JP2022547051A - 治療用融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、薬剤又は研究ツールとしての使用に適した融合タンパク質に関する。融合タンパク質の治療的使用は、急性又は慢性の炎症性及び免疫系に起因する臓器及び微小血管障害、例えば、急性腎障害、急性心筋梗塞、急性呼吸困難又は慢性閉塞性肺疾患線維症、並びに組織外傷並びに急性及び慢性損傷に起因する他の臓器損傷の予防又は処置を含み得る。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、全体が参照により本明細書に援用される。２０２０年８月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＰＡＴ０５８３３２＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは６５３，１９３バイトである。
本発明は、タンパク質のドメイン内に挿入されたアルブミンを含むマルチドメイン融合タンパク質、例えば、タンパク質のドメイン内に挿入されたアルブミンを含み、インテグリン結合及びホスファチジルセリン結合能力の両方をさらに含むマルチドメイン融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、特に急性又は慢性の炎症性障害、並びに免疫系又は凝固によって引き起こされる器官及び微小血管障害の予防又は処置のための治療薬として使用することができる。
大半のタンパク質は複数のドメインを含む（ドメインは、それ自体で単一ドメインタンパク質を形成するか、又は他のものと再結合してマルチドメインタンパク質の一部を形成することができる、独立した進化単位として定義される）。現在、薬剤としての使用のために、多種多様な生物学的に活性なタンパク質を産生することができる。しかし、所望の治療特性を有するそのようなタンパク質は、十分に高い溶解性、安定性、及び他の望ましい製造特性を有しない可能性がある。
ＨＳＡは、血流中の栄養素、ホルモン及び老廃物を含む、多くの必須内因性化合物の輸送体分子として周知である。これはまた、幅広い薬物分子に結合する。ＨＳＡは、５つの異なる薬物送達技術：（１）Ｎ末端又はＣ末端への遺伝子融合、（２）低分子量薬物の化学的カップリング、（３）アルブミンの疎水性ポケットとの薬物の会合、（４）薬物に遺伝子融合したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の会合、及び（５）アルブミンナノ粒子への薬物のカプセル化で使用されている（Ｅｌｓａｄｅｋ Ｂ，Ｋｒａｔｚ Ｆ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｏｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ － ｎｅｗ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｈｏｒｉｚｏｎ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１２）１５７（１）：４－２８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１１．０９．０６９；Ｋｒａｔｚ Ｆ．Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ａ ｄｒｕｇ ｖｅｈｉｃｌｅ － ａ ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１４）１９０：３３１－６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１４．０３．０１３）。
２つのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合薬が臨床使用のために承認された。グルカゴン様ペプチド１と組換え凝固第ＩＸ因子をそれぞれ含む、Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標）とＩｄｅｌｖｉｏｎ（登録商標）である。両方の薬剤はＨＳＡのＮ末端に遺伝的に融合しており、ペプチドの半減期を２分間から５日間に、凝固因子の半減期を２２時間から１０２時間に延長する。
他の多くのタンパク質薬は、血漿半減期を延長し、治療効果を高めるため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、及びアルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎなどの血清タンパク質に連結されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．，３３４：６８２－９２；Ｗｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．９９：６５９－６７；Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２０：１５１－６０；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：１１８６－９０）。
急性炎症性臓器損傷（ＡＯＩ）は、高い罹患率、死亡率、及び重大な満たされていない医療ニーズを伴う歴史的に困難な疾患である。典型的なＡＯＩには、世界中で毎年３，２４０万人の患者に発生する心筋梗塞（ＭＩ）及び脳卒中が含まれる。過去にＭＩ及び脳卒中を患った患者は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって、先進国の罹患率の上位の原因の１つにランクされている、さらなる冠動脈及び脳のイベントのリスクが最も高い群と見なされている。別のＡＯＩは急性腎障害（ＡＫＩ）であり、これは年間約１，３３０万人に発生する。高所得国では、ＡＫＩの発生率は３～５／１０００であり、高い死亡率（１４～４６％）と関連している（Ｍｅｔｈａ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｌａｎｃｅｔ，３８５（９９８７）：２６１６－４３）。ＭＩ及び脳卒中と同様に、ＡＫＩの生存者は完全に回復しないことが多く、慢性腎疾患又は末期腎疾患を発症するリスクが高い。現在まで、ＡＫＩを予防又は処置するために利用できるＦＤＡ承認薬は存在しない。ＡＫＩの新規処置の開発は困難であることが証明されており、これまでのところ臨床試験で成功した結果はない。これは、敗血症、虚血／再灌流及び／又は腎毒性損傷によって誘発される炎症性、微小血管機能障害、及び腎毒性の病理学的機序を含む、ＡＫＩの多因子的且つ多面的な病態生理学に起因する可能性がある。これらのドライバーは、同時に又は連続して作用して、大半が尿細管細胞であるが糸球体細胞の損傷、腎機能予備能の喪失、そして最終的には腎不全を引き起こす可能性がある。
ＡＯＩの一般的な共通因子の１つは、組織損傷による細胞死の増加、細胞断片の生成の増加、並びに循環及び損傷組織に侵入し得る血栓形成促進／炎症誘発性微粒子である。感染を防ぐために好中球が組織に浸潤した後、好中球は、影響を受けた組織でアポトーシス又は他の形態の細胞死を起こす。好中球には、タンパク質分解酵素及び危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）などの有害物質が含まれており、宿主組織の損傷を促進し、炎症を伝播させる可能性がある。死滅細胞の効率的な取り込みは、非炎症性の分解促進表現型に向けたマクロファージ（ＭΦ）の再プログラミング、並びに影響を受けた組織の分解及び修復の成功のための主要なメディエーターの放出につながる、シグナル伝達イベントを引き起こす。この再プログラミングは、最近、マクロファージにおける食作用性抗炎症反応を活性化する代謝シグナル伝達に起因するとされている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２９（２）：４４３－５６）。非炎症性の方法でのこの破片、又は老化若しくは死滅細胞の除去は、「エフェロサイトーシス」と呼ばれる。
しかし、エフェロサイトーシスが遅延した場合、壊死細胞が蓄積し、例えば、マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α）又は免疫抑制性ＩＬ－１０をトリガーする炎症反応を引き起こし得る（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ‐Ｗａｃｋｅｒ（２０１６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，２７３：３５７－３７０）。さらに、細胞の破片及び粒子が効率的に除去されない場合、好中球－血小板断片クラスター、微小血栓などの細胞塊及び凝集体を引き起こし、且つ／又はＡＴＰ、ＤＮＡ、ヒストン又はＨＭＧＢ１などの危険関連分子パターン（ＤＡＭＰＳ）を放出する可能性がある。結果には、微小血管閉塞、機能不全、並びに組織損傷の進行、一次及び二次臓器不全、又は修復不適応をもたらす顕著な無菌性炎症が含まれ得る。
ＡＯＩの急性期では、エフェロサイトーシス経路が大幅にダウンレギュレーションされているように見える。損傷に対する炎症又は急性反応（器質的要因、低酸素症、酸化ストレス、照射、炎症、及び感染）は、架橋タンパク質及び細胞表面エフェロサイトーシス／クリアランス受容体を含む専用のホスファチジルセリン（ＰＳ）結合タンパク質のダウンレギュレーションによって効果的なエフェロサイトーシス又は食作用を抑制する。エフェロサイトーシス受容体の機能不全の例は、Ｍｅｒチロシンキナーゼ（ＭｅｒＴＫ）などのＴＡＭファミリー受容体のタンパク質分解性シェディングである。ＭｅｒＴＫは、食細胞で優先的に発現する内在性膜タンパク質であり、シグナル伝達タンパク質として機能するだけでなく、エフェロサイトーシス（Ｇａｓ６又はプロテインＳなどのタンパク質を介して）を促進し、炎症性シグナル伝達を阻害する。ＭｅｒＴＫの可溶性エクトドメインのタンパク質分解切断及び放出は、メタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１７によって誘導される。シェディングプロセスは、表面ＭｅｒＴＫの剥脱により、食細胞のエフェロサイトーシスを減少させることができる。さらに、放出されたエクトドメインは、インビトロでエフェロサイトーシスを阻害することもできる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．，８７：１７１－９；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２３（３）：６２３－６２９）。血清／血漿可溶性Ｍｅｒ量の増加は、典型的には、糖尿病性腎症又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの炎症性、悪性、又は自己免疫性疾患で観察され、疾患の重症度を示し得る（Ｏｃｈｏｄｎｉｃｋｙ Ｐ（２０１７）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．，１８７（９）：１９７１－１９８３；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．１３：Ｒ８８）。さらに、乳脂肪球－ＥＧＦ第８因子タンパク質（ＭＦＧ－Ｅ８）などの架橋タンパク質も、大半の急性及び慢性の炎症性疾患の間にダウンレギュレーションされる。可溶性Ｍｅｒと同様に、ＭＦＧ－Ｅ８の血清／血漿濃度の低下は、ＭＩを有する患者又は安定狭心症患者に見ることができ（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．，８（１）：１－２３）、慢性閉塞性肺疾患について説明されているように、疾患の重症度を示し得る（ＣＯＰＤ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）上掲）。
死滅細胞へのホスファチジルセリン（ＰＳ）曝露は、免疫細胞に対する進化的に保存された抗炎症及び免疫抑制シグナルである。膨大な数の主要な哺乳動物病原体が、病原性細胞感染の一部としてＰＳ媒介性取り込みを利用している（Ｂｉｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ．，２３（６）：９６２－７８）。例えば、ウイルスは、ＰＳ結合受容体に直接、又はＧａｓ６などのタンパク質を介して結合できる（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ＆Ｃｈｅｎ（２０１４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，８８（８）：４２７５－９０）。傷害に応答した内因性クリアランス経路の不活性化は、傷害後に細胞に侵入し細胞を乗っ取る感染性病原体の効率を低下させ、それによって宿主の免疫応答及び防御を回避する進化的に発達した応答を提示する可能性がある。結果として、クリアランス経路のダウンモジュレーションは、感染と戦うための自然免疫及び獲得免疫エフェクターの有効性を改善するであろう。「フレンドリーファイア」の結果として、急性臓器損傷時にエフェロサイトーシスが一過性に影響を受ける可能性があり、ＡＯＩで上記の合併症が発生し得る。死滅細胞、破片、炎症誘発性及び血栓形成促進性のＭＰの蓄積は、ＡＯＩの特徴であり、炎症及び微小血管損傷の主要なトリガーを表す。炎症性及び血栓形成促進性微粒子のそのような蓄積は、高い医学的必要性を伴う重篤な疾患において一般的であり、それらの罹患率に寄与し得ることは注目に値する。そのような適応症の例は、敗血症及び癌である（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，３７（６）：７８８１－９１；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３５：５４；Ｍｕｈｓｉｎ－Ｓｈａｒａｆａｌｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｇｅｎ Ｓｕｂｊ．，１８６１（２）：２８６－２９５；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，７（１）：４９７８；Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．８７（６）：１１００－８）。この分野におけるこれまでの創薬の取り組みは、ＰＳ結合タンパク質に焦点を当てており、これは、（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｅｘｐ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，１７（１１）：１２７５－１２８５）によってレビューされるように、薬剤候補設計の基礎として役立ち得る。
ＰＳ結合タンパク質のサブセットは、食細胞を含む多くの細胞型で発現する、αｖβ３及びαｖβ５などのインテグリンも認識し結合する。これらのタンパク質は、アポトーシス／死滅細胞をインテグリンに曝露してＰＳを架橋するように作用し、マクロファージ及びノンプロフェッショナル食細胞によるエフェロサイトーシス（食作用とも呼ばれる）をもたらす。いくつかの架橋タンパク質はまた、大半の急性及び慢性の炎症性疾患の間にダウンレギュレーションされる。そのような架橋タンパク質又はその切断型バージョンの治療的使用は以前に示唆されている（国際公開第２００６１２２３２７号パンフレット（敗血症）、国際公開第２００９０６４４４８号パンフレット（虚血／再灌流後の臓器損傷）、国際公開第２０１２１４９２５４号パンフレット（脳虚血）Ｔｈｅ Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；国際公開第２０１５０２５９５９号パンフレット（心筋梗塞）九州大学及び東京医科大学；国際公開第２０１５０１７５５１２号パンフレット（骨吸収）ペンシルベニア大学；国際公開第２０１７０１８６９８号パンフレット（組織線維症）Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ及び米国特許出願公開第２０１８０３３４４８６号明細書（組織線維症）Ｎｅｘｅｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；国際公開第２０２００８４３４４号パンフレット；しかし、野生型又は天然に存在するタンパク質の使用は、多くの問題によって制限されている。例えば、野生型ＭＦＧ－Ｅ８（ｗｔＭＦＧ－Ｅ８）は、細胞発現系で培養した場合、発達性が低く、溶解性が低く、非常に低い収量で発現すると考えられている。Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）の研究によると、昆虫又はＣＨＯ細胞でＦｃ－ＩｇＧ融合体として発現するＭＦＧ－Ｅ８は完全に凝集しており、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００又はＣＨＡＰＳなどの界面活性剤を添加することによってのみ効率的に精製できることが示されている（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．，１２４：１０－２２）。
これまでに報告されているＭＦＧ－Ｅ８の主な機能は、エフェロサイトーシスを強化し（Ｈａｎａｙａｍａ ２００４ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、脂質の取り込み／処理を調節することである（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１４）。ｒＭＦＧ－Ｅ８は、腸細胞トリグリセリドヒドロラーゼ（ＴＧ）活性を促進することにより、腸細胞特異的な脂質貯蔵を調節する（ＪＣＩ２０１６）。細胞内ＭＦＧ－Ｅ８は、ＡＳＫ１－ＪＮＫ／ｐ３８シグナル伝達カスケードの阻害を介して作用する肝脂質蓄積及び炎症の抑制因子として示された。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０２０）。さらに、抗炎症特性、血管新生の促進、アテローム性動脈硬化症、組織リモデリング、及び止血調節がＭＦＧ－Ｅ８について記載されている。さらに、ＭＦＧ－Ｅ８は、そのＣ１ドメインを介したコラーゲンの結合により、肺組織の過剰なコラーゲンを除去することが報告されている。興味深いことに、ＭＦＧ－Ｅ８－／－マクロファージは、少なくとも１つのディスコイジンドメインを含む組換えＭＦＧ－Ｅ８によって救済できる欠陥のあるコラーゲン取り込みを示した（Ａｔａｂａｉ ｅｔ ａｌ ２００９）。
前臨床試験では、組換えＭＦＧ－Ｅ８は、急性炎症性疾患及び臓器疾患の様々な、大半はげっ歯類モデル、及び異常な治癒を伴う疾患モデルで、確証的な保護を示している。組換えＭＦＧ－Ｅ８は、糖尿病性及びＩ／Ｒ誘発性の創傷／潰瘍の創傷治癒を促進すること（Ｕｃｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ ２０１５／２０１７）；大腸炎後の腸上皮の修復の促進（Ｂｕ ｅｔ ａｌ ２００７）及び損傷後の腱修復の促進（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２０１９）；組換えＭＦＧ－Ｅ８は、尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルにおける腎障害及び線維症を軽減したこと（Ｂｒｉｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１６）が示されている。さらに、有効性は、線維症の典型的なモデルで証明されており、組換えＭＦＧ－Ｅ８は、ＴＡＡ及びＣＣｌ４誘発性肝線維症の解消を促進し（ＳＹ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１６）、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルで保護した（Ａｔａｂａｉ ｅｔ ａｌ ２００９）。最近、ＴＡＡ肝線維症モデルを含むいくつかの前臨床線維症モデルで同様又はさらに優れた有効性を発揮するために、Ｃ２枯渇切断型バージョンが公開された。（国際公開第２０２００８４３４４号パンフレット）。
ＥＤＩＬ３（ＥＧＦ様リピート及びディスコイジンＩ様ドメイン含有タンパク質３）は、最近、Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｖａｋｉｓ ２０１９によってレビューされた。ＥＤＩＬ３（別名ＤＥＬ－１）は、エフェロサイトーシスを媒介し、好中球の動員及び炎症を調節し、造血幹細胞ニッチの緊急骨髄造血（αｖｂ３－インテグリン依存性）の一部としてトリガーし、げっ歯類及び非ヒト霊長類における破骨細胞形成を抑制し、炎症性骨量減少を阻害することが示されている。ＥＤＩＬ３は、中枢神経系の免疫特権の不可欠な成分であることがわかった。治療用タンパク質としてのＥＤＩＬ３の可能性は、ヒトＩｇＧのＦｃ断片（ＤＥＬ－１－Ｆｃ）との融合タンパク質として試験された。ＤＥＬ－Ｆｃ投与は、好中球浸潤を阻害し、歯周炎のマウスモデルでＩＬ－１７による炎症性骨量減少を遮断した（Ｅｓｋａｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．２２６０）。さらに、ＤＥＬ－１－Ｆｃは、非ヒト霊長類歯周炎モデルにおける歯周炎、組織破壊、及び骨量減少を改善した（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１５ ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｃ５３８０）。さらに、ＤＥＬ－１－Ｆｃは、再発寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、並進多発性硬化症モデルを改善し（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ ２０１４ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｐ．２０１４．１４６）；ＤＥＬ－１－Ｆｃは、マウスモデルにおいて、術後腹膜癒着の発生率及び重症度をさらに低下させた。Ｆｕ ｅｔ ａｌ ２０１８。
架橋タンパク質、例えば、ＭＦＧ－Ｅ８、ＥＤＩＬ３、Ｇａｓ６による、死滅細胞、破片、微粒子の除去は、無菌炎症及び微小血管機能障害の主な原因を排除し、したがって組織損傷の進行を防ぎ、炎症の解消を可能にし得る。したがって、ＡＯＩの過程で死滅細胞のクリアランスを促進する治療アプローチは、ＡＯＩの病状を軽減又は少なくとも緩和するために使用される可能性があり、死滅細胞又はＰＳ曝露微粒子が十分にクリアされない他の疾患設定で意味がある可能性がある。
したがって、満たされていない医療ニーズに対処するための望ましい製造特性を有する治療用マルチドメインタンパク質が必要である。
本開示において、出願人らは、野生型タンパク質の前述の望ましくない特性及び産生の問題を伴わずに、天然に存在するタンパク質（例えば、ＭＦＧ－Ｅ８）の構造に基づいて組換え治療用マルチドメイン融合タンパク質を生成した。具体的には、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、治療用マルチドメイン融合タンパク質のドメイン間に位置する場合、非常に効果的な可溶化ドメインとして同定された。
可溶化ドメインを含むマルチドメイン治療用融合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、可溶化ドメイン、例えば、ＨＳＡなどのアルブミンは、融合タンパク質のドメイン間に位置しており、例えば、インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインの間に位置している。
本開示のマルチドメイン融合タンパク質は、インテグリン結合ドメイン（例えば、ＥＧＦ様ドメイン）、可溶化ドメイン、及びホスファチジルセリン結合ドメイン（例えば、ＭＦＧ－Ｅ－８からのＣ１ドメイン又はそのパラログＥＤＩＬ３）を含む。本発明のタンパク質は、急性又は慢性の炎症性臓器障害、免疫系又は線維症によって引き起こされる臓器障害の予防又は処置に適している。本発明のタンパク質はまた、修復及び再生を可能にし、加速し、促進するためのその用途が見出され得る。
インテグリン結合ドメイン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）結合ドメイン、及び可溶化ドメインを含むエフェロサイトーシスを強化するための治療用融合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、可溶化ドメインは、融合タンパク質の結合ドメイン間に位置しており、例えば、インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインの間に位置している。
本発明は、マルチドメインタンパク質の１つ以上のドメインを改変して所望の治療特性を有すること、及び治療用タンパク質のドメイン内に、アルブミン、例えば、ＨＳＡ又はその機能的変異体を挿入することによる、治療用マルチドメインタンパク質の開発のための方法をさらに提供する。
本発明は、マルチドメインタンパク質の１つ以上のドメインを改変して所望の治療特性を有すること、及び治療用タンパク質のドメイン内に、アルブミン、例えば、ＨＳＡ又はその機能的変異体を挿入することによる、治療用マルチドメインタンパク質の製造方法をさらに提供する。
融合マルチドメインタンパク質は、野生型タンパク質、例えば、ＭＦＧ－Ｅ８又はＥＤＩＬ３タンパク質の主要な生物学的機能を、例えば、ＰＳ曝露死滅細胞、破片、及び微粒子を食細胞に架橋し、したがってエフェロサイトーシスをトリガーするように機能することによって、維持する。さらに、本開示の治療用マルチドメイン融合タンパク質は、野生型、例えば、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質（配列番号１）、又は組換えＭＦＧ－Ｅ８及びＣ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８（ＥＧＦ＿Ｃ１）と比較して、開発可能性が改善されており、特に粘着性が低下し、溶解性が改善されている。さらに、これらの治療用マルチドメイン融合タンパク質は、野生型タンパク質と比較した場合、血漿曝露がより長く、細胞発現系で発現した場合の収量がより高くなる。本発明による治療用融合タンパク質は、マクロファージ選択的活性が増加している（エフェロサイトーシスの増強）。さらに、本発明による融合タンパク質は、驚くべきことに、全長ＭＦＧ－Ｅ８又は全長ＥＤＩＬ３と比較して、止血／血液凝固に影響を及ぼさない。さらに、本発明による治療用融合タンパク質は、全長、野生型ＭＦＧ－Ｅ８又は他の全長機能的変異体と比較して改善された安全性を有する。
インテグリン結合ドメイン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）結合ドメイン、及び可溶化ドメインを含むエフェロサイトーシスを強化するための治療用融合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、ＰＳ結合ドメインは、表２に列挙されている少なくとも１つのＰＳ結合ドメインの切断型変異体である。
いくつかの特定の実施形態において、治療用融合タンパク質は、可溶化ドメインのＮ末端に連結されたインテグリン結合ドメインのＣ末端、及びＰＳ結合ドメインに連結された可溶化ドメインのＣ末端を含む。いくつかの実施形態において、治療用融合タンパク質は、一般構造ＥＧＦ－Ｓ－Ｃを含み、ここで、ＥＧＦは、インテグリン結合ドメイン、例えば、ＭＦＧ－Ｅ８の、ＥＤＩＬ３の、又は表１に列挙されるインテグリン結合ドメインを含む任意の他のタンパク質の、インテグリン結合ドメインを表し；Ｓは、可溶化ドメインを表し；Ｃは、切断型ＰＳ結合ドメイン、例えば、ＭＦＧ－Ｅ８、ＥＤＩＬ３、又は表２に列挙されるＰＳ結合ドメインのＣ１及び／又はＣ２のいずれかを含む任意の他のタンパク質に見られるＰＳ結合ドメインの切断型変異体を表す。インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインの両方を含むタンパク質の例、例えば、ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号１）及びＥＤＩＬ３（配列番号１１）が表３に列挙される。
いくつかの実施形態において、ＰＳ結合ドメインは、２つのディスコイジンＣ１－Ｃ２サブドメインのうちの１つ、又はその機能的変異体を含む。例えば、配列番号３記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸、又はその切断型変異体を有するヒトＭＦＧ－Ｅ８のＰＳ結合ドメインである。一実施形態において、切断型ＰＳ結合ドメインは、ヒトＭＦＧ－Ｅ８の切断型ＰＳ結合ドメイン、又は１、２、３、４、５、最大１０個のアミノ酸修飾を含むその機能的変異体を含む。一実施形態において、ＰＳ結合ドメインは、ヒトＥＤＩＬ３の切断型ＰＳ結合ドメイン、又は１、２、３、４、５、最大１０個のアミノ酸修飾を含むその機能的変異体を含む。
特定の態様において、上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、可溶化ドメイン、Ｃ１ドメインを含むが、機能的Ｃ２ドメインを欠く融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、可溶化ドメイン、Ｃ１ドメインを含むが、メディン（ｍｅｄｉｎ）ポリペプチド又はその断片を欠く。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質の可溶化ドメインは、インテグリン結合ドメインに連結されている。いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ＰＳ結合ドメインに連結されている。いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、インテグリン結合ドメイン及びＰＳ結合ドメインの両方に連結されており、すなわち、インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインとの間に位置している。いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、インテグリン結合ドメイン内に挿入されるか、又はＰＳ結合ドメイン内に挿入される。一実施形態において、治療用融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、インテグリン結合ドメイン－可溶化ドメイン－ＰＳ結合ドメインの構造を有する。
いくつかの実施形態において、治療用融合タンパク質のインテグリン結合ドメインは、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）結合モチーフを含み、αｖβ３及び／又はαｖβ５又はα８β１インテグリンに結合する。
いくつかの実施形態において、治療用融合タンパク質の可溶化ドメインは、インテグリン結合ドメインに直接連結され、且つ／又はＰＳ結合ドメインに連結される、すなわち、前記ドメインの間に挿入される。代替的な実施形態において、可溶化ドメインは、外部リンカーなどのリンカーによって、インテグリン結合ドメイン及び／又はＰＳ結合ドメインに間接的に連結される。いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡのドメイン３（ＨＳＡ Ｄ３）若しくはＩｇＧのＦｃ領域（Ｆｃ－ＩｇＧ）、又はそれらの機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態において、インテグリン結合ドメインは、ＥＧＦ様ドメインであり、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸、又はその切断型変異体を有する。一実施形態において、ＥＧＦ様ドメインは、ヒトＭＦＧ－Ｅ８のＥＧＦ様ドメイン、又は１、２、３、４、５、最大１０個のアミノ酸修飾を含むその機能的変異体を含む。一実施形態において、ＥＧＦ様ドメインは、ヒトＥＤＩＬ３のＥＧＦ様ドメイン、又は１、２、３、４、５、最大１０個のアミノ酸修飾を含むその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ＨＳＡ又はその機能的変異体であり、例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸、又はその切断型変異体を有する。一実施形態において、ＨＳＡは、タンパク質の凝集傾向を低下させるように機能するアミノ酸置換Ｃ３４Ｓを含み、配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、又は１、２、３、４、５、最大１０個のアミノ酸修飾を含むその機能的変異体、例えば、ＨＳＡ Ｃ３４Ｓ、又はＨＳＡの切断型変異体、例えば、ＨＳＡのドメイン３（ＨＳＡ Ｄ３）又はその機能的変異体を含む。好ましい実施形態において、可溶化ドメインはＨＳＡ Ｃ３４Ｓである。
代替的な実施形態において、可溶化ドメインは、ＩｇＧのＦｃ領域（Ｆｃ－ＩｇＧ）、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はそれらの機能的変異体のＦｃ領域を含む。一実施形態において、可溶化ドメインは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸、又はその切断型変異体を有する、ヒトＦｃ－ＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。一実施形態において、Ｆｃ－ＩｇＧ１は、Ｆｃエフェクター機能を低下させるためのアミノ酸置換Ｄ２６５Ａ及びＰ３２９Ａを含み、配列番号８に記載されるようなアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、Ｆｃ－ＩｇＧ１は、「ノブ」を作製するためのアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含むか、又は「ホール」を作製するためのアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み得る。さらに、Ｆｃ－ＩｇＧ１ノブはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み得、Ｆｃ－ＩｇＧ１ホールはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含み得、その結果、対形成時にシステイン架橋が形成される。ノブ・イン・ホール修飾に加え、Ｆｃ－ＩｇＧ１はまた、Ｆｃエフェクター機能を低下させるためにＤ２６５Ａ及びＰ３２９Ａ置換を含み得る。一実施形態において、Ｆｃ－ＩｇＧ１は、配列番号９又は１０に記載されるようなアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態において、治療用融合タンパク質は、乳脂肪球－ＥＧＦ第８因子タンパク質（ＭＦＧ－Ｅ８）及び可溶化ドメインを含み、ここで、ＭＦＧ－Ｅ８は、インテグリン結合ＥＧＦ様ドメイン（配列番号２）及びホスファチジルセリン結合Ｃ１－Ｃ２ドメインの機能的変異体（配列番号３、又は配列番号７６）を含む。ＭＦＧ－Ｅ８は、天然又は野生型のヒトＭＦＧ－Ｅ８（配列番号１）、又は配列番号７５を有するＭＦＧＥ－８又はその機能的変異体を含み得る。一実施形態において、可溶化ドメインは、ＭＦＧ－Ｅ８のＮ又はＣ末端に連結されている。一実施形態において、可溶化ドメインは、ＥＧＦ様ドメインとＣ１ドメインとの間に、又はＥＧＦ様ドメインとＣ２ドメインとの間に挿入される。好ましい実施形態において、可溶化ドメインは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端に連結され、Ｃ１ドメインのＮ末端に連結される。可溶化ドメインは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端に直接的又は間接的に連結され得、Ｃ１ドメインのＮ末端に直接的又は間接的に連結され得る。いくつかの実施形態において、間接連結は、外部リンカー、例えば、グリシン－セリンベースのリンカーによる。
いくつかの実施形態において、及び実施例のセクションに記載されるように、本開示の治療用融合タンパク質は、ヒト内皮細胞－Ｊｕｒｋａｔ細胞エフェロサイトーシスアッセイにおいて内皮細胞によるエフェロサイトーシスを促進し、ヒトマクロファージ－好中球エフェロサイトーシスアッセイにおいて、マクロファージによる基礎エフェロサイトーシスの障害を回復し及び基礎エフェロサイトーシスを増強するように機能し；融合タンパク質は、ヒト内皮－微粒子エフェロサイトーシスアッセイにおけるクリアランスによって血漿微粒子の数を減少させるように機能し；且つ／又は融合タンパク質は、急性腎虚血モデルにおける多臓器損傷に対する保護を提供する。
これらの治療用融合タンパク質を利用する又はそれを含む方法、使用、診断試薬、医薬組成物及びキットも本明細書に開示される。開示される融合タンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含むクローニング及び発現ベクター、そのような核酸を含む宿主細胞、並びにそのような宿主細胞を培養することによって開示される融合タンパク質を産生するプロセスも本明細書に提供される。
