應(Zhang等人，(2019)Cell Metabolism[細胞代謝]，29(2)：443-56)。以非炎性的方式清除碎片或衰老或瀕死的細胞稱為「胞葬作用」。
然而，在延緩胞葬作用的情況下，壞死細胞會積聚並引起例如藉由巨噬細胞觸發促炎性細胞介素(TNF-α)或免疫抑制性IL-10的炎性反應(Greenlee-Wacker(2016)Immunol.Reviews[免疫學綜述]，273：357-370)。此外，如果未有效清除細胞碎片和微粒，它們會引起細胞團塊和聚集，例如中性粒細胞-血小板碎片簇，微血栓和/或釋放與危險相關的分子模式(DAMP)，例如ATP、DNA、組蛋白或HMGB1。後果可能包括微血管系統阻塞，功能障礙和 明顯的無菌性炎症，從而導致組織損傷、原發和繼發器官衰竭或不利於適應的修復的進展。
在AOI的急性期，胞葬途徑似乎顯著下調。炎症或急性損傷反應(機械提示、缺氧、氧化應激、輻射、炎症和感染)可藉由下調專門的磷脂醯絲胺酸(PS)結合蛋白(其包括橋接蛋白和細胞表面胞葬作用/清除受體)來抑制有效的胞葬作用或吞噬作用。胞葬作用受體去功能化的一個實例係TAM家族受體例如Mer酪胺酸激酶(MerTK)的蛋白水解脫落。MerTK係優先在吞噬細胞上表現之完整膜蛋白，在吞噬細胞上它既係傳訊蛋白，又可以促進胞葬作用(藉由諸如Gas6或蛋白S等蛋白)並抑制炎性傳訊。金屬蛋白酶ADAM17誘導MerTK的可溶性胞外結構域的蛋白水解切割和釋放。脫落過程可藉由剝奪表面MerTK來減少吞噬細胞的胞葬作用。另外，釋放的胞外結構域還可以在體外抑制胞葬作用(Zhang等人，(2015)J Mol Cell Cardiol.[分子和細胞心臟病學雜誌]，87：171-9；Miller等人，(2017)Clin Cancer Res.[臨床癌症研究]，23(3)：623-629)。可溶性Mer量的增加典型地在炎性、惡性或自體免疫性疾病(例如糖尿病性腎病或全身性紅斑狼瘡(SLE))的血清/血漿中觀察到，並且可以標記疾病嚴重程度(Ochodnicky P(2017)Am J Pathol.[美國病理學雜誌]，187(9)：1971-1983；Wu等人，(2011)Arthritis Res Ther.[關節炎研究與治療]13：R88)。此外，在大多數急性和慢性炎性疾病中，橋接蛋白(如乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFG-E8))也被下調。與可溶性Mer相似，MFG-E8的血清/血漿濃度降低可以在MI或穩定型心絞痛患者中發現(Dai等人，(2016)World J Cardiol.[心臟病學雜誌]，8(1)：1-23)，並且按照針對慢性阻塞性肺病的描述來標記疾病(COPD；Zhang等人，(2015)同上)。
瀕死細胞上磷脂醯絲胺酸(PS)的暴露係對於免疫細胞進化上保守的抗炎和免疫抑制信號。大量的主要哺乳動物病原體利用PS介導的攝取作為毒性細胞感染的一部分(Birge等人，(2016)Cell Death Diff.[細胞死亡與分化]，23(6)：962-78)。例如，病毒可以直接或經由蛋白例如Gas6與PS結合受體結合(Morizono和Chen(2014)J Virol.[病毒學雜誌]，88(8)：4275-90)。反應於損傷的內源清除途徑的失活可能呈現進化發展之反應，從而降低感染原在損傷後進入和劫持細胞並由此掩蓋宿主的免疫反應和防禦的效率。因此，清除途徑的下調將提高先天性和適應性免疫效應子抵抗感染之功效。作為「友好之火」之結果，在急性器官損傷期間，胞葬作用可能會暫時受到影響，並且可能發生AOI的上述併發症。瀕死的細胞、碎片、促炎性和促血栓形成性MP的積累係AOI的標誌並且是炎症和微血管損傷的主要誘因。值得注意的是，促炎性和促血栓形成性微粒的這種積累在具有高醫療需求的嚴重疾病中常見，並且可能助長其發病率。此類適應症的實例係敗血症和癌症(Yang等人，(2016)Tumour Biol.[腫瘤生物學]，37(6)：7881-91；Zhao等人，(2016)J Exp Clin Cancer Res.[實驗與臨床癌症研究雜誌]，35：54；Muhsin-Sharafaldine等人，(2017)Biochim Biophys Acta Gen Subj.[生物化學與生物物理學雜誌]，1861(2)：286-295；Ma等人，(2017)Sci Rep.[科學報導]，7(1)：4978；Souza等人，(2015)Kidney Int.[腎臟國際版]87(6)：1100-8)。在該領域中先前的藥物發現努力集中在PS結合蛋白上，其可以用作候選藥物設計的基礎，如(Li等人，(2013)Exp Opin Ther Targets[治療靶標專家觀點]，17(11)：1275-1285)所述。
PS結合蛋白的子集還識別並結合整聯蛋白，例如αvβ3和αvβ5，它們在包括吞噬細胞在內的許多細胞類型上表現。該等蛋白起到橋接PS的作用， 使凋亡/瀕死細胞暴露於整聯蛋白，從而導致藉由巨噬細胞和非專性吞噬細胞的胞葬作用(也稱為吞噬作用)。在大多數急性和慢性炎性疾病中，一些橋接蛋白也被下調。先前已經提出了這種橋接蛋白或其截短形式的治療用途(WO 2006122327(敗血症)，WO 2009064448(缺血/再灌注後的器官損傷)，WO 2012149254(腦缺血)，費恩斯坦醫學研究所(The Feinstein Institute for Medical Research)；WO 2015025959(心肌梗塞)九州大學和東京醫科大學(Kyushu University & Tokyo Medical University)；WO 20150175512(骨吸收)賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)；WO 2017018698(組織纖維化)高麗大學研究與商業基金會(Korea University Research and Business Foundation)和US20180334486(組織纖維化)尼克森公司(Nexel Co.，Ltd.))；然而，野生型或天然存在的蛋白的用途受到許多問題的限制。例如，當在細胞表現系統中培養時，野生型MFG-E8(wtMFG-E8)被認為具有較差的可開發性、低溶解度並且以非常低的產率表現。Castellanos等人(2016)的工作表明，昆蟲或CHO細胞中作為Fc-IgG融合蛋白表現的MFG-E8完全聚集，只能藉由添加去污劑如Triton X-100或CHAPS才能被有效純化(Castellanos等人，(2016)Protein Exp.Pur.[蛋白實驗與純化]，124：10-22)。
藉由橋接蛋白(例如MFG-E8、EDIL3、Gas6)去除瀕死的細胞、碎片和微粒，可以消除無菌性炎症和微血管功能障礙的主要原因，並且從而防止組織損傷的進展並能夠消退炎症。因此，在AOI過程中促進瀕死細胞清除的治療方法可用於減少或至少減輕AOI的病理學，並且在瀕死細胞或暴露於PS的微粒清除不充分的其他疾病中可能有意義。因此，需要治療劑，該治療劑可用於減少組織損傷和炎症並且具有期望的製造特性以解決AOI中未滿足的醫療需求。
在本揭露中，申請人已經基於天然存在的橋接蛋白(例如MFG-E8)的結構產生了重組的治療性融合蛋白，而沒有上述不希望的性質和野生型蛋白的生產問題。本揭露之融合蛋白包含整聯蛋白結合結構域、PS結合結構域和增溶結構域。融合蛋白例如藉由起作用將暴露於PS的死亡細胞、碎片和微粒的橋接到吞噬細胞並且從而觸發胞葬作用來維持野生型MFG-E8蛋白的主要生物學功能。另外，與野生型MFG-E8蛋白(SEQ ID NO：1)相比，本發明之治療性融合蛋白具有改善的可開發性，特別是降低的黏性和改善的溶解性。此外，與野生型MFG-E8蛋白相比，該等治療性融合蛋白在細胞表現系統中表現時具有更長的血漿暴露和更高的產率。
本文提供了用於增強胞葬作用之治療性融合蛋白，其包含整聯蛋白結合結構域、磷脂醯絲胺酸(PS)結合結構域和增溶結構域。
在一些實施方式中，該融合蛋白的增溶結構域連接至整聯蛋白結合結構域。在一些實施方式中，增溶結構域連接至PS結合結構域。在一些實施方式中，增溶結構域與整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域兩者連接，即位於整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域之間。在一些實施方式中，增溶結構域插入整聯蛋白結合結構域內或插入PS結合結構域內。在一個實施方式中，該治療性融合蛋白具有結構，該結構從N末端至C末端係：整聯蛋白結合結構域-增溶結構域-PS結合結構域。
在一些實施方式中，該治療性融合蛋白的整聯蛋白結合結構域包含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)結合模體，並與αvβ3和/或αvβ5或α8β1整聯蛋白結合。
在一些實施方式中，該治療性融合蛋白的增溶結構域直接連接至整聯蛋白結合結構域和/或連接至PS結合結構域，即插入所述結構域之間。在可替代實施方式中，該增溶結構域藉由連接子(linker)例如外部連接子間接連接至整聯蛋白結合結構域和/或PS結合結構域。在一些實施方式中，增溶結構域包含人血清白蛋白(HSA)、HSA的結構域3(HSA D3)或IgG的Fc區(Fc-IgG)或其功能變體。
在一些實施方式中，該治療性融合蛋白包含與增溶結構域的N末端連接的整聯蛋白結合結構域的C末端和與PS結合結構域的連接的增溶結構域的C末端。在一些實施方式中，治療性融合蛋白包含一般結構EGF-HSA-C1-C2，其中EGF代表MFG-E8、EDIL3或其他包含如表1中所列的整聯蛋白結合結構域的蛋白的結合整聯蛋白的EGF樣結構域，C1-C2代表在MFG-E8、EDIL3或其他包含表2中所列的PS結合結構域的蛋白中發現的PS結合結構域。表3列出了包含整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域(例如MFG-E8(SEQ ID NO：1)和EDIL3(SEQ ID NO：11))兩者的蛋白之實例。
在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域係EGF樣結構域(該EGF樣結構域例如具有SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸)或其截短的變體。在一個實施方式中，EGF樣結構域包含人MFG-E8的EGF樣結構域或其功能變體，該功能變體包含一、二、三、四、五、多達10個胺基酸修飾。在一個實施方式中，EGF樣結構域包含人EDIL3的EGF樣結構域或其功能變體，該功能變體包含一、二、三、四、五、多達10個胺基酸修飾。
在一些實施方式中，PS結合結構域包含兩個網柄菌凝素蛋白C1-C2亞結構域(例如，人MFG-E8的PS結合結構域，其具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、 97%、98%或99%序列同一性的胺基酸)或其截短的變體。在一個實施方式中，PS結合結構域包含人MFG-E8的PS結合結構域或其功能變體，該功能變體包含一、二、三、四、五、多達10個胺基酸修飾。在一個實施方式中，PS結合結構域包含人EDIL3的PS結合結構域或其功能變體，該功能變體包含一、二、三、四、五、多達10個胺基酸修飾。
在一些實施方式中，增溶結構域係HSA或其功能變體(例如，具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸)或其截短的變體。在一個實施方式中，HSA包含胺基酸取代C34S(其具有降低蛋白聚集傾向的功能)並具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。在一些實施方式中，增溶結構域包含人血清白蛋白(HSA)或其功能變體(該功能變體包含一、二、三、四、五、多達10個胺基酸修飾，例如HSA C34S)或HSA的截短的變體(例如，HSA的結構域3(HSA D3))或該截短的變體的功能變體。在一個較佳的實施方式中，增溶結構域係HSA C34S。
在可替代實施方式中，增溶結構域包含IgG的Fc區(Fc-IgG)(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區)或其功能變體。在一個實施方式中，增溶結構域包含人Fc-IgG1的Fc區(具有SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸)或其截短的變體。在一個實施方式中，Fc-IgG1包含胺基酸取代D265A和P329A以降低Fc效應子功能，並具有SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。 在另一個實施方式中，Fc-IgG1包含胺基酸取代T366W以產生「杵」，或者它可以包含胺基酸取代T366S、L368A、Y407V以產生「臼」。另外，Fc-IgG1杵可包含胺基酸取代S354C，並且Fc-IgG1臼可包含胺基酸取代Y349C，從而在配對時形成半胱胺酸橋。除杵臼修飾外，Fc-IgG1還可以包含D265A和P329A取代以降 低Fc效應子功能。在一個實施方式中，Fc-IgG1具有SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列。
在一個較佳的實施方式中，治療性融合蛋白包含乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFG-E8)和增溶結構域，其中MFG-E8包含整聯蛋白結合性EGF樣結構域(SEQ ID NO：2)和磷脂醯絲胺酸結合性C1-C2結構域(SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：76)。MFG-E8可包含天然存在的或野生型的人MFG-E8(SEQ ID NO：1)或具有SEQ ID NO：75的MFGE-8，或其功能變體。在一個實施方式中，增溶結構域連接至MFG-E8的N或C末端。在一個實施方式中，增溶結構域插入在EGF樣結構域和C1結構域之間或C1和C2結構域之間。在一個較佳的實施方式中，增溶結構域連接至EGF樣結構域的C末端，並連接至C1結構域的N末端。增溶結構域可以直接或間接連接至EGF樣結構域的C末端，並且直接或間接連接至C1結構域的N末端。在一些實施方式中，間接連接係借助於外部連接子，例如基於甘胺酸-絲胺酸的連接子。
在一個實施方式中，治療性融合蛋白包含SEQ ID NO：42(FP330)所示的胺基酸序列。在一個實施方式中，治療性融合蛋白可包含組胺酸標籤(His標籤；SEQ ID NO：67)，以輔助表徵測定和蛋白表現中的檢測和/或純化。在一個實施方式中，治療性融合蛋白具有C末端His標籤，並包含SEQ ID NO：44(FP278)所示的胺基酸序列。除向FP278添加His標籤外，治療性融合蛋白FP278和FP330具有相同的胺基酸序列。
在一些實施方式中，治療性融合蛋白包含SEQ ID NO：42(FP330)所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：42(FP330)所示的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸，或其截短的變體。例如，治療性融合蛋白FP776包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有97.7%序列同一性。例如，治療性融合蛋白FP068 包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有98.3%序列同一性。例如，治療性融合蛋白FP816包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有98.5%序列同一性。例如，治療性融合蛋白FP811包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有99.0%序列同一性。例如，治療性融合蛋白FP010包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有99.5%序列同一性。例如，治療性融合蛋白FP138包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有99.8%序列同一性。例如，治療性融合蛋白FP284包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，並且與FP330(SEQ ID NO：42)具有99.9%序列同一性。
在一些實施方式中，並且如在實例部分中所述，本發明之治療性融合蛋白的功能係在人內皮細胞-Jurkat細胞胞葬作用測定中促進內皮細胞的胞葬作用，並在人巨噬細胞-中性粒細胞胞葬作用測定中恢復巨噬細胞的受損的胞葬作用和增強基礎的胞葬作用；融合蛋白的功能係在人內皮細胞微粒胞葬作用測定中藉由清除而減少血漿微粒的數量；和/或融合蛋白在急性腎缺血模型中提供針對多器官損傷的保護。
本文還揭露了利用或包含該等治療性融合蛋白的方法、用途、診斷試劑、藥物組成物和套組(kit)。本文還提供了編碼所揭露的融合蛋白的核酸，包含此類核酸的選殖和表現載體，包含此類核酸的宿主細胞以及藉由培養此類宿主細胞產生所揭露的融合蛋白的方法。
[圖1]顯示了本揭露之治療性融合蛋白的實例之示意圖。增溶結構域(標記為「SD」)連接在MFG-E8的C末端、N末端或EGF、C1或C2結構域之間。
[圖2]顯示了在HEK細胞中表現的融合蛋白之許多SDS-PAGE蛋白凝膠。圖2A：EGF-HSA-C1-C2蛋白(FP330；SEQ ID NO：42)；圖2B：EDIL3的EGF-HSA-C1-C2蛋白(FP050；SEQ ID NO：12)；圖2C：未還原和還原的EGF-Fc(KiH)C1-C2蛋白(該蛋白係FP071(EGF-Fc(杵)-C1-C2；SEQ ID NO：18)與Fc-IgG1臼(SEQ ID NO：10)的異二聚體)；圖2D：EGF-HSA-C1蛋白(FP260；SEQ ID NO：34)。對於圖2A、2C和2D中的每一個，第一列顯示Precision Plus蛋白未染色的標準標誌物，並且第二列顯示各自的融合蛋白。對於圖2B，第一列顯示融合蛋白，並且第二列顯示Precision Plus蛋白未染色的標準標誌物。圖2E顯示了已經產生和純化的其他重組蛋白。
[圖3]示例了在實際操作期間野生型(wt)MFG-E8相比於融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)蛋白的損失的影響。圖3A顯示了與在非結合板中製備的稀釋液(符號：●)相比，當在聚丙烯板中製備蛋白稀釋液(符號：□)時，L-α-磷脂醯絲胺酸競爭測定中wtMFG-E8的功效之損失。相反，圖3B顯示，在PS競爭測定中，當在聚丙烯板中(符號：□)相比於在非結合板中(符號：●)製備蛋白稀釋液時，融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)的功效幾乎沒有損失。
[圖4]顯示融合蛋白與L-α-磷脂醯絲胺酸之結合。圖4A顯示了FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)以濃度依賴性的方式與固定化的L-α-磷脂醯絲胺酸之結合，以及與磷脂心磷脂的程度更弱之結合。圖4B顯示了人wtMFG-E8與許多治療性融合蛋白以濃度依賴性方式以競爭測定形式(生物素化的小鼠wtMFG-E8與L-α-磷脂醯絲胺酸結合的競爭)與固定化的L-α- 磷脂醯絲胺酸之結合，該治療性融合蛋白係：FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)、FP250(EGF-HSA；SEQ ID NO：32)、FP260(EGF-HSA-C1；SEQ ID NO：34)和FP270(EGF-HSA-C2；SEQ ID NO：36)。
[圖5]顯示對融合蛋白的αv-整聯蛋白依賴性細胞黏附。圖5A顯示αv整聯蛋白抑制劑西侖吉肽(cilengitide)或10mM EDTA完全阻斷了細胞對FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42)之黏附。如圖5B所示，EGF樣結構域(FP280；SEQ ID NO：38)的整聯蛋白結合模體RGD(RGD>RGE)中的單點突變導致細胞黏附之完全消除。圖5C顯示儘管有EGF樣結構域，但固定化的EGF-HSA蛋白(FP250；SEQ ID NO：32)不支持或僅適度支持BW5147.G.1.4細胞之黏附。如圖5D所示，當在CHO細胞或HEK細胞中表現時，本揭露之融合蛋白(FP330；SEQ ID NO：42)促進類似於wtMFG-E8的αv-整聯蛋白依賴性細胞黏附。
[圖6]顯示了治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)在促進人巨噬細胞對瀕死嗜中性白血球的胞葬作用方面之作用。融合蛋白的濃度顯示在x軸上，並且胞葬作用[%]顯示在y軸上。
[圖7]顯示了治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)可以挽救人巨噬細胞對瀕死嗜中性白血球的被內毒素(脂多糖)損害之胞葬作用。圖7A顯示了在三個人供體中，藉由100pg/ml的脂多糖(LPS)損害巨噬細胞對瀕死的人中性粒細胞之胞葬作用。左分圖顯示了單個供體之反應，右分圖顯示了三個供體之平均胞葬作用(%)。圖7B顯示了在治療性融合蛋白FP278的存在下，人巨噬細胞對瀕死的中性粒細胞的這種被內毒素(LPS)損害的胞葬作用之挽救。將3個不同的人巨噬細胞供體的胞葬作用指標標準化並繪製為胞葬作用(%)。
[圖8]顯示了用治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)，對人巨噬細胞對瀕死的中性粒細胞的胞葬作用的金黃色葡萄球菌(S.aureus)顆粒誘導的損害之挽救。圖8A顯示了濃度為100nM的FP278在促進胞葬作用方面的超過基礎水平的作用(虛線；圖的左手部分)，以及100nM的FP278在挽救由投與金黃色葡萄球菌引起的胞葬作用受損方面之作用(圖的右手部分)。圖8B顯示了增加融合蛋白FP278(EC 50 8nM)的濃度對挽救因投與金黃色葡萄球菌而引起的受損胞葬作用的作用，以及一旦達到胞葬作用的基本水平對促進胞葬作用之作用。
[圖9]顯示了治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)在促進人內皮細胞(HUVEC)對瀕死嗜Jurkat細胞的胞葬作用方面之作用。融合蛋白在內皮細胞胞葬測定中的效率取決於C1-C2或C1-C1串聯結構域的存在，因為如圖9所示，具有結構EGF-HSA-C2的融合蛋白(FP270；SEQ ID NO：36)在該測定中無效。
[圖10]顯示了HSA結構域在治療性融合蛋白中的位置(即在N或C末端位置(分別為FP220(HSA-EGF-C1-C2；SEQ ID NO：30)或FP110(EGF-C1-C2-HSA；SEQ ID NO：29))在巨噬細胞胞葬作用測定中賦予MFG-E8 HSA融合蛋白以胞葬作用阻斷功能。融合蛋白的濃度顯示在x軸上，胞葬作用[%]顯示在y軸上。
[圖11]顯示了藉由各種形式的包含HSA或Fc部分的治療性融合蛋白促進胞葬作用之比較。融合蛋白的濃度(nM)顯示在x軸上，並且胞葬作用[MFI]顯示在y軸上。圖11A顯示了包含HSA(其中HSA位於C末端或N末端或在EGF樣結構域和C1結構域之間)的融合蛋白之比較；分別是FP110(EGF-C1-C2-HSA；SEQ ID NO：29)，FP220(HSA-EGF-C1-C2；SEQ ID NO：30)和FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)。圖11B顯示了包含Fc部分(其 中Fc位於C末端(FP060(EGF-C1-C2-Fc[S354C,T366W]；SEQ ID NO：14)和FP080(EGF-C1-C2-Fc；SEQ ID NO：22))或位於EGF樣結構域和C1結構域之間(FP070(EGF-Fc-C1-C2；SEQ ID NO：16))的融合蛋白之比較，其中與野生型MFG-EG(SEQ ID NO：1)對比。顯示了Fc部分的兩種形式：野生型Fc(FP080)和具有S354C和T366W修飾的Fc部分(EU編號；FP060)。圖11C顯示了融合蛋白FP090(Fc-EGF-C1-C2；SEQ ID NO：24)的以三種不同濃度(0.72、7.2和72nM)的三個批次之比較，該融合蛋白包含位於N末端的Fc部分，其中與wt-MFG-E8對照對比。圖11D顯示藉由融合蛋白構建體FP050促進胞葬作用，該融合蛋白構建體FP050包含插入在EDIL3(基於EDIL3的EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：12)之EGF樣結構域和C1-C2結構域之間的HSA。圖11E顯示了本揭露之融合蛋白的其他實例，例如嵌合變體(FP145、FP1145、FP146和FP1146)以及MFGE8或EDIL3的整聯蛋白結合結構域與PS結合結構域例如TIM4的IgSF V結構域或橋接蛋白GAS6的GLA結構域的組合(FP1147和FP1148)。圖11F顯示了重組融合蛋白的促胞葬作用功能，該重組融合蛋白由將來自EDIL3和MFG-E8的結構域融合至HSA插入物的嵌合蛋白構成。數據顯示FP145和FP146以濃度依賴性方式誘導人巨噬細胞對瀕死中性粒細胞之胞葬作用。圖11G顯示了重組融合蛋白之促胞葬作用功能，該重組融合蛋白由將來自EDIL3和MFG-E8的結構域融合至HSA插入物的嵌合蛋白構成。數據顯示FP145和FP146以濃度依賴性方式誘導人內皮細胞(HUVEC)對瀕死Jurkat細胞之胞葬作用。
[圖12]顯示了在3種不同濃度(高達30nM)下測試的治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)對HUVEC細胞的胞葬作用之促進。胞葬作用的促進係濃度的依賴性的，其中胞葬作用隨著融合蛋白FP278濃度的增加而增加。
[圖13]顯示了治療性融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42；圖13A)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44；圖13B)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：48；圖13C)可以挽救人巨噬細胞對瀕死嗜中性白血球的被內毒素(脂多糖)損害之胞葬作用。融合蛋白的濃度顯示在x軸上，胞葬作用[%]顯示在y軸上。
