PT1463751E - Proteínas de fusão de albumina - Google Patents

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PT1463751E
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PT
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fusion protein
albumin fusion
albumin
protein
seq
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PT2799966T
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Craig A Rosen
Steven M Ruben
William A Haseltine
Original Assignee
Human Genome Sciences Inc
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Publication date
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Description

DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE FUSÃO DE ALBUMINA"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A invenção refere-se, em geral, a uma proteína de fusão de albumina compreendendo dois ou mais polipéptidos de GLP-1 orientados em tandem, em que (i) os referidos polipéptidos de GLP-1 são seleccionados de (a) GLP-1 de tipo selvagem (b) GLP-1 (9-36); (c) GLP-1 (7-36); (d) GLP-1 (7-36(A8G)); (e) GLP-1 (7-36(A8S)); e (f) outros fragmentos de GLP-1 e/ou variantes de GLP-1 tendo actividade de GLP-1; fundidos a albumina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1038, um fragmento de albumina ou seu variante de albumina. (ii) o referido fragmento de albumina ou variante de albumina aumenta a meia- -vida plasmática sérica dos polipéptidos de GLP-1 e (iii) a referida proteína de fusão tem actividade de GLP-1. 1 A invenção abrange polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina terapêuticas e proteínas de fusão de albumina terapêuticas. A albumina sérica humana (HSA ou HA) , uma proteína de 585 aminoácidos na sua forma madura (como mostrado na Figura 1 ((SEQ ID N° : 1038)), é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica do soro e também funciona como um veículo de ligandos endógenos e exógenos. Presentemente, a HA para utilização clínica é produzida por extracção de sangue humano. A produção de HA recombinante (rHA) em microrganismos foi divulgada nos documentos EP 330451 e EP 361991.
As proteínas terapêuticas no seu estado nativo ou quando recombinantemente produzidas, tais como interferões e hormonas do crescimento, são tipicamente moléculas lábeis, exibindo curtas meias-vidas, particularmente quando formuladas em solução aquosa. A instabilidade nestas moléculas, quando formuladas para administração, estipula que muitas das moléculas, durante o armazenamento, devem estar sempre liofilizadas e refrigeradas tornando, desse modo, as moléculas difíceis de transportar e/ou armazenar. Os problemas de armazenamento são particularmente agudos quando as formulações farmacêuticas devem ser armazenadas e doseadas no exterior do ambiente hospitalar. O documento WO 00/69911 divulga o péptido semelhante a glucagom da hormona peptídica insulinotrópica (GLP-1) que foi ligado covalentemente a albumina, de modo a aumentar a meia-vida de GLP-1. O documento WO 01/79258 divulga múltiplas cópias de um polinucleótido codificando uma proteína de fusão compreendendo albumina e uma proteína terapêutica, de modo a estabilizar e 2 alargar a estabilidade em armazenamento da proteína terapêutica. Estes polinucleótidos foram integrados no genoma. Têm sido propostas poucas soluções práticas para os problemas de armazenamento de moléculas de proteínas lábeis. Conseguentemente, há uma necessidade para formulações estabilizadas, de longa duração, de moléculas terapêuticas proteicas que sejam facilmente doseadas, de um modo preferido, com uma formulação simples, requerendo manipulação de pós-armazenamento mínima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO 1. Uma proteína de fusão de albumina compreendendo dois ou mais polipéptidos de GLP-1 orientados em tandem, em que (i) os referidos polipéptidos de GLP-1 são seleccionados de (a) GLP-1 de tipo selvagem; (b) Gap-1 (9-36); (c) GLP-1 (7-36); (d) GLP-1 (7-36(A8G)); (e) OLP-1 (7-36(A8S)); e (f) outros fragmentos de GLP-1 e/ou variantes de GLP-1, tendo actividade de GLP-1; fundidos a albumina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1038, um fragmento de albumina ou seu variante de albumina, 3 (ii) o referido fragmento de albumina ou variante de albumina aumenta a meia-vida plasmática sérica dos polipéptidos de GLP-1 e (iii) a referida proteína de fusão tem actividade de GLP-1. 2. Um polinucleótido codificando a proteína de fusão de albumina da invenção. 3. Um vector compreendendo o polinucleótido codificando a proteína de fusão de albumina da invenção. 4. Um método de produção de uma proteína de fusão de albumina, compreendendo (a) a transformação de uma célula hospedeira compreendendo, pelo menos, um vector compreendendo o polinucleótido codificando a proteína de fusão de albumina da invenção; (b) o cultivo da célula hospedeira em condições adequadas para a expressão da proteína de fusão de albumina; e (c) o isolamento da proteína de fusão de albumina. 5. Uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão de albumina da invenção. 6. A proteína de albumina da invenção para utilização como um medicamento 7. A proteína de fusão de albumina da invenção para utilização no tratamento de hiperglicemia; diabetes; diabetes insipidus; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; 4 diabetes tipo 2; resistência à insulina; deficiência de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM); obesidade; retinopatia; úlceras; supressão de peso corporal; supressão de apetite; síndrome X, distúrbios metabólicos, imunes e vasculares associados a diabetes e distúrbios cardiovasculares. 8. Utilização da proteina de fusão de albumina da invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia; diabetes; diabetes insipidus; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistência à insulina; deficiência de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM); obesidade; retinopatia; úlceras; supressão de peso corporal; supressão de apetite; síndrome X, distúrbios metabólicos, imunes e vasculares associados a diabetes e distúrbios cardiovasculares.
Num aspecto preferido, da invenção, as proteínas de fusão de albumina incluem, mas não estão limitadas, às construções de GLP-1 codificadas pelos polinucleótidos descritos na Tabela 2. A divulgação também abrange formulações farmacêuticas compreendendo uma proteína de fusão de albumina da invenção e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Essas formulações podem estar num kit ou recipiente. Esse kit ou recipiente pode ser embalado com instruções que se referem à estabilidade em armazenamento alargada de proteína terapêutica. Essas formulações podem ser utilizadas no tratamento, prevenção, melhoramento ou diagnóstico de um sintoma de doença ou doenças 5 num doente, de um modo preferido, um mamífero, de um modo muito preferido, um humano, compreendendo a etapa de administrar a formulação farmacêutica ao doente.
Noutras formas de realização, a presente divulgação abrange métodos de prevenção, tratamento ou melhoramento de uma doença ou distúrbio. A presente invenção abrange um método de tratamento de uma doença ou distúrbio listado na coluna "Indicação Preferida: Y" da Tabela 1, compreendendo administrar a um doente, no qual esse tratamento, prevenção ou melhoramento é desejado, uma proteína de fusão de albumina da invenção, que compreende GLP-1 ou porção correspondendo a um fragmento de GLP-1 ou seu variante, divulgado na coluna "Proteína Terapêutica: X" (no presente caso, GLP-1) da Tabela 1 (na mesma fila em que a doença ou distúrbio a ser tratado está listado na coluna "Indicação Preferida: Y" da Tabela 1), numa quantidade eficaz para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou distúrbio.
Numa forma de realização, uma proteína de fusão de albumina de acordo com a invenção, tem estabilidade em armazenamento alargada.
Numa segunda forma de realização, uma proteína de fusão de albumina de acordo com a invenção, é mais estável que a correspondente molécula de GLP-1 não fundida descrita na Tabela 1. 6
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1A-D mostra a sequência de aminoácidos da forma madura de albumina humana (SEQ ID N° : 1038) e um polinucleótido codificando-a (SEQ ID N°: 1037). A Figura 2 mostra o mapa de restrição do depósito PTA-3278 da ATCC do vector de clonagem pPPC0005. A Figura 3 mostra o mapa de restrição do vector de expressão pSAC35 da levedura S. cerevisiae (Sleep et al. , BioTechnology 8:42 (1990)). A Figura 4 mostra o efeito de diversas diluições das proteínas de fusão de albumina de EPO codificadas por ADN compreendido nas Construções ID N° (a seguir CID) 1966 e 1981 e EPO humana recombinante na proliferação de células TF-1 (ver os Exemplos 8 e 9). As células foram lavadas 3X para remover GM-CSF e plaqueadas a 10000 células/poço, durante 72 horas, na presença de diluições de 3 vezes da proteína CID 1966 ou proteína CID 1981. As concentrações utilizadas foram calculadas com base no peso de Epo isoladamente, não HSA mais Epo. A Epo humana recombinante (rhEpo) foi utilizada como o controlo positivo e diluída em série 3 vezes, desde 100 ng/mL a 0,01 ng/mL. As células foram expostas a 0,5 mCi/poço de 3H-timidina, durante 18 horas adicionais. (□) rhEpo; (T) HSA-Epo 1981; (·) Epo-HSA 1966. A Figura 5 é uma análise de dose-resposta e mostra o efeito de diversas doses de EPO humana recombinante e proteínas de fusão de albumina de EPO codificadas por ADN compreendido em CID 1966 e 1981 na percentagem de alteração no hematócrito desdo 7 dia 0 ao dia 7 (ver os Exemplos 8 e 9) . 48 Murganhos DBA/2NHsd fêmea, de oito semanas de idade, foram divididos em 12 grupos de 4 animais cada. A Epo humana recombinante (rhEpo) foi administrada subcutaneamente a 0,5, 1,5, 4,5 e 12 pg/kg, nos dias 0, 2, 4 e 6. As proteínas de fusão de albumina de Epo preparadas a partir das construções CID 1966 e CID 1981 foram administradas subcutaneamente a 2, 6, 18 e 54 pg/kg, nos dias 0, 2, 4 e 6. As doses mais elevadas das proteínas de fusão de albumina de Epo permitem uma comparação equimolar aproximada com Epo humana recombinante (notar que o peso das fusões é cerca de 4,35 vezes o peso de Epo não glicosilada) . Nos dias 0 e 7 da experiência, os animais foram sangrados por meio de uma veia da cauda e o hematócrito foi determinado por centrifugação. () rhEpo; (o) CID 1981; (A) CID 1966. A Figura 6A mostra o efeito de diversas administrações subcutâneas de proteínas de fusão de albumina de Epo codificadas por ADN compreendido em CID 1966 e 1997, respectivamente, na percentagem de alteração no hematócrito desdo dia 0 ao dia 8 (ver os Exemplos 8 e 10) . *, p<0,005 em comparação com rhEpo, como determinado por análise não paramétrica de Mann-Whitney (n=6) . A Figura 6B mostra o efeito de administrações subcutâneas de proteínas de fusão de albumina de Epo codificadas por ADN compreendido em CID 1997 e 1966 na percentagem de alteração no hematócrito desdo dia 0 ao dia 14 (ver os Exemplos 8 e 10) . *, p<0,005 em comparação com rhEpo, como determinado por análise não paramétrica de Mann-Whitney (n=6). **, p<0,05 em comparação com rhEpo, como determinado por análise não paramétrica de Mann-Whitney (n=6). A Figura 7 mostra o efeito de diversas diluições de proteínas de fusão de albumina codificadas por ADN compreendido em CID 1981 e 1997, respectivamente, na proliferação de células TF-1 (ver os Exemplos 9 e 10) . As células foram lavadas 3X para remover GM-CSF e plaqueadas a 10000 células/poço, durante 72 horas, na presença de diluições de 3 vezes de proteínas de fusão de albumina de Epo codificadas por CID 1981 ou 1997. Como um controlo positivo, foram utilizadas quantidades equimolares de rhEpo (4,35 vezes menos proteína adicionada, visto que o peso de Epo não glicosilada é 20 kd, enquanto as proteínas de fusão de albumina de Epo são 87 kd) . As células foram expostas a 0,5 pCi/poço de 3H-timidina, durante 24 horas adicionais. () Padrão de rhEpo; (A) CID 1981 (CHO); (o) CID 1997 (NSO). A Figura 8 mostra o efeito de diversas doses de EPO humana recombinante (rhEpo) e proteína de fusão de albumina de EPO codificada por ADN compreendido na construção 1997 (CID 1997) na percentagem de alteração no hematócrito desdo dia 0 ao dia 8 (ver o Exemplo 10). (A) = rhEpo, (□) = CID 1997. A Figura 9 mostra o efeito de diversas diluições de proteínas de fusão de albumina de IL2 codificadas por ADN compreendido em CID 1812 (ver o Exemplo 15) na proliferação de CTLL-2. lxlO4 células/poço foram inoculadas numa placa de 96 poços, num volume final de 200 pL de meio completo, contendo a quantidade indicada de proteína de fusão de albumina de IL2 (CID 1812). Todas as amostras foram aplicadas em triplicado. As células foram incubadas durante 40 horas, a 37 °C, depois foram adicionados 20 pL de Azul de Alamar e as células incubadas durante 8 horas. A absorvência a 530/590 foi utilizada como uma medida de proliferação. EC50 = 0,386 ± 0,021. (□) = CID 1812. 9 A Figura 10 mostra o efeito de proteína de fusão de albumina de IL2 codificada por ADN compreendido em CID 1812 no crescimento tumoral de RENCA no dia 21 (ver o Exemplo 15) .
Murganhos BALB/c (n=10) foram injectados SC (flanco médio) com 105 células de RENCA. 10 dias mais tarde, os murganhos receberam 2 ciclos (Dia 10 ao Dia 14 e Dias 17-21) de injecções diárias (QD) de rIL2 (0,9 mg/kg) , proteína de fusão de albumina de IL2 (proteína CID 1812; 0,6 mg/kg) ou PBS (Placebo) ou injecções, de dois em dois dias (QOD) , de proteína CID 1812 (0,6 mg/kg). O volume de tumor foi determinado no Dia 21 após inoculação de RENCA. Os dados são apresentados em análise de dispersão (cada ponto representando um único animal) . O valor médio de cada grupo é representado por linha horizontal. *, p=0,0035 entre controlo de placebo e proteína CID 1812. O número entre parênteses indica o número de murganhos vivos sobre o número total de murganhos por grupo. (o) = Placebo; (·) = IL2; (Δ) = proteína CID 1812 (QD); (□) = proteína CID 1812 (QOD). A Figura 11 mostra o efeito de diversas diluições de
proteínas de fusão de albumina de GCSF codificadas por ADN compreendido em CID 1642 e 1643 na proliferação celular de NFS-60 (ver os Exemplos 19 e 20) . () = CID 1642; (A) = CID 1643; (O) = HSA. A Figura 12 mostra o efeito de GCSF humano recombinante (Neupogen) e proteína de fusão de albumina de GCSF na contagem de glóbulos brancos totais (ver o Exemplo 19) . Os WBC totais (103 células/pL) em cada dia são apresentados como a média de grupo ± SEM. A proteína de fusão de albumina de GCSF foi administrada, sc, a 25 ou 100 pg/kg, de 4 em 4 dias, x 4 (Q4D) , ou a 100 pg/kg de 7 em 7 dias x 2 (Q7D). Os dados dos Dias 8 e 9
para 100 pg/kg Q7 de proteína de fusão de albumina de GCSF 10 são apresentados como Dias 9 e 10, respectivamente, para facilitar a comparação com outros grupos. Os controlos eram veiculo de soro fisiológico administrado, SC, de 4 em 4 dias x 4 (Veiculo Q4D), ou Neupogen administrado, SC, diariamente x 14 (Neupogen 5 pg/kg QD) . O período de tratamento é considerado Dias 1-14 e o período de recuperação Dias 15-28. A Figura 13 mostra o efeito de diversas diluições de proteínas de fusão de albumina de IFNb codificadas por ADN compreendido em CID 2011 e 2053 na actividade de SEAP nas células repórter ISRE-SEAP/293F (ver o Exemplo 25). As proteínas foram diluídas em série desde 5e-7 a le-14 g/mL, em DMEM/FBS a 10% e utilizadas para tratar células repórter ISRE-SEAP/293F. Após 24 horas, os sobrenadantes foram removidos das células repórter e ensaiados para actividade de SEAP. A proteína de fusão de albumina de IFNb foi purificada de três clones estáveis: 293F/N° 2011, CHO/N0 2011 e NSO/N° 2053. O IFNb derivado de mamífero, Avonex, proveio de Biogen e foi referido como tendo uma actividade específica de 2,0e5 IU/pg. A Figura 14 ilustra os níveis de estado estacionário de ARNm de insulina em células INS-1 (832/13) após tratamento com GLP-1 ou proteína de fusão de albumina de GLP-1 codificada pela construção m 3070 (proteína CID 3070). Glp-1 e a proteína CID 3070 estimulam a transcrição do gene de insulina em células INS-1. A primeira barra (preta) representa as células não tratadas. As barras 2-4 (brancas) representam células tratadas com as concentrações indicadas de GLP-1. As barras 5-7 (cinzentas) representam células tratadas com as concentrações indicadas de proteína CID 3070. 11 A Figura 15 compara a actividade antiproliferativa de proteína de fusão de albumina de IFN codificada por CID 3165 (proteína Cm 3165) e IFNa recombinante (rIFNa) em células de melanoma Hs294T. As células foram cultivadas com concentrações variáveis de proteína CID 3165 ou rIFNa e a proliferação foi medida por incorporação de BrdU após 3 dias de cultura. A proteína CID 3165 causou inibição mensurável da proliferação celular a concentrações acima de 10 ng/mL, com inibição de 50% alcançada a, aproximadamente, 200 ng/mL. () = CID 3165 proteína, (♦) = rIFNa. A Figura 16 mostra o efeito de diversas diluições de proteínas de fusão de albumina de IFNa na actividade de SEAP nas células repórter ISRE-SEAP/293F. Foi testada uma preparação de IFNa fundida a montante de albumina (♦), assim como duas preparações diferentes de IFNa fundidas a jusante de albumina (A) e () . A Figura 17 mostra o efeito do tempo e dose de proteína de fusão de albumina de IFNa codificada por ADN compreendido na construção 2249 (proteína CID 2249) no nível de ARNm de OAS (p41) em macacos tratados (ver o Exemplo 31). Por intervalo de tempo: primeira barra = controlo de Veículo, 2a barra = proteína CID 2249 a 30 pg/kg, dia 1, iv, terceira barra = proteína CID 2249 a 30 pg/kg, dia 1, sc, 4a barra = proteína CID 2249 a 300 pg/kg, dia 1, sc, 5a barra = IFNa recombinante a 40 pg/kg, dia 1, 3 e 5, sc. A Figura 18 mostra o efeito de diversas diluições de proteína de fusão de albumina de insulina codificada por ADN compreendido nas construções 2250 e 2276 na absorção de glucose em adipócitos 3T3-L1 (ver os Exemplos 33 e 35). 12 A Figura 19 mostra o efeito de diversas proteínas de fusão de albumina de GCSF, incluindo as codificadas por CID N° 1643 e N° 2702 (L-171, ver o Exemplo 114), na proliferação celular de NFS. A linha tracejada horizontal indica o nível mínimo de detecção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições
As seguintes definições são proporcionadas para facilitar a compreensão de determinados termos utilizados em toda esta descrição.
Como aqui utilizado, "polinucleótido" refere-se a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína de fusão de acordo com a invenção, como definido nas reivindicações, a referida proteína de fusão compreende ou, alternativamente, consiste em, pelo menos, uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) ligada em fase a, pelo menos, duas proteínas X Terapêuticas orientadas em tandem (ou seu fragmento ou variante) ("proteína X Terapêutica" aqui significando GLP-1), uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína de fusão compreendendo ou, alternativamente, consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: Y (i. e., as construções de GLP-1, como descrito na coluna 6 da Tabela 2) ou um seu fragmento ou variante; uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa das sequências mostradas na SEQ ID N° : X que codifica uma proteína de fusão da invenção; uma molécula de ácido nucleico 13 tendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína de fusão compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa das sequências de aminoácidos da SEQ ID N°: Z que codifica uma proteína de fusão da invenção; uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção, gerada como descrito na Tabela 2 ou nos Exemplos; uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica contida numa construção de fusão de albumina da invenção descrita na Tabela 2, ou uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica contida numa construção de fusão de albumina da invenção, depositada com a ATCC (como descrito na Tabela 3).
Como aqui utilizado, "construção de fusão de albumina" refere-se a uma molécula de ácido nucleico, como definida acima, opcionalmente compreendendo, ainda, por exemplo, um ou mais dos seguintes elementos: (1) um vector auto-replicável funcional (incluindo, mas não limitado a, um vector vaivém, um vector de expressão, um vector de integração e/ou um sistema de replicação), (2) uma região para iniciação de transcrição (e. g., uma região de promotor, tais como, por exemplo, um promotor regulável ou indutível, um promotor constitutivo), (3) uma região para terminação de transcrição, (4) uma sequência líder e (5) um marcador seleccionável. 0 polinucleótido codificando a proteína Terapêutica e proteína de albumina, uma vez parte da construção de fusão de albumina, pode ser, cada, referido como uma "porção", "região" ou "fracção" da construção de fusão de albumina. A presente invenção refere-se, em geral, a polinucleótidos, como definidos acima; e proteínas de fusão de albumina codificadas por esses polinucleótidos e como definidos nas 14 reivindicações. Como aqui utilizado, "proteína de fusão de albumina" refere-se a uma proteína formada pela fusão de, pelo menos, uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) a, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) ("proteína Terapêutica" aqui significando "GLP-1"). Uma proteína de fusão de albumina da invenção compreende as, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem da proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) e, pelo menos, um fragmento ou variante da albumina sérica humana, que estão associados entre si por fusão genética (i. e., a proteína de fusão de albumina é gerada por tradução de um ácido nucleico no qual um polinucleótido codificando a totalidade ou uma porção da proteína Terapêutica está ligado em fase com um polinucleótido codificando a totalidade ou uma porção de albumina). A proteína Terapêutica e proteína de albumina, uma vez parte da proteína de fusão de albumina, podem, cada, ser referidas como uma "porção", "região" ou "fracção" da proteína de fusão de albumina (e. g., uma "porção de proteína Terapêutica" ou uma "porção de proteína de albumina"). Numa foram de realização altamente preferida, uma proteína de fusão de albumina da invenção compreende as, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem da proteína X Terapêutica ou seu fragmento ou variante (incluindo, mas não limitado a, uma forma madura da proteína X Terapêutica) e, pelo menos, uma molécula de albumina ou seu fragmento ou variante (incluindo, mas não limitado a, uma forma madura de albumina).
Numa forma de realização preferida adicional, uma proteína de fusão de albumina da invenção é processada por uma célula hospedeira e segregada no meio de cultura circundante. 0 processamento da proteína de fusão de albumina nascente que ocorre nas vias secretórias do hospedeiro utilizado para 15 expressão pode incluir, mas não está limitado, a clivagem de péptido sinal; formação de ligações dissulfureto; enrolamento apropriado; adição e processamento de hidratos de carbono (tal como, por exemplo, glicosilação ligada a N e 0) ; clivagens proteolíticas específicas; e agrupamento em proteínas multiméricas. Uma proteína de fusão de albumina da invenção está, de um modo preferido, na forma processada. Numa forma de realização muito preferida, a "forma processada de uma proteína de fusão de albumina" refere-se a um produto de proteína de fusão de albumina que sofreu clivagem de péptido sinal N-terminal, aqui também referida como uma "proteína de fusão de albumina madura".
Em vários casos, um clone representativo contendo uma construção de fusão de albumina da invenção foi depositado com a American Type Culture Collection (aqui referida como "ATCC®") . Além disso, é possível extrair uma dada construção de fusão de albumina do depósito por técnicas conhecidas na matéria e aqui descritas em qualquer outra parte. A ATCC® está localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, EUA. Os depósitos ATCC® foram realizados de acordo com os termos do Tratado de Budapeste, no reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para efeitos de processo de patente.
Numa forma de realização, a proteína de fusão de albumina da invenção compreende dois ou mais fragmentos orientados em tandem, biologicamente activos e/ou terapeuticamente activos, da proteína Terapêutica, como definido acima e uma proteína de albumina sérica. Noutras formas de realização, a proteína de fusão de albumina da invenção compreende ou, alternativamente, consiste em duas ou mais moléculas orientadas em tandem de um variante biologicamente activo e/ou terapeuticamente activo da 16 proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Em formas de realização preferidas, o componente de proteína de albumina sérica da proteína de fusão de albumina é a porção madura da albumina sérica. A invenção abrange, ainda, polinucleótidos codificando estas proteínas de fusão de albumina.