本開示の治療用融合タンパク質の例の概略図を示す。可溶化ドメイン（「ＳＤ」と表示）は、ＭＦＧ－Ｅ８のＣ末端、Ｎ末端、又はＥＧＦ、Ｃ１若しくはＣ２ドメイン間のいずれかで連結されていた。 図２：ＨＥＫ細胞で発現した融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲルの数を示す。図２Ａ：ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２タンパク質（ＦＰ３３０；配列番号４２）；図２Ｂ：ＥＤＩＬ３タンパク質のＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２（ＦＰ０５０；配列番号１２）；図２Ｃ：非還元及び還元ＥＧＦ－Ｆｃ（ＫｉＨ）Ｃ１－Ｃ２タンパク質（このタンパク質は、ＦＰ０７１（ＥＧＦ－Ｆｃ（ノブ）－Ｃ１－Ｃ２；配列番号１８）とＦｃ－ＩｇＧ１ホール（配列番号１０）のヘテロ二量体である）；図２Ｄ：ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１タンパク質（ＦＰ２６０；配列番号３４）。図２Ａ、２Ｃ、及び２Ｄのそれぞれについて、第１列はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓタンパク質の未染色標準マーカーを示し、第２列はそれぞれの融合タンパク質を示す。図２Ｂについて、第１列は融合タンパク質を示し、第２列はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓタンパク質未染色標準マーカーを示す。図２Ｅは、産生及び精製されたさらなる組換えタンパク質を示す。 （上記の通り。） 実際の取り扱い中の野生型（ｗｔ）ＭＦＧ－Ｅ８に対する、融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）タンパク質の損失の影響を例示する。図３Ａは、非結合プレート（記号：●）で作製した希釈物と比較して、ポリプロピレンプレート（記号：□）でタンパク質希釈物を作製した場合のＬ－α－ホスファチジルセリン競合アッセイでの野生型ＭＦＧ－Ｅ８の有効性の喪失を示す。対照的に、図３Ｂは、非結合プレート（記号：●）に対し、ポリプロピレンプレート（記号：□）でタンパク質希釈物を作製した場合、ＰＳ競合アッセイにおいて、融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の有効性の損失が実質的にないことを示す。 Ｌ－α－ホスファチジルセリンへの融合タンパク質の結合を示す。図４Ａは、ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の、固定化されたＬ－α－ホスファチジルセリンへの、及びより弱い程度でのリン脂質カルジオリピンへの結合を、濃度依存的に示す。図４Ｂは、競合アッセイ形式（ビオチン化マウス野生型ＭＦＧ－Ｅ８のＬ－α－ホスファチジルセリンへの結合に対する競合）における、ヒト野生型ＭＦＧ－Ｅ８及びいくつかの治療用融合タンパク質：ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）、ＦＰ２５０（ＥＧＦ－ＨＳＡ；配列番号３２）、ＦＰ２６０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１；配列番号３４）、及びＦＰ２７０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ２；配列番号３６）の、固定化されたＬ－α－ホスファチジルセリンへの濃度依存的な結合を示す。 図５：融合タンパク質へのαｖ－インテグリン依存性細胞接着を示す。図５Ａは、ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）への細胞接着がαｖインテグリン阻害剤シレンジタイド又は１０ｍＭ ＥＤＴＡによって完全に遮断されていることを示す。ＥＧＦ様ドメイン（ＦＰ２８０；配列番号３８）のインテグリン結合モチーフＲＧＤ（ＲＧＤ＞ＲＧＥ）の単一点変異は、図５Ｂに示すように細胞接着の完全な抑制をもたらす。図５Ｃは、固定化されたＥＧＦ－ＨＳＡタンパク質（ＦＰ２５０；配列番号３２）が、ＥＧＦ様ドメインにもかかわらず、ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞の接着をサポートしないか、又は中程度にのみサポートすることを示す。図５Ｄに示されるように、本開示の融合タンパク質（ＦＰ３３０；配列番号４２）は、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞で発現される場合、野生型ＭＦＧ－Ｅ８と同様にαｖ－インテグリン依存性細胞接着を促進する。 （上記の通り。） 治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）がヒトマクロファージによる死滅好中球のエフェロサイトーシスの促進に及ぼす影響を示す。融合タンパク質の濃度はｘ軸に示され、エフェロサイトーシス［％］はｙ軸に示される。 図７：治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）が、ヒトマクロファージによる死滅好中球のエンドトキシン（リポ多糖）障害性エフェロサイトーシスを救済できることを示す。図７Ａは、３人のヒトドナーにおける１００ｐｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）による、死滅するヒト好中球のマクロファージエフェロサイトーシスの障害を示す。左のパネルは個々のドナーの応答を示し、右のパネルは３人のドナーのエフェロサイトーシスの平均障害（％）を示す。図７Ｂは、治療用融合タンパク質ＦＰ２７８の存在下でのヒトマクロファージによる死滅好中球のこのエンドトキシン（ＬＰＳ）障害性エフェロサイトーシスの救済を示す。３人の異なるヒトマクロファージドナーのエフェロサイトーシス指数を正規化し、エフェロサイトーシス（％）としてプロットした。 （上記の通り。） 図８：治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）を用いたヒトマクロファージによる、死滅好中球のエフェロサイトーシスの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）粒子誘発性障害の救済を示す。図８Ａは、ベースレベルと比較したエフェロサイトーシスの促進に対する１００ｎＭのＦＰ２７８の濃度の効果（点線；図の左側）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の投与によって引き起こされるエフェロサイトーシスの障害の救済における１００ｎＭのＦＰ２７８の効果（図の右側）を示す。図８Ｂは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の投与によって引き起こされるエフェロサイトーシス障害の救済、及びエフェロサイトーシスの基本レベルに達した後のエフェロサイトーシスの促進に対する、融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＣ５０ ８ｎＭ）の濃度の増加の影響を示す。 （上記の通り。） ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞のエフェロサイトーシスの促進に対する治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の効果を示す。図９に示すように、構造ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ２（ＦＰ２７０；配列番号３６）の融合タンパク質はこのアッセイでは効果がないため、内皮細胞エフェロサイトーシスアッセイにおける融合タンパク質の効率は、Ｃ１－Ｃ２又はＣ１－Ｃ１タンデムドメインの存在に依存する。 治療用融合タンパク質のＨＳＡドメインの位置、すなわちＮ末端又はＣ末端の位置（それぞれＦＰ２２０（ＨＳＡ－ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号３０）又はＦＰ１１０（ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－ＨＳＡ；配列番号２８））は、マクロファージエフェロサイトーシスアッセイにおいてＭＦＧ－Ｅ８ ＨＳＡ融合タンパク質にエフェロサイトーシス遮断機能を付与することを示す。融合タンパク質の濃度はｘ軸に示され、エフェロサイトーシス［％］はｙ軸に示される。 図１１：ＨＳＡ又はＦｃ部分を含む様々な形式の治療用融合タンパク質によるエフェロサイトーシスの促進の比較を示す。融合タンパク質の濃度はｘ軸（ｎＭ）に示され、エフェロサイトーシス［ＭＦＩ］はｙ軸に示される。図１１Ａは、ＨＳＡがＣ末端、又はＮ末端、又はＥＧＦ様ドメインとＣ１ドメインとの間；それぞれＦＰ１１０（ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－ＨＳＡ；配列番号２８）、ＦＰ２２０（ＨＳＡ－ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号３０）及びＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号：４４）に位置する、ＨＳＡを含む融合タンパク質の比較を示す。図１１Ｂは、ＦｃがＣ末端（ＦＰ０６０（ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－Ｆｃ［Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ］；配列番号１４）及びＦＰ０８０（ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－Ｆｃ；配列番号２２））又はＥＧＦ様ドメインとＣ１ドメインの間（ＦＰ０７０（ＥＧＦ－Ｆｃ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号１６））に位置する、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質の、野生型ＭＦＧ－ＥＧ（配列番号１）に対する比較を示す。Ｆｃ部分の２つのフォーマットが示される：野生型Ｆｃ（ＦＰ０８０；配列番号２２）及び修飾Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを有するＦｃ部分（ＥＵ付番；ＦＰ０６０；配列番号１４）。図１１Ｃは、３つの異なる濃度（０．７２、７．２及び７２ｎＭ）で、Ｎ末端に配置されたＦｃ部分を含む融合タンパク質ＦＰ０９０（Ｆｃ－ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号２４）の３つのバッチの、野生型ＭＦＧ－Ｅ８対照に対する比較を示す。図１１Ｄは、ＥＤＩＬ３のＥＧＦ様ドメイン及びＣ１－Ｃ２ドメインの間に挿入されたＨＳＡを含む融合タンパク質構築物ＦＰ０５０（ＥＤＩＬ３ベースＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号１２）によるエフェロサイトーシスの促進を示す。図１１Ｅは、本開示の融合タンパク質のさらなる例、例えば、キメラ変異体（ＦＰ１１４又はＦＰ２６０；配列番号３４、ＦＰ１４７又はＦＰ１７７７；配列番号７１、ＦＰ１１４９、ＦＰ１１５０、ＦＰ１４５；配列番号８０、ＦＰ１１４５；配列番号１０３、ＦＰ１４６；配列番号８２、ＦＰ１１４６）及びＭＦＧＥ８又はＥＤＩＬ３のインテグリン結合ドメインと、ＴＩＭ４のＩｇＳＦＶドメイン又は架橋タンパク質ＧＡＳ６（ＦＰ１１４７及びＦＰ１１４８）のＧＬＡドメインなどのＰＳ結合ドメインとの組み合わせを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ３０ｎＭまでの３つの異なる濃度で試験された治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）のＨＵＶＥＣ細胞によるエフェロサイトーシスの促進を示す。エフェロサイトーシスの促進は濃度依存性であり、融合タンパク質ＦＰ２７８の濃度が増加するにつれてエフェロサイトーシスが増加した。 図１３：治療用融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２；図１３Ａ）、ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４；図１３Ｂ）及びＦＰ７７６（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４８；図１３Ｃ）が、ヒトマクロファージによる死滅好中球のエンドトキシン（リポ多糖）障害性エフェロサイトーシスを救済できることを示す。融合タンパク質の濃度はｘ軸に示され、エフェロサイトーシス［％］はｙ軸に示される。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図１４：融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２；図１４Ａ）、ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４；図１４Ｂ）及びＦＰ７７６（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４８；図１４Ｃ）のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞のエフェロサイトーシスの促進に対する効果を示す。融合タンパク質の濃度はｘ軸に示され、エフェロサイトーシス［％］はｙ軸に示される。 （上記の通り。） 図１５：治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）、ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）又はＦＰ７７６（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４８）の単回投与が、虚血再灌流傷害誘発性急性腎障害（ＡＫＩ）のモデルで腎機能を保護することを示す。図１５Ａは、０．１６ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇのＦＰ２７８（配列番号４４）（ｘ軸）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によって血清クレアチニン（ｓＣｒ）（ｍｇ／ｄＬ；ｙ軸）の上昇が減少することを示す。図１５Ｂに示されるように、０．５ｍｇ／ｋｇ又は１．５ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質ＦＰ３３０（配列番号４２）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、血清クレアチニンレベルを有意に低下させた。図１５Ｃは、融合タンパク質ＦＰ７７６（配列番号４８）の静脈内投与が用量依存的に血清クレアチニンを減少させたことを示す。 （上記の通り。） ０．１６ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇのいずれかの治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の単回投与により、急性腎障害のマウスモデルにおける血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルが減少したことを示す。 図１７：治療用融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の単回投与が、損傷マーカーの遺伝子発現に基づいて、虚血再灌流誘発性ＡＫＩによって誘発される急性期反応から遠隔臓器を保護することを示す。図１７Ａは、マウス心臓における血清アミロイドタンパク質のそのようなＡＫＩ誘発性応答（ＳＡＡ）を例示し、図１７Ｂは、ネズミ肺におけるそのようなＡＫＩ誘発性応答（ＳＡＡ）を例示し、これらは両方、０．１６ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．でのＭＦＧ－Ｅ８由来融合タンパク質ＦＰ２７８の単回のｉ．ｐ．注射の後に強力に遮断された。 （上記の通り。） 肝臓による超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）造影剤（Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標））の経時的な取り込みを示す。Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標）は、ＡＫＩを有する動物（疾患誘発後２４時間）又は偽手術後（腎摘出後２４時間の動物）に、１．２秒間ボーラスとして静脈内注射した。ＡＫＩを有する動物は、偽手術の動物と比較して、肝臓（標的＝クッパー細胞）による造影剤の取り込みが大幅に減少していることを示した。ＡＫＩ誘発の約３０分前に予防的に投与された、又は虚血再灌流傷害誘発の５時間後に治療的に投与された、融合タンパク質ＦＰ７７６（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４８）による処置は、ＡＫＩマウスの肝臓における造影剤蓄積の喪失から保護した。 本明細書でＦＰ２６０とも呼ばれる治療用融合タンパク質ＦＰ１１４（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１ 配列番号３４）は、１．５ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｖ．で、実施例に記載されるように、ＡＫＩモデルで試験された。この研究では、ＦＰ１１４は虚血再灌流傷害発症の３０分前に投与された。血清マーカー及び腎臓重量は、疾患の誘発から２４時間後に評価された。血清クレアチニン及びＢＵＮの低下、並びに正常な腎臓重量は、このモデルにおいてＡＫＩからの保護を示唆している。 本明細書においてＦＰ２６１とも呼ばれる治療用融合タンパク質ＦＰ１３５（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１ 配列番号７３）は、ＣＣＬ４線維症モデルで、０．８ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．で試験された。処置は、４週間の線維症誘発（ＣＣＬ４による）後（合計１１回の投与）、又は５週間のＣＣＬ４による線維症誘発後（合計８回の投与）、週３回の投与で開始された。動物の第３群は、ＣＣＬ４による疾患誘発の中止の６週間後に投与された（合計４投与）。全ての群で、ＦＰ１３５は最後の３日間で１日１回投与された。肝臓の硬化度は、ベースラインの日（実験の開始時）のＣＣＬ４の中止時とＣＣＬ４の中止の３日後に評価された。データは、ＦＰ１３５（ＣＣｌ４の４週目及び５週目以降に開始）で処置された動物では、ＣＣＬ４によって誘発された肝臓の硬化度の有意に加速された解消が達成されたことを示唆している。 図２１：図２１Ａ 治療用融合タンパク質ＦＰ１３５（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１ 配列番号７３）は、ＣＣＬ４線維症モデルで、０．８ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．で試験された。処置は、４週間の線維症誘発（ＣＣＬ４による）後（合計１１回の投与）、又は５週間のＣＣＬ４による線維症誘発後（合計８回の投与）、週３回の投与で、又はＣＣＬ４による疾患誘発の中止の６週間後（合計４回の投与）に開始された。全ての群で、ＦＰ１３５は最後の３日間で１日１回投与された。血清ＡＬＴの低下は、ＦＰ１３５による処置が、ＣＣｌ４の４週目及び５週目以降に処置を開始した群でＣＣＬ４によって引き起こされた肝障害の解消を加速するのに役立ったことを示唆している。図２１Ｂ 治療用融合タンパク質ＦＰ１３５（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１ 配列番号７３）は、図２１Ａで説明したように、ＣＣＬ４線維症モデルで、０．８ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．で試験された。屠殺された動物の肝臓におけるコラーゲン含有量は、ヒドロキシプロリンアッセイによって定量化された。８回及び１１回投与された動物で観察された減少は、ＦＰ１３５による処置が、ＣＣＬ４によって引き起こされた肝線維症の解消を加速するのに役立ったことを示唆している。図２１Ｃ 治療用融合タンパク質ＦＰ１３５（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１ 配列番号７３）は、図２１Ａで説明したように、ＣＣＬ４線維症モデルで、０．８ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．で試験された。屠殺された動物の肝臓におけるコラーゲン発現は、ｑＰＣＲによって定量化された。８回及び１１回投与された動物で観察された減少は、ＦＰ１３５による処置が、ＣＣＬ４によって引き起こされた肝線維症の解消を加速するのに役立ったことを示唆している。 （上記の通り。） 切断型タンパク質ＦＰ１３７、ＦＰ１３５及びＦＰ１４７のセクションのインテグリン接着データを示す。 Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８（ＥＧＦ－Ｃ１；配列番号１１５）及びＨＳＡ融合（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１；配列番号７３）の動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。
可溶化ドメインを含む治療用マルチドメイン融合タンパク質が本明細書に開示され、ここで、可溶化ドメイン、例えば、ＨＳＡなどのアルブミンは、融合タンパク質のドメイン間に位置しており、例えば、インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインの間に位置している。インテグリン結合ドメイン、ＰＳ結合ドメイン及び可溶化ドメインを含む治療用マルチドメイン融合タンパク質も本明細書に開示される。本開示の融合タンパク質を使用する処置方法、並びに融合タンパク質の特徴付けに有用なエフェロサイトーシスアッセイなどのアッセイも本明細書に開示される。
ヒト血清アルブミンには、多くの望ましい医薬特性を有する。これらには以下が含まれる：１９～２０日の血清半減期；約３００ｍｇ／ｍＬの溶解度；良好な安定性；発現の容易さ；エフェクター機能なし；低い免疫原性；約４５ｍｇ／ｍＬの自然循環血清濃度。ＨＳＡは、タンパク質、ペプチド、ワクチン、細胞及び遺伝子治療製品を、とりわけ表面吸着、凝集、酸化、沈殿から効果的に安定化、保護するための製剤用の用途の広い賦形剤として当技術分野で知られている。脂肪酸及び薬物などの生物学的に重要な分子を含む、又は他のタンパク質と複合体を形成した、リガンドを有しない又は有するＨＳＡの結晶構造は、当技術分野で周知である。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ Ｐ０２７６８；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５８：２０９－２１５（１９９２）；Ｓｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１２：４３９－４４６（１９９９）を参照されたい。ウシ、ウマ（ｈｏｒｓｅ）、ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅ）のアルブミンのアミノ酸配列及び構造は公知である。例えば、Ｍａｊｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５２：１７４－１８２（２０１２）；Ｂｕｊａｃｚ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６８：１２７８－１２８９（２０１２）を参照されたい。多くのヒト血清アルブミンの天然遺伝的変異体は当技術分野で周知である。このような天然に存在する変異体は、ＨＳＡの安定性、半減期、リガンド結合、及び担体機能に影響を与え得る。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａａｒｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｖｉａ，Ｉｔａｌｙにより維持されるＴｈｅ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｗｅｂｓｉｔｅ（ａｌｂｕｍｉｎ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｔｉｃ－ｖａｒｉａｎｔｓ－ｏｆ－ｈｕｍａｎ－ｓｅｒｕｍ－ａｌｂｕｍｉｎ及びａｌｂｕｍｉｎ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｔｉｃ－ｖａｒｉａｎｔｓ－ｏｆ－ｈｕｍａｎ－ｓｅｒｕｍ－ａｌｂｕｍｉｎ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｌｉｓｔ）を参照されたい。そのため、ヒト血清アルブミン及びその天然の遺伝的変異体［又はＨＳＡの改変バージョン］を利用して、新規治療薬を生成することが可能である。そのようなアルブミン、例えばＨＳＡ、変異体は、例えば国際公開第２０１２１５０３１９号パンフレット、国際公開第２０１４０７２４８１号パンフレットから公知である。
定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語が、詳細な説明全体を通して具体的に定義されている。別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
配列（例えば、アミノ酸配列）に関して「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が使用される全ての場合において、前記配列はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」、「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」などの用語によっても限定され得ることが理解されるものとする。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という句は、方法又は組成物に含まれる活性医薬品の属又は種、並びに方法又は組成物の意図された目的に対して不活性な任意の賦形剤を指す。いくつかの態様において、「本質的にからなる」という句は、本開示の多重特異性結合分子以外の１つ以上のさらなる活性剤の包含を明示的に除外する。いくつかの態様において、「本質的にからなる」という句は、本開示の多重特異性結合分子及び第２の共投与される薬剤以外の１つ以上のさらなる活性剤の包含を明示的に除外する。
本明細書で使用される場合、「エフェロサイトーシス」という用語は、細胞生物学におけるプロセスを指し、ここで、アポトーシス又は壊死又は老化細胞又は高度に活性化された細胞又は細胞外細胞小胞（微粒子）又は細胞破片などの死滅細胞又は死細胞（総称して「プレイ」と呼ばれる）は、食作用によって除去され、すなわち、食細胞に貪食され、消化される。エフェロサイトーシスの間、食細胞は活発にプレイをつなぎとめ、貪食し、エフェロソームと呼ばれるプレイを含有する細胞内の大きな液体で満たされた小胞を生成し、プレイの分解が開始されるリソソーム区画を生じる。アポトーシス中、エフェロサイトーシスは、それらの膜の完全性が損なわれ、その内容物が周囲組織に漏れる前に死滅細胞が除去され、毒性酵素、酸化剤、並びにＤＮＡ、ヒストン、及びプロテアーゼなど他の細胞内成分のＤＡＭＰへの周囲組織の曝露を防ぐことを保証する。プロフェッショナル食細胞には、マクロファージ及び樹状細胞などの骨髄由来の細胞が含まれるが、その他の細胞、例えば間質細胞は、上皮細胞及び内皮細胞、並びに線維芽細胞などのエフェロサイトーシスも実施できる。エフェロサイトーシスの障害は、自己免疫疾患及び組織損傷に関連づけられており、嚢胞性線維症、気管支拡張症、ＣＯＰＤ、喘息、特発性肺線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎及びアテローム性動脈硬化症などの疾患で実証されている（Ｖａｎｄｉｖｉｅｒ ＲＷ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｈｅｓｔ，１２９（６）：１６７３－８２）。現時点で、エフェロサイトーシスを特異的に促進する治療法は臨床試験に入っていない。
本明細書で使用され、実施例で説明される「エフェロサイトーシスアッセイ」という用語は、食細胞としてヒトマクロファージ又はヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用する、融合タンパク質のプロファイリングのために開発されたアッセイシステムに関する。マクロファージ－好中球エフェロサイトーシスアッセイ、内皮細胞－ジＪｕｒｋａｔ細胞エフェロサイトーシスアッセイ、又は内皮細胞微粒子エフェロサイトーシスアッセイが本明細書に例示される。これらのアッセイは、実施例でより詳細に説明されるように、本開示の融合タンパク質などのＭＦＧ－Ｅ８由来の生物療法剤が、マクロファージ又は内皮細胞による死滅細胞及び微粒子のエフェロサイトーシスを効果的に促進することを実証するために使用することができる。さらに、記載されたマクロファージ－好中球アッセイは、本発明のそのような化合物が、死滅細胞のＬＰＳ又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）障害性エフェロサイトーシスであっても救済できることを実証するのに適している。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書において同義的に使用される。この語句は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。特に示されない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾された変異体も暗に包含する。
本明細書で使用される場合、「ドメイン」は、それ自体で単一ドメインタンパク質を形成するか、又は他のものと再結合してマルチドメインタンパク質の一部を形成することができる、独立した進化単位を指す。
本開示のタンパク質に関して本明細書で使用される「粘着性」という用語は、タンパク質の凝集（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）又は凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を促進するタンパク質のミスフォールディングの結果を指す。これらの望ましくない非機能的効果は、表面の疎水性相互作用の結果である。
本明細書で使用される場合、「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有するポリペプチド鎖のカルボキシル末端アミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するポリペプチド鎖のアミノ末端アミノ酸を指す。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」又は「マルチドメイン融合タンパク質」という用語は、いくつかのドメインを含むタンパク質を指し、これは、天然又は野生型のタンパク質全体を構成するとは限らないが、細胞表面の対応する受容体への結合に関与するタンパク質全体の活性ドメインに限定され得る。融合タンパク質は、組換えタンパク質設計を使用して生成することができ、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技法によって調製、発現、作製、又は単離されたタンパク質を指す。例えば、タンデム融合は、目的のタンパク質又はタンパク質ドメインが、タンパク質間のＮ末端又はＣ末端の融合を介して単純に両端で接続される技術を指す。これにより、可動性ブリッジ構造が提供され、融合パートナー間に十分なスペースが確保され、適切なフォールディングが保証される。ただし、ペプチドのＮ末端又はＣ末端は、組換えタンパク質の望ましいフォールディングパターンを取得する上で重要な成分であることが多く、ドメインの単純な両端の結合は効果がない可能性がある。或いは、ドメイン挿入のプロセスは、所望の構造を単一のポリペプチド鎖にコードすることによる連続したタンパク質ドメインの融合、及び時には別のドメイン内へのドメインの挿入を伴う。これらの前述のプロセスの両方において、ドメインは「直接的に連結（ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」又は「直接的に連結（ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ）」される。ドメイン挿入は、目的の遺伝子に適切な核酸連結部位を見つけることが難しいため、タンデム融合よりも実行が難しいことがよくある。
前述の直接連結の融合技術に加え、外部リンカーを使用して、融合タンパク質のタンパク質ドメインの機能が維持され得る。このようなリンカーは、タンパク質ドメインを別のタンパク質ドメインに接続する一連のアミノ酸を指し、本明細書では「間接リンカー」と呼ばれる。そのため、ドメインは「間接的に連結（ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」又は「間接的にリンク（ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ）」される。例えば、当業者は、その構造が２つ以上の機能的又は組織的ドメインを含むポリペプチドが、それらを互いに連結するそのようなドメイン間に一連のアミノ酸を含むことが多いことを理解している。リンカーは、ドメインの相互作用を可能にし、安定性を強化し、立体障害を減らすことができ、これにより、Ｎ末端とＣ末端を融合できる場合でも、改変タンパク質設計における使用が好ましいことが多い。いくつかの実施形態において、リンカーは、それが強固な三次元構造を採用しない傾向にあり、むしろポリペプチドに柔軟性を提供することを特徴とする。様々なタイプの天然に存在するリンカーが、改変タンパク質、例えば、多くの組換え治療用タンパク質、特に改変抗体構築物においてリンカーとして機能する免疫グロブリンヒンジ領域に使用されてきた（Ｐａｃｋ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４６：２８－３４）。天然リンカーに加えて、多数の人工リンカーが考案されており、これらは、可動性、剛性、及びインビボで切断可能なリンカーの３つのカテゴリーに細分することができる。（Ｙｕ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖａｎｃｅｓ，３３（１）：１５５－６４；Ｃｈｅｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｄ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５（１０）：１３５７－６９）。最も広く使用されている可動性リンカー配列は、（Ｇｌｙ）ｎ（Ｓａｂｏｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｙｅａｓｔ，２４：３９－４５）及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６４）（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，８５：５８７９－８３）であり、ここで、リンカー長はコピー数「ｎ」で調整できる。いくつかの実施形態において、リンカーエレメントを含むポリペプチドは、一般形態Ｄ１－リンカー－Ｄ２の全体構造を有し、ここで、Ｄ１及びＤ２は、同じ又は異なっていてもよく、リンカーによって互いに関連する２つのドメインを表す。いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるアミノ酸長である。