[圖14]顯示了融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42；圖14A)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44；圖14B)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：48；圖14C)在促進人內皮細胞(HUVEC)對瀕死Jurkat細胞的胞葬作用方面之作用。融合蛋白的濃度顯示在x軸上，胞葬作用[%]顯示在y軸上。
[圖15]顯示了單劑量的治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)、FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42)或FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：48)在缺血-再灌注損傷誘導的急性腎損傷(AKI)模型中保護腎功能。圖15A顯示藉由腹膜內(i.p.)投與0.16mg/kg或0.5mg/kg的FP278(x軸)，血清肌酐(sCr)的升高(mg/dL；y軸)被減少。如圖15B所示，靜脈內(i.v.)投與0.5mg/kg或1.5mg/kg的融合蛋白FP330顯著降低了血清肌酐水平。圖15C顯示了融合蛋白FP776的i.v.投與以劑量依賴性方式降低了血清肌酐。
[圖16]顯示了0.16mg/kg或0.5mg/kg的單劑量治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)降低了急性腎損傷的鼠模型中血尿素氮(BUN)水平。
[圖17]顯示了損傷標誌物之基因表現，單劑量治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)可保護遠處器官免受缺血再灌注誘導的AKI引起的急性期反應。圖17A示例了鼠心臟中的這種AKI誘導的 血清澱粉樣蛋白(SAA)反應，圖17B示例了鼠肺中的這種AKI誘導的反應(SAA)，二者單次腹膜內注射0.16mg/kg或0.5mg/kg/i.p.的MFGE8衍生的融合蛋白FP278後都被有力地阻斷。
[圖18]顯示了隨著時間的推移，肝對超順磁性氧化鐵(SPIO)造影劑(Endorem ® )之攝取。(誘導疾病後24小時)或進行假手術後(腎切除術後24h的動物)將Endorem ® 推注1.2s靜脈注射到患有AKI的動物中。與假手術動物相比，患有AKI的動物顯示肝對造影劑的攝取顯著降低(靶=枯否細胞)。治療(在AKI誘導前-30分鐘預防性給予或在缺血再灌注損傷誘導後+5小時治療性給予融合蛋白FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：48))保護AKI小鼠肝中造影劑積累免受損失。
本文公開了包含整聯蛋白結合結構域、PS結合結構域和增溶結構域的治療性融合蛋白。本文還揭露了使用本揭露之融合蛋白的治療方法以及可用於表徵融合蛋白的測定，例如胞葬作用測定。
定義
為了可以更容易地理解本揭露，在整個具體實施方式中具體定義了某些術語。除非另外定義，否則本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意義。
在提及序列(例如，胺基酸序列)時使用術語「包含(comprise、comprises、comprising)」等的所有情況下，應理解所述序列也可受術語「由......組成(consist、consists、consisting)」等限制。如本文所用，短語「基本上由...... 組成」係指方法或組成物中所包括的活性藥劑以及對該方法或組成物的預期目的無活性的任何賦形劑的類屬或種類。在一些方面，短語「基本上由......組成」明確地排除了包括除本揭露內容的多特異性結合分子以外的一種或多種另外的活性劑。在一些方面，短語「基本上由......組成」明確排除了包括除本揭露內容的多特異性結合分子和第二共同投與藥劑以外的一種或多種另外的活性劑。
如本文所用，術語「胞葬作用」係指細胞生物學中的過程，其中瀕死或死亡的細胞，例如凋亡或壞死或衰老的細胞或細胞外囊泡(微粒)-統稱為「獵物」-藉由吞噬作用除去，即被吞噬細胞吞噬並消化。在胞葬作用過程中，吞噬細胞主動栓系並吞噬獵物，生成含有獵物的細胞內大的充滿流體的囊泡，稱為胞葬體(efferosome)，產生溶酶體區室，在其中開始獵物的降解。在細胞凋亡過程中，胞葬作用確保了瀕死細胞在其膜完整性受到損害並且其內容物可能洩漏到周圍組織中之前已被除去，從而防止了周圍組織暴露於DAMP(例如毒性酶、氧化劑和其他細胞內組分，例如DNA、組蛋白和蛋白酶)。專性吞噬細胞包括髓系來源的細胞，例如巨噬細胞和樹突細胞，但其他例如基質細胞也可以進行胞葬作用，例如上皮和內皮細胞以及成纖維細胞。受損的胞葬作用已經與自體免疫性疾病和組織損傷聯繫，並且已在諸如囊性纖維化、支氣管擴張、COPD、氣喘、特發性肺纖維化、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、腎小球腎炎和動脈粥樣硬化等疾病中得到證實(Vandivier RW等人(2006)Chest[胸]，129(6)：1673-82)。迄今為止，還沒有專門用於促進胞葬作用的療法進入臨床。
如本文所用和如實例中所述之術語「胞葬作用測定」涉及針對融合蛋白的譜分析而開發的測試系統，其利用人巨噬細胞或作為吞噬細胞的人內皮細胞(HUVEC)。本文示例了巨噬細胞-中性粒細胞胞葬作用測定，內皮細胞-Jurkat細胞胞葬作用測定或內皮細胞微粒胞葬作用測定。如實例中更詳細描述的，該等測定可用於證明MFG-E8衍生的生物治療劑，例如本揭露之融合蛋白， 有效地促進巨噬細胞或內皮細胞對瀕死細胞和微粒的胞葬作用。此外，所描述的巨噬細胞-中性粒細胞測定適合於證明本發明之此類化合物甚至可以挽救對瀕死細胞的LPS或金黃色葡萄球菌損害的胞葬作用。
該術語「多肽」和「蛋白」在本文中可互換使用來指胺基酸殘基的聚合物。該短語還適用於一個或多個胺基酸殘基係相應天然存在胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，並且適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其經保守修飾的變體。
如本文關於本揭露之蛋白所使用的術語「黏性」係指蛋白錯誤折疊的結果，其促進蛋白凝結或聚集。該等不希望的和非功能性的影響係表面疏水相互作用的結果。
如本文所用，「C末端」係指具有游離羧基(-COOH)的多肽鏈的羧基末端胺基酸。如本文所用，「N末端」係指具有游離胺基(-NH2)的多肽鏈的胺基末端胺基酸。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含多個結構域的蛋白，該多個結構域可能不構成完整的天然或野生型蛋白，但可能限於完整蛋白的負責結合至細胞表面上相應受體的活性結構域。可以使用重組蛋白設計來生成融合蛋白，其中術語「重組蛋白」係指已經藉由重組DNA技術手段製備、表現、創建或分離的蛋白。例如，串聯融合係指藉由蛋白之間的N或C末端的融合簡單地將目的蛋白或目的蛋白的結構域末端對末端連接的技術。這提供了靈活的橋結構，從而在融合伴侶之間留出足夠的空間以確保正確折疊。然而，肽的N或C末端通常是獲得重組蛋白期望的折疊模式的關鍵組分，其結果係結構域的簡單的末端對末端連接可能是無效的。可替代地，結構域插入的過程涉及藉由將期望的結構編碼成單個多肽鏈並且有時將結構域插入另一結構域內來融合連續的蛋 白結構域。在上述這兩個過程中，結構域皆為「直接連接」或「直接地連接」。由於難以在目的基因中找到合適的連接位點，所以結構域插入通常比串聯融合更難進行。
除了上述直接連接的融合技術之外，可以使用外部連接子來維持融合蛋白中蛋白結構域的功能。這樣的連接子係指將蛋白結構域連接到另一個蛋白結構域的一段胺基酸，並且在本文中被稱為「間接連接子」。因此，該等結構域係「間接連接」或「間接地連接」。例如，熟悉該項技術者理解，結構包括兩個或更多個功能或組織結構域的多肽通常在該等結構域之間包含將它們彼此連接的一段胺基酸。連接子允許結構域相互作用，增強穩定性並可以減少空間位阻，即使N和C末端可以融合，這也常常使它們成為工程改造蛋白設計中使用的較佳項。在一些實施方式中，連接子的特徵在於它傾向於不採用剛性的三維結構，而是為多肽提供柔性。各種類型的天然存在的連接子已用於工程改造的蛋白中，例如免疫球蛋白鉸鏈區，其在許多重組治療性蛋白中，特別是在工程改造的抗體構建體中用作連接子(Pack P等人，(1995)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]，246：28-34)。除天然連接子外，還已經設計了許多人工連接子，可將其細分為三類：柔性、剛性和體內可切割的連接子。(Yu K等人，(2015)Biotech.Advances[生物技術進展]，33(1)：155-64；Chen X等人，(2013)Ad.Drug Delivery Reviews[藥物遞送進展綜述]，65(10)：1357-69)。使用最廣泛的柔性連接子序列係(Gly)n(Sabourin等人，(2007)Yeast[酵母]，24：39-45)和(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：114)(Huston等人，1988,85：5879-83)，其中可以藉由拷貝數n調整連接子長度。在一些實施方式中，包含連接子元件的多肽具有總體形式D1-連接子-D2的整體結構，其中D1和D2可以相同或不同，並且代表藉由連接子彼此締合的兩個結構域。在一些實施方式中，多肽連接子的長度係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個胺基酸。
如本文所用的胺基酸殘基/位置的「修飾」或「突變」係指與起始胺基酸序列相比，一級胺基酸序列的變化，其中該變化係由涉及所述胺基酸殘基/位置的序列變化引起的。例如，典型的修飾包括用另一個胺基酸取代殘基(或在所述位置取代)(例如，保守或非保守取代)，在所述殘基/位置附近插入一個或多個胺基酸，以及缺失所述殘基/位置。胺基酸「取代」或其變化形式係指用不同的胺基酸殘基置換預定(起始)胺基酸序列中的現有胺基酸殘基。通常且較佳的是，與包含起始(或「野生型」)胺基酸序列的多肽相比，修飾使變體多肽的至少一種物理生物化學活性改變。
術語「經保守修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列兩者。對於特定核酸序列，經保守修飾的變體係指編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸，或者在該核酸不編碼胺基酸序列的情況下，係指基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡並性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在密碼子指定丙胺酸的每個位置，該密碼子可以改變為任何所述之相應密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異係「緘默變異」，其係經保守修飾的變異中的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每種可能性緘默變異。技術人員應認識到，核酸中的每個密碼子(除了通常是甲硫胺酸的唯一密碼子的AUG和通常是色胺酸的唯一密碼子的TGG)均可以經修飾以產生功能上相同的分子。因此，在每個該序列中均隱含了編碼多肽的核酸的每種緘默變異。
對於多肽序列，「經保守修飾的變體」包括對多肽序列的單個取代、缺失或添加，從而使某個胺基酸取代為化學上類似的胺基酸。提供功能上類似的胺基酸的保守取代表係本領域中已知的。此類經保守修飾的變體係對多 態變體、種間同源物和等位基因的補充，並且不排除該等多態變體、種間同源物和等位基因。以下八組含有互為保守取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如，Creighton,Proteins[蛋白](1984))。在一些實施方式中，短語「保守序列修飾」用於指如下胺基酸修飾，其不顯著影響或改變本發明之工程改造的蛋白的結合結構域的結合特徵。
本文所指的「蛋白變體」或「蛋白的變體」涉及包含變異的蛋白，在該變異中一個或多個，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸已被修飾。本文所指的蛋白的「功能變體」涉及蛋白變體，該蛋白變體包含導致胺基酸序列改變但蛋白的整體性質或其功能沒有改變的修飾。本文所指的蛋白的「截短的變體」涉及蛋白的縮短形式，但是蛋白的縮短形式保留了親本蛋白的功能。為了確定功能變體或截短的變體在總體特性或功能上是否沒有變化，可以如本揭露中該在許多os測定中針對全長或未經修飾的親本蛋白測試該等變體蛋白的作用。例如，在人內皮細胞-Jurkat細胞胞葬作用測定中促進內皮細胞的胞葬作用，在人巨噬細胞-中性粒細胞胞葬作用測定中恢復巨噬細胞的受損的胞葬作用，在人內皮細胞-微粒胞葬作用測定中藉由清除而減少血漿微粒的數量，和/或在急性腎缺血模型中提供針對多器官損傷的保護。
在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中，術語「同一性百分比」或「序列同一性百分比」係指兩個或更多個相同的序列或子序列。當在比較窗口或指定區域內進行比較和比對以在例如使用以下序列比較演算法之一或藉由手動比對和目視檢查測量時獲得最大對應時，如果兩個序列具有規定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即，在規定區域上或在沒有規定時在整個序 列上，至少60%同一性，視需要至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性)，則這兩個序列係「基本上相同的」並且顯示「序列同一性」。視需要，同一性存在於長度至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)的區域上，或存在於長度為100至500或1000，或2000或3000或更多個核苷酸的區域上，或可替代地存在於長度為30至200或300或500或700或800或900或1000或更多個胺基酸的區域上。
對於序列比較，典型地一個序列充當參考序列，將測試序列與該參考序列進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參考序列輸入到電腦中，必要時指定子序列座標，並且指定序列演算法程式參數。可以使用預設程式參數，或者可以指定替代參數。然後，序列比較演算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的術語「比較窗口」包括提及區段，該區段具有選自包含20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150的組的連續核酸或胺基酸位置數量中的任一個，其中可以將序列與具有相同數量連續位置的參考序列在兩個序列最佳比對後進行比較。用於比較的序列比對方法係本領域中已知的。例如藉由Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.[應用數學進展]2：482c的局部同源性演算法，藉由Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物學期刊]，48：443的同源性比對演算法，藉由Pearson & Lipman(1988)PNAS USA[美國國家科學院院刊]85：2444的相似性方法研究，藉由該等演算法(威斯康辛州麥迪森的科學大道575號遺傳學電腦小組(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)的威斯康辛遺傳學套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的電腦實現，或藉由手動比對和目測檢查(參見例如，Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學實驗指南])，可以進行用於比較的序列的最佳比對。
適於確定序列同一性百分比和序列相似性的演算法的兩個實例係BLAST和BLAST 2.0演算法，它們分別描述於Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]，.25：3389-3402；和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]，215：403-410。用於執行BLAST分析的軟體可藉由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開地獲得。
該BLAST演算法還對兩個序列之間的相似度進行統計學分析(參見例如，Karlin和Altschul(1993)PNAS.USA[美國國家科學院院刊]，90：5873-5787)。由BLAST演算法提供的一種相似性量度係最小總和概率(P(N))，該最小總和概率提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和概率小於約0.2、更較佳的是小於約0.01、最較佳的是小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比也可以使用已併入ALIGN程式(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.[電腦應用生物科學]，4：11-17(1988))的演算法，利用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12、空位罰分4來確定。另外，兩個胺基酸序列之間的百分比同一性可以使用已併入GCG套裝軟體(在www.gcg.com上可獲得)中的GAP程式中的Needleman & Wunsch(同上)演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及缺口權重為16、14、12、10、8、6或4和長度權重為1、2、3、4、5或6來確定。
多肽典型地與第二多肽基本上相同，例如其中兩種肽僅藉由保守取代而不同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示係兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交。
術語「核酸」與術語「多核苷酸」在本文中可互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾的骨架殘基或連接的核酸，該等核酸係合成 的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸類似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其經保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)和互補序列以及明確指示的序列。具體地，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而實現，在該等序列中，一個或多個所選(或全部)密碼子的第三位被混合的鹼基和/或去氧肌苷殘基取代(Batzer等人，(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]，19：5081；Ohtsuka等人，(1985)J Biol Chem.[生物化學雜誌]，260：2605-2608；和Rossolini等人，(1994)Mol Cell Probes[分子與細胞探針]，8：91-98)。如本文所用，術語「優化的核苷酸序列」意指核苷酸序列已被改變為使用在產生細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO))中較佳的密碼子編碼胺基酸序列。將優化的核苷酸序列工程改造以完全保留最初由起始核苷酸序列編碼的胺基酸序列，該起始核苷酸序列也稱為「親本」序列。在特定的實施方式中，本文優化的序列已被工程改造以具有在CHO哺乳動物細胞中較佳的密碼子。
治療性融合蛋白
整聯蛋白結合結構域
整聯蛋白係促進細胞-細胞外基質(ECM)黏附的跨膜受體。配位基結合後，整聯蛋白激活介導細胞信號的訊息傳導途徑，例如細胞週期的調節、細胞內細胞骨架的組織以及新受體向細胞膜的移動(Giancotti & Ruoslahti(1999)Science[科學]，285(5430)：1028-32)。整聯蛋白的存在允許對細胞表面的事件做出快速而靈活的反應。存在多種類型的整聯蛋白，並且一個細胞在其表 面上可能具有多種不同類型。整聯蛋白具有兩個亞基：α(alpha)和β(beta)，其各自穿透質膜並具有幾個胞質結構域(Nermut MV等人(1988).EMBO J.[歐洲分子生物學學會雜誌]，7(13)：4093-9)。許多ECM蛋白的整聯蛋白相互作用位點的酸性胺基酸特徵，例如作為胺基酸序列精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(單字母胺基酸代碼為「RGD」)的一部分。RGD模體已發現於眾多基質蛋白(例如纖網蛋白、纖維蛋白原、玻連蛋白和骨橋蛋白)中，並有助於細胞黏附。RGD模體發現於許多蛋白中的稱為EGF樣結構域的保守蛋白結構域中，該結構域的名稱源於最初描述其的表皮生長因子。EGF樣結構域係細胞外蛋白中最常見的結構域之一(Hidai C(2018)開放可得的J Trans Med Res.[轉化醫學研究雜誌]，2(2)：67-71)以及一些包含RGD模體的EGF樣結構域的實例在下表1中列出。
[表1]：包含含有RGD整聯蛋白模體的EGF樣結構域蛋白的蛋白的實例
Figure 109130528-A0202-12-0025-1
如本文所用，術語「整聯蛋白結合結構域」係指具有與整聯蛋白結合的功能的一段胺基酸或蛋白結構域。在本揭露之一個實施方式中，術語「整聯蛋白結合結構域」係指具有與整聯蛋白結合的功能並且含有RGD模體的一段胺基酸或蛋白結構域。在本揭露之一個實施方式中，整聯蛋白結合結構域係來自具有SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列的人MFG-E8的EGF樣結構域。在本揭露之可替代實施方式中，整聯蛋白結合結構域係來自人EDIL3(以下序列中的任何 一個：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101)的EGF樣結構域；例如，其中可以在SEQ ID NO：11的胺基酸1-132的區段中找到EGF樣結構域。
如本文所用，術語「與整聯蛋白結合」係指整聯蛋白結合活性。整聯蛋白結合活性可以藉由本領域眾所周知的方法確定。例如，在實例的第3.2節中描述了整聯蛋白黏附測定，其中確定了表現螢光標記的αvβ3整聯蛋白的淋巴瘤細胞對本揭露之治療性融合蛋白的黏附。如果整聯蛋白結合結構域具有對人MFG-E8蛋白(SEQ ID NO：1)觀察到的整聯蛋白結合活性的至少10%，例如至少25%、至少50%、至少75%、更較佳的是至少80%、例如至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，則該整聯蛋白結合結構域被認為具有整聯蛋白結合活性(這係當用相同的方法測定各自的活性時，較佳的是當用第3.2節的實例中所述之測定來測試時)。
磷脂醯絲胺酸結合結構域
如本文所用，「磷脂醯絲胺酸」(PS)涉及作為細胞膜的組分的磷脂。PS主要局限於細胞膜的內葉，而磷脂醯膽鹼和鞘磷脂則主要位於外葉。磷脂的不對稱分佈藉由質膜中的翻轉酶(P4-ATP酶，例如ATP11A和11C)的作用來維持，從而將PS從外葉主動易位到內葉。PS的細胞表面暴露不僅在凋亡細胞中觀察到，還在活化的淋巴細胞、活化的血小板、衰老的紅血球以及一些癌細胞和各自的微粒中觀察到(Sakuragi等人，(2019)PNAS USA[美國科學院院刊]，116(8)：2907-12)。PS暴露可以是促血栓形成性、炎性或缺血性疾病狀態的生物標誌物(Pasalic等人，(2018)J Thromb Haemost.[血栓形成和止血雜誌]，16(6)：1198-2010；Ma等人，(2017)同上；Zhao等人，(2016)同上。PS在多種細胞傳訊途徑中具有功能，並在凝血過程中作為必需的磷脂，在其中它可以充當tenase(因子 IXa、VIIIa和X)和凝血酶原酶(因子Xa、Va和凝血酶原)複合物的形成增強劑(Spronk等人，(2014)Thromb Res.[血栓形成研究]133(Suppl 1)：S54-6)。外部化的PS的最可能被理解的功能仍然是吞噬細胞(例如巨噬細胞)吞噬凋亡細胞、細胞碎片或暴露於PS的活化細胞的「吃掉我」標誌物。如本文所用，術語「磷脂醯絲胺酸結合結構域」或「PS結合結構域」係指具有結合PS的功能的一段胺基酸或蛋白結構域。具有PS結合結構域的內源蛋白的實例可在下表2中找到。
[表2]：具有磷脂醯絲胺酸結合結構域的受體/蛋白的實例
Figure 109130528-A0202-12-0027-2
Figure 109130528-A0202-12-0028-3
在本揭露之一個實施方式中，PS結構域衍生自具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列的人MFG-E8。在本揭露之可替代實施方式中，整聯蛋白結合結構域係來自人EDIL3(SEQ ID NO：11)的PS結合結構域，其中PS結合結構域包含SEQ ID NO：11的胺基酸135-453。
PS結合活性可以藉由本領域眾所周知的方法來確定。例如，在實例第3.1節中描述了PS結合測定，其中藉由與生物素化的鼠MFG-E8的結合競爭來評估本發明之融合蛋白與包被在微量滴定板上的PS的結合。根據本揭露，如果PS結合結構域具有對人MFG-E8蛋白(顯示於SEQ ID NO：1中)觀察到的PS結合活性的至少10%，例如至少25%、至少50%、至少75%、至少80%、較佳的是至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，則該PS結合結構域被認為具有PS結合活性(這係當用相同的方法測定各自的活性時，較佳的是當用第3.1節的實例中所述之測定來測試時)。
橋接蛋白
有許多包含整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域兩者的內源蛋白。下表3中顯示了此類「橋接蛋白」的實例。
[表3]：包含整聯蛋白和磷脂醯絲胺酸結合結構域的橋接蛋白
Figure 109130528-A0202-12-0028-4
Figure 109130528-A0202-12-0029-5
為了具有治療價值，如果橋接蛋白包含識別吞噬細胞上的整聯蛋白(其典型地對蛋白水解切割或脫落不敏感，如在TAM家族成員或其他PS結合受體中所觀察到的)的整聯蛋白結合結構域，則這係有用的。具有PS結合結構域和整聯蛋白結合結構域的蛋白，例如MFG-E8或其旁系同源物EDIL3/DEL1，已顯示出在體外誘導胞葬作用，並且因此作為AOI中的胞葬作用誘導劑具有治療價值。相反，例如，GAS6蛋白在促進AOI中的胞葬作用方面可能不是特別有效，因為如上所述，其在吞噬細胞(MerTK)上的吞噬細胞在炎症和感染過程中被蛋白水解切割。
