CN114341195A - 治疗性融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适合用作药物或研究工具的融合蛋白。所述融合蛋白的治疗用途可包括预防或治疗急性或慢性炎性和免疫系统驱动的器官和微血管障碍，例如急性肾损伤、急性心肌梗塞、急性呼吸窘迫或慢性阻塞性肺病纤维化以及其他因组织创伤和急慢性损伤引起的器官损伤。

Description

治疗性融合蛋白
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且所述序列表通过引用以其整体特此并入。所述ASCII副本创建于2020年8月31日，名称为PAT058332_SL.txt并且大小为653,193字节。
技术领域
本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含整联蛋白结合能力和磷脂酰丝氨酸结合能力两者。所述融合蛋白可用作治疗剂，特别是用于预防或治疗急性或慢性炎性障碍以及免疫系统驱动的或凝血驱动的器官和微血管障碍。
背景技术
急性炎性器官损伤(AOI)从历史上讲是具有挑战性的疾病，其发病率高，死亡率高且医疗需求显著未得到满足。典型的AOI包括心肌梗塞(MI)和中风，全球每年在3240万患者中发生。先前患有MI和中风的患者被世界卫生组织视为发生进一步冠状动脉和脑事件的最高风险组，这些事件在发达国家中是发病率的排名靠前的原因之一。另一个AOI是急性肾损伤(AKI)，每年在约1330万人中发生。在高收入国家，AKI发生率是3-5/1000，并与高死亡率(14％-46％)相关(Metha等人,(2015)Lancet[柳叶刀],385(9987):2616-43)。与MI和中风相似，AKI幸存者通常无法完全康复，并且罹患慢性肾脏疾病或终末期肾脏疾病的风险增加。迄今为止，尚无FDA批准的药物可预防或治疗AKI。开发用于AKI的新治疗已被证明具有挑战性，到目前为止临床试验还没有成功的结果。这很可能是由于AKI的多因素和多方面的病理生理学，包括化脓、缺血/再灌注和/或肾毒性损伤引起的炎症、微血管功能障碍和肾毒性病理机理。这些驱动因子可以同时或连续地起作用，从而引起大部分肾小管还有肾小球细胞受损，肾功能储备丧失并最终导致肾衰竭。
AOI的一个常见共同特征是由于组织损伤引起的细胞死亡增加、细胞碎片的产生增加以及可以进入循环和受伤组织的促血栓形成性/促炎性微粒。在中性粒细胞组织浸润以抵抗感染后，中性粒细胞在受影响的组织中发生凋亡或其他形式的细胞死亡。中性粒细胞含有有害物质，包括蛋白水解酶和与危险相关的分子模式(DAMP)，所述DAMP可促进宿主组织损伤并传播炎症。有效摄取濒死的细胞会触发信号传导事件，所述事件导致巨噬细胞(MΦ)重新编程为非炎性促消退表型，并释放关键介质以成功消退和修复受影响的组织。该重编程最近已归因于代谢信号传导，所述代谢信号传导激活巨噬细胞中的吞噬抗炎应答(Zhang等人,(2019)Cell Metabolism[细胞代谢],29(2):443-56)。以非炎性的方式清除碎片或衰老或濒死的细胞称为“胞葬作用”。
然而，在延缓胞葬作用的情况下，坏死细胞会积聚并引起例如通过巨噬细胞触发促炎性细胞因子(TNF-α)或免疫抑制性IL-10的炎性应答(Greenlee-Wacker(2016)Immunol.Reviews[免疫学综述],273:357-370)。此外，如果未有效清除细胞碎片和微粒，它们会引起细胞团块和聚集，例如中性粒细胞-血小板碎片簇，微血栓和/或释放与危险相关的分子模式(DAMP)，例如ATP、DNA、组蛋白或HMGB1。后果可能包括微血管系统阻塞，功能障碍和明显的无菌性炎症，从而导致组织损伤、原发和继发器官衰竭或不利于适应的修复的进展。
在AOI的急性期，胞葬途径似乎显著下调。炎症或急性损伤应答(机械提示、缺氧、氧化应激、辐射、炎症和感染)可通过下调专门的磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白(其包括桥接蛋白和细胞表面胞葬作用/清除受体)来抑制有效的胞葬作用或吞噬作用。胞葬作用受体去功能化的一个实例是TAM家族受体例如Mer酪氨酸激酶(MerTK)的蛋白水解脱落。MerTK是优先在吞噬细胞上表达的完整膜蛋白，在吞噬细胞上它既是信号传导蛋白，又可以促进胞葬作用(通过诸如Gas6或蛋白S等蛋白)并抑制炎性信号传导。金属蛋白酶ADAM17诱导MerTK的可溶性胞外结构域的蛋白水解切割和释放。脱落过程可通过剥夺表面MerTK来减少吞噬细胞的胞葬作用。另外，释放的胞外结构域还可以在体外抑制胞葬作用(Zhang等人,(2015)JMol Cell Cardiol.[分子和细胞心脏病学杂志],87:171-9；Miller等人,(2017)ClinCancer Res.[临床癌症研究],23(3):623-629)。可溶性Mer量的增加典型地在炎性、恶性或自身免疫性疾病(例如糖尿病性肾病或系统性红斑狼疮(SLE))的血清/血浆中观察到，并且可以标记疾病严重程度(Ochodnicky P(2017)Am J Pathol.[美国病理学杂志],187(9):1971-1983；Wu等人,(2011)Arthritis Res Ther.[关节炎研究与治疗]13:R88)。此外，在大多数急性和慢性炎性疾病中，桥接蛋白(如乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFG-E8))也被下调。与可溶性Mer相似，MFG-E8的血清/血浆浓度降低可以在MI或稳定型心绞痛患者中发现(Dai等人,(2016)World J Cardiol.[心脏病学杂志],8(1):1-23)，并且按照针对慢性阻塞性肺病的描述来标记疾病(COPD；Zhang等人,(2015)同上)。
濒死细胞上磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露是对于免疫细胞进化上保守的抗炎和免疫抑制信号。大量的主要哺乳动物病原体利用PS介导的摄取作为毒性细胞感染的一部分(Birge等人,(2016)Cell Death Diff.[细胞死亡与分化],23(6):962-78)。例如，病毒可以直接或经由蛋白例如Gas6与PS结合受体结合(Morizono和Chen(2014)J Virol.[病毒学杂志],88(8):4275-90)。应答于损伤的内源清除途径的失活可能呈现进化发展的应答，从而降低感染原在损伤后进入和劫持细胞并由此掩盖宿主的免疫应答和防御的效率。因此，清除途径的下调将提高先天性和适应性免疫效应子抵抗感染的功效。作为“友好之火”的结果，在急性器官损伤期间，胞葬作用可能会暂时受到影响，并且可能发生AOI的上述并发症。濒死的细胞、碎片、促炎性和促血栓形成性MP的积累是AOI的标志并且是炎症和微血管损伤的主要诱因。值得注意的是，促炎性和促血栓形成性微粒的这种积累在具有高医疗需求的严重疾病中常见，并且可能助长其发病率。此类适应症的实例是败血症和癌症(Yang等人,(2016)Tumour Biol.[肿瘤生物学],37(6):7881-91；Zhao等人,(2016)J Exp Clin CancerRes.[实验与临床癌症研究杂志],35:54；Muhsin-Sharafaldine等人,(2017)BiochimBiophys Acta Gen Subj.[生物化学与生物物理学杂志],1861(2):286-295；Ma等人,(2017)Sci Rep.[科学报道],7(1):4978；Souza等人,(2015)Kidney Int.[肾脏国际版]87(6):1100-8)。在该领域中先前的药物发现努力集中在PS结合蛋白上，其可以用作候选药物设计的基础，如(Li等人,(2013)Exp Opin Ther Targets[治疗靶标专家观点],17(11):1275-1285)所述。
PS结合蛋白的子集还识别并结合整联蛋白，例如αvβ3和αvβ5，它们在包括吞噬细胞在内的许多细胞类型上表达。这些蛋白起到桥接PS的作用，使凋亡/濒死细胞暴露于整联蛋白，从而导致通过巨噬细胞和非专性吞噬细胞的胞葬作用(也称为吞噬作用)。在大多数急性和慢性炎性疾病中，一些桥接蛋白也被下调。先前已经提出了这种桥接蛋白或其截短形式的治疗用途(WO 2006122327(败血症)，WO 2009064448(缺血/再灌注后的器官损伤)，WO 2012149254(脑缺血)，费恩斯坦医学研究所(The Feinstein Institute for MedicalResearch)；WO 2015025959(心肌梗塞)九州大学和东京医科大学(Kyushu University&Tokyo Medical University)；WO 20150175512(骨吸收)宾夕法尼亚大学(University ofPennsylvania)；WO 2017018698(组织纤维化)高丽大学研究与商业基金会(KoreaUniversity Research and Business Foundation)和US 20180334486(组织纤维化)尼克森公司(Nexel Co.，Ltd.))；WO 2020084344；然而，野生型或天然存在的蛋白的用途受到许多问题的限制。例如，当在细胞表达系统中培养时，野生型MFG-E8(wtMFG-E8)被认为具有较差的可开发性、低溶解度并且以非常低的产率表达。Castellanos等人(2016)的工作表明，昆虫或CHO细胞中作为Fc-IgG融合蛋白表达的MFG-E8完全聚集，只能通过添加去污剂如Triton X-100或CHAPS才能被有效纯化(Castellanos等人,(2016)Protein Exp.Pur.[蛋白实验与纯化],124:10-22)。
迄今为止报道的MFG-E8的主要功能是增强胞葬作用(Hanayama2004Science[科学])，调节脂质摄取/加工(Nat Med.[自然医学]2014)。rMFG-E8通过促进肠细胞甘油三酸酯水解酶(TG)活性来调节肠细胞特异性脂质储存(JCI 2016)。细胞内MFG-E8被显示为肝脂质积累和炎症的阻遏子，其通过抑制ASK1-JNK/p38信号传导级联来起作用。(Zhang等人2020)。另外，已经针对MFG-E8描述了抗炎特性、促进血管生成、动脉粥样硬化、组织重塑和止血调节。此外，据报道MFG-E8通过其C1结构域结合胶原蛋白而去除了肺组织中过量的胶原蛋白。有趣的是，MFG-E8-/-巨噬细胞表现出胶原蛋白摄取缺陷，这可以通过含有至少一个网柄菌凝素结构域的重组MFG-E8来挽救(Atabai等人2009)。
在临床前研究中，重组MFG-E8在急性炎症和器官疾病的各种(主要是)啮齿动物模型以及愈合异常治疗的疾病模型中显示出令人信服的保护作用。重组MFG-E8已显示可加速糖尿病和I/R诱导的伤口/溃疡的伤口愈合(Uchiyama等人2015/2017)；结肠炎后肠上皮的修复加速(Bu等人2007)以及受伤后肌腱修复加速(Shi等2019)；重组MFG-E8减少了输尿管梗阻(UUO)模型中的肾脏损害和纤维化(Brisette等人2016)。此外，在典型的纤维化模型中证明了疗效，其中重组MFG-E8加速了TAA和CCl4诱导的肝纤维化的消退(An SY,Gastroenterology 2016)，并在博来霉素诱导的肺纤维化模型中保护(Atabai等人2009)。最近，发表了C2耗减的截短版本，以在包括TAA肝纤维化模型在内的几种临床前纤维化模型中发挥相似甚至更好的功效。(WO 2020084344)。
Hajishengallis和Chavakis 2019最近对EDIL3(含EGF样重复序列和网柄菌凝素I样域的蛋白3)进行了综述。EDIL3(别名DEL-1)已显示出介导胞葬作用，调节中性粒细胞募集和炎症，可以作为造血干细胞生境紧急骨髓生成(ɑvb3-整联蛋白依赖性)的一部分触发，限制破骨细胞生成并抑制啮齿类和非人灵长类动物的炎性骨损失。发现EDIL3是中枢神经系统免疫赦免的整体组分。EDIL3作为治疗性蛋白的潜力已作为与人IgG Fc片段(DEL-1-Fc)的融合蛋白进行了测试。在牙周炎的小鼠模型中，DEL-Fc的施用抑制了中性粒细胞浸润，阻断了IL-17驱动的炎性骨损失(Eskan等人2012doi:10.1038/ni.2260)。另外，在非人灵长类牙周炎模型中，DEL-1-Fc改善了牙周炎症、组织破坏和骨损失(Shin等人2015DOI:10.1126/scitranslmed.aac5380)。此外，DEL-1-Fc改善了复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，一种翻译性多发性硬化模型(Choi等人2014doi:10.1038/mp.2014.146)；此外，DEL-1-Fc还降低了小鼠模型(Fu等人2018)中术后腹腔粘连的发生率和严重程度。
通过桥接蛋白(例如MFG-E8、EDIL3、Gas6)去除濒死的细胞、碎片和微粒，可以消除无菌性炎症和微血管功能障碍的主要原因，并且从而防止组织损伤的进展并能够消退炎症。因此，在AOI过程中促进濒死细胞清除的治疗方法可用于减少或至少减轻AOI的病理学，并且在濒死细胞或暴露于PS的微粒清除不充分的其他疾病中可能有意义。因此，需要治疗剂，所述治疗剂可用于减少组织损伤和炎症并且具有期望的制造特性以解决AOI中未满足的医疗需求。
发明内容
在本披露中，申请人已经基于天然存在的桥接蛋白(例如MFG-E8)的结构产生了重组的治疗性融合蛋白，而没有上述不希望的性质和野生型蛋白的生产问题。本披露的融合蛋白包含整联蛋白结合结构域(例如，EGF样结构域)、增溶结构域和磷脂酰丝氨酸结合结构域(例如，来自MFG-E-8的C1结构域或其旁系同源物EDIL3)。本发明的蛋白适用于预防或治疗急性或慢性炎性、免疫系统驱动的或纤维化驱动的器官障碍。本发明的蛋白还可发现其实现、加速和促进修复和再生的应用。
融合蛋白例如通过起作用将暴露于PS的死亡细胞、碎片和微粒的桥接到吞噬细胞并且从而触发胞葬作用来维持野生型MFG-E8或EDIL3蛋白的主要生物学功能。另外，与野生型MFG-E8蛋白(SEQ ID NO:1)或与重组MFG-E8和C2截短的MFG-E8(EGF_C1)相比，本披露的治疗性融合蛋白具有改善的可开发性，特别是降低的粘性和改善的溶解性。此外，与野生型MFG-E8蛋白相比，这些治疗性融合蛋白在细胞表达系统中表达时具有更长的血浆暴露和更高的产率。根据本发明的治疗性融合蛋白具有增加的巨噬细胞选择性活性(胞葬作用增强)。此外，与全长野生型MFG-E8或其他全长功能变体相比，根据本发明的治疗性融合蛋白具有更高的安全性。
本文提供了用于增强胞葬作用的治疗性融合蛋白，其包含整联蛋白结合结构域、磷脂酰丝氨酸(PS)结合结构域和增溶结构域，其中所述PS结合结构域是表2中所列的至少一个PS结合结构域的截短的变体。
在一些实施例中，所述治疗性融合蛋白包含与增溶结构域的N末端连接的整联蛋白结合结构域的C末端和与PS结合结构域的连接的增溶结构域的C末端。在一些实施例中，所述治疗性融合蛋白包含一般结构EGF-S-C，其中EGF代表整联蛋白结合结构域，例如MFG-E8的、EDIL3的或包含表1中所列的整联蛋白结合结构域的任何其他蛋白的EGF样结构域；S表示增溶结构域；C表示截短的PS结合结构域，例如在MFG-E8、EDIL3或包含表2中所列PS结合结构域的C1和/或C2中任何的其他蛋白中发现的PS结合结构域的截短的变体。表3列出了包含整联蛋白结合结构域和PS结合结构域(例如MFG-E8(SEQ ID NO:1)和EDIL3(SEQ IDNO:11))两者的蛋白的实例。
在一些实施例中，所述PS结合结构域包含两个网柄菌凝素C1-C2亚结构域之一或其功能变体。在一些实施例中，所述人MFG-E8的PS结合结构域具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸或其截短的变体。在一个实施例中，截短的PS结合结构域包含人MFG-E8的截短的PS结合结构域或其功能变体，所述功能变体包含一、二、三、四、五、多达10个氨基酸修饰。在一个实施例中，PS结合结构域包含人EDIL3的截短的PS结合结构域或其功能变体，所述功能变体包含一、二、三、四、五、多达10个氨基酸修饰。
在某些方面，本文提供一种融合蛋白，其包含表皮生长因子(EGF)样结构域、增溶结构域、C1结构域，但缺乏功能性C2结构域。在一些实施例中，所述融合蛋白包含表皮生长因子(EGF)样结构域、增溶结构域、C1结构域，但是缺乏中介素(medin)多肽或其片段。
在一些实施例中，所述融合蛋白的增溶结构域连接至整联蛋白结合结构域。在一些实施例中，增溶结构域连接至PS结合结构域。在一些实施例中，增溶结构域与整联蛋白结合结构域和PS结合结构域两者连接，即位于整联蛋白结合结构域和PS结合结构域之间。在一些实施例中，增溶结构域插入整联蛋白结合结构域内或插入PS结合结构域内。在一个实施例中，所述治疗性融合蛋白具有结构，所述结构从N末端至C末端是：整联蛋白结合结构域-增溶结构域-PS结合结构域。
在一些实施例中，所述治疗性融合蛋白的整联蛋白结合结构域包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)结合基序，并与αvβ3和/或αvβ5或α8β1整联蛋白结合。
在一些实施例中，所述治疗性融合蛋白的增溶结构域直接连接至整联蛋白结合结构域和/或连接至PS结合结构域，即插入所述结构域之间。在可替代实施例中，所述增溶结构域通过接头例如外部接头间接连接至整联蛋白结合结构域和/或PS结合结构域。在一些实施例中，增溶结构域包含人血清白蛋白(HSA)、HSA的结构域3(HSA D3)或IgG的Fc区(Fc-IgG)或其功能变体。
在一些实施例中，整联蛋白结合结构域是EGF样结构域(所述EGF样结构域例如具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸)或其截短的变体。在一个实施例中，EGF样结构域包含人MFG-E8的EGF样结构域或其功能变体，所述功能变体包含一、二、三、四、五、多达10个氨基酸修饰。在一个实施例中，EGF样结构域包含人EDIL3的EGF样结构域或其功能变体，所述功能变体包含一、二、三、四、五、多达10个氨基酸修饰。
在一些实施例中，增溶结构域是HSA或其功能变体(例如，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸)或其截短的变体。在一个实施例中，HSA包含氨基酸取代C34S(其具有降低蛋白聚集倾向的功能)并具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一些实施例中，增溶结构域包含人血清白蛋白(HSA)或其功能变体(所述功能变体包含一、二、三、四、五、多达10个氨基酸修饰，例如HSA C34S)或HSA的截短的变体(例如，HSA的结构域3(HSA D3))或所述截短的变体的功能变体。在一个优选的实施例中，增溶结构域是HSA C34S。
在可替代实施例中，增溶结构域包含IgG的Fc区(Fc-IgG)(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区)或其功能变体。在一个实施例中，增溶结构域包含人Fc-IgG1的Fc区(具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸)或其截短的变体。在一个实施例中，Fc-IgG1包含氨基酸取代D265A和P329A以降低Fc效应子功能，并具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在另一个实施例中，Fc-IgG1包含氨基酸取代T366W以产生“杵”，或者它可以包含氨基酸取代T366S、L368A、Y407V以产生“臼”。另外，Fc-IgG1杵可包含氨基酸取代S354C，并且Fc-IgG1臼可包含氨基酸取代Y349C，从而在配对时形成半胱氨酸桥。除杵臼修饰外，Fc-IgG1还可以包含D265A和P329A取代以降低Fc效应子功能。在一个实施例中，Fc-IgG1具有SEQ IDNO:9或10所示的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，治疗性融合蛋白包含乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFG-E8)和增溶结构域，其中MFG-E8包含整联蛋白结合性EGF样结构域(SEQ ID NO:2)和磷脂酰丝氨酸结合性C1-C2结构域(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:76)的功能变体。MFG-E8可包含天然存在的或野生型的人MFG-E8(SEQ ID NO:1)、或具有SEQ ID NO:75的MFGE-8、或其功能变体。在一个实施例中，增溶结构域连接至MFG-E8的N或C末端。在一个实施例中，增溶结构域插入在EGF样结构域和C1结构域之间或在EGF样结构域和C2结构域之间。在一个优选的实施例中，增溶结构域连接至EGF样结构域的C末端，并连接至C1结构域的N末端。增溶结构域可以直接或间接连接至EGF样结构域的C末端，并且直接或间接连接至C1结构域的N末端。在一些实施例中，间接连接是借助于外部接头，例如基于甘氨酸-丝氨酸的接头。
在一些实施例中，并且如在实例部分中所述，本披露的治疗性融合蛋白的功能是在人内皮细胞-Jurkat细胞胞葬作用测定中促进内皮细胞的胞葬作用，并在人巨噬细胞-中性粒细胞胞葬作用测定中恢复巨噬细胞的受损的胞葬作用和增强基础的胞葬作用；融合蛋白的功能是在人内皮细胞微粒胞葬作用测定中通过清除而减少血浆微粒的数量；和/或融合蛋白在急性肾缺血模型中提供针对多器官损伤的保护。
本文还披露了利用或包含这些治疗性融合蛋白的方法、用途、诊断试剂、药物组合物和试剂盒。本文还提供了编码所披露的融合蛋白的核酸，包含此类核酸的克隆和表达载体，包含此类核酸的宿主细胞以及通过培养此类宿主细胞产生所披露的融合蛋白的方法。
附图说明
图1显示了本披露的治疗性融合蛋白的实例的示意图。增溶结构域(标记为‘SD’)连接在MFG-E8的C末端、N末端或EGF、C1或C2结构域之间。
图2显示了在HEK细胞中表达的融合蛋白的许多SDS-PAGE蛋白凝胶。图2A：EGF-HSA-C1-C2蛋白(FP330；SEQ ID NO:42)；图2B：EDIL3蛋白的EGF-HSA-C1-C2(FP050；SEQ IDNO:12)；图2C：未还原和还原的EGF-Fc(KiH)C1-C2蛋白(此蛋白是FP071(EGF-Fc(杵)-C1-C2；SEQ ID NO:18)与Fc-IgG1臼(SEQ ID NO:10)的异二聚体；图2D：EGF-HSA-C1蛋白(FP260；SEQ ID NO:34)。对于图2A、2C和2D中的每一个，第一列显示Precision Plus蛋白未染色的标准标志物，并且第二列显示各自的融合蛋白。对于图2B，第一列显示融合蛋白，并且第二列显示Precision Plus蛋白未染色的标准标志物。图2E显示了已经产生和纯化的其他重组蛋白。
图3示例了在实际操作期间野生型(wt)MFG-E8相比于融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)蛋白的损失的影响。图3A显示了与在非结合板中制备的稀释液(符号：●)相比，当在聚丙烯板中制备蛋白稀释液(符号：□)时，L-α-磷脂酰丝氨酸竞争测定中wtMFG-E8的功效的损失。相反，图3B显示，在PS竞争测定中，当在聚丙烯板中(符号：□)相比于在非结合板中(符号：●)制备蛋白稀释液时，融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)的功效几乎没有损失。
图4显示融合蛋白与L-α-磷脂酰丝氨酸的结合。图4A显示了FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)以浓度依赖性的方式与固定化的L-α-磷脂酰丝氨酸的结合，以及与磷脂心磷脂的程度更弱的结合。图4B显示了人wtMFG-E8与许多治疗性融合蛋白以浓度依赖性方式以竞争测定形式(生物素化的小鼠wtMFG-E8与L-α-磷脂酰丝氨酸结合的竞争)与固定化的L-α-磷脂酰丝氨酸的结合，所述治疗性融合蛋白是：FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)、FP250(EGF-HSA；SEQ ID NO:32)、FP260(EGF-HSA-C1；SEQ ID NO:34)和FP270(EGF-HSA-C2；SEQ ID NO:36)。
图5显示对融合蛋白的αv-整联蛋白依赖性细胞粘附。图5A显示αv整联蛋白抑制剂西仑吉肽或10mM EDTA完全阻断了细胞对FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42)的粘附。如图5B所示，EGF样结构域(FP280；SEQ ID NO:38)的整联蛋白结合基序RGD(RGD>RGE)中的单点突变导致细胞粘附的完全消除。图5C显示尽管有EGF样结构域，但固定化的EGF-HSA蛋白(FP250；SEQ ID NO:32)不支持或仅适度支持BW5147.G.1.4细胞的粘附。如图5D所示，当在CHO细胞或HEK细胞中表达时，本披露的融合蛋白(FP330；SEQ ID NO:42)促进类似于wtMFG-E8的αv-整联蛋白依赖性细胞粘附。
图6显示了治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)在促进人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的胞葬作用方面的作用。融合蛋白的浓度显示在x轴上，并且胞葬作用[％]显示在y轴上。
图7显示了治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)可以挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的被内毒素(脂多糖)损害的胞葬作用。图7A显示了在三个人供体中，通过100pg/ml的脂多糖(LPS)损害巨噬细胞对濒死的人中性粒细胞的胞葬作用。左分图显示了单个供体的应答，右分图显示了三个供体的平均胞葬作用(％)。图7B显示了在治疗性融合蛋白FP278的存在下，人巨噬细胞对濒死的中性粒细胞的这种被内毒素(LPS)损害的胞葬作用的挽救。将3个不同的人巨噬细胞供体的胞葬作用指标标准化并绘制为胞葬作用(％)。