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基／位置の「修飾」又は「変異」は、出発アミノ酸配列と比較した一次アミノ酸配列の変化を指し、ここで、変化は、前記アミノ酸残基／位置が関与する配列変化に起因する。例えば、典型的な修飾には、残基（又は前記位置）の別のアミノ酸による置換（例えば、保存的又は非保存的置換）、前記残基／位置に隣接する１つ以上のアミノ酸の挿入、及び前記残基／位置の欠失が含まれる。アミノ酸の「置換」又はその変形は、所定の（出発）アミノ酸配列中の既存のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることを指す。一般に、且つ好ましくは、修飾は、出発（又は「野生型」）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、変異型ポリペプチドの少なくとも１つの物理生化学的活性の変化をもたらす。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、機能的に同一の多数の核酸が任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードしている。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸バリエーションは「サイレントバリエーション」であり、保存的に修飾されたバリエーションの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレントバリエーションを説明する。当業者は、核酸の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得られることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に潜在している。
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」には、アミノ酸を化学的に類似したアミノ酸で置換する結果となる、ポリペプチド配列への個々の置換、欠失、又は付加が含まれる。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で公知である。そのような保存的に修飾された変異体は、多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に追加され、それらを除外しない。次の８つの群には、相互に保存的に置換されたアミノ酸：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が含まれている（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。いくつかの実施形態において、「保存的配列修飾」という句は、本開示の改変タンパク質の結合ドメインの結合特性に有意に影響を与えないか又は変更しないアミノ酸修飾を指すために使用される。
本明細書で言及される場合、「タンパク質変異体」又は「タンパク質の変異体」は、１以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０アミノ酸が修飾されているバリエーションを含むタンパク質に関する。本明細書で言及される場合、タンパク質の「機能的変異体」は、アミノ酸配列に変化をもたらすが、タンパク質の全体的な特性又はその機能に変化がない修飾を含む、タンパク質変異体に関する。本明細書で言及される場合、タンパク質又はタンパク質のドメインの「切断型変異体」は、タンパク質又はタンパク質ドメインの短縮バージョンに関連するが、タンパク質の短縮バージョンは、親タンパク質の機能を保持している。機能的変異体又は切断型変異体が全体的な特性又は機能に変化を有しないかを決定するために、これらの変異体タンパク質を、本開示に記載されるようないくつかのアッセイにおけるそれらの効果について、全長又は未修飾の親タンパク質に対して試験することができる。例えば、ヒト内皮細胞－Ｊｕｒｋａｔ細胞エフェロサイトーシスアッセイにおける内皮細胞によるエフェロサイトーシスの促進、ヒトマクロファージ－好中球エフェロサイトーシスアッセイにおけるマクロファージによるエフェロサイトーシス障害の回復、ヒト内皮－微粒子エフェロサイトーシスアッセイにおけるクリアランスによる血漿微粒子の数の減少、及び／又は急性腎虚血モデルにおける多臓器損傷に対する保護の提供である。
本明細書で使用される場合、「治療用マルチドメイン融合タンパク質は主要な生物学的機能を維持する」という用語は、可溶化ドメインを含まない、例えば、マルチドメインタンパク質のドメイン間にＨＳＡが挿入されていない、出発（又は「野生型」）アミノ酸配列を含むマルチドメインタンパク質で観察される物理生化学的活性の少なくとも５０％を有する場合、マルチドメインタンパク質の生物学的活性を指す。本明細書で使用される場合、「治療用融合タンパク質は主要な生物学的機能を維持する」という用語は、可溶化ドメインがマルチドメインタンパク質のドメインの間に挿入されていない、出発（又は「野生型」）アミノ酸配列を含むマルチドメインタンパク質で観察される、又は出発（又は「野生型」）ドメインアミノ酸配列を含むマルチドメインタンパク質で観察される、少なくとも５０％、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の物理生化学的活性を有する場合のマルチドメインタンパク質の生物学的活性を指す。生物学的活性、例えば、物理生化学的活性は、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。
「パーセンテージ同一性」又は「パーセンテージ配列同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連して、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。比較ウィンドウ上又は指定される領域での最大の一致について比較及びアラインされる場合、例えば、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて又は手動のアライメント及び外観検査によって測定される際、２つの配列が同じアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する場合（すなわち、特定の領域にわたって、又は特定されていない場合は配列全体にわたって、少なくとも６０％の同一性、任意選択により少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）、２つの配列は「実質的に同一」であり、「配列同一性」を示す。任意選択により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）長の領域にわたって、又は１００～５００若しくは１０００、若しくは２０００若しくは３０００若しくはそれを超えるヌクレオチド長、或いは３０～２００、若しくは３００、若しくは５００、若しくは７００若しくは８００若しくは９００若しくは１０００若しくはそれを超えるアミノ酸長の領域にわたって存在する。
配列比較について、典型的に、１つの配列が参照配列としての役割を果たし、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列がコンピュータ中に入力され、部分配列の座標が指定され、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、又は代替パラメータが指定され得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べた試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」という用語は、２０～６００、通常は約５０～約２００、より通常は約１００～約１５０からなる群から選択されるいくつかの連続する核酸又はアミノ酸位置のいずれか１つのセグメントへの言及を含み、ここで、２つの配列は、最適にアラインされた後、配列を同じ数の連続した位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局地的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５：２４４４の類似性の探索方法により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のコンピュータによる実行により、又は手動のアライメント及び視覚的検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）により行われ得る。
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，．２５：３３８９－３４０２；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって公的に入手可能である。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することもでき、このアルゴリズムは、ＰＡＭ１２０残基重量表、１２のギャップ長さペナルティ及び４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（上掲）アルゴリズムを用いて決定することができ、このアルゴリズムは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５又は６の長さ重みを用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれている。
ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の兆候は、２つの分子又はそれらの補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
「核酸」という用語は、本明細書においては「ポリヌクレオチド」という用語と同義的に使用され、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。この用語は、合成、天然及び非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基又は連結を含む核酸を包含する。このような類似体の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
特に示されない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その核酸配列の保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５－２６０８；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１－９８）。本明細書で使用される場合、「最適化されたヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる出発ヌクレオチド配列によって最初にコードされたアミノ酸配列を完全に保持するように改変されている。特定の実施形態において、本明細書の最適化された配列は、ＣＨＯ哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように改変されている。
治療用融合タンパク質
可溶化ドメイン
本明細書に記載されるように、本開示の治療用融合タンパク質は、２つ以上のドメイン（マルチドメイン融合タンパク質）、例えば、インテグリン結合ドメイン及びＰＳ結合ドメインを含む。さらに、融合タンパク質はまた、融合タンパク質にいくつかの望ましい特性を付与するさらなるドメインを含む。本出願の目的のために、「可溶化ドメイン」と呼ばれるこのさらなるドメインは、溶解性の増加、凝集の減少、生物活性の増加などの生物学的特性の改善をもたらす。結果として、融合タンパク質は、望ましい薬物動態プロファイル、特に製造、貯蔵、及び治療剤としての有用性を促進する特性を示すことができる。さらに、可溶化ドメインの存在は、治療用融合タンパク質の安定性を改善し、精製後の収量の増加によって示されるように、細胞発現系における野生型タンパク質と比較して融合タンパク質の発現を改善する。
可溶化ドメインの存在はまた、治療用融合タンパク質に延長された半減期を付与し得る。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；配列番号４）又はその変異体などのアルブミンタンパク質である。例えば、凝集傾向を低下させるためのアミノ酸置換Ｃ３４Ｓを含むＨＳＡ（配列番号５）、又はＨＳＡ Ｄ３（配列番号６）などのＨＳＡのドメインである。ＨＳＡは、腎ろ過を低下させる比較的大きなサイズ、及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合特性を含むいくつかの要因により、非常に長い血清半減期を有し、細胞内分解が回避される。ポリペプチドへの融合のためのＨＳＡのＮ末端断片の使用も提案されている（例えば、欧州特許第３９９６６６号明細書）。したがって、分子をアルブミンに遺伝的又は化学的に融合又はコンジュゲートすることにより、安定化又は有効期間を延長することができ、且つ／又は溶液中、インビトロ及び／又はインビボで、分子の活性を長期間保持することができる。ＨＳＡ融合に関連するさらなる方法は、例えば、国際公開第２００１／０７７１３７号パンフレット及び国際公開第２００３／０６００７１号パンフレットに見出すことができる。
一部の例において、ＨＳＡ変異体は、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＨＳＡと同じであるか、又は実質的に同じである、望ましい医薬特性を有する（例えば、１９～２０日の血清半減期；約３００ｍｇ／ｍＬの溶解度；良好な安定性；発現の容易さ；エフェクター機能なし；低い免疫原性；及び／又は約４５ｍｇ／ｍＬの循環血清レベル）。一部の例において、可溶化ドメインとして使用されるＨＳＡは、ＨＳＡの遺伝的変異体である。一部の例において、ＨＳＡ変異体は、Ｏｔａｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２（４），５２７－５３４（２００９）に開示されている７７の変異体のいずれか１つである。特定の実施形態において、可溶化ドメインとして使用されるＨＳＡは、配列番号４のＨＳＡと比較して新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性が改善されたＨＳＡの変異バージョンである（例えば、米国特許第９，１２０，８７５号明細書；米国特許第９，０４５，５６４号明細書；米国特許第８，８２２，４１７号明細書；米国特許第８，７４８，３８０号明細書；Ｓａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５ ：６８２（２０１４）；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９（１９）：１３４９２－５０２（２０１４）；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９（１１）：７８１２－２４（２０１４）；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１（１１）：１９６６－７８（２０１３）；国際公開第２０１４／１２５０８２Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレット、国際公開第２０１１／１２４７１８号パンフレット、国際公開第２０１２／０５９４８６号パンフレット、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット；国際公開第２０１１／１０３０７６号パンフレット；及び国際公開第２０１２／１１２１８８号パンフレットを参照、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）。特定の例において、ＨＳＡ変異体はＥ５０５Ｇ／Ｖ５４７Ａ変異体である。特定の例において、ＨＳＡ変異体はＫ５７３Ｐ変異体である。ＨＳＡのＦｃＲｎに対する親和性が改善されたそのようなＨＳＡ変異体を使用して、本明細書に開示される融合タンパク質の半減期を増加させることができる。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ヒトＦｃ免疫グロブリンＧ１（Ｆｃ－ＩｇＧ１；配列番号７）などの抗体Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインはまた、例えば、ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）ベースの修飾を使用して、相補的なアミノ酸置換をＦｃのＣＨ３ドメインに導入することでＦｃのヘテロ二量体化を改善することによって修飾され得る。例えば、一方のＣＨ３ドメインに「ノブ」を作製するための置換Ｔ３６６Ｗ、及びもう一方のＣＨ３ドメインに「ホール」を作製するための置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖである（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（７）：６７７－８１；ＥＵ付番ＩｇＧ１）。単独で、又はヘテロ二量体化を改善するための修飾と組み合わせて、Ｆｃドメインに含めることができるさらなる修飾には、例えば、さらなるシステイン結合を作製するためのシステインへのアミノ酸置換、例えば、Ｓ３５４Ｃ及び／又はＹ３４９Ｃ、及びＦｃγ受容体及び補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を減少又は排除して免疫エフェクター機能を「沈黙」させるためのアミノ酸置換が含まれ得る。いわゆる「ＬＡＬＡ」二重変異（Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ、ＥＵ付番）により、エフェクター機能が低下する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：５３－９）。或いは、「ＤＡＰＡ」二重変異（Ｄ２６５ＡとＰ３２９Ａ、ＥＵ付番）により、エフェクター機能が低下する。本開示の一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃサイレンシングのためのアミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、及び／又はＫｉＨアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ノブ）又はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）を含み得る。一実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ（配列番号８）を含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｓ３５４Ｃ及びアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（Ｆｃ－ＩｇＧ１－ノブ；配列番号９）を含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ並びにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｆｃ－ＩｇＧ１－ホール；配列番号１０）を含む。
インテグリン結合ドメイン
インテグリンは、細胞－細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着を促進する膜貫通型受容体である。リガンドが結合すると、インテグリンは、細胞サイクルの調節、細胞内細胞骨格の組織化、及び細胞膜への新しい受容体の移動などの、細胞シグナルを媒介するシグナル伝達経路を活性化する（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ＆Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３０）：１０２８－３２）。インテグリンの存在は、細胞表面でのイベントへの迅速且つ柔軟な応答を可能にする。インテグリンにはいくつかのタイプがあり、１つの細胞は、その表面に複数の異なるタイプを有し得る。インテグリンは２つのサブユニット：α（アルファ）及びβ（ベータ）を有し、それぞれが原形質膜を貫通し、いくつかの細胞質ドメインを有する（Ｎｅｒｍｕｔ ＭＶ ｅｔ ａｌ（１９８８）．ＥＭＢＯ Ｊ．，７（１３）：４０９３－９）。酸性アミノ酸は、多くのＥＣＭタンパク質のインテグリン相互作用部位（例えば、アミノ酸配列アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（１文字のアミノ酸コードでは「ＲＧＤ」）の一部として）を特徴とする。ＲＧＤモチーフは、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチンなどの多くのマトリックスタンパク質に見られ、細胞接着を助ける。ＲＧＤモチーフは、ＥＧＦ様ドメインとして公知の保存されたタンパク質ドメインの多くのタンパク質に見られ、これは、最初に記述された上皮成長因子に由来する名前である。ＥＧＦ様ドメインは、細胞外タンパク質に見られる最も一般的なドメインの１つであり（Ｈｉｄａｉ Ｃ（２０１８）Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ Ｊ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．，２（２）：６７－７１）、ＲＧＤ結合モチーフを含むＥＧＦ様ドメインのいくつかの例を以下の表１に列挙する。
Figure 2022547051000001
本明細書で使用される場合、「インテグリン結合ドメイン」という用語は、インテグリンに結合する機能を有する一連のアミノ酸又はタンパク質ドメインを指す。本開示の一実施形態において、本明細書で使用される場合、「インテグリン結合ドメイン」は、インテグリンに結合し、ＲＧＤモチーフを含む機能を有する一連のアミノ酸又はタンパク質ドメインを指す。本開示の一実施形態において、インテグリン結合ドメインは、配列番号２に記載されるようなアミノ酸配列を有するヒトＭＦＧ－Ｅ８由来のＥＧＦ様ドメインである。代替的な本開示の一実施形態において、インテグリン結合ドメインは、ヒトＥＤＩＬ３由来のＥＧＦ様ドメインであり（以下の配列：配列番号１１、配列番号７７、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、又は配列番号１０１のいずれか）；例えば、ＥＧＦ様ドメインは、配列番号１１の一連のアミノ酸１～１３２内に見出すことができる。
本明細書で使用される「インテグリンに結合する」という用語は、インテグリン結合活性を指す。インテグリン結合活性は、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。例えば、インテグリン接着アッセイは、本開示の治療用融合タンパク質への蛍光標識されたαｖβ３インテグリン発現リンパ腫細胞の接着が決定された実施例、セクション３．２に記載されている。インテグリン結合ドメインは、それぞれの活性を決定するのと同じ方法で試験した場合、好ましくは実施例のセクション３．２に記載のアッセイを使用して試験した場合、それがヒトＭＦＧ－Ｅ８タンパク質（配列番号１）につき観察されたインテグリン結合活性の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％のインテグリン結合活性を有する場合、インテグリン結合活性を有すると見なされる。
ホスファチジルセリン結合ドメイン
本明細書で使用される「ホスファチジルセリン」（ＰＳ）は、細胞膜の成分であるリン脂質に関する。ＰＳは主に細胞膜の内側の小葉（ｌｅａｆｌｅｔ）に限定されているが、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンは主に外側の小葉に局在している。リン脂質の非対称分布は、原形質膜内のフリッパーゼ（ＡＴＰ１１Ａ及び１１ＣなどのＰ４－ＡＴＰａｓｅ）の作用によって維持され、ＰＳを外側の小葉から内側の小葉に活発に移動させる。ＰＳの細胞表面曝露は、アポトーシス細胞だけでなく、活性化リンパ球、活性化血小板、老化赤血球、並びに一部の癌細胞及びそれぞれの微粒子でも観察される（Ｓａｋｕｒａｇｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１１６（８）：２９０７－１２）。ＰＳ曝露は、血栓形成促進性、炎症性、又は虚血性の病態のバイオマーカーとなり得る（Ｐａｓａｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１６（６）：１１９８－２０１０；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）上掲；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）上掲。ＰＳは、多数の細胞シグナル伝達経路で機能し、凝固において必須のリン脂質として機能し、テナーゼ（第ＩＸａ、第ＶＩＩＩａ、及び第Ｘ因子）及びプロトロンビナーゼ（第Ｘａ、第Ｖａ因子、及びプロトロンビン）複合体のエンハンサー形成として機能することができる（Ｓｐｒｏｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．１３３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ５４－６）。外在化されたＰＳの最も理解されている機能は依然として、アポトーシス細胞、細胞破片、又はＰＳ曝露活性化細胞を貪食するマクロファージなどの食細胞の「イートミー」マーカーである可能性がある。本明細書で使用される場合、「ホスファチジルセリン結合ドメイン」又は「ＰＳ結合ドメイン」という用語は、ＰＳに結合する機能を有する一連のアミノ酸又はタンパク質ドメインを指す。ＰＳ結合ドメインを有する内因性タンパク質の例は、以下の表２に見出すことができる。
Figure 2022547051000002
本開示の一実施形態において、ＰＳドメインは、配列番号３に記載されるようなアミノ酸配列を有するヒトＭＦＧ－Ｅ８に由来する。本開示の代替的な実施形態において、インテグリン結合ドメインは、ヒトＥＤＩＬ３（配列番号１１）からのＰＳ結合ドメインであり、ここで、ＰＳ結合ドメインは、配列番号１１のアミノ酸１３５～４５３を含む。
ＰＳ結合活性は、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。例えば、ＰＳ結合アッセイは、実施例、セクション３．１に記載されており、ここで、マイクロタイタープレート上にコーティングされたＰＳへの本開示の融合タンパク質の結合は、ビオチン化マウスＭＦＧ－Ｅ８の結合と競合することによって評価された。本開示によれば、ＰＳ結合ドメインは、それぞれの活性を決定するのと同じ方法で試験した場合、好ましくは実施例のセクション３．１に記載のアッセイを使用して試験した場合、それが配列番号１に示されるヒトＭＦＧ－Ｅ８タンパク質につき観察されたＰＳ結合活性の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％のＰＳ結合活性を有する場合、ＰＳ結合活性を有すると見なされる。
架橋タンパク質
インテグリン結合ドメイン及びＰＳ結合ドメインの両方を含む内因性タンパク質がいくつか存在する。このような「架橋タンパク質」の例を以下の表３に示す。
Figure 2022547051000003
治療的価値があるためには、架橋タンパク質が、ＴＡＭファミリーメンバー又は他のＰＳ結合受容体で観察されたように、タンパク質分解による切断又はシェディングに対し典型的には感受性でない食細胞上のインテグリンを認識するインテグリン結合ドメインを含む場合に有用である。ＰＳ結合ドメイン及びインテグリン結合ドメインを有するタンパク質、例えばＭＦＧ－Ｅ８又はそのパラログＥＤＩＬ３／ＤＥＬ１は、インビトロでエフェロサイトーシスを誘導することが示されているため、ＡＯＩのエフェロサイトーシス誘導因子として治療的価値がある可能性がある。対照的に、例えば、ＧＡＳ６タンパク質は、食細胞上の受容体（ＭｅｒＴＫ）が上記のように炎症及び感染中にタンパク質分解的に切断されるため、ＡＯＩのエフェロサイトーシスの促進に特に効果的ではない可能性がある。
上記の表３に列挙される架橋タンパク質の一例はＭＦＧ－Ｅ８であり、これは、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）に見られる主要なタンパク質の１つである。ＭＦＧ－Ｅ８は、いくつかの異なるタイプの細胞（例えば、乳腺上皮細胞、血管細胞、精巣上体上皮細胞、大動脈平滑筋細胞、活性化マクロファージ、刺激された子宮内膜、及び未成熟樹状細胞）及び組織（例えば、心臓、肺、乳腺、脾臓、腸、肝臓、腎臓、脳、血液、及び内皮）によって発現及び分泌される。ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質は、ラクトアドヘリン、ＢＰ４７、成分１５／１６、ＭＦＧＭ、ＭＧＰ５７／５３、ＰＡＳ－６／ＰＡＳ－７糖タンパク質、細胞壁タンパク質ＳＥＤ１、精子表面タンパク質ＳＰ４７、乳房上皮抗原ＢＡ４６、及びＯ－アセチルＧＤ３ガングリオシドシンターゼ（ＡＧＳ）などの、いくつかの異なる名前でも知られている。ＭＦＧ－Ｅ８遺伝子は、ラットでは第１染色体、マウスでは第７染色体、ヒトでは第１５染色体に位置している。ＭＦＧ－Ｅ８のプレｍＲＮＡの選択的スプライシングは、ヒトタンパク質の３つのアイソフォーム及びｍＲＮＡの２つの形態をもたらし、長い変異体及び短い変異体がマウス乳腺で発現する。ヒトＭＦＧ－Ｅ８遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０８４３１）は、プロセシングされて複数のタンパク質産物を形成する３８７残基長のタンパク質をコードする。シグナルペプチド（残基１～２３；下線）、ＥＧＦ様ドメイン（残基２４～６７；斜体）、Ｃ１ドメイン（残基７０～２２５；太字）、及びＣ２ドメイン（残基２３０～３８７；太字下線）を含む、ヒトＭＦＧ－Ｅ８のアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022547051000004
ＭＦＧ－Ｅ８は、ＭＦＧＭが有する膜貫通機能を欠いているため、表在性膜タンパク質として機能する。ヒトＭＦＧ－Ｅ８は、食細胞に発現するαｖβ３及びαｖβ５インテグリンに結合する１つのＮ末端ＥＧＦ様ドメイン（配列番号２）と、陰イオン性リン脂質に高い親和性で結合する２つのＦ５／８－ディスコイジンサブドメイン（Ｃ１及びＣ２）を含むＰＳ結合ドメイン（配列番号３）とからなる。インテグリン結合は、ヒトＭＦＧ－Ｅ８（配列番号１）の残基４６～４８に位置するＲＧＤモチーフの結果である。アポトーシス細胞、細胞破片、過剰活性化細胞、及び大部分の微粒子（ＭＰ）は、ＰＳを曝露し、ＭＦＧ－Ｅ８の標的であり、架橋分子として作用し、これらの細胞及び微粒子をオプソニン化し、食細胞上のαｖβ３及びαｖβ５インテグリンに連結する。この架橋作用は、細胞、破片、微粒子の内部移行につながる効率的な貪食プログラムをトリガーする。ＭＦＧＭに見られるタンパク質は、種全体で高度に保存されている。ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質の構造は種によって異なり、現在公知の全ての種には２つのＣドメインが含まれているが、ＥＧＦ様ドメインの数が異なる。例えば、ヒトＭＦＧ－Ｅ８タンパク質は１つのＥＧＦ様ドメインを含む一方、ウシＭＦＧ－Ｅ８及びマウスＭＦＧ－Ｅ８（配列番号６８）は２つのＥＧＦ様ドメインを有し、ニワトリ、カエル、及びゼブラフィッシュは３つのＥＧＦ様ドメインを有する。ＭＦＧ－Ｅ８のドメインは、治療薬の構成要素として以前に提案されており、特にＰＳ結合ドメイン（Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，１０（５）：２４１３－２４２６）及びＭＦＧ－Ｅ８の断片は、線維症のモデルで作用すると記載されている（米国特許出願公開第２０１８／０３３４４８６号明細書）。
プロフェッショナル及びノンプロフェッショナル食細胞による死滅細胞、破片、及び微粒子の非炎症性取り込みは、組織損傷後の恒常性において重要な役割を果たす（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ－Ｗａｃｋｅｒ（２０１６）上掲）。適切なクリアランスの重要性は、ＭＦＧ－Ｅ８ノックアウトマウスが、例えば、組織内の（クリアされていない）死滅細胞の数の増加、新生児敗血症、自己免疫、血管新生不良、創傷治癒障害などの疾患モデルにおける炎症反応の悪化を示した遺伝子モデルでさらに明らかになった（Ｈａｎａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０４（５４７４）：１１４７－５０；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９６（１２）：５０８９－５１００；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｓｕｒｇ．，５２（９）：１５２０－７）。
さらに、ＭＦＧ－Ｅ８は、制御性Ｔ細胞サブセット（Ｔｒｅｇ）を増加させながら、Ｔ細胞の活性化及び増殖の抑制、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７亜集団の阻害によって、免疫寛容原性環境を生成することが示されている。興味深いことに、Ｔｒｅｇは、マクロファージによるエフェロサイトーシスを誘発することにより、炎症の解消に貢献する（（Ｐｒｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４９（４）：６６６－７７）。ＭＦＧ－Ｅ８は、ＭＨＣバリアを越えた胚性幹細胞由来組織の同種異系生着を促進することが報告されている（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，５（５）：７４１－７５２）。ＭＦＧ－Ｅ８には複数の栄養用途もあり、これは組織の発達を促進し、感染性病原体から保護するのに役立つ。ＭＦＧ－Ｅ８などの糖タンパク質は、食品及び医薬品用途向けの潜在的な健康増進栄養補助食品である。ＭＦＧ－Ｅ８は、他の栄養素（例えば、プロバイオティクス、ホエイプロテインミセル、α－ヒドロキシイソカプロン酸、シトルリン、及び分岐鎖脂肪酸）と組み合わせることもできる。
その他の可溶化ドメイン
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ヒトＦｃ免疫グロブリンＧ１（Ｆｃ－ＩｇＧ１；配列番号７）などの抗体Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインはまた、例えば、ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）ベースの修飾を使用して、相補的なアミノ酸置換をＦｃのＣＨ３ドメインに導入することでＦｃのヘテロ二量体化を改善することによって修飾され得る。例えば、一方のＣＨ３ドメインに「ノブ」を作製するための置換Ｔ３６６Ｗ、及びもう一方のＣＨ３ドメインに「ホール」を作製するための置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖである（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（７）：６７７－８１；ＥＵ付番ＩｇＧ１）。単独で、又はヘテロ二量体化を改善するための修飾と組み合わせて、Ｆｃドメインに含めることができるさらなる修飾には、例えば、さらなるシステイン結合を作製するためのシステインへのアミノ酸置換、例えば、Ｓ３５４Ｃ及び／又はＹ３４９Ｃ、及びＦｃγ受容体及び補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を減少又は排除して免疫エフェクター機能を「沈黙」させるためのアミノ酸置換が含まれ得る。いわゆる「ＬＡＬＡ」二重変異（Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ、ＥＵ付番）により、エフェクター機能が低下する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：５３－９）。或いは、「ＤＡＰＡ」二重変異（Ｄ２６５ＡとＰ３２９Ａ、ＥＵ付番）により、エフェクター機能が低下する。本開示の一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃサイレンシングのためのアミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、及び／又はＫｉＨアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ノブ）又はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）を含み得る。一実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ（配列番号８）を含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｓ３５４Ｃ及びアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（Ｆｃ－ＩｇＧ１－ノブ；配列番号９）を含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ並びにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｆｃ－ＩｇＧ１－ホール；配列番号１０）を含む。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する抗体Ｆｃドメインを含む。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ＳＵＭＯ（小ユビキチン様修飾因子）、ユビキチン、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）、又はそれらの変異体を含む。