如上表3所示，橋接蛋白的一個實例係MFG-E8，它係乳脂肪球膜(MFGM)中發現的主要蛋白之一。MFG-E8由幾種不同類型的細胞(例如，乳腺上皮細胞、血管細胞、附睾上皮細胞、主動脈平滑肌細胞、活化的巨噬細胞、受刺激的子宮內膜和未成熟的樹突細胞)和組織(例如心、肺、乳腺、脾、腸、肝、腎、腦、血液和內皮)表現。MFG-E8蛋白也有幾種不同的名稱，例如乳凝集素、BP47、組分15/16、MEGM、MGP57/53、PAS-6/PAS-7糖蛋白、細胞壁蛋白SED1、精子表面蛋白SP47、乳腺上皮抗原BA46和O-乙醯GD3神經節苷脂合酶 (AGS)。MFG-E8基因位於大鼠的1號染色體上、小鼠的7號染色體上和人的15號染色體上。MFG-E8的前-mRNA的可變剪接導致人蛋白的三種同種型和兩種形式的mRNA，長變體和短變體在小鼠乳腺中表現。人MFG-E8基因(UniProtKB-Q08431)編碼長387個殘基的蛋白，其可被加工成多個蛋白產物。人MFG-E8的胺基酸序列(包括訊息肽(殘基1-23；帶底線)，EGF樣結構域(殘基24-67；斜體)，C1結構域(殘基70-225；粗體)和C2結構域(殘基230-387；粗體並帶底線))如下提供：
Figure 109130528-A0202-12-0030-6
Figure 109130528-A0202-12-0030-7
(SEQ ID NO：1)。
MFG-E8缺乏MFGM具有的跨膜功能，並且因此可作為外周膜蛋白。人MFG-E8由一個與吞噬細胞上表現的αvβ3和αvβ5整聯蛋白結合的N末端EGF樣結構域(SEQ ID NO：2)和包含與陰離子磷脂以高親和力結合的兩個F5/8-網柄菌凝素亞結構域(C1和C2)的PS結合結構域(SEQ ID NO：3)組成。整聯蛋白結合係位於人MFG-E8(SEQ ID NO：1)殘基46-48中的RGD模體的結果。凋亡細胞、細胞碎片、超活化細胞和大多數微粒(MP)暴露PS並且是MFG-E8的靶，MFG-E8作為橋接分子，調理該等細胞和微粒並將它們與吞噬細胞上的αvβ3和αvβ5整聯蛋白連接。這種橋接作用觸發了有效的吞噬程式，導致細胞、碎片和微粒的內化。MFGM中發現的蛋白在整個物種中皆為高度保守的。MFG-E8的蛋白結構因物種而異；目前已知的所有物種都包含兩個C結構域，但EGF樣結構域的數量不同。例如，人MFG-E8蛋白包含一個EGF樣結構域，而牛 MFG-E8和鼠MFG-E8(SEQ ID NO：68)具有兩個EGF樣結構域，而雞、青蛙和斑馬魚則具有三個EGF樣-結構域。先前已經提出了MFG-E8的結構域作為治療劑的成分，特別是MFG-E8的PS結合結構域(Kooijmans等人，(2018)Nanoscale[奈米尺度]，10(5)：2413-2426)和片段已經被描述為在纖維化模型中起作用(美國專利申請US 2018/0334486)。
專性和非專性吞噬細胞對瀕死細胞、碎片和微粒的非炎性攝取在組織損傷後的體內穩態中起著至關重要的作用(Greenlee-Wacker(2016)同上)。適當清除的重要性在遺傳模型中變得更為明顯，在遺傳模型中MFG-E8敲除小鼠顯示出例如組織中(未清除的)瀕死細胞數量增加，疾病模型(如新生兒敗血症、自體免疫性、血管生成不良和傷口癒合受損)中的炎症反應增加(Hanayama等人，(2004)Science[科學]，204(5474)：1147-50；Das等人，(2016)J Immunol.[免疫學雜誌]，196(12)：5089-5100；Hansen等人，(2017)J Pediatr Surg.[兒科外科雜誌]，52(9)：1520-7)。
此外，已顯示MFG-E8可藉由抑制T細胞活化和增殖，抑制Th1、Th2和Th17亞群同時增加調節性T細胞亞群(Treg)來產生致耐受性環境。有趣的是，Treg藉由誘導巨噬細胞的胞葬作用來貢獻於炎症的消退(Proto等人，(2018)Immunity[免疫]，49(4)：666-77)。已經描述了MFG-E8促進跨MHC屏障的胚胎幹細胞衍生組織的同種異體移植(Tan等人，(2015)Stem Cell Reports[幹細胞報導]，5(5)：741-752)。MFG-E8還具有多種營養用途，該用途有助於促進組織發育和針對感染原的保護。糖蛋白(例如MFG-E8)係潛在的用於食物和藥物應用的健康增強型營養品。MFG-E8也可以與其他營養物質(例如益生菌、乳清蛋白微團、α-羥基異己酸、瓜胺酸和支鏈脂肪酸)組合使用。
增溶結構域
如本文所述，本揭露之治療性融合蛋白包含整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域。另外，融合蛋白還包含賦予融合蛋白許多期望性質的另外結構域。該另外結構域(處於本申請的目的被稱為「增溶結構域」)賦予改善的生物學特性，例如增加的溶解度，減少的聚集和增加的生物活性。結果，融合蛋白顯示出期望的藥物動力學譜。此外，增溶結構域的存在改善了治療性融合蛋白的穩定性，並且使得在細胞表現系統中融合蛋白的表現與野生型蛋白相比得以改善，如藉由純化後產率的增加所表明。
增溶結構域的存在還可以賦予治療性融合蛋白延長的半衰期。例如，許多蛋白藥物與聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體支架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)和血清蛋白(如白蛋白、IgG和FcRn)連接，以延長其血漿半衰期並達到增強的治療效果(Kim等人，(2010)J Pharmacol Exp Ther.[藥理學和實驗治療學雜誌]，334：682-92；Weimer等人，(2008)Thromb Haemost.[血栓形成和止血]99：659-67；Dumont等人，(2006)BioDrugs[生物藥物]，20：151-60；Schellenberger等人，(2009)Nat Biotechnol.[自然生物技術]，27：1186-90)。
在一些實施方式中，增溶結構域係白蛋白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA；SEQ ID NO：4)或其變體。例如，HSA包含具有較低聚集傾向的胺基酸取代C34S(SEQ ID NO：5)，或HSA的結構域，例如HSA D3；(SEQ ID NO：6)。由於許多因素(包括其相對較大的尺寸(可減少腎臟濾過作用)及其新生兒Fc受體(FcRn)結合特徵)HSA具有非常長的血清半衰期，從而避免了細胞內降解。還已經提出使用HSA的N末端片段與多肽融合(例如專利申請EP399666)。因此，將該分子遺傳地或化學地融合或軛合至白蛋白可以穩定或延長保質期，和/或保留分子在溶液中、在體外和/或在體內的活性持續延長的時間段。關於HSA融合的另外方法可以在例如國際專利申請WO 2001/077137和WO 2003/060071中找到。
在一些實施方式中，增溶結構域包含抗體Fc結構域，例如人Fc-免疫球蛋白G1(Fc-IgG1；SEQ ID NO：7)。Fc結構域也可以被修飾，例如，藉由使用基於杵臼(KiH)(藉由在Fc的CH3結構域中引入互補的胺基酸取代)的修飾，來改善Fc的異二聚化。例如，取代T366W在一個CH3結構域上產生「杵」，取代T366S、L368A和Y407V在另一個CH3結構域上產生「臼」(Merchant等人(1998)Nat.Biotechnol.[自然生物技術]，16(7)：677-81；EU編號IgG1)。Fc結構域中可以包括的單獨或與修飾組合以改善異二聚體化的另外的修飾可以包括，例如，胺基酸取代為半胱胺酸以產生另外的半胱胺酸鍵，例如S354C和/或Y349C，和減少或消除與Fcγ受體和補體蛋白C1q的結合從而使免疫效應子功能「緘默」的胺基酸取代。所謂的「LALA」雙突變(L234A和L235A一起；EU編號)導致效應子功能減弱(Lund等人，(1992)Mol Immunol.[分子免疫學]，29：53-9)。另外，「DAPA」雙突變(D265A和P329A；EU編號)導致效應子功能減弱。在本揭露之一個實施方式中，Fc結構域可包含用於Fc緘默的胺基酸取代D265A、P329A和/或KiH胺基酸取代T366W(杵)或T366S、L368A和Y407V(臼)。在一個實施方式中，Fc結構域衍生自人IgG1並且包含胺基酸取代D265A、P329A(SEQ ID NO：8)。在另一個實施方式中，Fc結構域衍生自人IgG1，並包含胺基酸取代D265A、P329A、S354C和胺基酸取代T366W(Fc-IgG1-杵；SEQ ID NO：9)。在另一個實施方式中，Fc結構域衍生自人IgG1，並且包含胺基酸取代D265A、P329A、Y349C和胺基酸取代T366S、L368A和Y407V(Fc-IgG1-臼；SEQ ID NO：10)。
在一些實施方式中，增溶結構域包含衍生自人IgA、IgD、IgE或IgM的抗體Fc結構域。
在一些實施方式中，增溶結構域包含SUMO(小泛素樣修飾劑)、泛素、GST(麩胱甘肽S-轉移酶)或其變體。
治療性融合蛋白的結構域的連接和定向
本揭露之融合蛋白的整聯蛋白結合結構域、PS結合結構域和增溶結構域被連接。如本文所用，術語「連接的」或「連接」係指融合蛋白的一個結構域直接或間接地附接於融合蛋白的另一結構域。直接附接係連接的一種形式，並且在本文中稱為「融合的」或「融合」。以具有A-B-C形式的分子為例：結構域A直接連接到結構域B，並且直接連接到結構域C。這樣，結構域A也可以描述為與結構域B融合，該結構域B與結構域C融合。作為另一個實例，結構域A直接連接到結構域B，並且間接連接到結構域C。這樣，結構域A也可以描述為與結構域B融合，該結構域B藉由內部連接子間接連接到結構域C。
在一些實施方式中，該連接係直接連接，並且因此該結構域彼此融合。在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域與PS結合結構域融合，該PS結合結構域與增溶結構域融合。具體而言，PS結合結構域(例如C1-C2網柄菌凝素亞結構域)融合至整聯蛋白結合結構域(例如，EGF樣結構域)的C末端，並融合至增溶結構域(例如，HSA)的N末端。在一些實施方式中，增溶結構域與整聯蛋白結合結構域融合，該整聯蛋白結合結構域與PS結合結構域融合。具體而言，整聯蛋白結合結構域(例如，EGF樣結構域)融合至增溶結構域(例如，HSA)的C末端，並融合至PS結合結構域(例如，C1-C2網柄菌凝素亞結構域)的N末端。在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域與包含C1-C2網柄菌凝素亞結構域的PS結合結構域融合，並且增溶結構域插入在C1-C2網柄菌凝素亞結構域之間。具體地，整聯蛋白結合結構域(例如，EGF樣結構域)的C末端與C1網柄菌凝素亞結構域的N末端融合，並且C1網柄菌凝素亞結構域的C末端與增溶結構域(例如HSA)的N末端融合，並且增溶結構域的C末端與C2網柄菌凝素亞結構域的N末端融合。在另一個實施方式中，整聯蛋白結合結構域與增溶結構域融 合，該增溶結構域與PS結合結構域融合。具體而言，增溶結構域(例如，HSA)融合至整聯蛋白結合結構域(例如，EGF樣結構域)的C末端，並融合至PS結合結構域(例如，C1-C2網柄菌凝素亞結構域)的N末端。在一個實施方式中，HSA融合至EGF樣結構域的C末端，並融合至C1網柄菌凝素結構域的N末端。
在一些實施方式中，增溶結構域(例如HSA)融合在整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域之間。在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域位於融合蛋白的N末端，並且PS結合結構域位於融合蛋白的C末端。
在一些實施方式中，融合蛋白包含含有整聯蛋白結合結構域(例如EGF樣結構域)的第一區域，包含增溶結構域(例如HSA)的第二區域和包含PS結合結構域(例C1和/或C2網柄菌凝素結構域)的第三區域。在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域位於融合蛋白的N末端，並且PS結合結構域位於融合蛋白的C末端。
在一些實施方式中，增溶結構域(例如HSA)融合在整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域之間。在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域位於融合蛋白的N末端，並且PS結合結構域位於融合蛋白的C末端。
在一些實施方式中，融合蛋白包含含有整聯蛋白結合結構域(例如EGF樣結構域)的第一區域，包含增溶結構域(例如HSA或Fc)的第二區域和包含PS結合結構域(例C1和/或C2網柄菌凝素結構域)的第三區域。在一些實施方式中，整聯蛋白結合結構域位於融合蛋白的N末端，並且PS結合結構域位於融合蛋白的C末端。
在一些實施方式中，增溶結構域係HSA。
在一些實施方式中，增溶結構域係抗體Fc-免疫球蛋白G1(Fc-IgG1；SEQ ID NO：7)。
在一些實施方式中，增溶結構域(例如HSA)係包含SEQ ID NQ：5所示的胺基酸序列的HSA或其功能變體。
在一個較佳的實施方式中，包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列融合至HSA與MFG-E8的EGF樣結構域的C末端，並融合至MFG-E8的PS結合結構域的N末端。在一個實施方式中，融合蛋白包含SEQ ID NO：46(FP068)所示的胺基酸序列。在一個實施方式中，融合蛋白包含SEQ ID NO：48(FP776)所示的胺基酸序列。
在可替代實施方式中，包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列融合至HSA與EDIL3的EGF樣結構域的C末端，並融合至EDIL3的PS結合結構域的N末端。在一個實施方式中，融合蛋白包含SEQ ID NO：70(FP1068)所示的胺基酸序列。在一個實施方式中，融合蛋白包含SEQ ID NO：69(FP1776)所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，連接係藉由多肽連接子並且例如在本揭露之融合蛋白中將增溶結構域與PS結合結構域連接的多肽連接子稱為「外部連接子」。該等外部連接子典型地包含甘胺酸(G)和/或絲胺酸(S)，並且還可以包含甘胺酸和白胺酸(GL)或甘胺酸和纈胺酸(GL)。在一些實施方式中，連接子包含多個G和S殘基，例如G2S及其倍數，例如SEQ ID NO：62所示的(G2S)4，SEQ ID NO：63所示的(GS)4，SEQ ID NO：64所示的G4S或SEQ ID NO：65所示的(G4S)2。
在一些實施方式中，外部連接子融合在整聯蛋白結合結構域的C末端與增溶結構域的N末端之間。具體而言，外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端和HSA的N末端。在一些實施方式中，外部連接子融合在增溶結構域的C末端和PS結合結構域的N末端之間。具體而言，外部連接子融合至HSA的C末端和PS結合結構域的N末端。在一些實施方式中，外部連接子融合在整聯蛋白結合 結構域的C末端和增溶結構域的N末端之間，並且另外的外部連接子融合在增溶結構域的C末端和PS結合結構域的N末端之間。具體而言，外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端和HSA的N末端，並且另外的外部連接子融合至HSA的C末端和PS結合結構域的N末端。
在一些實施方式中，包含GS的外部連接子融合至整聯蛋白結合結構域的C末端並融合至增溶結構域的N末端。在一些實施方式中，包含GL的外部連接子融合至增溶結構域的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。在一些實施方式中，包含(G2S)4(SEQ ID NO：62)的外部連接子融合至增溶結構域的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。在一些實施方式中，包含G4S(SEQ ID NO：64)的外部連接子融合至增溶結構域的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。在一些實施方式中，包含(G4S)2(SEQ ID NO：65)的外部連接子融合至增溶結構域的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。
在一個實施方式中，包含GS的外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端並融合至HSA的N末端。本揭露之包含該結構的融合蛋白具有SEQ ID NO：58(FP816)所示的胺基酸序列。
在一個實施方式中，包含GS的外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端並融合至HSA的N末端，並且包含(GS)4(SEQ ID NO：63)的另外的外部連接子融合至HSA的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。本揭露之包含該結構的融合蛋白具有SEQ ID NO：52(FP138)所示的胺基酸序列。
在一個實施方式中，包含GS的外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端並融合至HSA的N末端，並且包含(G2S)4(SEQ ID NO：62)的另外的外部連接子融合至HSA的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。本揭露之包含該結構的融合蛋白具有SEQ ID NO：42(FP330)所示的胺基酸序列。
在一個實施方式中，包含GS的外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端並融合至HSA的N末端。HSA的C末端直接融合至PS結合結構域的N末端。本揭露之包含該結構的融合蛋白具有SEQ ID NO：50(FP284)所示的胺基酸序列。
在一個實施方式中，包含GS的外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端並融合至HSA的N末端，並且包含G4S(SEQ ID NO：64)的另外的外部連接子融合至HSA的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。本揭露之包含該結構的融合蛋白具有SEQ ID NO：54(FP811)所示的胺基酸序列。
在一個實施方式中，包含GS的外部連接子融合至EGF樣結構域的C末端並融合至HSA的N末端，並且包含(G4S)2(SEQ ID NO：65)的另外的外部連接子融合至HSA的C末端並融合至PS結合結構域的N末端。本揭露之包含該結構的融合蛋白具有SEQ ID NO：56(FP010)所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，His標籤與包含GS(GS-6xHis；SEQ ID NO：66)的外部連接子融合，該GS與PS結合結構域的C末端融合。在一個實施方式中，本揭露之包含His標籤的融合蛋白具有SEQ ID NO：44(FP278)或SEQ ID NO：60(FP114)所示的胺基酸序列。
治療性融合蛋白的功能特性
本揭露提供了衍生自人MFG-E8的融合蛋白，並且該融合蛋白有效促進胞葬作用並且因此在消除全身性炎症和微血管病理學的關鍵驅動因子方面具有活性。如實例中所述，具有EGF-HSA-C1-C2的一般結構的融合蛋白已在許多胞葬作用測定中顯示有效。例如，融合蛋白已有效恢巨噬細胞的被脂多糖(LPS)或金黃色葡萄球菌損害的胞葬作用，並增強了內皮細胞對微粒和瀕死細 胞的胞葬作用。在急性腎損傷的小鼠模型中，融合蛋白還已有效抑制微粒依賴性凝血酶的產生，並保護腎功能並防止體重減輕。
示例性蛋白序列
表4中的胺基酸序列包括本揭露之治療性融合蛋白及其部分的實例。
在本申請的全文中，如果說明書文本(例如，表4)與序列表之間存在差異，則以說明書文本為准。
[表4].示例性蛋白序列
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本申請還包括SEQ ID NO：69、70和72中每個的變體，其中在該變體中包括的EDIL3序列的EGF樣結構域對應於以下序列中的任何一個：SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、或SEQ ID NO：101。
本申請還包括治療性融合蛋白，該治療性融合蛋白包含MFGE8或EDIL3的整聯蛋白結合結構域，以及PS結合結構域，例如TIM4的IgSF V結構域或橋接蛋白GAS6變體的GLA結構域(例如FP1147和FP1148)。
本公開之蛋白的修飾
本申請包括本文所述之蛋白的在結構域中具有各種修飾的變體和/或其片段，以及所揭露分子的融合物和軛合物。例如，治療性融合蛋白的結構域可以具有胺基酸殘基的保守修飾，並且其中與包含親本結構域的融合蛋白相比，經修飾的蛋白保留或具有增強的特性。可替代地，治療性融合蛋白的結構域可具有一個或多個胺基酸殘基的缺失，其中與包含親本結構域的蛋白相比，經修飾的融合蛋白保留或具有增強的特性。可替代地，治療性融合蛋白可具有一個或多個胺基酸殘基的插入，其中與未經修飾的蛋白相比，經修飾的蛋白保留或具有增強的特性。在一個實施方式中，這樣的胺基酸插入包括以多種組合的甘胺酸或絲胺酸殘基，以作為親本蛋白的結構域之間的連接子。
可以進行定點誘變或PCR介導的誘變以引入一個或多個突變，並且可以在體外或體內測定中評價對整聯蛋白和/或PS結合或其他目的功能特性的影響。可以引入保守修飾(如上所述)和/或突變可以是胺基酸取代、添加或缺失。此外，典型地結合結構域內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基被改變。
具有治療性融合蛋白的胺基酸序列變體(其特性與未經修飾的變體基本相似)可藉由將適當的核苷酸變化引入編碼DNA中或藉由合成期望的變體來製備。此類變體包括例如本發明分子的胺基酸序列內殘基的缺失、插入或取代。在一些實施方式中，變體可包括另外的連接子序列，減少的連接子序列或連接子序列的去除，和/或一個或多個胺基酸的胺基酸突變或取代和缺失。可 以進行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終構建體，條件係最終構建體具有期望的特徵。胺基酸變化還可以改變分子的翻譯後過程，諸如改變可能的糖基化位點的數量或位置。
產生重組分子的方法
核酸和表現系統
在一個實施方式中，本申請提供了一種重組產生治療性融合蛋白的一個或多個多肽鏈的方法，該方法包括：1)產生一種或多種DNA構建體，該DNA構建體包含編碼多特異性結合分子的多肽鏈的核酸分子；2)將所述一種或多種DNA構建體引入一種或多種表現載體中；3)將所述一種或多種表現載體共轉染在一種或多種宿主細胞中；和4)在宿主細胞或溶液中表現並組裝該分子。
在這方面，本揭露提供了編碼本文所述之治療性融合蛋白的分離的核酸，例如一種或多種多核苷酸。核酸分子包括單鏈和雙鏈形式的DNA和RNA，以及相應的互補序列。本發明之核酸分子包括全長基因或cDNA分子以及其片段的組合。本發明之核酸衍生自人來源，但本發明包括衍生自非人物種的核酸。
「分離的核酸」係在從天然存在的來源分離的核酸的情況下，與分離了核酸的生物體的基因組中存在的相鄰遺傳序列分開的核酸。在以酶促方式從模板或以化學方式合成的核酸(如PCR產物、cDNA分子、或寡核苷酸)的情況下，應理解，由此類過程產生的核酸係分離的核酸。分離的核酸分子係指單獨片段形式或作為較大核酸構建體的組分的核酸分子。在一個較佳的實施方式中，核酸基本上不含污染性的內源材料。核酸分子較佳的是衍生自以基本上純的形式和以使得能夠藉由標準生物化學方法(如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]，第2版，紐約冷泉港的冷泉 港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1989)中概述的那些)鑒定、操縱和回收其組分核苷酸序列的量或濃度分離至少一次的DNA或RNA。此類序列較佳的是以不被典型地存在於真核基因中的內部非翻譯序列或內含子中斷的可讀框的形式提供和/或構建。非翻譯DNA的序列可以存在於可讀框的5'或3'，其中該序列不干擾編碼區的操縱或表現。
本發明還提供了包含至少一種如上所述之多核苷酸的呈質體、表現載體、轉錄或表現盒形式的表現系統和構建體。此外，本發明提供了包含此類表現系統或構建體的宿主細胞。
在一個實施方式中，本揭露提供了一種製備治療性融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟：(a)培養包含編碼該融合蛋白的核酸的宿主細胞，其中該培養的宿主細胞表現該融合蛋白；以及(b)從該宿主細胞培養物中回收該融合蛋白。
本揭露還提供了表現載體和宿主細胞，用於產生上述治療性融合蛋白。術語「載體」係指適合於轉化或轉染宿主細胞並且包含指導和/或控制(與宿主細胞結合)一個或多個與其可操作地連接的異源編碼區的表現的核酸序列的任何分子或實體(例如核酸，質體，噬菌體或病毒)。可以使用各種表現載體來表現編碼該分子的鏈或結合結構域的多核苷酸。基於病毒的表現載體和非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生治療性融合蛋白。非病毒載體和系統包括質體、附加型載體(典型地具有用於表現蛋白或RNA的表現盒)、和人類人工染色體(參見例如，Harrington等人，(1997)Nat Genet.[自然遺傳學]15：345)。例如，可用於在哺乳動物(例如，人)細胞中表現多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pThioHis A、pThioHis B和pThioHis C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、pEBVHis B和pEBVHis C(加利福尼亞州聖地牙哥市英傑公司(Invitrogen,San Diego,CA))，MPSV載體和本領域中已知用於表現其他蛋白的多種其他載體。 有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體，基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP愛巴病毒(HBP Epstein Barr virus)的載，牛痘病毒載體和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)。參見，Brent等人，(1995)同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物學年度評論]49：807；和Rosenfeld等人，(1992)Cell[細胞]68：143。