Numa forma de realização preferida adicional, a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina da invenção é o domínio solúvel extracelular da proteína Terapêutica. Numa forma de realização alternativa, a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina é a forma activa da proteína Terapêutica. A invenção abrange, ainda, polinucleótidos codificando estas proteínas de fusão de albumina.
Proteínas terapêuticas
Como referido acima, um polinucleótido da invenção codifica uma proteína compreendendo ou, alternativamente, consistindo em, pelo menos, dois fragmentos ou variantes orientados em tandem da proteína Terapêutica, como definido acima e, pelo menos, um fragmento ou variante de albumina sérica humana, que estão associados entre si, de um modo preferido, por fusão genética.
Uma forma de realização adicional inclui um polinucleótido codificando uma proteína compreendendo ou, alternativamente, consistindo em, pelo menos, dois fragmentos ou variantes orientados em tandem da proteína Terapêutica e, pelo menos, um fragmento ou variante de albumina sérica humana, que estão ligados entre si por conjugação química. 17
Como aqui utilizado, "proteína Terapêutica" refere-se a polipéptidos de GLP-1 seleccionados de GLP-1 de tipo selvagem, fragmentos de GLP-1 e variantes de GLP-1 tendo actividade de GLP-1, quando presentes na proteína de fusão de albumina da invenção.
Por um polipéptido exibindo uma "actividade terapêutica" ou uma proteína que é "terapeuticamente activa" entende-se um polipéptido que possui uma ou mais actividades biológicas e/ou terapêuticas conhecidas, associadas à proteína Terapêutica aqui descrita ou, de outro modo, conhecidas na técnica. Como um exemplo não limitativo, uma "proteína Terapêutica" é uma proteína que é útil para tratar, prevenir ou melhorar uma doença, estado ou distúrbio. Como um exemplo não limitativo, uma "proteína Terapêutica" pode ser aquela que se liga especificamente a um tipo de célula particular (normal (e. g., linfócitos) ou anómalo e. g., (células de cancro)) e, por conseguinte, pode ser utilizada para direccionar, de um modo específico, um composto (fármaco ou agente citotóxico) àquele tipo de célula.
As porções de "proteína Terapêutica" compreendidas pela proteína de fusão de albumina da invenção são GLP-1 ou fragmentos de GLP-1 ou variantes de GLP-1.
Noutro exemplo não limitativo, a "proteína Terapêutica" é uma proteína de GLP-1 que tem uma actividade biológica e, em particular, uma actividade biológica que é útil para o tratamento, prevenção ou melhoramento de uma doença. Uma lista não inclusiva de actividades biológicas que podem ser possuídas pela proteína Terapêutica inclui, 18 uma ou mais das actividades biológicas descritas na secção "Actividades Biológicas" abaixo e/ou como divulgado para a proteína Terapêutica proporcionada na Tabela 1 (coluna 2).
Como agui utilizado, "actividade terapêutica" ou "actividade" pode referir-se a uma actividade cujo efeito é consistente com um resultado terapêutico desejável em humanos, ou a efeitos desejados em mamíferos não humanos ou noutras espécies ou organismos. A actividade terapêutica pode ser medida in vivo ou in vitro. Por exemplo, um efeito desejável pode ser ensaiado em cultura celular.
Esses ensaios in vitro ou de cultura celular estão geralmente disponíveis para muitas proteínas Terapêuticas, como descrito na técnica. Os exemplos de ensaios incluem, mas não estão limitados aos aqui descritos na secção de Exemplos ou na coluna "Ensaio de Actividade Exemplificativo" (coluna 3) da Tabela 1.
As proteínas Terapêuticas correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, tais como proteínas de superfície celular e secretórias, são frequentemente modificadas pela conjugação de um ou mais grupos oligossacarídicos. A modificação, referida como glicosilação, pode afectar dramaticamente as propriedades físicas das proteínas e pode ser importante na estabilidade, secreção e localização de proteína. A glicosilação ocorre em localizações específicas ao longo do esqueleto polipeptídico. Há, habitualmente, dois tipos principais de glicosilação, glicosilação caracterizada por oligossacáridos ligados por 0, que estão conjugados a serina em resíduos de treonina; e glicosilação caracterizada por oligossacáridos ligados a N, que 19 estão conjugados a resíduos de asparagina numa sequência de Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido, excepto prolina. 0 ácido N-acetilneurâmico (também conhecido como ácido siálico) é, habitualmente, o resíduo terminal de oligossacáridos ligados a N e ligados a 0. Variáveis, tais como estrutura de proteína e tipo de célula, influenciam o número e natureza das unidades de hidrato de carbono nas cadeias em diferentes sítios de glicosilação. Os isómeros de glicosilação também são comuns no mesmo sítio num determinado tipo de célula.
As proteínas Terapêuticas correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, assim como seus análogos e variantes, podem ser modificadas de modo que a glicosilação num ou mais sítios seja alterada como resultado de manipulação (manipulações) da sua sequência de ácidos nucleicos, pela célula hospedeira na qual são expressas, ou devido a outras condições da sua expressão. Por exemplo, os isómeros de glicosilação podem ser produzidos pela abolição ou introdução de sítios de glicosilação, e. g., por substituição ou deleção de resíduos de aminoácido, tal como substituição de glutamina por asparagina, ou as proteínas recombinantes não glicosiladas podem ser produzidas pela expressão das proteínas em células hospedeiras que não as irão glicosilar, e. g., em E. coli ou levedura deficiente em glicosilação. Estas abordagens são descritas em maior detalhe abaixo e são conhecidas na técnica. A proteína terapêutica divulgada na Tabela 1 e suas sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos são bem conhecidas na técnica e disponíveis em bases de dados públicas, tais como Chemical Abstracts Services Databases (e. g. , o Registo CAS), GenBank e bases de dados proporcionadas por subscrição, tal como 20
GenSeq (e. g., Derwent) . As sequências nucleotídicas exemplificativas da proteína Terapêutica que podem ser utilizadas para derivar um polinucleótido da invenção são mostradas na coluna 7, "SEQ ID N°: X", da Tabela 2. As sequências mostradas como SEQ ID N°: X podem ser uma sequência polinucleotídica de tipo selvagem codificando uma dada proteína Terapêutica (e. g., de tamanho total ou madura) ou, em alguns casos, a sequência pode ser um variante da referida sequência polinucleotídica de tipo selvagem (e. g., um polinucleótido que codifica a proteína Terapêutica de tipo selvagem, em que a sequência de ADN do referido polinucleótido foi optimizada, por exemplo, para expressão numa espécie particular; ou um polinucleótido codificando um variante da proteína Terapêutica de tipo selvagem (i. e., um mutante de sítio dirigido; um variante alélico)) . Está bem dentro da capacidade do especialista na técnica utilizar a sequência mostrada como SEQ ID N° : X para derivar a construção descrita na mesma fileira. Por exemplo, se a SEQ ID N°: X corresponder a uma proteína de tamanho total, mas apenas uma porção dessa proteína for utilizada para gerar a CID específica, está dentro do estado da técnica confiar em técnicas de biologia molecular, tal como PCR, para amplificar o fragmento específico e cloná-lo no vector apropriado. A Tabela 1 proporciona a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção ou uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido da invenção. A primeira coluna, "proteína Terapêutica X," divulga a molécula de proteína Terapêutica que pode ser seguida de parênteses contendo nomes científicos e de marca de proteínas que compreendem ou, alternativamente, consiste nessa molécula de proteína Terapêutica ou um seu fragmento ou variante. "Proteína 21
Terapêutica X", como aqui utilizada, pode referir-se a uma molécula de proteína Terapêutica individual ou ao grupo integral de proteínas Terapêuticas associadas a uma dada molécula de proteína Terapêutica divulgada nesta coluna. A coluna de "actividade Biológica" (coluna 2) descreve actividades Biológicas associadas à molécula de proteína Terapêutica. A coluna 3, "Ensaio de Actividade Exemplificativo", proporciona referências que descrevem ensaios que podem ser utilizados para testar a actividade terapêutica e/ou biológica da proteína Terapêutica:X, ou uma proteína de fusão de albumina compreendendo a porção de proteína X Terapêutica (ou seu fragmento). A quarta coluna, "Indicação Preferida: Y", descreve doenças, distúrbios e/ou estados que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou melhorados pela proteína X Terapêutica ou uma proteína de fusão de albumina compreendendo a porção de proteína X Terapêutica (ou seu fragmento). A coluna "Construção ID" (coluna 5) proporciona uma ligação para uma construção de fusão de albumina exemplificativa, divulgada na Tabela 2, que codifica uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo na porção de proteína X Terapêutica referenciada (ou seu fragmento). 22
Tabela 1
Proteína Actividade Biológica Ensaio de Indicação Preferida:Y Construção ID Proteína Terapêutica:X Actividade Terapêutica:Z Exemplificativo Semelhante a Estimula a síntese Actividade de GLPl Hiperglicemia; Diabetes; 2448, 2455, Ver a Glucagom pode ser Diabetes Insipidus; 2456, 2457, Tabela 2, Péptido 1 (GLPl; e libertação de ensaiada in vítro Diabetes mellitus; 2803, 2804, SEQ ID N°: Z Insulinotropina) insulina; melhora a utilizando um diabetes Tipo 1; diabetes 2900, 2904, para sensibilidade de ensaio de absorção Tipo 2; Resistência à 2945, 2964, construção tecidos adiposos, de de [3-H]-glucose. insulina; Deficiência de 2982, 3070, particular músculo e de fígado (J Bíol Chem, 1999, insulina; Hiperlipidemia; 2802, 3027, para a insulina; 22 de Outubro; Hipercetonemia; Diabetes 3028, 3045, estimula a absorção de 274(43):30864- Mellitus não dependente de 3046, 3069, glucose; abranda o 30873). insulina (NIDDM); Diabetes 3071, 3072, processo digestivo; Mellitus dependente de 3085, 3086, suprime o apetite; insulina (IDDM); Um Estado 3087, 3140, bloqueia a secreção de Associado a Diabetes 3309 glucagom. Incluindo, mas não limitado a, Obesidade, Doença Cardíaca, Hiperglicemia, Infecções, Retinopatia e/ou Ulceras; Distúrbios Metabólicos; Distúrbios Imunes; Obesidade; Distúrbios Vasculares; Supressão de Peso Corporal; Supressão de Apetite; Síndrome X.
Tabela 2
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder 197 2448 pSAC35:GLP-l(7-36).HSA Aminoácidos H98 a R127 de preproglucagom (SEQ ID N°: 630) (a seguir, este domínio específico será referido como "GLP-l(7-36)") está fundido a montante de HSA madura e a jusante da sequência líder HSA/kex2. pSAC35 414 198 630 988 989 HSA/kex2 199 2455 pSAC35:HSA.GLP-l(7- 36) 0 GLP-1(7-36) está fundido a jusante de HSA madura e sequência líder HSA/kex2. pSAC35 416 200 632 992 993 HSA/kex2 200 2456 pSAC35:GLP-l(7-36 (A8G)) .HSA Aminoácidos H98 a R127 de Preproglucagom (SEQ ID N°: 633) (também referido pSAC35 417 201 633 994 995 HSA/kex2 (continuação)
(continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Lider madura e sequência lider HSA/kex2. 276 2802 pSAC35:GLP-l(7-36(A8G)).IP2.HSA 0 GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) está fundido a jusante da sequência lider HSA/kex2 e a montante do péptido 2 intermédio do péptido de proglucagom e a montante de HSA madura. pScNHSA 1559 1391 1727 HSA/kex2 211 2803 pSAC35:GLP-l(7-36(A8G))x2.HSA 0 GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) está repetido em tandem e fundido a jusante da sequência sinal de HSA/kex2 e a montante de HSA madura. pScCHSA 1231 1216 1246 1261 1262 HSA/kex2 278 2804 pSAC35:coGLP-l(7-36(A8G))x2.HSA 0 GLP-1 (7-36 (A8G)) (SEQ ID N°: 1808) pScCHSA 1232 1217 1247 1263 1264 HSA/kex2 (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder está repetido em tandem e fundido a jusante da sequência sinal de HSA/kex2 e a montante de HSA madura. 312 2900 pSAC:GLP-1(7-36)x2,HSA 0 GLP-1(7-36) é repetido em tandem e, depois, fundido a jusante da sequência sinal de HSA/kex2 e a montante de HSA madura. pScCHSA 1233 1218 1248 1265 1266 HSA/kex2 316 2904 pSAC35:GLP-l(9-36) ,GLP-l(7-36) .HSA Aminoácidos E100 a R127 de preproglucagom (SEQ ID N°: 1249) (a seguir, este mutante particular é referido como GLP-1(9-36)) está fundido a jusante da sequência sinal de HSA/kex2 e a pScCHSA 1234 1219 1249 1267 1268 HSA/kex2 (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder montante de GLP-1(7-36) e HSA madura. 326 2945 pSAC35:GLP-l(7-36(A8S)).GLP-1(7-36).HSA Aminoácidos H98 a R127 de preproglucagom (SEQ ID N°: 1250) está mutada na posição 99 de alanina em serina (a seguir, este mutante particular é referido como GLP-1(7-36(A8S)), que está fundido a jusante da sequência sinal de HSA/kex2 e a montante de GLP-1(7-36) e HSA madura. pScCHSA 1235 1220 1250 1269 1270 HSA/kex2 329 2964 pSAC35:GLP-l(7- 36)x2,HSA 0 GLP-1(7-36) está repetido em tandem como um dimero e fundido a jusante da sequência líder pSAC35 1236 1221 1251 1271 1272 HSA/kex2 (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder HSA/kex2 e a montante de HSA madura. 332 2982 pSAC35:GLP-l(7-36(A8G).GLP-1(7-36).HSA 0 GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) está fundido a jusante da sequência sinal de HSA/kex2 e a montante de GLP-1(7-36) e HSA madura. pScCHSA 1237 1222 1252 1273 1274 HSA/kex2 336 3027 pSAC35:INV.GLP-l(7-36A8G)x2.HSA Péptido sinal de invertase seguido de GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) repetido em tandem como um dimero, seguido de HSA madura. pSAC35 1607 1439 1775 2004 2005 invertase 337 3028 pSAC35:INV.GLP-l(7-36(A8G)).GLP-1(7-36).HSA Péptido sinal de invertase seguido de GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), pSAC35 1608 1440 1776 2006 2007 invertase (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder depois, GLP-1(7-36(A8G)) e, depois, HSA madura. 338 3045 pSAC35:DeltaKex.GLP-l(7-36A8G)x2.HSA Sequência sinal de HSA/kex2, menos os últimos seis aminoácidos do líder, está fundida a GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) que está repetida em tandem como um dímero, seguido de HSA madura. pSAC35 1609 1440 1776 2008 2009 Últimos seis aminoácidos de HSA/kex2 339 3046 pSAC35:Delta Kex.GLP.1(7-36A8G).GLP-1(7-36).HSA Sequência sinal de HSA/kex2, menos os últimos seis aminoácidos do líder, está fundida a GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), GLP-1(7-36) e HSA madura. pSAC35 1610 1440 1776 2010 2011 Últimos seis aminoácidos de HSA/kex2 (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder 349 3066 pSAC35:CKB-ld8.GLP-1(7-36).HSA Péptido sinal de invertase seguido dos aminoácidos G28-N93 de CKfl de tamanho total (SEQ ID N°: 1788), seguido de GLP-1(7-36), seguido de HSA madura. pScCHSA 1620 1452 1788 2030 2031 invertase 350 3069 pSAC35:INU.GLP-l(7- 36(A8G)x2.HSA A sequência sinal de inulinase está fundida a GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), que está repetida em tandem como um dimero e fundida a HSA madura. pSAC35 1621 1453 1789 2032 2033 inulinase 351 3070 pSAC3 5:KT.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA 0 GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) está repetido em tandem como um dimero e fundido a montante de HSA madura e a jusante pSAC35 1280 1281 1282 1283 1284 Toxina assassina (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder da sequência sinal da toxina assassina. 352 3071 pSAC35:MAF.GLP-l(7-36(A8G))x2.HSA A sequência sinal do factor a-1 de cruzamento de levedura (a seguir MFoí-1) está fundida a cópias repetidas em tandem de GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), que estão fundidas a HSA madura. pSAC35 1622 1454 1790 2034 2035 MFa-1 353 3072 pSAC3 5:AP.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA A sequência sinal de fosfatase ácida está fundida a cópias repetidas em tandem GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), que estão fundidas a HSA madura. pSAC35 1623 1455 1791 2036 2037 Fosfatase ácida 354 3085 pSAC35:MAF.GLP-l(7-36(A8G)).GLP-1(7- A sequência sinal do factor a-1 de pSAC35 1624 1456 1792 2038 2039 MFa-1 (continuação)
Fusão N° Construção ID Nome de Construção Descrição Vector de Expressão SEQ ID N°: Y SEQ ID N°: X SEQ ID N°: Z SEQ ID N°: A SEQ ID N°: B Sequência Líder 36).HSA cruzamento de levedura (a seguir MFoí-1) está fundida a GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), GLP-1(7-36) e HSA madura. 355 3086 pSAC35:INU.GLP-l(7-36(A8G)).GLP.1(7-36).HSA A sequência sinal de inulinase está fundida a GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), GLP-1(7-36) e HSA madura. pSAC35 1625 1457 1793 2040 2041 inulinase 356 3087 pSAC3 5:AP.GLP-1(7-36(A8G)).GLP-1(7-36).HSA A sequência sinal de fosfatase ácida está fundida a GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808), GLP-1(7-36) e HSA madura. pSAC35 1626 1458 1794 2042 2043 Fosfatase ácida 370 3140 pSAC35:GLPl(mut)DA HK.HSA 0 GLP-1(7-36(A8G)) (SEQ ID N°: 1808) está ligado a HSA madura por um pSAC35 1640 1472 1808 2064 2065 HSA/kex2 (continuação)
A Tabela 2 proporciona uma lista não exaustiva de polinucleótidos da invenção compreendendo ou, alternativamente, consistindo em moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de albumina. A primeira coluna, "Fusão N°" proporciona um número de fusão para cada polinucleótido. A coluna 2, "Construção ID" proporciona um identificador numérico único para cada polinucleótido da invenção. As Construções ID podem ser utilizadas para identificar polinucleótidos que codificam proteínas de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa porção de proteína Terapêutica correspondendo à Proteína Terapêutica: X dada, listada na correspondente fileira da Tabela 1, em que essa Construção ID está listada na coluna 5. A coluna de "Nome de Construção" (coluna 3) proporciona o nome de uma dada construção ou polinucleótido de fusão de albumina. A quarta coluna na Tabela 2, "Descrição" proporciona uma descrição geral de uma dada construção de fusão de albumina e a quinta coluna, "Vector de Expressão" lista o vector dentro do qual foi clonado um polinucleótido compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa molécula de ácido nucleico codificando uma dada proteína de fusão de albumina. Os vectores são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente ou descritos em qualquer outra parte. Por exemplo, como descrito nos Exemplos, uma "cassete de expressão" compreendendo ou, alternativamente, consistindo num ou mais de (1) um polinucleótido codificando uma dada proteína de fusão de albumina, (2) uma sequência líder, (3) uma região de promotor e (4) um terminador de transcrição, pode ser montada num vector de clonagem conveniente e, subsequentemente, ser deslocada para um vector alternativo, tal como, por exemplo, um vector de 35 expressão incluindo, por exemplo, um vector de expressão de levedura ou um vector de expressão de mamífero. Numa forma de realização, para expressão em S. cervisiae, uma cassete de expressão compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de albumina é clonada em pSAC35. Noutra forma de realização, para expressão em células CHO, uma cassete de expressão compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de albumina é clonada em pC4. Numa forma de realização adicional, um polinucleótido compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa molécula de ácido nucleico codificando a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina é clonado em pC4:HSA. Ainda numa forma de realização adicional, para expressão em células NSO, uma cassete de expressão compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de albumina é clonada em pEE12. Outros vectores de clonagem e/ou expressão úteis serão conhecidos do especialista na técnica. A coluna 6, "SEQ ID N°: Y", proporciona a sequência de aminoácidos de tamanho total da proteína de fusão de albumina da invenção. Na maioria dos casos, a SEQ ID N° : Y mostra a forma não processada da proteína de fusão de albumina codificada - por outras palavras, a SEQ ID N° : Y mostra a sequência sinal, uma porção de HSA e uma porção terapêutica, todas codificadas pela construção particular. Estão especificamente contemplados pela presente invenção todos os polinucleótidos que codificam a SEQ ID N°: Y. Quando estes polinucleótidos são utilizados para expressar a proteína codificada a partir de uma célula, a secreção natural da célula e as etapas de processamento produzem 36 uma proteína que está desprovida da sequência sinal listada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2. A sequência de aminoácidos específica da sequência sinal listada é mostrada mais adiante na descrição ou é bem conhecida na técnica. Deste modo, as formas de realização muito preferidas da presente invenção incluem a proteína de fusão de albumina produzida por uma célula (que seria desprovida da sequência lider mostrada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2). Também são muito preferidos os polipéptidos compreendendo a SEQ ID N°:Y, sem a sequência lider específica listada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2. As composições compreendendo estas duas formas de realização preferidas, incluindo composições farmacêuticas, também são preferidas. Além disso, está bem dentro da capacidade do especialista na técnica substituir a sequência sinal listada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2 com uma sequência sinal diferente, tal como as descritas adiante na descrição, para facilitar a secreção da proteína de fusão de albumina processada. A sétima coluna, "SEQ ID N°: X", proporciona a sequência de ácidos nucleicos parental, a partir da qual um polinucleótido codificando a porção de proteína Terapêutica de uma dada proteína de fusão de albumina pode ser derivado. Numa forma de realização, a sequência de ácidos nucleicos parental, a partir da qual um polinucleótido codificando a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina pode ser derivado, compreende a sequência qénica de tipo selvagem codificando a proteína Terapêutica mostrada na Tabela 1. Numa forma de realização alternativa, a sequência de ácidos nucleicos parental, a partir da qual um polinucleótido codificando a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina pode ser derivado, compreende um variante ou derivado 37 de uma sequência génica de tipo selvagem codificando a proteína Terapêutica mostrada na Tabela 1, tal como, por exemplo, um variante sintético codão-optimizado de uma sequência génica de tipo selvagem codificando a proteína Terapêutica. A oitava coluna, "SEQ ID N°: Z", proporciona uma tradução prevista da sequência de ácidos nucleicos parental (SEQ ID N°: X). Esta sequência parental pode ser uma proteína parental de tamanho total, utilizada para derivar a construção particular, a porção madura de uma proteína parental, um variante ou fragmento de uma proteína de tipo selvagem ou uma sequência artificial que pode ser utilizada para criar a construção descrita. Um especialista na técnica pode utilizar esta sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: Z para determinar que resíduos de aminoácido de uma proteína de fusão de albumina codificada por uma dada construção são proporcionados pela proteína terapêutica. Além disso, está bem dentro da capacidade do especialista na técnica utilizar a sequência mostrada como SEQ ID N° : Z para derivar a construção descrita na mesma fileira. Por exemplo, se a SEQ ID N°: Z corresponder a uma proteína de tamanho total, mas apenas uma porção dessa proteína for utilizada para gerar a CID específica, está dentro do estado da técnica confiar em técnicas de biologia molecular, tal como PCR, para amplificar o fragmento específico e cloná-lo no vector apropriado.
Os iniciadores de amplificação proporcionados nas colunas 9 e 10, "SEQ ID N°: A" e "SEQ ID N° : B", respectivamente, são iniciadores exemplificativos utilizados para gerar um polinucleótido compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa molécula de ácido nucleico codificando a porção de proteína 38
Terapêutica de uma dada proteína de fusão de albumina. Numa forma de realização da divulgação, os iniciadores oligonucleotídicos tendo a sequência mostrada nas colunas 9 e/ou 10 (SEQ ID N°:A e/ou B) são utilizados para amplificar por PCR um polinucleótido codificando a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina, utilizando uma molécula de ácido nucleico compreendendo ou, alternativamente, consistindo na sequência nucleotídica proporcionada na coluna 7 (SEQ ID N°:X) da correspondente fileira como o ADN molde. Os métodos de PCR estão bem estabelecidos na técnica. Sequências de iniciadores úteis adicionais poderiam ser facilmente previstas e utilizadas por alguém com conhecimentos gerais na técnica.