治療用融合タンパク質のドメインの連結及び配向
本開示の融合タンパク質のインテグリン結合ドメイン、ＰＳ結合ドメイン及び可溶化ドメインは連結されている。本明細書で使用される場合、「連結された」又は「連結している」という用語は、融合タンパク質の別のドメインに直接的又は間接的に結合している融合タンパク質の１つのドメインを指す。直接結合は連結の一形態であり、本明細書では「融合された」又は「融合」と呼ばれる。例として、Ａ－Ｂ－Ｃの形式を有する分子を使用する：ドメインＡはドメインＢに直接連結され、ドメインＣに直接連結されている。その場合、ドメインＡは、ドメインＣに融合されたドメインＢに融合されていると説明することもできる。別の例として、ドメインＡはドメインＢに直接連結され、ドメインＣに間接的に連結されている。その場合、ドメインＡは、内部リンカーによってドメインＣに間接的に連結されているドメインＢに融合されていると説明することもできる。
いくつかの実施形態において、連結は直接連結であり、したがって、ドメインは互いに融合している。いくつかの実施形態において、インテグリン結合ドメインは、可溶化ドメインに融合されているＰＳ結合ドメインに融合される。具体的には、ＰＳ結合ドメイン（例えば、Ｃ１－Ｃ２ディスコイジンサブドメイン）は、インテグリン結合ドメイン（例えば、ＥＧＦ様ドメイン）のＣ末端に融合され、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ）のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、ＰＳ結合ドメインに融合されているインテグリン結合ドメインに融合される。具体的には、インテグリン結合ドメイン（例えば、ＥＧＦ様ドメイン）は、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ）のＣ末端に融合され、ＰＳ結合ドメイン（例えば、Ｃ１－Ｃ２ディスコイジンサブドメイン）のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、インテグリン結合ドメインは、Ｃ１－Ｃ２ディスコイジンサブドメインを含むＰＳ結合ドメインに融合され、可溶化ドメインは、Ｃ１－Ｃ２ディスコイジンサブドメインの間に挿入される。具体的には、インテグリン結合ドメイン（例えば、ＥＧＦ様ドメイン）のＣ末端は、Ｃ１ディスコイジンサブドメインのＮ末端に融合され、Ｃ１ディスコイジンサブドメインのＣ末端は、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ）のＮ末端に融合され、可溶化ドメインのＣ末端は、Ｃ２ディスコイジンサブドメインのＮ末端に融合される。別の実施形態において、インテグリン結合ドメインは、ＰＳ結合ドメインに融合されている可溶化ドメインに融合される。具体的には、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ）は、インテグリン結合ドメイン（例えば、ＥＧＦ様ドメイン）のＣ末端及びＰＳ結合ドメイン（例えば、Ｃ１－Ｃ２ディスコイジンサブドメイン）のＮ末端に融合される。一実施形態において、ＨＳＡは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端に融合され、Ｃ１ディスコイジンドメインのＮ末端に融合される。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ）は、インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインとの間に融合される。いくつかの実施形態において、インテグリン結合ドメインは、融合タンパク質のＮ末端に位置し、ＰＳ結合ドメインは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、インテグリン結合ドメイン、例えば、ＥＧＦ様ドメインを含有する、第１の領域、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ又はＦｃ）を含有する、第２の領域、及びＰＳ結合ドメイン、例えば、Ｃ１及び／又はＣ２ディスコイジンドメインを含有する、第３の領域を含む。いくつかの実施形態において、インテグリン結合ドメインは、融合タンパク質のＮ末端に位置し、ＰＳ結合ドメインは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメイン（例えば、ＨＳＡ又はＦｃ）は、ＨＳＡである。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインはＨＳＡ、又はその機能的変異体である。
いくつかの実施形態において、可溶化ドメインは、抗体Ｆｃ－免疫グロブリンＧ１（Ｆｃ－ＩｇＧ１；配列番号７）である。
好ましい実施形態において、配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＨＳＡは、ＭＦＧ－Ｅ８のＥＧＦ様ドメインのＣ末端に融合され、ＭＦＧ－Ｅ８のＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４６（ＦＰ０６８）に記載されるようなアミノ酸配列を含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４８（ＦＰ７７６）に記載されるようなアミノ酸配列を含む。
代替的な実施形態において、配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＨＳＡは、ＥＤＩＬ３のＥＧＦ様ドメインのＣ末端に融合され、ＥＤＩＬ３のＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７０（ＦＰ１０６８）に記載されるようなアミノ酸配列を含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号６９（ＦＰ１７７６）に記載されるようなアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、連結はポリペプチドリンカーを介したものであり、例えば、本開示の融合タンパク質において可溶化ドメインをＰＳ結合ドメインに結合するポリペプチドリンカーは、「外部リンカー」と呼ばれる。これらの外部リンカーは、典型的には、グリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）を含み、グリシン及びロイシン（ＧＬ）又はグリシン及びバリン（ＧＬ）を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、複数のＧ及びＳ残基、例えば、Ｇ２Ｓ、及び配列番号６２に示される（Ｇ２Ｓ）４などのその複数、配列番号６３に示される（ＧＳ）４、配列番号６４に記載されているＧ４Ｓ又は配列番号６５に記載されている（Ｇ４Ｓ）２を含む。
いくつかの実施形態において、外部リンカーは、インテグリン結合ドメインのＣ末端と可溶化ドメインのＮ末端との間に融合される。具体的には、外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、外部リンカーは、可溶化ドメインのＣ末端とＰＳ結合ドメインのＮ末端との間に融合される。具体的には、外部リンカーは、ＨＳＡのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、外部リンカーは、インテグリン結合ドメインのＣ末端と可溶化ドメインのＮ末端との間に融合され、さらなる外部リンカーは、可溶化ドメインのＣ末端とＰＳ結合ドメインのＮ末端との間に融合される。具体的には、外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合され、さらなる外部リンカーは、ＨＳＡのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。
いくつかの実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、インテグリン結合ドメインのＣ末端及び可溶化ドメインのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、ＧＬを含む外部リンカーは、可溶化ドメインのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、（Ｇ２Ｓ）４（配列番号６２）を含む外部リンカーは、可溶化ドメインのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、Ｇ４Ｓ（配列番号６４）を含む外部リンカーは、可溶化ドメインのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６５）を含む外部リンカーは、可溶化ドメインのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。
一実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合される。この構造を含む本開示の融合タンパク質は、配列番号４２（ＦＰ３３０）に記載のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合され、（ＧＳ）４（配列番号６３）を含むさらなる外部リンカーは、ＨＳＡのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。
一実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合され、（Ｇ２Ｓ）４（配列番号６２）を含むさらなる外部リンカーは、ＨＳＡのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。この構造を含む本開示の融合タンパク質は、配列番号４２（ＦＰ３３０）に記載のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合される。ＨＳＡのＣ末端は、ＰＳ結合ドメインのＮ末端に直接融合される。
一実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合され、Ｇ４Ｓ（配列番号６４）を含むさらなる外部リンカーは、ＨＳＡのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。この構造を含む本開示の融合タンパク質は、配列番号５４（ＦＰ８１１）に記載のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、ＧＳを含む外部リンカーは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端及びＨＳＡのＮ末端に融合され、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６５）を含むさらなる外部リンカーは、ＨＳＡのＣ末端及びＰＳ結合ドメインのＮ末端に融合される。この構造を含む本開示の融合タンパク質は、配列番号５６（ＦＰ０１０）に記載のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、Ｈｉｓタグは、ＰＳ結合ドメインのＣ末端に融合されるＧＳ（ＧＳ－６ｘＨｉｓ；配列番号６６）を含む外部リンカーに融合される。一実施形態において、Ｈｉｓタグを含む本開示の融合タンパク質は、配列番号４４（ＦＰ２７８）又は配列番号６０（ＦＰ１１４又はＦＰ２６０）に記載のアミノ酸配列を有する。
治療用融合タンパク質の機能特性
本開示は、ヒトＭＦＧ－Ｅ８に由来し、エフェロサイトーシスを促進するのに効果的であり、したがって、全身性炎症及び微小血管病変の主要なドライバーを排除するのに活性である融合タンパク質を提供する。実施例に記載されているように、一般構造ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２を有する融合タンパク質は、いくつかのエフェロサイトーシスアッセイにおいて有効であることが示されている。例えば、融合タンパク質は、マクロファージのリポ多糖（ＬＰＳ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）障害性エフェロサイトーシスを回復し、内皮細胞による微粒子及び死滅細胞のエフェロサイトーシスを促進するのに効果的である。融合タンパク質はまた、急性腎障害のマウスモデルにおいて、腎機能を保護し、体重減少から保護するのに効果的である。
例示的なタンパク質配列
表４のアミノ酸配列は、本開示の治療用融合タンパク質及びその一部の例を含む。
本出願の本文全体を通して、本明細書の本文（例えば、表４）と配列表との間に相違があった場合、本明細書の本文が優先されるものとする。
Figure 2022547051000005
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Figure 2022547051000056
Figure 2022547051000057
Figure 2022547051000058
本出願はまた、配列番号６９、７０及び７２のそれぞれの変異体を含み、そこに含まれるＥＤＩＬ３配列のＥＧＦ様ドメインは、以下の配列：配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、又は配列番号１０１のいずれか１つに対応する。
本出願はまた、ＭＦＧＥ８又はＥＤＩＬ３のインテグリン結合ドメイン、及びＴＩＭ４のＩｇＳＦ Ｖドメインの切断型変異体又は架橋タンパク質ＧＡＳ６変異体のＧＬＡドメインの切断型変異体などの切断型ＰＳ結合ドメインを含む、治療用融合タンパク質を含む。
本発明の開示のタンパク質の修飾
本出願は、本明細書に記載のタンパク質の変異体及び／又はドメインに様々な修飾を有するその断片、並びに開示された分子の融合体及びコンジュゲートを含む。例えば、治療用融合タンパク質のドメインは、アミノ酸残基の保存的修飾を有し得、ここで、修飾されたタンパク質は、親ドメインを含む融合タンパク質と比較して、増強された特性を保持又は有する。或いは、治療用融合タンパク質のドメインは、アミノ酸残基の欠失を有し得、ここで、修飾された融合タンパク質は、親ドメインを含むタンパク質と比較して、増強された特性を保持又は有する。或いは、治療用融合タンパク質は、アミノ酸残基の挿入物を有し得、ここで、修飾されたタンパク質は、修飾されていないタンパク質と比較して、増強された特性を保持又は有する。一実施形態において、そのようなアミノ酸挿入は、親タンパク質のドメイン間のリンカーとして機能するために、いくつかの組み合わせでグリシン又はセリン残基を含む。
部位指向性変異誘発又はＰＣＲ媒介性変異誘発を実施して変異を導入することができ、インテグリン及び／又はＰＳ結合に対する効果、又は目的の他の機能特性を、インビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。（上記のような）保存的修飾を導入することができ、且つ／又は突然変異はアミノ酸の置換、付加又は欠失であり得る。さらに、典型的には、結合ドメイン内の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以下の残基が変更される。
未修飾の変異体と本質的に同様の特性を有する治療用融合タンパク質のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をコードＤＮＡに導入することによって、又は所望の変異体の合成によって、調製することができる。そのような変異体には、例えば、現在の分子のアミノ酸配列内の残基からの欠失、又は残基の挿入若しくは置換が含まれる。いくつかの実施形態において、変異体は、さらなるリンカー配列、減少したリンカー配列又はリンカー配列の除去、及び／又はアミノ酸変異又は１つ以上のアミノ酸の置換及び欠失を含み得る。最終構築物が所望の特性を有するという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが行われて、最終構築物に到達する。アミノ酸の変化はまた、可能なグリコシル化部位の数又は位置の変化など、分子の翻訳後プロセスを変化させ得る。
組換え分子の産生方法
核酸及び発現系
一実施形態において、本出願は、治療用融合タンパク質の１つ以上のポリペプチド鎖を組換え的に産生する方法を提供し、これは、１）多重特異性結合分子のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む１つ以上のＤＮＡ構築物を産生すること；２）前記ＤＮＡ構築物を１つ以上の発現ベクターに導入すること；３）１つ以上の宿主細胞において前記発現ベクターを共トランスフェクトすること；及び４）宿主細胞中又は溶液中で分子を発現及び組み立てることを含む。
この点に関して、本開示は、本明細書に記載の治療用融合タンパク質をコードする、単離された核酸、例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補配列が含まれる。本発明の核酸分子は、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子、並びにそれらの断片の組み合わせを含む。本発明の核酸はヒト源に由来するが、本発明は非ヒト種に由来するものを含む。
「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接する遺伝子配列から分離された核酸である。例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドなどの、テンプレートから酵素的に又は化学的に合成された核酸の場合、そのようなプロセスから生じる核酸は、単離された核酸であることが理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の、又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を指す。１つの好ましい実施形態において、核酸は、内因性物質の汚染を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、標準的な生化学的方法によるその構成ヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡに由来する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されるものなど）。そのような配列は、好ましくは、真核生物の遺伝子に典型的に存在する内部の非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在する可能性があり、コード領域の操作又は発現に干渉しない。
本発明はまた、プラスミド、発現ベクター、転写又は発現カセットの形態の発現系及び構築物を提供し、これらは、上記のように少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は、そのような発現系又は構築物を含む宿主細胞を提供する。
一実施形態において、本開示は、（ａ）融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップであって、培養された宿主細胞が融合タンパク質を発現するステップ；及び（ｂ）宿主細胞培養物から融合タンパク質を回収するステップを含む治療用融合タンパク質を調製する方法を提供する。
上記の治療用融合タンパク質を産生するための発現ベクター及び宿主細胞もまた、本開示において提供される。「ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに適しており、それに作動可能に連結された１つ以上の異種コード領域の発現を指示及び／又は制御する（宿主細胞と関連して）核酸配列を含む、任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。様々な発現ベクターを使用して、分子の鎖又は結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルス性及び非ウイルス性の両方の発現ベクターを使用して、哺乳動物宿主細胞において治療用融合タンパク質を産生することができる。非ウイルス性のベクター及び系としては、典型的には、タンパク質又はＲＮＡを発現させるための発現カセットを有するプラスミド、エピソームベクター、及びヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：３４５を参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルス性ベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ及びＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、並びに他のタンパク質を発現するための、当技術分野において知られる多数のその他のベクターが挙げられる。有用なウイルス性ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターが挙げられる。Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）上掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３を参照されたい。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることになる目的の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、治療用融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター及び他の制御配列（例えば、エンハンサー）を含有する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下以外での挿入された配列の発現を妨げる。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター又は熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物を、発現産物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列のために集団を偏らせない非誘導条件下で増やすことができる。プロモーターに加えて、他の制御エレメントもまた、治療用融合タンパク質の効率的な発現のために必要となるか又は要求される場合がある。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列を含む。加えて、発現効率は、使用される細胞系に適したエンハンサーを含めることによって高められ得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５；及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３ ：５１６を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させてもよい。
発現ベクターはまた、上記の結合ドメイン及び／又は可溶化ドメインの配列を挿入することによってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供し得る。より多くの場合、挿入された配列は、ベクター中に包含される前にシグナル配列に連結される。融合タンパク質としての結合ドメイン及び可溶化ドメインの発現を可能にするベクターは、それにより、インタクトな改変タンパク質の産生をもたらす。適切な条件下で培養された場合、宿主細胞は、その後培地から回収され得るか（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合）、又はそれを産生する宿主細胞から直接回収され得る（分泌されない場合）、改変タンパク質を発現するために使用され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）に望ましい又は必要なポリペプチド修飾、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの様々な要因に依存する。宿主細胞は、真核生物又は原核生物であり得る。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野で公知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含むが、これに限定されず、当技術分野で公知の発現系で使用される任意の細胞株を使用して、本発明の組換え融合タンパク質を作製することができる。一般に、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。使用され得る宿主細胞の中には、原核生物、酵母又は高等真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が含まれる。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＣＯＳ－７細胞、Ｌ細胞、Ｃｌ２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はそれらの誘導体及び無血清培地で成長する関連細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞株、ＣＶ－１ ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡ又はＭＳＲ２９３などのヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、その他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織、初代外植片のインビトロ培養に由来する細胞株、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。任意選択により、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３又はＳ４９などの哺乳動物細胞株は、様々なシグナル伝達又はレポーターアッセイでポリペプチドを使用することが望ましい場合、ポリペプチドの発現に使用することができる。或いは、酵母などの下等真核生物又は細菌などの原核生物でポリペプチドを産生することが可能である。適切な酵母には、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、又は異種ポリペプチドを発現することができる任意の酵母株が含まれる。適切な細菌株には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は異種ポリペプチドを発現することができる任意の細菌株が含まれる。融合タンパク質が酵母又は細菌で作製される場合、機能的産物を得るために、例えば適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によって、そこで産生される産物を修飾することが望ましい場合がある。このような共有結合は、公知の化学的又は酵素的方法を使用して達成することができる。
目的のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは、一般的に原核生物の細胞に対して利用される一方で、他の細胞宿主に対してはリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが使用され得る。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合、ＤＮＡの薬剤促進性取り込み、及びエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期にわたる高収率産生のためには、安定的な発現が所望されることが多い。例えば、改変タンパク質を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点又は内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含有する本開示の発現ベクターを用いて作製され得る。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１～２日間増殖させた後、それらは選択培地に切り替えられ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在が、選択培地中で導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖を可能にする。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖され得る。
融合タンパク質は、典型的には、分泌されたポリペプチドとして培地から回収されるが、分泌シグナルなしで直接的に産生された場合、宿主細胞溶解物から回収されることもある。ポリペプチドが膜に結合している場合、適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）を使用して膜から放出できる。
融合タンパク質がヒト由来のもの以外の組換え細胞で産生される場合、それはヒト由来のタンパク質又はポリペプチドを完全に含まない。ただし、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから融合タンパク質を精製する必要がある。第１のステップとして、培地又は溶解液を通常遠心分離して粒子状の細胞破片を除去する。産生された分子は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの、タンパク質精製のための他の技術も利用可能である。
特定の態様において、本発明の治療用融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶに由来する。特定のいくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、治療用融合タンパク質が発現される対象、例えば、ヒトに投与され、本明細書に列挙されるような疾患の処置及び／又は予防のために使用され得る。
医薬組成物
別の態様において、本開示は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、本発明の治療用融合タンパク質を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本開示の（例えば、２つ以上の異なる）治療用融合タンパク質の１つ又は組み合わせを含み得る。
本明細書に記載の医薬組成物はまた、組み合わせ療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、組み合わせ療法は、例えば、少なくとも１つの抗炎症剤、抗感染剤又は免疫抑制剤と組み合わされた本開示の融合タンパク質を含み得る。組み合わせ療法で使用することができる治療剤の例は、本開示の治療用融合タンパク質の使用に関するセクションで、以下により詳細に記載されている。
本開示の融合タンパク質を含む医薬又は滅菌組成物を調製するために、融合タンパク質は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合される。
「薬学的に許容される」という句は、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されたか、又は動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの有効成分（例えば、改変タンパク質）と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体との混合物を指す。
「薬剤」とは、医学的処置に使用される物質を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性のある全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している必要がある。一実施形態において、担体は皮下経路に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち融合タンパク質は、化合物を不活性化し得る酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護する材料でコーティングされ得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。本明細書に記載の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、塩酸システイン、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。
本明細書に記載の医薬組成物に使用され得る適切な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散の場合に必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含み得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順、及び様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって、確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な剤形の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
薬学的に許容される担体には、無菌の注射用液又は分散液の即時調製のための無菌の水溶液又は分散液及び無菌の粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
治療用組成物は、典型的には、製造及び保管の条件下で無菌且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の規則構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する、溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合に必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。
安定なタンパク質製剤の開発に関するレビューは、Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０（４）：３０７－３７７及びＷｅｉ Ｗ（１９９９）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１８５：１２９－８８に見出され得る。
皮内又は皮下投与に使用される溶液又は懸濁液には、典型的に、以下の成分の１つ以上が含まれる：注射用水、食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整できる。そのような製剤は、ガラス又はプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ、又は複数用量バイアルに封入され得る。
無菌注射液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒に組み込んだ後、無菌精密ろ過することによって調製することができる。一般に、分散液は、本発明の融合タンパク質を、基本的な分散媒及び上に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、有効成分加えて、以前に無菌濾過された溶液から任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される対象、及び特定の投与様式に応じて変化するであろう。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．０１パーセント～約９９パーセントの有効成分、約０．１パーセント～約７０パーセント、又は約１パーセント～約３０パーセントの、薬学的に許容される担体と組み合わせた有効成分の範囲である。