表現載體的選擇取決於要表現該載體的預期宿主細胞。典型地，表現載體含有與編碼治療性融合蛋白的多核苷酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列(例如，增強子)。在一些實施方式中，採用誘導型啟動子以防止插入的序列在誘導條件之外的條件下表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除了啟動子之外，還可能需要或期望其他調節元件以高效表現治療性融合蛋白。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，可以藉由包括適合於使用的細胞系統的增強子提高表現效率(參見例如，Scharf等人，(1994)Results Probl.Cell Differ.[細胞分化中的結果和問題]20：125；和Bittner等人，(1987)Meth.Enzymol.[酶學方法]，153：516)。例如，SV40增強子或CMV增強子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
表現載體還可提供分泌訊息序列位置，以與藉由插入結合結構域和/或增溶結構域的上述序列編碼的多肽形成融合蛋白。更常見的是，插入序列在包含在載體中之前與訊息序列連接。載體允許將結合結構域和增溶結構域表現為融合蛋白，從而導致產生完整的工程改造的蛋白。當在適當條件下培養時，宿主細胞可以用於表現工程改造的蛋白，該工程改造的蛋白隨後可從培養基中收集(如果宿主細胞將其分泌到培養基中)或直接從產生它的宿主細胞中收集(如果不是分泌性的)。適當宿主細胞的選擇將取決於各種因素，如期望的表 現水平、活性(如糖基化或磷酸化)期望或必需的多肽修飾以及折疊成生物活性分子的便宜性。宿主細胞可以是真核或原核細胞。
可用作表現宿主的哺乳動物細胞系係本領域熟知的並且包括但不限於可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的永生化細胞系，並且本領域已知的表現系統中使用的任何細胞系均可以用於製備本發明之重組融合蛋白。一般來講，用包含編碼期望融合蛋白的DNA的重組表現載體轉化宿主細胞。可採用的宿主細胞係原核生物、酵母或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌(E.coli)或桿菌(bacilli)。高等真核細胞包括昆蟲細胞和已建立的哺乳動物細胞系。合適的哺乳動物宿主細胞系的示例包括COS-7細胞、L細胞、C127細胞、3T3細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或在無血清培養基中生長的它們的衍生物和相關細胞系、HeLa細胞、BHK細胞系、CV-1 EBNA細胞系、人胚胎腎(HEK)細胞(如293、293 EBNA或MSR 293)、人表皮A431細胞、人Colo205細胞、其他轉化的靈長類動物細胞系、正常二倍體細胞、源自原代組織的體外培養的細胞株、原代外植體、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。視需要，當期望在各種訊息傳導或報告蛋白測定中使用多肽時，哺乳動物細胞系(如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49)可以用於多肽的表現。替代性地，可以在低等真核生物(如酵母)或在原核生物(如細菌)中產生多肽。合適的酵母包括巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、克魯維酵母屬菌株、假絲酵母屬、或能夠表現異源多肽的任何酵母菌株。合適的細菌菌株包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、或能夠表現異源多肽的任何細菌菌株。如果融合蛋白在酵母或細菌中製備，則可能期望修飾其中產生的產物，例如藉由適當位點的磷酸化或糖基化，以便獲得功能性產物。此類共價附接可以使用已知的化學或酶促方法實現。
用於引入含有目的多核苷酸序列的表現載體的方法根據細胞宿主的類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。其他方法包括，例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導的轉化、注射和顯微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、聚陽離子：核酸軛合物、裸露的DNA、人工病毒體、與皰疹病毒結構蛋白VP22融合、藥劑增強的對DNA的攝取、和離體轉導。對於重組蛋白的長期高產量生產，通常期望穩定的表現。例如，可以使用含有病毒複製起點或內源表現元件和可選擇標記基因的本揭露之表現載體製備穩定地表現工程改造的蛋白的細胞系。在引入載體後，可以使細胞在富集培養基中生長1-2天，然後將它們轉換為選擇性培養基。選擇性標記的目的係賦予選擇抗性，並且它的存在允許在選擇性培養基中成功地表現引入的序列的細胞生長。可以使用適合於細胞類型的組織培養技術來增殖抗性、穩定轉染的細胞。
融合蛋白典型地作為分泌的多肽從培養基中回收，但當它們直接產生而無分泌信號時也可以從宿主細胞裂解物中回收。如果該多肽係膜結合的，則可以使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X 100)將其從膜上釋放出來。
當該融合蛋白在非人源細胞的重組細胞中產生時，它完全不含人源蛋白或多肽。但是，有必要從重組細胞蛋白或多肽純化融合蛋白。作為第一步，通常將培養基或裂解液離心以去除顆粒細胞碎片。產生的分子可以方便地藉由羥基磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親和層析純化，其中親和層析係較佳的純化技術。還可以使用用於蛋白純化的其他技術，諸如在離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、二氧化矽上層析、肝素瓊脂糖上層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沈澱。
在某些方面，本文提供了病毒載體，該病毒載體包含編碼本發明之治療性融合蛋白的多核苷酸。在一些實施方式中，病毒載體衍生自AAV。在某些實施方式中，將病毒載體投與給其中治療性融合蛋白被表現的受試者例如人，並且可以用於治療和/或預防本文列出的疾病。
藥物組成物
在另一方面，本揭露提供了包含本發明之治療性融合蛋白以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑的組成物，例如藥物組成物。這樣的組成物可以包含本揭露之治療性融合蛋白之一或本揭露之治療性融合蛋白的組合(例如，兩種或更多種不同的治療性融合蛋白)。
本文所述之藥物組成物也可以在聯合療法中，即與其他藥劑組合地投與。例如，聯合療法可以包括本揭露之融合蛋白，其與例如至少一種抗炎劑、抗感染劑或免疫抑制劑組合。可以用於組合療法中的治療劑的實例更詳細地描述於以下關於本揭露之治療性融合蛋白的用途的章節中。
為了製備包括本揭露之融合蛋白的藥物或無菌組成物，將該融合蛋白與藥學上可接受的載劑或賦形劑混合。
術語「藥學上可接受」意指由聯邦或州政府的監管機構批准或者列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍認可的藥典中適用於動物並且更特別地適用於人。
術語「藥物組成物」係指至少一種活性成分(例如，工程改造的蛋白)和至少一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑的混合物。
「藥物」係指用於醫療的物質。
如本文所用，「藥學上可接受的載劑」包括在生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。 該載劑應適合於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。在一個實施方式中，載劑應適合於皮下途徑。根據投與途徑，活性化合物(即融合蛋白)可以包被在材料中以保護化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然條件的作用。
本文所述之藥物組成物可包含一種或多種藥學上可接受的鹽。本文所述之藥物組成物還可包含藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括：水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基苯甲醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以用於本文所述之藥物組成物中的合適的水性和非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(如橄欖油)和可注射有機酯(如油酸乙酯)。適當流動性可以例如藉由以下方式來維持：藉由使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散體的情況下藉由維持所需粒度，以及藉由使用表面活性劑。
該等組成物也可以含有輔助劑如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以同時藉由滅菌程序和藉由包括各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、三氯三級丁醇、苯酚山梨酸等)來確保阻止微生物的存在。還令人希望的是在組成物中包括等滲劑，如糖、氯化鈉等。另外，可以藉由包括延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來實現可注射藥物形式的延長吸收。
藥學上可接受的載劑包括無菌水性溶液或分散液、以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。此類介質和試劑用作藥物活性物質的用途係本領域中已知的。除非任何常規介質或試劑與活性化合物不相容，否 則可考慮將其用於本發明之藥物組成物中。還可以將補充活性化合物併入組成物中。
治療性組成物典型地必須在製造和儲存條件下是無菌且穩定的。可以將組成物配製為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度的其他有序結構。該載劑可以是溶劑或分散介質，該溶劑或分散介質含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適合的混合物。例如，可以藉由使用塗層(如卵磷脂)、藉由在分散體的情況下維持所需顆粒大小以及藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，可以在組成物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。
可以在Cleland等人，(1993)Crit Reviews Ther Drug Carrier Systems[治療性藥物載劑系統重要綜述]，10(4)：307-377和Wei W(1999)Int J Pharmaceutics[藥劑學雜誌國際版]，185：129-88中找到關於穩定蛋白配製物開發的綜述。
被用於真皮內、或皮下應用的溶液或懸浮液典型地包括以下組分中的一種或多種：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩衝液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節滲透壓的試劑，如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼調節pH，如鹽酸或氫氧化鈉。該等製劑可以封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶中。
無菌可注射溶液可以藉由以下方式來製備：視需要將活性化合物以所需量併入含有上文所列舉成分中的一種或組合的適當溶劑中，之後進行滅菌微孔過濾。總體上，藉由將本發明之融合蛋白摻入無菌媒介物來製備分散體，該無菌媒介物含有基礎分散介質以及來自以上列舉的所需其他成分。在用於製 備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，製備方法係真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，其從活性成分加上任何另外的期望的成分的事先經無菌過濾的溶液產生該活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。
可以與載劑材料組合以產生單一劑型的活性成分的量將根據所治療的受試者和特定的投與方式而變化。可以與載劑材料組合以產生單一劑型的活性成分的量通常為產生治療效果的組成物的量。通常，在百分之百的範圍內，這個量的範圍將是從約0.01%至約99%的活性成分、從約0.1%至約70%或從約1%至約30%的活性成分與藥學上可接受的載劑組合。
為治療性的工程改造的蛋白選擇投與方案取決於若干種因素，包括實體的血清或組織周轉速率、症狀水平、實體的免疫原性和生物基質中的靶標細胞可及性。在某些實施方式中，投與方案使遞送至患者的與可接受水平的副作用一致的治療劑的量達最大。因此，遞送的蛋白的量部分地取決於特定實體和正在治療的病症的嚴重程度。可獲得選擇合適劑量的生物和小分子的指南(參見，例如，Bach(編輯)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases[自體免疫性疾病中的單株抗體和肽療法]，Marcel Dekker,紐約，N.Y.；Baert，等人(2003)New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]348：601-608；Milgrom，等人(1999)New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]341：1966-1973；Slamon，等人(2001)New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]344：783-792；Beniaminovitz，等人(2000)New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]342：613-619；Ghosh，等人(2003)New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]348：24-32；Lipsky，等人(2000)New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]343：1594-1602)。
由臨床醫生，例如，使用本領域已知或疑似影響治療或預計影響治療的參數或因素確定適當的劑量。通常，劑量始於略小於最佳劑量的量並此後將其以小增量增加，直至相對於任何不利副作用，實現所希望的或最佳的效 果。重要的診斷量值包括症狀(例如炎症)的那些量值或產生的炎性細胞介素的水平。
可以改變本揭露的藥物組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得一定量的活性成分，該活性成分的量有效地實現對於特定的患者、組成物和投與方式的期望的治療反應，而對該患者沒有毒性。所選擇的劑量水平將取決於各種藥物動力學因素，包括所採用的本揭露特定組成物的活性、投與途徑、投與時間、所採用的特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所採用的特定組成物組合的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史、以及醫學領域中已知的類似因素。
調整劑量方案以提供最佳的所期望的反應。例如，如由治療情況的緊急狀態所指示的，可以投與單次推注，可以隨著時間投與若干個分次劑量，或可以按比例減少或增加劑量。可以特別有利地以單位劑型配製腸胃外組成物以易於投與和實現劑量均勻性。如本文所用，單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療受試者的物理上離散的單位；每個單位含有經計算產生期望治療作用的預定量的活性化合物以及所需藥物載劑。本發明劑量單位形式的規格係藉由以下指定並且直接取決於以下：活性化合物的獨特特徵和有待實現的特定治療效果，以及在混配此類活性化合物用於治療個體的敏感性的領域中的固有限制。
對於治療性融合蛋白的投與，劑量在約0.0001至150mg/kg宿主體重範圍內，諸如皮下投與5、15和50mg/kg，並且更通常0.01至5mg/kg宿主體重。示例性治療方案需要每週投與一次，每兩週一次，每三週一次，每四週一次，每個月一次，每3個月一次或每三至6個月一次。
本發明之治療性融合蛋白可以在多種情況下投與。單一劑量之間的間隔可以是例如每週、每個月、每三個月或每年。如藉由測量患者中工程改 造的蛋白的血液水平所示，間隔也可以是無規律的。在一些方法中，調節劑量以獲得約1-1000μg/ml並且在一些方法中約25-300μg/ml的血漿蛋白濃度。
可替代地，治療性融合蛋白可以作為持續釋放配製物投與，在這種情況下需要不太頻繁的投與。劑量和頻率取決於患者體中的蛋白的半衰期而變化，並且可以取決於治療係預防性還是治療性而變化。在預防性應用中，在長時間段內以相對不頻繁的間隔投與相對較低的劑量。一些患者可以在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短的間隔給予相對較高的劑量直至病症或疾病進展減少或終止，或者直至患者顯示病症或疾病症狀的部分或完全改善。此後，可以向患者投與預防性方案。
可以改變本發明藥物組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得一定量的活性成分，該活性成分的量有效地實現對於特定的患者、組成物和投與方式的所期望的治療反應，而對患者沒有毒性。所選擇的劑量水平取決於多種藥物動力學因素，包括所採用的本揭露之特定組成物的活性、投與途徑、投與時間、所採用的特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所用特定組成物組合的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史、以及醫學領域中已知的類似因素。
本發明之融合蛋白的「治療有效劑量」可導致病症或症狀或疾病的嚴重程度降低和/或預防由於病症導致的損害或殘疾。
可以使用本領域已知的各種方法中的一種或多種，藉由一種或多種投與途徑投與本揭露之組成物。如熟悉該項技術者將理解的，投與途經和/或模式將根據所希望結果而變化。用於本發明之工程改造的蛋白的投與途徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下、脊柱或其他腸胃外投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，短語「腸胃外投與」意指除了腸道和局部投與以外的投與方式，通常藉由注射投與，並且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、 鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬腦膜外以及胸骨內注射和輸注。
可替代地，本發明之治療性融合蛋白可以藉由非腸胃外途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑。
本揭露之治療性融合蛋白可以與載劑一起製備，該等載劑將防止蛋白快速釋放，如控制釋放配製物，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊化遞送系統。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類和聚乳酸。用於製備此類配製物的方法係獲得專利權的或係熟悉該項技術者通常已知的。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[緩控釋藥物遞送系統]，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.[馬塞爾德克爾公司]，紐約，1978。
在某些實施方式中，可以配製本發明之治療性融合蛋白以確保適當的體內分佈。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高度親水性化合物。為了確保本發明之治療性化合物穿過BBB(如果需要)，可以將它們配製在例如脂質體中。對於製造脂質體的方法，參見例如，美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質體可以包含一個或多個部分，該一個或多個部分被選擇性運輸至特定細胞或器官中，因此增強靶向藥物遞送(參見例如，Ranade VV(1989)J.Clin.Pharmacol.[臨床藥理學雜誌]，29：685)。
本發明之治療用途和方法
本發明的治療性融合蛋白具有體外和體內診斷和治療用途。例如，可以將該等分子投與至培養中(例如體外)或受試者中(例如體內)的細胞來治療、預防或診斷多種障礙。該方法特別適用於治療、預防或診斷急性或慢性炎性和免疫系統驅動的器官和微血管障礙。
本發明之治療性融合蛋白可用於但不限於治療、預防或改善急性和慢性炎性器官損傷，特別是其中用於去除瀕死細胞、細胞碎片和促血栓形成性/促炎性微粒的內源性體內穩態清除機制或胞葬作用途徑明顯下調的炎性損傷。急性炎性器官損傷的實例包括心肌梗塞、急性腎損傷(AKI)、急性中風和炎症以及由缺血/再灌注引起的器官損傷，例如胃腸道、肝、脾、肺、腎、胰腺、心、腦、脊髓和/或壓傷的四肢的缺血/再灌注。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防或改善血液凝固的抑制或減慢、微生物組治療、炎性腸病(IBD)、脂肪酸攝取和/或降低的胃動力、微血栓形成依賴性障礙、動脈粥樣硬化、心臟重塑、組織纖維化、急性肝損傷、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血管疾病、與年齡有關的血管障礙、腸道疾病、敗血症、骨骼障礙、癌症、地中海貧血、胰腺炎、肝炎、心內膜炎、肺炎、急性肺損傷、骨關節炎、牙周炎、組織創傷引起的炎症、結腸炎、糖尿病、失血性休克、移植排斥、放射引起的損害、脾腫大、敗血症引起的AKI或多器官衰竭、急性燒傷、成人和兒童呼吸窘迫綜合症、傷口癒合、腱修復和神經疾病。
在一個實施方式中，神經疾病可以選自具有神經精神病學、神經炎性和/或神經退行性成分的病症，其包括症狀，例如疾病綜合症、噁心、被動回避、行為敏捷性抑制、記憶障礙和記憶功能障礙。神經疾病的實例包括與澱粉樣蛋白β有關的神經疾病，例如阿茲海默氏症、巴金森氏病和抑鬱症。
在一個實施方式中，骨障礙可以選自包括骨質疏鬆症、骨軟化症、骨質硬化和骨硬化病的病症。更特別地，本揭露之融合蛋白的投與可以抑制至少一種破骨細胞標誌物例如NFATc1、組織蛋白酶K和αvβ3整聯蛋白的表現。在一個實施方式中，該投與抑制破骨細胞生成。在另一個實施方式中，該投與抑制RANKL誘導的破骨細胞生成。在另一個實施方式中，該投與抑制骨吸 收。在另一個實施方式中，該投與抑制至少一種骨吸收刺激子(例如包含以下的骨吸收刺激子：TNF、IL-6、IL-17A、MMP-9、Ptgs2、RANKL、Tnfsfl 1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5及其組合)的表現。在另一個實施方式中，該投與抑制選自由IL-8和CCL2/MCP-1組成的組中的至少一種促炎細胞介素的表現。
在一個實施方式中，組織纖維化可以是肝、肺、隔膜、腎、腦、心中的纖維化，其中本發明之融合蛋白降低了膠原蛋白表現。在一個實施方式中，肺纖維化係間質性肺纖維化(IPF)。在一個實施方式中，肝纖維化係肝硬化，其可歸因於或可不歸因於NASH。
多種呼吸疾病的特徵係凋亡細胞的積累。此外，慢性阻塞性肺疾病(COPD)中巨噬細胞的缺陷性胞葬作用和吞噬作用與病情加重和嚴重程度有關。本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防或改善呼吸疾病，例如急性呼吸窘迫症候群或COPD。本揭露之治療性融合蛋白還可用於以下的診斷、治療、預防或改善：急性肺損傷(ALI)，例如吸入或吸進有毒的外源或內源性化合物或藥物引起的肺損傷；由肺水腫、休克、胰腺炎、燒傷、胸部創傷或多創傷、放射、敗血症、病原體(細菌、病毒或寄生蟲例如瘧原蟲)引起的肺損傷；導致低氧血症的慢性肺功能不全疾病。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防由冠狀型病毒(例如SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS-CoV)引起的肺損傷或改善其嚴重程度。在一個實施方式中，提供本發明之治療性融合蛋白用於治療COVID 19患者的SARS-CoV-2感染。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防與輸注相關的肺功能不全(TRALI)或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防導致低氧血症的慢性肺功能不全疾病或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白(例如包含本揭露之EDIL3的結構域的治療性融合蛋白)還可用於診斷、治療、預防術後腹膜黏連或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防心臟衰竭或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防血液透析或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防移植物功能延遲或移植物抗宿主疾病或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防嚴重凍傷、戰壕足病、壞疽性膿皮病/壞疽或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防由細菌、真菌、病毒或寄生蟲引起的病理學(例如敗血症或例如在炭疽、鼠疫、壞死性軟組織感染(NSTI，例如壞死性筋膜炎)、骨髓炎、瘧疾中由病原體直接誘導的其他病理學)或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防由造成損傷的事故(例如工作事故、跌倒、交通事故、子彈和戰鬥損傷或其他損傷機制)引起的創傷/多創傷或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白還可用於診斷、治療、預防破骨細胞介導的病理學或改善其嚴重程度。