图8显示了用治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)，对人巨噬细胞对濒死的中性粒细胞的胞葬作用的金黄色葡萄球菌(S.aureus)颗粒诱导的损害的挽救。图8A显示了浓度为100nM的FP278在促进胞葬作用方面的超过基础水平的作用(虚线；图的左手部分)，以及100nM的FP278在挽救由施用金黄色葡萄球菌引起的胞葬作用受损方面的作用(图的右手部分)。图8B显示了增加融合蛋白FP278(EC50 8nM)的浓度对挽救因施用金黄色葡萄球菌而引起的受损胞葬作用的作用，以及一旦达到胞葬作用的基本水平对促进胞葬作用的作用。
图9显示了治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)在促进人内皮细胞(HUVEC)对濒死嗜Jurkat细胞的胞葬作用方面的作用。融合蛋白在内皮细胞胞葬测定中的效率取决于C1-C2或C1-C1串联结构域的存在，因为如图9所示，具有结构EGF-HSA-C2的融合蛋白(FP270；SEQ ID NO：36)在该测定中无效。
图10显示了HSA结构域在治疗性融合蛋白中的位置(即在N或C末端位置(分别为FP220(HSA-EGF-C1-C2；SEQ ID NO:30)或FP110(EGF-C1-C2-HSA；SEQ ID NO:28))在巨噬细胞胞葬作用测定中赋予MFG-E8 HSA融合蛋白以胞葬作用阻断功能。融合蛋白的浓度显示在x轴上，胞葬作用[％]显示在y轴上。
图11显示了通过各种形式的包含HSA或Fc部分的治疗性融合蛋白促进胞葬作用的比较。融合蛋白的浓度(nM)显示在x轴上，胞葬作用[MFI]显示在y轴上。图11A显示了包含HSA(其中HSA位于C末端或N末端或在EGF样结构域和C1结构域之间)的融合蛋白的比较；分别是FP110(EGF-C1-C2-HSA；SEQ ID NO:28)，FP220(HSA-EGF-C1-C2；SEQ ID NO:30)和FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)。图11B显示了包含Fc部分(其中Fc位于C末端(FP060(EGF-C1-C2-Fc[S354C,T366W]；SEQ ID NO:14)和FP080(EGF-C1-C2-Fc；SEQ IDNO:22))或位于EGF样结构域和C1结构域之间(FP070(EGF-Fc-C1-C2；SEQ ID NO:16))的融合蛋白的比较，其中与野生型MFG-EG(SEQ ID NO:1)对比。显示了Fc部分的两种形式：野生型Fc(FP080；SEQ ID NO:22)和具有S354C和T366W修饰的Fc部分(EU编号；FP060；SEQ IDNO:14)。图11C显示了融合蛋白FP090(Fc-EGF-C1-C2；SEQ ID NO:24)的以三种不同浓度(0.72、7.2和72nM)的三个批次的比较，所述融合蛋白包含位于N末端的Fc部分，其中与wt-MFG-E8对照对比。图11D显示通过融合蛋白构建体FP050促进胞葬作用，所述融合蛋白构建体FP050包含插入在EDIL3(基于EDIL3的EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:12)的EGF样结构域和C1-C2结构域之间的HSA。图11E显示了本披露的融合蛋白的其他实例，例如嵌合变体(FP114或FP260；SEQ ID NO:34，FP147或FP1777；SEQ ID NO:71，FP1149、FP1150、FP145；SEQ IDNO:80，FP1145；SEQ ID NO:103，FP146；SEQ ID NO:82，FP1146)以及MFGE8或EDIL3的整联蛋白结合结构域与PS结合结构域例如TIM4的IgSF V结构域或桥接蛋白GAS6的GLA结构域的组合(FP1147和FP1148)。
图12显示了在3种不同浓度(高达30nM)下测试的治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)对HUVEC细胞的胞葬作用的促进。胞葬作用的促进是浓度的依赖性的，其中胞葬作用随着融合蛋白FP278浓度的增加而增加。
图13显示了治疗性融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42；图13A)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44；图13B)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:48；图13C)可以挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的被内毒素(脂多糖)损害的胞葬作用。融合蛋白的浓度显示在x轴上，胞葬作用[％]显示在y轴上。
图14显示了融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42；图14A)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44；图14B)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:48；图14C)在促进人内皮细胞(HUVEC)对濒死Jurkat细胞的胞葬作用方面的作用。融合蛋白的浓度显示在x轴上，胞葬作用[％]显示在y轴上。
图15显示了单剂量的治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ IDNO:44)、FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42)或FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:48)在缺血-再灌注损伤诱导的急性肾损伤(AKI)模型中保护肾功能。图15A显示通过腹膜内(i.p.)施用0.16mg/kg或0.5mg/kg的FP278(SEQ ID NO:44)(x轴)，血清肌酐(sCr)的升高(mg/dL；y轴)被减少。如图15B所示，静脉内(i.v.)施用0.5mg/kg或1.5mg/kg的融合蛋白FP330(SEQ ID NO:42)显著降低了血清肌酐水平。图15C显示了融合蛋白FP776(SEQ ID NO:48)的i.v.施用以剂量依赖性方式降低了血清肌酐。
图16显示了0.16mg/kg或0.5mg/kg的单剂量治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)降低了急性肾损伤的鼠模型中血尿素氮(BUN)水平。
图17显示了基于损伤标志物的基因表达，单剂量治疗性融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)可保护远处器官免受缺血再灌注诱导的AKI引起的急性期应答。图17A示例了鼠心脏中的这种AKI诱导的血清淀粉样蛋白(SAA)应答，图17B示例了鼠肺中的这种AKI诱导的应答(SAA)，二者单次腹膜内注射0.16mg/kg或0.5mg/kg/i.p.的MFG-E8衍生的融合蛋白FP278(SEQ ID NO:44)后都被有力地阻断。
图18显示了随着时间的推移，肝对超顺磁性氧化铁(SPIO)造影剂
Figure BDA0003527831370000151
的摄取。(诱导疾病后24小时)或进行假手术后(肾切除术后24h的动物)将
Figure BDA0003527831370000152
推注1.2s静脉注射到患有AKI的动物中。与假手术动物相比，患有AKI的动物显示肝对造影剂的摄取显著降低(靶＝枯否细胞)。治疗(在AKI诱导前-30分钟预防性给予或在缺血再灌注损伤诱导后+5小时治疗性给予融合蛋白FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:48))保护AKI小鼠肝中造影剂积累免受损失。
图19如实例中所述在AKI模型中以1.5mg/kg/i.v测试治疗性融合蛋白FP114，在本文中也称为FP260(EGF-HSA-C1 SEQ ID No:34)。对于该研究，在缺血再灌注损伤发作前30分钟施用FP114。疾病诱导后24小时评估血清标志物和肾脏重量。血清肌酐和BUN降低以及正常肾脏重量表明该模型中针对AKI的保护。
图20在CCL4纤维化模型中以0.8mg/kg/i.p测试了治疗性融合蛋白FP135，在本文中也称为FP261(EGF-HSA-C1 SEQ ID No:73)。在纤维化诱导(用CCL4)4周后(共11个剂量)或在纤维化诱导(用CCL4)5周后(共8个剂量)(其中施用3个每周剂量)开始治疗。在疾病诱导停止6周后，给第三组动物施用CCL4(共4个剂量)。在所有组中，FP135在最近三天内每天给药一次。在停止CCL4时的基线(实验开始时)时和停止CCL4后3天评估肝硬度。数据表明，在用FP135治疗的动物中(从CCl4的第4周和第5周后开始)，可以达到CCL4诱导的肝脏硬度的加速消退。
图21.图21A在CCL4纤维化模型中以0.8mg/kg/i.p测试了治疗性融合蛋白FP135(EGF-HSA-C1 SEQ ID No:73)。在纤维化诱导(用CCL4)4周后(共11个剂量)或在纤维化诱导(用CCL4)5周后(共8个剂量)(其中施用3个每周剂量)或停止用CCL4(共4个剂量)诱导疾病6周后开始治疗。在所有组中，FP135在最近三天内每天给药一次。血清ALT的降低表明，在CCl4的第4周和第5周开始治疗的组中，FP135治疗有助于加速CCL4引起的肝损伤的消退。
图21B在CCL4纤维化模型中以0.8mg/kg/i.p测试了治疗性融合蛋白FP135(EGF-HSA-C1 SEQ ID No：73)，如图21A所述。通过羟脯氨酸测定法定量处死动物肝脏中的胶原蛋白含量。在8和11倍剂量的动物中观察到的减少表明FP135的治疗有助于加速CCL4引起的肝纤维化的消退。
图21C在CCL4纤维化模型中以0.8mg/kg/i.p测试了治疗性融合蛋白FP135(EGF-HSA-C1 SEQ ID No:73)，如图21A所述。通过羟脯氨酸测定法定量处死动物肝脏中的胶原蛋白表达。在8和11倍剂量的动物中观察到的减少表明FP135的治疗有助于加速CCL4引起的肝纤维化的消退。
图22显示了截短的蛋白FP137、FP135和FP147的部分的整联蛋白粘附数据。
图23显示了C2截短的MFG-E8(EGF-C1；SEQ ID NO:115)和HSA融合体(EGF-HSA-C1；SEQ ID NO:73)的动态光散射(DLS)。
具体实施方式
本文披露了包含整联蛋白结合结构域、PS结合结构域和增溶结构域的治疗性融合蛋白。本文还披露了使用本披露的融合蛋白的治疗方法以及可用于表征融合蛋白的测定，例如胞葬作用测定。
定义
为了可以更容易地理解本披露，在整个具体实施方式中具体定义了某些术语。除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
在提及序列(例如，氨基酸序列)时使用术语‘包含(comprise、comprises、comprising)’等的所有情况下，应理解所述序列也可受术语‘由……组成(consist、consists、consisting)’等限制。如本文所用，短语‘基本上由……组成’是指方法或组合物中所包括的活性药剂以及对所述方法或组合物的预期目的无活性的任何赋形剂的类属或种类。在一些方面，短语‘基本上由……组成’明确地排除了包括除本披露内容的多特异性结合分子以外的一种或多种另外的活性剂。在一些方面，短语‘基本上由……组成’明确排除了包括除本披露内容的多特异性结合分子和第二共同施用药剂以外的一种或多种另外的活性剂。
如本文所用，术语“胞葬作用”是指细胞生物学中的过程，其中濒死或死亡的细胞，例如凋亡或坏死或衰老的细胞或高度活化的细胞或细胞外囊泡(微粒)或细胞碎片-统称为“猎物”-通过吞噬作用除去，即被吞噬细胞吞噬并消化。在胞葬作用过程中，吞噬细胞主动栓系并吞噬猎物，生成含有猎物的细胞内大的充满流体的囊泡，称为胞葬体(efferosome)，产生溶酶体区室，在其中开始猎物的降解。在细胞凋亡过程中，胞葬作用确保了濒死细胞在其膜完整性受到损害并且其内容物可能泄漏到周围组织中之前已被除去，从而防止了周围组织暴露于DAMP(例如毒性酶、氧化剂和其他细胞内组分，例如DNA、组蛋白和蛋白酶)。专性吞噬细胞包括髓系来源的细胞，例如巨噬细胞和树突细胞，但其他例如基质细胞也可以进行胞葬作用，例如上皮和内皮细胞以及成纤维细胞。受损的胞葬作用已经与自身免疫性疾病和组织损伤联系，并且已在诸如囊性纤维化、支气管扩张、COPD、哮喘、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎和动脉粥样硬化等疾病中得到证实(Vandivier RW等人(2006)Chest[胸],129(6):1673-82)。迄今为止，还没有专门用于促进胞葬作用的疗法进入临床。
如本文所用和如实例中所述的术语‘胞葬作用测定’涉及针对融合蛋白的谱分析而开发的测试系统，其利用人巨噬细胞或作为吞噬细胞的人内皮细胞(HUVEC)。本文示例了巨噬细胞-中性粒细胞胞葬作用测定，内皮细胞-Jurkat细胞胞葬作用测定或内皮细胞微粒胞葬作用测定。如实例中更详细描述的，这些测定可用于证明MFG-E8衍生的生物治疗剂，例如本披露的融合蛋白，有效地促进巨噬细胞或内皮细胞对濒死细胞和微粒的胞葬作用。此外，所描述的巨噬细胞-中性粒细胞测定适合于证明本发明的此类化合物甚至可以挽救对濒死细胞的LPS或金黄色葡萄球菌损害的胞葬作用。
所述术语‘多肽’和‘蛋白’在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述短语还适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指示，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体。
如本文关于本披露的蛋白所使用的术语‘粘性’是指蛋白错误折叠的结果，其促进蛋白凝结或聚集。这些不希望的和非功能性的影响是表面疏水相互作用的结果。
如本文所用，‘C末端’是指具有游离羧基(-COOH)的多肽链的羧基末端氨基酸。如本文所用，‘N末端’是指具有游离胺基(-NH2)的多肽链的氨基末端氨基酸。
如本文所用，术语‘融合蛋白’是指包含多个结构域的蛋白，所述多个结构域可能不构成完整的天然或野生型蛋白，但可能限于完整蛋白的负责结合至细胞表面上相应受体的活性结构域。可以使用重组蛋白设计来生成融合蛋白，其中术语‘重组蛋白’是指已经通过重组DNA技术手段制备、表达、创建或分离的蛋白。例如，串联融合是指通过蛋白之间的N或C末端的融合简单地将目的蛋白或目的蛋白的结构域末端对末端连接的技术。这提供了灵活的桥结构，从而在融合伴侣之间留出足够的空间以确保正确折叠。然而，肽的N或C末端通常是获得重组蛋白期望的折叠模式的关键组分，其结果是结构域的简单的末端对末端连接可能是无效的。可替代地，结构域插入的过程涉及通过将期望的结构编码成单个多肽链并且有时将结构域插入另一结构域内来融合连续的蛋白结构域。在上述这两个过程中，结构域都是‘直接连接’或‘直接地连接’。由于难以在目的基因中找到合适的连接位点，所以结构域插入通常比串联融合更难进行。
除了上述直接连接的融合技术之外，可以使用外部接头来维持融合蛋白中蛋白结构域的功能。这样的接头是指将蛋白结构域连接到另一个蛋白结构域的一段氨基酸，并且在本文中被称为“间接接头”。因此，这些结构域是“间接连接”或“间接地连接”。例如，本领域普通技术人员理解，结构包括两个或更多个功能或组织结构域的多肽通常在这些结构域之间包括将它们彼此连接的一段氨基酸。接头允许结构域相互作用，增强稳定性并可以减少空间位阻，即使N和C末端可以融合，这也常常使它们成为工程改造蛋白设计中使用的优选。在一些实施例中，接头的特征在于它倾向于不采用刚性的三维结构，而是为多肽提供柔性。各种类型的天然存在的接头已用于工程改造的蛋白中，例如免疫球蛋白铰链区，其在许多重组治疗性蛋白中，特别是在工程改造的抗体构建体中用作接头(Pack P等人,(1995)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],246:28-34)。除天然接头外，还已经设计了许多人工接头，可将其细分为三类：柔性、刚性和体内可切割的接头。(Yu K等人,(2015)Biotech.Advances[生物技术进展],33(1):155-64；Chen X等人,(2013)Ad.Drug Delivery Reviews[药物递送进展综述],65(10):1357-69)。使用最广泛的柔性接头序列是(Gly)n(Sabourin等人,(2007)Yeast[酵母],24:39-45)和(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:64)(Huston等人,1988,85:5879-83)，其中可以通过拷贝数n调整接头长度。在一些实施例中，包含接头元件的多肽具有总体形式D1-接头-D2的整体结构，其中D1和D2可以相同或不同，并且代表通过接头彼此缔合的两个结构域。在一些实施例中，多肽接头的长度是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸。
如本文所用的氨基酸残基/位置的‘修饰’或‘突变’是指与起始氨基酸序列相比，一级氨基酸序列的变化，其中所述变化是由涉及所述氨基酸残基/位置的序列变化引起的。例如，典型的修饰包括用另一个氨基酸取代残基(或在所述位置取代)(例如，保守或非保守取代)，在所述残基/位置附近插入一个或多个氨基酸，以及缺失所述残基/位置。氨基酸‘取代’或其变化形式是指用不同的氨基酸残基置换预定(起始)氨基酸序列中的现有氨基酸残基。通常且优选地，与包含起始(或‘野生型’)氨基酸序列的多肽相比，修饰使变体多肽的至少一种物理生物化学活性改变。
术语‘经保守修饰的变体’适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定核酸序列，经保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述的相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是‘沉默变异’，其是经保守修饰的变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能性沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG)均可以经修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每种沉默变异。
对于多肽序列，‘经保守修饰的变体’包括对多肽序列的单个取代、缺失或添加，从而使某个氨基酸取代为化学上类似的氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域中已知的。此类经保守修饰的变体是对多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。以下八组含有互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。在一些实施例中，短语‘保守序列修饰’用于指如下氨基酸修饰，其不显著影响或改变本披露的工程改造的蛋白的结合结构域的结合特征。
本文所指的‘蛋白变体’或‘蛋白的变体’涉及包含变异的蛋白，在所述变异中一个或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸已被修饰。本文所指的蛋白的‘功能变体’涉及蛋白变体，所述蛋白变体包含导致氨基酸序列改变但蛋白的整体性质或其功能没有改变的修饰。本文所指的蛋白的或蛋白的结构域的‘截短的变体’涉及蛋白的或蛋白的结构域的缩短形式，但是蛋白的缩短形式保留了亲本蛋白的功能。为了确定功能变体或截短的变体在总体特性或功能上是否没有变化，可以如本披露中所述在许多os测定中针对全长或未经修饰的亲本蛋白测试这些变体蛋白的作用。例如，在人内皮细胞-Jurkat细胞胞葬作用测定中促进内皮细胞的胞葬作用，在人巨噬细胞-中性粒细胞胞葬作用测定中恢复巨噬细胞的受损的胞葬作用，在人内皮细胞-微粒胞葬作用测定中通过清除而减少血浆微粒的数量，和/或在急性肾缺血模型中提供针对多器官损伤的保护。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语‘同一性百分比’或‘序列同一性百分比’是指两个或更多个相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以在例如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量时获得最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或在没有规定时在整个序列上，至少60％同一性，任选地至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，则这两个序列是‘基本上相同的’并且显示‘序列同一性’。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或存在于长度为100至500或1000，或2000或3000或更多个核苷酸的区域上，或可替代地存在于长度为30至200或300或500或700或800或900或1000或更多个氨基酸的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的术语“比较窗口”包括提及区段，所述区段具有选自包含20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的组的连续核酸或氨基酸位置数量中的任一个，其中可以将序列与具有相同数量连续位置的参考序列在两个序列最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域中已知的。例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学期刊],48:443的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman(1988)PNAS USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法研究，通过这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或通过手动比对和目测检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南])，可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究],.25:3389-3402；和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。
该BLAST算法还对两个序列之间的相似度进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)PNAS.USA[美国国家科学院院刊],90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，所述最小总和概率提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01、最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17(1988))的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com上可获得)中的GAP程序中的Needleman&Wunsch(同上)算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及缺口权重为16、14、12、10、8、6或4和长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。
多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其补体在严格条件下彼此杂交。
术语‘核酸’与术语‘多核苷酸’在本文中可互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选(或全部)密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究],19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J Biol Chem.[生物化学杂志],260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol Cell Probes[分子与细胞探针],8:91-98)。如本文所用，术语‘优化的核苷酸序列’意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))中优选的密码子编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列工程改造以完全保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述起始核苷酸序列也称为‘亲本’序列。在特定的实施例中，本文优化的序列已被工程改造以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子。