Numa forma de realização alternativa, os iniciadores oligonucleotídicos podem ser utilizados em reacções de PCR de sobreposição para gerar mutações numa sequência de ADN molde. Os métodos de PCR são conhecidos na técnica.
Como mostrado na Tabela 3, determinadas construções de fusão de albumina divulgadas neste pedido foram depositadas com a ATCC®.
Tabela 3
Construção ID Nome de Construção Depósito ATCC Na/Data 3070 pSAC35:KT.GLP-1(7-36(A8G))x2.HSA PTA-4671, 16 de Setembro de 2002 39 É possível extrair uma dada construção de fusão de albumina do depósito por técnicas conhecidas na matéria e aqui descritas em qualquer outra parte (ver o Exemplo 40). A ATCC está localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, Virqínia 20110-2209, EUA. Os depósitos ATCC foram realizados de acordo com os termos do Tratado de Budapeste, no reconhecimento internacional do depósito de microrqanismos para efeitos de processo de patente. É descrita uma "cassete de expressão" compreendendo ou, alternativamente, consistindo num ou mais de (1) um polinucleótido codificando uma dada proteína de fusão de albumina, (2) uma sequência líder, (3) uma reqião de promotor e (4) um terminador de transcrição pode ser deslocado ou "subclonado" de um vector para outro. Os fragmentos a serem subclonados podem ser gerados por métodos bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, amplificação por PCR (e. g., utilizando iniciadores oligonucleotidicos tendo a sequência mostrada na SEQ ID N° : A ou B) , e/ou digestão de enzimas de restrição.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são capazes de uma actividade terapêutica e/ou actividade biológica correspondente à actividade terapêutica e/ou actividade biológica da proteína Terapêutica correspondente à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina listada na correspondente fileira da Tabela 1. Em formas de realização preferidas adicionais, as porções de proteína terapeuticamente activa das proteínas de fusão de albumina da invenção são fragmentos ou variantes da proteína codificada pela sequência mostrada na coluna 40 SEQ ID N°: X da Tabela 2 e são capazes da actividade terapêutica e/ou actividade biológica da correspondente proteína Terapêutica.
Proteínas de fusão de albumina não humanas da hormona do crescimento.
Numa forma de realização, as proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem uma ou mais proteínas de Albumina Sérica de uma espécie animal não humana, fundidas em tandem e em fase à terminação N ou à terminação C a uma ou mais proteínas da Hormona do Crescimento da mesma espécie animal não humana. As proteínas de Albumina Sérica e de Hormona do Crescimento não humanas são bem conhecidas na técnica e disponíveis em bases de dados públicas. Por exemplo, a Tabela 4 apresenta números de acesso correspondendo a sequências de Albumina Sérica não humana (coluna 2) e sequências de Hormona do Crescimento não humana (coluna 3) verificadas no GenBank. Numa forma de realização preferida, uma proteína de Albumina Sérica de uma espécie animal não humana, listada na Tabela 4, está fundida a uma proteína de Hormona do Crescimento da mesma espécie animal não humana.
Numa forma de realização específica, a proteína de fusão de albumina da invenção compreende uma ou mais proteínas de Albumina Sérica de Bos taurus listadas na Tabela 4, coluna 2, fundidas em tandem e em fase à terminação N ou à terminação C a uma ou mais proteínas de Hormona do Crescimento de Bos taurus listadas na Tabela 4, coluna 3. 41
As proteínas de fusão compreendendo fragmentos ou variantes de Albumina Sérica não humana, tal como, por exemplo, a forma madura de Albumina Sérica, também estão abrangidas pela invenção. As proteínas de fusão compreendendo fragmentos ou variantes de proteínas de Hormona do Crescimento não humana, tal como, por exemplo, a forma madura de Hormona do Crescimento, também estão abrangidas pela invenção. De um modo preferido, os fragmentos e variantes de Hormona do Crescimento não humana retêm actividade de hormona do crescimento.
Os polinucleótidos da invenção compreendem ou, alternativamente, consistem numa ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de albumina não humana descrita acima. Por exemplo, os polinucleótidos podem compreender ou, alternativamente, consistir numa ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de
Albumina Sérica de uma espécie animal não humana, listada na Tabela 4, coluna 1 (tal como, por exemplo, as sequências de referência de Albumina Sérica não humana listadas na Tabela 4, coluna 2) fundida em tandem e em fase, 5' ou 3', a um polinucleótido que compreende ou, alternativamente, consiste numa ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a proteína de Hormona do Crescimento não humana da correspondente espécie animal não humana (por exemplo, as sequências de referência da Hormona do Crescimento listadas na Tabela 4, coluna 3).
As proteínas de fusão de albumina não humanas descritas acima estão abrangidas pela invenção, como estão células hospedeiras e vectores contendo estes polinucleótidos. Numa forma de realização, uma proteína de fusão de albumina não humana codificada por um polinucleótido, como descrito acima, 42 tem estabilidade em armazenamento alargada. Numa forma de realização adicional, uma proteina de fusão de albumina não humana codificada por um polinucleótido descrito acima tem uma meia-vida sérica mais longa e/ou actividade mais estabilizada em solução (ou numa composição farmacêutica), in vitro e/ou in vivo, do que a correspondente molécula Hormona do Crescimento não fundida. A presente invenção também abrange métodos de prevenção, tratamento ou melhoramento de uma doença ou distúrbio numa espécie animal não humana. Em determinadas formas de realização, a presente invenção abrange um método de tratamento de uma doença ou distúrbio veterinário, compreendendo administrar a uma espécie animal não humana, na qual esse tratamento, prevenção ou melhoramento é desejado, uma proteina de fusão de albumina da invenção que compreende uma porção de Hormona do Crescimento correspondendo a uma proteina de Hormona do Crescimento (ou seu fragmento ou variante), numa quantidade eficaz para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou distúrbio. As doenças e/ou distúrbios veterinários que podem ser tratados, prevenidos ou melhorados incluem distúrbios do crescimento (tal como, por exemplo, nanismo pituitário), ulceração da pele, obesidade, dermatose responsiva a hormona do crescimento, cardiomiopatia dilatada, distúrbios alimentares, distúrbios reprodutivos e distúrbios endócrinos.
As proteínas de fusão de albumina não humanas da invenção também podem ser utilizadas para promover a cicatrização de feridas de pele, lesões corneanas, fracturas ósseas e lesões de articulações, tendões ou ligamentos. 43
As proteínas de fusão de albumina não humanas da invenção também podem ser utilizadas para aumentar a produção de leite em animais lactantes. Numa forma de realização preferida, o animal lactante é uma vaca leiteira.
As proteínas de fusão de albumina não humanas da invenção também podem ser utilizadas para melhorar o estado do corpo em animais idosos.
As proteínas de fusão de albumina não humanas da invenção também podem ser utilizadas para aumentar a fertilidade, taxas de gravidez e sucesso reprodutivo em animais domesticados.
As proteínas de fusão de albumina não humanas da invenção também podem ser utilizadas para melhorar a razão de carne magra/gorda em animais criados para consumo, assim como melhorar o apetite e aumentar o tamanho e taxa de crescimento corporal. 44
Tabela 4
Espécie Não Humana Sequência(s) de Referência de Albumina Sérica Não Humana: N° de Acesso de Proteína do GenBank Sequência(s) de Referência de Hormona da Crescimento Não Humana: N°s de Acesso de Proteína do GenBank Bos taurus ABBOS, CM76847, P02769, CAA41735, 229552, MA51411 STBO, BAA06379, A29864, AAF28806, AAF28805, AAF28804, P01246, AAF03132, AAC63901, AAB92549, A36506, 145901, JC1316, CAA23445, CAA00787, CAA00598, AAA30547, AAA30546, AAA30545, AAA30544, AAA30543, AAA30542 Sus scrofa P08835, CM30970, AM30988 STPG, PC1017, AAB29947, AAB84359, 146585, 146584, PC1063, A01516, AAB17619, 226829, 225740, CAA37411, CAA00592, AAA73478, AAA73477, CAA00356, AAA31046, AAA31045, AAA31044, AA30543 Equus cahallus ABHOS, AAG40944, P35747, CAA52194 STHO, P01245, AAD25992, 227704, AAA21027 Ovis aries ABSHS, P14639, CAA34903 STSH, AAB24467, AAC48679, 228487, 223932, CAA34098, CAA31063, CAA00828, AAA31527 Salmo salar AB0NS2, AB0NS2, CAA36643, CAA43187 STONC, P07064, Q07221, P48096, P10814, P10607, 151186, S03709, JS0179, A23154, S06489, CAA42431, AAB29165, AAB24612, Q91221, Q91222, CAA43942, CAA32481, 738042, 224555, CAA00427, AAA50757, AAA49558, AAA49555, AAA49553, AAA49401, AAA49406, AAA49403, AAA49402 Gallus gallus ABCHS, P19121, CAA43098 BAB62262, BAB69037, AAK95643, A60509, AAG01029, BAA01365, P08998, 226895, CAA31127, CAA35619, AAA48780 Felís catus P49064, S57632, CAA59279, JC4660 JC4632, P46404, AAC00073, AAA96142, AAA67294 Canis famílíarís P49822, S29749, CAB64867, CAA76841, AAB30434 P33711, 146145, AAF89582, AAF21502, AAD43366, S35790, AAB34229, CAA80601
Fragmentos e Variantes Polipeptídicos e Polinucleotidicos
Fragmentos
Mesmo se a deleção de um ou mais aminoácidos da terminação N de uma proteína resultar em modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas da proteína Terapêutica, a proteína de albumina e/ou proteína de fusão de albumina da invenção, outras actividades Terapêuticas e/ou actividades funcionais (e. g., actividades biológicas, capacidade de multimerizar, capacidade de ligar um ligando) podem ainda ser retidas. Por exemplo, a capacidade de os polipéptidos com deleções N-terminais induzirem e/ou se ligarem a anticorpos que reconhecem as formas completas ou maduras dos polipéptidos será, em geral, retida quando menos do que a maioria dos resíduos do polipéptido completo forem removidos da terminação N. Se um polipéptido particular, desprovido de resíduos N-terminais de um polipéptido completo, retém essas actividades imunogénicas pode ser facilmente determinado por métodos de rotina aqui descritos e, de outro modo, conhecidos na técnica. Não é improvável que uma muteína com um grande número de resíduos de aminoácidos N-terminais removidos possa reter algumas actividades biológicas ou imunogénicas. De facto, os péptidos compostos por apenas seis resíduos de aminoácido podem frequentemente suscitar uma resposta imunitária.
Consequentemente, os fragmentos da proteína Terapêutica, correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, incluem a proteína de tamanho total, assim como polipéptidos tendo um ou mais resíduos removidos da terminação amino da sequência de aminoácidos do polipéptido de referência (i. e., a proteína Terapêutica referida na Tabela 1 ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2). Em particular, as deleções N-terminais podem ser descritas pela fórmula geral m a q, onde q é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido num polipéptido de referência (e. g., a proteína Terapêutica referida na Tabela 1, ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2) e m é definido como qualquer número inteiro variando de 2 e q menos 6. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Além disso, os fragmentos de polipéptidos de albumina sérica, correspondendo a uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina da invenção, incluem a proteína de tamanho total, assim como polipéptidos tendo um ou mais resíduos removidos da terminação amino da sequência de aminoácidos do polipéptido de referência (i. e., a albumina sérica ou uma porção de albumina sérica de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2). Em formas de realização preferidas, as deleções N-terminais podem ser descritas pela fórmula geral m a 585, onde 585 é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido na albumina sérica humana madura (SEQ ID N°: 1038) e m é definido como qualquer número inteiro variando de 2 a 579. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção. Em formas de realização adicionais, as 47 deleções N-terminais podem ser descritas pela fórmula geral m a 609, onde 609 é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido na albumina sérica humana de tamanho total (SEQ ID N° : 1094) e m é definido como qualquer número inteiro variando de 2 a 603. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Além disso, os fragmentos de proteínas de fusão de albumina da invenção incluem a proteína de fusão de albumina de tamanho total, assim como polipéptidos tendo um ou mais resíduos removidos da terminação amino da proteína de fusão de albumina (e. g. , uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2; ou uma proteína de fusão de albumina tendo a sequência de aminoácidos divulgada na coluna 6 da Tabela 2) . Em particular, as deleções N-terminais podem ser descritas pela fórmula geral m a q, onde q é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido na proteína de fusão de albumina e m é definido como qualquer número inteiro variando de 2 a q menos 6. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Também como mencionado acima, se uma deleção de um ou mais aminoácidos da terminação N ou terminação C de um polipéptido de referência (e. g., a proteína Terapêutica; proteína de albumina sérica; ou proteína de fusão de albumina da invenção) resultar na modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas da proteína, outras actividades funcionais (e. g., actividades biológicas, capacidade de multimerizar, capacidade de ligar um ligando) e/ou actividades Terapêuticas podem ainda ser retidas. Por exemplo, a capacidade de os polipéptidos com deleções C-terminais induzirem e/ou se ligarem a anticorpos que 48 reconhecem as formas completas ou maduras dos polipéptidos será, em geral, retida quando menos do que a maioria dos resíduos do polipéptido completo ou maduro forem removidos da terminação C. Se um polipéptido particular, desprovido dos resíduos N-terminais e/ou C-terminais de um polipéptido de referência, retiver actividade Terapêutica pode ser facilmente determinado por métodos de rotina aqui descritos e/ou de outro modo conhecidos na técnica. A presente divulgação proporciona, ainda, polipéptidos tendo um ou mais resíduos removidos da terminação carboxilo da sequência de aminoácidos da proteína Terapêutica correspondente à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção (e. g. , a proteína Terapêutica referida na Tabela 1 ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2). Em particular, as deleções C-terminais podem ser descritas pela fórmula geral 1 até n, onde n é qualquer número inteiro variando de 6 a q menos 1 e onde q é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido num polipéptido de referência (e. g., a proteína Terapêutica referida na Tabela 1 ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2). Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Além disso, a presente divulgação proporciona polipéptidos tendo um ou mais resíduos removidos da terminação carboxilo da sequência de aminoácidos de uma proteína de albumina correspondente a uma porção de proteína de albumina de uma 49 proteína de fusão de albumina da invenção (e. g., albumina sérica ou uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2) . Em particular, as deleções C-terminais podem ser descritas pela fórmula geral I a n, onde n é qualquer número inteiro variando de 6 a 584, onde 584 é o número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido na albumina sérica humana madura (SEQ ID N°: 1038) menos 1. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção. Em particular, as deleções C-terminais podem ser descritas pela fórmula geral 1 até n, onde n é qualquer número inteiro variando de 6 a 608, onde 608 é o número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido na albumina sérica (SEQ ID N°: 1094) menos 1. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Além disso, a presente divulgação proporciona polipéptidos tendo um ou mais resíduos removidos da terminação carboxilo de uma proteína de fusão de albumina da invenção. Em particular, as deleções C-terminais podem ser descritas pela fórmula geral 1 até n, onde n é qualquer número inteiro variando de 6 a q menos 1 a q é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácido na proteína de fusão de albumina da invenção. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Além disso, qualquer das deleções N- ou C-terminais acima descritas pode ser combinada para produzir um polipéptido de referência removido em N- e C-terminal. A divulgação também proporciona polipéptidos tendo um ou mais aminoácidos removidos das terminações amino e carboxilo que podem ser descritos, em 50 geral, como tendo resíduos m a n de um polipéptido de referência (e. g., a proteína Terapêutica referida na Tabela 1, ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, ou uma porção de proteína Terapêutica codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2, ou albumina sérica (e. g., SEQ ID N°: 1038), ou uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina da invenção, ou uma porção de proteína de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2, ou uma proteína de fusão de albumina, ou uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina da invenção), onde nem são números inteiros, como descrito acima. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também são divulgados. A presente divulgação também é dirigida a proteínas contendo polipéptidos, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a uma sequência polipeptídica de referência (e. g. , a proteína Terapêutica referida na Tabela 1, ou uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, ou uma porção de proteína Terapêutica codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2, ou albumina sérica (e. g., SEQ ID N° : 1038), ou uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina da invenção, ou uma porção de proteína de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 2, ou uma proteína de fusão de albumina, ou uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina da invenção) aqui exposta ou seus fragmentos. A divulgação é dirigida a proteínas compreendendo polipéptidos, 51 pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a polipéptidos de referência tendo a sequência de aminoácidos de deleções N- e C-terminais, como descrito acima. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também são divulgados.
Os fragmentos polipeptídicos preferidos são fragmentos compreendendo ou, alternativamente, consistindo numa sequência de aminoácidos que exibe uma actividade Terapêutica e/ou actividade funcional (e. g., actividade biológica) da sequência polipeptídica da proteina Terapêutica ou proteína de albumina, da qual a sequência de aminoácidos é um fragmento.
Outros fragmentos polipeptídicos preferidos são fragmentos biologicamente activos. Os fragmentos biologicamente activos são aqueles exibindo actividade semelhante, mas não necessariamente idêntica, a uma actividade do polipéptido da presente invenção. A actividade biológica dos fragmentos pode incluir uma actividade desejada melhorada ou uma actividade indesejável diminuída.
Variantes "Variante" refere-se a um polinucleótido ou ácido nucleico diferindo de um ácido nucleico ou polipéptido de referência, mas retendo as suas propriedades essenciais. Em geral, os variantes, globalmente, são estreitamente semelhantes e, em muitas regiões, idênticos ao ácido nucleico ou polipéptido de referência.
Como aqui utilizado, "variante", refere-se à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da 52 invenção, porção de albumina de uma proteína de fusão de albumina da invenção, ou proteína de fusão de albumina da invenção diferindo em sequência da proteína Terapêutica (e. g., ver coluna "terapêutica" da Tabela 1), proteína de albumina e/ou proteína de fusão de albumina, respectivamente, mas retendo, pelo menos, uma sua propriedade funcional e/ou terapêutica, como aqui descrito em qualquer outra parte ou, de outro modo, conhecida na técnica. Em geral, os variantes são, globalmente, muito semelhantes e, em muitas regiões, idênticos à sequência de aminoácidos da proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina, proteína de albumina correspondendo a uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina e/ou os ácidos Nucleicos de proteína de fusão de albumina codificando estes variantes também estão abrangidos pela invenção. A presente divulgação também é dirigida a proteínas que compreendem ou, alternativamente, consistem numa sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica, por exemplo, à sequência de aminoácidos da proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção (e. g., a sequência de aminoácidos da proteína Terapêutica:X divulgada na Tabela 1 que é GLP-1; ou a sequência de aminoácidos da porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 1 e 2 ou seus fragmentos ou variantes), proteínas de albumina correspondendo a uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina da invenção (e. g. , a sequência de aminoácidos de uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão 53 de albumina descrito na Tabela 1 e 2; a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 1038; ou seus fragmentos ou variantes) e/ou proteínas de fusão de albumina. Os fragmentos destes polipéptidos também são proporcionados (e. g., os fragmentos aqui descritos). São ainda descritos polipéptidos codificados por polinucleótido que se híbrida ao complemento de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção, sob condições estringentes de hibridação (e. g., hibridação a ADN ligado a filtro em 6X cloreto de Sódio/citrato de Sódio (SSC), a cerca de 45 graus Celsius, seguida de uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS a 0,1%, a cerca de 50 - 65 graus Celsius), sob condições altamente estringentes (e. g. , hibridação a ADN ligado a filtro em 6X cloreto de sódio/citrato de Sódio (SSC), a cerca de 45 graus Celsius, seguida de uma ou mais lavagens em 0,1X SSC, SDS a 0,2%, a cerca de 68 graus Celsius) ou sob outras condições estringentes de hibridação que são conhecidas dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, F.M. et ai., ed., 1989 Current protocol in Molecular Blology, Green publishing associates, Inc., e John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque, nas páginas 6.3.1 - 6.3.6 e 2 10.3). Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção.
Por um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de pesquisa, entende-se que a sequência de aminoácidos do polipéptido submetido é idêntica à sequência de pesquisa, com a excepção de que a sequência polipeptídica submetida pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de pesquisa. Por outras palavras, de modo a obter-se um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 95% idêntica a uma 54 sequência de aminoácidos de pesquisa, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência submetida podem ser inseridos, removidos ou substituídos com outro aminoácido. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino- ou carboxi-terminais da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer parte entre essas posições terminais, dispersas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
Em termos práticos, se qualquer polipéptido particular for, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico, por exemplo, à sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão de albumina da invenção ou um seu fragmento (tais como uma porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina ou uma porção de albumina da proteína de fusão de albumina), pode ser determinado de modo convencional utilizando programas de computador conhecidos. Um método preferido, para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de pesquisa (uma sequência da presente invenção) e uma sequência submetida, também referido como um alinhamento de sequência global, pode ser determinado utilizando o programa de computador FASTDB, baseado no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Num alinhamento de sequência, as sequências de pesquisa e submetida são ambas sequências nucleotídicas ou ambas sequências de aminoácidos. O resultado do referido alinhamento de sequência global é expresso como percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento de aminoácidos de FASTDB são: Matriz=PAM0, k-tuplo=2, Penalidade de Não Correspondência=l, Penalidade de Junção=20, Comprimento de Grupo de Aleatorização=0, Pontuação de Exclusão=l, Tamanho de Janela=comprimento de sequência, Penalidade de Lacuna=5, Penalidade de Tamanho de Lacuna=0,05 Tamanho de Janela=500 ou o 55 comprimento da sequência de aminoácido submetida, consoante o que for mais pequeno.
Se a sequência submetida for mais curta do que a sequência de pesquisa, devido a deleções N- ou C-terminais, não devido a deleções internas, deve ser realizada uma correcção manual aos resultados. Tal ocorre porque, quando se calcula a percentagem de identidade global, o programa FASTDB não tem em conta truncamentos N- e C-terminais da sequência submetida. Para sequências submetidas truncadas nas terminações N e C, relativamente à sequência de pesquisa, a percentagem de identidade é corrigida pelo cálculo do número de resíduos da sequência de pesquisa que são N- e C-terminais da sequência submetida, que não são correspondentes/alinhados com um correspondente resíduo submetido, como uma percentagem das bases totais da sequência de pesquisa. Se um resíduo for correspondente/alinhado, é determinado por resultados do alinhamento de sequência de FASTDB. Esta percentagem é, depois, subtraída da percentagem de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima, utilizando os parâmetros especificados, de modo a chegar-se a uma pontuação de percentagem de identidade final. Esta pontuação de percentagem de identidade final é o que é utilizado para efeitos da presente divulgação. Apenas os resíduos para as terminações N e C da sequência submetida que não são correspondentes/alinhados com a sequência de pesquisa são considerados para efeitos do ajuste manual da pontuação de percentagem de identidade. Isto é, apenas as posições de resíduos de pesquisa fora dos resíduos N- e C-terminais mais distantes da sequência submetida.