治療用改変タンパク質のための投与計画の選択は、実体の血清又は組織代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性、及び生体マトリックス中の標的細胞の到達性を含むいくつかの要因に依存する。特定の実施形態では、投与計画は、許容できる副作用レベルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大にする。したがって、送達されるタンパク質の量は、一つには、特定の実体及び治療される病態の重症度に依存する。生物学的分子及び小分子の適切な用量を選択するための指針が利用可能である（例えば、Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７３；Ｓｌａｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９；Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２；Ｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２を参照）。
適切な用量の決定は、例えば、治療に影響を与えることが当技術分野において知られている若しくは疑われているか又は治療に影響を与えることが予測されるパラメータ又は要因を用いて、臨床医によってなされる。一般に、投与は、至適用量よりいくらか少ない量から開始し、その後、負の副作用と比べて所望の又は最適な効果が得られるまで少しずつ増加される。重要な診断尺度は、例えば、炎症の症状の尺度又は産生される炎症性サイトカインのレベルを含む。
本開示の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルを、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化させてもよい。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物の活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される治療、他の薬物、化合物及び／若しくは材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び過去の病歴、並びに医療技術分野において公知の要素のようなものを含む種々の薬物動態要因に依存することになる。
投与計画は、最適な望ましい応答を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割された用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、処置される対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個人の感受性の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、直接的に依存する。
治療用融合タンパク質の投与について、投与量は、宿主体重の約０．０００１～１５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、５、１５、及び５０ｍｇ／ｋｇの皮下投与、より通常では０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示的な処置計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３ヶ月に１回、又は３～６ヶ月に１回の投与を伴う。
本発明の治療用融合タンパク質は、複数回投与することができる。単回投与の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月ごと、又は毎年とすることができる。患者の改変タンパク質の血中濃度を測定することで示されるように、間隔も不規則であり得る。いくつかの方法では、投与量は、約１～１０００μｇ／ｍｌの血漿タンパク質濃度を達成するように調整され、いくつかの方法では、約２５～３００μｇ／ｍｌの血漿タンパク質濃度を達成するように調整される。
或いは、治療用融合タンパク質は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者のタンパク質の半減期によって異なり、処置が予防的か治療的かによって異なり得る。予防的用途では、比較的低用量が長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者は、一生処置を受け続ける可能性がある。治療用途では、状態又は疾患の進行が軽減又は終了するまで、或いは患者が状態又は疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が必要になる場合がある。その後、患者は予防投与計画を受けることができる。
本発明の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルを、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化させてもよい。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物の活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される治療、他の薬物、化合物及び／若しくは材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び過去の病歴、並びに医療技術分野において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態要因に依存することになる。
本発明の融合タンパク質の「治療有効投与量」は、状態又は症状又は疾患の重症度の低下、及び／又は状態による機能障害又は能力障害の予防を生じ得る。
本開示の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法の１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に応じて変化する。本発明の改変タンパク質の投与の経路としては、例えば、注射又は注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の一般的な投与経路が挙げられる。本明細書で使用される場合、「非経口投与」という語句は、通常、注射による腸内及び局所投与以外の投与方法を意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。
或いは、本発明の治療用融合タンパク質は、局所、表皮、又は粘膜投与経路などの非経口経路によって投与することができる。
本開示の治療用融合タンパク質は、移植片、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、急速放出からタンパク質を保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、特許を取得しているか、又は一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
特定の実施形態において、本発明の治療用融合タンパク質は、インビボで適切な分布を確実にするように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を除外する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを越えることを確実にするために（必要に応じて）、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；及び同第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は器官中に選択的に輸送されて、それにより標的化された薬物送達を促進する１つ以上の部分を含み得る（例えば、Ｒａｎａｄｅ ＶＶ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２９：６８５を参照）。
本発明の治療用途及び方法
本発明の治療用融合タンパク質は、インビトロ及びインビボの診断及び治療用途を有する。例えば、これらの分子は、培養中の細胞に、例えばインビトロで、又は対象に、例えばインビボで、投与して、様々な障害を処置、予防又は診断することができる。方法は、急性又は慢性の炎症性及び免疫系に起因する臓器及び微小血管障害を処置、予防、又は診断するのに特に適している。
本発明の治療用融合タンパク質は、限定はされないが、死滅細胞、細胞断片、及び血栓形成促進性／炎症性微粒子を除去するための内因性恒常性クリアランスメカニズム又はエフェロサイトーシス経路が大幅にダウンレギュレーションされている場合の、急性及び慢性の炎症性臓器損傷、特に炎症性損傷の処置、予防、又は改善に有用である。急性炎症性臓器損傷の例には、心筋梗塞、急性腎障害（ＡＫＩ）、急性脳卒中及び炎症、並びに胃腸管、肝臓、脾臓、肺、腎臓、膵臓、心臓の虚血／再灌流、脳、脊髄及び／又は押しつぶされた手足などの虚血／再灌流に起因する臓器損傷が挙げられる。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、血液凝固の阻害又は遅延、マイクロバイオーム処置、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、脂肪酸の取り込み及び／又は胃の運動性の低下、微小血栓依存性障害、アテローム性動脈硬化症、心臓リモデリング、組織線維症、急性肝障害、慢性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、血管疾患、加齢性血管障害、腸疾患、敗血症、骨障害、癌、サラセミア、膵臓炎、肝炎、心内膜炎、肺炎、急性肺損傷、変形性関節症、歯周炎、組織外傷誘発性炎症、大腸炎、糖尿病、出血性ショック、移植片拒絶、放射線誘発性損傷、脾腫、敗血症誘発性ＡＫＩ又は多臓器不全、急性火傷、成人呼吸窮迫症候群、創傷治癒、腱修復及び神経疾患の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
一実施形態において、神経学的疾患は、疾病症候群、悪心、受動的回避、行動敏捷性の抑制、記憶障害及び記憶機能障害などの症状を含む、神経精神医学的、神経炎症性及び／又は神経変性成分を有する状態から選択され得る。神経疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病などのアミロイドベータ関連の神経疾患が含まれる。
一実施形態において、骨障害は、骨粗鬆症、骨軟化症、骨硬化症及び大理石骨病を含む状態から選択され得る。より具体的には、本開示の融合タンパク質の投与は、ＮＦＡＴｃ１、カテプシンＫ及びαｖβ３インテグリンなどの少なくとも１つの破骨細胞マーカーの発現を阻害し得る。一実施形態において、投与は破骨細胞形成を阻害する。別の実施形態において、投与は、ＲＡＮＫＬ誘導性破骨細胞形成を阻害する。さらに別の実施形態において、投与は骨吸収を阻害する。さらに別の実施形態において、投与は、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＭＭＰ－９、Ｐｔｇｓ２、ＲＡＮＫＬ、Ｔｎｆｓｆ１１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、及びそれらの組み合わせを含む骨吸収刺激剤などの少なくとも１つの骨吸収刺激剤の発現を阻害する。別の実施形態において、投与は、ＩＬ－８及びＣＣＬ２／ＭＣＰ－１からなる群から選択される少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの発現を阻害する。
一実施形態において、組織線維症は、本発明の融合タンパク質がコラーゲン発現を低下させる、肝臓、肺、横隔膜、腎臓、脳、心臓における線維症であり得る。一実施形態において、肺線維症は、間質性肺線維症（ＩＰＦ）である。一実施形態において、肝線維症は肝硬変であり、これは、ＮＡＳＨに起因する場合もしない場合もある。
複数の呼吸器疾患は、アポトーシス細胞の蓄積を特徴とする。さらに、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）におけるマクロファージによる欠陥のあるエフェロサイトーシス及び食作用は、悪化及び重症度に関連している。本開示の治療用融合タンパク質はまた、急性呼吸窮迫症候群、又はＣＯＰＤなどの呼吸器疾患の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。本開示の治療用融合タンパク質はまた、急性肺損傷（ＡＬＩ）、例えば、有毒な外因性又は内因性の化合物又は薬物の吸入又は吸引によって誘発される肺損傷；肺水腫、ショック、膵炎、火傷、胸部外傷又は多発性外傷、放射線、敗血症、病原体（細菌、ウイルス、又はマラリア原虫などの寄生虫）によって引き起こされる肺損傷；低酸素血症につながる慢性呼吸不全の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、Ｃｏｒｏｎａ型のウイルス、例えば、ＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＭＥＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされる肺損傷の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。一実施形態において、本開示の治療用融合タンパク質は、ＣＯＶＩＤ１９患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の処置における使用のために提供される。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、輸血関連肺不全（ＴＲＡＬＩ）の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、低酸素血症につながる慢性呼吸不全の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質、例えば、本開示のＥＤＩＬ３のドメインを含む治療用融合タンパク質は、術後の腹膜癒着の重症度の診断、処置、予防、又は改善にも有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、心不全の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、血液透析の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、移植片機能の遅延又は移植片対宿主病の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、重度の凍傷、塹壕足炎、壊疽性膿皮症／壊疽の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、細菌、真菌、ウイルス又は寄生虫によって誘発される病状（例えば、敗血症、又は壊死性軟部組織感染症（壊死性筋膜炎などのＮＳＴＩ）、骨髄炎、マラリアなどの病原体によって直接誘発される他の病状）の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、労働事故、転倒、交通事故、弾道及び戦闘による傷害、などの傷害を引き起こす事故又はその他の傷害メカニズムによって引き起こされる外傷／多発外傷の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質はまた、破骨細胞媒介性病理の重症度の診断、処置、予防、又は改善に有用であり得る。
本開示の治療用融合タンパク質は、唯一の有効成分として、又は組み合わせて、例えば、他の薬剤（例えば、免疫抑制剤又は免疫調節剤又は他の抗炎症剤又は例えば細胞毒性又は抗癌剤）の補助剤として、又はそれと組み合わせて、例えば上記の疾患の処置又は予防のために投与され得る。
さらなる治療剤に関し、「組み合わせて」投与されるとは、２つ（以上）の異なる治療薬が、対象が疾患に罹患する過程において対象に送達されること、例えば２つ以上の治療薬が、対象が疾患と診断された後及び疾患が治癒若しくは取り除かれる前又は治療が他の理由で停止される前に送達されることを意味する。ある実施形態において、投与に関して重複があるように、１つの治療薬の送達は、第２の治療薬の送達が開始したときに依然として行われている。これは、本明細書において「同時の」又は「同時の送達」と呼ばれることがある。他の実施形態において、１つの治療薬の送達は、他の治療薬の送達が開始する前に終了する。いずれの場合もある実施形態において、治療薬は、組み合わせ投与により、より有効である。例えば、第２の治療薬は、より有効であり、例えば同等の効果がより少ない第２の治療薬で見られるか、又は第２の治療薬は、第２の治療薬が第１の治療薬なしで投与される場合に見られる、より大きい程度に症状を軽減するか、又は類似の状況が第１の治療薬で見られる。ある実施形態において、送達は、症状の軽減又は疾患に関連する他のパラメータが、他の治療薬なしで送達される１つの治療薬により観察されるより大きくなるようなものである。２つの治療薬の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、又は相加的以上であり得る。送達は、送達される第１の治療薬の効果が、第２の治療薬が送達されるときに依然として検出可能であるようなものであり得る。
「同時に」という用語は、ちょうど同時の治療薬（例えば、予防又は治療剤）の投与に限定されず、本開示のその治療用融合タンパク質を含む医薬組成物が、融合タンパク質がさらなる治療剤と一緒に作用して、それらが他の方法で投与される場合より増加した利益を提供し得るような順序及び時間間隔内で対象に投与されることを意味する。例えば、各治療薬は、同時に又は異なる時点で任意の順序で連続して対象に投与され得るが；同時に投与されない場合、それらは、所望の治療又は予防効果を提供するように十分に近い時間内に投与されるべきである。各治療薬は、別個に、任意の適切な形態で及び任意の好適な経路によって対象に投与され得る。
本明細書に記載の治療用融合タンパク質、及びさらなる治療剤は、同時に、本開示の融合タンパク質と同じ又は別個の医薬組成物で、又は連続して、投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載されるような融合タンパク質がまず投与され得、さらなる薬剤が２番目に投与され得るか、又は投与の順序が逆にされ得る。さらなる治療剤は、融合タンパク質と同じ又は異なる投与経路によって対象に投与され得る。
本明細書に記載の治療用融合タンパク質、及び／又はさらなる治療剤、手順又はモダリティは、活性障害の期間中、又は寛解期間又は活性の低い疾患の期間中に投与することができる。本明細書に記載されるような治療用融合タンパク質は、他の処置の前に、処置と同時に、処置後に、又は障害の寛解中に投与することができる。
組み合わせて投与される場合、本明細書に記載の治療用融合タンパク質、及びさらなる治療剤（例えば、第２又は第３の薬剤）は、例えば、単剤療法として個別に使用される各薬剤の量又は投与量より多い、少ない又は同じ量又は用量で投与され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の治療用融合タンパク質、さらなる薬剤（例えば、第２又は第３の薬剤）、又は全ては、例えば単剤療法として、個別に使用される各薬剤の量又は投与量よりも、低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）。他の実施形態において、所望の効果（例えば、炎症性疾患又は状態の処置）を生じる本明細書に記載の治療用融合タンパク質、さらなる薬剤（例えば、第２又は第３の薬剤）、又は全ての量又は投与量は、例えば同じ治療効果の達成が求められる単剤療法として、個別に使用される各薬剤の量又は投与量よりも、低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％低い）。
例えば、本開示の治療用融合タンパク質は、ＤＭＡＲＤ、例えば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、メトトレキサート、Ｄ－ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６；リンパ球再循環のモジュレーター、例えば、ＦＴＹ７２０及びＦＴＹ７２０類似体；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３又はＴＡＦＡ－９３；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えば、ＡＢＴ－２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプリン；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸モフェチル；１５－デオキシスペルグアリン又はその免疫抑制性相同体、類似体又は誘導体；免疫抑制モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はそれらのリガンド；他の免疫調節化合物、例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一部又はその変異体を有する組換え結合分子、例えば、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したＣＴＬＡ４又はその変異体の少なくとも細胞外部分、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ６８６２９と呼ばれる）又はその変異体、例えば、ＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えば、ＬＦＡ－１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ－１又は－３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ－４アンタゴニスト又はＶＬＡ－４アンタゴニスト；又は化学療法剤、例えば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン又は５－フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えば、ＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、又はＴＮＦ－ＲＩ又はＴＮＦ－ＲＩＩに対する受容体コンストラクト、例えば、エタネルセプト、ＰＥＧ－ＴＮＦ－ＲＩ；炎症性サイトカインの遮断剤、ＩＬ－１遮断剤、例えばアナキンラ又はＩＬ－１トラップ、カナキヌマブ、ＩＬ－１３遮断剤、ＩＬ－４遮断剤、ＩＬ－６遮断剤；ケモカイン遮断剤、例えば、プロテアーゼの阻害剤又は活性剤、例えば、メタロプロテアーゼ、抗ＩＬ－１５抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－４抗体、抗ＩＬ－１３抗体、抗ＣＤ２０抗体、アスピリン又は抗感染剤などのＮＳＡＩＤ；損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）又は病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）アンタゴニスト、例えば、コンバーター、解毒剤、リムーバー、例えば、ＡＴＰコンバーター、ＨＭＧＢ－１モジュレーター、ヒストン解毒剤；超抗原誘発性免疫応答の阻害剤；補体阻害剤及び体外血漿交換デバイス、と組み合わせて使用され得る。
キット
組成物、例えば、本開示の治療用融合タンパク質、及び使用の指示からなるキットも本発明の範囲内である。そのようなキットは、本開示によると、治療有効量の融合タンパク質を含む。さらに、そのようなキットは、治療用融合タンパク質を投与するための手段（例えば、自動注射器、シリンジ及びバイアル、プレフィルドシリンジ、プレフィルドペン）及び使用の指示を含み得る。これらのキットは、自己免疫疾患又は炎症性障害又はＡＯＩを有する患者を処置するための追加の治療剤（以下に記載）を含み得る。そのようなキットはまた、患者を処置するための治療用融合タンパク質の投与のための指示を含み得る。そのような指示は、封入された融合タンパク質と共に使用するための用量、投与経路、レジメン、及び総処置期間を提供し得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される用法を示すラベルを含む。ラベルという用語には、キット上若しくはキットと共に供給されるか、そうでなければキットに付属している、文書又は記録物が含まれる。キットは、上記で定義されたように、患者が本発明の治療用融合タンパク質による処置に応答する群に属するかを診断するためのツールをさらに含み得る。
実施形態
本開示は、以下の実施形態を提供する。
１．可溶化ドメインを含む治療用マルチドメイン融合タンパク質であって、可溶化ドメインが、マルチドメイン融合タンパク質のドメインの間に位置する、治療用マルチドメイン融合タンパク質。
２．式Ａ－Ｓ－Ｂ（式Ｉ）の治療用融合タンパク質であって、式中、
（ｉ）Ａは、第１のドメイン、又は第１のドメインのセットであり、
（ｉｉ）Ｓは、可溶化ドメインであり、
（ｉｉｉ）Ｃは、第２のドメイン、又は第２のドメインのセットであり、
任意選択により、マルチドメイン治療用融合タンパク質が主要な生物学的機能を維持する、治療用融合タンパク質。
３．可溶化ドメインが、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、又はその機能的変異体を含む、実施形態１又は２に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
４．可溶化ドメインが、ヒト血清アルブミン、又はその機能的変異体である、実施形態３に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
５．可溶化ドメインがＨＳＡ Ｄ３である、実施形態４に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
６．可溶化ドメインがＨＳＡであり、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載のマルチドメイン融合タンパク質。
７．可溶化ドメインが、第１のドメイン、第２のドメイン、又は両方のドメインに直接連結している、先の実施形態のいずれか１つに記載のマルチドメイン融合タンパク質。
８．可溶化ドメインが、リンカーによって第１のドメイン及び／又は第２のドメインに間接的に連結している、先の実施形態のいずれか１つに記載のマルチドメイン融合タンパク質。
９．第１のドメインがインテグリン結合ドメインであり、第２のドメインがホスファチジルセリン（ＰＳ）結合ドメインである、先の実施形態のいずれか１つに記載のマルチドメイン融合タンパク質。
１０．インテグリン結合ドメインがインテグリンに結合し、例えば、αｖβ３及び／又はαｖβ５及び／又はα８β１インテグリンに結合する、実施形態９に記載の治療用融合タンパク質。
１１．インテグリン結合ドメインが、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含む、実施形態９又は実施形態１０に記載の治療用融合タンパク質。
１２．インテグリン結合ドメインが、ＭＦＧ－Ｅ８、ＥＤＩＬ３又は表１に列挙されるインテグリン結合ドメインを含むタンパク質のＥＧＦ様ドメインである、実施形態９～１１のいずれか１つに記載の治療用融合タンパク質。
１３．ＰＳ結合ドメインが、表２に列挙されるＰＳ結合ドメインであるか、又は表２に列挙されるＰＳ結合ドメインの切断型変異体である、実施形態９～１２のいずれか１つに記載の治療用融合タンパク質。
１４．ＰＳ結合ドメインが、ＭＦＧ－Ｅ８若しくはＥＤＩＬ３のＰＳ結合モチーフ、又はそれらの切断型変異体である、実施形態９～１３のいずれか１つに記載の治療用融合タンパク質。
１５．ＰＳ結合ドメインが、ＭＦＧ－Ｅ８のＰＳ結合モチーフ、又はその切断型変異体である、実施形態１４に記載の融合タンパク質。
１６．ＰＳ結合ドメインがディスコイジンドメイン、又はその切断型変異体である、実施形態１３に記載の融合タンパク質。
１７．切断型ＰＳ結合（ｂｉｎｇｉｎｇ）ドメインが、表２に列挙されるＰＳ結合ドメインのＣ１ドメイン及び／又はＣ２ドメインのいずれかを含む、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の治療用融合タンパク質。
１８．切断型ＰＳ結合ドメインがＣ１ドメインである、実施形態１３～１７のいずれか１つに記載の治療用融合タンパク質。
１９．切断型ＰＳ結合ドメインがＣ２ドメインを含まない、実施形態１３～１８のいずれか１つに記載の治療用融合タンパク質。
２０．インテグリン結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２１．インテグリン結合ドメインが、配列番号７７のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２２．インテグリン結合ドメインが、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、若しくは配列番号１０１から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２３．ＰＳ結合ドメインが、配列番号１４１若しくは配列番号１４２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２４．ＰＳ結合ドメインが、配列番号１４４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２５．インテグリン結合ドメイン－ＨＳＡ－ＰＳ結合ドメインを順番に含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２６．ＭＦＧ－Ｅ８が、Ｎ末端からＣ末端まで、ＥＧＦ様ドメイン、可溶化ドメイン（ｄｏａｍｉｎ）、及びＣ１ドメイン及び／又はＣ２ドメインを含み；野生型ヒトＭＦＧ－Ｅ８（配列番号１）からの配列又はその機能的変異体を含む、ＭＦＧ－Ｅ８及び可溶化ドメインを含む、治療用融合タンパク質。
２７．可溶化ドメインが、ＥＧＦ様ドメインとＣ１又はＣ２ドメインとの間に挿入される、実施形態２６に記載の融合タンパク質。
２８．可溶化ドメインが、ＨＳＡ、ＨＳＡ Ｄ３若しくはＦｃ－ＩｇＧ、又はそれらの機能的変異体である、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２９．可溶化ドメインが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、又はその機能的変異体を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３０．タンパク質が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、若しくは配列番号１４７から選択されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３１．実施形態３０のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
３２．実施形態３１に記載の核酸を含む、クローニング又は発現ベクター。
３３．実施形態３１に記載の単離された核酸を含むウイルスベクターであって、好ましくは、実施形態３１に記載の単離された核酸を含むウイルスベクターが、ＡＡＶに由来する、ウイルスベクター。
３４．ベクターが、それを必要とする対象、例えば、ヒト対象に投与される、実施形態３３に記載のウイルスベクター。
３５．本明細書に列挙される疾患の処置及び／又は予防における使用のための、実施形態３３に記載のウイルスベクター。
３６．実施形態３２による１つ以上のクローニング又は発現ベクター、及び任意選択により分泌シグナルを含む、治療用融合タンパク質の産生に適した組換え宿主細胞。
３７．宿主細胞が、例えば、原核生物、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞である、実施形態３６に記載の組換え宿主細胞。
３８．宿主細胞におけるタンパク質の発現が、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの収量を生じる、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３９．哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現が、野生型、例えば、野生型ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号１）の少なくとも１００倍の収量の増加を生じる、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
４０．先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
４１．実施形態１～４０のいずれか１つに記載の治療有効量の融合タンパク質を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における炎症性障害又は炎症性器官損傷の処置又は予防の方法。
４２．それを必要とする個体における炎症性障害又は炎症性器官損傷の処置又は予防における使用のための、先の実施形態のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
４３．炎症性障害又は炎症性臓器損傷が、急性腎障害、敗血症、心筋梗塞、急性脳卒中、火傷、外傷性損傷、並びに虚血／再灌流に起因する炎症性及び臓器損傷である、実施形態４１に記載の方法又は実施形態４２に記載の使用。
４４．融合タンパク質が、別の治療剤と組み合わせて投与される、実施形態４１に記載の方法又は実施形態４２に記載の使用。
４５．別の治療剤が、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗炎症剤、抗酸化剤、抗感染剤、細胞毒性剤又は抗癌剤である、実施形態４４に記載の方法又は使用。
４６．（ｉ）マルチドメインタンパク質の１つ以上のドメインを改変して所望の治療特性を有すること、及び（ｉｉ）治療用タンパク質のドメイン内に、アルブミン、例えば、ＨＳＡ又はその機能的変異体を挿入することによる、治療用マルチドメインタンパク質の製造のための方法。
４７．可溶化ドメインがＨＳＡであり、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態４６に記載の方法。
４８．可溶化ドメインが、第１のドメイン、第２のドメイン、又は両方のドメインに直接連結している、実施形態４６又は４７のいずれか１つに記載のマルチドメイン融合タンパク質。
４９．可溶化ドメインが、リンカーによって第１のドメイン及び／又は第２のドメインに間接的に連結している、実施形態４６又は４７のいずれか１つに記載のマルチドメイン融合タンパク質。
５０．治療用マルチドメインタンパク質が、先の実施形態のいずれか１つに記載の治療用マルチドメインタンパク質である、実施形態４６に記載の方法。
そのような組み合わせが実施形態の説明と一致する範囲で、各実施形態が１つ以上の他の実施形態と組み合わせられ得ることを理解されたい。上記で提供される実施形態は、実施形態の組み合わせの結果としてのそのような実施形態を含む、全ての実施形態を含むことが理解されることをさらに理解されたい。
特許、特許出願、論文、刊行物、教科書などを含む、本明細書で引用された全ての参考文献、及びそこに引用された参考文献（それらがまだ組み込まれていない範囲で）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の例は、開示をさらに説明するために提供されるが、その範囲を限定するものではない。本開示の他の変形は、当業者には容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲に包含される。
実施例１：融合タンパク質の生成
ＭＦＧ－Ｅ８は、Ｎ末端上皮成長因子（ＥＧＦ様）ドメイン及び２つのＣ末端レクチン型Ｃドメイン（Ｃ１及びＣ２）からなるマルチドメインタンパク質である。文献に記載されているように、組換え全長ヒトタンパク質を産生する試みは、タンパク質凝集及び発現速度が非常に低いことを示す（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １１２４：１０－２２）。したがって、タンパク質を可溶化し、その発現を強化することを試みるために、本発明者らは、ＭＦＧ－Ｅ８にいくつかのタンパク質を融合することの効果を調査した。
ヒトＦｃ－ＩｇＧ１に由来する可溶化ドメイン（ＳＤ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びＨＳＡのドメイン３（ＨＳＡ Ｄ３）は、異なる位置、すなわち図１に概略的に示されているように、Ｎ末端又はＣ末端、又はＥＧＦとＣ１又はＣ１とＣ２ドメインの間でＭＦＧ－Ｅ８に融合された。さらに、Ｆｃ－ＩｇＧ１又はＨＳＡへの融合は、これらのタンパク質がＦｃＲｎに結合するため、インビボでの分子の半減期を延長する可能性がある。ＭＦＧ－Ｅ８のＦｃ－ＩｇＧ１又はＨＳＡへの融合は、以下の例に示すように、融合タンパク質の産生及び溶解性を高めることもできる（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）上掲）。