治疗性融合蛋白
整联蛋白结合结构域
整联蛋白是促进细胞-细胞外基质(ECM)粘附的跨膜受体。配体结合后，整联蛋白激活介导细胞信号的信号转导途径，例如细胞周期的调节、细胞内细胞骨架的组织以及新受体向细胞膜的移动(Giancotti&Ruoslahti(1999)Science[科学],285(5430):1028-32)。整联蛋白的存在允许对细胞表面的事件做出快速而灵活的应答。存在多种类型的整联蛋白，并且一个细胞在其表面上可能具有多种不同类型。整联蛋白具有两个亚基：α(alpha)和β(beta)，其各自穿透质膜并具有几个胞质结构域(Nermut MV等人(1988).EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],7(13):4093-9)。许多ECM蛋白的整联蛋白相互作用位点的酸性氨基酸特征，例如作为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(单字母氨基酸代码为‘RGD’)的一部分。RGD基序已发现于众多基质蛋白(例如纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白和骨桥蛋白)中，并有助于细胞粘附。RGD基序发现于许多蛋白中的称为EGF样结构域的保守蛋白结构域中，所述结构域的名称源于最初描述其的表皮生长因子。EGF样结构域是细胞外蛋白中最常见的结构域之一(Hidai C(2018)开放可得的J Trans Med Res.[转化医学研究杂志],2(2):67-71)以及一些包含RGD结合基序的EGF样结构域的实例在下表1中列出。
表1：包含含有RGD整联蛋白结合基序的EGF样结构域蛋白的蛋白的实例
Figure BDA0003527831370000251
如本文所用，术语“整联蛋白结合结构域”是指具有与整联蛋白结合的功能的一段氨基酸或蛋白结构域。在本披露的一个实施例中，如本文所用，‘整联蛋白结合结构域’是指具有与整联蛋白结合的功能并且含有RGD基序的一段氨基酸或蛋白结构域。在本披露的一个实施例中，整联蛋白结合结构域是来自具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的人MFG-E8的EGF样结构域。在本披露的可替代实施例中，整联蛋白结合结构域是来自人EDIL3(以下序列中的任何一个：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101)的EGF样结构域；例如，其中可以在SEQID NO:11的氨基酸1-132的区段中找到EGF样结构域。
如本文所用，术语‘与整联蛋白结合’是指整联蛋白结合活性。整联蛋白结合活性可以通过本领域众所周知的方法确定。例如，在实例的第3.2节中描述了整联蛋白粘附测定，其中确定了表达荧光标记的αvβ3整联蛋白的淋巴瘤细胞对本披露的治疗性融合蛋白的粘附。如果整联蛋白结合结构域具有对人MFG-E8蛋白(SEQ ID NO:1)观察到的整联蛋白结合活性的至少10％，例如至少25％、至少50％、至少75％、更优选至少80％、例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，则所述整联蛋白结合结构域被认为具有整联蛋白结合活性(这是当用相同的方法测定各自的活性时，优选是当用第3.2节的实例中所述的测定来测试时)。
磷脂酰丝氨酸结合结构域
如本文所用，‘磷脂酰丝氨酸’(PS)涉及作为细胞膜的组分的磷脂。PS主要局限于细胞膜的内叶，而磷脂酰胆碱和鞘磷脂则主要位于外叶。磷脂的不对称分布通过质膜中的翻转酶(P4-ATP酶，例如ATP11A和11C)的作用来维持，从而将PS从外叶主动易位到内叶。PS的细胞表面暴露不仅在凋亡细胞中观察到，还在活化的淋巴细胞、活化的血小板、衰老的红细胞以及一些癌细胞和各自的微粒中观察到(Sakuragi等人,(2019)PNAS USA[美国科学院院刊],116(8):2907-12)。PS暴露可以是促血栓形成性、炎性或缺血性疾病状态的生物标志物(Pasalic等人,(2018)J Thromb Haemost.[血栓形成和止血杂志],16(6):1198-2010；Ma等人,(2017)同上；Zhao等人,(2016)同上。PS在多种细胞信号传导途径中具有功能，并在凝血过程中作为必需的磷脂，在其中它可以充当tenase(因子IXa、VIIIa和X)和凝血酶原酶(因子Xa、Va和凝血酶原)复合物的形成增强剂(Spronk等人,(2014)Thromb Res.[血栓形成研究]133(Suppl 1):S54-6)。外部化的PS的最可能被理解的功能仍然是吞噬细胞(例如巨噬细胞)吞噬凋亡细胞、细胞碎片或暴露于PS的活化细胞的“吃掉我”标志物。如本文所用，术语‘磷脂酰丝氨酸结合结构域’或‘PS结合结构域’是指具有结合PS的功能的一段氨基酸或蛋白结构域。具有PS结合结构域的内源蛋白的实例可在下表2中找到。
表2：具有磷脂酰丝氨酸结合结构域的受体/蛋白的实例
Figure BDA0003527831370000271
Figure BDA0003527831370000281
在本披露的一个实施例中，PS结构域衍生自具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的人MFG-E8。在本披露的可替代实施例中，整联蛋白结合结构域是来自人EDIL3(SEQ IDNO:11)的PS结合结构域，其中PS结合结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸135-453。
PS结合活性可以通过本领域众所周知的方法来确定。例如，在实例第3.1节中描述了PS结合测定，其中通过与生物素化的鼠MFG-E8的结合竞争来评估本披露的融合蛋白与包被在微量滴定板上的PS的结合。根据本披露，如果PS结合结构域具有对人MFG-E8蛋白(显示于SEQ ID NO:1中)观察到的PS结合活性的至少10％，例如至少25％、至少50％、至少75％、至少80％、优选至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，则所述PS结合结构域被认为具有PS结合活性(这是当用相同的方法测定各自的活性时，优选是当用第3.1节的实例中所述的测定来测试时)。
桥接蛋白
有许多包含整联蛋白结合结构域和PS结合结构域两者的内源蛋白。下表3中显示了此类“桥接蛋白”的实例。
表3：包含整联蛋白和磷脂酰丝氨酸结合结构域的桥接蛋白
Figure BDA0003527831370000282
Figure BDA0003527831370000291
为了具有治疗价值，如果桥接蛋白包含识别吞噬细胞上的整联蛋白(其典型地对蛋白水解切割或脱落不敏感，如在TAM家族成员或其他PS结合受体中所观察到的)的整联蛋白结合结构域，则这是有用的。具有PS结合结构域和整联蛋白结合结构域的蛋白，例如MFG-E8或其旁系同源物EDIL3/DEL1，已显示出在体外诱导胞葬作用，并且因此作为AOI中的胞葬作用诱导剂具有治疗价值。相反，例如，GAS6蛋白在促进AOI中的胞葬作用方面可能不是特别有效，因为如上所述，其在吞噬细胞(MerTK)上的吞噬细胞在炎症和感染过程中被蛋白水解切割。
如上表3所示，桥接蛋白的一个实例是MFG-E8，它是乳脂肪球膜(MFGM)中发现的主要蛋白之一。MFG-E8由几种不同类型的细胞(例如，乳腺上皮细胞、血管细胞、附睾上皮细胞、主动脉平滑肌细胞、活化的巨噬细胞、受刺激的子宫内膜和未成熟的树突细胞)和组织(例如心、肺、乳腺、脾、肠、肝、肾、脑、血液和内皮)表达。MFG-E8蛋白也有几种不同的名称，例如乳凝集素、BP47、组分15/16、MFGM、MGP57/53、PAS-6/PAS-7糖蛋白、细胞壁蛋白SED1、精子表面蛋白SP47、乳腺上皮抗原BA46和O-乙酰GD3神经节苷脂合酶(AGS)。MFG-E8基因位于大鼠的1号染色体上、小鼠的7号染色体上和人的15号染色体上。MFG-E8的前-mRNA的可变剪接导致人蛋白的三种同种型和两种形式的mRNA，长变体和短变体在小鼠乳腺中表达。人MFG-E8基因(UniProtKB-Q08431)编码长387个残基的蛋白，其可被加工成多个蛋白产物。人MFG-E8的氨基酸序列(包括信号肽(残基1-23；带下划线)，EGF样结构域(残基24-67；斜体)，C1结构域(残基70-225；粗体)和C2结构域(残基230-387；粗体并带下划线))如下提供：
Figure BDA0003527831370000301
MFG-E8缺乏MFGM具有的跨膜功能，并且因此可作为外周膜蛋白。人MFG-E8由一个与吞噬细胞上表达的αvβ3和αvβ5整联蛋白结合的N末端EGF样结构域(SEQ ID NO:2)和包含与阴离子磷脂以高亲和力结合的两个F5/8-网柄菌凝素亚结构域(C1和C2)的PS结合结构域(SEQ ID NO:3)组成。整联蛋白结合是位于人MFG-E8(SEQ ID NO:1)残基46-48中的RGD基序的结果。凋亡细胞、细胞碎片、超活化细胞和大多数微粒(MP)暴露PS并且是MFG-E8的靶，MFG-E8作为桥接分子，调理这些细胞和微粒并将它们与吞噬细胞上的αvβ3和αvβ5整联蛋白连接。这种桥接作用触发了有效的吞噬程序，导致细胞、碎片和微粒的内化。MFGM中发现的蛋白在整个物种中都是高度保守的。MFG-E8的蛋白结构因物种而异；目前已知的所有物种都包含两个C结构域，但EGF样结构域的数量不同。例如，人MFG-E8蛋白包含一个EGF样结构域，而牛MFG-E8和鼠MFG-E8(SEQ ID NO:68)具有两个EGF样结构域，而鸡、青蛙和斑马鱼则具有三个EGF样-结构域。先前已经提出了MFG-E8的结构域作为治疗剂的成分，特别是MFG-E8的PS结合结构域(Kooijmans等人,(2018)Nanoscale[纳米尺度],10(5):2413-2426)和片段已经被描述为在纤维化模型中起作用(美国专利申请US2018/0334486)。
专性和非专性吞噬细胞对濒死细胞、碎片和微粒的非炎性摄取在组织损伤后的体内稳态中起着至关重要的作用(Greenlee-Wacker(2016)同上)。适当清除的重要性在遗传模型中变得更为明显，在遗传模型中MFG-E8敲除小鼠显示出例如组织中(未清除的)濒死细胞数量增加，疾病模型(如新生儿败血症、自身免疫性、血管生成不良和伤口愈合受损)中的炎症应答增加(Hanayama等人,(2004)Science[科学],204(5474):1147-50；Das等人,(2016)J Immunol.[免疫学杂志],196(12):5089-5100；Hansen等人,(2017)J PediatrSurg.[儿科外科杂志],52(9):1520-7)。
此外，已显示MFG-E8可通过抑制T细胞活化和增殖，抑制Th1、Th2和Th17亚群同时增加调节性T细胞亚群(Treg)来产生致耐受性环境。有趣的是，Treg通过诱导巨噬细胞的胞葬作用来贡献于炎症的消退(Proto等人,(2018)Immunity[免疫],49(4):666-77)。已经描述了MFG-E8促进跨MHC屏障的胚胎干细胞衍生组织的同种异体移植(Tan等人,(2015)StemCell Reports[干细胞报道],5(5):741-752)。MFG-E8还具有多种营养用途，所述用途有助于促进组织发育和针对感染原的保护。糖蛋白(例如MFG-E8)是潜在的用于食物和药物应用的健康增强型营养品。MFG-E8也可以与其他营养物质(例如益生菌、乳清蛋白微团、α-羟基异己酸、瓜氨酸和支链脂肪酸)组合使用。
增溶结构域
如本文所述，本披露的治疗性融合蛋白包含整联蛋白结合结构域和PS结合结构域。另外，融合蛋白还包含赋予融合蛋白许多期望性质的另外结构域。所述另外结构域(处于本申请的目的被称为‘增溶结构域’)赋予改善的生物学特性，例如增加的溶解度，减少的聚集和增加的生物活性。结果，融合蛋白显示出期望的药代动力学谱。此外，增溶结构域的存在改善了治疗性融合蛋白的稳定性，并且使得在细胞表达系统中融合蛋白的表达与野生型蛋白相比得以改善，如通过纯化后产率的增加所表明。
增溶结构域的存在还可以赋予治疗性融合蛋白延长的半衰期。例如，许多蛋白药物与聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)和血清蛋白(如白蛋白、IgG和FcRn)连接，以延长其血浆半衰期并达到增强的治疗效果(Kim等人,(2010)J Pharmacol Exp Ther.[药理学和实验治疗学杂志],334:682-92；Weimer等人,(2008)Thromb Haemost.[血栓形成和止血]99:659-67；Dumont等人,(2006)BioDrugs[生物药物],20:151-60；Schellenberger等人,(2009)Nat Biotechnol.[自然生物技术],27:1186-90)。
在一些实施例中，增溶结构域是白蛋白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA；SEQ ID NO:4)或其变体。例如，HSA包含具有较低聚集倾向的氨基酸取代C34S(SEQ ID NO:5)，或HSA的结构域，例如HSA D3；(SEQ ID NO:6)。由于许多因素(包括其相对较大的尺寸(可减少肾脏滤过作用)及其新生儿Fc受体(FcRn)结合特征)HSA具有非常长的血清半衰期，从而避免了细胞内降解。还已经提出使用HSA的N末端片段与多肽融合(例如专利申请EP 399666)。因此，将所述分子遗传地或化学地融合或缀合至白蛋白可以稳定或延长保质期，和/或保留分子在溶液中、在体外和/或在体内的活性持续延长的时间段。关于HSA融合的另外方法可以在例如国际专利申请WO 2001/077137和WO2003/060071中找到。
在一些实施例中，增溶结构域包含抗体Fc结构域，例如人Fc-免疫球蛋白G1(Fc-IgG1；SEQ ID NO:7)。Fc结构域也可以被修饰，例如，通过使用基于杵臼(KiH)(通过在Fc的CH3结构域中引入互补的氨基酸取代)的修饰，来改善Fc的异二聚化。例如，取代T366W在一个CH3结构域上产生‘杵’，取代T366S、L368A和Y407V在另一个CH3结构域上产生‘臼’(Merchant等人(1998)Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16(7):677-81；EU编号IgG1)。Fc结构域中可以包括的单独或与修饰组合以改善异二聚体化的另外的修饰可以包括，例如，氨基酸取代为半胱氨酸以产生另外的半胱氨酸键，例如S354C和/或Y349C，和减少或消除与Fcγ受体和补体蛋白C1q的结合从而使免疫效应子功能‘沉默’的氨基酸取代。所谓的‘LALA’双突变(L234A和L235A一起；EU编号)导致效应子功能减弱(Lund等人,(1992)MolImmunol.[分子免疫学],29:53-9)。另外，‘DAPA’双突变(D265A和P329A；EU编号)导致效应子功能减弱。在本披露的一个实施例中，Fc结构域可包含用于Fc沉默的氨基酸取代D265A、P329A和/或KiH氨基酸取代T366W(杵)或T366S、L368A和Y407V(臼)。在一个实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1并且包含氨基酸取代D265A、P329A(SEQ ID NO:8)。在另一个实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1，并包含氨基酸取代D265A、P329A、S354C和氨基酸取代T366W(Fc-IgG1-杵；SEQ ID NO:9)。在另一个实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1，并且包含氨基酸取代D265A、P329A、Y349C和氨基酸取代T366S、L368A和Y407V(Fc-IgG1-臼；SEQ ID NO:10)。
在一些实施例中，增溶结构域包含衍生自人IgA、IgD、IgE或IgM的抗体Fc结构域。
在一些实施例中，增溶结构域包含SUMO(小泛素样修饰剂)、泛素、GST(谷胱甘肽S-转移酶)或其变体。
治疗性融合蛋白的结构域的连接和定向
本披露的融合蛋白的整联蛋白结合结构域、PS结合结构域和增溶结构域被连接。如本文所用，术语‘连接的’或‘连接’是指融合蛋白的一个结构域直接或间接地附接于融合蛋白的另一结构域。直接附接是连接的一种形式，并且在本文中称为‘融合的’或‘融合’。以具有A-B-C形式的分子为例：结构域A直接连接到结构域B，并且直接连接到结构域C。这样，结构域A也可以描述为与结构域B融合，所述结构域B与结构域C融合。作为另一个实例，结构域A直接连接到结构域B，并且间接连接到结构域C。这样，结构域A也可以描述为与结构域B融合，所述结构域B通过内部接头间接连接到结构域C。
在一些实施例中，所述连接是直接连接，并且因此所述结构域彼此融合。在一些实施例中，整联蛋白结合结构域与PS结合结构域融合，所述PS结合结构域与增溶结构域融合。具体而言，PS结合结构域(例如C1-C2网柄菌凝素亚结构域)融合至整联蛋白结合结构域(例如，EGF样结构域)的C末端，并融合至增溶结构域(例如，HSA)的N末端。在一些实施例中，增溶结构域与整联蛋白结合结构域融合，所述整联蛋白结合结构域与PS结合结构域融合。具体而言，整联蛋白结合结构域(例如，EGF样结构域)融合至增溶结构域(例如，HSA)的C末端，并融合至PS结合结构域(例如，C1-C2网柄菌凝素亚结构域)的N末端。在一些实施例中，整联蛋白结合结构域与包含C1-C2网柄菌凝素亚结构域的PS结合结构域融合，并且增溶结构域插入在C1-C2网柄菌凝素亚结构域之间。具体地，整联蛋白结合结构域(例如，EGF样结构域)的C末端与C1网柄菌凝素亚结构域的N末端融合，并且C1网柄菌凝素亚结构域的C末端与增溶结构域(例如HSA)的N末端融合，并且增溶结构域的C末端与C2网柄菌凝素亚结构域的N末端融合。在另一个实施例中，整联蛋白结合结构域与增溶结构域融合，所述增溶结构域与PS结合结构域融合。具体而言，增溶结构域(例如，HSA)融合至整联蛋白结合结构域(例如，EGF样结构域)的C末端，并融合至PS结合结构域(例如，C1-C2网柄菌凝素亚结构域)的N末端。在一个实施例中，HSA融合至EGF样结构域的C末端，并融合至C1网柄菌凝素结构域的N末端。
在一些实施例中，增溶结构域(例如HSA)融合在整联蛋白结合结构域和PS结合结构域之间。在一些实施例中，整联蛋白结合结构域位于融合蛋白的N末端，并且PS结合结构域位于融合蛋白的C末端。
在一些实施例中，融合蛋白包含含有整联蛋白结合结构域(例如EGF样结构域)的第一区域，包含增溶结构域(例如HSA或Fc)的第二区域和包含PS结合结构域(例C1和/或C2网柄菌凝素结构域)的第三区域。在一些实施例中，整联蛋白结合结构域位于融合蛋白的N末端，并且PS结合结构域位于融合蛋白的C末端。
在一些实施例中，增溶结构域(例如，HSA或Fc)是HSA。
在一些实施例中，增溶结构域是HSA或其功能变体。
在一些实施例中，增溶结构域是抗体Fc-免疫球蛋白G1(Fc-IgG1；SEQ ID NO:7)。
在一个优选的实施例中，包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列融合至HSA与MFG-E8的EGF样结构域的C末端，并融合至MFG-E8的PS结合结构域的N末端。在一个实施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:46(FP068)所示的氨基酸序列。在一个实施例中，融合蛋白包含SEQ IDNO:48(FP776)所示的氨基酸序列。
在可替代实施例中，包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列融合至HSA与EDIL3的EGF样结构域的C末端，并融合至EDIL3的PS结合结构域的N末端。在一个实施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:70(FP1068)所示的氨基酸序列。在一个实施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:69(FP1776)所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，连接是通过多肽接头并且例如在本披露的融合蛋白中将增溶结构域与PS结合结构域连接的多肽接头称为‘外部接头’。这些外部接头典型地包含甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)，并且还可以包含甘氨酸和亮氨酸(GL)或甘氨酸和缬氨酸(GL)。在一些实施例中，接头包含多个G和S残基，例如G2S及其倍数，例如SEQ ID NO:62所示的(G2S)4，SEQID NO:63所示的(GS)4，SEQ ID NO:64所示的G4S或SEQ ID NO:65所示的(G4S)2。
在一些实施例中，外部接头融合在整联蛋白结合结构域的C末端与增溶结构域的N末端之间。具体而言，外部接头融合至EGF样结构域的C末端和HSA的N末端。在一些实施例中，外部接头融合在增溶结构域的C末端和PS结合结构域的N末端之间。具体而言，外部接头融合至HSA的C末端和PS结合结构域的N末端。在一些实施例中，外部接头融合在整联蛋白结合结构域的C末端和增溶结构域的N末端之间，并且另外的外部接头融合在增溶结构域的C末端和PS结合结构域的N末端之间。具体而言，外部接头融合至EGF样结构域的C末端和HSA的N末端，并且另外的外部接头融合至HSA的C末端和PS结合结构域的N末端。
在一些实施例中，包含GS的外部接头融合至整联蛋白结合结构域的C末端并融合至增溶结构域的N末端。在一些实施例中，包含GL的外部接头融合至增溶结构域的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。在一些实施例中，包含(G2S)4(SEQ ID NO:62)的外部接头融合至增溶结构域的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。在一些实施例中，包含G4S(SEQID NO:64)的外部接头融合至增溶结构域的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。在一些实施例中，包含(G4S)2(SEQ ID NO:65)的外部接头融合至增溶结构域的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。
在一个实施例中，包含GS的外部接头融合至EGF样结构域的C末端并融合至HSA的N末端。本披露的包含该结构的融合蛋白具有SEQ ID NO:42(FP330)所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，包含GS的外部接头融合至EGF样结构域的C末端并融合至HSA的N末端，并且包含(GS)4(SEQ ID NO:63)的另外的外部接头融合至HSA的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。
在一个实施例中，包含GS的外部接头融合至EGF样结构域的C末端并融合至HSA的N末端，并且包含(G2S)4(SEQ ID NO:62)的另外的外部接头融合至HSA的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。本披露的包含该结构的融合蛋白具有SEQ ID NO:42(FP330)所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，包含GS的外部接头融合至EGF样结构域的C末端并融合至HSA的N末端。HSA的C末端直接融合至PS结合结构域的N末端。
在一个实施例中，包含GS的外部接头融合至EGF样结构域的C末端并融合至HSA的N末端，并且包含G4S(SEQ ID NO:64)的另外的外部接头融合至HSA的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。本披露的包含该结构的融合蛋白具有SEQ ID NO:54(FP811)所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，包含GS的外部接头融合至EGF样结构域的C末端并融合至HSA的N末端，并且包含(G4S)2(SEQ ID NO:65)的另外的外部接头融合至HSA的C末端并融合至PS结合结构域的N末端。本披露的包含该结构的融合蛋白具有SEQ ID NO:56(FP010)所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，His标签与包含GS(GS-6xHis；SEQ ID NO:66)的外部接头融合，所述GS与PS结合结构域的C末端融合。在一个实施例中，本披露的包含His标签的融合蛋白具有SEQ ID NO:44(FP278)或SEQ ID NO:60(FP114或FP260)所示的氨基酸序列。
治疗性融合蛋白的功能特性
本披露提供了衍生自人MFG-E8的融合蛋白，并且所述融合蛋白有效促进胞葬作用并且因此在消除全身性炎症和微血管病理学的关键驱动因子方面具有活性。如实例中所述，具有EGF-HSA-C1-C2的一般结构的融合蛋白已在许多胞葬作用测定中显示有效。例如，融合蛋白已有效恢复巨噬细胞的被脂多糖(LPS)或金黄色葡萄球菌损害的胞葬作用，并增强了内皮细胞对微粒和濒死细胞的胞葬作用。在急性肾损伤的小鼠模型中，融合蛋白还已有效保护肾功能并防止体重减轻。
示例性蛋白序列
表4中的氨基酸序列包括本披露的治疗性融合蛋白及其部分的实例。
在本申请的全文中，如果说明书文本(例如，表4)与序列表之间存在差异，则以说明书文本为准。
表4.示例性蛋白序列
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本申请还包括SEQ ID NO:69、70和72中每个的变体，其中在所述变体中包括的EDIL3序列的EGF样结构域对应于以下序列中的任何一个：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101。