Por exemplo, uma sequência submetida de 90 resíduos de aminoácido é alinhada com uma sequência de pesquisa de 56 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre no terminal N da sequência submetida e, por conseguinte, o alinhamento de FASTDB não mostra uma correspondência/alinhamento dos primeiros 10 resíduos no terminal N. Os 10 resíduos desemparelhados representam 10% da sequência (número de resíduos nas terminações N e C não correspondentes/número total de resíduos na sequência de pesquisa), portanto subtrai-se 10% da pontuação de percentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os restantes 90 resíduos fossem perfeitamente correspondentes, a percentagem de identidade final seria 90%. Noutro exemplo, uma sequência submetida de 90 resíduos é comparada com uma sequência de pesquisa de 100 resíduos. Desta vez, as deleções são deleções internas, de modo que não existem resíduos nas terminações N ou C da sequência submetida que não sejam correspondentes/alinhados com a pesquisa. Neste caso, a percentagem de identidade calculada pelo FASTDB não é manualmente corrigida. Mais uma vez, apenas as posições de resíduo fora das extremidades N- e C-terminais da sequência submetida, como exibido no alinhamento de FASTDB, que não são correspondentes/alinhadas com a sequência de pesquisa são manualmente corrigidas. Para efeitos da presente invenção, não devem ser realizadas outras correcções manuais. O variante terá, habitualmente, pelo menos, 75% (de um modo preferido, pelo menos, cerca de 80%, 90%, 95% ou 99%) de identidade de sequência com um comprimento de HA ou proteína Terapêutica normal que tem o mesmo comprimento que o variante. A homologia ou identidade ao nível de sequência de nucleótidos ou aminoácidos é determinada por análise de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), utilizando o algoritmo empregue pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268 (1990) e 57
Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993)) que sao talhados para pesquisa de semelhança de sequência. A abordagem utilizada pelo programa BLAST é, em primeiro lugar, considerar segmentos semelhantes entre uma sequência de pesquisa e uma sequência de base de dados, depois, avaliar a significância estatística de todas as correspondências que são identificadas e, finalmente, sumariar apenas as correspondências que satisfazem um limiar de significância pré-seleccionado. Para uma discussão de questões básicas em pesquisa de semelhança de bases de dados de sequência, ver Altschul et al., (Nature
Genetics 6: 119-129 (1994)). Os parâmetros de pesquisa para histograma, descrições, alinhamentos, previsão (i. e., o limiar de significância estatística para relatar correspondências contra sequências de bases de dados), exclusão, matriz e filtro estão nas regulações predefinidas. A matriz de pontuação predefinida utilizada por blastp, blastx, tblastn e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919 (1992)).
Para blastn, a matriz de pontuação é fixa pelas razões de M (i. e., a pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes) para N (i. e., a pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes), em que os valores predefinidos para M e N são 5 e -4, respectivamente. Quatro parâmetros de blastn podem ser ajustados como se segue: Q=10 (penalidade de criação de lacuna); R=10 (penalidade de extensão de lacuna); wink=l (gera acertos de palavras em cada enésima posição de wink ao longo da pesquisa); e gapw=16 (fixa a largura de janela dentro da qual os alinhamentos de lacuna são gerados). As regulações equivalentes de parâmetro de Blastp foram Q=9; R=2; wink=l; e gapw=32. Uma comparação de Bestfit entre sequências, 58 disponível na versão 10.0 do pacote de GCG, utiliza os parâmetros de ADN GAP=50 (penalidade de criação de lacuna) e LEN=3 (penalidade de extensão de lacuna) e as regulações equivalentes em comparações de proteína são GAP=8 e LEN=2.
Os variantes polinucleotídicos da divulgação podem conter alterações nas regiões codificantes, regiões não codificantes ou ambas. São especialmente preferidos variantes polinucleotídicos contendo alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou actividades do polipéptido codificado. São preferidos os variantes nucleotídicos produzidos por substituições silenciosas, devido à degenerescência do código genético. Além disso, também são preferidos os variantes polipeptídicos nos quais menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10 ou 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 ou 1-2 aminoácidos são substituídos, removidos ou adicionados em qualquer combinação. Os variantes polinucleotídicos podem ser produzidos por uma variedade de razões, e. g., optimizar a expressão de codão para um hospedeiro particular (alterar codões no ARNm humano para os preferidos por um hospedeiro bacteriano, tais como levedura ou E. coli) .
Um polinucleótido da divulgação que codifica a porção de albumina de uma proteína de fusão de albumina é optimizado para expressão em células de levedura ou mamífero. Um polinucleótido que codifica a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina é optimizado para expressão em células de levedura ou mamífero. Um polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção é optimizado para expressão em células de levedura ou mamífero. 59
Um polinucleótido de codão optimizado que codifica a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina não se hibrida ao polinucleótido de tipo selvagem codificando a proteína Terapêutica sob condições estringentes de hibridação, como aqui descrito. Um polinucleótido de codão optimizado que codifica uma porção albumina de uma proteína de fusão de albumina não se hibrida ao polinucleótido de tipo selvagem codificando a proteína de albumina sob condições estringentes de hibridação, como aqui descrito. Um polinucleótido de codão optimizado que codifica uma proteína de fusão de albumina não se hibrida ao polinucleótido de tipo selvagem codificando a porção de proteína Terapêutica ou a porção de proteína de albumina sob condições estringentes de hibridação, como aqui descrito.
Numa forma de realização adicional, um polinucleótido que codifica a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina não compreende ou, alternativamente, consiste na sequência de ocorrência natural dessa proteína Terapêutica. Numa forma de realização adicional, um polinucleótido que codifica uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina não compreende ou, alternativamente, consiste na sequência de ocorrência natural dessa proteína de albumina. Numa forma de realização alternativa, um polinucleótido que codifica uma proteína de fusão de albumina não compreende ou, alternativamente, consiste na sequência de ocorrência natural de uma porção de proteína Terapêutica ou da porção de proteína de albumina.
Os variantes de ocorrência natural são denominados "variantes alélicos" e referem-se a uma de várias formas alternativas de um gene ocupando um determinado lócus num cromossoma de um organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John 60
Wiley & Sons, Nova Iorque (1985)). Estes variantes alélicos podem variar ao nível polinucleotídico e/ou polipeptídico e estão incluídos na presente invenção. Alternativamente, os variantes de ocorrência não natural podem ser produzidos por técnicas de mutagénese ou por síntese directa.
Utilizando métodos conhecidos de engenharia de proteínas e tecnologia de ADN recombinante, podem ser gerados variantes para melhorar ou alterar as características dos polipéptidos da presente invenção. Por exemplo, podem ser removidos um ou mais aminoácidos da terminação N ou terminação C do polipéptido da presente invenção, sem perda substancial da função biológica. Como um exemplo, Ron et al. (J. BioL Chem. 268: 2984-2988 (1993)), referiram proteínas de KGF variantes tendo actividade de ligação de heparina, mesmo após deleção de 3, 8 ou 27 resíduos de aminoácido amino-terminais. De modo semelhante, o Interferão gama exibiu actividade até dez vezes superior, após deleção de 8-10 resíduos de aminoácido da terminação carboxilo desta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988).)
Além disso, ampla evidência demonstra que os variantes frequentemente retêm uma actividade biológica semelhante à da proteína de ocorrência natural. Por exemplo, Gayle e colaboradores (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993)) conduziram extensa análise mutacional da citocina IL-la humana. Utilizaram mutagénese aleatória para gerar mais de 3500 mutantes de IL-la individuais que perfaziam uma média de 2,5 alterações de aminoácido por variante, ao longo de todo o comprimento da molécula. Foram examinadas múltiplas mutações em cada posição possível de aminoácido. Os investigadores verificaram que "a [m]aior parte da molécula poderia ser alterada com pouco efeito 61 na [ligação ou actividade biológica]". De facto, de mais de 3500 sequências nucleotidicas examinadas, apenas 23 sequências de aminoácido únicas produziram uma proteína que diferia significativamente em actividade das de tipo selvagem.
Além disso, mesmo se a deleção de um ou mais aminoácidos da terminação N ou terminação C de um polipéptido resultar na modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas, podem ser ainda retidas outras actividades biológicas. Por exemplo, a capacidade de um variante de deleção induzir e/ou ligar-se a anticorpos que reconhecem a forma segregada será provavelmente retida quando menos do que a maioria dos resíduos da forma segregada for removida da terminação N ou terminação C. Se um polipéptido particular, desprovido de resíduos N- ou C-terminais de uma proteína, retém essas actividades imunogénicas pode ser facilmente determinado por métodos de rotina aqui descritos e, de outro modo, conhecidos na técnica.
Deste modo, a invenção inclui ainda variantes polipeptídicos que têm uma actividade funcional (e. g., actividade biológica e/ou actividade terapêutica). Numa forma de realização, a invenção proporciona variantes de proteínas de fusão de albumina que têm uma actividade funcional (e. g., actividade biológica e/ou actividade terapêutica) que corresponde a uma ou mais actividades biológicas e/ou terapêuticas da proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina. Noutra forma de realização, a invenção proporciona variantes de proteínas de fusão de albumina que têm uma actividade funcional (e. g., actividade biológica e/ou actividade terapêutica) que corresponde a uma ou mais actividades biológicas e/ou terapêuticas da proteína Terapêutica correspondendo à porção de 62 proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina. Esses variantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições e substituições, seleccionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de modo a terem pouco efeito na actividade. Os polinucleótidos codificando esses variantes também estão abrangidos pela invenção.
Em formas de realização preferidas, os variantes da invenção têm substituições conservativas. Por "substituições conservativas" entende-se trocas nos grupos, tal como substituição dos aminoácidos alifáticos ou hidrófobos Ala, Vai, Leu e Ile; substituição dos resíduos de hidroxilo Ser e Thr; substituição dos resíduos acídicos Asp e Glu; substituição dos resíduos de amida Asn e Gin, substituição dos resíduos básicos Lys, Arg e His; substituição dos resíduos aromáticos Phe, Tyr e Trp e substituição dos aminoácidos de pequeno tamanho Ala, Ser, Thr, Met e Gly. A orientação que se refere a como preparar substituições de aminoácido fenotipicamente silenciosas é proporcionada, por exemplo, em Bowie et al., "Decifrando a Mensagem em Sequências de Proteína: Tolerância a Substituições de Aminoácido", Science 247:1306-1310 (1990), em que a requerente indicam que existem duas estratégias principais para estudar a tolerância de uma sequência de aminoácidos à alteração. A primeira estratégia explora a tolerância de substituições de aminoácido por selecção natural durante o processo de evolução. Pela comparação de sequências de aminoácido em diferentes espécies, podem ser identificados aminoácidos conservados. É provável que estes aminoácidos conservados sejam importantes para a função de proteína. Em contraste, as posições 63 de aminoácido onde as substituições foram toleradas pela selecção natural indicam que estas posições não são criticas para a função de proteína. Deste modo, as posições tolerando substituição de aminoácido poderiam ser modificadas mantendo ainda, simultaneamente, a actividade biológica da proteína. A segunda estratégia utiliza a engenharia genética para introduzir alterações de aminoácido em posições específicas de um gene clonado para identificar regiões críticas para a função de proteína. Por exemplo, pode ser utilizada a mutagénese dirigida pontual ou mutagénese de rastreio de alanina (introdução de mutações de alanina únicas em cada resíduo na molécula). Ver Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989). As moléculas mutantes resultantes podem ser, depois, testadas para actividade biológica.
Como afirma a requerente, estas duas estratégias revelaram que as proteínas são surpreendentemente tolerantes a substituições de aminoácido. A requerente indica, ainda, que alterações de aminoácido são susceptíveis de serem permissivas a determinadas posições de aminoácido na proteína. Por exemplo, os resíduos de aminoácido mais profundos (dentro da estrutura terciária da proteína) requerem cadeias laterais não polares, ao passo que poucas características de cadeias laterais de superfície são, em geral, conservadas. Além disso, as substituições de aminoácido conservativas toleradas envolvem a substituição dos aminoácidos alifáticos ou hidrófobos Ala, Vai, Leu e Ile; substituição dos resíduos de hidroxilo Ser e Thr; substituição dos resíduos acídicos Asp e Glu; substituição dos resíduos de amida Asn e Gin, substituição dos resíduos básicos Lys, Arg e His; substituição dos resíduos aromáticos Phe, Tyr e Trp e substituição dos aminoácidos de pequeno tamanho Ala, Ser,
Thr, Met e Gly. Além da substituição conservativa de aminoácido, os variantes da presente invenção incluem (i) polipéptidos contendo substituições de um ou mais dos resíduos de aminoácido não conservados, onde os resíduos de aminoácido substituídos podem ou não ser um codificado pelo código genético, ou (ii) polipéptidos contendo substituições de um ou mais dos resíduos de aminoácido tendo um grupo substituinte, ou (iii) polipéptidos que foram fundidos ou quimicamente conjugados a outro composto, tal como um composto para aumentar a estabilidade e/ou solubilidade do polipéptido (por exemplo, polietilenoglicol), (iv) polipéptido contendo aminoácidos adicionais, tal como, por exemplo, um péptido de região de fusão de Fc de IgG. Considera-se que esses polipéptidos variantes estão dentro do âmbito dos especialistas na técnica, a partir dos presentes ensinamentos.
Por exemplo, os variantes polipeptídicos contendo substituições de aminoácido de aminoácidos carregados com outros aminoácidos carregados ou neutros, podem produzir proteínas com características melhoradas, tal como menos agregação. A agregação de formulações farmacêuticas reduz a actividade e aumenta a depuração, devido à actividade imunogénica do agregado. Ver Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:30 7-3 77 (1993) .
Em formas de realização específicas, os polipéptidos da invenção compreendem ou, alternativamente, consistem em fragmentos ou variantes da sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão de albumina, em que os fragmentos ou variantes têm as actividades especificadas nas reivindicações e em que os 65 fragmentos ou variantes têm 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 ou 50-150 adições, substituições e/ou deleções de resíduos de aminoácido, quando comparados com a sequência de aminoácidos de referência. Em formas de realização preferidas, as substituições de aminoácido são conservativas. Os ácidos nucleicos codificando estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção. 0 polipéptido da presente invenção pode ser composto por aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, i. e., isoésteres peptídicos e pode conter aminoácidos que não os 20 aminoácidos codificados por gene. Os polipéptidos podem ser modificados por processos naturais, tal como processamento pós-traducional ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Essas modificações estão bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como numa volumosa literatura de investigação. As modificações podem ocorrer em qualquer parte num polipéptido, incluindo o esqueleto peptídico, as cadeias laterais de aminoácido e as terminações amino ou carboxilo. Será entendido que, num determinado polipéptido, o mesmo tipo de modificação pode estar presente, no mesmo ou em graus variáveis, em diversos sítios. Igualmente, um determinado polipéptido pode conter muitos tipos de modificações. Os polipéptidos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os polipéptidos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais de pós-tradução ou podem ser preparados por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, conjugação covalente de flavina, conjugação covalente de uma fracção heme, conjugação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, conjugação covalente de um lípido ou derivado de lípido, conjugação 66 covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfureto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolitico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por ARN de transferência de aminoácidos a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação. (Ver, por exemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, páginas 1-12 (1983); Seifter et ai., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 663:48-62 (1992)).
Actividade funcional "Um polipéptido tendo actividade funcional" refere-se a um polipéptido capaz de exibir uma ou mais actividades funcionais conhecidas associadas à pro-proteína de tamanho total e/ou forma madura da proteína Terapêutica. Essas actividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, actividade biológica, antigenicidade [capacidade de se ligar (ou competir com um polipéptido para ligação) a um anticorpo anti-polipéptido], imunogenicidade (capacidade de gerar anticorpo que se liga a um polipéptido específico da invenção), capacidade de formar multímeros com polipéptidos da invenção e capacidade de se ligar a um receptor ou ligando para um polipéptido. 67 "Um polipéptido tendo actividade biológica" refere-se a um polipéptido exibindo actividade semelhante, mas não necessariamente idêntica, a uma actividade da proteína Terapêutica da presente invenção, incluindo formas maduras, como medido num ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. No caso onde exista dependência de dose, esta não necessita de ser idêntica à do polipéptido mas, em vez disso, substancialmente semelhante à dependência de dose numa determinada actividade, em comparação com o polipéptido da presente invenção (i. e., o polipéptido candidato irá exibir maior actividade ou não mais de cerca de 25 vezes menos e, de um modo preferido, não mais de cerca de dez vezes menos actividade e, de um modo muito preferido, não mais de cerca de três vezes menos actividade, relativamente ao polipéptido da presente invenção) . A proteína de fusão de albumina da invenção tem actividade de GLP-1.
As proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser ensaiadas para actividade funcional (e. g., actividade biológica), utilizando ou modificando rotineiramente ensaios conhecidos na técnica, assim como ensaios aqui descritos. Além disso, um especialista na técnica pode ensaiar rotineiramente fragmentos da proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina, para actividade utilizando ensaios referenciados na sua correspondente fileira da Tabela 1 (e. g., na coluna 3 da Tabela 1). Além disso, um especialista na técnica pode rotineiramente ensaiar fragmentos de uma proteína de albumina correspondendo a uma porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão de albumina para actividade, utilizando 68 ensaios conhecidos na técnica e/ou como descrito na secção de Exemplos abaixo.
Por exemplo, onde se ensaie para a capacidade de uma proteína de fusão de albumina se ligar ou competir com a proteína Terapêutica para ligação a um anticorpo anti-polipéptido Terapêutico e/ou anticorpo anti-albumina, podem ser utilizados diversos imunoensaios conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos, utilizando técnicas, tais como radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), imunoensaios de "sanduíche", ensaios imunorradiométricos, reacções de precipitação de difusão de gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (utilizando ouro coloidal, marcadores de enzima ou radioisótopo, por exemplo), transferências de Western, reacções de precipitação, ensaios de aglutinação (e. g., ensaios de aglutinação de gel, ensaios de hemaglutinação) , ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A e ensaios de imunoelectroforese, etc. A ligação de anticorpo é detectada pela detecção de um marcador no anticorpo primário. 0 anticorpo primário é detectado pela detecção da ligação de um anticorpo ou reagente secundário ao anticorpo primário. 0 anticorpo secundário está marcado. São conhecidos na técnica muitos meios para a detecção da ligação num imunoensaio.
Onde um parceiro de ligação (e. g., um receptor ou um ligando) da proteína Terapêutica é identificado, a ligação a esse parceiro de ligação por uma proteína de fusão de albumina que compreende essa proteína Terapêutica como a porção de proteína Terapêutica da fusão pode ser ensaiada, e. g., por meios bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, 69 cromatografia de gel redutor e não redutor, cromatografia de afinidade de proteína e transferência de afinidade. Ver, de um modo geral, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). A capacidade de correlativos fisiológicos de uma proteína de fusão de albumina se ligarem a um substrato(s) do polipéptido Terapêutico correspondendo à porção de proteína Terapêutica da fusão pode ser rotineiramente ensaiada utilizando técnicas conhecidas na técnica.
Onde a capacidade de uma proteína de fusão de albumina se multimerizar esteja a ser avaliada, a associação com outros componentes do multímero pode ser ensaiada, e. g., por meios bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, cromatografia de gel redutor e não redutor, cromatografia de afinidade de proteína e transferência de afinidade. Ver, de um modo geral, Phizicky et al., supra.
Os ensaios para a capacidade de as proteínas de fusão de albumina se ligarem (Especificamente) a uma proteína ou epitopo específicos podem ser realizados em solução (e. g., Houghten, Bio/Techniques 13:412-421(1992)), em esferas (e. g., Lam, Nature 354:82-84 (1991)), em chips (e. g. , Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), em bactérias (e. g., patente U.S. N° 5223409), em esporos (e. g. , Patentes N° 5571698; 5403484; e 5223409), em plasmídeos (e. g., Cull et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA 89:1865-1869 (1992)) num fago (e. g., Scott e Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1990); e
Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)). 70 A afinidade de ligação de uma proteína de fusão de albumina a uma proteína, antigénio ou epitopo e a velocidade de dissociação de uma interacção de proteína de fusão de albumina-proteína/antigénio/epitopo pode ser determinada por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antigénio marcado (e. g., 3H ou 125I) com a proteína de fusão de albumina da invenção, na presença de quantidades crescentes de antigénio não marcado e a detecção do anticorpo ligado ao antigénio marcado. A afinidade da proteína de fusão de albumina para uma proteína, antigénio ou epitopo específicos e as velocidades de dissociação de ligação podem ser determinadas dos dados por análise de representação gráfica de Scatchard. A competição com uma segunda proteína que se liga à mesma proteína, antigénio ou epitopo que as proteínas de fusão de albumina, também pode ser determinada utilizando radioimunoensaios. Neste caso, a proteína, antigénio ou epitopo é incubado com uma proteína de fusão de albumina conjugada a um composto marcado (e. g. , 3H ou 125I), na presença de quantidades crescentes de uma segunda proteína não marcada que se liga à mesma proteína, antigénio ou epitopo que a proteína de fusão de albumina da invenção.
Numa forma de realização preferida, a análise cinética de BLAcore é utilizada para determinar as velocidades de ligação e dissociação de proteínas de fusão de albumina da invenção a uma proteína, antigénio ou epitopo. A análise cinética de BIAcore compreende a análise da ligação e dissociação de proteínas de fusão de albumina, ou polipéptidos, antigénios ou epitopos específicos de chips com polipéptidos, antigénios ou epitopos ou proteínas de fusão de albumina específicos imobilizados, respectivamente, na sua superfície. 71
Os anticorpos que se ligam à proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina também podem ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação para uma dada proteína ou antigénio, de um modo preferido, o antigénio a que se ligam especificamente. As afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10“2 M, 1CT2 M, 5 X 1CT3 Μ, 10“3 M, 5 X 10“4 M, 1CT4 M. As afinidades de ligação mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X ΙΟ-5 Μ, IO-5 M, 5 X IO-6 M, 1(T6M, 5 X ΙΟ-7 Μ, 107 M, 5 X IO-8 M ou 1(Γ8 M. As afinidades de ligação ainda mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 1CT9 Μ, 10“9 M, 5 X IO-10 M, 1(Γ10 M, 5 X 1CT11 Μ, IO-11 M, 5 X 1CT12 M, 10 5 X IO-13 M, 1(Γ13 M, 5 X ΙΟ-14 Μ, IO-14 M, 5 X IO-15 M ou 10 Além disso, os ensaios aqui descritos (ver os Exemplos
Tabela 1) e, de outro modo, conhecidos na técnica podem ser rotineiramente aplicados para medir a capacidade de as proteínas de fusão de albumina e seus fragmentos, variantes e derivados deduzirem actividade biológica e/ou actividade Terapêutica {in vitro ou in vivo) relacionada com a porção de proteína
Terapêutica e/ou porção de albumina da proteína de fusão de albumina. Outros métodos serão conhecidos do especialista na técnica e estão dentro do âmbito da invenção.
Albumina
Como descrito acima, uma proteína de fusão de albumina da invenção compreende, pelo menos, dois fragmentos ou variantes orientados em tandem da proteína Terapêutica e, pelo menos, variantes de fragmentos da proteína Terapêutica e, pelo menos, 72 um fragmento ou variante de albumina sérica humana, que estão associados entre si, de um modo preferido, por fusões genéticas.
Uma forma de realização adicional compreende, pelo menos, dois fragmentos ou variantes orientados em tandem de uma proteína Terapêutica e, pelo menos, um fragmento ou variante de albumina sérica humana, que estão ligados entre si por conjugação química.
Os termos albumina sérica humana (HSA) e albumina humana (HA) são aqui utilizados com o mesmo significado. Os termos "albumina e "albumina sérica" são latos e abrangem albumina sérica humana (e seus fragmentos e variantes), assim como albumina de outras espécies (e seus fragmentos e variantes).
Como aqui utilizado, "albumina" refere-se colectivamente a proteína ou sequência de aminoácidos de albumina, ou um fragmento ou variante de albumina, tendo uma ou mais actividades funcionais (e. g. , actividades biológicas) de albumina. Em particular, "albumina" refere-se a albumina humana ou seus fragmentos (ver, por exemplo, os documentos EP 201239, EP 322094 WO 97/14445, W095/23857), especialmente a forma madura de albumina humana, como mostrado na Figura 1 e SEQ ID N°: 1038, ou albumina de outros vertebrados ou seus fragmentos, ou análogos ou variantes destas moléculas ou seus fragmentos.
Em formas de realização preferidas, a proteína de albumina sérica humana utilizada nas proteínas de fusão de albumina da invenção contém um, ou ambos, dos seguintes conjuntos de mutações pontuais com referência a SEQ ID N°: 1038: Leu-407 até Ala, Leu-408 até Vai, Val-409 até Ala e Arg-410 até Ala; ou 73
Arg-410 até A, Lys-413 até Gin e Lys-414 até Gin (ver, e. g. , Publicação Internacional N° W095/23857).
Em formas de realização ainda mais preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção que contêm um, ou ambos, dos conjuntos descritos acima de mutações pontuais têm estabilidade/resistência melhorada à clivagem proteolítica de levedura Yap3p, permitindo produção aumentada de proteínas de fusão de albumina recombinantes expressas em células hospedeiras de levedura.