本揭露之治療性融合蛋白可以作為單獨的活性成分或與其他藥物(例如免疫抑制劑或免疫調節劑或其他抗炎劑或例如細胞毒性劑或抗癌劑)聯合(例如作為佐劑)或組合投與，例如以治療或預防上述疾病。
對於與另外的治療劑的「組合」投與意指在受試者患有障礙的過程期間，將兩種(或更多種)不同治療遞送至受試者，例如在受試者被診斷患 有障礙後並且在該障礙被治癒或消除或由於其他原因終止治療之前遞送兩種或更多種治療。在一些實施方式中，第一治療的遞送在第二治療的遞送開始時仍在進行，所以就投與而言存在重疊。這在本文中有時被稱為「同時遞送」或「並行遞送」。在其他實施方式中，一種治療的遞送在另一種治療的遞送開始前結束。在每一種情況的一些實施方式中，治療因組合投與而更有效。例如，第二治療更有效，例如，與第一治療不存在的情況下投與第二治療所觀察到的結果相比，使用較少的第二治療觀察到等效的作用，或者第二治療使症狀減少更大的程度，或對第一治療觀察到類似的情況。在一些實施方式中，與一種治療不存在的情況下遞送另一種治療所觀察到的結果相比，遞送使得症狀或與該障礙相關的有他參數減少更多。兩種治療的作用可以部分累加、完全累加或大於累加。該遞送可以使得當遞送第二治療時，遞送的第一治療的作用仍然是可以檢測的。
術語「並行」不限於在完全相同的時間投與療法(例如，預防劑或治療劑)，而是意指將包含本揭露之其治療性融合蛋白的藥物組成物以一定的順序並在一定的時間間隔內投與至受試者，以使得融合蛋白可以與一種或多種另外的治療劑一起發揮作用，以提供與如果以其他方式投與相比增加的益處。例如，可以將每種療法在相同的時間或以任何次序依序在不同的時間點投與至受試者；然而，如果不在相同的時間投與，則應當在時間上充分接近地投與該療法，以提供所希望的治療或預防作用。可以將每種療法以任何適當的形式並且藉由任何合適的途徑分別投與至受試者。
可以同時地(以與所揭露的融合蛋白相同或分開的藥物組成物)或依次地投與本文所述之治療性融合蛋白和另外的治療劑。對於依次投與，可以首先投與本文所述之融合蛋白，然後可以投與另外的試劑，或者可以顛倒投 與順序。與融合蛋白相比，可以藉由相同或不同的投與途徑將一種或多種另外的治療劑投與至受試者。
可以將如本文所述之治療性融合蛋白和/或一種或多種另外的治療劑、程序或方式在活性障礙期間，或在緩解期或活性較低的疾病期間投與。可以將本文所述之治療性融合蛋白在其他治療之前、與治療並行、治療後或在障礙緩解期間投與。
當組合投與時，本文所述之治療性融合蛋白和另外的治療劑(例如，第二或第三藥劑)或全部以比單獨使用(例如，作為單一療法)的每種藥劑的量或劑量更高、更低或相同的量或劑量投與。在某些實施方式中，本文所述之治療性融合蛋白、另外的藥劑(例如，第二或第三藥劑)或全部比單獨使用(例如，作為單一療法)的每種藥劑的量或劑量更低(例如，至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%)。在其他實施方式中，導致期望的效果(例如，治療炎性疾病或病症)的本文所述之治療性融合蛋白、另外的藥劑(例如，第二或第三藥劑)或全部的量或劑量比單獨使用(例如作為單一療法)的每種藥劑實現相同治療效果所需的量或劑量低(例如低至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%)。
例如，本揭露的治療性融合蛋白可以與以下藥物組合使用：DMARD，例如，金鹽、柳氮磺吡啶、抗瘧藥、胺甲喋呤、D-青黴胺、硫唑嘌呤、黴酚酸、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、米諾環素(minocycline)、來氟米特(leflunomide)、糖皮質激素；鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如環孢素A或FK 506；淋巴細胞再循環的調節劑，例如FTY720和FTY720類似物；mTOR抑制劑，例如雷帕黴素(rapamycin)、40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性的子囊黴素，例如ABT-281、ASM981等；皮質類固醇；環磷醯胺；硫唑嘌呤；來氟米特；咪唑立賓(mizoribine)； 黴酚酸
Figure 109130528-A0202-12-0103-63
啉基乙酯；15-去氧精脈菌素或其免疫抑制性相似物、類似物或衍生物；免疫抑制性單株抗體，例如針對白血球受體的單株抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配位基；其他免疫調節化合物，例如重組結合分子，該重組結合分子具有CTLA4的細胞外結構域的至少一部分或其突變體，例如CTLA4中與非CTLA4蛋白序列例如CTLA4Ig(例如指定為ATCC 68629)或其突變體例如LEA29Y接合的至少細胞外部分或其突變體；黏附分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或ICAM-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化學治療劑，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿嘧啶；抗TNF劑，例如TNF的單株抗體，例如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII的受體構建體，例如依那西普(Etanercept)、PEG-TNF-RI；促炎細胞介素的阻滯劑，IL-1阻滯劑，例如阿那白滯素或IL-1陷阱、卡那單抗(canakinumab)，IL-13阻滯劑，IL-4阻滯劑，IL-6阻滯劑；趨化因子阻滯劑，例如蛋白酶例如金屬蛋白酶的抑制劑或活化劑，抗IL-15抗體，抗IL-6抗體，抗IL-4抗體，抗IL-13抗體，抗CD20抗體，NSAID，諸如阿司匹林或抗感染劑；損傷相關分子模式(DAMP)或病原體相關分子模式(PAMP)拮抗劑，例如轉換劑、排毒劑、去除劑，例如ATP轉換劑、HMGB-1調節劑、組蛋白解毒劑；超抗原誘導的免疫反應抑制劑；補體抑制劑和體外血漿置換設備。
套組
套組也包括在本發明之範圍內，該套組由例如本揭露之治療性融合蛋白的組成物和使用說明書組成。此類套組包含治療有效量的根據本揭露之融合蛋白。另外，此類套組可以包含用於投與治療性融合蛋白的工具(例如， 自動注射器、注射器和小瓶、預填充注射器、預填充筆)以及使用說明書。該等套組可包含另外的治療劑(如下所述)，用於治療患有自體免疫性疾病或炎性障礙或AOI的患者。此類套組還可包含用於投與治療性融合蛋白以治療患者的說明書。此類說明書可以提供用於所包裝的融合蛋白的劑量、投與途徑、方案和總治療持續時間。套組典型地包括標籤，該標籤指示套組內容物的預期用途。術語標籤包括套組上提供或與套組附帶提供的任何書面或記錄材料。套組可進一步包括用於診斷患者是否屬於對如上所定義的本發明之治療性融合蛋白的治療有反應的組的工具。
[實施方式]
本揭露提供以下實施方式：
1.一種用於增強胞葬作用之治療性融合蛋白，該治療性融合蛋白包含整聯蛋白結合結構域、磷脂醯絲胺酸(PS)結合結構域和增溶結構域。
2.如實施方式1所述之融合蛋白，其中該增溶結構域係：
(i)連接至該整聯蛋白結合結構域；
(ii)連接至該PS結合結構域；
(iii)插入在該整聯蛋白結合結構域和該PS結合結構域之間；
(iv)插入在該整聯蛋白結合結構域中；或
(v)插入在該PS結合結構域中。
3.如實施方式1或實施方式2所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域與一種或多種整聯蛋白結合。
4.如實施方式3所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域與αvβ3和/或αvβ5和/或α8β1整聯蛋白結合。
5.如實施方式3或實施方式4所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域包含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)模體。
6.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域直接連接至該整聯蛋白結合結構域，至PS結合結構域或這兩個結構域。
7.如實施方式1至6中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域藉由連接子間接連接至該整聯蛋白結合結構域和/或該PS結合結構域。
8.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域包含人血清白蛋白(HSA)、HSA的結構域3(HSA D3)、Fc-IgG、或其功能變體。
9.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域包含人血清白蛋白(HSA)或其功能變體。
7.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
8.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該PS蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少90%序列同一性；或該PS蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：76的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
9.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域係HSA並且具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
10.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具 有至少90%序列同一性，並且該PS結合結構域具有SEQ ID NO：78的胺基酸序列或與SEQ ID NO：78的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
11.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：77的胺基酸序列或與SEQ ID NO：77的胺基酸序列具有至少90%序列同一性，並且該PS結合結構域具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：76的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
12.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中所述融合蛋白：
a.在人內皮細胞-Jurkat細胞胞葬作用測定中促進內皮細胞的胞葬作用；
b.在人巨噬細胞-中性粒細胞的胞葬作用測定中恢復受損的巨噬細胞的胞葬作用；
c.在人內皮細胞-微粒胞葬作用測定中藉由清除而減少血漿微粒的數量；和/或
d.在急性腎損傷模型中預防多器官損傷。
13.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，該融合蛋白依次包含：整聯蛋白結合結構域-HSA-PS結合結構域。
14.一種治療性融合蛋白，該治療性融合蛋白包含MFG-E8和增溶結構域，其中該MFG-E8從N末端到C末端包含：EGF樣結構域，C1結構域和C2結構域，並包含來自野生型人MFG-E8(SEQ ID NO：1)、或具有SEQ ID NO：75的MFG-E8、或其功能變體的序列。
15.如實施方式14所述之融合蛋白，其中該增溶結構域插入在該EGF樣結構域和該C1結構域之間。
16.如實施方式14或實施方式15所述之融合蛋白，其中該增溶結構域係HSA、HSA D3或Fc-IgG或其功能變體。
17.如實施方式1-16中任一項所述之融合蛋白，其中該工程改造的蛋白具有SEQ ID NO：42的胺基酸序列或與SEQ ID NO：42的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
18.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：44的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少90%序列同一性；或具有SEQ ID NO：47的胺基酸序列或與SEQ ID NO：47的胺基酸序列具有至少90%序列同一性；或具有SEQ ID NO：48的胺基酸序列或與SEQ ID NO：48的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
19.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：80的胺基酸序列或與SEQ ID NO：80的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
20.如前述實施方式中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：82的胺基酸序列或與SEQ ID NO：82的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
21.一種分離的核酸，該分離的核酸編碼如實施方式17至20中任一項所述之胺基酸序列。
22.一種選殖載體或表現載體，該選殖載體或表現載體包含如實施方式21所述之核酸。
23.一種包含如實施方式21所述之分離的核酸的病毒載體，較佳的是，包含根據如實施方式21所述之分離的核酸的病毒載體衍生自AAV。
24.如實施方式23所述之病毒載體，其中將該載體投與給有需要的受試者，例如人受試者。
25.如實施方式23所述之病毒載體，用於治療和/或預防本文列出的疾病。
26.一種適於產生治療性融合蛋白的重組宿主細胞，該重組宿主細胞包含一個或多個如實施方式22所述之選殖載體或表現載體、以及視需要的分泌信號。
27.如實施方式26所述之重組宿主細胞，其中該宿主細胞係例如原核、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。
28.如實施方式1至20中任一項所述之融合蛋白，其中該蛋白在宿主細胞中的表現導致至少10mg/L的產率。
29.如實施方式1至20中任一項所述之融合蛋白，其中該蛋白在哺乳動物細胞中的表現導致產率比野生型MFG-E8(SEQ ID NO：1)增加至少100倍。
30.一種藥物組成物，該藥物組成物包含如實施方式1至20中任一項所述之融合蛋白和至少一種藥學上可接受的載劑。
31.一種治療或預防有需要的個體的炎性障礙或炎性器官損傷的方法，該方法包括向該個體投與治療有效量的如實施方式1至20中任一項所述之融合蛋白。
32.如實施方式1至20中任一項所述之融合蛋白，用於治療或預防有需要的個體的炎性障礙或炎性器官損傷。
33.如實施方式31所述之方法或如實施方式32所述之用途，其中該炎性障礙或炎性器官損傷係急性腎損傷、敗血症、心肌梗塞、急性中風、燒傷、創傷以及由缺血/再灌注引起的炎性和器官損傷。
34.如實施方式31所述之方法或如實施方式32所述之用途，其中該炎性障礙或炎性器官損傷係急性腎損傷。
35.如實施方式31所述之方法或如實施方式32所述之用途，其中該炎性障礙或炎性器官損傷係心肌梗塞。
36.如實施方式31所述之方法或如實施方式32所述之用途，其中該炎性障礙或炎性器官損傷係中風。
37.如實施方式31所述之方法或如實施方式32所述之用途，其中該炎性障礙或炎性器官損傷係急性肺損傷(例如急性呼吸窘迫症候群)或肝損傷或急性腸道損傷。
38.如實施方式31所述之方法或如實施方式32所述之用途，其中該融合蛋白與另一種治療劑組合投與。
39.如實施方式38所述之方法或用途，其中該另一種治療劑係免疫抑制劑、免疫調節劑、抗炎劑、抗氧化劑、抗感染劑、細胞毒性劑或抗癌劑。
40.一種治療性融合蛋白，該治療性融合蛋白包含MFG-E8和增溶結構域，其中該MFG-E8從N末端到C末端包含：EGF樣結構域，C1結構域和C2結構域，並包含來自野生型人MFG-E8(SEQ ID NO：1)、或SEQ ID NO：75、或其功能變體的序列。
41.如實施方式40所述之融合蛋白，其中該增溶結構域連接至MFG-E8(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：75)的N末端或C末端。
42.如實施方式40所述之融合蛋白，其中該增溶結構域插入在該EGF樣結構域和該C1結構域之間。
43.如實施方式41所述之融合蛋白，其中該增溶結構域插入在該C1結構域和該C2結構域之間。
44.如實施方式40至43中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域係HSA、HSA D3或Fc-IgG或其功能變體。
38.一種分離的核酸，該分離的核酸編碼如實施方式33-37中任一項所述之融合蛋白。
39.一種選殖載體或表現載體，該選殖載體或表現載體包含如實施方式38所述之核酸。
40.一種包含如實施方式38所述之分離的核酸的病毒載體，較佳的是，包含根據如實施方式38所述之分離的核酸的病毒載體衍生自AAV。
41.如實施方式40所述之病毒載體，其中將該載體投與給有需要的受試者，例如人受試者。
42.如實施方式40所述之病毒載體，用於治療和/或預防本文列出的疾病。
43.一種適於產生治療性融合蛋白的重組宿主細胞，該重組宿主細胞包含一個或多個如實施方式39所述之選殖載體或表現載體、以及視需要的分泌信號。
44.如實施方式43所述之重組宿主細胞，其中該宿主細胞係例如原核、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。
45.如實施方式33至37中任一項所述之融合蛋白，其中該蛋白在宿主細胞中的表現導致至少10mg/L的產率。
46.如實施方式33至37中任一項所述之融合蛋白，其中該蛋白在哺乳動物細胞中的表現導致產率比野生型MFG-E8增加至少100倍。
應當理解的是，每個實施方式可以與一個或多個其他實施方式組合，直到達到此類組合與實施方式的描述相一致的程度。還應理解，以上提供的實施方式應理解為包括所有實施方式，包括由實施方式的組合產生的此類實施方式。
本文引用的所有參考，包括專利、專利申請、論文、出版物、教科書等，以及其中引用的參考，在它們尚未的程度上，藉由引用以其全文特此併入。
實例
提供以下實例以進一步說明本揭露，但不限制本揭露之範圍。本揭露之其他變型對熟悉該項技術者而言將是顯而易見的，且也為所附申請專利範圍所涵蓋。
實例1：融合蛋白的產生
MFG-E8係多結構域蛋白，該多結構域蛋白由N末端表皮生長因子(EGF樣)結構域和兩個C末端凝集素C型結構域(C1和C2)組成。如文獻中記載的為了產生重組全長人蛋白的嘗試已經顯示蛋白聚集並且表現率非常低(Castellanos等人，(2016)Protein Expression Purification[蛋白表現純化]1124：10-22)。因此，為了嘗試增溶蛋白並提高其表現，我們研究了將多種蛋白融合至MFG-E8的效果。
來自人Fc-IgG1、人血清白蛋白(HSA)和HSA的結構域3(HSA D3)的增溶結構域(SD)在不同位置融合至MFG-E8；如圖1所示，在N或C末端，或在EGF與C1或C1和C2結構域之間。此外，與Fc-IgG1或HSA的融合有潛力延長分子在體內的半衰期，因為該等蛋白與FcRn結合。MFG-E8與Fc-IgG1或HSA的融合還可以提高融合蛋白的產量和溶解度(Castellanos等人，(2016)同上)，如以下實例所示。
表5顯示了包含HSA插入物的融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42)與人新生兒Fc受體的融合(也參見實例5.1)。
[表5]：融合蛋白FP330與人FcRn的結合親和力
Figure 109130528-A0202-12-0112-56
實例2：wtMFG-E8和MFG-E8 HSA融合的產生；表現和純化
產生融合蛋白的方法描述如下；簡而言之，根據以下方法產生了MFG-E8和MFG-E8融合體和EDIL融合體，特別是與HSA的融合體。
DNA在基因藝術公司(GeneArt)(德國雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成並使用基於限制酶-連接的選殖技術選殖到哺乳動物表現載體中。將所得質體轉染到HEK293T細胞中。為了暫態表現蛋白，使用聚乙烯亞胺(PEI；目錄號24765，聚合科學公司(Polysciences,Inc.))將針對野生型或工程改造的鏈的載體轉染入懸浮液適應的HEK293T細胞中。典型地，用含有100μg編碼工程改造的鏈的表現載體的DNA轉染以1-2 Mio細胞/ml的密度懸浮的100ml細胞。然後將重組表現載體引入宿主細胞中，並藉由進一步培養細胞7天的時段來產生構建體，以允許分泌到補充有0.1%普朗尼克酸(pluronic acid)、4mM麩醯胺酸和0.25μg/ml抗生素的培養基(HEK，無血清培養基)中。
然後使用固定化金屬離子親和層析(IMAC)、蛋白A捕獲或抗HSA捕獲層析從無細胞上清液中純化產生的構建體。
當IMAC捕獲了帶有組胺酸標籤的蛋白時，經過濾的條件培養基與IMAC樹脂(通用健康醫療集團(GE Healthcare))混合，並用1% triton和20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、20mM咪唑(pH 7.0)平衡。用15柱體積的20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、20mM咪唑(pH 7.0)將樹脂洗滌三次，然後用10柱體積的洗脫緩衝液(20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、500mM咪唑(pH 7.0))洗脫蛋白。
當藉由蛋白A或抗HSA層析捕獲蛋白時，經過濾的條件培養基與蛋白A樹脂(CaptivA PriMabTM，瑞普利金公司(Repligen))或抗HSA樹脂(捕獲選擇人白蛋白親和基質(Capture Select Human Albumin affinity matrix)，賽默公司(Thermo))混合，並用PBS(pH 7.4)平衡。用15柱體積的PBS(pH 7.4)洗滌樹脂三次，然後用10柱體積的洗脫緩衝液(50mM檸檬酸鹽、90mM NaCl(pH 2.5))洗脫蛋白，並用1M TRIS pH 10.0中和pH。
最後，洗脫的級分藉由使用尺寸排阻層析(HiPrep Superdex 200，16/60，通用生命科學公司(GE Healthcare Life Sciences)進行精製，並藉由SDS-PAGE針對Precision Plus蛋白未染色標準標誌物(伯樂公司(Biorad)，ref#161-0363)進行分析。
融合蛋白的代表性表現凝膠如圖2所示：圖2A：EGF-HSA-C1-C2蛋白(FP330；SEQ ID NO：42)；圖2B：EDIL3蛋白的EGF-HSA-C1-C2(FP050；SEQ ID NO：12)；圖2C：未還原和還原的EGF-Fc(KiH)C1-C2蛋白。該蛋白係FP071(EGF-Fc(杵)-C1-C2；SEQ ID NO：18)與Fc-IgG1臼(SEQ ID NO：10)的異二聚體；圖2D：EGF-HSA-C1蛋白(FP260；SEQ ID NO：34)。在還原和未還原條件下的蛋白如圖2C所示，因為異二聚體在還原條件下趨於分解，因此測試了兩種條件。表6顯示了另一組融合蛋白純化後的表現和產率的結果；從表現數據可以看出，MFG-E8的HSA融合體(即使在不同位置與HSA融合)與 wtMFG-E8相比表現提高了至少100倍。如表6的右欄中所示，MFG-E8的HSA融合體也顯示出比wtMFG-E8的在產率方面增加至少100倍。
[表6]：在HEK細胞系中表現的融合蛋白的表現和產率
Figure 109130528-A0202-12-0114-57
根據上述方法產生本揭露之治療性融合蛋白的其他實例，並藉由SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)進一步分析，該SDS-PAGE基於蛋白的分子量分離蛋白。將每種蛋白與Laemmli緩衝液混合，然後載入到聚丙烯醯胺凝膠上(伯樂公司，4%-20% Mini-PROTEAN TGX免染色)。在200V下在TRIS-甘胺酸-SDS運行緩衝液中遷移30分鐘後，凝膠中包含的蛋白在免染色成像儀(伯樂公司，Gel Doc EZ)中顯示。如圖2E所示，SDS-PAGE顯示已經產生和純化的重組蛋白：
泳道1、12：分子量標誌物(伯樂公司，精確加蛋白(Precision plus protein))
泳道2：His6_EGF[MFG-E8]_C1[MFG-E8] 23.87kDa
泳道3：EGF[MFG-E8]_C1[MFG-E8]_His6 23.87kDa
泳道4：EGF[MFG-E8]_HSA_C1[MFG-E8]連接子1 90.43kDa
泳道5：EGF[MFG-E8]_HSA_C1[MFG-E8]連接子2 89.31kDa
泳道6：EGF[MFG-E8]_HSA_C1[MFG-E8] 88.77kDa
泳道7：EGF[EDIL3]_HSA_C1[EDIL3] 98.22kDa
泳道8：EGF[EDIL3]_HSA_C2[EDIL3] 98.20kDa
泳道9：EGF[MFG-E8]_HSA_C2[MFG-E8] 88.45kDa
泳道10：EGF[EDIL3]_HSA_C1_C2[MFG-E8] 115.67kDa
泳道11：EGF[MFG-E8]_HSA_C1_C2[EDIL3] 107.32kDa
實例3：MFG-E8-HSA工程改造的蛋白的表徵
3.1 磷脂醯絲胺酸結合(生化)
將L-α-磷脂醯絲胺酸(腦，豬，Avanti 840032，美國阿拉巴馬州)溶解在氯仿中，用甲醇稀釋，並以1μg/mL包被在384孔微量滴定板(COrning TM 3653，肯納邦克(Kennebunk)緬因州，美國)上。在4℃孵育過夜後，使用SpeedVac TM 系統(Thermo Scientific TM )蒸發溶劑。在室溫下，用含3%無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)處理板1.5小時。