本申请还包括治疗性融合蛋白，其包含MFGE8或EDIL3的整联蛋白结合结构域以及截短的PS结合结构域，例如TIM4的IgSF V结构域的截短的变体或桥接蛋白GAS6变体的GLA结构域的截短的变体。
本披露的蛋白的修饰
本申请包括本文所述的蛋白的在结构域中具有各种修饰的变体和/或其片段，以及所披露分子的融合物和缀合物。例如，治疗性融合蛋白的结构域可以具有氨基酸残基的保守修饰，并且其中与包含亲本结构域的融合蛋白相比，经修饰的蛋白保留或具有增强的特性。可替代地，治疗性融合蛋白的结构域可具有一个或多个氨基酸残基的缺失，其中与包含亲本结构域的蛋白相比，经修饰的融合蛋白保留或具有增强的特性。可替代地，治疗性融合蛋白可具有一个或多个氨基酸残基的插入，其中与未经修饰的蛋白相比，经修饰的蛋白保留或具有增强的特性。在一个实施例中，这样的氨基酸插入包括以多种组合的甘氨酸或丝氨酸残基，以作为亲本蛋白的结构域之间的接头。
可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变，并且可以在体外或体内测定中评价对整联蛋白和/或PS结合或其他目的功能特性的影响。可以引入保守修饰(如上所述)和/或突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，典型地结合结构域内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
具有治疗性融合蛋白的氨基酸序列变体(其特性与未经修饰的变体基本相似)可通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA中或通过合成期望的变体来制备。此类变体包括例如本发明分子的氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。在一些实施例中，变体可包括另外的接头序列，减少的接头序列或接头序列的去除，和/或一个或多个氨基酸的氨基酸突变或取代和缺失。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特征。氨基酸变化还可以改变分子的翻译后过程，诸如改变可能的糖基化位点的数量或位置。
产生重组分子的方法
核酸和表达系统
在一个实施例中，本申请提供了一种重组产生治疗性融合蛋白的一个或多个多肽链的方法，所述方法包括：1)产生一种或多种DNA构建体，所述DNA构建体包含编码多特异性结合分子的多肽链的核酸分子；2)将所述一种或多种DNA构建体引入一种或多种表达载体中；3)将所述一种或多种表达载体共转染在一种或多种宿主细胞中；和4)在宿主细胞或溶液中表达并组装所述分子。
在这方面，本披露提供了编码本文所述的治疗性融合蛋白的分离的核酸，例如一种或多种多核苷酸。核酸分子包括单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段的组合。本发明的核酸衍生自人来源，但本发明包括衍生自非人物种的核酸。
‘分离的核酸’是在从天然存在的来源分离的核酸的情况下，与分离了核酸的生物体的基因组中存在的相邻遗传序列分开的核酸。在以酶促方式从模板或以化学方式合成的核酸(如PCR产物、cDNA分子、或寡核苷酸)的情况下，应理解，由此类过程产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选实施例中，核酸基本上不含污染性的内源材料。核酸分子优选地衍生自以基本上纯的形式和以使得能够通过标准生物化学方法(如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1989)中概述的那些)鉴定、操纵和回收其组分核苷酸序列的量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。此类序列优选以不被典型地存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的可读框的形式提供和/或构建。非翻译DNA的序列可以存在于可读框的5'或3'，其中所述序列不干扰编码区的操纵或表达。
本发明还提供了包含至少一种如上所述的多核苷酸的呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体。此外，本发明提供了包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。
在一个实施例中，本披露提供了一种制备治疗性融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养包含编码所述融合蛋白的核酸的宿主细胞，其中所述培养的宿主细胞表达所述融合蛋白；以及(b)从所述宿主细胞培养物中回收所述融合蛋白。
本披露还提供了表达载体和宿主细胞，用于产生上述治疗性融合蛋白。术语“载体”是指适合于转化或转染宿主细胞并且包含指导和/或控制(与宿主细胞结合)一个或多个与其可操作地连接的异源编码区的表达的核酸序列的任何分子或实体(例如核酸，质粒，噬菌体或病毒)。可以使用各种表达载体来表达编码所述分子的链或结合结构域的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生治疗性融合蛋白。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白或RNA的表达盒)、和人类人工染色体(参见例如，Harrington等人,(1997)Nat Genet.[自然遗传学]15:345)。例如，可用于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、pThioHis B和pThioHis C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、pEBVHis B和pEBVHis C(加利福尼亚州圣地亚哥市英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA))，MPSV载体和本领域中已知用于表达其他蛋白的多种其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP爱巴病毒(HBP Epstein Barrvirus)的载体，牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)。参见，Brent等人,(1995)同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年度评论]49:807；和Rosenfeld等人,(1992)Cell[细胞]68:143。
表达载体的选择取决于要表达该载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与编码治疗性融合蛋白的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施例中，采用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除了启动子之外，还可能需要或期望其他调节元件以高效表达治疗性融合蛋白。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过包括适合于使用的细胞系统的增强子提高表达效率(参见例如，Scharf等人,(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125；和Bittner等人,(1987)Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可提供分泌信号序列位置，以与通过插入结合结构域和/或增溶结构域的上述序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的是，插入序列在包含在载体中之前与信号序列连接。载体允许将结合结构域和增溶结构域表达为融合蛋白，从而导致产生完整的工程改造的蛋白。当在适当条件下培养时，宿主细胞可以用于表达工程改造的蛋白，所述工程改造的蛋白随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果不是分泌性的)。适当宿主细胞的选择将取决于各种因素，如期望的表达水平、活性(如糖基化或磷酸化)期望或必需的多肽修饰以及折叠成生物活性分子的便宜性。宿主细胞可以是真核或原核细胞。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，并且本领域已知的表达系统中使用的任何细胞系均可以用于制备本发明的重组融合蛋白。一般来讲，用包含编码期望融合蛋白的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可采用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(bacilli)。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括COS-7细胞、L细胞、Cl27细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或在无血清培养基中生长的它们的衍生物和相关细胞系、HeLa细胞、BHK细胞系、CV-1EBNA细胞系、人胚胎肾(HEK)细胞(如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织的体外培养的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地，当期望在各种信号转导或报告蛋白测定中使用多肽时，哺乳动物细胞系(如HepG2/3B、KB、NIH3T3或S49)可以用于多肽的表达。替代性地，可以在低等真核生物(如酵母)或在原核生物(如细菌)中产生多肽。合适的酵母包括巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、克鲁维酵母属菌株、假丝酵母属、或能够表达异源多肽的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、或能够表达异源多肽的任何细菌菌株。如果融合蛋白在酵母或细菌中制备，则可能期望修饰其中产生的产物，例如通过适当位点的磷酸化或糖基化，以便获得功能性产物。此类共价附接可以使用已知的化学或酶促方法实现。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸露的DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合、药剂增强的对DNA的摄取、和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量生产，通常期望稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和可选择标记基因的本披露的表达载体制备稳定地表达工程改造的蛋白的细胞系。在引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将它们转换为选择性培养基。选择性标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许在选择性培养基中成功地表达引入的序列的细胞生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖抗性、稳定转染的细胞。
融合蛋白典型地作为分泌的多肽从培养基中回收，但当它们直接产生而无分泌信号时也可以从宿主细胞裂解物中回收。如果所述多肽是膜结合的，则可以使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)将其从膜上释放出来。
当所述融合蛋白在非人源细胞的重组细胞中产生时，它完全不含人源蛋白或多肽。但是，有必要从重组细胞蛋白或多肽纯化融合蛋白。作为第一步，通常将培养基或裂解液离心以去除颗粒细胞碎片。产生的分子可以方便地通过羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析或亲和色谱纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。还可以使用用于蛋白纯化的其他技术，诸如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上色谱、肝素琼脂糖上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在某些方面，本文提供了病毒载体，所述病毒载体包含编码本发明的治疗性融合蛋白的多核苷酸。在一些实施例中，病毒载体衍生自AAV。在某些实施例中，将病毒载体施用给其中治疗性融合蛋白被表达的受试者例如人，并且可以用于治疗和/或预防本文列出的疾病。
药物组合物
在另一方面，本披露提供了包含本发明的治疗性融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的组合物，例如药物组合物。这样的组合物可以包含本披露的治疗性融合蛋白之一或本披露的治疗性融合蛋白的组合(例如，两种或更多种不同的治疗性融合蛋白)。
本文所述的药物组合物也可以在联合疗法中，即与其他药剂组合地施用。例如，联合疗法可以包括本披露的融合蛋白，其与例如至少一种抗炎剂、抗感染剂或免疫抑制剂组合。可以用于组合疗法中的治疗剂的实例更详细地描述于以下关于本披露的治疗性融合蛋白的用途的章节中。
为了制备包括本披露的融合蛋白的药物或无菌组合物，将所述融合蛋白与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。
术语‘药学上可接受’意指由联邦或州政府的监管机构批准或者列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍认可的药典中适用于动物并且更特别地适用于人。
术语‘药物组合物’是指至少一种活性成分(例如，工程改造的蛋白)和至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的混合物。
‘药物’是指用于医疗的物质。
如本文所用，‘药学上可接受的载剂’包括在生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述载剂应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一个实施例中，载剂应适合于皮下途径。根据施用途径，活性化合物(即融合蛋白)可以包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。
本文所述的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。本文所述的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以用于本文所述的药物组合物中的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过以下方式来维持：通过使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。
这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以同时通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)来确保阻止微生物的存在。还令人希望的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包括延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散液、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用作药物活性物质的用途是本领域中已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。还可以将补充活性化合物并入组合物中。
治疗性组合物典型地必须在制造和储存条件下是无菌且稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。所述载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。例如，可以通过使用涂层(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，可以在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。
可以在Cleland等人,(1993)Crit Reviews Ther Drug Carrier Systems[治疗性药物载剂系统重要综述],10(4):307-377和Wei W(1999)Int J Pharmaceutics[药剂学杂志国际版],185:129-88中找到关于稳定蛋白配制品开发的综述。
被用于真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液典型地包括以下组分中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的试剂，如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。这些制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：视需要将活性化合物以所需量并入含有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后进行灭菌微孔过滤。总体上，通过将本发明的融合蛋白掺入无菌媒介物来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上列举的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从活性成分加上任何另外的期望的成分的事先经无菌过滤的溶液产生所述活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。
可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之百的范围内，这个量的范围将是从约0.01％至约99％的活性成分、从约0.1％至约70％或从约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载剂组合。
为治疗性的工程改造的蛋白选择施用方案取决于若干种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中的靶标细胞可及性。在某些实施例中，施用方案使递送至患者的与可接受水平的副作用一致的治疗剂的量达最大。因此，递送的蛋白的量部分地取决于特定实体和正在治疗的病症的严重程度。可获得选择合适剂量的生物和小分子的指南(参见，例如，Bach(编辑)(1993)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases[自身免疫性疾病中的单克隆抗体和肽疗法],Marcel Dekker,纽约,N.Y.；Baert,等人(2003)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:601-608；Milgrom,等人(1999)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973；Slamon,等人(2001)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]344:783-792；Beniaminovitz,等人(2000)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]342:613-619；Ghosh,等人(2003)NewEngl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:24-32；Lipsky,等人(2000)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适当的剂量。通常，剂量始于略小于最佳剂量的量并此后将其以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所希望的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以改变本披露的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的期望的治疗应答，而对该患者没有毒性。所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的本披露特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及医学领域中已知的类似因素。
调整剂量方案以提供最佳的所期望的应答。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以施用单次推注，可以随着时间施用若干个分次剂量，或可以按比例减少或增加剂量。可以特别有利地以单位剂型配制肠胃外组合物以易于施用和实现剂量均匀性。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生期望治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载剂。本发明剂量单位形式的规格是通过以下指定并且直接取决于以下：活性化合物的独特特征和有待实现的特定治疗效果，以及在混配此类活性化合物用于治疗个体的敏感性的领域中的固有限制。
对于治疗性融合蛋白的施用，剂量在约0.0001至150mg/kg宿主体重范围内，诸如皮下施用5、15和50mg/kg，并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重。示例性治疗方案需要每周施用一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每个月一次，每3个月一次或每三至6个月一次。
本发明的治疗性融合蛋白可以在多种情况下施用。单一剂量之间的间隔可以是例如每周、每个月、每三个月或每年。如通过测量患者中工程改造的蛋白的血液水平所示，间隔也可以是无规律的。在一些方法中，调节剂量以获得约1-1000μg/ml并且在一些方法中约25-300μg/ml的血浆蛋白浓度。
可替代地，治疗性融合蛋白可以作为持续释放配制品施用，在这种情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率取决于患者体中的蛋白的半衰期而变化，并且可以取决于治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者可以在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔给予相对较高的剂量直至病症或疾病进展减少或终止，或者直至患者显示病症或疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，所述活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所期望的治疗应答，而对患者没有毒性。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本披露的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及医学领域中已知的类似因素。
本发明的融合蛋白的‘治疗有效剂量’可导致病症或症状或疾病的严重程度降低和/或预防由于病症导致的损害或残疾。
可以使用本领域已知的各种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用本披露的组合物。如本领域技术人员将理解的，施用途经和/或模式将根据所希望结果而变化。用于本发明的工程改造的蛋白的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语‘肠胃外施用’意指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。
可替代地，本发明的治疗性融合蛋白可以通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径。
本披露的治疗性融合蛋白可以与载剂一起制备，这些载剂将防止蛋白快速释放，如控制释放配制品，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备此类配制品的方法是获得专利权的或是本领域技术人员通常已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[缓控释药物递送系统],J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,1978。
在某些实施例中，可以配制本发明的治疗性融合蛋白以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331中所述的方法。脂质体可以包含一个或多个部分，所述一个或多个部分被选择性运输至特定细胞或器官中，因此增强靶向药物递送(参见例如，Ranade VV(1989)J.Clin.Pharmacol.[临床药理学杂志],29:685)。