Como aqui utilizado, uma porção de albumina suficiente para prolongar a actividade terapêutica ou estabilidade em armazenamento da proteína Terapêutica refere-se a uma porção de albumina suficiente em comprimento ou estrutura para estabilizar ou prolongar a actividade terapêutica da proteína, de modo que a estabilidade em armazenamento da porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina seja prolongada ou alargada, comparativamente com a estabilidade em armazenamento no estado não fundido. A porção de albumina das proteínas de fusão de albumina pode compreender o tamanho total da sequência de HA, como descrito acima, ou pode incluir um ou mais seus fragmentos que sejam capazes da estabilização ou prolongamento da actividade terapêutica. Esses fragmentos podem ser de 10 ou mais aminoácidos em comprimento ou podem incluir cerca de 15, 20, 25, 30, 50 ou mais aminoácidos contíguos da sequência de HA ou podem incluir parte ou a totalidade de domínios específicos de HA. Por exemplo, podem ser utilizados um ou mais fragmentos de HA abarcando os primeiros dois domínios semelhantes a imunoglobulina. Numa forma de realização preferida, o fragmento de HA é a forma madura de HA. 74 A porção de albumina das proteínas de fusão de albumina da invenção pode ser um variante de HA normal. A porção de proteína Terapêutica das proteínas de fusão de albumina da invenção também pode ser variantes das proteínas Terapêuticas, como aqui descrito. 0 termo "variantes" inclui inserções, deleções e substituições, conservativas ou não conservativas, onde essas alterações não alterem substancialmente uma ou mais das propriedades oncóticas, de ligação de ligando e não imunogénicas úteis de albumina, ou o sítio activo, ou domínio activo que confere as actividades terapêuticas das proteínas Terapêuticas.
Em particular, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem incluir variantes polimórficos de ocorrência natural de albumina humana e fragmentos de albumina humana, por exemplo, os fragmentos divulgados no documento EP 322094 (nomeadamente HA (Pn) , onde n é 369 a 419) . A albumina pode ser derivada de qualquer vertebrado, especialmente qualquer mamífero, por exemplo humano, vaca, ovelha ou porco. As albuminas não mamíferas incluem, mas não estão limitadas a, galinha poedeira e salmão. A porção de albumina da proteína de fusão de albumina pode ser de um animal diferente do da porção de proteína Terapêutica.
De um modo geral, um fragmento ou variante de HA terá, pelo menos, 100 aminoácidos de comprimento, de um modo preferido, pelo menos, 150 aminoácidos de comprimento. 0 variante de HA pode consistir ou, alternativamente, compreender, pelo menos, um domínio completo de HA, por exemplo domínios 1 (aminoácidos 1-194 da SEQ ID N°: 1038), domínio 2 (aminoácidos 195-387 da SEQ ID N°: 1038), domínio 3 (aminoácidos 388-585 da SEQ ID N° : 1038), domínios 1 e 2 (1-387 da SEQ ID N° : 1038), domínios 2 e 3 (195-585 da SEQ ID N° : 1038) ou domínios 1 e 3 75 (aminoácidos 1-194 da SEQ ID N°: 1038 e aminoácidos 388-585 da SEQ ID N°: 1038). Cada domínio é, ele próprio, composto por dois subdomínios homólogos, nomeadamente 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 e 512-585, com regiões ligantes inter-subdomínio flexíveis compreendendo os resíduos Lysl06 até Glull9, Glu292 até Val315 e Glu492 até Ala511.
De um modo preferido, a porção de albumina de uma proteína de fusão de albumina da invenção compreende, pelo menos, um subdomínio ou domínio de HA ou suas modificações conservativas. Se a fusão for baseada em subdomínios, algum ou a totalidade do ligante adjacente é, de um modo preferido, utilizado para se ligar à fracção de proteína Terapêutica.
Demonstração de Actividade Terapêutica ou Profiláctica
Os compostos ou composições farmacêuticas da invenção são, de um modo preferido, testados in vitro e, depois, in vivo, para a desejada actividade terapêutica ou profiláctica, antes da utilização em humanos. Por exemplo, os ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica ou profiláctica de um composto ou composição farmacêutica incluem o efeito de um composto numa linha celular ou uma amostra de tecido de doente. O efeito do composto ou composição na linha celular e/ou amostra de tecido pode ser determinado utilizando técnicas conhecidas dos especialistas na técnica, incluindo, mas não limitadas a, ensaios de formação de roseta e ensaios de lise celular. Os ensaios in vitro que podem ser utilizados para determinar se a administração de um composto específico é indicada incluem ensaios de cultura celular in vitro, nos quais uma amostra de tecido de doente é cultivada em cultura e exposta ou, de outro 76 modo, administrado um composto e o efeito desse composto sobre a amostra de tecido é observado.
Administração e Composição Terapêutica/Profiláctica 0 composto ou composição farmacêutica da invenção pode ser utilizado para tratamento, inibição e profilaxia, pela administração de uma quantidade eficaz a um indivíduo. Numa forma de realização preferida, o composto é substancialmente purificado (e. g., substancialmente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos secundários indesejados). 0 indivíduo é, de um modo preferido, um animal, incluindo, mas não limitado a, animais, tais como vacas, porcos, cavalos, galinhas, gatos, cães, etc., e é, de um modo preferido, um mamífero e, de um modo muito preferido, humano.
As formulações e métodos de administração que podem ser empregues quando o composto compreende um ácido nucleico ou uma imunoglobulina são descritos acima; formulações e vias de administração apropriadas adicionais podem ser seleccionadas de entre aquelas aqui descritas abaixo. São conhecidos diversos sistemas de distribuição e podem ser utilizados para administrar um composto da invenção, e. g., encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressarem o composto, endocitose mediada por receptor (ver, e. g., Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um vector retroviral ou outro, etc. Os métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, 77 subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. Os compostos ou composições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injecção de bólus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos, (e. g., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntamente com outros agentes biologicamente activos. A administração pode ser sistémica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os compostos ou composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injecção intraventricular e intratecal; a injecção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, ligado a um
reservatório, tal como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser empregue, e. g., por utilização de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizante.
Pode ser desejável administrar os compostos ou composições farmacêuticos da invenção localmente na área a necessitar de tratamento; tal pode ser alcançado por, por exemplo, e não a titulo de limitação, infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, e. g., em conjunto com um penso após cirurgia, por injecção, por meio de um cateter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, o referido implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tal como membranas sialásticas, ou fibras. Quando se administra uma proteína, incluindo um anticorpo, deve ter-se cuidado ao utilizar materiais aos quais a proteína não se absorve. 0 composto ou composição pode ser distribuído numa vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy 78 of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler (ed.), Liss, Nova Iorque, p. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327; ver, de um modo geral, ibid.). 0 composto ou composição pode ser distribuído num sistema de libertação controlada. Pode ser utilizada uma bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Podem ser utilizados materiais poliméricos (ver Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (ed.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Bali (ed.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, J., MacromoL Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); ver também Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J.Neurosurg. 71:105 (1989)). Um sistema de libertação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, e. g., o cérebro requerendo, deste modo, apenas uma fraeção da dose sistémica (ver, e. g., Goodson, in Medicai Applications of Controlled Release, supra, vo. 2, p. 115-138 (1984)).
Outros sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
Onde os compostos da invenção sejam um ácido nucleico codificando uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão da sua proteína codificada, pela sua construção como parte de um vector de expressão de ácido nucleico apropriado e sua administração de modo a que se torne intracelular, e. g., por utilização de um vector retroviral (ver a patente U.S. N° 4980286), ou por injecção 79 directa, ou por utilização de bombardeamento de microparticulas (e. g., um canhão de genes; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lipidos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção, ou pela sua administração em ligação a um péptido semelhante a homeobox, que se sabe que entra no núcleo (ver, e. g., Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado no ADN da célula hospedeira para expressão por recombinação homóloga. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas. Essas composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou Estadual ou listado na Farmacopeia U.S. ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais e, mais particularmente, em humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é um veículo preferido, quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregues como veículos líquidos, particularmente para soluções injectáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, cré, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite 80 desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsionantes ou agentes de tamponização de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação prolongada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, tal como triglicéridos. A formulação oral pode incluir veículos padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarinato de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Os exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Essas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, de um modo preferido, na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo, de modo a proporcionar a forma para administração apropriada ao doente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração. A composição é formulada de acordo com processos de rotina, como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como a lignocaína, para aliviar a dor no local da injecção. Em geral, os ingredientes são proporcionados separadamente ou misturados entre si em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco, ou concentrado isento de água, num recipiente hermeticamente selado, tais como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de agente activo. Onde a composição seja 81 para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou soro fisiológico estéril de grau farmacêutico. Onde a composição for administrada por injecção, pode ser proporcionada uma ampola de água estéril para injecção ou soro fisiológico, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
Os compostos da invenção podem ser formulados como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com aniões, tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e os formados com catiões, tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaina, etc. A quantidade do composto da invenção que será eficaz no tratamento, inibição e prevenção de uma doença ou distúrbio associado a expressão e/ou actividade aberrante de uma proteína Terapêutica pode ser determinada por técnicas clínicas correntes. Além disso, podem ser opcionalmente empregues ensaios in vitro para auxiliar a identificar gamas de dosagem óptimas. A dose precisa a ser empregue na formulação também irá depender da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com o parecer do médico e das circunstâncias de cada doente. As doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou modelos animais. 82
Proteínas de fusão de albumina A presente invenção refere-se a proteínas de fusão de albumina, como definido acima e nas reivindicações, e à utilização das referidas proteínas de fusão de albumina para tratamento, prevenção ou melhoramento de doenças ou distúrbios. Como aqui utilizado, "proteína de fusão de albumina" refere-se a uma proteína formada da fusão de, pelo menos, uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) a, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem da proteína Terapêutica (aqui GLP-1) (ou seu fragmento ou variante), em que a referida proteína tem a actividade especificada nas reivindicações. Uma proteína de fusão de albumina da invenção compreende, pelo menos, dois fragmentos ou variantes orientados em tandem da proteína Terapêutica e, pelo menos, um fragmento ou variante da albumina sérica humana, que estão associados entre si, de um modo preferido, por fusão genética (i. e., a proteína de fusão de albumina é gerada por tradução de um ácido nucleico no qual um polinucleótido codificando a totalidade ou uma porção da proteína Terapêutica está ligado em fase com um polinucleótido codificando a totalidade ou uma porção de albumina) ou entre si. A proteína Terapêutica e proteína de albumina, uma vez parte da proteína de fusão de albumina, podem, cada, ser referidas como uma "porção", "região" ou "fracção" da proteína de fusão de albumina.
Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina codificada por um polinucleótido ou construção de fusão de albumina descrito na Tabela 1 ou Tabela 2. Os polinucleótidos codificando estas proteínas de fusão de albumina também estão abrangidos pela invenção. 83
As proteínas de fusão de albumina preferidas da invenção incluem proteínas de fusão de albumina codificadas por uma molécula de ácido nucleico compreendendo ou, alternativamente, consistindo num polinucleótido codificando, pelo menos, uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) ligada em fase a, pelo menos, um polinucleótido codificando, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem da proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante); uma molécula de ácido nucleico compreendendo ou, alternativamente, consistindo num polinucleótido codificando, pelo menos, uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) ligada em fase a, pelo menos, um polinucleótido codificando, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem da proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) gerada como descrito na Tabela 1, Tabela 2 ou nos Exemplos; ou uma molécula de ácido nucleico compreendendo ou, alternativamente, consistindo num polinucleótido codificando, pelo menos, uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) ligada em fase a, pelo menos, um polinucleótido codificando, pelo menos, duas moléculas orientadas em tandem da proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) compreendendo, ainda, por exemplo, um ou mais dos seguintes elementos: (1) um vector auto-replicável funcional (incluindo, mas não limitado a, um vector vaivém, um vector de expressão, um vector de integração e/ou um sistema de replicação), (2) uma região para iniciação de transcrição (e. g., uma região de promotor, tais como, por exemplo, um promotor regulável ou indutível, um promotor constitutivo), (3) uma região para terminação de transcrição, (4) uma sequência líder e (5) um marcador seleccionável.
Numa forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, 84 alternativamente, consistindo em, pelo menos, duas proteínas Terapêuticas orientadas em tandem (e. g., como descrito na Tabela 1) e uma proteína de albumina sérica. Noutras formas de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo em, pelo menos, dois fragmentos orientados em tandem, biologicamente activos e/ou terapeuticamente activos, da proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Noutras formas de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo em, pelo menos, dois variantes orientados em tandem, biologicamente activos e/ou terapeuticamente activos, da proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Em formas de realização preferidas, o componente de proteína de albumina sérica da proteína de fusão de albumina é a porção madura de albumina sérica.
Em formas de realização adicionais, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo em, pelo menos, duas proteínas Terapêuticas orientadas em tandem e um fragmento biologicamente activo e/ou terapeuticamente activo de albumina sérica. Em formas de realização adicionais, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo em, pelo menos, duas proteínas Terapêuticas orientadas em tandem e um variante biologicamente activo e/ou terapeuticamente activo de albumina sérica. Em formas de realização preferidas, a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina é a porção madura da proteína Terapêutica.
Em formas de realização adicionais, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, 85 alternativamente, consistindo em, pelo menos, dois fragmentos ou variantes, orientados em tandem, biologicamente activos e/ou terapeuticamente activos de uma proteína Terapêutica e um fragmento ou variante biologicamente activo e/ou terapeuticamente activo de albumina sérica. Em formas de realização preferidas, a invenção proporciona uma proteína de fusão de albumina compreendendo ou, alternativamente, consistindo na porção madura da proteína Terapêutica e a porção madura de albumina sérica.
De um modo preferido, a proteína de fusão de albumina compreende HA como a porção N-terminal e a proteína Terapêutica como a porção C-terminal. Alternativamente, também pode ser utilizada uma proteína de fusão de albumina compreendendo HA como a porção C-terminal e a proteína Terapêutica como a porção N-terminal.
Noutras formas de realização, a proteína de fusão de albumina tem a proteína Terapêutica fundida à terminação N e à terminação C de albumina. Numa forma de realização preferida, as proteínas Terapêuticas fundidas às terminações N e C são as mesmas proteínas Terapêuticas. Numa forma de realização preferida alternativa, as proteínas Terapêuticas fundidas às terminações N e C são proteínas Terapêuticas diferentes. Noutra forma de realização preferida, as proteínas Terapêuticas fundidas às terminações N e C são proteínas Terapêuticas diferentes gue podem ser utilizadas para tratar ou prevenir a mesma doença, distúrbio ou estado ou uma doença, distúrbio ou estado relacionado (e. g., como listado na coluna "Indicação Preferida Y" da Tabela 1). Noutra forma de realização preferida, as proteínas Terapêuticas fundidas às terminações N e C são proteínas Terapêuticas diferentes que podem ser utilizadas para 86 tratar, melhorar ou prevenir doenças ou distúrbios (e. g., como listado na coluna "Indicação Preferida Y" da Tabela 1) que são conhecidos na técnica como ocorrendo geralmente em doentes simultaneamente, concorrentemente ou consecutivamente, ou que ocorrem geralmente em doentes em associação entre si.
As proteínas de fusão de albumina da invenção abrangem proteínas contendo uma, duas, três, quatro ou mais moléculas da proteína X Terapêutica ou sua variante fundidas à terminação N ou C de uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou à terminação N e/ou C de albumina ou sua variante. As moléculas da proteína X Terapêutica ou suas variantes, estão presentes na proteína de fusão de albumina em orientação de tandem, incluindo uma orientação de "cabeça com cauda" (e. g., em que a terminação C de uma molécula da proteína X Terapêutica está fundida à terminação N de outra molécula da proteína X Terapêutica).
Numa forma de realização, dois, três ou mais polipéptidos de proteína X Terapêutica orientados em tandem (ou seus fragmentos ou variantes) estão fundidos à terminação N ou C de uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou à terminação N e/ou C de albumina ou sua variante.
Noutra forma de realização específica, duas, três, quatro, cinco ou mais moléculas de GLP-1 orientadas em tandem estão fundidas à terminação N ou C de albumina ou sua variante. Por exemplo, duas, três, quatro, cinco ou mais moléculas de GLP-1 orientadas em tandem (incluindo, mas não limitadas a, moléculas de GLP-1 compreendendo ou, alternativamente, consistindo nos aminoácidos 7 a 36, com o resíduo 8 sendo mutado de uma Alanina numa Glicina) (Ver, por exemplo, os mutantes divulgados na patente U.S. N° 5545618) estão fundidas à terminação N ou C de 87 albumina ou sua variante. As proteínas de fusão exemplificativas da invenção contendo múltiplas porções de proteína de GLP-1 incluem, mas não estão limitadas a, GL1-GLP1-HSA, HSA-GLP1-GLP1, GLPlmutante-GLPlmutante-HSA, HSA-GLPlmutante-GLPlmutante, GLPlmutante-GLPl-HSA, HSA-GLPlmutante-GLPl, GLPl-GLPlmutante-HSA ou HSA-GLPl-GLPlmutante. São formas de realização particularmente preferidas as fusões em tandem de GLP-1, tais como a construção ID N° 3070 e a proteína codificada por essa construção.
As proteínas de fusão de albumina da invenção abrangem, ainda, proteínas contendo duas, três, quatro ou mais moléculas das proteínas X Terapêuticas dadas ou suas variantes fundidas à terminação N ou C de uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou à terminação N e/ou C de albumina ou sua variante, em que as moléculas estão ligadas através de ligantes peptídicos. Exemplos incluem os ligantes peptídicos descritos na Pat. U.S. N° 5073627. As proteínas de fusão de albumina, compreendendo múltiplos polipéptidos de proteína X Terapêutica separados por ligantes peptídicos, podem ser produzidas utilizando tecnologia convencional de ADN recombinante. Os ligantes são particularmente importantes quando se funde um pequeno péptido à grande molécula de HSA. O próprio péptido pode ser um ligante pela fusão de cópias em tandem do péptido (ver, por exemplo, GLP-1) ou podem ser utilizados outros ligantes conhecidos. As construções que incorporam ligantes são descritas na Tabela 2 ou são evidentes quando se examina a SEQ ID N°: Y.
Além disso, as proteínas de fusão de albumina da invenção também podem ser produzidas pela fusão da proteína X Terapêutica ou suas variantes a N-terminal e/ou C-terminal de albumina ou suas variantes, num modo que permita a formação de formas multiméricas intramoleculares e/ou intermoleculares. Numa forma de realização da invenção, as proteínas de fusão de albumina podem estar nas formas monoméricas ou multiméricas (i. e., dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros superiores). Numa forma de realização adicional da invenção, a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina pode estar na forma monomérica ou forma multimérica (i. e., dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros superiores) . Numa forma de realização específica, a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina está na forma multimérica (i. e., dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros superiores) e a porção de proteína de albumina está na forma monomérica.
Além das proteínas de fusão de albumina, nas quais a porção de albumina está fundida N-terminal e/ou C-terminal da porção de proteína Terapêutica, as proteínas de fusão de albumina da invenção também podem ser produzidas pela inserção da proteína Terapêutica ou péptido de interesse (e. g., uma proteína X Terapêutica, como divulgado na Tabela 1) numa região interna de HA. Por exemplo, na sequência de proteína da molécula de HA, existe um número de ganchos ou dobras entre o fim e o começo de hélices α que estão estabilizadas por ligações dissulfureto. Os ganchos, como determinado a partir da estrutura cristalina de HA (identificadores de PDB 1A06, 1BJ5, 1BKE, 1BM0, 1E7E até 1E7I e 1U0R), estendem-se, na sua maior parte, para longe do corpo da molécula. Estes ganchos são úteis para a inserção, ou fusão interna, de péptidos terapeuticamente activos, particularmente aqueles requerendo que uma estrutura secundária seja funcional, ou proteínas Terapêuticas, para gerar essencialmente uma molécula de albumina com actividade biológica específica. 89
Os ganchos na estrutura de albumina humana dentro dos quais os péptidos ou polipéptidos podem ser inseridos para gerar proteínas de fusão de albumina da invenção incluem: Val54-Asn61, Thr76-Asp89, Ala92-Glul00, Glnl70-Alal76, His 247 - Glu252, Glu 266 - Glu2 7 7, Glu 280-His288, Ala362-Glu368, Lys439-Pro447, Val462-Lys475, Thr478-Pro486 e Lys560-Thr566. Em formas de realização mais preferidas, os péptidos ou polipéptidos estão inseridos nos ganchos Val54-Asn61, Glnl70-Alal76 e/ou Lys560-Thr566 de albumina humana madura (SEQ ID N°: 1038) .
Os péptidos a serem inseridos podem ser derivados de bibliotecas de apresentação fágica ou péptido sintético, rastreadas para actividade biológica especifica, ou das porções activas de uma molécula com a função desejada. Além disso, as bibliotecas peptídicas aleatórias podem ser geradas dentro de ganchos particulares ou por inserções de péptidos aleatorizados dentro de ganchos particulares da molécula de HA e em que todas as combinações possíveis de aminoácidos estão representadas.
Essa(s) biblioteca(s) poderia(m) ser gerada(s) em HA ou fragmentos de domínio de HA por um dos seguintes métodos: mutação aleatorizada de aminoácidos dentro de um ou mais ganchos peptídicos de HA ou fragmentos de domínio de HA. Um, mais ou a totalidade dos resíduos dentro de um gancho poderiam ser mutados deste modo; substituição ou inserção num ou mais ganchos de HA ou fragmentos de domínio de HA (i. e., fusão interna) de (um) péptido(s) aleatorizado (s) de comprimento Xn (onde X é um aminoácido e n é o número de resíduos; 90 fusões de péptido/proteína N-, C- ou N- e C-terminais além de (a) e/ou (b) . A HA ou fragmento de domínio de HA também pode ser tornada multifuncional, pelo enxerto dos péptidos derivados de diferentes rastreios de diferentes ganchos contra diferentes alvos na mesma HA ou fragmento de domínio de HA.
Em formas de realização preferidas, os péptidos inseridos num gancho de albumina sérica humana são fragmentos peptídicos ou variantes peptídicos das proteínas Terapêuticas divulgadas na Tabela 1. De um modo mais particular, a invenção abrange proteínas de fusão de albumina que compreendem fragmentos peptídicos ou variantes peptídicos de, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 ou, pelo menos, 40 aminoácidos em comprimento inseridos num gancho de albumina sérica humana. A invenção também abrange proteínas de fusão de albumina que compreendem fragmentos peptídicos ou variantes peptídicos de, pelo menos 7, pelo menos 8 , pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 ou , pelo menos , 40 aminoácidos fundidos à terminação N de albumina sérica humana. A invenção também abrange proteínas de fusão de albumina que compreendem fragmentos peptídicos ou variantes peptídicos de, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos LO i—1 pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35 ou, pelo menos, 40 aminoácidos fundidos à terminação C de albumina sérica humana. Por exemplo, os péptidos curtos descritos na Tabela 1 e 91 2 (e. g., Terapêutico Y) podem ser inseridos nos ganchos de albumina.
Em geral, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ter uma região derivada de HA e uma região derivada de proteina Terapêutica. Contudo, podem ser utilizadas múltiplas regiões de cada proteina para preparar uma proteina de fusão de albumina da invenção. De modo semelhante, mais de uma proteina Terapêutica pode ser utilizada para preparar uma proteina de fusão de albumina da invenção. Por exemplo, a proteina
Terapêutica pode estar fundida às extremidades N- e C-terminais da HA. Nessa configuração, as porções de proteina Terapêutica podem ser as mesmas moléculas de proteina Terapêutica ou moléculas de proteína Terapêutica diferentes. A estrutura das proteínas de fusão de albumina bifuncionais pode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.
As proteínas de fusão de albumina bifuncionais ou multifuncionais também podem ser preparadas para direccionar a porção de proteína Terapêutica de uma fusão para um órgão alvo ou tipo de célula, por meio de proteína ou péptido no terminal oposta de HA.