藉由與生物素化的鼠MFG-E8/乳凝集素(內部產生，mMFG-E8：生物素)的結合競爭來評估融合蛋白與L-α-磷脂醯絲胺酸的結合。將蛋白在含有3%無脂肪酸BSA的PBS(pH7.4)中稀釋，並與L-α-磷脂醯絲胺酸包被的微量滴定板孵育30分鐘。以1nM添加含有3%無脂肪酸BSA的PBS(pH 7.4)中的mMFG-E8：生物素，並再孵育30分鐘。藉由離解增強型鑭系元素螢光免疫測定(DELFIA TM )洗滌緩衝液(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer)1244-114 MA，美國)藉由三個洗滌步驟除去未結合的mMFG-E8：生物素。在室溫下於DELFIA TM 測定緩衝液(珀金埃爾默公司1244-111 MA，美國)中添加經銪標記的鏈黴親和素(珀金埃爾默公司1244-360，Wallac Oy，芬蘭)放置20分鐘。隨後是用DELFIA TM 測定緩衝液進行的三個洗滌步驟。銪係按照製造商的說明(珀金埃爾默公司1244-105，麻塞諸塞州波士頓，美國)顯示的。銪的時間分辨螢光藉由Envision TM 2103多標記酶標儀(珀金埃爾默公司，康涅狄格州，美國)進行定量。使用MS Excel和GraphPad Prism軟體進行數據分析。
聚丙烯板係典型地在實驗室中用於連續稀釋的低蛋白結合微量滴定板。與聚苯乙烯相比，該等板具有減少稀釋過程中蛋白損失的優勢，並且典型地被歸類為「低蛋白結合」板。當在聚丙烯板中製備wtMFG-E8的稀釋液時，與在非結合板中製備的稀釋液相比，wtMFG-E8在L-α-磷脂醯絲胺酸競爭測定中損失了效力。如圖3所示，該等數據表明，當使用已經針對低蛋白結合進行了優化的聚丙烯板時，wtMFG-E8在液體處理和稀釋步驟中會部分損失(圖3A)。該等結果表明，wtMFG-E8的固有黏性在實驗室中以及極有可能在藥物製造和生產過程中提出挑戰，在該等情況下需要進行捕獲和精製步驟才能生產出高產率和非常高純度的原料藥。相反，與wtMFG-E8相比，工程改造的蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)的黏性顯著降低，並且在非結合板相比於在聚丙烯中進行的稀釋之間幾乎沒有觀察到差異(圖3B)。該等數據表明，將增溶結構域插入本發明之蛋白中可以改善其技術處理，從而提高步驟產率，並且因此提高製造過程中的總產率。
融合蛋白與L-α-磷脂醯絲胺酸結合的評估如圖4所示。工程改造的MFG-E8衍生的蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)以濃度依賴性的方式與固定化的PS結合並且在較小程度上與磷脂心磷脂結合(圖4A)。使用針對wtMFG-E8的EGF-L結構域的抗體來檢測FP278與固定化的L-α-磷脂醯絲胺酸的結合或與心磷脂(1,3-雙(sn-3'-磷脂醯)-sn-甘油)的結合。幾種重組融合蛋白與固定化的L-α-磷脂醯絲胺酸的結合強度如圖4B所示。人wtMFG-E8與融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)和FP260(EGF-HSA-C1；SEQ ID NO：34)以濃度依賴性方式有效與1nM生物素化小鼠MFG-E8競爭結合固定化的L-α-磷脂醯絲胺酸。與人wtMFG-E8相比，融合蛋白獲得的IC50值表示工程改造的蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)的C1-C2結構域的高度相似的L-α-磷脂醯絲胺酸結合強度。出人意料地， 該等數據還表明人C2結構域不與L-α-磷脂醯絲胺酸相互作用或僅與其弱相互作用，如FP270(EGF-HSA-C2；SEQ ID NO：36)的結果所示，FP270連同FP250(EGF-HSA；SEQ ID NO：32)不以這種測定形式競爭。測試了FP100(EGF-C2-C2蛋白(SEQ ID NO：26))並且不以這種測定形式競爭(未顯示)，使C1結構域作為人MFG-E8中的主要PS結合部分。這一發現出人意料，因為大量文獻表明MFG-E8的C2結構域係負責PS結合的主要結構域(Andersen等人，(2000)Biochemistry[生物化學]，39(20)：6200-6；Shi & Gilbert(2003)Blood[血液]，101：2628-2636；Shao等人，(2008)J Biol Chem.[生物化學雜誌]，283(11)：7230-41)。總之，該等發現表明，C1結構域係MFG-E8工程改造的蛋白的主要整體PS結合結構域，並且對於PS結合依賴性功能很重要。這樣，C1結構域可用於取代進入異源蛋白以賦予PS結合；但是，對於包含C1-C2或C1-C1串聯結構域的融合蛋白，顯示最高PS結合(未顯示)。
3.2 αv整聯蛋白黏附測定
將融合蛋白在pH 7.4的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋，並藉由吸附(96孔板，Nunc Maxisorb)過夜(1.2nM/孔)來固定50μL的24nM溶液。隨後在室溫下用含有3%無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的PBS處理板1.5小時。將表現αvβ3整聯蛋白的淋巴瘤細胞(ATCC-TIB-48 BW5147.G.1.4，ATCC，美國)培養在補充有GlutaMax、25mM HEPES、10% FBS、Pen/Strep、1mM丙酮酸鈉、50μM β-巰基乙醇的RPMI 1640中。在黏附實驗前一天將細胞分開。用3μg/mL 2',7'-雙-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基螢光素乙醯氧基甲酯(BCECF AM)(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc)，美國)標記細胞30分鐘。將BW5147.G.1.4細胞重懸浮於黏附緩衝液(TBS，0.5% BSA，1mM MnCl2，pH 7.4)中，並在RT下使50000個細胞/孔黏附40分鐘。藉由用黏附緩衝液反復洗滌 除去非黏附細胞。使用EnvisionTM 2103多標記酶標儀，珀金埃爾默公司，美國對黏附細胞的螢光進行定量。使用MS Excel和GraphPad Prism軟體進行數據分析。
細胞對固定化的融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42)的黏附被αv整聯蛋白抑制劑西侖吉肽或10mM EDTA完全阻斷，表明細胞對固定化的工程改造的蛋白的整聯蛋白依賴性黏附(圖5A)。EGF樣結構域(FP280；SEQ ID NO：38)的整聯蛋白結合模體RGD的單點突變(RGD>RGE)導致細胞黏附的完全消除，表明融合蛋白中有功能性且易於接近的RGD結合模體對於αv整聯蛋白依賴性黏附至關重要(圖5B)。固定化的缺乏C1-C2結構域的EGF-HSA蛋白FP250(SEQ ID NO：32)儘管有EGF樣結構域，但不支持或僅勉強支持BW5147.G.1.4細胞的黏附(圖5C)。該發現表明，在測試的實驗條件下，可能由於空間原因，融合至HSA的EGF樣結構域中的RGD環可能不足以能夠接近細胞表面整聯蛋白。一旦C1、C2或C1-C2在C末端位置融合到EGF-HSA，這種干擾就不明顯了。如果在CHO細胞或HEK細胞中表現，則本揭露之重組蛋白例如FP330類似於wtMFG-E8地促進αv-整聯蛋白依賴性細胞黏附(圖5D)。
綜上所述，該等數據表明，本發明之融合蛋白與細胞整聯蛋白結合，支持整聯蛋白依賴性細胞黏附，並表明在具有HSA結構域插入物的蛋白中，C末端EGF樣結構域可以從C末端融合的蛋白結構域獲益以支持整聯蛋白結合。
3.3 人巨噬細胞-中性粒細胞胞葬作用測定
藉由Ficoll梯度離心(Ficoll®-Paque PLUS，通用健康醫療集團，瑞典)從血沈棕黃層中分離出人外周血單核細胞(PBMC)，然後使用幹細胞分離套組(幹細胞19059，溫哥華，加拿大)對單核細胞進行負選擇。使用重組人M-CSF 40ng/mL(巨噬細胞群落刺激因子，R & D系統公司(R & D Systems)，美國)在含有25mM HEPES、10% FBS、Pen/Strep、1mM NaPyr，50μM β-Merc 的RPMI 1640中5天，使單核細胞分化為「M0」巨噬細胞。胞葬作用前一天，使用紅色螢光染料連接子套組(西格瑪公司(Sigma)MINI26，美國)用PKH26標記巨噬細胞。將細胞重懸浮於包含25mM HEPES、10% FBS、Pen/Strep、1mM NaPyr、50μM β-Merc的RPMI 1640中，並以40000個細胞/孔接種到黑色96孔板(康寧公司(Corning)，美國)中，並允許黏附20小時。
中性粒細胞：藉由葡聚糖沈降結合FicollTM密度梯度從血沈棕黃層中分離出人中性粒細胞，如下所示：藉由稀釋的血沈棕黃層的離心除去血沈棕黃層的血漿。將細胞收穫物用1%葡聚糖(得自明串珠菌屬物種，MW 450.000-650.000；西格瑪公司，美國)稀釋，並在冰上沈降20-30分鐘。
從上清液收集白血球並置於FicollTM-Paque層(通用健康醫療集團瑞典)上。離心後，收集沈澱，並使用紅血球(RBC)裂解緩衝液(生物概念公司(BioConcept)，瑞士)裂解剩餘的紅血球。中性粒細胞在培養基(含有25mM HEPES、10% FBS、Pen/Strep、0.1mM NaPyr、50uM b-Merc的RPMI 1640+GlutaMax)中洗滌一次，並在15℃保持過夜。細胞凋亡/細胞死亡係藉由在37℃下用1μg/mL Superfas Ligand(恩佐生命科學公司(Enzo Life Sciences)，洛桑，瑞士)處理嗜中性白血球3小時而誘導的。中性粒細胞用Hoechst 33342(生命技術公司(Life technologies)，美國)染色25分鐘，並用DRAQ5(e生物科學公司(eBioscience)，英國，1：2000稀釋)在37℃在黑暗中染色5分鐘。
胞葬作用測定
將M0巨噬細胞與融合蛋白一起孵育30分鐘。以M0/中性粒細胞1：4的比率添加凋亡標記的中性粒細胞。利用中性粒細胞在M0巨噬細胞的低pH溶酶體區室中定位後DRAQ5的螢光強度增加，可以看到巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的胞葬作用。
使用ImageXpress Micro XLS廣域高含量分析系統(分子設備公司(Molecular DEVICES)加利福尼亞州，美國)對胞葬作用進行定量。藉由PKH26螢光鑒定巨噬細胞。胞葬作用指數(EI，顯示為%)被計算為包含至少一個攝入的凋亡中性粒細胞(DRAQ5高)事件的巨噬細胞與巨噬細胞總數的比率。使用MS Excel和GraphPad Prism軟體進行數據分析。
圖6中顯示了治療性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)在促進人巨噬細胞對瀕死嗜中性白血球的胞葬作用方面的作用。融合蛋白增加了經pHrodo標記的瀕死人中性粒細胞內化進入巨噬細胞，超過了M0巨噬細胞已有的高胞葬作用能力(其顯示為基礎水平)。在圖7中，顯示了重組融合蛋白FP278可以挽救人巨噬細胞對瀕死中性粒細胞的被內毒素(脂多糖)損害的胞葬作用。圖7A顯示了在三個人供體中，藉由100pg/ml的脂多糖(LPS)損害巨噬細胞對瀕死的人中性粒細胞的胞葬作用。左分圖顯示了單個供體的反應，右分圖顯示了三個供體的平均胞葬作用(%)。圖7B顯示了融合蛋白FP278挽救人巨噬細胞對瀕死中性粒細胞的這種被內毒素(LPS)損害的胞葬作用。
圖8顯示了融合蛋白FP330挽救人巨噬細胞對瀕死中性粒細胞的被金黃色葡萄球菌顆粒損害的胞葬作用。圖8A顯示了濃度為100nM的融合蛋白在促進胞葬作用方面的超過基礎水平的作用(虛線；圖的左手部分)，以及100nM的融合蛋白在挽救由添加金黃色葡萄球菌引起的胞葬作用受損方面的作用(圖的右手部分)。圖8B顯示了增加融合蛋白FP278(EC50 8nM)的濃度對挽救因添加金黃色葡萄球菌而引起的受損胞葬作用的作用，以及一旦達到胞葬作用的基本水平對促進胞葬作用的作用。
3.4 人內皮細胞-Jurkat胞葬作用測定
細胞培養
人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)獲自龍沙公司(Lonza)(巴塞爾，瑞士)。在包被明膠(來自牛皮膚，PBS中終濃度為0.2%，2%儲備液的稀釋液，西格瑪公司，德國)的燒瓶中培養細胞。細胞在補充了10% FBS(通用健康醫療集團，英國)、1% Pen/Strep(賽默飛世爾科技公司，美國)、1% Glutamax(賽默飛世爾科技公司，美國)和1ng/mL的重組成纖維細胞生長因子-基本(派普泰克公司(Peprotech)，英國)的培養基199(賽默飛世爾科技公司，美國)下生長。使用AccutaseTM(賽默飛世爾科技公司，美國)分離細胞以進行收穫或傳代。
Jurkat E6-1細胞獲自ATCC(美國典型培養物保藏中心，美國)，並在補充有10% FBS(通用健康醫療集團，英國)、1% Pen/Strep(賽默飛世爾科技公司，美國)、10mM丙酮酸鈉(賽默飛世爾科技公司，美國)和10mM HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 109130528-A0202-12-0121-64
乙烷磺酸，賽默飛世爾科技公司，美國)的培養基RPMI 1640(賽默飛世爾科技公司，美國)中生長。
使用重組人TRAIL(R & D系統公司，美國)誘導Jurkat E6-1細胞的凋亡。用pHrodoTM綠色STP酯染料(賽默飛世爾科技公司，美國)標記凋亡細胞。用補充有1% FBS(通用健康醫療集團，英國)，0.05% w/v疊氮化鈉(默克公司(Merck)，德國)和0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸，賽默飛世爾科技公司，美國)的PBS(賽默飛世爾科技公司，美國)製備流式細胞分析技術緩衝液。
胞葬作用測定
在第1天，藉由用AccutaseTM分離5分鐘來收集HUVEC(70%-90%匯合)，用PBS洗滌並重懸浮在細胞培養基中。根據製造商的說明，使用Guava EasyCyte流式細胞儀(默克公司，德國)和Guava ViaCount試劑(默克公司，德國)評估細胞數量和活力。將所需量的細胞在室溫下以300 x g離心5分鐘，並且 重懸浮在培養基中，以使細胞數量為6.6 x 104個細胞/mL。將150μL/孔的這種細胞懸液添加到96孔組織培養板(CorningTM，美國)中。將HUVEC在37℃/5% CO2/95%濕度的培養箱中再培養16-20小時。
根據製造商的說明，使用Guava EasyCyte流式細胞儀(默克公司，德國)和Guava ViaCount試劑(默克公司，德國)評估Jurkat E6-1細胞數量和生存力/細胞死亡狀態。將所需量的細胞在室溫下以300 x g離心5分鐘，並且以1 x 106個細胞/mL的密度重懸浮於補充有終濃度為50ng/mL的重組人TRAIL的培養基中。在37℃/5% CO2/95%濕度下過夜來誘導細胞死亡。
在第2天，藉由抽吸從HUVEC去除培養基，並添加25μL新鮮的預熱(37℃)培養基，然後添加在預熱(37℃)培養基中稀釋的25μL融合蛋白或對照。為了稀釋，使用未結合表面(NBS)處理的96孔板(CorningTM，美國)。在添加瀕死的Jurkat細胞之前，使融合蛋白在37℃/5% CO2/95%濕度下與HUVEC相互作用30分鐘。
使用Guava EasyCyte流式細胞儀(默克公司，德國)和Guava ViaCount試劑(默克公司，德國)對凋亡/瀕死Jurkat E6-1細胞數量進行計數。將所需量的凋亡細胞在室溫下以400 x g離心5分鐘，並且以5 x 106個細胞/mL的密度重懸浮在補充有終濃度為5μg/mL的pHrodoTM綠色STP酯染料的RPMI 1640培養基(無FBS)(染色培養基)中。在37℃染色10分鐘後，剩餘的反應性pHrodoTM綠色STP酯用補充有10% FBS的染色培養基在37℃失活5分鐘。將pHrodoTM綠色標記的細胞洗滌一次，並在HUVEC培養基中將細胞數量調整為3 x 106個細胞/mL。將1.5 x 106/孔的經pHrodoTM綠色標記的Jurkat細胞添加至HUVEC，並在37℃/5% CO2/95%濕度下孵育5小時。除去培養基，將HUVEC在PBS中洗滌一次，並藉由40μL/孔的AccutaseTM溶液進行分離。添加80μL冰冷的流式細胞分析技術緩衝液收集細胞，轉移到1.5mL聚丙烯96孔塊中，用過量的冰冷的流式細胞 分析技術緩衝液洗滌，並在400 x g(4℃)下離心5分鐘。藉由抽吸去除上清液，並且將沈澱物重懸浮於80μL冰冷的流式細胞分析技術緩衝液中，並轉移至96孔V型底微量滴定板(BD生物科學公司(BD Biosciences)，美國)中。然後在BD LSRFortessaTM流式細胞儀(BD生物科學公司，美國)上測量樣本。記錄了pHrodoTM綠色螢光強度，作為吞噬的Jurkat細胞的溶酶體定位的指標。使用FlowJoTM軟體進行流式細胞分析技術數據分析。來自單重閘控HUVEC的pHrodoTM綠色信號的中值螢光強度(MFI)值用作讀出。使用MS Excel和GraphPad Prism軟體進行數據分析以進行EC50計算。
融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)和FP270(EGF-HSA-C2；SEQ ID NO：36)在促進HUVEC內皮細胞對瀕死Jurkat細胞的胞葬作用方面的作用如圖9所示。融合蛋白FP278可以有力促進HUVEC對經pHrodo標記的瀕死人Jurkat T細胞的內化作用。結果表明，內皮細胞被融合蛋白武裝成為瀕死細胞的有效吞噬細胞。出人意料的是，在該測定中融合蛋白的功效明顯取決於C1-C2或C1-C1串聯結構域的存在。例如，由EGF-HSA-C2(FP270)組成的融合蛋白在該實驗環境中是失活的，如圖9所示。圖10證明了我們非常出人意料的發現，即工程改造的蛋白中HSA結構域的位置，即N或C末端位置(分別是HSA-EGF-C1-C2(FP220；SEQ ID NO：30)或EGF-C1-C2-HSA(分別為FP110；SEQ ID NO：29))在MFG-E8 HSA工程改造的蛋白的巨噬細胞胞葬作用測定中賦予了胞葬作用阻斷能力。該等數據清楚地證明了將HSA結構域定位在整聯蛋白結合結構域和PS結合結構域之間對於有效促進本揭露之融合蛋白的胞葬作用的重要性。
圖11顯示了藉由各種形式的融合蛋白(包括EGF結構域、C1-C2結構域、HSA或Fc結構域的組合)促進內皮細胞胞葬作用的比較。圖11A顯示了包含HSA(其中HSA位於C末端或N末端或在EGF樣結構域和C1-C2結構域之間) 的融合蛋白的比較；分別是EGF-C1-C2-HSA(FP110；SEQ ID NO：29)，HSA-EGF-C1-C2(FP220；SEQ ID NO：30)和EGF-HSA-C1-C2-His標籤(FP278；SEQ ID NO：44)。圖11B顯示了包含Fc結構域(Fc位於C末端或在EGF樣結構域與C1結構域之間)的融合蛋白的比較。顯示了Fc部分的兩種形式：FP070(EGF-Fc-C1-C2；SEQ ID NO：17)和FP080(EGF-C1-C2-Fc；SEQ ID NO：22)中發現的野生型Fc(SEQ ID NO：7)和Fc的一個臂上有KiH修飾S354C和T366W的Fc部分(FP060；EGF-C1-C2-Fc[S354C，T366W]；SEQ ID NO：14)EU編號(Merchant等人(1998)同上)。圖11C顯示了針對以三種不同濃度(0.72、7.2和72nM)的三個批次的FP090，包含位於N末端的Fc部分的融合蛋白FP090(Fc-EGF-C1-C2；SEQ Id NO：24)的比較，其中與wtMFG-E8對照對比。HUVEC對瀕死Jurkat細胞的胞葬作用僅由在EGF樣結構域後插入HSA或Fc部分的工程改造的蛋白來促進。圖11D顯示，增溶結構域的插入可基於內源性橋接蛋白EDIL3(MFG-E8的旁系同源物)產生新的生物活性融合蛋白。如圖11D所示，HSA插入在MFG-E8的旁系同源物EDIL3的EGF樣結構域和C1-C2結構域之間。該EDIL3構建體(FP050(基於EDIL3的EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：12)僅具有在wtEDIL3中發現的3個EGF樣結構域中的一個(含RGD環)。在該構建體中，我們出乎意料地發現了HSA結構域插入物關於具有很高純度的新型重組工程改造蛋白的表現具有相似的容忍性(圖2B)。另外，出人意料地發現，衍生自EDIL3的重組工程改造蛋白FP050促進內皮細胞(HUVECS)對瀕死Jurkat細胞的胞葬作用，證明了橋接蛋白的核心功能，並示例了橋接蛋白的結構域可用於設計功能性的新穎的重組工程改造蛋白。
實例4：促血栓形成性血漿微粒的胞葬作用
4.1 人內皮細胞微粒胞葬作用測定
細胞培養
HUVEC細胞獲自龍沙公司(巴塞爾，瑞士)。在包被明膠(來自牛皮膚，PBS中終濃度為0.2%，2%儲備液的稀釋液，西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich)/默克公司，德國)的燒瓶中培養細胞。細胞在補充了10% FBS(通用健康醫療集團，英國)、1% Pen/Strep(賽默飛世爾科技公司，美國)、1% Glutamax(賽默飛世爾科技公司，美國)和1ng/mL的重組成纖維細胞生長因子-基本(派普泰克公司(Peprotech)，英國)的培養基199(賽默飛世爾科技公司，美國)下生長。使用AccutaseTM(賽默飛世爾科技公司，美國)分離細胞以進行收穫或傳代。
根據以下程序製備血小板衍生的微粒：獲得書面知情同意後，從健康成人志願者那裡收集檸檬酸化靜脈血(凝血9NC檸檬酸鹽Monovette(Coagulation 9NC Citrate Monovette)，薩斯泰特(Sarstedt)，德國)。藉由離心(200 x g，15分鐘，無制動，室溫)製備富含血小板的血漿(PRP)。血小板衍生的微粒/碎片係藉由在37℃下使用液氮和解凍對PRP進行三個速凍/冷凍循環而產生的。藉由在RT在20’000 x g離心15分鐘沈澱血小板片段/微粒。將沈澱物重懸浮於PBS中，製備等分試樣並儲存在-80℃。如使用Alexa FluorTM 488標記的鼠MFG-E8/乳凝集素(諾華公司(Novartis)內部)藉由流式細胞分析技術測定，微粒製劑係85%-100% PS陽性的。使用專用計數珠(BioCytex/Stago公司，法國)確定微粒的數量。用補充有1% FBS(通用健康醫療集團，英國)，0.05% w/v疊氮化鈉(默克公司(Merck)，德國)和0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸，賽默飛世爾科技公司，美國)的PBS(賽默飛世爾科技公司，美國)製備流式細胞分析技術緩衝液。
4.2 胞葬作用測定
在第1天，藉由用AccutaseTM分離5分鐘來收集HUVEC細胞(70%-90%匯合)，用PBS洗滌並重懸浮在細胞培養基中。根據製造商的說明，使用Guava EasyCyte流式細胞儀(默克公司，德國)和Guava ViaCount試劑(默克公司，德國)評估細胞數量和活力。將所需量的細胞在室溫下以300 x g離心5分鐘，並且重懸浮在培養基中，以使細胞數量為6.6 x 104個細胞/mL。將150μL/孔的這種細胞懸液添加到96孔組織培養板(CorningTM，美國)中。將HUVEC細胞在37℃/5% CO2/95%濕度的培養箱中再培養16-20小時。
在第2天，藉由抽吸從HUVEC細胞去除培養基，並添加25μL新鮮的預熱(37℃)培養基，然後添加在預熱(37℃)培養基中稀釋的25μL融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)(三種不同濃度：0.3nM，3nM或30nM)或對照。為了稀釋，使用未結合表面(NBS)處理的96孔板(CorningTM，美國)。在添加血小板衍生的微粒之前，讓測試蛋白在37℃/5% CO2/95%濕度下與HUVEC細胞相互作用30分鐘。
將所需量的微粒在4℃下以20’000 x g離心15分鐘，並且以2 x 108個顆粒/mL的密度重懸浮在補充有終濃度為5μg/mL的pHrodoTM綠色STP酯染料的RPMI 1640培養基(無FBS)(染色培養基)中。在37℃染色10分鐘後，剩餘的反應性pHrodoTM綠色STP酯用補充有10% FBS的染色培養基在37℃失活5分鐘。將pHrodoTM綠色標記的微粒藉由在4℃下以20’000 x g離心15分鐘洗滌一次，並在HUVEC細胞培養基中將數量調整為1 x 108個顆粒/mL。將5 x 106個顆粒/孔的經pHrodoTM綠色標記的微粒添加至HUVEC細胞，並在37℃/5% CO2/95%濕度下孵育5小時。除去培養基，將HUVEC細胞在PBS中洗滌一次，並藉由40μL/孔的AccutaseTM溶液進行分離。添加80μL冰冷的流式細胞分析技術緩衝液收集細胞，轉移到1.5mL聚丙烯96孔塊中，用過量的冰冷的流式細胞分析技術緩衝液洗滌，並在400 x g(4℃)下離心5分鐘。藉由抽吸去除上清液，並且將沈澱物重 懸浮於80μL冰冷的流式細胞分析技術緩衝液中，並轉移至96孔V型底微量滴定板(BD生物科學公司，美國)中。在BD LSRFortessaTM流式細胞儀(BD生物科學公司，美國)上測量樣本。記錄了pHrodoTM綠色螢光強度，作為吞噬的微粒的溶酶體定位的指標。使用FlowJoTM軟體進行流式細胞分析技術數據分析。來自單重閘控HUVEC細胞的pHrodoTM綠色信號的中值螢光強度值(MFI)用作讀出。使用MS Excel和GraphPad Prism軟體進行數據分析以進行EC50計算。融合蛋白FP278以濃度依賴的方式促進內皮細胞對血小板衍生的微粒的胞葬作用，如圖12所示。攝取的促進係濃度依賴性的，並且在其他類型的內皮細胞中也觀察到(未顯示)。
實例5：MFG-E8-HSA融合蛋白的技術特性
5.1 融合蛋白FP330與FcRn的表面電漿共振(SPR)
結合分析
進行直接結合測定以表徵融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO：42)與FcRn的結合。使用重組人FcRn作為分析物，在捕獲的蛋白上測量動力學結合親和常數(KD)。在室溫下並分別在pH 5.8和7.4下在BIAcore ® T200(瑞士格拉特布魯格市GE醫療公司(GE Healthcare,Glattbrugg,Switzerland))上進行測量。為進行親和力測量，將蛋白在10mM NaP、150mM NaCl、0.05% Tween 20(pH 5.8)中稀釋並根據製造商的建議(GE醫療公司(GE Healthcare))使用標準程序固定在CM5研究級感測器晶片(GE醫療公司(GE Healthcare)，參考號BR-1000-14)的流動池上。為了用作參考，將一個流動池作為空白樣固定。藉由隨後在參考和測量流動池上注射分析物稀釋液系列獲得結合數據。納入零濃度樣本(僅操作緩衝液)以允許在數據評價期間進行雙重參考。為了進行數據評價，使用了雙重參考的傳感圖並分析瞭解離常數(KD)。