本发明的治疗用途和方法
本发明的治疗性融合蛋白具有体外和体内诊断和治疗用途。例如，可以将这些分子施用至培养中(例如体外)或受试者中(例如体内)的细胞来治疗、预防或诊断多种障碍。所述方法特别适用于治疗、预防或诊断急性或慢性炎性和免疫系统驱动的器官和微血管障碍。
本发明的治疗性融合蛋白可用于但不限于治疗、预防或改善急性和慢性炎性器官损伤，特别是其中用于去除濒死细胞、细胞碎片和促血栓形成性/促炎性微粒的内源性体内稳态清除机制或胞葬作用途径明显下调的炎性损伤。急性炎性器官损伤的实例包括心肌梗塞、急性肾损伤(AKI)、急性中风和炎症以及由缺血/再灌注引起的器官损伤，例如胃肠道、肝、脾、肺、肾、胰腺、心、脑、脊髓和/或压伤的四肢的缺血/再灌注。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防或改善血液凝固的抑制或减慢、微生物组治疗、炎性肠病(IBD)、脂肪酸摄取和/或降低的胃动力、微血栓形成依赖性障碍、动脉粥样硬化、心脏重塑、组织纤维化、急性肝损伤、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血管疾病、与年龄有关的血管障碍、肠道疾病、败血症、骨障碍、癌症、地中海贫血、胰腺炎、肝炎、心内膜炎、肺炎、急性肺损伤、骨关节炎、牙周炎、组织创伤引起的炎症、结肠炎、糖尿病、失血性休克、移植排斥、放射引起的损害、脾肿大、败血症引起的AKI或多器官衰竭、急性烧伤、成人呼吸窘迫综合征、伤口愈合、腱修复和神经疾病。
在一个实施例中，神经疾病可以选自具有神经精神病学、神经炎性和/或神经退行性成分的病症，其包括症状，例如疾病综合症、恶心、被动回避、行为敏捷性抑制、记忆障碍和记忆功能障碍。神经疾病的实例包括与淀粉样蛋白β有关的神经疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病和抑郁症。
在一个实施例中，骨障碍可以选自包括骨质疏松症、骨软化症、骨质硬化和骨硬化病的病症。更特别地，本披露的融合蛋白的施用可以抑制至少一种破骨细胞标志物例如NFATc1、组织蛋白酶K和αvβ3整联蛋白的表达。在一个实施例中，所述施用抑制破骨细胞生成。在另一个实施例中，所述施用抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。在另一个实施例中，所述施用抑制骨吸收。在另一个实施例中，所述施用抑制至少一种骨吸收刺激子(例如包含以下的骨吸收刺激子：TNF、IL-6、IL-17A、MMP-9、Ptgs2、RANKL、Tnfsf11、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5及其组合)的表达。在另一个实施例中，所述施用抑制选自由IL-8和CCL2/MCP-1组成的组中的至少一种促炎细胞因子的表达。
在一个实施例中，组织纤维化可以是肝、肺、隔膜、肾、脑、心中的纤维化，其中本发明的融合蛋白降低了胶原蛋白表达。在一个实施例中，肺纤维化是间质性肺纤维化(IPF)。在一个实施例中，肝纤维化是肝硬化，其可归因于或可不归因于NASH。
多种呼吸疾病的特征是凋亡细胞的积累。此外，慢性阻塞性肺疾病(COPD)中巨噬细胞的缺陷性胞葬作用和吞噬作用与病情加重和严重程度有关。本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防或改善呼吸疾病，例如急性呼吸窘迫综合征或COPD。本披露的治疗性融合蛋白还可用于以下的诊断、治疗、预防或改善：急性肺损伤(ALI)，例如吸入或吸进有毒的外源或内源性化合物或药物引起的肺损伤；由肺水肿、休克、胰腺炎、烧伤、胸部创伤或多创伤、放射、败血症、病原体(细菌、病毒或寄生虫例如疟原虫)引起的肺损伤；导致低氧血症的慢性肺功能不全疾病
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防由冠状型病毒(例如SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS-CoV)引起的肺损伤或改善其严重程度。在一个实施例中，提供本发明的治疗性融合蛋白用于治疗COVID 19患者的SARS-CoV-2感染。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防与输注相关的肺功能不全(TRALI)或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防导致低氧血症的慢性肺功能不全疾病或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白(例如包含本披露的EDIL3的结构域的治疗性融合蛋白)还可用于诊断、治疗、预防术后腹膜粘连或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防心脏衰竭或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防血液透析或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防移植物功能延迟或移植物抗宿主疾病或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防严重冻伤、战壕足病、坏疽性脓皮病/坏疽或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防由细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的病理学(例如败血症或例如在炭疽、鼠疫、坏死性软组织感染(NSTI，例如坏死性筋膜炎)、骨髓炎、疟疾中由病原体直接诱导的其他病理学)或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防由造成损伤的事故(例如工作事故、跌倒、交通事故、子弹和战斗损伤或其他损伤机制)引起的创伤/多创伤或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白还可用于诊断、治疗、预防破骨细胞介导的病理学或改善其严重程度。
本披露的治疗性融合蛋白可以作为单独的活性成分或与其他药物(例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其他抗炎剂或例如细胞毒性剂或抗癌剂)联合(例如作为佐剂)或组合施用，例如以治疗或预防上述疾病。
对于与另外的治疗剂的‘组合’施用意指在受试者患有障碍的过程期间，将两种(或更多种)不同治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有障碍后并且在所述障碍被治愈或消除或由于其他原因终止治疗之前递送两种或更多种治疗。在一些实施例中，第一治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，治疗因组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如，与第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所观察到的结果相比，使用较少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗使症状减少更大的程度，或对第一治疗观察到类似的情况。在一些实施例中，与一种治疗不存在的情况下递送另一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与所述障碍相关的有他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可以检测的。
术语‘并行’不限于在完全相同的时间施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是意指将包含本披露的其治疗性融合蛋白的药物组合物以一定的顺序并在一定的时间间隔内施用至受试者，以使得融合蛋白可以与一种或多种另外的治疗剂一起发挥作用，以提供与如果以其他方式施用相比增加的益处。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何次序依序在不同的时间点施用至受试者；然而，如果不在相同的时间施用，则应当在时间上充分接近地施用所述疗法，以提供所希望的治疗或预防作用。可以将每种疗法以任何适当的形式并且通过任何合适的途径分别施用至受试者。
可以同时地(以与所披露的融合蛋白相同或分开的药物组合物)或依次地施用本文所述的治疗性融合蛋白和一种或多种另外的治疗剂。对于依次施用，可以首先施用本文所述的融合蛋白，然后可以施用另外的试剂，或者可以颠倒施用顺序。与融合蛋白相比，可以通过相同或不同的施用途径将一种或多种另外的治疗剂施用至受试者。
可以将如本文所述的治疗性融合蛋白和/或一种或多种另外的治疗剂、程序或方式在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间施用。可以将本文所述的治疗性融合蛋白在其他治疗之前、与治疗并行、治疗后或在障碍缓解期间施用。
当组合施用时，本文所述的治疗性融合蛋白和另外的治疗剂(例如，第二或第三药剂)或全部以比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，本文所述的治疗性融合蛋白、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更低(例如，至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。在其他实施例中，导致期望的效果(例如，治疗炎性疾病或病症)的本文所述的治疗性融合蛋白、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。
例如，本披露的治疗性融合蛋白可以与以下药物组合使用：DMARD，例如，金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、甲氨蝶呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、霉酚酸、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、米诺环素(minocycline)、来氟米特(leflunomide)、糖皮质激素；钙调神经磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK 506；淋巴细胞再循环的调节剂，例如FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性的子囊霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；来氟米特；咪唑立宾(mizoribine)；霉酚酸吗啉基乙酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制性相似物、类似物或衍生物；免疫抑制性单克隆抗体，例如针对白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配体；其他免疫调节化合物，例如重组结合分子，所述重组结合分子具有CTLA4的细胞外结构域的至少一部分或其突变体，例如CTLA4中与非CTLA4蛋白序列例如CTLA4Ig(例如指定为ATCC 68629)或其突变体例如LEA29Y接合的至少细胞外部分或其突变体；粘附分子抑制剂，例如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化学治疗剂，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿嘧啶；抗TNF剂，例如TNF的单克隆抗体，例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如依那西普(Etanercept)、PEG-TNF-RI；促炎细胞因子的阻滞剂，IL-1阻滞剂，例如阿那白滞素或IL-1陷阱、卡那单抗(canakinumab)，IL-13阻滞剂，IL-4阻滞剂，IL-6阻滞剂；趋化因子阻滞剂，例如蛋白酶例如金属蛋白酶的抑制剂或活化剂，抗IL-15抗体，抗IL-6抗体，抗IL-4抗体，抗IL-13抗体，抗CD20抗体，NSAID，诸如阿司匹林或抗感染剂；损伤相关分子模式(DAMP)或病原体相关分子模式(PAMP)拮抗剂，例如转换剂、排毒剂、去除剂，例如ATP转换剂、HMGB-1调节剂、组蛋白解毒剂；超抗原诱导的免疫应答抑制剂；补体抑制剂和体外血浆置换设备。
试剂盒
试剂盒也包括在本发明的范围内，所述试剂盒由例如本披露的治疗性融合蛋白的组合物和使用说明书组成。此类试剂盒包含治疗有效量的根据本披露的融合蛋白。另外，此类试剂盒可以包含用于施用治疗性融合蛋白的工具(例如，自动注射器、注射器和小瓶、预填充注射器、预填充笔)以及使用说明书。这些试剂盒可包含另外的治疗剂(如下所述)，用于治疗患有自身免疫性疾病或炎性障碍或AOI的患者。此类试剂盒还可包含用于施用治疗性融合蛋白以治疗患者的说明书。此类说明书可以提供用于所包装的融合蛋白的剂量、施用途径、方案和总治疗持续时间。试剂盒典型地包括标签，所述标签指示试剂盒内容物的预期用途。术语标签包括试剂盒上提供或与试剂盒附带提供的任何书面或记录材料。试剂盒可进一步包括用于诊断患者是否属于对如上所定义的本发明的治疗性融合蛋白的治疗有应答的组的工具。
实施例
本披露提供以下实施例：
1.一种用于增强胞葬作用的治疗性融合蛋白，所述治疗性融合蛋白包含整联蛋白结合结构域、磷脂酰丝氨酸(PS)结合结构域和增溶结构域，其中所述增溶结构域插入在所述整联蛋白结合结构域和所述PS结合结构域之间，并且其中所述PS结合结构域是截短的变体。
2.如实施例1所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是表2中所列的至少一个PS结合结构域的截短的变体。
3.如实施例1或实施例2所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是MFG-E8或EDIL3的PS结合基序的截短的变体。
4.如实施例3所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是MFG-E8的PS结合基序的截短的变体。
5.如实施例4所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是网柄菌凝素结构域。
6.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是C1结构域。
7.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域不包含C2结构域。
8.一种用于增强胞葬作用的融合蛋白，所述融合蛋白包含整联蛋白结合结构域、磷脂酰丝氨酸(PS)结合结构域和增溶结构域，其中所述增溶结构域插入在所述整联蛋白结合结构域和所述PS结合结构域之间，并且其中所述PS结合结构域是C1结构域。
9.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域与一种或多种整联蛋白结合。
10.如实施例9所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域与αvβ3和/或αvβ5和/或α8β1整联蛋白结合。
11.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序。
12.一种式EGF-S-C(式I)的治疗性融合蛋白，其中
(i)EGF是整联蛋白结合结构域，其中所述整联蛋白结合结构域与一种或多种蛋白结合，
(ii)S是增溶结构域，并且
(iii)C是截短的PS结合结构域。
13.如实施例12所述的治疗性融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域与αvβ3和/或αvβ5和/或α8β1整联蛋白结合。
14.如实施例12或实施例13所述的治疗性融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序。
15.如实施例12至14中任一项所述的治疗性融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域是MFG-E8、EDIL3或包含表1中所列整联蛋白结合结构域的蛋白的EGF样结构域。
16.如实施例12至15中任一项所述的治疗性融合蛋白，其中所述截短的PS结合结构域是表2中所列的PS结合结构域的截短的变体。
17.如实施例12至16中任一项所述的治疗性融合蛋白，其中所述PS结合结构域是MFG-E8或EDIL3的PS结合基序的截短的变体。
18.如实施例12至16中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是MFG-E8的PS结合基序的截短的变体。
19.如实施例12至18中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是网柄菌凝素结构域。
20.如实施例11至16中任一项所述的治疗性融合蛋白，其中所述截短的PS结合结构域包含表2中所列的PS结合结构域的C1结构域和/或C2结构域中的任何一个。
21.如实施例11至18中任一项所述的治疗性融合蛋白，其中所述截短的PS结合结构域是C1结构域。
22.如实施例11至21中任一项所述的治疗性融合蛋白，其中所述截短的PS结合结构域不包含C2结构域。
23.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域直接连接至所述整联蛋白结合结构域、至所述PS结合结构域或这两个结构域。
24.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域通过接头间接连接至所述整联蛋白结合结构域和/或所述PS结合结构域。
25.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
26.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
27.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域具有选自以下的氨基酸序列或与选自以下的氨基酸序列具有至少90％序列同一性：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101。
28.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域具有SEQ IDNO:141或SEQ ID NO:142的氨基酸序列或与SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
29.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域具有SEQ IDNO:144的氨基酸序列或与SEQ ID NO:144的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
30.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域是HSA并且具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
31.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白依次包含：整联蛋白结合结构域-HSA-PS结合结构域。
32.一种治疗性融合蛋白，所述治疗性融合蛋白包含MFG-E8和增溶结构域，其中所述MFG-E8从N末端到C末端包含：EGF样结构域、C1结构域或C2结构域，并包含来自野生型人MFG-E8(SEQ ID NO:1)或其功能变体的序列。
33.如实施例32所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域插入在所述EGF样结构域和所述C1或C2结构域之间。
34.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域是HSA、HSA D3或Fc-IgG或其功能变体。
35.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域包含人血清白蛋白(HSA)或其功能变体。
36.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与SEQID NO:34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
37.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与SEQID NO:36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
38.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白具有选自以下的氨基酸序列或与选自以下的氨基酸序列具有至少90％序列同一性：SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ IDNO:147。
39.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:147的氨基酸序列或与SEQID NO:147的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
40.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白
a.在人巨噬细胞-中性粒细胞的胞葬作用测定中恢复巨噬细胞的受损的胞葬作用；
b.在人内皮细胞-微粒胞葬作用测定中通过清除而减少血浆微粒的数量；和/或
c.在急性肾缺血模型中预防多器官损伤。
d.改善肝纤维化模型中的疾病负担
41.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如实施例36至39中任一项所述的氨基酸序列。
42.一种克隆载体或表达载体，所述克隆载体或表达载体包含如实施例41所述的核酸。
43.一种包含如实施例41所述的分离的核酸的病毒载体，优选地，包含根据如实施例41所述的分离的核酸的病毒载体衍生自AAV。
44.如实施例43所述的病毒载体，其中将所述载体施用给有需要的受试者，例如人受试者。
45.如实施例43所述的病毒载体，用于在治疗和/或预防本文列出的疾病中使用。
46.一种适于产生治疗性融合蛋白的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一个或多个如实施例42所述的克隆载体或表达载体、以及任选的分泌信号。
47.如实施例46所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是例如原核、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
48.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述蛋白在宿主细胞中的表达导致至少10mg/L的产率。
49.如前述实施例中任一项所述的融合蛋白，其中所述蛋白在哺乳动物细胞中的表达导致产率比野生型MFG-E8(SEQ ID NO:1)增加至少100倍。
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施例1至40中任一项所述的融合蛋白和至少一种药学上可接受的载剂。
51.一种治疗或预防有需要的个体的炎性障碍或炎性器官损伤的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如实施例1至40中任一项所述的融合蛋白。
52.如实施例1至40中任一项所述的融合蛋白，用于在治疗或预防有需要的个体的炎性障碍或炎性器官损伤中使用。
53.如实施例51所述的方法或如实施例52所述的用途，其中所述炎性障碍或炎性器官损伤是急性肾损伤、败血症、心肌梗塞、急性中风、烧伤、创伤以及由缺血/再灌注引起的炎性和器官损伤。
54.如实施例51所述的方法或如实施例52所述的用途，其中所述融合蛋白与另一种治疗剂组合施用。
55.如实施例54所述的方法或用途，其中所述另一种治疗剂是免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗感染剂、细胞毒性剂或抗癌剂。
56.一种治疗性融合蛋白，所述治疗性融合蛋白包含MFG-E8和增溶结构域，其中所述MFG-E8从N末端到C末端包含：EGF样结构域、C1结构域或C2结构域，并包含来自野生型人MFG-E8(SEQ ID NO:1)的序列的功能变体。
57.如实施例56所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域插入在所述EGF样结构域和所述C1结构域之间。
58.如实施例56所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域插入在所述EGF样结构域和所述C2结构域之间。
59.如实施例56至58中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域是HSA、HSAD3或Fc-IgG或其功能变体。