Como uma alternativa à fusão de moléculas terapêuticas conhecidas, os péptidos poderiam ser obtidos pelo rastreio de bibliotecas construídas como fusões às terminações N, C ou N e C de HA, ou fragmento de domínio de HA, de tipicamente 6, 8, 12, 20 ou 25 ou Xn (onde X é um aminoácido (aa) e n é igual ao número de resíduos) aminoácidos aleatorizados e nos quais todas as combinações possíveis de aminoácidos foram representadas. Uma vantagem particular desta abordagem é que os péptidos podem ser seleccionados in situ na molécula HA e as propriedades do 92 péptido seriam, por conseguinte, como seleccionadas, em vez de potencialmente modificadas, como poderia ser o caso para um péptido derivado por qualquer outro método sendo, depois, conjugado a HA.
Além disso, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem incluir um péptido ligante entre as porções fundidas para proporcionar maior separação física entre as fracções e, deste modo, maximizar a acessibilidade da porção de proteína Terapêutica, por exemplo, para ligação ao seu receptor correlacionado. 0 péptido ligante pode consistir em aminoácidos, de modo a que seja flexível ou mais rígido. A sequência ligante pode ser clivável por uma protease ou quimicamente para produzir a fracção relacionada com a hormona do crescimento. De um modo preferido, a protease é aquela que é produzida naturalmente pelo hospedeiro, por exemplo a kex2 de S. cerevisiae protease ou proteases equivalentes.
Por conseguinte, como descrito acima, as proteínas de fusão de albumina podem ter a seguinte fórmula R1-L-R2; R2-L-R1; ou R1-L-R2-L-R1, em que RI é, pelo menos, uma proteína Terapêutica, sequência peptídica ou polipeptídica e não necessariamente a mesma proteína Terapêutica, L é um ligante e R2 é uma sequência de albumina sérica.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção compreendendo a proteína Terapêutica têm estabilidade em armazenamento alargada, comparativamente com a estabilidade em armazenamento da mesma proteína Terapêutica quando não fundida a albumina. A estabilidade em armazenamento tipicamente refere-se ao período de tempo ao longo do qual a 93 actividade terapêutica da proteína Terapêutica em solução, ou em alguma outra formulação de armazenamento, é estável sem perda indevida de actividade terapêutica. Muitas das proteínas Terapêuticas são altamente lábeis no seu estado não fundido. Como descrito abaixo, a estabilidade em armazenamento típica destas proteínas Terapêuticas é marcadamente prolongada após incorporação na proteína de fusão de albumina da invenção.
As proteínas de fusão de albumina da invenção com estabilidade em armazenamento "prolongada" ou "alargada" exibem maior actividade terapêutica relativamente a um padrão que tenha sido submetido às mesmas condições de armazenamento e manipulação. 0 padrão pode ser a proteína Terapêutica de tamanho total não fundida. Quando a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina é um análogo, um variante ou é, de outro modo, alterada ou não inclui a sequência completa para essa proteína, o prolongamento da actividade terapêutica pode, alternativamente, ser comparado com o equivalente não fundido desse análogo, variante, péptido alterado ou sequência incompleta. Como um exemplo, uma proteína de fusão de albumina da invenção pode reter mais de cerca de 100% da actividade terapêutica, ou mais de cerca de 105%, 110%, 120%, 130%, 150% ou 200% da actividade terapêutica de um padrão, quando submetida às mesmas condições de armazenamento e manipulação que o padrão, quando comparado a um determinado intervalo de tempo. A estabilidade em armazenamento também pode ser avaliada em termos de actividade terapêutica permanecendo após armazenamento, normalizada para actividade terapêutica, quando começou o armazenamento. As proteínas de fusão de albumina da invenção com estabilidade em armazenamento prolongada ou alargada, como exibida por actividade terapêutica prolongada ou 94 alargada, podem reter mais de cerca de 50% da actividade terapêutica, cerca de 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais da actividade terapêutica da proteína Terapêutica não fundida equivalente, quando submetida às mesmas condições. Por exemplo, como discutido no Exemplo 38, uma proteína de fusão de albumina da invenção compreendendo hGH fundida à sequência de HA de tamanho total pode reter cerca de 80% ou mais da sua actividade original em solução, durante períodos de até 5 semanas ou mais, sob diversas condições de temperatura.
Expressão de Proteínas de Fusão
As proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser produzidas como moléculas recombinantes por secreção a partir de levedura, um microrganismo, tal como uma bactéria ou uma linha celular humana ou animal. De um modo preferido, o polipéptido é segregado das células hospedeiras.
Uma forma de realização particular da invenção compreende uma construção de ADN codificando uma sequência sinal eficaz para dirigir a secreção em levedura, particularmente uma sequência sinal derivada de levedura (especialmente uma que seja homóloga à do hospedeiro de levedura) e a molécula fundida do primeiro aspecto da invenção, não sendo a pro sequência derivada de levedura entre o sinal e o polipéptido maduro. O sinal de invertase de Saccharomyces cerevisiae é um exemplo preferido, de uma sequência sinal derivada de levedura.
Os conjugados do tipo preparado por Poznansky et al., (FEBS Lett. 239 : 18 (1988)), nos quais polipéptidos preparados 95 separadamente estão ligados por reticulação química, não estão contemplados. A presente divulgação também includi uma célula, de um modo preferido, uma célula de levedura, transformada para expressar uma proteína de fusão de albumina da invenção. Além das próprias células hospedeiras transformadas, também é divulgada uma cultura dessas células, de um modo preferido, uma cultura monoclonal (clonalmente homogénea) ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, num meio nutriente. Se o polipéptido for segregado, o meio conterá o polipéptido, com as células, ou sem as células se tiverem sido removidas por filtração ou centrifugação. Muitos sistemas de expressão são conhecidos e podem ser utilizados, incluindo bactérias (por exemplo, E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris, fungos filamentosos (por exemplo Aspergillus), células vegetais, células animais e células de insecto.
As estirpes de levedura preferidas a serem utilizadas na produção de proteínas de fusão de albumina são D88, DXY1 e BXP10. A D88 [leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4] é um derivado da estirpe parental AH22his+ (também conhecida como DB1; ver, e. g. , Sleep et ai. Biotechnology 8:42-46 (1990)). A estirpe contém uma mutação de leu2 que permite a selecção auxotrópica de 2 plasmídeos baseados em micron que contêm o gene LEU2. A D88 também exibe uma desrepressão de PRB1 em excesso de glucose. O promotor de PRB1 é normalmente controlado por dois pontos de controlo que monitorizam os níveis de glucose e estádio de crescimento. 0 promotor é activado na levedura de tipo selvagem após depleção de glucose e entrada na fase estacionária. A estirpe D88 exibe a repressão por glucose mas mantém a indução 96 após entrada na fase estacionária. 0 gene de PRA1 codifica uma protease vacuolar de levedura, YscA endoprotease A, que está localizada no ER. 0 gene de ABC4 está na via de ubiquitinação e está envolvido no alvejamento de proteínas de vida curta e anormais para degradação dependente de ubiquitina. Verificou-se que o isolamento desta mutação de ubc4 aumenta o número de cópia de um plasmídeo de expressão na célula e causa um nível aumentado de expressão de uma proteína desejada expressa a partir do plasmídeo (ver, e. g., a Publicação Internacional N° W099/00504). DXY1, um derivado de D88, tem o seguinte genótipo: [leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4, ura3::yap3]. Além das mutações isoladas em D88, esta estirpe também tem um nocaute da protease de YAP3. Esta protease causa a clivagem da maioria dos resíduos dibásicos (RR, RK, KR, KK) mas também pode promover a clivagem em resíduos únicos básicos em proteínas. 0 isolamento desta mutação de yap3 resultou em níveis superiores de produção de HSA de tamanho total (ver, e. g., a Patente U.S. N° 5965386 e Kerry-Williams et al., Yeast 14:1661-169 (1998)). A BXP10 tem o seguinte genótipo: leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp!50::LYS2, pmtl::URA3. Além das mutações isoladas em DXY1, esta estirpe também tem um nocaute do gene de PMT1 e do gene de HSP150. 0 gene de PMT1 é um membro da família evolutivamente conservada das doliquil-fosfato-manose proteína O-manosiltransferases (Pmts). A topologia transmembranar de Pmtlp sugere que é uma proteína membranar integral do retículo endoplasmático, com um papel na glicosilação ligada a 0. Esta mutação serve para reduzir/eliminar a glicosilação ligada a 0 das fusões de HSA (ver, e. g., a Publicação Internacional N° WOOO/44772). 97
Estudos revelaram que a proteína Hspl50 é ineficientemente separada de rHA por cromatografia de permuta iónica. A mutação no gene de HSP150 remove um potencial contaminante que se revelou difícil de remover por técnicas de purificação correntes. Ver, e. g. , a Patente U.S. N° 5783423. A proteína desejada é produzida em modos convencionais, por exemplo, a partir de uma sequência codificante inserida no cromossoma do hospedeiro ou num plasmídeo livre. As leveduras são transformadas com uma sequência codificante para a proteína desejada em qualquer dos modos habituais, por exemplo electroporação. Os métodos para a transformação de levedura por electroporação são divulgados em Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.
As células transformadas com sucesso, i. e., as células que contêm uma construção de ADN da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as células resultando da introdução de uma construção de expressão podem ser cultivadas para produzir o polipéptido desejado. As células podem ser recolhidas e lisadas e o seu conteúdo de ADN examinado para a presença do ADN utilizando um método, tal como o descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 ou Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Alternativamente, a presença da proteína no sobrenadante pode ser detectada utilizando anticorpos.
Os vectores plasmídicos de levedura úteis incluem pRS403-406 e pro413-416 e estão, em geral, disponíveis de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Os plasmídeos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídeos de Integração em Levedura (YIp) e incorporam os marcadores 98 seleccionáveis de levedura HIS3, 7RP1, LEU2 e URA3. Os plasmídeos pRS413-416 são plasmídeos de Centrómero de Levedura (Ycp).
Os vectores preferidos para preparação de proteínas de fusão de albumina para expressão em levedura incluem pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA e pC4:HSA que são descritos em detalhe no
Exemplo 1. A Figura 2 mostra um mapa do plasmídeo pPPC0005 que pode ser utilizado como o vector base dentro do qual os polinucleótidos codificando as proteínas Terapêutica podem ser clonados para formar fusões de HA. Contém um promotor de S. cerevisiae PRB1 (PRBlp), uma sequência líder de Fusão (FL) , ADN codificando HA (rHA) e uma sequência terminadora de S. cerevisiae ADH1. A sequência da sequência líder de fusão consiste nos primeiros 19 aminoácidos do péptido sinal da albumina sérica humana (SEQ ID N°: 1094) e nos últimos cinco aminoácidos do promotor alfa 1 do factor de cruzamento (SLDKR, ver o documento EP-A-397319).
Os plasmídeos pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA e pC4:HSA foram depositados a 11 de Abril de 2001 na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 e dados os números de acesso ATCC PTA-3278, PTA-3276, PTA-3279 e PTA-3277, respectivamente. Outro vector útil para a expressão de uma proteína de fusão de albumina na levedura é o vector pSAC35, que é descrito em Sleep et al., BioTechnology 8:42 (1990) .
Outro promotor de levedura que pode ser utilizado para expressar a proteína de fusão de albumina é o promotor de MET25.
Ver, por exemplo, Dominik Mumburg, Rolf Muller e Martin Funk. Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, N° 25, p. 5767-5768 . O 99 promotor de Met25 tem 383 bases de comprimento (bases -382 a -1) e os genes expressos por este promotor também são conhecidos como Metl5, Meti7 e YLR303W. Uma forma de realização preferida utiliza a sequência abaixo onde, na extremidade 5' da sequência abaixo, o sitio Not 1 utilizado na clonagem está sublinhado e, na extremidade 3', o codão de iniciação ATG está sublinhado: GCGGCCGCCGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTAl TTTTTGC ΠΤΓΤ CTCTTGAGGTCACATGATCGCAAAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATT GGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAGGCGCCATCCTC ATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCA ATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTC TGTTAGAAAGGAAGTTTTTCC Π'Γ I ILTIGCTCTCTTGTCITITCATCTACTATTTC CTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCC ATACAATG (SEQ ID N2: 2138)
Foi desenvolvida uma variedade de métodos para ligar, de um modo operativo, ADN a vectores, por meio de terminações coesivas complementares. Por exemplo, aparelhos de homopolímero complementares podem ser adicionados ao segmento de ADN a ser inserido no ADN de vector. 0 vector e segmento de ADN são, depois, ligados por ligação de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas complementares, para formar moléculas de ADN recombinante.
Os ligantes sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição proporcionam um método alternativo de ligação do segmento de ADN a vectores. 0 segmento de ADN, gerado por digestão de restrição de endonuclease, é tratado com T4 ADN polimerase de bacteriófago ou ADN polimerase I de E. coli, enzimas que removem terminações protuberantes, de cadeia simples gama, com as suas actividades exonucleolíticas 3' 5' e 100 preenchem, com as suas actividades polimerizantes, as extremidades 3' com recessos. A combinação destas actividades gera, por conseguinte, segmentos de ADN de extremidades rombas. Os segmentos de extremidades rombas são, depois, incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes, na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de ADN de extremidades rombas, tal como T4 ADN ligase de bacterióf ago. Deste modo, os produtos da reacção são segmentos de ADN transportando sequências ligantes poliméricas nas suas extremidades. Estes segmentos de ADN são, depois, clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vector de expressão que foi clivado com uma enzima que produz terminações compatíveis com as do segmento de ADN.
Os ligantes sintéticos contendo uma variedade de sítios de endonuclease de restrição estão comercialmente disponíveis de um número de fontes, incluindo International Biotechnologies Inc, New Haven, CT, EUA.
Um modo desejável de modificar o ADN de acordo com a invenção, se, por exemplo, os variantes de HA devam ser preparados, é utilizar a reacção em cadeia da polimerase, como divulgado por Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. Neste método, o ADN a ser amplificado enzimaticamente é flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos específicos que se tornam, eles próprios, incorporados no ADN amplificado. Os iniciadores específicos podem conter sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que podem ser utilizados para clonagem em vectores de expressão, utilizando métodos conhecidos na técnica. 101
Os géneros exemplificativos de levedura contemplados como sendo úteis na prática da presente invenção como hospedeiros para expressão das proteínas de fusão de albumina são Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis e semelhantes. Os géneros preferidos são aqueles seleccionados do grupo consistindo em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia e Torulaspora. Os exemplos de Saccharomyces spp. são S. cerevisiae, S. italicus e S. rouxii.
Os exemplos de Kluyveromyces spp. são K. fragilis, K. lactis e K. marxianus. Uma espécie de Torulaspora adequada é T. delbrueckii. Os exemplos de Pichia (Hansenula) spp. são P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anómala (anteriormente H. anómala) e P. pastoris. Os métodos para a transformação de S. cerevisiae são ensinados, em geral, nos documentos EP 251744, EP 258067 e WO 90/01063, todos eles são aqui incorporados por referência.
As espécies exemplificativas preferidas de Saccharomyces incluem S. cerevisiae, S. italicus, S. diastaticus e Zygosaccharomyces rouxii. As espécies exemplificativas preferidas de Kluyveromyces incluem K. fragilis e K. lactis. As espécies exemplificativas preferidas de Hansenula incluem H. polymorpha (agora Pichia angusta), H. anómala (agora Pichia anómala) e Pichia capsulata. As espécies exemplificativas preferidas adicionais de Pichia incluem P. pastoris. As espécies exemplificativas preferidas de Aspergillus incluem A. niger e A. nidulans. As espécies exemplificativas preferidas de Yarrowia incluem Y. lipolítica. Muitas espécies de levedura preferidas 102 estão disponíveis da ATCC. Por exemplo, as seguintes espécies de levedura preferidas estão disponíveis da ATCC e são úteis na expressão de proteínas de fusão de albumina: Saccharomyces cerevisiae Hansen, estirpe teleomorfa BY4743 yap3 mutante (Acesso ATCC N° 4022731); Saccharomyces cerevisiae Hansen, estirpe teleomorfa BY4743 hsp!50 mutante (Acesso ATCC N° 4021266); Saccharomyces cerevisiae Hansen, estirpe teleomorfa BY4743 pmtl mutante (Acesso ATCC N° 4023792); Saccharomyces cerevisiae Hansen, teleomorfa (Acessos ATCC N° 20626; 44773; 44774; e 62995); Saccharomyces diastaticus Andrews et Gilliland ex van der Walt, teleomorfa (Acesso ATCC N° 62987); Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorfa (Acesso ATCC N° 76492); Pichia angusta (Teunisson et al.) Kurtzman, teleomorfa depositada como Hansenula polymorpha de Morais et Maia, teleomorfa (Acesso ATCC N° 26012); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (Acesso ATCC N° 9029); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (Acesso ATCC N° 16404); Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, anamorfa (Acesso ATCC N° 48756); e Yarrowia lipolytica (Wickerham et al.) van der Walt et von Arx, teleomorfa (Acesso ATCC N° 201847).
Os promotores adequados para S. cerevisiae incluem aqueles associados ao gene de PGKI, genes de GAL1 ou GAL10, CYCI, PHOS, TRPI, ADHI, ADH2, os genes para gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, triose fosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, glucocinase, feromona de factor de cruzamento alfa, [uma feromona do factor de cruzamento], o promotor de PRBI, o promotor de GUT2, o promotor de GPDI e promotores híbridos envolvendo híbridos de partes de regiões regulatórias 5' com partes de regiões regulatórias 5' de outros promotores ou com 103 sítios de activação a montante (e. g., o promotor do documento EP-A-258 06 7) .
Os promotores reguláveis convenientes para utilização em Schizosaccharomyces pombe são o promotor reprimível de tiamina do gene nmt, como descrito por Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 e o promotor do gene jbpl reprimível de glucose, como descrito por Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.
Os métodos de transformação de Pichia para expressão de genes estranhos são ensinados, por exemplo, em Cregg et ai. (1993) e diversas patentes de Phillips (e. g., documento US 4857467) e os kits de expressão de Pichia estão comercialmente disponíveis da Invitrogen BV, Leek, Países Baixos e Invitrogen Corp, San Diego, Califórnia. Os promotores adequados incluem AOXI e AOX2. Gleeson et ai. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 incluem informação sobre vectores e transformação de Hansenula, sendo promotores adequados MOX1 e FMD1; enquanto o documento EP 361991, Fleer et al. (1991) e outras publicações da Rhone-Poulenc Rorer ensinam como expressar proteínas estranhas em Kluyveromyces spp., um promotor adequado sendo PGKI. O sinal de terminação de transcrição é, de um modo preferido, a sequência flanqueante 3' de um gene eucariótico que contém sinais apropriados para terminação de transcrição e poliadenilação. As sequências flanqueantes 3' adequadas podem ser, por exemplo, as do gene naturalmente ligado às sequências de controlo de expressão utilizadas, i. e., podem corresponder ao promotor. Alternativamente, podem ser diferentes, caso em que 104 o sinal de terminação do gene de ADHI de S. cerevisiae é preferido. A proteína de fusão de albumina desejada pode ser inicialmente expressa com uma sequência líder de secreção, que pode ser qualquer líder eficaz na levedura escolhida. Os líderes úteis na levedura incluem qualquer dos seguintes: a) a sequência sinal de MPIF-1 (e. g., aminoácidos 1-21 do Acesso GenBank número AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (SEQ ID N°: 2132) b) a sequência sinal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID N°: 1054) c) a região pre-pro da sequência sinal de HSA (e. g-, MKWVTFISLLFLF S SAYSRGVFRR, SEQ ID N°: 1176) d) a região pre da sequência sinal de HSA (e. g, MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEQ ID N°: 1171) ou suas variantes, tal como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID N°: 1168) e) a sequência sinal de invertase (e. g., MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID N°: 1108) f) a sequência sinal alfa do factor de cruzamento de levedura (e. g., MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTTTIASIAAKEEGVSLEKR, SEQ ID N°: 1109 ou MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTUASIAAKEEGVSLDKR, SEQ ID N°: 1109) g) sequência líder da toxina assassina de K. lactis h) uma sequência sinal híbrida (e. g., MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEQ ID N°: 1110) i) uma sequência sinal híbrida de HSA/MFa-1 (também conhecida como HSA/kex2) (e. g. , MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEQ ID N°: 1111) 105 j) uma sequência líder da fusão de assassina/MFa-1 de K. lactis (e. g., MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID N°: 1169) k) a sequência sinal da Imunoglobulina Ig (e. g., MGWSCIILFLVATATGVHS, SEQ ID N°: 1095) l) a sequência sinal do precursor de Fibulina B (e. g., MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID N°: 1096) m) a sequência sinal do precursor de clusterina (e. g., MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID N°: 1097) n) a sequência sinal da proteína 4 de ligação do factor de crescimento semelhante a insulina (e. g., MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID N°: 1098) o) variantes da região pre-pro da sequência sinal de HSA, tais como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEQ ID N°: 1167), MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEQ ID N°: 1099), MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ ID N°: 1100), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEQ ID N°: 1101), Líder de HSA modificada HSA N° 64 MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID N°: 2133); Líder de HSA modificada HSA N° 66 MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID N°: 2134); Líder de HSA modificada (A14) -MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID N°: 1102); Líder de HSA modificada (S14) (também conhecido como HSA N° 65 modificado) - MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEQ ID N°: 1103), Líder de HSA modificada (G14) - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID N°: 1104), ou MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEQ ID N°: 1105) p) uma sequência sinal consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID N°: 1055) 106 q) líder de fosfatase ácida (PH05) (e. g., MFKSVVYSILAASLANA SEQ ID N°: 2135) r) a sequência pre de MFoz-1 s) a sequência pre de 0 glucanase (BGL2) t) líder da toxina assassina u) a presequência da toxina assassina v) prepro da toxina assassina de k. lactis (29 aminoácidos; 16 aminoácidos de pre e 13 aminoácidos de pro) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEQ ID N°: 2136) w) sequência líder de secreção de glucoamilase D de S. diastaticus x) sequência líder de secreção de galactosidase α de S. carlsbergensis (MEL1) y) sequência líder de glucoamilase de Candida z) Os líderes híbridos divulgados no documento EP-A-387319 (aqui incorporado por referência) aa) a sequência sinal de gp67 (em conjunto com sistemas de expressão baculovirais) (e. g., aminoácidos 1-19 do Acesso
GenBank Número AAA72759) ou bb) o líder natural da proteína X Terapêutica; cc) líder de invertase de S. cerevisiae (SUC2), como divulgado no documento JP 62-096086 (concedido como 911036516, aqui incorporado por referência); ou dd) Inulinase - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEQ ID N°: 2137). ee) Um variante do líder de propéptido TA57 modificado N° 1 MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTN SGGLDVVGLISMAKR (SEQ ID N°: 2128) ff) Um variante do líder de propéptido TA57 modificado N° 2 MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTISVNLMADDTESAFATQTN SGGLDVVGLISMAEEGEPKR (SEQ ID N°: 2129). 107 Métodos Adicionais de Produção Recombinante e Sintética de Proteínas de Fusão de Albumina A presente divulgação também se refere a vectores contendo um polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, células hospedeiras e a produção de proteínas de fusão de albumina por técnicas sintéticas e recombinantes. 0 vector pode ser, por exemplo, um fago, plasmídeo, virai ou vector retroviral. Os vectores retrovirais podem ser de replicação competente ou de replicação defeituosa. No último caso, a propagação virai irá ocorrer, em geral, apenas em células hospedeiras de complementação.
Os polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser ligados a um vector contendo um marcador seleccionável para propagação num hospedeiro. Em geral, um vector plasmídico é introduzido num precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio ou num complexo com um lípido carregado. Se o vector for um vírus, pode ser empacotado in vitro utilizando uma linha celular de empacotamento apropriada e, depois, transduzido em células hospedeiras. 0 inserto polinucleótídico deve estar operativamente ligado a um promotor apropriado, tal como o promotor PL do fago lambda, os promotores de lac, trp, phoA e tac de E. coli, os promotores precoce e tardio de SV40 e promotores de LTR retrovirais, para nomear alguns. Outros promotores adequados serão conhecidos do especialista na técnica. As construções de expressão conterão, ainda, sítios para iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação de ribossoma para tradução. A porção codificante dos transcritos expressos pelas construções irá incluir, de um modo preferido, um codão de 108 iniciação de tradução no inicio e um codão de terminação (UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado na extremidade do polipéptido a ser traduzido.