融合蛋白FP330在pH 5.8下以1380nM的親和力與FcRn結合，而在pH 7.4下未觀察到結合(參見以上表5)。該等結果與野生型HSA(1000-2000nM，pH 5.8，數據未顯示)很好地一致。
5.2 MFG-E8及變體的差示掃描量熱法(DSC)
使用差示掃描量熱法測量工程改造的MFG-E8蛋白變體FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)的熱穩定性。在差示掃描微量熱計(Nano DSC，TA儀器公司(TA instruments))上進行測量。池容積為0.5ml並且加熱速率為1℃/分鐘。蛋白以在PBS(pH 7.4)中1mg/ml的濃度使用。藉由與含有相同緩衝液的重複樣本(其中沒有蛋白)進行比較來估計蛋白的莫耳熱容。使用標準程序分析部分莫耳熱容和熔融曲線。對熱譜圖進行基線校正和濃度標準化。觀察到兩個熔化事件，第一Tm在50℃，第二Tm在64℃。
5.3 MFG-E8變體的聚集傾向和溶解度測量
首先，藉由動態光散射(DLS，懷雅特公司(Wyatt))測量MFG-E8變體蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID NO：44)的聚集傾向。使用動態光散射藉由定量散射光中的動態波動來測量溶液中FP278的平移擴散係數。未經分級分離的蛋白變體尺寸分佈提供了多分散性估算值以及流體動力學半徑，在1mg/ml的濃度下測量該參數。使用DynaProTM讀板儀(懷雅特技術歐洲有限公司(Wyatt Technology Europe GmbH)，代恩巴赫市(Dernbach)，德國))結合軟體DYNAMICS(7.1.0.25版，懷雅特公司)測定融合蛋白FP278的流體動力學半徑。在384孔板(384圓孔板，聚苯乙烯，賽默飛世爾科技公司，朗根塞爾博多市(Langenselbold)，德國))中測量了50μL未稀釋並過濾(0.22μm PVDF-過濾器(Millex®注射筒驅動的過濾器單元，比爾裡卡市密理博公司(Millipore, Billerica)，美國)的蛋白溶液。未能鑒定蛋白樣本的更高分子量聚集體。蛋白的流體動力學半徑約為5-6nm，表明溶液中存在單體蛋白。
其次，對融合蛋白FP278進行濃度依賴性的流體動力學半徑測量，以估計蛋白的溶解度。應用了高達22mg/ml的蛋白濃度。如上所述確定流體動力學半徑。融合蛋白FP278濃度的增加後，未能觀察到半徑(5-7nm)的增加，而wtMFG-E8(SEQ ID NO：1)的動態光散射測量因在濃度約0.2mg/ml處的高聚集而失敗。
實例6：MFG-E8融合蛋白的優化
質譜(MS)用於研究融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2)，以產生一組基於變體MFG-E8的融合蛋白，該融合蛋白經優化以提高表現和產率。產生了一組具有不同大小和結構的連接子(例如，在EGF和HSA結構域之間的包含GS的連接子和/或在HSA和C1結構域之間的包含GS或G4S的倍數的連接子)的變體蛋白。另外，在該變體的一些中包括包含缺失或取代的胺基酸修飾(在表7中示為HSA*)。變體融合蛋白的組總結在下表7中。
[表7]：變體融合蛋白總結
Figure 109130528-A0202-12-0129-58
Figure 109130528-A0202-12-0130-59
1胺基酸修飾的位置根據SEQ ID NO：42(FP330)進行編號
實例7：變體MFG-E8融合蛋白；表現和純化
實例2中描述了在HEK細胞系中產生融合蛋白的方法。為了在CHO細胞系中表現，在基因藝術公司(Geneart)(生命技術公司(LifeTechnologies))合成了編碼MFG-E8變體的核酸，並使用基於限制性酶連接的選殖技術將其選殖到哺乳動物表現載體中。將所得質體轉染到CHO-S細胞(賽默公司)中。簡而言之，為了暫態表現融合蛋白，使用ExpifectamineCHO轉染劑(賽默公司)將表現載體轉染到懸浮液適應的CHO-S細胞中。典型地，用含有400μg編碼工程改造的蛋白的表現載體的DNA轉染以6 Mio細胞/ml的密度懸浮的400ml細胞。然後將重組表現載體引入宿主細胞以在培養基(ExpiCHO表現培養基，補充有ExpiCHO料和增強劑(賽默公司))中進一步分泌七天。
從表8所示的表現數據中可以看出，變體融合蛋白FP068(SEQ ID NO：46)和FP776(SEQ ID NO：48)的表現比融合蛋白FP330(SEQ ID NO：42)大約提高了兩倍。
[表8]：在HEK和CHO*細胞系中融合蛋白的表現
Figure 109130528-A0202-12-0130-60
Figure 109130528-A0202-12-0131-61
*表示在CHO細胞系中產生的融合蛋白
實例8：變體融合蛋白的表徵
如實例3所述，藉由進行胞葬作用測定來確定變體融合蛋白對胞葬作用的作用。
在第一測定中，根據上文第3.3節中描述的方法確定了變體融合蛋白在人巨噬細胞-中性粒細胞胞葬作用測定中的作用。將M0巨噬細胞與融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No：42)或變體FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID No：44)或FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No：48)孵育30分鐘。如圖13所示，融合蛋白FP330、FP278和FP776可以挽救人巨噬細胞對瀕死中性粒細胞的被內毒素(脂多糖(LPS))損害的胞葬作用。融合蛋白FP330(EC 50 =1.6nM；圖13A)、FP278(EC 50 =1.78nM；圖13B)和FP776(EC 50 =0.5nM；圖13C)導致挽救由於添加LPS引起的受損的胞葬作用，標籤在達到基本水平後甚至促進了胞葬作用。
根據上文3.4節中描述的方法，在人內皮(HUVEC)細胞-Jurkat細胞胞葬作用測定中進一步表徵了融合蛋白FP330、FP278和FP776。融合蛋白FP330、FP278和FP776在促進HUVEC內皮細胞對瀕死Jurkat細胞的胞葬作用方面的作用如圖14所示。藉由增加FP330(EC 50 =3.4nM；圖14A)、FP278(EC 50 =2.4 nM；圖14B)和FP776(EC50=3nM；圖14C)濃度來有力地促進HUVEC對經pHrodo標記的瀕死人Jurkat T細胞的內化作用。該等結果表明，內皮細胞被融合蛋白武裝成為瀕死細胞的有效吞噬細胞。
實例9：保護小鼠免受AKI和AKI觸發的急性器官反應
9.1 急性腎損傷模型
從法國查理斯河公司(Charles River)購買雌性C57BL/6小鼠(18-22g)，將其置於溫度控制的設備中在頂部過濾器保護的籠子中(12小時的明/暗循環)。嚴格按照瑞士聯邦法律和NIH實驗動物護理原則處理動物。在手術前兩小時腹膜內(i.p.)或靜脈內(i.v.)投與被測治療性融合蛋白。手術前60至30分鐘以0.1mg/kg的劑量皮下(s.c.)注射丁丙諾啡(億維德瑞士公司(Indivior Schweiz AG))。手術前在麻醉室(3.5-5 Vol%，載氣：氧氣)中誘導使用異氟烷進行吸入麻醉5分鐘。在手術期間，藉由面罩用1-2 Vol%異氟烷/氧氣將動物維持在麻醉下，氣體流速為0.8-1.2 l/分鐘。將腹部皮膚剃毛並用Betaseptic(穆迪藥物公司(Mundipharma)，法國)消毒。將動物置於具有恒溫監測系統(PhysiTemp公司，美國Physitemp儀器公司(US-Physitemp Instruments LLC)，美國)的恒溫毯(羅塔徹公司(Rothacher)-瑞士)上，並用無菌紗布覆蓋。在整個手術過程中，藉由直腸探針(Physitemp儀器公司，美國)監測體溫，並控制其體溫為36.5℃-37.5℃。包括假手術對照在內的所有動物均接受了右腎的單側腎切除術：中線切口/剖腹手術後，將腹部內容物向左縮回以暴露右腎。斷開並結紮右輸尿管和腎血管，然後取出右腎。對於進行了AKI的動物，將腹部內容物放在無菌紗布上的右側，並解剖左腎動脈和靜脈，以夾住用於誘導缺血。使用微動脈瘤夾(B Braun公司，瑞士)夾住腎蒂(使用一個夾將動脈和靜脈夾在一起)，以阻斷血液流向腎並誘導腎缺血。腎從紅色到深紫色的顏色 變化證實了成功缺血，這在幾秒鐘內發生。誘導缺血後(35-38分鐘)，移開微動脈瘤夾。在傷口閉合之前，使用溫熱的無菌鹽水(約2ml，37℃)沖洗腹部內容物以使組織水化。洗滌後，腹膜內地另外添加1ml無菌鹽水作為補液。開始再灌注時，傷口分為兩層(分別是肌肉和皮膚)閉合。然後將動物保持在紅色暖燈下直至完全康復。手術後1小時和4小時再次投與丁丙諾啡，劑量為0.1mg/kg，並且也包含在飲用水中(9.091μg/mL)。24小時後，對動物實施安樂死進行分析。
9.2 治療性融合蛋白的投與
治療性融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No：42)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID No：44)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No：48)如上所述在AKI模型中以下表9中列出的劑量進行測試。為了檢測血清標誌物和qPCR標誌物表現的研究，在手術前2小時投與融合蛋白FP278。FP330和FP776經靜脈內給藥。缺血再灌注損傷發作前30分鐘。為了藉由磁共振成像來測量造影劑攝取的研究，在AKI誘導前30分鐘預防性給予劑量為1.26mg/kg的融合蛋白FP776，或在缺血再灌注損傷誘導後5小時治療性靜脈內給予以2mg/kg。
[表9]：治療性融合蛋白的給藥
Figure 109130528-A0202-12-0133-62
9.3 讀出/AKI保護分析：
血清標誌物：
缺血再灌注誘導後24小時取血清樣本，並根據製造商的說明(Axonlab公司，瑞士)使用Hitachi M40臨床分析儀分析血清肌酐和血液尿素氮(BUN)含量。
器官中的qPCR標誌物表現：
AKI誘導後24小時收穫器官(腎、肝、肺和心)，並且切成1釐米的片段，並在4℃下於RNA晚緩衝液(RNA Later buffer)(賽默飛世爾科技公司，美國)中儲存過夜。將器官片段轉移至在裂解基質D(Lysing Matrix D)管(MP生物醫藥公司(MP Biomedicals)法國)中含有134mM β-巰基乙醇(默克公司，德國)的RLT緩衝液(RNeasy微量套組，凱傑公司(Qiagen)，DE)中，並使用FastPrep-24儀器(MP生物醫藥公司)進行均質化。隨後用蛋白酶K(RNeasy微量套組)消化心纖維組織，同時在微量離心機(艾本德公司(Eppendorf)，德國)中將腎、肝和肺裂解物直接全速離心3分鐘。將上清液轉移至QIAshredder旋轉柱(凱傑公司，德國)上並離心2分鐘。根據RNeasy微量套組手冊(包括DNA酶消化)對流過液進行RNA提取。使用Nano Drop 1000設備(賽默飛世爾科技公司)測量RNA濃度。使用SimpliAmp Thermocycler(應用生物系統公司(Applied Biosystems)，美國)，根據高容量cDNA逆轉錄套組手冊(賽默飛世爾科技公司)，將每個樣本2μg RNA進行反轉錄。將cDNA與無核酸酶的水(賽默飛世爾科技公司)、TaqMan探針(TaqMan基因表現測定(FAM)、賽默飛世爾科技公司)和TaqMan基因表現預混液(賽默飛世爾科技公司)在384孔微孔板(MicroAmp 384孔反應板，賽默飛世爾科技公司)中組合。qPCR在ViiA 7即時 PCR系統(應用生物系統公司，美國)上進行。設定為1：2分鐘，50℃；2：10分鐘，95℃；3：15s，95℃；4：1分鐘，60℃。重複步驟3和4進行45個循環。使用ViiA 7軟體進行數據分析，使用MS Excel和GraphPad Prism軟體進行qPCR數據分析軟體。
藉由磁共振成像(MRI)測量的肝對造影劑的攝取
進行MRI的方法改編自Egger等人的出版物(Egger等人，(2015)J Magn Reson Imaging[磁共振成像雜誌]，41：829-840)。實驗係在7-T Bruker Biospec MRI系統(Bruker Biospin公司，埃特林根(Ettlingen)，德國)上進行的。在MRI信號採集期間，將小鼠仰臥在Plexiglas支架中。用加熱墊將體溫保持在37℃±1℃。短暫的誘導期後，用藉由鼻錐投與的在O2/N2O(1：2)混合物中的約1.4%異氟烷維持麻醉。所有測量均在自發呼吸的動物上進行；既沒有應用心臟觸發也沒有應用呼吸觸發。
將小鼠放在掃描器中後，可以獲取偵察性快速圖像用於定位目的。使用包含超順磁性氧化鐵(SPIO)奈米顆粒(Endorem®，瓜爾貝特(Guerbet)，法國)的血管內藥劑進行灌注分析。(誘導疾病後24小時)或進行假手術後(腎切除術後24h的動物)將Endorem®推注1.2s靜脈注射到患有AKI的動物中。在1.2s內投與第一推注，並以400ms/圖像的解析度順序採集回波平面圖像。採集25個基線圖像後，在1.2s內施用第二推注，推注之後又採集了575個圖像，從而在4分鐘內總共獲得了600個圖像。超順磁性造影劑引起敏感性的局部變化，這導致信號衰減與腎灌注成比例。對於一系列圖像，對位於皮質/外髓質外紋中的目的區域(ROI)進行信號強度評估。仔細選擇ROI的位置、形狀和大小，以確保儘管呼吸引起腎移動，但它們覆蓋大約相同的區域。注射前圖像的平均信號強度 提供了基線強度(S(0))。根據以下比率的平均值確定灌注指數(Rosen等人，(1990)Magn Reson Med.[醫學中的磁共振]，14：249-265)：
-ln[S(t)/S(0)]~TE.V.cT(t)
其中TE係回波時間，V係血液量，並且cT係造影劑的濃度。
研究中使用的SPIO奈米粒子的平均直徑為約150nm，並被肝中的枯否細胞吸收。因此，除了腎灌注以外，MRI還可以藉由檢測位於肝中的ROI中評估的對比度變化來監測肝中奈米顆粒的攝取。
9.4 結果
如圖15所示，當進行腹膜內投與(FP278)或靜脈內投與(FP330和FP776)時，融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No：42)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His標籤；SEQ ID No：44)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No：48)在這種急性腎損傷(AKI)模型中保護腎功能。血清肌酐升高(sCr)的阻斷反映了這種保護作用。圖15A顯示，與媒介物處理的動物相比，在兩種測試劑量下的融合蛋白FP278都顯著降低了血清肌酐水平(p<0.0001)，並且與鼠MFG-E8一樣有效。如圖15B所示，融合蛋白FP330以劑量依賴性方式保護腎功能，並且對於融合蛋白FP776(圖15C)同樣如此，其中血清肌酐水平也以劑量依賴性方式被阻斷。
腎功能受損也反映在測試的小鼠的血液尿素氮(BUN)水平方面，並且融合蛋白FP278對BUN水平的作用如圖16所示。
總之，如圖15和16所示，融合蛋白FP278、FP330和FP776有力地防止了該等用於臨床診斷腎衰竭的標誌物的升高。藉由組織學證實了觀察到的功效(未顯示)。
此外，如圖17所示，單劑量的融合蛋白FP278保護遠處器官免受由AKI引起的急性期反應。AKI誘導過量的mRNA反應，該反應可以藉由qPCR在遠處的高度灌注器官(例如脾、肺、肝、心和腦)的裂解物中測量。典型的mRNA誘導選擇性損傷(NGAL、KIM-1)、趨化因子的誘導(未顯示)或急性期反應蛋白(例如血清澱粉樣蛋白A(SAA))誘導的誘導。圖17A和17B例示了在鼠心和肺中這種由AKI誘導的反應(血清澱粉樣蛋白A(SAA))，該反應在單次注射融合蛋白後被有力地被阻斷並恢復到假手術水平。
肝隨時間對SPIO造影劑Endorem®的攝取如圖18所示。與假手術動物相比，患有AKI的動物顯示肝對造影劑的攝取顯著降低(靶=枯否細胞)。FP776治療(在AKI誘導前-30分鐘預防性地以1.26mg/kg給藥，或在缺血再灌注損傷誘導後+5小時治療性地以2mg/kg給藥)保護AKI小鼠肝中造影劑積累免受損失。該等結果表明，在該小鼠模型中，AKI引起內源性枯否細胞介導的微粒清除的顯著受損，並且AKI引起微血管紊亂，這影響肝中鐵顆粒造影劑的積累。與假手術動物相比，用融合蛋白FP776進行處理可防止清除受損失和微血管紊亂，並且甚至可以增強兩種測試劑量下造影劑的攝取。
治療性融合蛋白(例如根據實施方式19(例如SEQ ID NO：80)或實施方式20(例如SEQ ID NO：82))，當在上述實驗中測試時，與FPJ776類似，促進av整聯蛋白血球黏附並促進胞葬作用。因此，它們適合於本文揭露的治療用途。
<110> 諾華公司(NOVARTIS AG)
<120> 治療性融合蛋白
<130> PAT058332
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<141>
<150> EP 19196045.9
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<170> PatentIn版本3.5
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<211> 641
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 32
Figure 109130528-A0202-12-0191-351
Figure 109130528-A0202-12-0192-352
Figure 109130528-A0202-12-0193-353
<210> 33
<211> 1923
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 33
Figure 109130528-A0202-12-0193-354
Figure 109130528-A0202-12-0194-356
<210> 34
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 34
Figure 109130528-A0202-12-0194-355
Figure 109130528-A0202-12-0195-357
Figure 109130528-A0202-12-0196-358
Figure 109130528-A0202-12-0197-359
<210> 35
<211> 2427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 35
Figure 109130528-A0202-12-0197-360
Figure 109130528-A0202-12-0198-361
<210> 36
<211> 811
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 36
Figure 109130528-A0202-12-0199-362
Figure 109130528-A0202-12-0200-363
Figure 109130528-A0202-12-0201-364
<210> 37
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 37
Figure 109130528-A0202-12-0202-365
Figure 109130528-A0202-12-0203-366
<210> 38
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 38
Figure 109130528-A0202-12-0203-367
Figure 109130528-A0202-12-0204-368
Figure 109130528-A0202-12-0205-369
Figure 109130528-A0202-12-0206-370
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 39
Figure 109130528-A0202-12-0207-371
Figure 109130528-A0202-12-0208-372
<210> 40
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 40
Figure 109130528-A0202-12-0208-373
Figure 109130528-A0202-12-0209-374
Figure 109130528-A0202-12-0210-375
<210> 41
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 41
Figure 109130528-A0202-12-0210-376
Figure 109130528-A0202-12-0211-377
<210> 42
<211> 963
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 42
Figure 109130528-A0202-12-0211-378
Figure 109130528-A0202-12-0212-379
Figure 109130528-A0202-12-0213-380
Figure 109130528-A0202-12-0214-381
Figure 109130528-A0202-12-0215-382
<210> 43
<211> 2889
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 43
Figure 109130528-A0202-12-0215-383
Figure 109130528-A0202-12-0216-384
<210> 44
<211> 971
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 44
Figure 109130528-A0202-12-0217-385
Figure 109130528-A0202-12-0218-386
Figure 109130528-A0202-12-0219-387
Figure 109130528-A0202-12-0220-388
<210> 45
<211> 2913
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 45
Figure 109130528-A0202-12-0220-389
Figure 109130528-A0202-12-0221-390
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 46
Figure 109130528-A0202-12-0222-391
Figure 109130528-A0202-12-0223-392
Figure 109130528-A0202-12-0224-393
Figure 109130528-A0202-12-0225-394
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 47
Figure 109130528-A0202-12-0225-395
Figure 109130528-A0202-12-0226-396
Figure 109130528-A0202-12-0227-397
<210> 48
<211> 941
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 48
Figure 109130528-A0202-12-0227-398
Figure 109130528-A0202-12-0228-399
Figure 109130528-A0202-12-0229-400
Figure 109130528-A0202-12-0230-401
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 49
Figure 109130528-A0202-12-0230-402
Figure 109130528-A0202-12-0231-403
Figure 109130528-A0202-12-0232-404
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<211> 963
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 50
Figure 109130528-A0202-12-0232-405
Figure 109130528-A0202-12-0233-406
Figure 109130528-A0202-12-0234-407
Figure 109130528-A0202-12-0235-408
<210> 51
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<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0235-409
Figure 109130528-A0202-12-0236-410
Figure 109130528-A0202-12-0237-411
<210> 52
<211> 961
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 52
Figure 109130528-A0202-12-0237-412
Figure 109130528-A0202-12-0238-413
Figure 109130528-A0202-12-0239-414
Figure 109130528-A0202-12-0240-415
<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 53
Figure 109130528-A0202-12-0240-416
Figure 109130528-A0202-12-0241-417
Figure 109130528-A0202-12-0242-418
<210> 54
<211> 954
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 54
Figure 109130528-A0202-12-0242-419