60.如实施例56至59中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有选自表4中所列的SEQ ID的氨基酸序列。
61.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如实施例56至60中任一项所述的融合蛋白。
62.一种包含如实施例61所述的分离的核酸的病毒载体，优选地，包含根据如实施例60所述的分离的核酸的病毒载体衍生自AAV。
63.如实施例62所述的病毒载体，其中将所述载体施用给有需要的受试者，例如人受试者。
64.如实施例62所述的病毒载体，用于治疗和/或预防本文列出的疾病。
65.一种克隆载体或表达载体，所述克隆载体或表达载体包含如实施例61所述的核酸。
66.一种适于产生治疗性融合蛋白的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一个或多个如实施例65所述的克隆载体或表达载体、以及任选的分泌信号。
67.如实施例66所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是例如原核、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
67.如实施例56至60中任一项所述的融合蛋白，其中所述蛋白在宿主细胞中的表达导致至少10mg/L的产率。
69.如实施例56至60中任一项所述的融合蛋白，其中所述蛋白在哺乳动物细胞中的表达导致产率比野生型MFG-E8增加至少100倍。
应当理解的是，每个实施例可以与一个或多个其他实施例组合，直到达到此类组合与实施例的描述相一致的程度。还应理解，以上提供的实施例应理解为包括所有实施例，包括由实施例的组合产生的此类实施例。
本文引用的所有参考，包括专利、专利申请、论文、出版物、教科书等，以及其中引用的参考，在它们尚未的程度上，通过引用以其全文特此并入。
实例
提供以下实例以进一步说明本披露，但不限制本披露的范围。本披露的其他变型对本领域普通技术人员而言将是显而易见的，且也为所附权利要求书所涵盖。
实例1：融合蛋白的产生
MFG-E8是多结构域蛋白，所述多结构域蛋白由N末端表皮生长因子(EGF样)结构域和两个C末端凝集素C型结构域(C1和C2)组成。如文献中记载的为了产生重组全长人蛋白的尝试已经显示蛋白聚集并且表达率非常低(Castellanos等人,(2016)Protein ExpressionPurification[蛋白表达纯化]1124:10-22)。因此，为了尝试增溶蛋白并提高其表达，我们研究了将多种蛋白融合至MFG-E8的效果。
来自人Fc-IgG1、人血清白蛋白(HSA)和HSA的结构域3(HSA D3)的增溶结构域(SD)在不同位置融合至MFG-E8；如图1所示，在N或C末端，或在EGF与C1或C1和C2结构域之间。此外，与Fc-IgG1或HSA的融合有潜力延长分子在体内的半衰期，因为这些蛋白与FcRn结合。MFG-E8与Fc-IgG1或HSA的融合还可以提高融合蛋白的产量和溶解度(Castellanos等人,(2016)同上)，如以下实例所示。
表5显示了包含HSA插入物的融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42)与人新生儿Fc受体的融合(也参见实例5.1)。
表5：融合蛋白FP330与人FcRn的结合亲和力
Figure BDA0003527831370001091
实例2：wtMFG-E8和MFG-E8 HSA融合的产生；表达和纯化
产生融合蛋白的方法描述如下；简而言之，根据以下方法产生了MFG-E8和MFG-E8融合体和EDIL融合体，特别是与HSA的融合体。
DNA在基因艺术公司(GeneArt)(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成并使用基于限制酶-连接的克隆技术克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒转染到HEK293T细胞中。为了瞬时表达蛋白，使用聚乙烯亚胺(PEI；目录号24765，聚合科学公司(Polysciences,Inc.))将针对野生型或工程改造的链的载体转染入悬浮液适应的HEK293T细胞中。典型地，用含有100μg编码工程改造的链的表达载体的DNA转染以1-2Mio细胞/ml的密度悬浮的100ml细胞。然后将重组表达载体引入宿主细胞中，并通过进一步培养细胞7天的时段来产生构建体，以允许分泌到补充有0.1％普朗尼克酸(pluronic acid)、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml抗生素的培养基(HEK，无血清培养基)中。
然后使用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)、蛋白A捕获或抗HSA捕获色谱从无细胞上清液中纯化产生的构建体。
当IMAC捕获了带有组氨酸标签的蛋白时，经过滤的条件培养基与IMAC树脂(通用健康医疗集团(GE Healthcare))混合，并用1％triton和20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、20mM咪唑(pH 7.0)平衡。用15柱体积的20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、20mM咪唑(pH 7.0)将树脂洗涤三次，然后用10柱体积的洗脱缓冲液(20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、500mM咪唑(pH 7.0))洗脱蛋白。
当通过蛋白A或抗HSA色谱捕获蛋白时，经过滤的条件培养基与蛋白A树脂(CaptivA PriMabTM，瑞普利金公司(Repligen))或抗HSA树脂(捕获选择人白蛋白亲和基质(Capture Select Human Albumin affinity matrix)，赛默公司(Thermo))混合，并用PBS(pH 7.4)平衡。用15柱体积的PBS(pH 7.4)洗涤树脂三次，然后用10柱体积的洗脱缓冲液(50mM柠檬酸盐、90mM NaCl(pH 2.5))洗脱蛋白，并用1M TRIS pH 10.0中和pH。
最后，洗脱的级分通过使用尺寸排阻色谱(HiPrep Superdex 200，16/60，通用生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)进行精制，并通过SDS-PAGE针对PrecisionPlus蛋白未染色标准标志物(伯乐公司(Biorad)，ref#161-0363)进行分析。
融合蛋白的代表性表达凝胶如图2所示：图2A：EGF-HSA-C1-C2蛋白(FP330；SEQ IDNO:42)；图2B：EDIL3蛋白的EGF-HSA-C1-C2(FP050；SEQ ID NO:12)；图2C：未还原和还原的EGF-Fc(KiH)C1-C2蛋白该蛋白是FP071(EGF-Fc(杵)-C1-C2；SEQ ID NO:18)与Fc-IgG1臼(SEQ ID NO:10)的异二聚体；图2D：EGF-HSA-C1蛋白(FP260；SEQ ID NO:34)。在还原和未还原条件下的蛋白如图2C所示，因为异二聚体在还原条件下趋于分解，因此测试了两种条件。表6显示了另一组融合蛋白纯化后的表达和产率的结果；从表达数据可以看出，MFG-E8的HSA融合体(即使在不同位置与HSA融合)与wtMFG-E8相比表达提高了至少100倍。如表6的右栏中所示，MFG-E8的HSA融合体也显示出比wtMFG-E8的在产率方面增加至少100倍。
表6：在HEK细胞系中表达的融合蛋白的表达和产率
Figure BDA0003527831370001111
根据上述方法产生本披露的治疗性融合蛋白的其他实例，并通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)进一步分析，所述SDS-PAGE基于蛋白的分子量分离蛋白。将每种蛋白与Laemmli缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上(伯乐公司，4％-20％Mini-PROTEAN TGX免染色)。在200V下在TRIS-甘氨酸-SDS运行缓冲液中迁移30分钟后，凝胶中包含的蛋白在免染色成像仪(伯乐公司，Gel Doc EZ)中显示。如图2E所示，SDS-PAGE显示已经产生和纯化的重组蛋白：
Figure BDA0003527831370001121
实例3：MFG-E8-HSA工程改造的蛋白的表征
3.1磷脂酰丝氨酸结合(生化)
将L-α-磷脂酰丝氨酸(脑，猪，Avanti 840032，美国阿拉巴马州)溶解在氯仿中，用甲醇稀释，并以1μg/mL包被在384孔微量滴定板(CorningTM 3653，肯纳邦克(Kennebunk)缅因州，美国)上。在4℃孵育过夜后，使用SpeedVacTM系统(Thermo ScientificTM)蒸发溶剂。在室温下，用含3％无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理板1.5小时。
通过与生物素化的鼠MFG-E8/乳凝集素(内部产生，mMFG-E8:生物素)的结合竞争来评估融合蛋白与L-α-磷脂酰丝氨酸的结合。将蛋白在含有3％无脂肪酸BSA的PBS(pH7.4)中稀释，并与L-α-磷脂酰丝氨酸包被的微量滴定板孵育30分钟。以1nM添加含有3％无脂肪酸BSA的PBS(pH 7.4)中的mMFG-E8:生物素，并再孵育30分钟。通过离解增强型镧系元素荧光免疫测定(DELFIATM)洗涤缓冲液(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)1244-114MA，美国)通过三个洗涤步骤除去未结合的mMFG-E8:生物素。在室温下于DELFIATM测定缓冲液(珀金埃尔默公司1244-111MA，美国)中添加经铕标记的链霉亲和素(珀金埃尔默公司1244-360，Wallac Oy，芬兰)放置20分钟。随后是用DELFIATM测定缓冲液进行的三个洗涤步骤。铕是按照制造商的说明(珀金埃尔默公司1244-105，马萨诸塞州波士顿，美国)显示的。铕的时间分辨荧光通过EnvisionTM 2103多标记酶标仪(珀金埃尔默公司，康涅狄格州，美国)进行定量。使用MS Excel和GraphPad Prism软件进行数据分析。
聚丙烯板是典型地在实验室中用于连续稀释的低蛋白结合微量滴定板。与聚苯乙烯相比，这些板具有减少稀释过程中蛋白损失的优势，并且典型地被归类为“低蛋白结合”板。当在聚丙烯板中制备wtMFG-E8的稀释液时，与在非结合板中制备的稀释液相比，wtMFG-E8在L-α-磷脂酰丝氨酸竞争测定中损失了效力。如图3所示，这些数据表明，当使用已经针对低蛋白结合进行了优化的聚丙烯板时，wtMFG-E8在液体处理和稀释步骤中会部分损失(图3A)。这些结果表明，wtMFG-E8的固有粘性在实验室中以及极有可能在药物制造和生产过程中提出挑战，在这些情况下需要进行捕获和精制步骤才能生产出高产率和非常高纯度的原料药。相反，与wtMFG-E8相比，工程改造的蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ IDNO:44)的粘性显著降低，并且在非结合板相比于在聚丙烯中进行的稀释之间几乎没有观察到差异(图3B)。这些数据表明，将增溶结构域插入本披露的蛋白中可以改善其技术处理，从而提高步骤产率，并且因此提高制造过程中的总产率。
融合蛋白与L-α-磷脂酰丝氨酸结合的评估如图4所示。工程改造的MFG-E8衍生的蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)以浓度依赖性的方式与固定化的PS结合并且在较小程度上与磷脂心磷脂结合(图4A)。使用针对wtMFG-E8的EGF-L结构域的抗体来检测FP278与固定化的L-α-磷脂酰丝氨酸的结合或与心磷脂(1,3-双(sn-3'-磷脂酰)-sn-甘油)的结合。几种重组融合蛋白与固定化的L-α-磷脂酰丝氨酸的结合强度如图4B所示。人wtMFG-E8与融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)和FP260(EGF-HSA-C1；SEQ ID NO:34)以浓度依赖性方式有效与1nM生物素化小鼠MFG-E8竞争结合固定化的L-α-磷脂酰丝氨酸。与人wtMFG-E8相比，融合蛋白获得的IC50值表示工程改造的蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)的C1-C2结构域的高度相似的L-α-磷脂酰丝氨酸结合强度。出人意料地，这些数据还表明人C2结构域不与L-α-磷脂酰丝氨酸相互作用或仅与其弱相互作用，如FP270(EGF-HSA-C2；SEQ ID NO:36)的结果所示，FP270连同FP250(EGF-HSA；SEQ ID NO:32)不以这种测定形式竞争。测试了FP100(EGF-C2-C2蛋白(SEQID NO:26))并且不以这种测定形式竞争(未显示)，使C1结构域作为人MFG-E8中的主要PS结合部分。这一发现出人意料，因为大量文献表明MFG-E8的C2结构域是负责PS结合的主要结构域(Andersen等人,(2000)Biochemistry[生物化学],39(20):6200-6；Shi&Gilbert(2003)Blood[血液],101:2628-2636；Shao等人,(2008)J Biol Chem.[生物化学杂志],283(11):7230-41)。总之，这些发现表明，C1结构域是MFG-E8工程改造的蛋白的主要整体PS结合结构域，并且对于PS结合依赖性功能很重要。这样，C1结构域可用于取代进入异源蛋白以赋予PS结合；但是，对于包含C1-C2或C1-C1串联结构域的融合蛋白，显示最高PS结合(未显示)。
3.2αv整联蛋白粘附测定
将融合蛋白在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，并通过吸附(96孔板，NuncMaxisorb)过夜(1.2nM/孔)来固定50μL的24nM溶液。随后在室温下用含有3％无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的PBS处理板1.5小时。将表达αvβ3整联蛋白的淋巴瘤细胞(ATCC-TIB-48BW5147.G.1.4，ATCC，美国)培养在补充有GlutaMax、25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、1mM丙酮酸钠、50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640中。在粘附实验前一天将细胞分开。用3μg/mL2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯(BCECF AM)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc)，美国)标记细胞30分钟。将BW5147.G.1.4细胞重悬浮于粘附缓冲液(TBS，0.5％BSA，1mM MnCl2，pH 7.4)中，并在RT下使50000个细胞/孔粘附40分钟。通过用粘附缓冲液反复洗涤除去非粘附细胞。使用EnvisionTM 2103多标记酶标仪，珀金埃尔默公司，美国对粘附细胞的荧光进行定量。使用MS Excel和GraphPad Prism软件进行数据分析。
细胞对固定化的融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42)的粘附被αv整联蛋白抑制剂西仑吉肽或10mM EDTA完全阻断，表明细胞对固定化的工程改造的蛋白的整联蛋白依赖性粘附(图5A)。EGF样结构域(FP280；SEQ ID NO:38)的整联蛋白结合基序RGD的单点突变(RGD>RGE)导致细胞粘附的完全消除，表明融合蛋白中有功能性且易于接近的RGD结合基序对于αv整联蛋白依赖性粘附至关重要(图5B)。固定化的缺乏C1-C2结构域的EGF-HSA蛋白FP250(SEQ ID NO:32)尽管有EGF样结构域，但不支持或仅勉强支持BW5147.G.1.4细胞的粘附(图5C)。该发现表明，在测试的实验条件下，可能由于空间原因，融合至HSA的EGF样结构域中的RGD环可能不足以能够接近细胞表面整联蛋白。一旦C1、C2或C1-C2在C末端位置融合到EGF-HSA，这种干扰就不明显了。如果在CHO细胞或HEK细胞中表达，则本披露的重组蛋白例如FP330类似于wtMFG-E8地促进αv-整联蛋白依赖性细胞粘附(图5D)。
综上所述，这些数据表明，本披露的融合蛋白与细胞整联蛋白结合，支持整联蛋白依赖性细胞粘附，并表明在具有HSA结构域插入物的蛋白中，C末端EGF样结构域可以从C末端融合的蛋白结构域获益以支持整联蛋白结合。
3.3人巨噬细胞-中性粒细胞胞葬作用测定
通过Ficoll梯度离心(
Figure BDA0003527831370001151
-Paque PLUS，通用健康医疗集团，瑞典)从血沉棕黄层中分离出人外周血单核细胞(PBMC)，然后使用干细胞分离试剂盒(干细胞19059，温哥华，加拿大)对单核细胞进行负选择。使用重组人M-CSF 40ng/mL(巨噬细胞集落刺激因子，R&D系统公司(R&D Systems)，美国)在含有25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、1mM NaPyr，50μMβ-Merc的RPMI 1640中5天，使单核细胞分化为“M0”巨噬细胞。胞葬作用前一天，使用红色荧光染料接头试剂盒(西格玛公司(Sigma)MINI26，美国)用PKH26标记巨噬细胞。将细胞重悬浮于包含25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、1mM NaPyr、50μMβ-Merc的RPMI 1640中，并以40000个细胞/孔接种到黑色96孔板(康宁公司(Corning)，美国)中，并允许粘附20小时。
中性粒细胞：通过葡聚糖沉降结合FicollTM密度梯度从血沉棕黄层中分离出人中性粒细胞，如下所示：通过稀释的血沉棕黄层的离心除去血沉棕黄层的血浆。将细胞收获物用1％葡聚糖(得自明串珠菌属物种，MW 450.000-650.000；西格玛公司，美国)稀释，并在冰上沉降20-30分钟。
从上清液收集白细胞并置于FicollTM-Paque层(通用健康医疗集团瑞典)上。离心后，收集沉淀，并使用红细胞(RBC)裂解缓冲液(生物概念公司(BioConcept)，瑞士)裂解剩余的红细胞。中性粒细胞在培养基(含有25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、0.1mM NaPyr、50uM b-Merc的RPMI 1640+GlutaMax)中洗涤一次，并在15℃保持过夜。细胞凋亡/细胞死亡是通过在37℃下用1μg/mL Superfas Ligand(恩佐生命科学公司(Enzo Life Sciences)，洛桑，瑞士)处理中性粒细胞3小时而诱导的。中性粒细胞用Hoechst 33342(生命技术公司(Life technologies)，美国)染色25分钟，并用DRAQ5(e生物科学公司(eBioscience)，英国，1:2000稀释)在37℃在黑暗中染色5分钟。
胞葬作用测定
将M0巨噬细胞与融合蛋白一起孵育30分钟。以M0/中性粒细胞1:4的比率添加凋亡标记的中性粒细胞。利用中性粒细胞在M0巨噬细胞的低pH溶酶体区室中定位后DRAQ5的荧光强度增加，可以看到巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的胞葬作用。
使用ImageXpress Micro XLS广域高含量分析系统(分子设备公司加利福尼亚州，美国)对胞葬作用进行定量。通过PKH26荧光鉴定巨噬细胞。胞葬作用指数(EI，显示为％)被计算为包含至少一个摄入的凋亡中性粒细胞(DRAQ5高)事件的巨噬细胞与巨噬细胞总数的比率。使用MS Excel和GraphPad Prism软件进行数据分析。
图6中显示了融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)在促进人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的胞葬作用方面的作用。融合蛋白增加了经pHrodo标记的濒死人中性粒细胞内化进入巨噬细胞，超过了M0巨噬细胞已有的高胞葬作用能力(其显示为基础水平)。在图7中，显示了重组融合蛋白FP278可以挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的被内毒素(脂多糖)损害的胞葬作用。图7A显示了在三个人供体中，通过100pg/ml的脂多糖(LPS)损害巨噬细胞对濒死的人中性粒细胞的胞葬作用。左分图显示了单个供体的应答，右分图显示了三个供体的平均胞葬作用(％)。图7B显示了融合蛋白FP278挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的这种被内毒素(LPS)损害的胞葬作用。
图8显示了融合蛋白FP330挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的被金黄色葡萄球菌颗粒损害的胞葬作用。图8A显示了浓度为100nM的融合蛋白在促进胞葬作用方面的超过基础水平的作用(虚线；图的左手部分)，以及100nM的融合蛋白在挽救由添加金黄色葡萄球菌引起的胞葬作用受损方面的作用(图的右手部分)。图8B显示了增加融合蛋白FP278(EC508nM)的浓度对挽救因添加金黄色葡萄球菌而引起的受损胞葬作用的作用，以及一旦达到胞葬作用的基本水平对促进胞葬作用的作用。
3.4人内皮细胞-Jurkat胞葬作用测定
细胞培养
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自龙沙公司(Lonza)(巴塞尔，瑞士)。在包被明胶(来自牛皮肤，PBS中终浓度为0.2％，2％储备液的稀释液，西格玛公司，德国)的烧瓶中培养细胞。细胞在补充了10％FBS(通用健康医疗集团，英国)、1％Pen/Strep(赛默飞世尔科技公司，美国)、1％Glutamax(赛默飞世尔科技公司，美国)和1ng/mL的重组成纤维细胞生长因子-基本(派普泰克公司(Peprotech)，英国)的培养基199(赛默飞世尔科技公司，美国)下生长。使用AccutaseTM(赛默飞世尔科技公司，美国)分离细胞以进行收获或传代。
Jurkat E6-1细胞获自ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国)，并在补充有10％FBS(通用健康医疗集团，英国)、1％Pen/Strep(赛默飞世尔科技公司，美国)、10mM丙酮酸钠(赛默飞世尔科技公司，美国)和10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，赛默飞世尔科技公司，美国)的培养基RPMI 1640(赛默飞世尔科技公司，美国)中生长。
使用重组人TRAIL(R&D系统公司，美国)诱导Jurkat E6-1细胞的凋亡。用pHrodoTM绿色STP酯染料(赛默飞世尔科技公司，美国)标记凋亡细胞。用补充有1％FBS(通用健康医疗集团，英国)，0.05％w/v叠氮化钠(默克公司(Merck)，德国)和0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸，赛默飞世尔科技公司，美国)的PBS(赛默飞世尔科技公司，美国)制备流式细胞术缓冲液。
胞葬作用测定
在第1天，通过用AccutaseTM分离5分钟来收集HUVEC(70％-90％汇合)，用PBS洗涤并重悬浮在细胞培养基中。根据制造商的说明，使用Guava EasyCyte流式细胞仪(默克公司，德国)和Guava ViaCount试剂(默克公司，德国)评估细胞数量和活力。将所需量的细胞在室温下以300xg离心5分钟，并且重悬浮在培养基中，以使细胞数量为6.6x104个细胞/mL。将150μL/孔的这种细胞悬液添加到96孔组织培养板(CorningTM，美国)中。将HUVEC在37℃/5％CO2/95％湿度的培养箱中再培养16-20小时。
根据制造商的说明，使用Guava EasyCyte流式细胞仪(默克公司，德国)和GuavaViaCount试剂(默克公司，德国)评估Jurkat E6-1细胞数量和生存力/细胞死亡状态。将所需量的细胞在室温下以300xg离心5分钟，并且以1x106个细胞/mL的密度重悬浮于补充有终浓度为50ng/mL的重组人TRAIL的培养基中。在37℃/5％CO2/95％湿度下过夜来诱导细胞死亡。
在第2天，通过抽吸从HUVEC去除培养基，并添加25μL新鲜的预热(37℃)培养基，然后添加在预热(37℃)培养基中稀释的25μL融合蛋白或对照。为了稀释，使用非结合表面(NBS)处理的96孔板(CorningTM，美国)。在添加濒死的Jurkat细胞之前，使融合蛋白在37℃/5％CO2/95％湿度下与HUVEC相互作用30分钟。