Como indicado, os vectores de expressão irão, de um modo preferido, incluir, pelo menos, um marcador seleccionável. Esses marcadores incluem resistência a di-hidrofolato redutase, G418, glutamina sintase ou neomicina, para cultura celular eucariótica e genes de resistência a tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultivo em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem, mas não estão limitados a, células bacterianas, tais como células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células fúngicas, tal como células de levedura (e. g., Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris (Acesso ATCC N° 201178)); células de insecto, tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais, tais como CHO, COS, NSO, 293 e células de melanoma de Bowes; e células vegetais. São conhecidos na técnica meios de cultura e condições apropriados para as células hospedeiras acima descritas.
Dos vectores preferidos para utilização em bactérias incluem-se pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis da QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNHlôa, pNH18A, pNH46A, disponíveis da Stratagene Cloning Systems, Inc.; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis da Pharmacia Biotech, Inc. De entre os vectores eucarióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG, disponíveis da Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL, disponíveis da Pharmacia. Os vectores de expressão preferidos para utilização em sistemas de levedura incluem, mas não estão limitados a, pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, 109 pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-Sl, pPIC3.5K, pPIC9K e PA0815 (todos disponíveis da Invitrogen, Carlbad, CA) . Outros vectores adequados serão facilmente perceptíveis ao especialista na técnica.
Numa forma de realização, os polinucleótidos codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção podem estar fundidos a sequências sinal que irão dirigir a localização de uma proteína da invenção para compartimentos particulares de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou dirigir a secreção de uma proteína da invenção de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. coli, pode desejar-se dirigir a expressão da proteína para o espaço periplasmático. Os exemplos de sequências sinal ou proteínas (ou seus fragmentos) a que as proteínas de fusão de albumina da invenção podem estar fundidas, de modo a dirigir a expressão do polipéptido para o espaço periplasmático de bactérias, incluem, mas não estão limitados à sequência sinal de pelB, à sequência sinal da proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, à sequência sinal de ompA, à sequência sinal da subunidade da enterotoxina B termolábil de E. coli periplasmática e à sequência sinal da fosfatase alcalina. Vários vectores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que irão dirigir a localização de uma proteína, tal como a série pMAL de vectores (particularmente a série pMAL-p), disponível da New England Biolabs. Numa forma de realização específica, os polinucleótidos de proteínas de fusão de albumina da invenção podem estar fundidos à sequência sinal da pectato liase pelB, para aumentar a eficiência de expressão e purificação desses polipéptidos em bactérias Gram-negativas. Ver, as Patentes U.S. N° 5576195 e 5846818 . 110 uma diri
Os exemplos de péptidos sinal que podem estar fundidos a proteína de fusão de albumina da invenção, de modo a girem a sua secreção em células de mamífero, incluem a) a sequência sinal de MPIF-1 (e. g., aminoácidos 1-21 do Acesso GenBank número AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (SEQ ID N°: 2132) b) a sequência sinal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID N°: 1054) c) a região pre-pro da sequência sinal de HSA (e. g-, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEQ ID N°: 1176) d) a região pre da sequência sinal de HSA (e. 9·, MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEQ ID N°: 1177) ou suas variantes, tal como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID N°: 1168) e) a sequência sinal de invertase (e. g., MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID N°: 1108) f) a sequência sinal alfa do factor de cruzamento de levedura (e. g., MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVL PFSNSTNNGLLFINTUASIAAKEEGVSLEKR, SEQ ID N° : 1109 ou MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVL PFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEQ ID N°: 1109) g) sequência líder da toxina assassina de K. lactis h) uma sequência sinal híbrida (e. g., MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEQ ID N°: 1110) i) uma sequência sinal híbrida de HSA/MFa-1 (também conhecida como HSA/kex2) (e. g. , MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEQ ID N°: 1111) j) uma sequência líder da fusão de assassina/MFa-1 de K. lactis (e. g., MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID N°: 1169) k) a sequência sinal da Imunoglobulina Ig (e. g., MGWSCIILFLVATATGVHS, SEQ ID N°: 1095) 111 1) a sequência sinal do precursor de Fibulina B (e. g., MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID N°: 1096) m) a sequência sinal do precursor de clusterina (e. g., MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID N°: 1097) n) a sequência sinal da proteína 4 de ligação do factor de crescimento semelhante a insulina (e. g., MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID N°: 1098)
o) variantes da região pre-pro da sequência sinal de HSA, tais como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR
como HSA (SEQ ID N°: 1167), MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEQ MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEQ Líder de HSA modificada MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ Líder de HSA modificada MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ Líder de HSA modificada MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ Líder de HSA modificac ID N°: 1099), ID N°: 1100), ID N°: 1101), HSA N° 64 ID N°: 2133); HSA N° 66 ID N°: 2134); (AI4) -ID N°: 1102); a (S14) (também conhecido N° 65 modificado) - MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEQ ID N°: 1103), Líder de HSA modificada HSA (G14) -MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID N°: 1104), ou MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEQ ID N°: 1105) p) uma sequência sinal consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID N°: 1055) q) líder de fosfatase ácida (PH05) (e. g., MFKSVVYSILAASLANA SEQ ID N°: 2135) r) a sequência pre de MFoz-1 s) a sequência pre de 0 glucanase (BGL2) t) líder da toxina assassina 112 u) a presequência da toxina assassina v) prepro da toxina assassina de k. lactis (29 aminoácidos; 16 aminoácidos de pre e 13 aminoácidos de pro) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEQ ID N°: 2136) w) sequência lider de secreção de glucoamilase II de S. diastaticus x) sequência lider de secreção de galactosidase α de S. carlsbergensis (MEL1) y) sequência líder de glucoamilase de Candida z) Os lideres híbridos divulgados no documento EP-A-387319 (aqui incorporado por referência) aa) a sequência sinal de gp67 (em conjunto com sistemas de expressão baculovirais) (e. g., aminoácidos 1-19 do Acesso
GenBank Número AAA72759) ou bb) o líder natural da proteína X Terapêutica; cc) líder de invertase de S. cerevisiae (SUC2), como divulgado no documento JP 62-096086 (concedido como 911036516, aqui incorporado por referência); ou dd) Inulinase - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEQ ID N°: 2137). ee) Um variante do líder do propéptido de TA57 modificado N° 1-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGG LDVVGLISMAKR (SEQ ID N°: 2128)
ff) Um variante do líder do propéptido de TA57 modificado N° 2 - MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSG GLDVVGLISMAEEGEPKR (SEQ ID N°: 2129)
Os vectores que utilizam glutamina sintase (GS) ou DHFR como os marcadores seleccionáveis podem ser amplificados na presença dos fármacos metionina sulfoximina ou metotrexato, respectivamente. Uma vantagem dos vectores baseados em glutamina sintase é a disponibilidade de linhas celulares (e. g., a linha celular de mieloma murino, NSO) que são negativas para glutamina 113 sintase. Os sistemas de expressão de glutamina sintase também podem funcionar em células expressando glutamina sintase (e. g., células de Ovário de Hámster Chinês (CHO)), proporcionando inibidor adicional para prevenir o funcionamento do gene endógeno. Um sistema de expressão de glutamina sintase e seus componentes são detalhados nas publicações PCT: WO87/04462; WO86/05807; W089/01036; W089/10404; e WO91/06657.
Além disso, os vectores de expressão de glutamina sintase podem ser obtidos da Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) . A expressão e produção de anticorpos monoclonais utilizando um sistema de expressão de GS em células de mieloma de murino são descritas em Bebbington et al., Bio/technology 10:169(1992) e em Biblia e Robinson Biotechnol. Prog. 11:1 (1995). A presente divulgação também se refere a células hospedeiras contendo as construções de vector descritas acima aqui descritas e abrange, ainda, células hospedeiras contendo sequências nucleotidicas da invenção que estão associadas, de um modo operativo, a uma ou mais regiões de controlo heterólogas (e. g., promotor e/ou estimulador), utilizando técnicas conhecidas na matéria. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero (e. g., uma célula derivada de humano) ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. Pode ser escolhida uma estirpe hospedeira que module a expressão das sequências génicas inseridas ou modifique e processe o produto génico no modo especifico desejado. A expressão de determinados promotores pode ser elevada na presença de determinados indutores; deste modo, a expressão do polipéptido geneticamente manipulado pode ser controlada. Além 114 disso, diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento e modificação traducional e pós-traducional (e. g., fosforilação, clivagem) de proteínas. As linhas celulares apropriadas podem ser escolhidas para garantir as modificações e processamento desejados da proteína estranha expressa. A introdução dos ácidos nucleicos construções de ácidos nucleicos da invenção na célula hospedeira pode ser efectuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lípido catiónico, electroporação, transdução, infecção ou outros métodos. Esses métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tal como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Está especificamente contemplado que os polipéptidos da presente invenção podem, de facto, ser expressos por uma célula hospedeira desprovida de um vector recombinante.
Além da descrição de células hospedeiras contendo as construções de vector aqui discutidas, a divulgação também descreve células hospedeiras primárias, secundárias e imortalizadas de origem vertebrada, particularmente origem mamífera, que foram manipuladas para delecionar ou substituir material genético endógeno (e. g., a sequência codificante correspondendo à proteína Terapêutica pode ser substituída com uma proteína de fusão de albumina correspondendo à proteína Terapêutica) e/ou incluir material genético (e. g., podem ser incluídas sequências polinucleotídicas heterólogas, tal como, por exemplo, uma proteína de fusão de albumina da invenção correspondendo à proteína Terapêutica). 0 material genético associado, de um modo operativo, ao polinucleótido endógeno pode activar, alterar e/ou amplificar polinucleótidos endógenos. 115
Além disso, as técnicas conhecidas na matéria podem ser utilizadas para associar, de um modo operativo, polinucleótidos heterólogos (e. g., polinucleótidos codificando uma proteína de albumina, ou um seu fragmento ou variante) e/ou regiões de controlo heterólogas (e. g., promotor e/ou estimulador) com sequências polinucleotídicas endógenas codificando a proteína Terapêutica por meio de recombinação homóloga (ver, e. g., a Patente US Número 5641670, emitida em 24 de Junho de 1997; Publicação Internacional Número WO 96/29411; Publicação Internacional Número WO 94/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:8932-8935 (1989); e Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989) ) .
As proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser recuperadas e purificadas a partir de culturas celulares recombinantes por métodos bem conhecidos, incluindo precipitação por sulfato de amónio ou etanol, extraeção ácida, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interaeção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite, cromatografia de interaeção de carga hidrófoba e cromatografia de lectina. De um modo muito preferido, a cromatografia líquida de alta resolução ("HPLC") é empregue para purificação.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de Permuta Aniónica, incluindo, mas não limitada a, cromatografia em colunas de Q-sepharose, DEAE sepharose, poros HQ, poros DEAE, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q e DEAE, Fractogel Q e DEAE. 116
Em formas de realização específicas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de Permuta Catiónica, incluindo colunas de SP-sepharose, CM sepharose, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toyopearl CM, Resource/Source S e CM, Fractogel S e CM e seus equivalentes e comparáveis.
Em formas de realização específicas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de Interacção Hidrófoba, incluindo, mas não limitada a, colunas de Fenilo, Butilo, Metilo, Octilo, Hexil-sepharose, poros Fenilo, Butilo, Metilo, Octilo, Hexilo, Toyopead Fenilo, Butilo, Metilo, Octilo, Hexilo Resource/Source Fenilo, Butilo, Metilo, Octilo, Hexilo, Fractogel Fenilo, Butilo, Metilo, Octilo, Hexilo e seus equivalentes e comparáveis.
Em formas de realização específicas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de Exclusão de Tamanho, incluindo, mas não limitada a, colunas de resina de sepharose S100, S200, S300, superdex e seus equivalentes e comparáveis.
Em formas de realização específicas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de Afinidade, incluindo, mas não limitada a, colunas de afinidade de Corante Mimético, afinidade de péptido e afinidade de anticorpo que são selectivas para HSA ou as moléculas de "alvo de fusão".
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando um ou mais métodos de Cromatografia listados acima. Noutras formas de 117 realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando uma ou mais das seguintes colunas de Cromatografia. Coluna de Q sepharose FF, coluna de SP Sepharose FF, Coluna de Alta Resolução de Q Sepharose, coluna de Blue Sepharose FF, Coluna Blue, coluna de Fenilo Sepharose FF, DEAE Sepharose FF ou Coluna Metilo.
Além disso, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser purificadas utilizando o processo descrito na Publicação Internacional PCT WO 00/44772.
Um especialista na técnica poderia facilmente modificar o processo descrito nesta para utilização na purificação de proteínas de fusão de albumina da invenção.
As proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser recuperadas de: produtos de processos sintéticos químicos; e produtos produzidos por técnicas recombinantes de um hospedeiro procariótico ou eucariótico incluindo, por exemplo, células bacterianas, de levedura, de plantas superiores, de insecto e de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregue num processo de produção recombinante, os polipéptidos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, as proteínas de fusão de albumina da invenção também podem incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos como resultado de processos mediados por hospedeiro. Deste modo, é bem sabido na técnica que a metionina N-terminal codificada pelo codão de iniciação de tradução é, em geral, removida com elevada eficiência de qualquer proteína, após tradução em todas as células eucarióticas. Embora a metionina N-terminal na maioria das proteínas também seja eficientemente removida na maioria dos procariotas, para algumas proteínas, este processo de remoção procariótico é ineficiente, 118 dependendo da natureza do aminoácido ao qual a metionina N-terminal está covalentemente ligada.
Numa forma de realização, a levedura Pichia pastoris é utilizada para expressar proteínas de fusão de albumina da invenção num sistema eucariótico. A Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que pode metabolizar metanol como sua única fonte de carbono. Uma etapa principal na via de metabolização de metanol é a oxidação de metanol em formaldeído utilizando O2 · Esta reacção é catalisada pela enzima álcool oxidase. De modo a metabolizar o metanol como sua única fonte de carbono, a Pichia pastoris deve gerar níveis elevados de álcool oxidase devido, em parte, à afinidade relativamente baixa da álcool oxidase para 02. Consequentemente, num meio de crescimento dependendo de metanol como uma principal fonte de carbono, a região de promotor de um dos dois genes da álcool oxidase (A0X1) está altamente activa. Na presença de metanol, a álcool oxidase produzida a partir do gene AOX1 compreende até, aproximadamente, 30% da proteína solúvel total em Pichia pastoris. Ver Ellis, S.B., et al., Mol. Cell. Biol. 5:1111-21 (1985); Koutz, P.J, et al., Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., et al., Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987). Deste modo, uma sequência codificante heteróloga, tal como, por exemplo, um polinucleótido da presente invenção, sob a regulação de transcrição da totalidade ou parte da sequência regulatória de AOXl, é expressa a níveis excepcionalmente elevados na levedura Pichia, cultivada na presença de metanol.
Num exemplo, o vector pPIC9K plasmídico é utilizado para expressar ADN codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção, como aqui exposto, num sistema de levedura de Pichia, essencialmente como descrito em "Pichia Protocols: Methods in 119
Molecular Biology", D.R. Higgins e J. Cregg, ed. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Este vector de expressão permite a expressão e secreção de um polipéptido da invenção, em virtude do forte promotor de A0X1 ligado ao péptido sinal secretório da alcalina fosfatase (PHO) de Pichia pastoris (i. e., líder), localizado a montante de um sítio de múltipla clonagem.
Muitos outros vectores de levedura poderiam ser utilizados em vez de pPIC9K, tais como, pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-Sl, pPIC3.5K e PA0815, como um especialista na técnica facilmente entenderia, desde que a construção de expressão proposta proporcione apropriadamente sinais localizados para transcrição, tradução, secreção (se desejado) e semelhantes, incluindo um AUG em fase, como requerido.
Noutra forma de realização, a expressão de nível elevado de uma sequência codificante heteróloga, tal como, por exemplo, um polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, pode ser alcançada pela clonagem do polinucleótido heterólogo da invenção num vector de expressão, tais como, por exemplo, pGAPZ ou pGAPZalpha, e cultivando a cultura de levedura na ausência de metanol.
Além disso, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser sintetizadas quimicamente utilizando técnicas conhecidas na matéria (e. g., ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., N.I., e Hunkapiller et al.r Nature, 310:105-111 (1984)). Por exemplo, um polipéptido correspondendo a um fragmento de um polipéptido pode ser sintetizado por utilização de um sintetizador peptídico. Além disso, se desejado, aminoácidos não clássicos ou análogos 120 de aminoácidos químicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na sequência polipeptídica. Os aminoácidos não clássicos incluem, mas não estão limitados aos isómeros D dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-aminohexanóico, Aib, ácido 2-aminoisobutiricod, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de concepção, tais como aminoácidos b-metilo, aminoácidos Ca-metilo, aminoácidos Na-metilo e análogos de aminoácidos em geral. Além disso, o aminoácido pode ser D (dextrogiro) ou L (levogiro). A invenção abrange proteínas de fusão de albumina da presente invenção que são diferencialmente modificadas durante ou após tradução, e. g., por glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização, por grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, etc. Qualquer das numerosas modificações químicas pode ser efectuada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a, clivagem química específica por brometo de cianogénio, tripsina, quimotripsina, papaína, protease V8, NaBH4; acetilação, formilação, oxidação, redução; síntese metabólica na presença de tunicamicina; etc.
As modificações pós-traducionais adicionais abrangidas pela invenção incluem, por exemplo, e. g., cadeias de hidratos de carbono ligadas a N ou ligadas a 0, processamento de extremidades N-terminais ou C-terminais) , conjugação de fracções 121 químicas ao esqueleto de aminoácido, modificações químicas de cadeias de hidratos de carbono ligadas a N ou ligadas a 0 e adição ou deleção de um resíduo de metionina N-terminal, como resultado de expressão de célula hospedeira procariótica. As proteínas de fusão de albumina também podem ser modificadas com um marcador detectável, tais como um marcador enzimático, fluorescente, isotópico ou de afinidade, para permitir a detecção e isolamento da proteína.
Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina; e exemplos de material radioactivo adequado incluem iodo (1111, i231, 125I, 131I), carbono (14C) , enxofre (35S), trítio (3H) , índio (141In , 112ln, n3mIn, 115mIn) , tecnécio (99Tc, 99mTc), tálio (201Ti) , gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd) , molibdénio (99Mo), xénon (133Xe ), flúor (18F), 153Sm, 177Lu,159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166 HO, 90Y, 47Sc, 186Re, 188 Re, 142Pr, 105Rh e 97Ru.
Em formas de realização específicas, as proteínas de fusão de albumina da presente invenção ou seus fragmentos ou variantes estão conjugadas a quelantes macrocíclicos que se associam com iões radiometálicos, incluindo, mas não limitados a, 177Lu, 90Y, 166Ho e 153Sm, a polipéptidos. Numa forma de realização preferida, o ião radiometálico associado aos quelantes macrocíclicos é mIn. Noutra forma de realização preferida, o ião 122 Y. Em radiometálico associado ao quelante macrocíclico é formas de realização especificas, o quelante macrocíclico é o ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,Ν',N",N"‘-tetra-acético (DOTA). Noutras formas de realização específicas, o DOTA está conjugado a um anticorpo da invenção ou seu fragmento, por meio de molécula ligante. Os exemplos de moléculas ligantes úteis para conjugação de DOTA a um polipéptido são geralmente conhecidos na técnica - ver, por exemplo, DeNardo et ai., Clin Câncer Res. 4(10):2483-90 (1998); Peterson et ai., Bioconjug.
Chem. 10 (4):553-7 (1999); e Zimmerman et ai., Nucl. Med. Biol. 26 (8) :943-50 (1999) .
Como mencionado, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser modificadas por processos naturais, tal como processamento pós-traducional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na matéria. Será entendido que, num determinado polipéptido, o mesmo tipo de modificação pode estar presente, no mesmo grau ou em graus variáveis, em diversos sítios. Os polipéptidos da invenção podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os polipéptidos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais de pós-tradução ou podem ser preparados por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, conjugação covalente de flavina, conjugação covalente de um grupo heme, conjugação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, conjugação covalente de um lípido ou derivado de lípido, conjugação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfureto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, 123 iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por ARN de transferência de aminoácidos a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação. (Ver, por exemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, páginas 1-12 (1983); Seifter et ai., Meth Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 663:48-62 (1992) ) .
As proteínas de fusão de albumina da invenção e anticorpos que se ligam à proteína Terapêutica ou seus fragmentos ou variantes podem estar fundidos a sequências marcadoras, tal como um péptido, para facilitar a purificação. A sequência de aminoácidos marcadora pode ser um péptido de hexa-histidina, tal como a cauda proporcionada num vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona purificação conveniente da proteína de fusão. Outras caudas peptídicas úteis para purificação incluem, mas não estão limitadas à cauda "HA", que corresponde a um epitopo derivado da proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e a cauda "flag".
Além disso, uma proteína de fusão de albumina da invenção pode estar conjugada a uma fraeção terapêutica, tal como uma citotoxina, e. g., um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um ião metálico radioactivo, e. g., emissores 124 alfa, tal como, por exemplo, 213Bi. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo para as células. Os exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, antracina diona di-hidróxido, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina e seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (e. g., metotrexato, 6-mercaptopurina, β-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (e. g., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (e. g., daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (e. g., dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (e. g., vincristina e vinblastina).
Os conjugados da invenção podem ser utilizados para a modificação de uma dada resposta biológica, o agente terapêutico ou fracção de fármaco não deve ser interpretado como limitado aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fracção de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína, tais como factor de necrose tumoral, interferao alfa, interferão β, factor de crescimento nervoso, factor de 125 crescimento derivado de plaquetas, activador do plasminogénio tecidular, um agente apoptótico, e. g., TNF alfa, TNF beta, AIM I (Ver a Publicação Internacional N° WO 97/33899), AIM II (Ver a Publicação Internacional N° WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al. , Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Ver a Publicação Internacional N° WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, e. g., angiostatina ou endostatina; ou modificadores de resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina 6 ("IL-6"), factor de estimulação de colónias de macrófagos granulocíticos ("GM-CSF"), factor de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF") ou outros factores de crescimento. As técnicas para conjugação dessas fracções terapêuticas a proteínas (e. g., proteínas de fusão de albumina) são bem conhecidas na técnica.
As proteínas de fusão de albumina também podem estar conjugadas a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação de polipéptidos que são ligados, que se ligam ou associam com proteínas de fusão de albumina da invenção. Esses suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno.
As proteínas de fusão de albumina, com ou sem uma fracção terapêutica a elas conjugada, administradas isoladamente ou em combinação com factor(es) citotóxico(s) e/ou citocina(s), podem ser utilizadas como um terapêutico.
Também são proporcionados pela invenção derivados quimicamente modificados das proteínas de fusão de albumina da invenção que podem proporcionar vantagens adicionais, tais como 126 solubilidade, estabilidade e tempo em circulação aumentados do polipéptido ou imunogenicidade diminuída (ver a Patente U.S. N° 4179337). As fracções químicas para derivatização podem ser seleccionadas de polímeros solúveis em água, tais como polietilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico e semelhantes. As proteínas de fusão de albumina podem ser modificadas em posições aleatórias na molécula ou em posições predeterminadas na molécula e podem incluir uma, duas, três ou mais fracções químicas conjugadas. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietilenoglicol, o peso molecular preferido, é entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indicando que, em preparações de polietilenoglicol, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular especificado) para facilidade em manipulação e preparação. Dependendo do perfil terapêutico (e. g. , a duração de libertação prolongada desejada, os efeitos, se existirem, na actividade biológica, a facilidade em manipulação, o grau ou ausência de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietilenoglicol para uma proteína Terapêutica ou análogo) desejado, podem ser utilizados outros tamanhos. Por exemplo, o polietilenoglicol pode ter um peso molecular médio de cerca de 200, 500, 1000, 1500 , 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, - 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 19500, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000 ou 100000 kDa. 127
Como notado acima, o polietilenoglicol pode ter uma estrutura ramificada. Os polietilenoglicóis ramificados são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 5643575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al.f Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); e Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999).