表５は、ＨＳＡ挿入物を含む融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）のヒト新生児Ｆｃ受容体への結合を示す（実施例５．１も参照）。
Figure 2022547051000059
実施例２：野生型ＭＦＧ－Ｅ８及びＭＦＧ－Ｅ８ ＨＳＡ融合体の生成；発現及び精製
融合タンパク質の生成方法を以下に説明する。簡単に説明すると、ＭＦＧ－Ｅ８とＭＦＧ－Ｅ８の融合及びＥＤＩＬ融合、特にＨＳＡへの融合は、以下の方法に従って生成された。
ＤＮＡはＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）で合成され、制限酵素ライゲーションベースのクローニング技術を使用して哺乳動物発現ベクターにクローニングされた。得られたプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。タンパク質の一過性発現のために、野生型又は改変鎖のベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；カタログ番号２４７６５ Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、懸濁液適応ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。典型的には、１ｍｌあたり１～２Ｍｉｏ細胞の密度の懸濁液中の細胞１００ｍｌに、改変鎖をコードする１００μｇの発現ベクターを含むＤＮＡをトランスフェクトした。次に、組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、０．１％のプルロニック酸、４ｍＭのグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌの抗生物質を補充した培地（ＨＥＫ、無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｅｅ）培地）への分泌を可能にするために細胞をさらに７日間培養することによって、構築物を産生した。
次に、産生された構築物を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、又はプロテインＡ捕捉、又は抗ＨＳＡ捕捉クロマトグラフィーを使用して、無細胞上清から精製した。
ｈｉｓタグ付きタンパク質がＩＭＡＣによって捕捉されたとき、ろ過された馴化培地は、１％トリトン及び２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．５Ｍｎ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０で平衡化されたＩＭＡＣレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と混合された。タンパク質を１０カラム容量の溶出バッファー（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．５Ｍｎ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）で溶出する前に、樹脂を１５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．５Ｍｎ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０で３回洗浄した。
タンパク質をプロテインＡ又は抗ＨＳＡクロマトグラフィーで捕捉した場合、ろ過した馴化培地をプロテインＡ樹脂（ＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭａｂ（商標），Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）又は抗ＨＳＡレジン（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎアフィニティマトリックス、Ｔｈｅｒｍｏ）と混合し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した。タンパク質を１０カラム容量の溶出バッファー（５０ｍＭクエン酸塩、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で溶出する前に、樹脂を１５カラム容量のＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄し、１Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ１０．０を使用してｐＨを中和した。
最後に、溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、１６／６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して研磨し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓマーカー（Ｂｉｏｒａｄ，ｒｅｆ＃１６１－０３６３）に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
融合タンパク質の代表的な発現ゲルを図２に示す。図２Ａ：ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２タンパク質（ＦＰ３３０；配列番号４２）；図２Ｂ：ＥＤＩＬ３タンパク質のＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２（ＦＰ０５０；配列番号１２）；図２Ｃ：非還元及び還元ＥＧＦ－Ｆｃ（ＫｉＨ）Ｃ１－Ｃ２タンパク質。このタンパク質は、ＦＰ０７１（ＥＧＦ－Ｆｃ（ノブ）－Ｃ１－Ｃ２；配列番号１８）とＦｃ－ＩｇＧ１ホール（配列番号１０）；図２Ｄ：ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１タンパク質（ＦＰ２６０；配列番号３４）のヘテロ二量体である。還元及び非還元条件下でのタンパク質を図２Ｃに示す。ヘテロ二量体は還元条件下で崩壊する傾向があるため、両方の条件を試験した。融合タンパク質のさらなるセットの精製後の発現及び収量の結果を表６に示す。発現データからわかるように、ＭＦＧ－Ｅ８のＨＳＡ融合は、ＨＳＡが異なる位置にある場合でも、野生型ＭＦＧ－Ｅ８よりも少なくとも１００倍の発現改善を示す。表６の右側の列に示されているように、ＭＦＧ－Ｅ８のＨＳＡ融合体も、野生型ＭＦＧ－Ｅ８の少なくとも１００倍の収量の増加を示す。
Figure 2022547051000060
本開示の治療用融合タンパク質の他の例は、上記の方法に従って生成され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によってさらに分析され、タンパク質はそれらの分子量に基づいて分離された。ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ，４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ染色フリー）にロードする前に、各タンパク質をＬａｅｍｍｌｉバッファーと混合した。トリス－グリシン－ＳＤＳランニングバッファーで、２００Ｖで３０分間泳動させた後、ゲルに含有されるタンパク質を無染色対応のイメージャー（Ｂｉｏｒａｄ，Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ）で明らかにした。図２Ｅで説明したように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、産生及び精製された組換えタンパク質を示す。
列１，１２：分子量マーカー（Ｂｉｏｒａｄ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）
列２：Ｈｉｓ６＿ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿Ｃ１［ＭＦＧ－Ｅ８］ ２３．８７ｋＤａ
列３：ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿Ｃ１［ＭＦＧ－Ｅ８］＿Ｈｉｓ６ 配列番号１１５ ２３．８７ｋＤａ
列４：ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿ＨＳＡ＿Ｃ１［ＭＦＧ－Ｅ８］ 配列番号１１７ ９０．３８ｋＤａ
列５：ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿ＨＳＡ＿Ｃ１［ＭＦＧ－Ｅ８］ 配列番号７４ ８９．２７ｋＤａ
列６：ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿ＨＳＡ＿Ｃ１［ＭＦＧ－Ｅ８］ 配列番号７３ ８８．７２ｋＤａ
列７：ＥＧＦ［ＥＤＩＬ３］＿ＨＳＡ＿Ｃ１［ＥＤＩＬ３］ 配列番号７１ ９８．２２ｋＤａ
列８：ＥＧＦ［ＥＤＩＬ３］＿ＨＳＡ＿Ｃ２［ＥＤＩＬ３］ 配列番号１３５ ９８．２０ｋＤａ
列９：ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿ＨＳＡ＿Ｃ２［ＭＦＧ－Ｅ８］ 配列番号１３７ ８８．４５ｋＤａ
列１０：ＥＧＦ［ＥＤＩＬ３］＿ＨＳＡ＿Ｃ１＿Ｃ２［ＭＦＧ－Ｅ８］ 配列番号８０ １１５．６７ｋＤａ
列１１：ＥＧＦ［ＭＦＧ－Ｅ８］＿ＨＳＡ＿Ｃ１＿Ｃ２［ＥＤＩＬ３］ 配列番号８２ １０７．３２ｋＤａ
実施例３：ＭＦＧ－Ｅ８－ＨＳＡ改変タンパク質の特性評価
３．１ホスファチジルセリン結合（生化学的）
Ｌ－α－ホスファチジルセリン（脳、ブタ、Ａｖａｎｔｉ ８４００３２、Ａｌａｂａｍａ，ＵＳ）をクロロホルムに溶解し、メタノールで希釈し、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）３６５３、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ ＭＥ，ＵＳ）上に１μｇ／ｍＬでコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、ＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用して溶媒を蒸発させた。プレートを、３％脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、室温で１．５時間処理した。
融合タンパク質のＬ－α－ホスファチジルセリンへの結合は、ビオチン化マウスＭＦＧ－Ｅ８／ラクトアドヘリン（自社産生、ｍＭＦＧ－Ｅ８：ビオチン）の結合と競合することによって評価された。タンパク質を、３％脂肪酸フリーＢＳＡ、ｐＨ７．４を含むＰＢＳで希釈し、Ｌ－α－ホスファチジルセリンでコーティングしたマイクロタイタープレートで３０分間インキュベートした。３％脂肪酸フリーＢＳＡを含有するＰＢＳ中のｍＭＦＧ－Ｅ８：ビオチン、ｐＨ７．４を、１ｎＭで添加し、さらに３０分間インキュベートした。未結合のｍＭＦＧ－Ｅ８：ビオチンは、解離強化ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（商標））洗浄バッファー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２４４－１１４ ＭＡ，ＵＳ）を使用した３回の洗浄ステップで除去した。ユーロピウム標識ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２４４－３６０、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，フィンランド）をＤＥＬＦＩＡ（商標）アッセイバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２４４－１１１ ＭＡ，ＵＳ）に室温で２０分間添加した。その後、ＤＥＬＦＩＡ（商標）アッセイバッファーで３回洗浄した。ユーロピウムは、製造元（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２４４－１０５，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ，ＵＳ）の指示に従って明らかにされた。ユーロピウムの時間分解蛍光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）２１０３マルチラベルプレートリーダー，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＣＴ，ＵＳ）で定量化された。データ分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
ポリプロピレンプレートは、低タンパク質結合マイクロタイタープレートであり、典型的には、実験室で段階希釈に使用される。ポリスチレンと比較して、これらのプレートには、希釈中のタンパク質の損失を減らすという利点があり、典型的には、「低タンパク質結合」プレートとして分類される。野生型ＭＦＧ－Ｅ８の希釈がポリプロピレンプレートで行われた場合、非結合プレートで行われた希釈と比較して、野生型ＭＦＧ－Ｅ８は、Ｌ－α－ホスファチジルセリン競合アッセイで効力を失った。これらのデータは、図３に示すように、低タンパク質結合用にすでに最適化されているポリプロピレンプレートを使用した場合、液体の取り扱い及び希釈のステップで野生型ＭＦＧ－Ｅ８が部分的に失われることを示す（図３Ａ）。これらの結果は、野生型ＭＦＧ－Ｅ８の固有の粘着性が、実験室での取り扱い、及びおそらく医薬品の製造及び産生中の取り扱いに課題をもたらすことを示し、ここで、高収率且つ非常に高純度の原薬を産生するために、捕捉及び研磨のステップが必要とされる。対照的に、改変タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の粘着性は、野生型ＭＦＧ－Ｅ８と比較して大幅に減少し、非結合プレートとポリプロピレンプレートで実施された希釈の間に実質的な違いは観察されなかった（図３Ｂ）。これらのデータは、本開示のタンパク質に可溶化ドメインを挿入することにより、それらの技術的取り扱いを改善して、ステップ収量、ひいては製造プロセス中の全体収量を改善できることを示唆している。
融合タンパク質のＬ－α－ホスファチジルセリンへの結合の評価を図４に示す。改変ＭＦＧ－Ｅ８由来タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）は、固定化されたＰＳに結合し、リン脂質カルジオリピンにはより少ない程度で濃度依存的に結合した（図４Ａ）。ＦＰ２７８の、固定化されたＬ－α－ホスファチジルセリンへの結合又はカルジオリピン（１，３－ビス（ｓｎ－３’－ホスファチジル）－ｓｎ－グリセロール）への結合は、野生型ＭＦＧ－Ｅ８のＥＧＦ－Ｌドメインに対する抗体を使用して検出された。固定化されたＬ－α－ホスファチジルセリンへのいくつかの組換え融合タンパク質の結合強度を図４Ｂに示す。ヒト野生型ＭＦＧ－Ｅ８、及び融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）及びＦＰ２６０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１；配列番号３４）は、１ｎＭビオチン化マウスＭＦＧ－Ｅ８の固定化Ｌ－α－ホスファチジルセリンへの濃度依存的結合と効率的に競合した。融合タンパク質について得られたＩＣ５０値は、改変タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）のＣ１－Ｃ２ドメインのＬ－α－ホスファチジルセリン結合強度がヒト野生型ＭＦＧ－Ｅ８と比較して非常に類似していることを示す。驚くべきことに、これらのデータは、ＦＰ２７０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ２；配列番号３６）の結果が示すように、ヒトＣ２ドメインがＬ－α－ホスファチジルセリンと相互作用しないか、又はわずかにしか相互作用しないことも示唆しており、これは、ＦＰ２５０（ＥＧＦ－ＨＳＡ；配列番号３２）とともに、このアッセイ形式では競合しなかった。ＥＧＦ－Ｃ２－Ｃ２タンパク質であるＦＰ１００（配列番号２６）が試験され、このアッセイ形式（示されず）では競合せず、Ｃ１ドメインをヒトＭＦＧ－Ｅ８の主要なＰＳ結合部分として残した。主要な文献がＭＦＧ－Ｅ８のＣ２ドメインがＰＳ結合に関与する主要なドメインであることを示唆しているため、この知見は驚くべきものであった（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（２０）：６２００－６；Ｓｈｉ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０１：２６２８－２６３６；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８３（１１）：７２３０－４１）。結論として、これらの知見は、Ｃ１ドメインがＭＦＧ－Ｅ８改変タンパク質の主要な統合ＰＳ結合ドメインであり、ＰＳ結合依存機能にとって重要であることを示す。そのため、Ｃ１ドメインは、ＰＳ結合を付与するための異種タンパク質への置換に役立知売る。ただし、Ｃ１－Ｃ２又はＣ１－Ｃ１タンデムドメイン（後者は示されず）を含む融合タンパク質で最も高いＰＳ結合が示された。
３．２ αｖインテグリン接着アッセイ
融合タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で希釈し、５０μＬの２４ｎＭ溶液を一晩吸着によって固定化した（９６ウェルプレート、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）（１．２ｎＭ／ウェル）。続いて、プレートを、室温で１．５時間、３％脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理した。αｖβ３インテグリン発現リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ－ＴＩＢ－４８ ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４，ＡＴＣＣ，ＵＳ）は、ＧｌｕｔａＭａｘ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ β－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した。接着実験の前日に細胞を分割した。細胞を３μｇ／ｍＬの２’，７’－ビス－（２－カルボキシエチル）－５－（及び－６）－カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ ＡＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ，ＵＳ）で３０分間標識した。ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞を接着バッファー（ＴＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁し、５００００細胞／ウェルを室温で４０分間接着させた。非接着細胞は、接着バッファーで繰り返し洗浄することにより除去された。付着細胞の蛍光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）２１０３マルチラベルプレートリーダー，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳを使用して定量化された。データ分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
固定化融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）への細胞接着は、αｖインテグリン阻害剤シレンジタイド又は１０ ｍＭ ＥＤＴＡによって完全に遮断され、固定化改変タンパク質へのインテグリン依存性細胞接着を示した（図５Ａ）。ＥＧＦ様ドメイン（ＦＰ２８０；配列番号３８）のインテグリン結合モチーフＲＧＤ（ＲＧＤ＞ＲＧＥ）の単一点変異は細胞接着の完全な抑制をもたらし、融合タンパク質の機能的且つアクセス可能なＲＧＤ結合モチーフが、αｖインテグリン依存性接着に不可欠であることを示した（図５Ｂ）。Ｃ１－Ｃ２ドメインを欠く固定化ＥＧＦ－ＨＳＡタンパク質であるＦＰ２５０（配列番号３２）は、ＥＧＦ様ドメインにもかかわらず、ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞の接着をサポートしなかったか、又はわずかにしかサポートしなかった（図５Ｃ）。この発見は、試験された実験条件下で、ＨＳＡに融合したＥＧＦ様ドメインのＲＧＤループが、おそらく立体性の理由により、細胞表面インテグリンに十分にアクセスできない可能性があることを示唆している。Ｃ１、Ｃ２、又はＣ１－Ｃ２がＣ末端の位置でＥＧＦ－ＨＳＡに融合すると、この障害は明らかではなかった。本開示の組換えタンパク質、例えば、ＦＰ３３０は、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞で発現される場合、野生型ＭＦＧ－Ｅ８と同様にαｖ－インテグリン依存性細胞接着を促進する（図５Ｄ）。
まとめると、これらのデータは、本開示の融合タンパク質が細胞インテグリンに結合し、インテグリン依存性細胞接着をサポートし、ＨＳＡドメイン挿入物を有するタンパク質において、Ｃ末端ＥＧＦ様ドメインが、インテグリン結合をサポートするためにＣ末端融合タンパク質ドメインから機能的な利益を得る可能性があることを示す。
３．３ ヒトマクロファージ－好中球エフェロサイトーシスアッセイ
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，スウェーデン）、続いてＳｔｅｍｃｅｌｌ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ １９０５９、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，カナダ）を使用した単球のネガティブセレクションによって、バフィーコートから単離された。単球は、５日間にわたり、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、５０μＭ β－Ｍｅｒｃを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、組換えヒトＭ－ＣＳＦ４０ｎｇ／ｍＬ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）を使用して「Ｍ０」マクロファージに分化した。エフェロサイトーシスの１日前に、Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ Ｌｉｎｋｅｒキット（Ｓｉｇｍａ ＭＩＮＩ２６，ＵＳ）を使用してマクロファージをＰＫＨ２６で標識した。細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、５０μＭ β－Ｍｅｒｃを含有するＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、４００００細胞／ウェルで黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳ）に播種し、２０時間にわたって接着させた。
好中球：ヒト好中球は、次のようにＦｉｃｏｌｌ（商標）密度勾配と組み合わせたデキストラン沈降によってバフィーコートから分離された。希釈したバフィーコートを遠心分離することにより、バフィーコートの血漿を除去した。細胞回収物を１％デキストランで希釈し（ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）由来、ＭＷ４５０．０００～６５０．０００；Ｓｉｇｍａ，ＵＳ）、氷上で２０～３０分間沈降させた。
上清から白血球を回収し、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）－Ｐａｑｕｅ層（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｗｅｄｅｎ）に置いた。遠心分離後、ペレットを回収し、赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ，スイス）を使用して残りの赤血球を溶解した。好中球を培地（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．１ｍＭ ＮａＰｙｒ、５０ｕＭ ｂ－Ｍｅｒｃを含有するＲＰＭＩ１６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ）で１回洗浄し、１５℃で一晩保存した。アポトーシス／細胞死は、好中球を１μｇ／ｍＬのＳｕｐｅｒｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，スイス）で、３７℃で３時間処理することにより誘導された。好中球は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）で２５分間染色し、ＤＲＡＱ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ、１：２０００希釈）で、３７℃、暗所で、５分間染色した。
エフェロサイトーシスアッセイ
Ｍ０マクロファージを融合タンパク質とともに３０分間インキュベートした。アポトーシス標識された好中球は、Ｍ０／好中球１：４の比率で添加された。マクロファージによるアポトーシス好中球のエフェロサイトーシスは、Ｍ０マクロファージの低ｐＨリソソームコンパートメントに好中球が局在する際のＤＲＡＱ５の蛍光強度の増加を利用して視覚化された。
エフェロサイトーシスは、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬＳワイドフィールドハイコンテンツ分析システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤＥＶＩＣＥＳ．ＣＡ，ＵＳ）を使用して定量化された。マクロファージはＰＫＨ２６蛍光を介して識別された。エフェロサイトーシス指数（ＥＩ、％として表示）は、マクロファージの総数に対する、少なくとも１つの摂取されたアポトーシス好中球（ＤＲＡＱ５ｈｉｇｈ）イベントを含むマクロファージの比率として計算された。データ分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）がヒトマクロファージによる死滅好中球のエフェロサイトーシスの促進に及ぼす影響を図６に示す。融合タンパク質は、基礎レベルとして示されている、Ｍ０マクロファージのすでに高いエフェロサイトーシス能力を超えて、ｐＨｒｏｄｏ標識死滅ヒト好中球のマクロファージへの内在化を増加させる。図７では、組換え融合タンパク質ＦＰ２７８が、ヒトマクロファージによる死滅好中球のエンドトキシン（リポ多糖）障害性エフェロサイトーシスを救済できることが示されている。図７Ａは、３人のヒトドナーにおける１００ｐｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）による、死滅するヒト好中球のマクロファージエフェロサイトーシスの障害を示す。左のパネルは個々のドナーの応答を示し、右のパネルは３人のドナーのエフェロサイトーシスの平均障害（％）を示す。図７Ｂは、融合タンパク質ＦＰ２７８を用いたヒトマクロファージによる、死滅好中球のこのエンドトキシン（ＬＰＳ）障害性エフェロサイトーシスの救済を示す。
融合タンパク質ＦＰ３３０を用いたヒトマクロファージによる死滅好中球の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）粒子障害性エフェロサイトーシスの救済を図８に示す。図８Ａは、ベースレベルと比較したエフェロサイトーシスの促進に対する１００ｎＭの融合タンパク質の濃度の効果（点線；図の左側）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の添加によって引き起こされるエフェロサイトーシスの障害の救済における１００ｎＭの融合タンパク質の効果（図の右側）を示す。図８Ｂは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の添加によって引き起こされるエフェロサイトーシス障害の救済、及びエフェロサイトーシスの基本レベルに達した後のエフェロサイトーシスの促進に対する、融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＣ５０ ８ｎＭ）の濃度の増加の影響を示す。
３．４ ヒト内皮－Ｊｕｒｋａｔエフェロサイトーシスアッセイ
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，スイス）から入手した。細胞は、ゼラチンでコーティングされたフラスコで培養された（ウシ皮膚由来、ＰＢＳ中０．２％の最終濃度、２％ストック溶液の希釈物、Ｓｉｇｍａ，ドイツ）。細胞は、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イギリス）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）及び１ｎｇ／ｍＬ組換え線維芽細胞成長因子－ベーシック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を補充した培地１９９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）で培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を使用して、細胞を回収又は継代するために分離した。
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳ）から入手し、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）、１０ ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）及び１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を補充した培地ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）中で成長させた。
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１細胞のアポトーシスは、組換えヒトＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）を使用して誘導された。アポトーシス細胞は、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＴＰエステル色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）で標識された。フローサイトメトリーバッファーは、１％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イギリス）、０．０５％ｗ／ｖナトリウムアジド（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）、及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を補充したＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）で調製した。
エフェロサイトーシスアッセイ
１日目に、ＨＵＶＥＣ（コンフルエンス７０～９０％）をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で５分間分離して回収し、ＰＢＳで洗浄し、細胞培地中に再懸濁した。細胞数及び生存率は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）及びＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を製造元の指示に従って使用して評価した。必要な量の細胞を３００ｘｇで５分間、室温で遠心分離し、培地に再懸濁して、６．６×１０４細胞／ｍＬの細胞数とした。１５０μＬ／ウェルのこの細胞懸濁液を、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標），ＵＳ）に添加した。ＨＵＶＥＣは、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度のインキュベーターでさらに１６～２０時間インキュベートされた。
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１の細胞数及び生存率／細胞死状態は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）及びＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を製造元の指示に従って使用して評価した。必要な量の細胞を３００ｘｇで５分間、室温で遠心分離し、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＲＡＩＬを補充した培地に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞死は、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度で一晩誘導された。
２日目に、培地を吸引によりＨＵＶＥＣから除去し、２５μＬの新鮮な予熱（３７℃）培地を添加した後、予熱（３７℃）培地中に希釈した２５μＬの融合タンパク質又は対照を添加した。希釈には、非結合表面（ＮＢＳ）処理９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標），ＵＳ）を使用した。融合タンパク質は、死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞を添加する前に、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度で３０分間ＨＵＶＥＣと相互作用させた。
アポトーシス／死滅Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１細胞数は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）及びＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）を使用してカウントされた。必要な量のアポトーシス細胞を４００ｘｇ、室温で５分間遠心分離し、５×１０６細胞／ｍＬの密度で、最終濃度５μｇ／ｍＬ（染色培地）のｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ色素を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳなし）中に再懸濁した。３７℃で１０分間染色した後、残りの反応性ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＴＰエステルを、１０％ＦＢＳを補充した染色培地で、３７℃でさらに５分間不活化した。ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識細胞を１回洗浄し、ＨＵＶＥＣ培地で細胞数を３×１０６細胞／ｍＬに調整した。１．５×１０６／ウェルのｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞をＨＵＶＥＣに添加し、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度で５時間インキュベートした。培地を除去し、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで１回洗浄し、４０μＬ／ウェルのＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）溶液で分離した。８０μＬの氷冷フローサイトメトリーバッファーを添加して細胞を回収し、１．５ｍＬポリプロピレン９６ウェルブロックに移し、過剰の氷冷フローサイトメトリーバッファーで洗浄し、４００ｘｇ（４℃）で５分間遠心分離した。上清を吸引により除去し、ペレットを８０μＬの氷冷フローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、９６ウェルＶ底マイクロタイタープレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳ）に移した。次に、サンプルをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳ）で測定した。貪食されたＪｕｒｋａｔ細胞のリソソーム局在化の指標としてのｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光強度を記録した。フローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して実施された。一重項ゲートＨＵＶＥＣからのｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎシグナルの蛍光強度（ＭＦＩ）値の中央値を読み取り値として使用した。データ分析は、ＥＣ５０計算用のＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）及びＦＰ２７０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ２；配列番号３６）の、ＨＵＶＥＣ内皮細胞による死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞のエフェロサイトーシスの促進に対する効果を図９に示す。ＨＵＶＥＣによるｐＨｒｏｄｏ標識死滅ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の内在化は、融合タンパク質ＦＰ２７８によって強力に促進される。結果は、内皮細胞が融合タンパク質によって武装して、死滅細胞の効率的な食細胞となることを示す。驚くべきことに、このアッセイにおける融合タンパク質の有効性は、Ｃ１－Ｃ２又はＣ１－Ｃ１タンデムドメインの存在に明らかに依存している。例えば、ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ２（ＦＰ２７０）からなる融合タンパク質は、図９に示すように、この実験設定では不活性である。図１０は、改変タンパク質のＨＳＡドメインの位置、すなわちＮ末端又はＣ末端の位置（それぞれＨＳＡ－ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２（ＦＰ２２０；配列番号３０）又はＥＧＦ－Ｃ１－ Ｃ２－ＨＳＡ（ＦＰ１１０；配列番号２８））は、マクロファージエフェロサイトーシスアッセイにおいてエフェロサイトーシス遮断能力をＭＦＧ－Ｅ８ ＨＳＡ改変タンパク質に付与するという、本発明者らの大いに驚くべき知見を示す。これらのデータは、本開示の融合タンパク質によるエフェロサイトーシスの効率的な促進のために、インテグリン結合ドメインとＰＳ結合ドメインの間にＨＳＡドメインを配置することの重要性を明確に示している。