使用Guava EasyCyte流式细胞仪(默克公司，德国)和Guava ViaCount试剂(默克公司，德国)对凋亡/濒死Jurkat E6-1细胞数量进行计数。将所需量的凋亡细胞在室温下以400xg离心5分钟，并且以5x106个细胞/mL的密度重悬浮在补充有终浓度为5μg/mL的pHrodoTM绿色STP酯染料的RPMI 1640培养基(无FBS)(染色培养基)中。在37℃染色10分钟后，剩余的反应性pHrodoTM绿色STP酯用补充有10％FBS的染色培养基在37℃失活5分钟。将pHrodoTM绿色标记的细胞洗涤一次，并在HUVEC培养基中将细胞数量调整为3x106个细胞/mL。将1.5x106/孔的经pHrodoTM绿色标记的Jurkat细胞添加至HUVEC，并在37℃/5％CO2/95％湿度下孵育5小时。除去培养基，将HUVEC在PBS中洗涤一次，并通过40μL/孔的AccutaseTM溶液进行分离。添加80μL冰冷的流式细胞术缓冲液收集细胞，转移到1.5mL聚丙烯96孔块中，用过量的冰冷的流式细胞术缓冲液洗涤，并在400xg(4℃)下离心5分钟。通过抽吸去除上清液，并且将沉淀物重悬浮于80μL冰冷的流式细胞术缓冲液中，并转移至96孔V型底微量滴定板(BD生物科学公司(BD Biosciences)，美国)中。然后在BD LSRFortessaTM流式细胞仪(BD生物科学公司，美国)上测量样品。记录了pHrodoTM绿色荧光强度，作为吞噬的Jurkat细胞的溶酶体定位的指标。使用FlowJoTM软件进行流式细胞术数据分析。来自单重门控HUVEC的pHrodoTM绿色信号的中值荧光强度(MFI)值用作读出。使用MS Excel和GraphPadPrism软件进行数据分析以进行EC50计算。
融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)和FP270(EGF-HSA-C2；SEQ ID NO:36)在促进HUVEC内皮细胞对濒死Jurkat细胞的胞葬作用方面的作用如图9所示。融合蛋白FP278可以有力促进HUVEC对经pHrodo标记的濒死人Jurkat T细胞的内化作用。结果表明，内皮细胞被融合蛋白武装成为濒死细胞的有效吞噬细胞。出人意料的是，在该测定中融合蛋白的功效明显取决于C1-C2或C1-C1串联结构域的存在。例如，由EGF-HSA-C2(FP270)组成的融合蛋白在该实验环境中是失活的，如图9所示。图10证明了我们非常出人意料的发现，即工程改造的蛋白中HSA结构域的位置，即N或C末端位置(分别是HSA-EGF-C1-C2(FP220；SEQ ID NO:30)或EGF-C1-C2-HSA(分别为FP110；SEQ ID NO:28))在MFG-E8HSA工程改造的蛋白的巨噬细胞胞葬作用测定中赋予了胞葬作用阻断能力。这些数据清楚地证明了将HSA结构域定位在整联蛋白结合结构域和PS结合结构域之间对于有效促进本披露的融合蛋白的胞葬作用的重要性。
图11显示了通过各种形式的融合蛋白(包括EGF结构域、C1-C2结构域、HSA或Fc结构域的组合)促进内皮细胞胞葬作用的比较。图11A显示了包含HSA(其中HSA位于C末端或N末端或在EGF样结构域和C1-C2结构域之间)的融合蛋白的比较；分别是EGF-C1-C2-HSA(FP110；SEQ ID NO:28)，HSA-EGF-C1-C2(FP220；SEQ ID NO:30)和EGF-HSA-C1-C2-His标签(FP278；SEQ ID NO:44)。图11B显示了包含Fc结构域(Fc位于C末端或在EGF样结构域与C1结构域之间)的融合蛋白的比较。显示了Fc部分的两种形式：FP070(EGF-Fc-C1-C2；SEQ IDNO:17)和FP080(EGF-C1-C2-Fc；SEQ ID NO:22)中发现的野生型Fc(SEQ ID NO:7)和Fc的一个臂上有KiH修饰S354C和T366W的Fc部分(FP060；EGF-C1-C2-Fc[S354C，T366W]；SEQ IDNO:14)EU编号(Merchant等人(1998)同上)。图11C显示了针对以三种不同浓度(0.72、7.2和72nM)的三个批次的FP090，包含位于N末端的Fc部分的融合蛋白FP090(Fc-EGF-C1-C2；SEQId NO:24)的比较，其中与wtMFG-E8对照对比。HUVEC对濒死Jurkat细胞的胞葬作用仅由在EGF样结构域后插入HSA或Fc部分的工程改造的蛋白来促进。图11D显示，增溶结构域的插入可基于内源性桥接蛋白EDIL3(MFG-E8的旁系同源物)产生新的生物活性融合蛋白。如图11D所示，HSA插入在MFG-E8的旁系同源物EDIL3的EGF样结构域和C1-C2结构域之间。该EDIL3构建体(FP050(基于EDIL3的EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:12)仅具有在wtEDIL3中发现的3个EGF样结构域中的一个(含RGD环)。在该构建体中，我们出乎意料地发现了HSA结构域插入物关于具有很高纯度的新型重组工程改造蛋白的表达具有相似的容忍性(图2B)。另外，出人意料地发现，衍生自EDIL3的重组工程改造蛋白FP050促进内皮细胞(HUVECS)对濒死Jurkat细胞的胞葬作用，证明了桥接蛋白的核心功能，并示例了桥接蛋白的结构域可用于设计功能性的新颖的重组工程改造蛋白。
实例4：促血栓形成性血浆微粒的胞葬作用
4.1人内皮细胞微粒胞葬作用测定
细胞培养
HUVEC细胞获自龙沙公司(巴塞尔，瑞士)。在包被明胶(来自牛皮肤，PBS中终浓度为0.2％，2％储备液的稀释液，西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)/默克公司，德国)的烧瓶中培养细胞。细胞在补充了10％FBS(通用健康医疗集团，英国)、1％Pen/Strep(赛默飞世尔科技公司，美国)、1％Glutamax(赛默飞世尔科技公司，美国)和1ng/mL的重组成纤维细胞生长因子-基本(派普泰克公司，英国)的培养基199(赛默飞世尔科技公司，美国)下生长。使用AccutaseTM(赛默飞世尔科技公司，美国)分离细胞以进行收获或传代。
根据以下程序制备血小板衍生的微粒：获得书面知情同意后，从健康成人志愿者那里收集柠檬酸化静脉血(凝血9NC柠檬酸盐Monovette(Coagulation 9NC CitrateMonovette)，萨斯泰特(Sarstedt)，德国)。通过离心(200xg，15分钟，无制动，室温)制备富含血小板的血浆(PRP)。血小板衍生的微粒/碎片是通过在37℃下使用液氮和解冻对PRP进行三个速冻/冷冻循环而产生的。通过在RT在20’000xg离心15分钟沉淀血小板片段/微粒。将沉淀物重悬浮于PBS中，制备等分试样并储存在-80℃。如使用Alexa FluorTM 488标记的鼠MFG-E8/乳凝集素(诺华公司(Novartis)内部)通过流式细胞术测定，微粒制剂是85％-100％PS阳性的。使用专用计数珠(BioCytex/Stago公司，法国)确定微粒的数量。用补充有1％FBS(通用健康医疗集团，英国)，0.05％w/v叠氮化钠(默克公司(Merck)，德国)和0.5mMEDTA(乙二胺四乙酸，赛默飞世尔科技公司，美国)的PBS(赛默飞世尔科技公司，美国)制备流式细胞术缓冲液。
4.2胞葬作用测定
在第1天，通过用AccutaseTM分离5分钟来收集HUVEC细胞(70％-90％汇合)，用PBS洗涤并重悬浮在细胞培养基中。根据制造商的说明，使用Guava EasyCyte流式细胞仪(默克公司，德国)和Guava ViaCount试剂(默克公司，德国)评估细胞数量和活力。将所需量的细胞在室温下以300xg离心5分钟，并且重悬浮在培养基中，以使细胞数量为6.6x104个细胞/mL。将150μL/孔的这种细胞悬液添加到96孔组织培养板(CorningTM，美国)中。将HUVEC细胞在37℃/5％CO2/95％湿度的培养箱中再培养16-20小时。
在第2天，通过抽吸从HUVEC细胞去除培养基，并添加25μL新鲜的预热(37℃)培养基，然后添加在预热(37℃)培养基中稀释的25μL融合蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)(三种不同浓度：0.3nM，3nM或30nM)或对照。为了稀释，使用非结合表面(NBS)处理的96孔板(CorningTM，美国)。在添加血小板衍生的微粒之前，让测试蛋白在37℃/5％CO2/95％湿度下与HUVEC细胞相互作用30分钟。
将所需量的微粒在4℃下以20’000xg离心15分钟，并且以2x108个颗粒/mL的密度重悬浮在补充有终浓度为5μg/mL的pHrodoTM绿色STP酯染料的RPMI 1640培养基(无FBS)(染色培养基)中。在37℃染色10分钟后，剩余的反应性pHrodoTM绿色STP酯用补充有10％FBS的染色培养基在37℃失活5分钟。将pHrodoTM绿色标记的微粒通过在4℃下以20’000xg离心15分钟洗涤一次，并在HUVEC细胞培养基中将数量调整为1x108个颗粒/mL。将5x106个颗粒/孔的经pHrodoTM绿色标记的微粒添加至HUVEC细胞，并在37℃/5％CO2/95％湿度下孵育5小时。除去培养基，将HUVEC细胞在PBS中洗涤一次，并通过40μL/孔的AccutaseTM溶液进行分离。添加80μL冰冷的流式细胞术缓冲液收集细胞，转移到1.5mL聚丙烯96孔块中，用过量的冰冷的流式细胞术缓冲液洗涤，并在400xg(4℃)下离心5分钟。通过抽吸去除上清液，并且将沉淀物重悬浮于80μL冰冷的流式细胞术缓冲液中，并转移至96孔V型底微量滴定板(BD生物科学公司，美国)中。在BD LSRFortessaTM流式细胞仪(BD生物科学公司，美国)上测量样品。记录了pHrodoTM绿色荧光强度，作为吞噬的微粒的溶酶体定位的指标。使用FlowJoTM软件进行流式细胞术数据分析。来自单重门控HUVEC细胞的pHrodoTM绿色信号的中值荧光强度值(MFI)用作读出。使用MS Excel和GraphPad Prism软件进行数据分析以进行EC50计算。融合蛋白FP278以浓度依赖的方式促进内皮细胞对血小板衍生的微粒的胞葬作用，如图12所示。摄取的促进是浓度依赖性的，并且在其他类型的内皮细胞中也观察到(未显示)。
实例5：MFG-E8-HSA融合蛋白的技术特性
5.1融合蛋白FP330与FcRn的表面等离子体共振(SPR)结合分析
进行直接结合测定以表征融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID NO:42)与FcRn的结合。使用重组人FcRn作为分析物，在捕获的蛋白上测量动力学结合亲和常数(KD)。在室温下并分别在pH 5.8和7.4下在
Figure BDA0003527831370001241
T200(瑞士格拉特布鲁格市通用健康医疗集团(GE Healthcare,Glattbrugg,Switzerland))上进行测量。为进行亲和力测量，将蛋白在10mM NaP、150mM NaCl、0.05％Tween 20(pH 5.8)中稀释并根据制造商的建议(通用健康医疗集团)使用标准程序固定在CM5研究级传感器芯片(通用健康医疗集团，参考号BR-1000-14)的流动池上。为了用作参考，将一个流动池作为空白样固定。通过随后在参考和测量流动池上注射分析物稀释液系列获得结合数据。纳入零浓度样品(仅操作缓冲液)以允许在数据评价期间进行双重参考。为了进行数据评价，使用了双重参考的传感图并分析了解离常数(KD)。
融合蛋白FP330在pH 5.8下以1380nM的亲和力与FcRn结合，而在pH 7.4下未观察到结合(参见以上表5)。这些结果与野生型HSA(1000-2000nM，pH 5.8，数据未显示)很好地一致。
5.2 MFG-E8及变体的差示扫描量热法(DSC)
使用差示扫描量热法测量工程改造的MFG-E8蛋白变体FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)的热稳定性。在差示扫描微量热计(Nano DSC，TA仪器公司(TAinstruments))上进行测量。池容积为0.5ml并且加热速率为1℃/分钟。蛋白以在PBS(pH7.4)中1mg/ml的浓度使用。通过与含有相同缓冲液的重复样品(其中没有蛋白)进行比较来估计蛋白的摩尔热容。使用标准程序分析部分摩尔热容和熔融曲线。对热谱图进行基线校正和浓度标准化。观察到两个熔化事件，第一Tm在50℃，第二Tm在64℃。
5.3 MFG-E8变体的聚集倾向和溶解度测量
首先，通过动态光散射(DLS，怀雅特公司(Wyatt))测量MFG-E8变体蛋白FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID NO:44)的聚集倾向。使用动态光散射通过定量散射光中的动态波动来测量溶液中FP278的平移扩散系数。未经分级分离的蛋白变体尺寸分布提供了多分散性估算值以及流体动力学半径，在1mg/ml的浓度下测量所述参数。使用DynaProTM读板仪(德国代恩巴赫市怀雅特技术欧洲有限公司(Wyatt Technology Europe GmbH,Dernbach,Germany))结合软件DYNAMICS(7.1.0.25版，怀雅特公司)测定融合蛋白FP278的流体动力学半径。在384孔板(384圆孔板，聚苯乙烯，赛默飞世尔科技公司,朗根塞尔博德市(Langenselbold),德国))中测量了50μL未稀释并过滤(0.22μm PVDF-过滤器(
Figure BDA0003527831370001251
注射筒驱动的过滤器单元，比尔里卡市密理博公司(Millipore,Billerica),美国)的蛋白溶液。未能鉴定蛋白样品的更高分子量聚集体。蛋白的流体动力学半径约为5-6nm，表明溶液中存在单体蛋白。
其次，对融合蛋白FP278进行浓度依赖性的流体动力学半径测量，以估计蛋白的溶解度。应用了高达22mg/ml的蛋白浓度。如上所述确定流体动力学半径。融合蛋白FP278浓度的增加后，未能观察到半径(5-7nm)的增加，而wtMFG-E8(SEQ ID NO:1)的动态光散射测量因在浓度约0.2mg/ml处的高聚集而失败。
实例6：MFG-E8融合蛋白的优化
质谱(MS)用于研究融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2)，以产生一组基于变体MFG-E8的融合蛋白，所述融合蛋白经优化以提高表达和产率。产生了一组具有不同大小和结构的接头(例如，在EGF和HSA结构域之间的包含GS的接头和/或在HSA和C1结构域之间的包含GS或G4S的倍数的接头)的变体蛋白。另外，在所述变体的一些中包括包含缺失或取代的氨基酸修饰(在表7中示为HSA*)。变体融合蛋白的组总结在下表7中。
表7：变体融合蛋白总结
Figure BDA0003527831370001261
1氨基酸修饰的位置根据SEQ ID NO:42(FP330)进行编号
实例7：变体MFG-E8融合蛋白；表达和纯化
实例2中描述了在HEK细胞系中产生融合蛋白的方法。为了在专有的CHO细胞系中表达，在基因艺术公司(Geneart)(生命技术公司(LifeTechnologies))合成了编码MFG-E8变体的核酸，并使用基于限制性酶连接的克隆技术将其克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒转染到CHO-S细胞(赛默公司)中。简而言之，为了瞬时表达融合蛋白，使用ExpifectamineCHO转染剂(赛默公司)将表达载体转染到悬浮液适应的CHO-S细胞中。典型地，用含有400μg编码工程改造的蛋白的表达载体的DNA转染以6Mio细胞/ml的密度悬浮的400ml细胞。然后将重组表达载体引入宿主细胞以在培养基(ExpiCHO表达培养基，补充有ExpiCHO料和增强剂(赛默公司))中进一步分泌七天。
从表8所示的表达数据中可以看出，变体融合蛋白FP068(SEQ ID NO:46)和FP776(SEQ ID NO:48)的表达比融合蛋白FP330(SEQ ID NO:42)大约提高了两倍。
表8：在HEK和CHO*细胞系中融合蛋白的表达
Figure BDA0003527831370001271
*表示在CHO细胞系中产生的融合蛋白
根据实例1所述的方法，获得了其他治疗性融合蛋白。例如，完全纯化过程(捕获和精制)后获得的表达水平(mg/l)对于Seq ID 80是4.3并且对于Seq ID 82是8.4。
实例8：变体融合蛋白的表征
如实例3所述，通过进行胞葬作用测定来确定变体融合蛋白对胞葬作用的作用。
在第一测定中，根据上文第3.3节中描述的方法确定了变体融合蛋白在人巨噬细胞-中性粒细胞胞葬作用测定中的作用。将M0巨噬细胞与融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No:42)或变体FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID No:44)或FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No:48)孵育30分钟。如图13所示，融合蛋白FP330、FP278和FP776可以挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的被内毒素(脂多糖(LPS))损害的胞葬作用。融合蛋白FP330(EC50＝1.6nM；图13A)、FP278(EC50＝1.78nM；图13B)和FP776(EC50＝0.5nM；图13C)导致挽救由于添加LPS引起的受损的胞葬作用，标签在达到基本水平后甚至促进了胞葬作用。
根据上文3.4节中描述的方法，在人内皮(HUVEC)细胞-Jurkat细胞胞葬作用测定中进一步表征了融合蛋白FP330、FP278和FP776。融合蛋白FP330、FP278和FP776在促进HUVEC内皮细胞对濒死Jurkat细胞的胞葬作用方面的作用如图14所示。通过增加FP330(EC50＝3.4nM；图14A)、FP278(EC50＝2.4nM；图14B)和FP776(EC50＝3nM；图14C)浓度来有力地促进HUVEC对经pHrodo标记的濒死人Jurkat T细胞的内化作用。这些结果表明，内皮细胞被融合蛋白武装成为濒死细胞的有效吞噬细胞。
实例9：保护小鼠免受AKI和AKI触发的急性器官应答
9.1急性肾损伤模型
从法国查尔斯河公司购买雌性C57BL/6小鼠(18-22g)，将其置于温度控制的设备中在顶部过滤器保护的笼子中(12小时的明/暗循环)。严格按照瑞士联邦法律和NIH实验动物护理原则处理动物。在手术前两小时腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)施用被测治疗性融合蛋白。手术前60至30分钟以0.1mg/kg的剂量皮下(s.c.)注射丁丙诺啡(亿维德瑞士公司(Indivior Schweiz AG))。手术前在麻醉室(3.5-5Vol.％，载气：氧气)中诱导使用异氟烷进行吸入麻醉5分钟。在手术期间，通过面罩用1-2Vol％异氟烷/氧气将动物维持在麻醉下，气体流速为0.8-1.2l/分钟。将腹部皮肤剃毛并用Betaseptic(穆迪药物公司，法国)消毒。将动物置于具有恒温监测系统(PhysiTemp公司，美国Physitemp仪器公司(US-PhysitempInstruments LLC)，美国)的恒温毯(罗塔彻公司(Rothacher)-瑞士)上，并用无菌纱布覆盖。在整个手术过程中，通过直肠探针(Physitemp仪器公司，美国)监测体温，并控制其体温为36.5℃-37.5℃。包括假手术对照在内的所有动物均接受了右肾的单侧肾切除术：中线切口/剖腹手术后，将腹部内容物向左缩回以暴露右肾。断开并结扎右输尿管和肾血管，然后取出右肾。对于进行了AKI的动物，将腹部内容物放在无菌纱布上的右侧，并解剖左肾动脉和静脉，以夹住用于诱导缺血。使用微动脉瘤夹(B Braun公司，瑞士)夹住肾蒂(使用一个夹将动脉和静脉夹在一起)，以阻断血液流向肾并诱导肾缺血。肾从红色到深紫色的颜色变化证实了成功缺血，这在几秒钟内发生。诱导缺血后(35-38分钟)，移开微动脉瘤夹。在伤口闭合之前，使用温热的无菌盐水(约2ml，37℃)冲洗腹部内容物以使组织水化。洗涤后，腹膜内地另外添加1ml无菌盐水作为补液。开始再灌注时，伤口分为两层(分别是肌肉和皮肤)闭合。然后将动物保持在红色暖灯下直至完全康复。手术后1小时和4小时再次施用丁丙诺啡，剂量为0.1mg/kg，并且也包括在饮用水中(9.091μg/mL)。24小时后，对动物实施安乐死进行分析。
9.2治疗性融合蛋白的施用
治疗性融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No:42)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID No:44)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No:48)如上所述在AKI模型中以下表9中列出的剂量进行测试。为了检测血清标志物和qPCR标志物表达的研究，在手术前2小时施用融合蛋白FP278。FP330和FP776经静脉内给药。缺血再灌注损伤发作前30分钟。为了通过磁共振成像来测量造影剂摄取的研究，在AKI诱导前30分钟预防性给予剂量为1.26mg/kg的融合蛋白FP776，或在缺血再灌注损伤诱导后5小时治疗性静脉内给予以2mg/kg。
表9：治疗性融合蛋白的给药
Figure BDA0003527831370001291
Figure BDA0003527831370001301
9.3读出/AKI保护分析：
血清标志物：
缺血再灌注诱导后24小时取血清样品，并根据制造商的说明(Axonlab公司，瑞士)使用Hitachi M40临床分析仪分析血清肌酐和血液尿素氮(BUN)含量。
器官中的qPCR标志物表达：
AKI诱导后24小时收获器官(肾、肝、肺和心)，并且切成1厘米的片段，并在4℃下于RNA晚缓冲液(RNA Later buffer)(赛默飞世尔科技公司，美国)中储存过夜。将器官片段转移至在裂解基质D(Lysing Matrix D)管(MP生物医药公司(MP Biomedicals)法国)中含有134mMβ-巯基乙醇(默克公司，德国)的RLT缓冲液(RNeasy微量试剂盒，凯杰公司(Qiagen)，DE)中，并使用FastPrep-24仪器(MP生物医药公司)进行均质化。随后用蛋白酶K(RNeasy微量试剂盒)消化心纤维组织，同时在微量离心机(艾本德公司(Eppendorf)，德国)中将肾、肝和肺裂解物直接全速离心3分钟。将上清液转移至QIAshredder旋转柱(凯杰公司，德国)上并离心2分钟。根据RNeasy微量试剂盒手册(包括DNA酶消化)对流过液进行RNA提取。使用Nano Drop 1000设备(赛默飞世尔科技公司)测量RNA浓度。使用SimpliAmp Thermocycler(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，美国)，根据高容量cDNA逆转录试剂盒手册(赛默飞世尔科技公司)，将每个样品2μg RNA进行反转录。将cDNA与无核酸酶的水(赛默飞世尔科技公司)、TaqMan探针(TaqMan基因表达测定(FAM)、赛默飞世尔科技公司)和TaqMan基因表达预混液(赛默飞世尔科技公司)在384孔微孔板(MicroAmp光学384孔反应板，赛默飞世尔科技公司)中组合。qPCR在ViiA 7实时PCR系统(应用生物系统公司，美国)上进行。设定为1：2分钟，50℃；2：10分钟，95℃；3：15s，95℃；4：1分钟，60℃。重复步骤3和4进行45个循环。使用ViiA 7软件进行数据分析，使用MS Excel和GraphPad Prism软件进行qPCR数据分析软件。
通过磁共振成像(MRI)测量的肝对造影剂的摄取
进行MRI的方法改编自Egger等人的出版物(Egger等人,(2015)J Magn ResonImaging[磁共振成像杂志],41:829-840)。实验是在7-T Bruker Biospec MRI系统(BrukerBiospin公司，埃特林根(Ettlingen)，德国)上进行的。在MRI信号采集期间，将小鼠仰卧在Plexiglas支架中。用加热垫将体温保持在37℃±1℃。短暂的诱导期后，用通过鼻锥施用的在O2/N2O(1:2)混合物中的约1.4％异氟烷维持麻醉。所有测量均在自发呼吸的动物上进行；既没有应用心脏触发也没有应用呼吸触发。
将小鼠放在扫描仪中后，可以获取侦察性快速图像用于定位目的。使用包含超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒(
Figure BDA0003527831370001311
瓜尔贝特(Guerbet)，法国)的血管内药剂进行灌注分析。(诱导疾病后24小时)或进行假手术后(肾切除术后24h的动物)将
Figure BDA0003527831370001312
推注1.2s静脉注射到患有AKI的动物中。在1.2s内施用第一推注，并以400ms/图像的分辨率顺序采集回波平面图像。采集25个基线图像后，在1.2s内施用第二推注，推注之后又采集了575个图像，从而在4分钟内总共获得了600个图像。超顺磁性造影剂引起敏感性的局部变化，这导致信号衰减与肾灌注成比例。对于一系列图像，对位于皮质/外髓质外纹中的目的区域(ROI)进行信号强度评估。仔细选择ROI的位置、形状和大小，以确保尽管呼吸引起肾移动，但它们覆盖大约相同的区域。注射前图像的平均信号强度提供了基线强度(S(0))。根据以下比率的平均值确定灌注指数(Rosen等人,(1990)Magn Reson Med.[医学中的磁共振],14:249-265):
-ln[S(t)/S(0)]～TE.V.cT(t)
其中TE是回波时间，V是血液量，并且cT是造影剂的浓度。
研究中使用的SPIO纳米粒子的平均直径为约150nm，并被肝中的枯否细胞吸收。因此，除了肾灌注以外，MRI还可以通过检测位于肝中的ROI中评估的对比度变化来监测肝中纳米颗粒的摄取。
9.4结果
如图15所示，当进行腹膜内施用(FP278)或静脉内施用(FP330和FP776)时，融合蛋白FP330(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No:42)、FP278(EGF-HSA-C1-C2-His标签；SEQ ID No:44)和FP776(EGF-HSA-C1-C2；SEQ ID No:48)在这种急性肾损伤(AKI)模型中保护肾功能。血清肌酐升高(sCr)的阻断反映了这种保护作用。图15A显示，与媒介物处理的动物相比，在两种测试剂量下的融合蛋白FP278都显著降低了血清肌酐水平(p<0.0001)，并且与鼠MFG-E8一样有效。如图15B所示，融合蛋白FP330以剂量依赖性方式保护肾功能，并且对于融合蛋白FP776(图15C)同样如此，其中血清肌酐水平也以剂量依赖性方式被阻断。