Figure 109130528-A0202-12-0243-420
Figure 109130528-A0202-12-0244-421
Figure 109130528-A0202-12-0245-422
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 55
Figure 109130528-A0202-12-0246-423
Figure 109130528-A0202-12-0247-424
<210> 56
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
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Figure 109130528-A0202-12-0247-425
Figure 109130528-A0202-12-0248-426
Figure 109130528-A0202-12-0249-427
Figure 109130528-A0202-12-0250-428
<210> 57
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<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0251-429
Figure 109130528-A0202-12-0252-430
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 58
Figure 109130528-A0202-12-0252-431
Figure 109130528-A0202-12-0253-432
Figure 109130528-A0202-12-0254-433
Figure 109130528-A0202-12-0255-434
<210> 59
<211> 2847
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 59
Figure 109130528-A0202-12-0256-435
Figure 109130528-A0202-12-0257-436
<210> 60
<400> 60
000
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<400> 61
000
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 肽"
<400> 62
Figure 109130528-A0202-12-0257-437
<210> 63
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 肽"
<400> 63
Figure 109130528-A0202-12-0258-441
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 肽"
<400> 64
Figure 109130528-A0202-12-0258-442
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 肽"
<400> 65
Figure 109130528-A0202-12-0258-440
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 肽"
<400> 66
Figure 109130528-A0202-12-0258-439
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<400> 67
Figure 109130528-A0202-12-0258-438
<210> 68
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 68
Figure 109130528-A0202-12-0259-443
Figure 109130528-A0202-12-0260-444
<210> 69
<211> 1030
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 69
Figure 109130528-A0202-12-0260-445
Figure 109130528-A0202-12-0261-446
Figure 109130528-A0202-12-0262-447
Figure 109130528-A0202-12-0263-448
Figure 109130528-A0202-12-0264-449
<210> 70
<211> 1036
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 70
Figure 109130528-A0202-12-0264-450
Figure 109130528-A0202-12-0265-451
Figure 109130528-A0202-12-0266-452
Figure 109130528-A0202-12-0267-453
Figure 109130528-A0202-12-0268-454
<210> 71
<211> 872
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 71
Figure 109130528-A0202-12-0268-455
Figure 109130528-A0202-12-0269-456
Figure 109130528-A0202-12-0270-457
Figure 109130528-A0202-12-0271-458
<210> 72
<211> 878
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 72
Figure 109130528-A0202-12-0271-459
Figure 109130528-A0202-12-0272-460
Figure 109130528-A0202-12-0273-461
Figure 109130528-A0202-12-0274-462
<210> 73
<211> 783
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 73
Figure 109130528-A0202-12-0274-463
Figure 109130528-A0202-12-0275-464
Figure 109130528-A0202-12-0276-465
Figure 109130528-A0202-12-0277-466
<210> 74
<211> 789
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 74
Figure 109130528-A0202-12-0277-467
Figure 109130528-A0202-12-0278-468
Figure 109130528-A0202-12-0279-527
Figure 109130528-A0202-12-0280-528
<210> 75
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 75
Figure 109130528-A0202-12-0280-529
Figure 109130528-A0202-12-0281-530
Figure 109130528-A0202-12-0282-531
<210> 76
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 76
Figure 109130528-A0202-12-0282-532
Figure 109130528-A0202-12-0283-534
<210> 77
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 77
Figure 109130528-A0202-12-0283-533
Figure 109130528-A0202-12-0284-535
<210> 78
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 78
Figure 109130528-A0202-12-0284-536
Figure 109130528-A0202-12-0285-537
<210> 79
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 79
Figure 109130528-A0202-12-0285-538
Figure 109130528-A0202-12-0286-539
<210> 80
<211> 1029
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 80
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Figure 109130528-A0202-12-0287-541
Figure 109130528-A0202-12-0288-542
Figure 109130528-A0202-12-0289-543
Figure 109130528-A0202-12-0290-544
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<213> 人工序列
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<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0291-546
Figure 109130528-A0202-12-0292-547
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 109130528-A0202-12-0293-549
Figure 109130528-A0202-12-0294-550
Figure 109130528-A0202-12-0295-551
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<213> 人工序列
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Figure 109130528-A0202-12-0296-553
Figure 109130528-A0202-12-0297-554
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<213> 人工序列
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Figure 109130528-A0202-12-0299-557
Figure 109130528-A0202-12-0300-558
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Figure 109130528-A0202-12-0302-560
Figure 109130528-A0202-12-0303-561
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Figure 109130528-A0202-12-0306-565
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Figure 109130528-A0202-12-0312-572
Figure 109130528-A0202-12-0313-573
Figure 109130528-A0202-12-0314-574
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Figure 109130528-A0202-12-0316-577
Figure 109130528-A0202-12-0317-578
Figure 109130528-A0202-12-0318-579
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Figure 109130528-A0202-12-0322-585
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Figure 109130528-A0202-12-0324-589
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Figure 109130528-A0202-12-0333-605
Figure 109130528-A0202-12-0334-606
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Figure 109130528-A0202-12-0336-609
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Figure 109130528-A0202-12-0343-618
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Figure 109130528-A0202-12-0347-623
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Figure 109130528-A0202-12-0351-627
Figure 109130528-A0202-12-0352-628
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Figure 109130528-A0202-12-0354-631
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Figure 109130528-A0202-12-0355-633
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Figure 109130528-A0202-12-0358-638
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Figure 109130528-A0202-12-0364-647
Figure 109130528-A0202-12-0365-648
Figure 109130528-A0202-12-0366-649
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<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0367-651
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<220>
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<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
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Figure 109130528-A0202-12-0368-653
Figure 109130528-A0202-12-0369-654
Figure 109130528-A0202-12-0370-655
<210> 120
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<212> DNA
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<220>
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<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0370-656
Figure 109130528-A0202-12-0371-657
<210> 121
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
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Figure 109130528-A0202-12-0372-658
Figure 109130528-A0202-12-0373-659
Figure 109130528-A0202-12-0374-660
<210> 122
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<212> DNA
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<220>
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<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0375-661
Figure 109130528-A0202-12-0376-662
<210> 123
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<220>
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Figure 109130528-A0202-12-0376-663
Figure 109130528-A0202-12-0377-665
<210> 124
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<212> DNA
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<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
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Figure 109130528-A0202-12-0377-666
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多肽"
<400> 125
Figure 109130528-A0202-12-0377-664
Figure 109130528-A0202-12-0378-667
Figure 109130528-A0202-12-0379-668
<210> 126
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=“人工序列的描述：合成的 多核苷酸"
<400> 126
Figure 109130528-A0202-12-0380-669
Figure 109130528-A0202-12-0381-671
<210> 127
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Figure 109130528-A0202-12-0384-676
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Figure 109130528-A0202-12-0401-698
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Figure 109130528-A0202-12-0402-700
Figure 109130528-A0202-12-0403-702
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Figure 109130528-A0202-12-0415-721

Claims (20)

  1. 一種用於增強胞葬作用之治療性融合蛋白，該治療性融合蛋白包含整聯蛋白結合結構域、磷脂醯絲胺酸(PS)結合結構域和增溶結構域，其中該增溶結構域插入在該整聯蛋白結合結構域和該PS結合結構域之間；並且其中該整聯蛋白結合結構域與整合素結合。
  2. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域與αvβ3和/或αvβ5和/或α8β1整聯蛋白結合。
  3. 如請求項1或2所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域包含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)模體。
  4. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域直接連接至該整聯蛋白結合結構域，至PS結合結構域或這兩個結構域。
  5. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域藉由連接子間接連接至該整聯蛋白結合結構域和/或該PS結合結構域。
  6. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域包含人血清白蛋白(HSA)、HSA的結構域3(HSA D3)、Fc-IgG、或其功能變體。
  7. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少90%序列同一性，並且該PS結合結構域具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少90%序列同一性，或該PS結合結構域具有SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：76的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  8. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域具有SEO ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至 少90%序列同一性，並且該PS結合結構域具有SEQ ID NO：78的胺基酸序列或與SEQ ID NO：78的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  9. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該整聯蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：77的胺基酸序列或與SEQ ID NO：77的胺基酸序列具有至少90%序列同一性，並且該PS結合結構域具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與SEQ ID NQ：3的胺基酸序列具有至少90%序列同一性，或該PS結合結構域具有SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：76的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  10. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該增溶結構域係HSA並且具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  11. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：42的胺基酸序列或與SEQ ID NO：42的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  12. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：44的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少90%序列同一性；或具有SEQ ID NO：47的胺基酸序列或與SEQ ID NO：47的胺基酸序列具有至少90%序列同一性；或具有SEQ ID NO：48的胺基酸序列或與SEQ ID NO：48的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  13. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：80的胺基酸序列或與SEQ ID NO：80的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  14. 如前述請求項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO：82的胺基酸序列或與SEQ ID NO：82的胺基酸序列具有至少90%序列同一性。
  15. 一種分離的核酸，該分離的核酸編碼如請求項11至14中任一項所述之胺基酸序列。
  16. 一種選殖載體或表現載體，該選殖載體或表現載體包含如請求項15所述之核酸。
  17. 一種適於產生治療性融合蛋白的重組宿主細胞，該重組宿主細胞包含一個或多個如請求項16所述之選殖載體或表現載體、以及視需要的分泌信號。
  18. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白、和藥學上可接受的載劑。
  19. 如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白，用於在治療或預防有需要的個體的炎性障礙或炎性器官損傷中使用，其中該炎性障礙或炎性器官損傷係急性腎損傷、急性呼吸窘迫症候群、急性肝損傷、敗血症、心肌梗塞、中風、燒傷、創傷以及由缺血/再灌注引起的炎性和器官損傷。
  20. 用於如請求項19所述使用的融合蛋白，其中該融合蛋白與另一種治療劑聯合投與，其中該治療劑係免疫抑制劑、免疫調節劑、抗炎劑、抗氧化劑、抗感染劑、細胞毒性劑或抗癌劑。
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