図１１は、ＥＧＦドメイン、Ｃ１－Ｃ２ドメイン、ＨＳＡ又はＦｃドメインの組み合わせを含む様々な形式の融合タンパク質による内皮エフェロサイトーシスの促進の比較を示す。図１１Ａは、ＨＳＡがＣ末端、又はＮ末端、又はＥＧＦ様ドメインとＣ１－Ｃ２ドメインとの間；それぞれＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－ＨＳＡ（ＦＰ１１０；配列番号２８）、ＨＳＡ－ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２（ＦＰ２２０；配列番号３０）及びＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ（ＦＰ２７８；配列番号：４４）に位置する、ＨＳＡを含む融合タンパク質の比較を示す。図１１Ｂは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質と、Ｃ末端に、又はＥＧＦ様ドメインとＣ１ドメインとの間に位置するＦｃとの比較を示す。Ｆｃ部分の２つのフォーマットが示されている：ＦＰ０７０（ＥＧＦ－Ｆｃ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号１７）及びＦＰ０８０（ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－Ｆｃ；配列番号２２）に見られる野生型Ｆｃ（配列番号７）並びにＦｃの一方のアームにＫｉＨ修飾Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを有するＦｃ部分（ＦＰ０６０；ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２－Ｆｃ［Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ］；配列番号１４）ＥＵ付番（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）上掲）。図１１Ｃは、３つの異なる濃度（０．７２、７．２及び７２ｎＭ）で、Ｎ末端に配置されたＦｃ部分を含む融合タンパク質ＦＰ０９０（Ｆｃ－ＥＧＦ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号２４）の３つのＦＰ０９０のバッチの、野生型ＭＦＧ－Ｅ８対照に対する比較を示す。ＨＵＶＥＣによる死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞のエフェロサイトーシスは、ＥＧＦ様ドメインの後にＨＳＡ又はＦｃ部分が挿入された改変タンパク質によってのみ促進された。図１１Ｄは、可溶化ドメインの挿入が、ＭＦＧ－Ｅ８のパラログである内因性架橋タンパク質ＥＤＩＬ３に基づく新規生物活性融合タンパク質をもたらすことができることを示す。図１１Ｄに示すように、ＨＳＡは、ＥＧＦ様ドメインとＭＦＧ－Ｅ８のパラログであるＥＤＩＬ３のＣ１－Ｃ２ドメインとの間に挿入された。このＥＤＩＬ３構築物（ＦＰ０５０（ＥＤＩＬ３ベースのＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号１２）は、野生型ＥＤＩＬ３に見られる３つのＥＧＦ様ドメインのうち１つ（ＲＧＤループを含む）のみを有する。驚くべきことに、本発明者らは、この構築物で、非常に高純度の新規組換え改変タンパク質の発現に関して、ＨＳＡドメイン挿入物の同様の許容度を見出した（図２Ｂ）。さらに、驚くべきことに、ＥＤＩＬ３由来の組換え操作タンパク質ＦＰ０５０は、内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）による死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞のエフェロサイトーシスを促進し、架橋タンパク質のコア機能を示し、架橋タンパク質のドメインが機能的な新規組換え改変タンパク質の設計に有用であることを実証することが見出された。
実施例４：血栓形成促進性血漿微粒子のエフェロサイトーシス
４．１ヒト内皮－微粒子エフェロサイトーシスアッセイ
細胞培養
ＨＵＶＥＣ細胞はＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，スイス）から入手した。細胞は、ゼラチンでコーティングされたフラスコで培養された（ウシ皮膚由来、ＰＢＳ中０．２％の最終濃度、２％ストック溶液の希釈物、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）。細胞は、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イギリス）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）及び１ｎｇ／ｍＬ組換え線維芽細胞成長因子－ベーシック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，イギリス）を補充した培地１９９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）で培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を使用して、細胞を回収又は継代するために分離した。
血小板由来の微粒子は、以下の手順に従って調製された：書面によるインフォームドコンセントが認められた後、健常成人ボランティアからクエン酸静脈血を採取した（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ９ＮＣ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ，Ｓａｒｓｔｅｄｔ，ドイツ）。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、遠心分離（２００ｘｇ、１５分、ブレーキなし、室温）によって調製した。血小板由来の微粒子／破片は、液体窒素を使用してＰＲＰを３回の瞬間凍結／凍結サイクルに供し、３７℃で解凍することによって生成された。血小板断片／微粒子は、２０，０００ｘｇで、室温、１５分間の遠心分離によってペレット化された。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、アリコートを調製し、－８０℃で保存した。微粒子調製物は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）４８８標識マウスＭＦＧ－Ｅ８／ラクトアドヘリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社内）を使用したフローサイトメトリーで測定した場合、８５～１００％ＰＳ陽性であった。微粒子の数は、専用のカウントビーズ（ＢｉｏＣｙｔｅｘ／Ｓｔａｇｏ，フランス）を使用して決定された。フローサイトメトリーバッファーは、１％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イギリス）、０．０５％ｗ／ｖナトリウムアジド（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）、及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を補充したＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）で調製した。
４．２エフェロサイトーシスアッセイ
１日目に、ＨＵＶＥＣ細胞（コンフルエンス７０～９０％）をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で５分間分離して回収し、ＰＢＳで洗浄し、細胞培地中に再懸濁した。細胞数及び生存率は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）及びＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を製造元の指示に従って使用して評価した。必要な量の細胞を３００ｘｇで５分間、室温で遠心分離し、培地に再懸濁して、６．６×１０４細胞／ｍＬの細胞数とした。１５０μＬ／ウェルのこの細胞懸濁液を、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標），ＵＳ）に添加した。ＨＵＶＥＣ細胞は、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度のインキュベーターでさらに１６～２０時間インキュベートされた。
２日目に、培地を吸引によりＨＵＶＥＣ細胞から除去し、２５μＬの新鮮な予熱（３７℃）培地を添加した後、予熱（３７℃）培地中に希釈した、０．３ｎＭ、３ｎＭ、又は３０ｎＭの３つの異なる濃度の融合タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）又は対照２５μＬを添加した。希釈には、非結合表面（ＮＢＳ）処理９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標），ＵＳ）を使用した。試験タンパク質は、血小板由来の微粒子を添加する前に、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度で３０分間ＨＵＶＥＣ細胞と相互作用させた。
必要な量の微粒子を２０，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離し、２×１０８粒子／ｍＬの密度で、最終濃度５μｇ／ｍＬ（染色培地）のｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ色素を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳなし）中に再懸濁した。３７℃で１０分間染色した後、残りの反応性ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＴＰエステルを、１０％ＦＢＳを補充した染色培地で、３７℃でさらに５分間不活化した。ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識された微粒子は、２０，０００ｘｇ、４℃で１５分間の遠心分離により１回洗浄され、ＨＵＶＥＣ細胞培地で１×１０８粒子／ｍＬに調整された。５×１０６粒子／ウェルのｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識微粒子をＨＵＶＥＣ細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２／９５％湿度で５時間インキュベートした。培地を除去し、ＨＵＶＥＣ細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４０μＬ／ウェルのＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）溶液で分離した。８０μＬの氷冷フローサイトメトリーバッファーを添加して細胞を回収し、１．５ｍＬポリプロピレン９６ウェルブロックに移し、過剰の氷冷フローサイトメトリーバッファーで洗浄し、４００ｘｇ（４℃）で５分間遠心分離した。上清を吸引により除去し、ペレットを８０μＬの氷冷フローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、９６ウェルＶ底マイクロタイタープレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳ）に移した。サンプルは、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳ）で測定した。貪食された微粒子のリソソーム局在化の指標としてのｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光強度を記録した。フローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して実施された。一重項ゲートＨＵＶＥＣ細胞からのｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎシグナルの蛍光強度値（ＭＦＩ）の中央値を読み取り値として使用した。データ分析は、ＥＣ５０計算用のＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。融合タンパク質ＦＰ２７８は、図１２に示すように、内皮細胞による血小板由来微粒子のエフェロサイトーシスを濃度依存的に促進した。取り込みの促進は濃度依存的であり、他のタイプの内皮細胞でも観察された（データは示されず）。
実施例５：ＭＦＧ－Ｅ８－ＨＳＡ融合タンパク質の技術的特性
５．１ 融合タンパク質ＦＰ３３０のＦｃＲｎへの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析
融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）のＦｃＲｎへの結合を特徴づけるために、直接結合アッセイを実施した。速度論的結合親和性定数（ＫＤ）は、分析物として組換えヒトＦｃＲｎを使用して、捕捉されたタンパク質で測定された。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，スイス）で、室温且つそれぞれｐＨ５．８及び７．４で実施した。親和性測定では、タンパク質を１０ｍＭ ＮａＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ５．８で希釈し、メーカーの推奨（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って標準的な手順を使用してＣＭ５研究グレードセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｒｅｆ ＢＲ－１０００－１４）のフローセルに固定化した。参照として使用するために、１つのフローセルをブランクで固定化した。結合データは、その後、参照及び測定フローセルに一連の分析物希釈液を注入することによって取得された。データ評価中に二重参照できるように、ゼロ濃度サンプル（ランニングバッファーのみ）が含まれていた。データ評価には、二重参照センサグラムを使用し、解離定数（ＫＤ）を分析した。
融合タンパク質ＦＰ３３０は、１３８０ｎＭの親和性で、ｐＨ５．８でＦｃＲｎに結合するが、ｐＨ７．４では結合は観察されなかった（上記表５を参照）。これらの結果は、野生型ＨＳＡ（１０００～２０００ｎＭ、ｐＨ５．８、データは示されず）とよく一致している。
５．２ ＭＦＧ－Ｅ８及びその変異体の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
示差走査熱量測定を使用して、改変ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質変異体ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の熱安定性を測定した。測定は示差走査マイクロ熱量計（Ｎａｎｏ ＤＳＣ，ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行った。セル容量は０．５ｍｌ、加熱速度は１℃／ｍｉｎであった。タンパク質は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用された。タンパク質のモル熱容量は、タンパク質が省略された同一のバッファーを含有する複製サンプルと比較することによって推定された。部分モル熱容量及び融解曲線は、標準的な手順を使用して分析された。サーモグラムはベースライン補正され、濃度が正規化された。２つの融解イベントが観察され、第１のＴｍは５０℃、第２のＴｍは６４℃であった。
５．３ ＭＦＧ－Ｅ８変異体の凝集傾向及び溶解度の測定
まず、ＭＦＧ－Ｅ８変異タンパク質ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）の凝集傾向を動的光散乱法（ＤＬＳ，Ｗｙａｔｔ）で測定した。動的光散乱を適用して、散乱光の動的変動を定量化することにより、溶液中のＦＰ２７８の並進拡散係数を測定した。分画なしのタンパク質変異体サイズ分布、多分散度の推定値、及び流体力学的半径を１ｍｇ／ｍｌの濃度で測定した。融合タンパク質ＦＰ２７８の流体力学的半径は、ＤｙｎａＰｒｏ（商標）プレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ，ドイツ）及びソフトウェアＤＹＮＡＭＩＣＳ（バージョン７．１．０．２５，Ｗｙａｔｔ）を組み合わせて測定した。５０μＬの未希釈のろ過済み（０．２２μｍ ＰＶＤＦ－Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）シリンジ駆動フィルターユニット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳ））タンパク質溶液を３８４ウェルプレート（３８４丸形ウェルプレート、ポリスチロール、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，ドイツ）で測定した。タンパク質サンプルの高分子量凝集体は特定できなかった。タンパク質の流体力学的半径は約５～６ｎｍであり、溶液中の単量体タンパク質を示す。
次に、融合タンパク質ＦＰ２７８の濃度依存性流体力学的半径測定を実施して、タンパク質の溶解度を推定した。２２ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度が適用された。流体力学的半径は上記のように決定された。融合タンパク質ＦＰ２７８の濃度を上げると、半径（５～７ｎｍ）の増加は観察できず、野生型ＭＦＧ－Ｅ８（配列番号１）の動的光散乱測定は、約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度での高凝集のために失敗した。
実施例６：ＭＦＧ－Ｅ８融合タンパク質の最適化
発現及び収量の向上に最適化された変異型ＭＦＧ－Ｅ８ベースの融合タンパク質のパネルを生成するために、質量分析（ＭＳ）を使用して、融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２）を調査した。変異体タンパク質のパネルは、様々なサイズ及び構造のリンカー、例えば、ＥＧＦドメインとＨＳＡドメインの間にＧＳを含むリンカー、及び／又はＨＳＡドメインとＣ１ドメインの間に複数のＧＳ又はＧ４Ｓを含むリンカーで生成された。さらに、いくつかの変異体には、欠失又は置換を含むアミノ酸修飾（表７にＨＳＡ＊として示されている）が含まれていた。変異型融合タンパク質のパネルは、以下の表７に要約される。
Figure 2022547051000061
実施例７：変異型ＭＦＧ－Ｅ８融合タンパク質；発現と精製
ＨＥＫ細胞株で融合タンパク質を生成する方法は実施例２に記載されている。独自のＣＨＯ細胞株で発現させるために、ＭＦＧ－Ｅ８変異体をコードする核酸をＧｅｎｅａｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で合成し、制限酵素ライゲーションベースのクローニング技術を使用して哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）にトランスフェクトした。簡単に説明すると、融合タンパク質の一過性発現のために、ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯトランスフェクション剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、発現ベクターを懸濁液適応ＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクトした。典型的には、１ｍｌあたり６Ｍｉｏ細胞の密度の懸濁液中の細胞４００ｍｌに、改変タンパク質をコードする４００μｇの発現ベクターを含むＤＮＡをトランスフェクトした。次に、組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、培地（ＥｘｐｉＣＨＯフィード及びエンハンサー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を補充したＥｘｐｉＣＨＯ発現培地）でさらに７日間分泌させた。
表８に示される発現データから分かるように、変異型融合タンパク質ＦＰ０６８（配列番号４６）及びＦＰ７７６（配列番号４８）は、融合タンパク質ＦＰ３３０（配列番号４２）よりも発現において約２倍の改善を示した。
Figure 2022547051000062
実施例１に記載の方法に従って、さらなる治療用融合タンパク質が得られた。例えば、完全な精製プロセス（捕捉及び研磨）後に得られる発現レベル（ｍｇ／ｌ）は、配列番号８０では４．３、配列番号８２では８．４である。
実施例８：変異型融合タンパク質の特性
エフェロサイトーシスに対する変異型融合タンパク質の効果は、実施例３に記載されているようにエフェロサイトーシスアッセイを実施することによって決定された。
第１のアッセイでは、ヒトマクロファージ－好中球エフェロサイトーシスアッセイにおける変異型融合タンパク質の効果を、上記のセクション３．３で説明した方法に従って決定した。Ｍ０マクロファージを融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）又は変異体ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）又はＦＰ７７６（ＥＧＦ－ ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４８）と３０分間インキュベートした。図１３に示すように、融合タンパク質ＦＰ３３０、ＦＰ２７８、及びＦＰ７７６は、ヒトマクロファージによる死滅好中球のエンドトキシン（リポ多糖（ＬＰＳ））障害性エフェロサイトーシスを救済することができる。融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＣ５０＝１．６ ｎＭ；図１３Ａ）、ＦＰ２７８（ＥＣ５０＝１．７８ ｎＭ；図１３Ｂ）及びＦＰ７７６（ＥＣ５０＝０．５ ｎＭ；図１３Ｃ）の濃度を上げると、ＬＰＳの添加によって引き起こされたエフェロサイトーシス障害の救済につながり、基本レベルに達すると、エフェロサイトーシスを促進さえした。
融合タンパク質ＦＰ３３０、ＦＰ２７８及びＦＰ７７６は、上記のセクション３．４で説明した方法に従って、ヒト内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞－Ｊｕｒｋａｔ細胞エフェロサイトーシスアッセイでさらに特徴づけられた。ＨＵＶＥＣ内皮細胞による死滅Ｊｕｒｋａｔ細胞のエフェロサイトーシスの促進に対する融合タンパク質ＦＰ３３０、ＦＰ２７８及びＦＰ７７６の効果を図１４に示す。ＨＵＶＥＣによるｐＨｒｏｄｏ標識死滅ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の内在化は、ＦＰ３３０（ＥＣ５０＝３．４ｎＭ；図１４Ａ）、ＦＰ２７８（ＥＣ５０＝２．４ｎＭ；図１４Ｂ）及びＦＰ７７６（ＥＣ５０＝３ｎＭ；図１４Ｃ）の濃度を上げることによって強力に促進された。これらの結果は、内皮細胞が融合タンパク質によって武装して、死滅細胞の効率的な食細胞となることを示す。
実施例９：ＡＫＩ及びＡＫＩによって引き起こされる急性臓器反応からのマウスの保護
９．１ 急性腎障害モデル
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８～２２ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（フランス）から購入し、１２時間の明暗サイクルで、フィルタートップで保護されたケージ内の温度制御された施設に収容した。動物は、スイス連邦法及びＮＩＨの実験動物取扱原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）を厳守して取り扱われた。試験中の治療用融合タンパク質は、手術の２時間前に腹腔内（ｉ．ｐ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかで投与された。ブプレノルフィン（Ｉｎｄｉｖｉｏｒ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ）は、手術の６０～３０分前に０．１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下（ｓ．ｃ．）に適用された。イソフルランによる吸入麻酔は、手術前に５分間麻酔チャンバー（３．５～５体積％、キャリアガス：酸素）で誘導された。手術中、動物は、１～２Ｖｏｌ％のイソフルラン／酸素のフェイスマスクを介して麻酔下に維持され、ガス流量は０．８～１．２ｌ／分であった。腹部の皮膚を剃り、Ｂｅｔａｓｅｐｔｉｃ（Ｍｕｎｄｉｐｈａｒｍａ，フランス）で消毒した。動物を恒温モニターシステム（ＰｈｙｓｉＴｅｍｐ，ＵＳ－Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬＬＣ，ＵＳ）を備えた恒温ブランケット（Ｒｏｔｈａｃｈｅｒ－スイス）上に置き、滅菌ガーゼで覆った。体温は、直腸プローブ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬＬＣ，ＵＳ）によって手術全体を通してモニターされ、体温が３６．５～３７．５℃となるように制御された。偽対照を含む全ての動物は、右腎臓の片側腎摘出術を受けた。正中切開／開腹術後、腹腔内容物を左に引っ込めて右腎臓を露出させた。右尿管と腎血管を切り離し、結紮した後、右腎臓を取り出した。ＡＫＩを経験した動物については、腹腔内容物を滅菌ガーゼの右側に配置し、左腎動脈及び静脈を切開して、虚血誘発のためのクランプを可能にした。腎茎をクランプする（１つのクランプを使用して動脈と静脈を一緒に）ために微小動脈瘤クランプ（Ｂ Ｂｒａｕｎ，スイス）を使用して、腎臓への血流を遮断し、腎虚血を誘発した。虚血の成功は、腎臓の色が赤から濃紫に変化することで確認され、これは数秒で発生した。虚血誘導（３５～３８分）の後、微小動脈瘤クランプを取り外した。腹腔内容物を洗浄するために温かい滅菌生理食塩水（約２ｍｌ、３７℃）を使用して、創傷の閉鎖前に組織を再水和させた。洗浄後、さらに１ｍｌの滅菌生理食塩水を補液として腹腔内に加えた。再灌流を開始するとき、創傷は２層（筋肉と皮膚を別個に）で閉鎖された。次に、動物は完全に回復するまで赤色の暖かいランプの下で維持された。ブプレノルフィンは、手術の１時間後及び４時間後に、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で再び投与され、飲用水（９．０９１μｇ／ｍＬ）にも含まれていた。２４時間後、分析のために動物を安楽死させた。
９．２ 治療用融合タンパク質の投与
治療用融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）、ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）及びＦＰ７７６（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２ ；配列番号４８）は、以下の表９に示される用量で、上記のようにＡＫＩモデルで試験された。血清マーカー及びｑＰＣＲマーカーの発現を検出するための研究では、融合タンパク質ＦＰ２７８を手術の２時間前に投与した。虚血再灌流傷害発症の３０分前にＦＰ３３０及びＦＰ７７６は、静脈内投与された。磁気共鳴画像法による造影剤の取り込みを測定するための研究では、融合タンパク質ＦＰ７７６をＡＫＩ誘発の３０分前に１．２６ｍｇ／ｋｇで予防的に投与するか、又は虚血再灌流傷害の誘発の５時間後に２ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．で治療的に投与した。
Figure 2022547051000063
９．３ ＡＫＩ保護のための読み出し／分析：
血清マーカー：
血清サンプルは、虚血再灌流誘導の２４時間後に採取され、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍ４０クリニックアナライザーを製造元の指示（Ａｘｏｎｌａｂ，スイス）に従って使用して、血清クレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）含有量について分析した。
臓器におけるｑＰＣＲマーカーの発現：
臓器（腎臓、肝臓、肺及び心臓）をＡＫＩ誘導の２４時間後に回収し、１ｃｍ片に切断し、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ，ＵＳ）中に４℃で一晩保存した。臓器片を、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＦＲ）に１３４ｍＭベータメルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ，ＤＥ）を含むＲＬＴバッファー（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，ＤＥ）に移し、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用してホモジナイズした。その後、心臓線維組織をプロテイナーゼＫ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）で消化し、腎臓、肝臓及び肺の溶解物を微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，ＤＥ）で、フルスピードで３分間直接遠心分離した。上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ＤＥ）に移し、２分間遠心分離した。フロースルーのＲＮＡ抽出は、ＤＮａｓｅ消化を含むＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌに従って実施した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ １０００デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）によって測定した。ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）を使用して、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）に従って、サンプルあたり２μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡは、３８４ウェルマイクロプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）で、Ｎｕｃｌｅａｓｅフリー水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）、ＴａｑＭａｎプローブ（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＦＡＭ），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）、及びＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）と組み合わせた。ｑＰＣＲは、ＶｉｉＡ ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）で実施された。設定は、１：２分、５０℃；２：１０分、９５℃；３：１５秒、９５℃；４：１分、６０℃であった。ステップ３及び４を４５サイクル繰り返した。データ分析はＶｉｉＡ７ソフトウェアを使用して実施され、ｑＰＣＲデータ分析ソフトウェアはＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で測定した肝臓による造影剤の取り込み
ＭＲＩを実施するための方法は、Ｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ，４１：８２９－８４０）による刊行物から採用された。実験は、７－Ｔ Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ＭＲＩシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，ドイツ）で実施された。ＭＲＩシグナルの取得中、マウスはプレキシグラスクレードル中、仰臥位に置いた。加熱パッドを使用して体温を３７±１℃に維持した。短期間の導入後、麻酔は、ノーズコーンを介して投与される、Ｏ２／Ｎ２Ｏ（１：２）の混合物中、およそ１．４％のイソフルランで維持された。全ての測定は、自発呼吸している動物で行われ、心臓又は呼吸のトリガーは適用されなかった。
スキャナーにマウスを置いた後、限局化の目的でスカウト高速画像を取得した。灌流分析は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子（Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標），Ｇｕｅｒｂｅｔ，フランス）を含む血管内薬剤を使用して実施された。Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標）は、ＡＫＩを有する動物（疾患誘発後２４時間）又は偽手術後（腎摘出後２４時間の動物）に、１．２秒間ボーラスとして静脈内注射した。第１のボーラスは、４００ｍｓ／画像の解像度でエコープラナー画像を順次取得することと併せて１．２秒間投与された。２５枚のベースライン画像を取得した後、１．２秒間に第２のボーラスを注入し、ボーラス後にさらに５７５枚の画像を取得した結果、４分間で合計６００枚の画像が取得された。超常磁性造影剤は、感受性の局所的変化を誘発し、その結果、腎臓の灌流に比例したシグナル減衰が生じた。一連の画像について、シグナル強度は、外部髄質の皮質／外帯に位置する関心領域（ＲＯＩ）で評価された。ＲＯＩの位置、形状、及びサイズは、呼吸によって引き起こされる腎臓の動きにもかかわらず、ＲＯＩがほぼ同じ領域をカバーするように慎重に選択された。注入前の画像の平均シグナル強度は、ベースライン強度（Ｓ（０））を提供した。灌流指数は、以下の比率の平均値から決定された（Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ．，１４：２４９－２６５）：
－ｌｎ［Ｓ（ｔ）／Ｓ（０）］～ＴＥ．Ｖ．ｃＴ（ｔ）
式中、ＴＥはエコー時間、Ｖは血液量、ｃＴは造影剤の濃度である。