肾功能受损也反映在测试的小鼠的血液尿素氮(BUN)水平方面，并且融合蛋白FP278对BUN水平的作用如图16所示。
总之，如图15和16所示，融合蛋白FP278、FP330和FP776有力地防止了这些用于临床诊断肾衰竭的标志物的升高。通过组织学证实了观察到的功效(未显示)。
此外，如图17所示，单剂量的融合蛋白FP278保护远处器官免受由AKI引起的急性期应答。AKI诱导过量的mRNA应答，所述应答可以通过qPCR在远处的高度灌注器官(例如脾、肺、肝、心和脑)的裂解物中测量。典型的mRNA诱导选择性损伤(NGAL、KIM-1)、趋化因子的诱导(未显示)或急性期应答蛋白(例如血清淀粉样蛋白A(SAA))诱导的诱导。图17A和17B例示了在鼠心和肺中这种由AKI诱导的应答(血清淀粉样蛋白A(SAA))，所述应答在单次注射融合蛋白后被有力地被阻断并恢复到假手术水平。
肝随时间对SPIO造影剂
Figure BDA0003527831370001331
的摄取如图18所示。与假手术动物相比，患有AKI的动物显示肝对造影剂的摄取显著降低(靶＝枯否细胞)。FP776治疗(在AKI诱导前-30分钟预防性地以1.26mg/kg给药，或在缺血再灌注损伤诱导后+5小时治疗性地以2mg/kg给药)保护AKI小鼠肝中造影剂积累免受损失。这些结果表明，在该小鼠模型中，AKI引起内源性枯否细胞介导的微粒清除的显著受损，并且AKI引起微血管紊乱，这影响肝中铁颗粒造影剂的积累。与假手术动物相比，用融合蛋白FP776进行处理可防止清除受损失和微血管紊乱，并且甚至可以增强两种测试剂量下造影剂的摄取。
实例10:MFG-E8-HSA工程改造的蛋白的表征
10.2αv整联蛋白粘附测定
将融合蛋白在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，并通过吸附(96孔板，NuncMaxisorb)过夜来固定50μL的指示浓度。随后在室温下用含有3％无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的PBS处理板1.5小时。将表达αvβ3整联蛋白的淋巴瘤细胞(ATCC-TIB-48BW5147.G.1.4，ATCC，美国)培养在补充有GlutaMax、25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、1mM丙酮酸钠、50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640中。用3μg/mL 2',7'-双-(2羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯(BCECF AM)(赛默飞世尔科技公司，美国)标记细胞30分钟。将BW5147.G.1.4细胞重悬浮于粘附缓冲液(TBS，0.5％BSA，1mM MnCl2，pH 7.4)中，并在RT下使50000个细胞/孔粘附40分钟。通过用粘附缓冲液手动洗涤除去非粘附细胞。使用EnvisionTM 2103多标记酶标仪，珀金埃尔默公司，美国对粘附细胞的荧光进行定量。使用MSExcel和GraphPad Prism软件进行数据分析。
BW5147.G.1.4细胞与固定化的包含融合蛋白的EGF样结构域的粘附。该发现表明，在测试的实验条件下，与MFG-E8的HSA或基于EDIL3/DEL-1的融合蛋白融合的EGF样结构域中的RGD环是可及的，并允许与细胞av整联蛋白相互作用。
综上所述，这些数据表明，本披露的融合蛋白与细胞整联蛋白结合，支持整联蛋白依赖性细胞粘附，并表明在具有HSA结构域插入物的蛋白中保留功能。
10.3人巨噬细胞-中性粒细胞胞葬作用测定
通过Ficoll梯度离心(
Figure BDA0003527831370001341
-Paque PLUS，通用健康医疗集团，瑞典)从血沉棕黄层中分离出人外周血单核细胞(PBMC)，然后使用干细胞分离试剂盒(干细胞19059，温哥华，加拿大)对单核细胞进行负选择。使用重组人M-CSF 40ng/mL(巨噬细胞集落刺激因子，R&D系统公司(R&D Systems)，美国)在含有25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、1mM NaPyr，50μMβ-Merc的RPMI 1640中5天，使单核细胞分化为“M0”巨噬细胞。胞葬作用前一天，使用红色荧光染料接头试剂盒(西格玛公司(Sigma)MINI26，美国)用PKH26标记巨噬细胞。将细胞重悬浮于包含25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、1mM NaPyr、50μMβ-Merc的RPMI 1640中，并以40000个细胞/孔接种到黑色96孔板(康宁公司(Corning)，美国)中，并允许粘附20小时。
中性粒细胞：通过葡聚糖沉降结合FicollTM密度梯度从血沉棕黄层中分离出人中性粒细胞，如下所示：通过稀释的血沉棕黄层的离心除去血沉棕黄层的血浆。将细胞收获物用1％葡聚糖(得自明串珠菌属物种，MW 450.000-650.000；西格玛公司，美国)稀释，并在冰上沉降2030分钟。
从上清液收集白细胞并置于FicollTM-Paque层(通用健康医疗集团瑞典)上。离心后，收集沉淀，并使用红细胞(RBC)裂解缓冲液(生物概念公司(BioConcept)，瑞士)裂解剩余的红细胞。中性粒细胞在培养基(含有25mM HEPES、10％FBS、Pen/Strep、0.1mM NaPyr、50uM b-Merc的RPMI 1640+GlutaMax)中洗涤一次，并在15℃保持过夜。细胞凋亡/细胞死亡是通过在37℃下用1μg/mL Superfas Ligand(恩佐生命科学公司，洛桑，瑞士)处理中性粒细胞3小时而诱导的。中性粒细胞用Hoechst 33342(生命技术公司，美国)染色25分钟，并用DRAQ5(e生物科学公司，英国，1:2000稀释)在37℃在黑暗中染色5分钟。
胞葬作用测定
将M0巨噬细胞与融合蛋白一起孵育30分钟。以M0/中性粒细胞1:4的比率添加凋亡标记的中性粒细胞。利用中性粒细胞在M0巨噬细胞的低pH溶酶体区室中定位后DRAQ5的荧光强度增加，可以看到巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的胞葬作用。
使用ImageXpress Micro XLS广域高含量分析系统(分子设备公司(MolecularDEVICES)加利福尼亚州，美国)对胞葬作用进行定量。通过PKH26荧光鉴定巨噬细胞。胞葬作用指数(EI，显示为％)被计算为包含至少一个摄入的凋亡中性粒细胞(DRAQ5高)事件的巨噬细胞与巨噬细胞总数的比率。使用MS Excel和GraphPad Prism软件进行数据分析。图13D中显示了融合蛋白FP114和FP133(MFG-E8衍生的EGF-HSA-C1 SEQ ID NO:xxx)在挽救和促进LPS处理的人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的胞葬作用方面的作用。融合蛋白增加了经pHrodo标记的濒死人中性粒细胞内化进入巨噬细胞，超过了M0巨噬细胞已有的高胞葬作用能力。在图13E中，显示了重组融合蛋白FP147(EDIL/DEL-1衍生的EGF_EGF_EGF_HSA_C1)可以挽救人巨噬细胞对濒死中性粒细胞的被内毒素(脂多糖)损害的胞葬作用。总体而言，数据显示出出人意料的发现，即C2截短的MFGE8或EDIL3/DEL-1衍生的融合蛋白可在体外以低nM功效促进胞葬作用。
实例11：保护小鼠免受AKI
11.1急性肾损伤模型
从法国查尔斯河公司(Charles River)购买雌性C57BL/6小鼠(18-22g)，将其置于温度控制的设备中在顶部过滤器保护的笼子中(12小时的明/暗循环)。严格按照瑞士联邦法律和NIH实验动物护理原则处理动物。在手术前两小时腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)施用被测治疗性融合蛋白。手术前60至30分钟以0.1mg/kg的剂量皮下(s.c.)注射丁丙诺啡(亿维德瑞士公司(Indivior Schweiz AG))。手术前在麻醉室(3.5-5Vol.％，载气：氧气)中诱导使用异氟烷进行吸入麻醉5分钟。在手术期间，通过面罩用1-2Vol％异氟烷/氧气将动物维持在麻醉下，气体流速为0.8-1.2l/分钟。将腹部皮肤剃毛并用Betaseptic(穆迪药物公司(Mundipharma)，法国)消毒。将动物置于具有恒温监测系统(PhysiTemp公司，美国Physitemp仪器公司，美国)的恒温毯(罗塔彻公司-瑞士)上，并用无菌纱布覆盖。在整个手术过程中，通过直肠探针(Physitemp仪器公司，美国)监测体温，并控制其体温为36.5℃-37.5℃。包括假手术对照在内的所有动物均接受了右肾的单侧肾切除术：中线切口/剖腹手术后，将腹部内容物向左缩回以暴露右肾。断开并结扎右输尿管和肾血管，然后取出右肾。对于进行了AKI的动物，将腹部内容物放在无菌纱布上的右侧，并解剖左肾动脉和静脉，以夹住用于诱导缺血。使用微动脉瘤夹(B Braun公司，瑞士)夹住肾蒂(使用一个夹将动脉和静脉夹在一起)，以阻断血液流向肾并诱导肾缺血。肾从红色到深紫色的颜色变化证实了成功缺血，这在几秒钟内发生。诱导缺血后(35-38分钟)，移开微动脉瘤夹。在伤口闭合之前，使用温热的无菌盐水(约2ml，37℃)冲洗腹部内容物以使组织水化。洗涤后，腹膜内地另外添加1ml无菌盐水作为补液。开始再灌注时，伤口分为两层(分别是肌肉和皮肤)闭合。然后将动物保持在红色暖灯下直至完全康复。手术后1小时和4小时再次施用丁丙诺啡，剂量为0.1mg/kg，并且也包括在饮用水中(9.091μg/mL)。24小时后，对动物实施安乐死进行分析。在AKI模型中以1.5mg/kg i.v.在缺血再灌注损伤发作前30分钟测试了治疗性融合蛋白FP135(EGF-HSA-C1；SEQ ID No:x)。缺血再灌注诱导后24小时取血清样品，并根据制造商的说明(Axonlab公司，瑞士)使用Hitachi M40临床分析仪分析血清肌酐和血液尿素氮(BUN)含量。
实例12:EGF_HSA_C1在肝纤维化模型(CCL4模型)中保护
肝纤维化是对各种侵损的伤口愈合应答。如果进展，可能会导致肝硬化，随后导致肝细胞癌(HCC)。在工业化国家，肝纤维化的常见原因是酗酒、病毒性肝炎感染以及由于肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病引起的代谢综合征。
长时间的侵损会导致炎症和通过肌成纤维细胞样细胞(基本上是活化的肝星状细胞(HSC))的细胞外基质(ECM)蛋白沉积。这些细胞产生α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和I型和III型沉积胶原蛋白，并产生基质金属蛋白酶(MMP)和组织抑制剂(TIMP)。随着疾病变为慢性，ECM的组成从IV型和VI型胶原蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖转变为I型和III型胶原蛋白和纤连蛋白。
如果损伤不严重，则肝脏能够再生，从而邻近的成熟肝细胞能够替代凋亡或坏死细胞。当活化的HSC发生凋亡或恢复为更静止的表型时，就会发生纤维化消退。
有几种体内模型可以用来模拟疾病的各个方面。肝纤维化模型需要能够反映人疾病的各种病理和分子特征，并且易于建立并具有良好的可重复性。化学诱导的纤维化模型最接近于这些理想特征，其中一种就是啮齿动物中的四氯化碳(CCl4)肝纤维化模型。反复腹膜内注射该肝毒素后，肝纤维化发展，表现出与人肝纤维化的良好相似性。此外，侵入损的撤消导致纤维化的消退，因此该模型是可逆的。
在第一阶段，CYP2E1酶代谢CCl4，产生三氯甲基自由基，所述自由基促成急性期反应，其特征是脂质膜和肝细胞内部细胞器的破坏最终导致坏死。然后，急性的CCl4介导的肝纤维化的特征是激活枯否细胞并诱导炎性应答，从而导致细胞因子、趋化因子和其他促炎因子的分泌。反过来，这会吸引并激活单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，进而促成肝脏坏死，继而产生强烈的再生应答，导致首次应用CCl4后约48小时，肝细胞和非实质性肝细胞大量增殖。组织学纤维化和疤痕纤维在疾病的第二阶段中在2至3周后出现。在CCl4损伤4至6周后，可以观察到第三阶段(具有广泛的纤维化和大量的肝脂肪积累以及血清甘油三酸酯和AST水平升高)。通常在撤消CCl4毒素后数周内即可观察到CCl4诱导的小鼠肝纤维化的完全消退。具有加速纤维化消退的特性的药物与已确诊疾病的患者特别相关。例如，已经具有确诊的纤维化的患有NASH(非酒精性脂肪性肝炎)慢性肾病或硬皮病的患者证明纤维化的消退可能成为主要的临床终点，不仅可以停止疾病，还可以恢复器官功能。(Yanguas等人2016.Experimental models of liver fibrosis.[肝纤维化的实验模型]Arch Toxicol.[毒理学档案]2016；90:1025-1048。doi:10.1007/s00204-015-1543-4.)
CCL4肝纤维化模型：
疾病诱导：
在8-12周龄的雄性BALB/c小鼠中，在6周内每周3次腹腔注射CCl4，剂量为500μl/kg(新鲜稀释在橄榄油中)。荷兰)。给予CCl4共6周以诱导肝纤维化。在4周或5周或6周的CCL4处理后开始用EGF_HSA_C1(FP135)治疗。EGF_HSA_C1(FP135)以0.8mg/kg每周3次腹膜内施用，直至实验终止(停止CCL4后3天)。
读数：
在CCL4停止时(第0天)和实验终止3天后获得的血清样本中，测量了ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)等肝酶，以评估肝损伤。根据制造商的说明(Axonlab，瑞士)，使用Hitachi M40临床分析仪对ALT和AST进行了分析。
为了量化动物肝脏中胶原蛋白的含量，根据制造商的说明使用总胶原蛋白测定法(快酶生物科学公司(QuickZyme Biosciences)，荷兰)进行了羟脯氨酸测定。如9.3节所述，通过qPCR进行胶原基因COL1A1和COL1A2的表达。
超声弹性描记术被用作评估肝弹性(硬度)的可靠且可再现的非侵入性方法，并已显示出与肝纤维化正相关(Li,R.,Ren,X.,Yan,F.等人Liver fibrosis detection andstaging:a comparative study of T1ρMR imaging and 2D real-time shear-waveelastography.[肝纤维化的检测和分期：T1ρMR成像与2D实时剪切波弹性成像的比较研究]Abdom Radiol[腹部放射学]43,1713-1722(2018).https://doi.org/10.1007/s00261-017-1381-3。此外，该技术已在临床中使用，并且可以帮助更好地将临床前数据的结果转译为具有纤维化的人肝脏疾病。使用基于超声的剪切波弹性成像(SWE)评估确定肝脏硬度：使用
Figure BDA0003527831370001391
装置(超声成像公司(Supersonic Imagine)，普罗旺斯地区艾克斯(Aix-en-Provence)，法国)进行SWE。为了进行采集，将小鼠用异氟烷(约1.5％)麻醉并置于加热垫上。将超声探头(SL25-15型，超声成像公司，带宽25MHz，元件数量256)连接到支架上，并接近肝脏进行评估。探头对B模式和SWE采集允许波的充分穿透。
为了最大程度地减少由于呼吸引起的运动伪影，在呼气时采集弹性图。每只小鼠和时间点采集三个弹性图。然后从三个弹性图中提取平均硬度。超声检查持续约5分钟。
实例13：C2截短的MFG-E8(EGF-C1)和HSA融合体(EGF-HSA-C1)的产生；表达和纯化。
产生本文披露的蛋白的方法描述如下。
DNA在基因艺术公司(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成并使用基于限制酶-连接的克隆技术克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒转染到HEK293T细胞中以瞬时表达蛋白。简而言之，使用聚乙烯亚胺(PEI；目录号24765聚科学公司(Polysciences,Inc.))将载体转染入悬浮液适应的HEK293T细胞中。典型地，用含有100μg编码目的蛋白的表达载体的DNA转染以1-2Mio细胞/ml的密度悬浮的100ml细胞。然后将重组表达载体引入宿主细胞中，并通过进一步培养细胞7天的时段来产生构建体，以允许分泌到补充有0.1％普朗尼克酸(pluronic acid)、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml抗生素的培养基(HEK，无血清培养基)中。
然后使用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)或抗HSA捕获色谱从无细胞上清液中纯化产生的构建体。
当IMAC捕获了带有组氨酸标签的蛋白时，经过滤的条件培养基与IMAC树脂(通用健康医疗集团)混合，并用20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、20mM咪唑(pH 7.0)平衡。用15柱体积的20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、20mM咪唑(pH 7.0)将树脂洗涤三次，然后用10柱体积的洗脱缓冲液(20mM NaPO4、0.5Mn NaCl、500mM咪唑(pH 7.0))洗脱蛋白。
当通过抗HSA色谱捕获蛋白时，经过滤的条件培养基与抗HSA树脂(捕获选择人白蛋白亲和基质(Capture Select Human Albumin affinity matrix)，赛默公司(Thermo))混合，并用PBS(pH 7.4)平衡。用15柱体积的PBS(pH 7.4)洗涤树脂三次，然后用10柱体积的洗脱缓冲液(50mM柠檬酸盐、90mM NaCl(pH 2.5))洗脱蛋白，并用1M TRIS pH 10.0中和pH。
最后，通过使用尺寸排阻色谱法(HiPrep Superdex 200，16/60，通用生命科学公司)精制洗脱的级分。
在整个纯化过程中，通过分析型尺寸排阻色谱法(Superdex 200Increase 3.2/300GL，通用生命科学公司)跟踪聚集物含量。
捕获步骤后的聚集水平和纯化C2截短的MFG-E8和HSA融合体后的表达产率示于表10中。C2截短的MFG-E8的HSA融合体显示比C2截短的MFG-E8在表达方面至少提高40倍。此外，与C2截短的MFG-E8相比，C2截短的MFG-E8的HSA融合体显示少至少4倍的聚集。这些数据表明，与C2截短的MFG-E8相比，C2截短的MFG-E8的HSA融合体表现出更好的生产特性。因此，HSA融合体针对用作药物似乎具有更好的可开发性。
表10：捕获步骤后的聚集水平和纯化EGF-C1和EGF-HSA-C1蛋白后的表达产率
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实例14：C2截短的MFG-E8(EGF-C1)和HSA融合体(EGF-HSA-C1)的动态光散射(DLS)
通过动态光散射(DLS，怀雅特公司(Wyatt))测量C2截短的MFG-E8和HSA融合体的聚集倾向。使用动态光散射通过定量散射光中的动态波动来测量溶液中蛋白的平移扩散系数。使用DynaProTM读板仪(德国代恩巴赫市怀雅特技术欧洲有限公司)结合软件DYNAMICS(7.1.0.25版，怀雅特公司(Wyatt))在热应力下以3mg/ml的浓度测量流体动力学半径作为聚集形成的指标。在384孔板(384圆孔板，聚苯乙烯，赛默飞世尔科技公司，朗根塞尔博德市，德国)中测量蛋白溶液。
如图23所示，与HSA融合体相比，C2截短的MFG-E8总体上显示更高的流体动力学半径(在25℃下5nm相比于80nm)。此外，C2截短的MFG-E8从45℃开始流体动力学半径显著增加，表明形成了强烈的聚集，而HSA融合体保持相同流体动力学半径直到至少55℃。这些数据表明，与C2截短的MFG-E8相比，C2截短的MFG-E8的HSA融合体更稳定并且展示更好的生物物理特性。因此，HSA融合体针对用作药物似乎具有更好的可开发性。
综上所述，这些数据表明，本披露的融合蛋白，例如具有HSA结构域插入物，具有功能性和有效性，因此可用作治疗剂。
应理解，本文描述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利、和专利申请都出于所有目的，通过引用特此并入。
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Claims (21)

1.一种用于增强胞葬作用的治疗性融合蛋白，所述治疗性融合蛋白包含整联蛋白结合结构域、磷脂酰丝氨酸(PS)结合结构域和增溶结构域，其中所述增溶结构域插入在所述整联蛋白结合结构域和所述PS结合结构域之间，并且其中所述PS结合结构域是截短的变体。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是表2中所列的至少一个PS结合结构域的截短的变体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是MFG-E8或EDIL3的PS结合基序的截短的变体。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是MFG-E8的PS结合基序的截短的变体。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是网柄菌凝素结构域。
6.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域是C1结构域。
7.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述PS结合结构域不包含C2结构域。
8.一种用于增强胞葬作用的融合蛋白，所述融合蛋白包含整联蛋白结合结构域、磷脂酰丝氨酸(PS)结合结构域和增溶结构域，其中所述增溶结构域插入在所述整联蛋白结合结构域和所述PS结合结构域之间，并且其中所述PS结合结构域是C1结构域。
9.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域与一种或多种整联蛋白结合。
10.如权利要求9所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域与αvβ3和/或αvβ5和/或α8β1整联蛋白结合。
11.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序。
12.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域直接连接至所述整联蛋白结合结构域、至所述PS结合结构域或这两个结构域。
13.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域通过接头间接连接至所述整联蛋白结合结构域和/或所述PS结合结构域。
14.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述整联蛋白结合结构域具有SEQID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
15.一种治疗性融合蛋白，所述治疗性融合蛋白包含MFG-E8和增溶结构域，其中所述MFG-E8从N末端到C末端包含：EGF样结构域、C1结构域或C2结构域，并包含来自野生型人MFG-E8(SEQ ID NO:1)或其功能变体的序列。
16.如权利要求17所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域插入在所述EGF样结构域和所述C1或C2结构域之间。
17.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域是HSA、HSA D3或Fc-IgG或其功能变体。
18.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述增溶结构域包含人血清白蛋白(HSA)或其功能变体。
19.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，用于在治疗或预防有需要的个体的炎性障碍或炎性器官损伤中使用，其中所述炎性障碍或炎性器官损伤是急性肾损伤、急性呼吸窘迫综合征、急性肝损伤、败血症、心肌梗塞、中风、烧伤、创伤以及由缺血/再灌注引起的炎性和器官损伤。
20.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，用于在治疗或预防或改善血液凝固的抑制或减慢、微生物组治疗、炎性肠病(IBD)、脂肪酸摄取和/或降低的胃动力、微血栓形成依赖性障碍、动脉粥样硬化、心脏重塑、组织纤维化、急性肝损伤、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血管疾病、与年龄有关的血管障碍、肠道疾病、败血症、骨障碍、癌症、地中海贫血、胰腺炎、肝炎、心内膜炎、肺炎、急性肺损伤、骨关节炎、牙周炎、组织创伤引起的炎症、结肠炎、糖尿病、失血性休克、移植排斥、放射引起的损害、脾肿大、败血症引起的AKI或多器官衰竭、急性烧伤、成人和儿童呼吸窘迫综合征、伤口愈合、腱修复和神经疾病中使用。
21.用于如权利要求19或权利要求20所述使用的融合蛋白，其中所述融合蛋白与另一种治疗剂联合施用，其中所述治疗剂是免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗感染剂、细胞毒性剂或抗癌剂。
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