この研究で使用されたＳＰＩＯナノ粒子の平均直径は約１５０ｎｍであり、肝臓のクッパー細胞に取り込まれる。したがって、腎臓の灌流に加えて、ＭＲＩは、肝臓に配置されたＲＯＩで評価されたコントラスト変化を検出することにより、肝臓でのナノ粒子の取り込みをモニターすることもできた。
９．４ 結果
図１５に示すように、融合タンパク質ＦＰ３３０（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４２）、ＦＰ２７８（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２－Ｈｉｓタグ；配列番号４４）及びＦＰ７７６（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１－Ｃ２；配列番号４８）は、ｉ．ｐ．（ＦＰ２７８）又はｉ．ｖ．（ＦＰ３３０及びＦＰ７７６）のいずれかで投与した場合、急性腎障害（ＡＫＩ）のこのモデルで腎機能を保護した。この保護は、血清クレアチニン上昇（ｓＣｒ）の遮断に反映される。図１５Ａは、試験された両方の用量での融合タンパク質ＦＰ２７８が、ビヒクル処置動物と比較して、及びマウスＭＦＧ－Ｅ８と同じぐらい効果的に、血清クレアチニンレベルを有意に（ｐ＜０．０００１）減少させたことを示す。図１５Ｂに示すように、融合タンパク質ＦＰ３３０は、用量依存的に腎機能を保護し、融合タンパク質ＦＰ７７６（図１５Ｃ）についても同様であり、ここで、血清クレアチニンレベルも用量依存的に遮断された。
腎機能障害は、試験したマウスの血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルにも反映され、融合タンパク質ＦＰ２７８のＢＵＮレベルへの影響を図１６に示す。
要約すると、図１５及び１６に示すように、融合タンパク質ＦＰ２７８、ＦＰ３３０及びＦＰ７７６は、腎不全の臨床診断に使用されるこれらのマーカーの上昇から強力に保護された。観察された有効性は、組織学によって確認された（示されず）。
さらに、図１７に示されるように、融合タンパク質ＦＰ２７８の単回投与は、ＡＫＩによって誘発される急性期反応から遠隔臓器を保護する。ＡＫＩは、脾臓、肺、肝臓、心臓、脳などの、離れた高度に灌流された臓器の溶解物で、ｑＰＣＲによって測定可能な過剰のｍＲＮＡ応答を誘導する。典型的なｍＲＮＡは、選択された損傷（ＮＧＡＬ、ＫＩＭ－１）、ケモカインの誘導（示されず）、又は血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）などの急性期応答タンパク質導入の誘導を誘導した。図１７Ａ及び１７Ｂは、融合タンパク質の単回注射後に強力に遮断され、偽レベルに戻った、マウスの心臓及び肺におけるそのようなＡＫＩ誘発性応答（血清アミロイドＡ（ＳＡＡ））を例示する。
肝臓によるＳＰＩＯ造影剤Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標）の経時的な取り込みを図１８に示す。ＡＫＩを有する動物は、偽手術の動物と比較して、肝臓（標的＝クッパー細胞）による造影剤の取り込みが大幅に減少していることを示した。ＦＰ７７６処置（１．２６ｍｇ／ｋｇで予防的に投与、ＡＫＩ誘発の約３０分前、又は２ｍｇ／ｋｇで治療的に投与、虚血再灌流傷害誘発の＋５時間後）は、ＡＫＩマウスの肝臓における造影剤蓄積の喪失から保護された。これらの結果は、このマウスモデルにおいて、ＡＫＩが内因性クッパー細胞を介した粒子のクリアランスの重大な障害を引き起こし、ＡＫＩが肝臓における鉄粒子造影剤の蓄積に影響を与える微小血管障害を引き起こすことを示唆している。融合タンパク質ＦＰ７７６による処置は、クリアランスの喪失及び微小血管障害から保護し、偽動物と比較した場合、試験された両方の用量で造影剤の取り込みを促進した。
実施例１０：ＭＦＧ－Ｅ８－ＨＳＡ改変タンパク質の特性評価
１０．２ αｖインテグリン接着アッセイ
融合タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で希釈し、指示された濃度の５０μＬを一晩吸着によって固定化した（９６ウェルプレート、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）。続いて、プレートを、室温で１．５時間、３％脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理した。αｖβ３インテグリン発現リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ－ＴＩＢ－４８ ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４，ＡＴＣＣ，ＵＳ）は、ＧｌｕｔａＭａｘ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ β－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した。細胞を３μｇ／ｍＬの２’，７’－ビス－（２カルボキシエチル）－５－（及び－６）－カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ ＡＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ，ＵＳ）で３０分間標識した。ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞を接着バッファー（ＴＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁し、５００００細胞／ウェルを室温で４０分間接着させた。非接着細胞は、接着バッファーで手動洗浄することにより除去された。付着細胞の蛍光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）２１０３マルチラベルプレートリーダー，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳを使用して定量化された。データ分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
融合タンパク質を含有する固定化ＥＧＦ様ドメインへのＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞の接着。この知見は、試験された実験条件下で、ＭＦＧ－Ｅ８又はＥＤＩＬ３／ＤＥＬ－１ベースの融合タンパク質のＨＳＡに融合したＥＧＦ様ドメインのＲＧＤループにアクセスでき、細胞のａｖインテグリンとの相互作用を可能にすることを示唆している。
まとめると、これらのデータは、本開示の融合タンパク質が細胞インテグリンに結合し、インテグリン依存性細胞接着をサポートし、ＨＳＡドメイン挿入物を有するタンパク質において機能性を保持することを示す。
１０．３ ヒトマクロファージ－好中球エフェロサイトーシスアッセイ
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，スウェーデン）、続いてＳｔｅｍｃｅｌｌ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ １９０５９、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，カナダ）を使用した単球のネガティブセレクションによって、バフィーコートから単離された。単球は、５日間にわたり、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、５０μＭ β－Ｍｅｒｃを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、組換えヒトＭ－ＣＳＦ４０ｎｇ／ｍＬ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）を使用して「Ｍ０」マクロファージに分化した。エフェロサイトーシスの１日前に、Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ Ｌｉｎｋｅｒキット（Ｓｉｇｍａ ＭＩＮＩ２６，ＵＳ）を使用してマクロファージをＰＫＨ２６で標識した。細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、５０μＭ β－Ｍｅｒｃを含有するＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、４００００細胞／ウェルで黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳ）に播種し、２０時間にわたって接着させた。
好中球：ヒト好中球は、次のようにＦｉｃｏｌｌ（商標）密度勾配と組み合わせたデキストラン沈降によってバフィーコートから分離された。希釈したバフィーコートを遠心分離することにより、バフィーコートの血漿を除去した。細胞回収物を１％デキストランで希釈し（ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）由来、ＭＷ４５０．０００～６５０．０００；Ｓｉｇｍａ，ＵＳ）、氷上で２０～３０分間沈降させた。
上清から白血球を回収し、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）－Ｐａｑｕｅ層（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）に置いた。遠心分離後、ペレットを回収し、赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ，スイス）を使用して残りの赤血球を溶解した。好中球を培地（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．１ｍＭ ＮａＰｙｒ、５０ｕＭ ｂ－Ｍｅｒｃを含有するＲＰＭＩ１６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ）で１回洗浄し、１５℃で一晩保存した。アポトーシス／細胞死は、好中球を１μｇ／ｍＬのＳｕｐｅｒｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，スイス）で、３７℃で３時間処理することにより誘導された。好中球は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）で２５分間染色し、ＤＲＡＱ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ、１：２０００希釈）で、３７℃、暗所で、５分間染色した。
エフェロサイトーシスアッセイ
Ｍ０マクロファージを融合タンパク質とともに３０分間インキュベートした。アポトーシス標識された好中球は、Ｍ０／好中球１：４の比率で添加された。マクロファージによるアポトーシス好中球のエフェロサイトーシスは、Ｍ０マクロファージの低ｐＨリソソームコンパートメントに好中球が局在する際のＤＲＡＱ５の蛍光強度の増加を利用して視覚化された。
エフェロサイトーシスは、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬＳワイドフィールドハイコンテンツ分析システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤＥＶＩＣＥＳ．ＣＡ，ＵＳ）を使用して定量化された。マクロファージはＰＫＨ２６蛍光を介して識別された。エフェロサイトーシス指数（ＥＩ、％として表示）は、マクロファージの総数に対する、少なくとも１つの摂取されたアポトーシス好中球（ＤＲＡＱ５ｈｉｇｈ）イベントを含むマクロファージの比率として計算された。データ分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施された。
融合タンパク質ＦＰ１１４及びＦＰ１３３（ＭＦＧ－Ｅ８由来ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１ 配列番号ｘｘｘ）が、ＬＰＳ処理したヒトマクロファージによる死滅好中球のエフェロサイトーシスの救済及び促進に及ぼす影響を図１３Ｄに示す。融合タンパク質は、Ｍ０マクロファージのすでに高いエフェロサイトーシス能力を超えて、ｐＨｒｏｄｏ標識死滅ヒト好中球のマクロファージへの内在化を増加させる。図１３Ｅでは、組換え融合タンパク質ＦＰ１４７（ＥＤＩＬ／ＤＥＬ－１由来ＥＧＦ＿ＥＧＦ＿ＥＧＦ＿ＨＳＡ＿Ｃ１）が、ヒトマクロファージによる死滅好中球のエンドトキシン（リポ多糖）障害性エフェロサイトーシスを救済できることが示されている。全体として、データは、Ｃ２切断型（ｔｒｕｎｃｔａｔｅｄ）ＭＦＧＥ８又はＥＤＩＬ３／ＤＥＬ－１由来の融合タンパク質がインビトロで低いｎＭ有効性でエフェロサイトーシスを促進するという驚くべき知見を示す。
実施例１１：ＡＫＩからのマウスの保護
１１．１ 急性腎障害モデル
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８～２２ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（フランス）から購入し、１２時間の明暗サイクルで、フィルタートップで保護されたケージ内の温度制御された施設に収容した。動物は、スイス連邦法及びＮＩＨの実験動物取扱原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）を厳守して取り扱われた。試験中の治療用融合タンパク質は、手術の２時間前に腹腔内（ｉ．ｐ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかで投与された。ブプレノルフィン（Ｉｎｄｉｖｉｏｒ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ）は、手術の６０～３０分前に０．１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下（ｓ．ｃ．）に適用された。イソフルランによる吸入麻酔は、手術前に５分間麻酔チャンバー（３．５～５体積％、キャリアガス：酸素）で誘導された。手術中、動物は、１～２Ｖｏｌ％のイソフルラン／酸素のフェイスマスクを介して麻酔下に維持され、ガス流量は０．８～１．２ｌ／分であった。腹部の皮膚を剃り、Ｂｅｔａｓｅｐｔｉｃ（Ｍｕｎｄｉｐｈａｒｍａ，フランス）で消毒した。動物を恒温モニターシステム（ＰｈｙｓｉＴｅｍｐ，ＵＳ－Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬＬＣ，ＵＳ）を備えた恒温ブランケット（Ｒｏｔｈａｃｈｅｒ－スイス）上に置き、滅菌ガーゼで覆った。体温は、直腸プローブ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬＬＣ，ＵＳ）によって手術全体を通してモニターされ、体温が３６．５～３７．５℃となるように制御された。偽対照を含む全ての動物は、右腎臓の片側腎摘出術を受けた。正中切開／開腹術後、腹腔内容物を左に引っ込めて右腎臓を露出させた。右尿管と腎血管を切り離し、結紮した後、右腎臓を取り出した。ＡＫＩを経験した動物については、腹腔内容物を滅菌ガーゼの右側に配置し、左腎動脈及び静脈を切開して、虚血誘発のためのクランプを可能にした。腎茎をクランプする（１つのクランプを使用して動脈と静脈を一緒に）ために微小動脈瘤クランプ（Ｂ Ｂｒａｕｎ，スイス）を使用して、腎臓への血流を遮断し、腎虚血を誘発した。虚血の成功は、腎臓の色が赤から濃紫に変化することで確認され、これは数秒で発生した。虚血誘導（３５～３８分）の後、微小動脈瘤クランプを取り外した。腹腔内容物を洗浄するために温かい滅菌生理食塩水（約２ｍｌ、３７℃）を使用して、創傷の閉鎖前に組織を再水和させた。洗浄後、さらに１ｍｌの滅菌生理食塩水を補液として腹腔内に加えた。再灌流を開始するとき、創傷は２層（筋肉と皮膚を別個に）で閉鎖された。次に、動物は完全に回復するまで赤色の暖かいランプの下で維持された。ブプレノルフィンは、手術の１時間後及び４時間後に、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で再び投与され、飲用水（９．０９１μｇ／ｍＬ）にも含まれていた。２４時間後、分析のために動物を安楽死させた。治療用融合タンパク質ＦＰ１３５（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１；配列番号ｘ）は、ＡＫＩモデルで試験され、１．５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．で、虚血再灌流傷害の発症の３０分前に投与された。血清サンプルは、虚血再灌流誘導の２４時間後に採取され、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍ４０クリニックアナライザーを製造元の指示（Ａｘｏｎｌａｂ，スイス）に従って使用して、血清クレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）含有量について分析した。
実施例１２：ＥＧＦ＿ＨＳＡ＿Ｃ１は肝線維症モデル（ＣＣＬ４モデル）で保護する
肝線維症は、様々な種類の損傷に対する創傷治癒反応である。それが進行すると、肝硬変を引き起こし、その後、肝細胞癌（ＨＣＣ）を引き起こす可能性がある。先進国における肝線維症の一般的な原因は、アルコール乱用、ウイルス性肝炎感染、並びに肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病によるメタボリックシンドロームである。
長期損傷は、基本的に活性化された肝星状細胞（ＨＳＣ）である筋線維芽細胞様細胞による炎症及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の沈着を生じる。これらの細胞は、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）を産生し、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを沈着させ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を生成する。疾患が慢性化するにつれて、ＥＣＭの組成は、ＩＶ型及びＶＩ型のコラーゲン、糖タンパク質並びにプロテオグリカンから、Ｉ型及びＩＩＩ型のコラーゲン並びにフィブロネクチンに変化する。
損傷が重度でない場合、肝臓は再生することができ、それによって隣接する成体肝細胞がアポトーシス細胞又は壊死細胞を置換することができる。線維症の解消は、活性化されたＨＳＣがアポトーシスを起こすか、又はより静止した表現型に戻るときに起こる。
疾患の様々な側面を模倣しようとする利用可能ないくつかのインビボモデルがある。肝線維症モデルは、ヒト疾患の様々な病理学的及び分子的特徴を反映できる必要があり、設定が簡単且つ良い再現性を有する必要がある。化学物質誘発性線維症モデルは、これらの理想的な特性に最も近く、その１つがげっ歯類の四塩化炭素（ＣＣｌ４）肝線維症モデルである。このヘパトキシンの腹腔内注射を繰り返すと、肝線維症が発症し、ヒト肝線維症によく似ていることが示される。さらに、損傷原因の中止は線維症の解消をもたらし、したがって、モデルは可逆的である。
第１段階では、ＣＹＰ２Ｅ１酵素がＣＣｌ４を代謝してトリクロロメチルフリーラジカルを生成し、これは、脂質膜及び肝細胞の内部細胞小器官の損傷を特徴とする急性期反応に寄与し、最終的に壊死を引き起こす。次に、急性ＣＣｌ４媒介性肝線維症は、クッパー細胞の活性化及び炎症反応の誘発を特徴とし、サイトカイン、ケモカイン、その他の炎症誘発性因子の分泌を生じる。これにより、単球、好中球及びリンパ球が誘引され、活性化され、これは、肝壊死とそれに続く強力な再生反応に寄与し、その結果、最初のＣＣｌ４適用から約４８時間後に肝細胞と非実質肝細胞が実質的に増殖する。組織学的線維症及び瘢痕化線維は、２～３週間後の疾患の第２段階に現れる。広範な線維症及び大量の肝脂肪蓄積、並びにトリグリセリド及びＡＳＴの血清レベルの増加を伴う第３段階は、ＣＣｌ４損傷の４～６週間後に観察できる。マウスにおけるＣＣｌ４誘発性肝線維症の完全な解消は、通常、ＣＣｌ４毒素の除去後数週間以内に観察される。線維症の解消を促進する特性を有する薬物は、確立された疾患を有する患者にとって特に関連性があるであろう。例えば、線維症を確立したＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）慢性腎（ｋｉｄｅｎｙ）疾患又は強皮症の患者は、線維症の解消の実証が主要臨床エンドポイントになる可能性があり、疾患を止めるだけでなく臓器機能を回復することもできる可能性がある。（Ｙａｎｇｕａｓｅｔ ａｌ ２０１６ ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１６；９０：１０２５－１０４８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２０４－０１５－１５４３－４）
ＣＣＬ４肝線維症モデル：
疾患の誘発：
ＣＣｌ４は、オリーブオイルで新たに希釈した５００μｌ／ｋｇの用量で、８～１２週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに６週間、週に３回腹腔内注射した。オランダ）。肝線維症を誘発するために、ＣＣｌ４を合計６週間投与した。ＥＧＦ＿ＨＳＡ＿Ｃ１（ＦＰ１３５）による処置は、ＣＣＬ４処置の４週間後又は５週間後又は６週間後に開始された。ＥＧＦ＿ＨＳＡ＿Ｃ１（ＦＰ１３５）は、実験が終了するまで（ＣＣＬ４の中止から３日後）、０．８ｍｇ／ｋｇを週３回腹腔内投与した。
読み出し：
ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）などの肝酵素を、ＣＣＬ４の中止時（０日目）及び実験終了時の３日後に得られた血清サンプルの肝障害の評価として測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴは、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍ４０クリニックアナライザーを製造元の指示（Ａｘｏｎｌａｂ，スイス）に従って使用して分析した。
動物の肝臓中のコラーゲンの含有量を定量化するために、ヒドロキシプロリンアッセイを、総コラーゲンアッセイ（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オランダ）を使用して製造業者の指示に従って実施した。ｑＰＣＲによるコラーゲン遺伝子ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２の発現は、セクション９．３に記載されているように実施された。
ソノエラストグラフィーは、肝臓の弾力性（硬化度）を評価するための信頼性及び再現性のある非侵襲的方法として使用され、肝線維症と正の相関があることが示されている（Ｌｉ，Ｒ．，Ｒｅｎ，Ｘ．，Ｙａｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｇｉｎｇ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｔ１ρ ＭＲ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ２Ｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｈｅａｒ－ｗａｖｅ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｂｄｏｍ Ｒａｄｉｏｌ ４３，１７１３－１７２２（２０１８）。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２６１－０１７－１３８１－３）。さらに、この手法はクリニックで使用されており、前臨床データの結果を、線維症を有するヒト肝疾患により適切に変換するのに役立つ。肝臓の硬化度は、超音波ベースのせん断波エラストグラフィー（ＳＷＥ）評価を使用して決定された。ＳＷＥは、Ａｉｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）デバイス（ｄｅｖｉｃｅ（Ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ Ｉｍａｇｉｎｅ，Ａｉｘ－ｅｎ－Ｐｒｏｖｅｎｃｅ，フランス）を使用して実施された。取得のために、マウスをイソフルラン（約１．５％）で麻酔し、加熱パッド上に置いた。超音波プローブ（モデルＳＬ２５－１５、ＳｕｐｅｒＳｏｎｉｃ Ｉｍａｇｉｎｅ、帯域幅２５ＭＨｚ、エレメント数２５６）を支持体に取り付け、評価のために肝臓に近づけた。プローブは、Ｂモード及びＳＷＥの両方の取得のために波の十分な透過を可能にした。
呼吸による動きアーチファクトを最小限に抑えるために、呼息時にエラストグラムを取得した。マウス及び時点ごとに３つのエラストグラムが取得された。次に、３つのエラストグラムから平均剛性を抽出した。超音波検査はおよそ５分間続いた。
実施例１３ Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８（ＥＧＦ－Ｃ１）及びＨＳＡ融合（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１）の生成；発現及び精製。
本明細書に開示されるタンパク質 の生成方法を以下に説明する。
ＤＮＡはＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）で合成され、制限酵素ライゲーションベースのクローニング技術を使用して哺乳動物発現ベクターにクローニングされた。タンパク質の一過性発現のため、得られたプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、ベクターは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；カタログ番号２４７６５ Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、懸濁液適応ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。典型的には、１ｍｌあたり１～２Ｍｉｏ細胞の密度の懸濁液中の細胞１００ｍｌに、目的のタンパク質をコードする１００μｇの発現ベクターを含むＤＮＡをトランスフェクトした。次に、組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、０．１％のプルロニック酸、４ｍＭのグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌの抗生物質を補充した培地（ＨＥＫ、無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｅｅ）培地）への分泌を可能にするために細胞をさらに７日間培養することによって、構築物を産生した。
次に、産生された構築物を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）又は抗ＨＳＡ捕捉クロマトグラフィーを使用して、無細胞上清から精製した。
ｈｉｓタグ付きタンパク質がＩＭＡＣによって捕捉されたとき、ろ過された馴化培地は、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．５Ｍｎ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０で平衡化されたＩＭＡＣレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と混合された。タンパク質を１０カラム容量の溶出バッファー（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．５Ｍｎ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）で溶出する前に、樹脂を１５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．５Ｍｎ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０で３回洗浄した。
タンパク質を抗ＨＳＡクロマトグラフィーで捕捉した場合、ろ過した馴化培地を抗ＨＳＡレジン（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎアフィニティマトリックス、Ｔｈｅｒｍｏ）と混合し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した。タンパク質を１０カラム容量の溶出バッファー（５０ｍＭクエン酸塩、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で溶出する前に、樹脂を１５カラム容量のＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄し、１Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ１０．０を使用してｐＨを中和した。
最後に、溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、１６／６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して研磨した。
分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ３．２／３００ ＧＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）による精製プロセスで、凝集内容物をフォローした。
Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８及びＨＳＡ融合体の捕捉ステップ後の凝集レベル並びに精製後の発現収量を表１０に示す。Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８のＨＳＡ融合体は、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８よりも発現が少なくとも４０倍改善されていることを示す。さらに、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８のＨＳＡ融合体は、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８と比較して少なくとも４倍少ない凝集を示す。これらのデータは、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８のＨＳＡ融合体が、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８と比較して、より優れた産生特性を示すことを示唆している。結果として、ＨＳＡ融合は、薬剤としての使用につきより良い開発可能性を有しているようである。
Figure 2022547051000064
実施例１４：Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８（ＥＧＦ－Ｃ１）及びＨＳＡ融合（ＥＧＦ－ＨＳＡ－Ｃ１）の動的光散乱（ＤＬＳ）
Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８及びＨＳＡ融合体の凝集傾向は、動的光散乱法（ＤＬＳ，Ｗｙａｔｔ）によって測定された。動的光散乱を適用して、散乱光の動的変動を定量化することにより、溶液中のタンパク質の並進拡散係数を測定した。凝集形成の指標として、ＤｙｎａＰｒｏ（商標）プレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ，ドイツ）及びソフトウェアＤＹＮＡＭＩＣＳ（バージョン７．１．０．２５，Ｗｙａｔｔ）を組み合わせて使用して、３ｍｇ／ｍｌの濃度で熱応力を加えたときの流体力学的半径を測定した。タンパク質溶液を３８４ウェルプレート（３８４丸形ウェルプレート、ポリスチロール、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，ドイツ）で測定した。
図２３に示すように、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８は、ＨＳＡ融合体と比較して全体的に高い流体力学的半径を示す（２５℃で５ｎｍ対８０ｎｍ）。さらに、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８は、４５℃から始まる流体力学的半径の強い増加を示し、これは、強い凝集形成を示す一方、ＨＳＡ融合体は少なくとも５５℃まで同じ流体力学的半径を保持する。これらのデータは、Ｃ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８のＨＳＡ融合体がＣ２切断型ＭＦＧ－Ｅ８と比較してより安定しており、より優れた生物物理学的特性を示すことを示唆している。結果として、ＨＳＡ融合は、薬剤としての使用につきより良い開発可能性を有しているようである。
まとめると、これらのデータは、本開示の融合タンパク質（例えば、ＨＳＡドメイン挿入物を伴う）は、機能的且つ効果的であるため、治療薬としての使用に適している。
本明細書に記載される実施例及び実施形態は単に例示を目的とするものであり、その点を考慮した様々な修飾又は変更が当業者によって示唆されることになり、且つ本出願及び添付の特許請求の範囲の主旨及び範囲内に含まれるべきであることは理解されよう。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. 可溶化ドメインを含む治療用マルチドメイン融合タンパク質であって、前記可溶化ドメインが、前記マルチドメイン融合タンパク質の前記ドメインの間に位置する、治療用マルチドメイン融合タンパク質。
  2. 式Ａ－Ｓ－Ｂ（式Ｉ）の治療用マルチドメイン融合タンパク質であって、式中、
    （ｉ）Ａは、第１のドメイン、又は第１のドメインのセットであり、
    （ｉｉ）Ｓは、可溶化ドメインであり、
    （ｉｉｉ）Ｃは、第２のドメイン、又は第２のドメインのセットである、
    治療用マルチドメイン融合タンパク質。
  3. 前記可溶化ドメインが、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、又はその機能的変異体を含む、請求項１又は２に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  4. 前記可溶化ドメインが、ヒト血清アルブミン、又はその機能的変異体である、請求項３に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  5. 前記可溶化ドメインがＨＳＡ Ｄ３である、請求項４に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  6. 前記可溶化ドメインがＨＳＡであり、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  7. 前記可溶化ドメインが、前記第１のドメイン、前記第２のドメイン、又は両方のドメインに直接連結している、請求項１～６のいずれか一項に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  8. 前記可溶化ドメインが、リンカーによって前記第１のドメイン及び／又は前記第２のドメインに間接的に連結している、請求項１～７のいずれか一項に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  9. （ｉ）マルチドメインタンパク質の１つ以上のドメインを改変して所望の治療特性を有すること、及び（ｉｉ）治療用タンパク質のドメイン内に、アルブミン、例えば、ＨＳＡ又はその機能的変異体を挿入することによる、治療用マルチドメインタンパク質の製造のための方法。
  10. 前記可溶化ドメインがＨＳＡであり、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記可溶化ドメインが、前記第１のドメイン、前記第２のドメイン、又は両方のドメインに直接連結している、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 前記可溶化ドメインが、リンカーによって前記第１のドメイン及び／又は前記第２のドメインに間接的に連結している、請求項９又は１０に記載の方法。
  13. 前記治療用マルチドメインタンパク質が、請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用マルチドメインタンパク質である、請求項９に記載の方法。
  14. 薬剤としての使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載のマルチドメイン融合タンパク質。
  15. 薬剤の製造のための、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法によって得られるマルチドメイン融合タンパク質の使用。
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