As moléculas de polietilenoglicol (ou outras fracções químicas) devem ser conjugadas à proteína com consideração dos efeitos nos domínios funcional ou antigénico da proteína. Um número de métodos de conjugação está disponível para os especialistas na técnica, tal como, por exemplo, o método divulgado no documento EP 0401384 (ligando PEG a G-CSF); ver também Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992), referindo a peguilação de GM-CSF utilizando cloreto de tresilo. Por exemplo, o polietilenoglicol pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoácido, por meio de grupo reactivo, tal como um grupo amino ou carboxilo livre. Os grupos reactivos são aqueles aos quais pode estar ligada uma molécula de polietilenoglicol activada. Os resíduos de aminoácido tendo um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácido N-terminais; aqueles tendo um grupo carboxilo livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido C-terminal. Os grupos sulfidrilo também podem ser utilizados como um grupo reactivo para conjugação das moléculas de polietilenoglicol. É preferida para efeitos terapêuticos a conjugação a um grupo amino, tal como conjugação no terminal N ou grupo de lisina.
Como sugerido acima, o polietilenoglicol pode ser conjugado a proteínas por meio de ligação a qualquer de um número de resíduos de aminoácido. Por exemplo, o polietilenoglicol pode 128 ser ligado a proteínas por meio de ligações covalentes a resíduos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína. Uma ou mais químicas reaccionais podem ser empregues para conjugar polietilenoglicol a resíduos de aminoácido específicos (e. g., lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína) da proteína ou a mais de um tipo de resíduo de aminoácido (e. g., lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína e suas combinações) da proteína.
Podem desejar-se, especificamente, proteínas quimicamente modificadas no terminal N. Utilizando polietilenoglicol como uma ilustração da presente composição, pode seleccionar-se, a partir de uma variedade de moléculas de polietilenoglicol (por peso molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de proteína (polipéptido) na mistura de reacção, o tipo de reacção de peguilação a ser realizado e o método de obtenção da proteína peguilada seleccionada N-terminalmente. 0 método de obtenção da preparação peguilada N-terminalmente (i. e., separação desta fracção de outras fracções monopeguiladas, se necessário) pode ser por purificação do material peguilado N-terminalmente desde uma população de moléculas de proteína peguiladas. Proteínas selectivas, quimicamente modificadas no terminal N, a modificação pode ser alcançada por alquilação redutora que explora a reactividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o N-terminal) disponíveis para derivatização numa proteína particular. Sob as condições reaccionais apropriadas, é alcançada derivatização substancialmente selectiva da proteína no terminal N com um grupo carbonilo contendo polímero. 129
Como indicado acima, a peguilação das proteínas de fusão de albumina da invenção pode ser alcançada por qualquer número de meios. Por exemplo, o polietilenoglicol pode ser conjugado à proteína de fusão de albumina directamente ou por um ligante intermédio. Os sistemas sem ligante para conjugação de polietilenoglicol a proteínas são descritos em Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis et al., Intern. J. of Hematol. 68:1-18 (1998); Patente U.S. N° 4002531; Patente U.S. N° 5349052; documentos WO 95/06058; e WO 98/32466.
Um sistema para conjugação de polietilenoglicol directamente a resíduos de aminoácido de proteínas sem um ligante intermédio emprega MPEG tresilado, que é produzido pela modificação de monometoxi polietilenoglicol (MPEG), utilizando cloreto de tresilo (CISO2CH2CF3) . Após reacção de proteína com MPEG tresilado, o polietilenoglicol é directamente conjugado a grupos amina da proteína. Deste modo, a invenção inclui conjugados de proteína-polietilenoglicol, produzidos por reacção de proteínas da invenção com uma molécula de polietilenoglicol tendo um grupo sulfonilo de 2,2,2-trifluoroetano. O polietilenoglicol também pode ser conjugado a proteínas utilizando um número de diferentes ligantes intermédios. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5612460 divulga ligantes de uretano para ligar polietilenoglicol a proteínas. Os conjugados de proteína-polietilenoglicol, em que o polietilenoglicol está conjugado à proteína por um ligante, também podem ser produzidos por reacção de proteínas com compostos, tais como MPEG-succinimidilsuccinato, MPEG activado com 1, 1'-carbonildiimidazole, MPEG-2,4,5-tricloropenilcarbonato, MPEG-p-nitrofenolcarbonato e diversos derivados de 130 MPEG-succinato. Um número de derivados de polietilenoglicol adicionais e químicas reaccionais para conjugação de polietilenoglicol a proteínas são descritos na Publicação Internacional N° WO 98/32466. Os produtos proteicos peguilados produzidos utilizando as químicas reaccionais aqui expostas estão incluídos no âmbito da invenção. 0 número de fracções de polietilenoglicol conjugadas a cada proteína de fusão de albumina da invenção (i. e., o grau de substituição) também pode variar. Por exemplo, as proteínas peguiladas da invenção podem estar ligadas, em média, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, ou mais moléculas de polietilenoglicol. De modo semelhante, o grau médio de substituição é dentro de gamas, tais como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 ou 18-20 fracções de polietilenoglicol por molécula de proteína. Os métodos para determinar o grau de substituição são discutidos, por exemplo, em Delgado et ai., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992).
Os polipéptidos da invenção podem ser recuperados e purificados a partir de síntese química e culturas celulares recombinantes, por métodos correntes que incluem, mas não estão limitados a, precipitação por sulfato de amónio ou etanol, extracção ácida, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite e cromatografia de lectina. De um modo muito preferido, a cromatografia líquida de alta resolução ("HPLC") é empregue para purificação. Podem ser empregues técnicas bem conhecidas para o re-enrolamento de proteína, para regenerar a 131 conformação activa quando o polipeptídeo é desnaturado durante o isolamento e/ou purificação. A presença e quantidade de proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser determinadas utilizando ELISA, um bem conhecido imunoensaio conhecido na técnica. Um protocolo de ELISA, que seria útil para detecção/quantificação de proteínas de fusão de albumina da invenção, compreende as etapas de revestimento de uma placa de ELISA com um anticorpo de albumina sérica anti-humano, bloqueamento da placa para prevenir ligação não especificada, lavagem da placa de ELISA, adição de uma solução contendo a proteína de fusão de albumina da invenção (numa ou mais concentrações diferentes), adição de um anticorpo específico anti-proteína Terapêutica secundário ligado a um marcador detectável (como aqui descrito ou, de outro modo, conhecido na técnica) e a detecção da presença do anticorpo secundário. Numa versão alternativa deste protocolo, a placa de ELISA poderá ser revestida com o anticorpo específico anti-proteína Terapêutica e o reagente secundário marcado poderá ser o anticorpo específico anti-albumina humana.
Utilizações do Polinucleótido
Cada dos polinucleótidos aqui identificados pode ser utilizado em numerosos modos como reagentes. A seguinte descrição deve ser considerada exemplificativa e utiliza técnicas conhecidas.
Os polinucleótidos da presente invenção são úteis para produzir as proteínas de fusão de albumina da invenção. Como descrito em maior detalhe abaixo, os polinucleótidos da invenção 132 (codificando proteínas de fusão de albumina) podem ser utilizados em métodos de ADN recombinante úteis na engenharia genética para preparar células, linhas celulares ou tecidos que expressam a proteína de fusão de albumina codificada pelos polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção.
Os polinucleótidos da presente invenção também são úteis em terapia génica. Um objectivo da terapia génica é inserir um gene normal num organismo tendo um gene defeituoso, num esforço para corrigir o defeito genético. Os polinucleótidos divulgados na presente invenção oferecem um meio de visar esses defeitos genéticos num modo altamente preciso. Outro objectivo é inserir num novo gene que não estava presente no genoma hospedeiro produzindo, desse modo, uma nova característica na célula hospedeira. Exemplos não limitativos adicionais de métodos de terapia génica abrangidos pela presente invenção são mais exaustivamente aqui descritos em qualquer outra parte (ver, e. g. , as secções intituladas "Terapia Génica" e os Exemplos 63 e 64) .
Utilizações dos Polipéptidos
Cada dos polipéptidos aqui identificados pode ser utilizado em numerosos modos. A seguinte descrição deve ser considerada exemplificativa e utiliza técnicas conhecidas.
Além disso, as proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser utilizadas para tratar ou prevenir doenças ou estados, tais como, por exemplo, distúrbios neuronais, distúrbios do sistema imunitário, distúrbios reprodutivos, 133 distúrbios gastrointestinais, distúrbios cardiovasculares e/ou distúrbios renais. Por exemplo, aos doentes pode ser administrado um polipéptido da presente invenção, num esforço para substituir niveis ausentes ou diminuídos do polipéptido (e. g., insulina), para suplementar níveis ausentes ou diminuídos de um polipéptido diferente (e. g., hemoglobina S por hemoglobina B, SOD, catálise, proteínas de reparação de ADN) , para inibir a actividade de um polipéptido (e. g., um oncogene ou supressor tumoral), para activar a actividade de um polipéptido (e. g., pela ligação a um receptor), para reduzir a actividade de um receptor ligado a membrana, pela sua competição com ligando livre (e. g., receptores de TNF solúveis utilizados na redução da inflamação) ou para causar uma resposta desejada (e. g., inibição do crescimento de vasos sanguíneos, estimulação da resposta imunitária para células ou tecidos proliferativos).
Em particular, as proteínas de fusão de albumina compreendendo, pelo menos, um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico, também podem ser utilizadas para tratar doenças (como descrito supra e aqui em qualquer outra parte). Por exemplo, a administração de uma proteína de fusão de albumina compreendendo, pelo menos, um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico pode ligar e/ou neutralizar o polipéptido ao qual o anticorpo Terapêutico utilizado para preparar a proteína de fusão de albumina se liga especificamente e/ou reduzir a sobreprodução do polipéptido ao qual o anticorpo Terapêutico utilizado para preparar a proteína de fusão de albumina se liga especificamente. De modo semelhante, a administração de uma proteína de fusão de albumina compreendendo, pelo menos, um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico pode activar o polipéptido ao qual o anticorpo Terapêutico utilizado para preparar a proteína de 134 fusão de albumina se liga especificamente, pela ligação ao polipéptido ligado a uma membrana (receptor).
No mínimo, as proteínas de fusão de albumina da invenção, da presente invenção, podem ser utilizadas como marcadores de peso molecular em géis de SDS-PAGE ou em colunas de filtração em gel de crivo molecular, utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica. As proteínas de fusão de albumina da invenção também podem ser utilizadas para deduzir anticorpos que, por sua vez, podem ser utilizados para medir a expressão de proteína da proteína Terapêutica, proteína de albumina e/ou da proteína de fusão de albumina da invenção a partir de uma célula recombinante, como um modo de avaliar a transformação da célula hospedeira ou numa amostra biológica. Além disso, as proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser utilizadas para testar as actividades biológicas aqui descritas.
Ensaios de Diagnóstico
Os compostos da presente invenção são úteis para diagnóstico, tratamento, prevenção e/ou prognóstico de diversos distúrbios em mamíferos, de um modo preferido, humanos. Esses distúrbios incluem, mas não estão limitados, aos descritos para a proteína Terapêutica na correspondente fileira da Tabela 1 e aqui sob os títulos de secção "Actividade Imunitária", "Distúrbios Renais", "Distúrbios Cardiovasculares", "Actividade Anti-Angiogénese", "Doenças ao Nível Celular", "Cicatrização e Proliferação Celular Epitelial", "Actividade Neuronal e Doenças Neurológicas", "Distúrbios Endócrinos" "Distúrbios do Sistema Reprodutivo", "Doença Infecciosa", "Regeneração" e/ou "Distúrbios Gastrointestinais" infra. 135
Para um número de distúrbios, níveis substancialmente alterados (aumentados ou diminuídos) de expressão génica podem ser detectados em tecidos, células ou fluidos corporais (e. g., soros, plasma, urina, sémen, fluido sinovial ou fluido espinal) retirados de um indivíduo tendo esse distúrbio, em relação a um nível de expressão génica "padrão", isto é, o nível de expressão em tecidos ou fluidos corporais de um indivíduo não tendo o distúrbio. Deste modo, é descrito um método de diagnóstico útil durante o diagnóstico de um distúrbio que envolve a medição do nível de expressão do gene codificando um polipéptido em tecidos, células ou fluido corporal de um indivíduo e a comparação do nível medido de expressão génica com um nível padrão de expressão génica, pelo que um aumento ou diminuição no (s) nível (níveis) de expressão génica comparativamente com o padrão é indicativo de um distúrbio. Estes ensaios de diagnóstico podem ser realizados in vivo ou in vitro, tais como, por exemplo, em amostras sanguíneas, tecido de biopsia ou tecido de autópsia. A presente divulgação também é útil como um indicador de prognóstico, pelo que doentes exibindo expressão génica melhorada ou deprimida irão sofrer um pior resultado clínico.
Por "ensaio do nível de expressão do gene codificando um polipéptido" entende-se medir ou estimar, qualitativamente ou quantitativamente, o nível de um polipéptido particular (e. g., um polipéptido correspondendo à proteína Terapêutica divulgada na Tabela 1) ou o nível do ARNm codificando o polipéptido da invenção numa primeira amostra biológica, directamente (e. g., pela determinação ou estimativa do nível de proteína ou nível de ARNm absoluto) ou relativamente (e. g., pela comparação do nível de polipéptido ou nível de ARNm numa segunda amostra biológica). 136
De um modo preferido, o nível de expressão de polipéptido ou nível de ARNm na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com um nível de polipéptido ou nível de ARNm padrão, o padrão sendo tomado de uma segunda amostra biológica obtida de um indivíduo não tendo o distúrbio ou sendo determinado pela realização da média dos níveis de uma população de indivíduos não tendo o distúrbio. Como será entendido na técnica, uma vez conhecido um nível de polipéptido ou nível de ARNm padrão, este pode ser utilizado repetidamente como um padrão para comparação.
Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo, linha celular, cultura de tecidos ou outra fonte contendo polipéptidos da invenção (incluindo suas porções) ou ARNm. Como indicado, a amostra biológica inclui fluidos corporais (tais como soros, plasma, urina, fluido sinovial e fluido espinal) e fontes de tecido que se verificou expressarem o tamanho total ou seus fragmentos de um polipéptido ou ARNm. Os métodos para obtenção de biopsias de tecido e fluidos corporais de mamíferos são bem conhecidos na técnica. Onde a amostra biológica inclua ARNm, uma biopsia de tecido é a fonte preferida.
Composições Farmacêuticas ou Terapêuticas
As proteínas de fusão de albumina da invenção ou suas formulações podem ser administradas por qualquer método convencional, incluindo injecção parentérica (e. g., subcutânea ou intramuscular) ou infusão intravenosa. 0 tratamento pode consistir numa dose única ou numa pluralidade de doses, ao longo de um período de tempo. 137
Embora seja possível que uma proteína de fusão de albumina da invenção seja administrada isoladamente, é preferido, apresentá-la como uma formulação farmacêutica, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis. 0 veículo ou veículos devem ser "aceitáveis", no sentido de ser compatível com a proteína de fusão de albumina e não deletério para os seus receptores. Tipicamente, os veículos serão água ou soro fisiológico que serão estéreis e apirogénicos. As proteínas de fusão de albumina da invenção estão particularmente adaptadas à formulação em veículos aquosos, tais como água apirogénica estéril, soro fisiológico ou outras soluções isotónicas, devido à sua estabilidade em armazenamento alargada em solução. Por exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas muito antecipadamente na forma aquosa, por exemplo, semanas ou meses ou períodos de tempo mais longos, antes de serem dispensadas.
Por exemplo, as formulações contendo a proteína de fusão de albumina podem ser preparadas tendo em conta a estabilidade em armazenamento alargada da proteina de fusão de albumina em formulações aquosas. Como discutido acima, a estabilidade em armazenamento da proteina Terapêutica é marcadamente aumentada ou prolongada após fusão a HA.
Nos casos onde a administração de aerossol seja apropriada, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser formuladas como aerossóis utilizando processos correntes. 0 termo "aerossol" inclui qualquer fase suspensa de gás de uma proteina de fusão de albumina da presente invenção que seja capaz de ser inalada para dentro dos bronquiolos ou passagens nasais. Especificamente, o aerossol inclui uma suspensão de gás de goticulas de uma proteina de fusão de albumina da presente 138 invenção, como pode ser produzida num inalador de dose calibrada ou nebulizador ou num pulverizador de vapor. 0 aerossol também inclui uma composição de pó seco de um composto da presente invenção suspenso em ar ou outro gás veiculo, que pode ser distribuído por insuflação de um dispositivo inalador, por exemplo. Ver Ganderton & Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313; e Raeburn et al.r. (1992) Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159.
As formulações da invenção também são tipicamente não imunogénicas, em parte, devido à utilização dos componentes da proteína de fusão de albumina sendo derivados da espécie apropriada. Por exemplo, para utilização humana, a proteína
Terapêutica e as porções de albumina da proteína de fusão de albumina serão tipicamente humanas. Em alguns casos, em que o componente é derivado de não humano, esse componente pode ser humanizado por substituição de aminoácidos chave, de modo a que epitopos específicos, em vez de estranhos, apareçam ao sistema imunitário humano como sendo humanos em natureza.
As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Esses métodos incluem a etapa de colocar em associação a proteína de fusão de albumina com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas colocando uniformemente e intimamente em associação o ingrediente activo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, depois, se necessário, dando forma ao produto. 139
As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções injectáveis estéreis, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação apropriada para o receptor pretendido; e suspensão estéril, aquosa e não aquosa, que pode incluir agentes de suspensão ou agentes de espessamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas e frascos-ampola ou seringas selados e podem ser armazenados num estado liofilizado, requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injecções, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões de injecção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós estéreis. As formulações de dosagem podem conter a porção de proteína Terapêutica a uma concentração molar inferior ou dosagem inferior, comparativamente com a formulação padrão não fundida para a proteína Terapêutica, dada meia-vida sérica alargada exibida por muitas das proteínas de fusão de albumina da invenção.
As formulações ou composições da invenção podem ser embaladas juntamente com ou incluídas num kit com instruções ou um inserto de embalagem fazendo referência à estabilidade em armazenamento alargada do componente de proteína de fusão de albumina. Por exemplo, essas instruções ou insertos de embalagem podem abordar condições de armazenamento recomendadas, tais como tempo, temperatura e luz, tendo em conta a estabilidade em armazenamento alargada ou prolongada das proteínas de fusão de albumina da invenção. Essas instruções ou insertos de embalagem também podem abordar as vantagens particulares das proteínas de fusão de albumina da invenção, tal como a facilidade de armazenamento para formulações que podem requerer utilização no campo, fora das condições controladas de hospital, clínica ou 140 consultório. Como descrito acima, as formulações da invenção podem ser na forma aquosa e podem ser armazenadas sob circunstâncias inferiores às ideais, sem perda significativa da actividade terapêutica.
As proteínas de fusão de albumina da invenção também podem ser incluídas em nutracêuticos. Por exemplo, determinadas proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser administradas em produtos naturais, incluindo leite ou produto lácteo, obtidos de um mamífero transgénico que expresse proteína de fusão de albumina. Essas composições também podem incluir plantas ou produtos de plantas, obtidos de uma planta transgénica que expresse a proteína de fusão de albumina. A proteína de fusão de albumina também pode ser proporcionada na forma de pó ou comprimido, com ou sem outros aditivos, veículos, espessantes e diluentes conhecidos. Os nutracêuticos são descritos em Scott Hegenhart, Food Product Design, Dezembro de 1993 . A proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido serão formulados e doseados num modo consistente com boas práticas médicas, tendo em conta o estado clínico do indivíduo doente (especialmente os efeitos secundários do tratamento com a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido isoladamente), o local de distribuição, o método de administração, o programa de administração e outros factores conhecidos dos médicos. A "quantidade eficaz" para os presentes efeitos é, deste modo, determinada por essas considerações.
Como proposição genérica, a quantidade farmaceuticamente eficaz total da proteína de fusão de albumina administrada parentericamente por dose será na gama de cerca de 1 pg/kg/dia a 141 10 mg/kg/dia de peso corporal de doente embora, como notado acima, esta esteja sujeita a critério terapêutico. De um modo mais preferido, esta dose é, pelo menos, 0,01 mg/kg/dia e, de um modo muito preferido, para humanos, entre cerca de 0,01 e 1 mg/kg/dia para a hormona. Se dada continuamente, a proteína de fusão de albumina é tipicamente administrada a uma taxa de dose de cerca de 1 pg/kg/hora a cerca de 50 pg/kg/hora, por 1-4 injecções por dia ou por infusões subcutâneas contínuas, por exemplo, utilizando uma minibomba. Também pode ser empregue um saco de solução intravenosa. A duração de tratamento necessária para observar alterações e o intervalo após tratamento para que ocorram respostas parece variar, dependendo do efeito desejado.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos podem ser administrados oralmente, rectalmente, parentericamente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, topicamente (como por pós, pomadas, géis, gotas ou adesivo transdérmico), bucalmente ou como um spray oral ou nasal. "Veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um espessante, diluente, material de encapsulamento não tóxico, sólido, semi-sólido ou líquido, ou auxiliar de formulação de qualquer. O termo "parentérico", como aqui utilizado, refere-se a modos de administração que incluem injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-esternal, subcutânea e intra-articular.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção também são adequadamente administrados por sistemas de libertação prolongada. Exemplos de proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos de libertação prolongada são administradas oralmente, rectalmente, parentericamente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, 142 topicamente (como por pós, pomadas, géis, gotas ou adesivo transdérmico), bucalmente ou como um spray oral ou nasal. "Veiculo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um espessante, diluente, material de encapsulamento não tóxico, sólido, semi-sólido ou liquido ou auxiliar de formulação de qualquer tipo. 0 termo "parentérico", como aqui utilizado, refere-se a modos de administração que incluem injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-esternal, subcutânea e intra-articular. Exemplos adicionais de proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos de libertação prolongada incluem materiais poliméricos adequados (tais como, por exemplo, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, e. g. , filmes, ou mirocápsulas), materiais hidrófobos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica e derivados moderadamente solúveis (tal como, por exemplo, um sal moderadamente solúvel).
As matrizes de libertação prolongada incluem polilactidas (Pat. U.S. N° 3773919, documento EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al. , Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) e Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etileno vinílico (Langer et al. , Id.) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133988).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos de libertação prolongada também incluem proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção aprisionados em lipossomas (ver, de um modo geral, Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious 143
Disease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler (ed.), Liss, Nova Iorque, p. 317-327 e 353-365 (1989)). Os lipossomas contendo a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido são preparados por métodos conhecidos per se: documento DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 77:4030-4034 (1980); documentos EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; Pedido de Pat. Japonesa 83-118008; Pat. U.S. N° 4485045 e 4544545; e documento EP 102324. Habitualmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 Angstrom) , nos quais o teor de lípido é superior a cerca de 30 por cento de colesterol, em mol, sendo a proporção seleccionada ajustada para a Terapêutica óptima.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser distribuídos por meio de uma bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et ai., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)).
Outros sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
Para administração parentérica, a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido podem ser formulados, em geral, pela sua mistura com um grau de pureza desejado, numa forma injectável de dosagem unitária (solução, suspensão ou emulsão), com um veículo farmaceuticamente aceitável, i. e., um que seja não tóxico para os receptores às dosagens e concentrações empregues e seja compatível com outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação, de um modo preferido, não 144 inclui agentes de oxidação e outros compostos que sejam conhecidos por serem deletérios para a Terapêutica.
Em geral, as formulações são preparadas pela colocação da proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido em contacto, uniformemente e intimamente, com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos. Depois, se necessário, o produto é formado na formulação desejada. De um modo preferido, o veículo é um veículo parentérico, de um modo mais preferido, uma solução que seja isotónica com o sangue do receptor. Exemplos desses veículos veículos incluem água, soro fisiológico, solução de Ringer e solução de dextrose. Os veículos não aquosos, tais como óleos fixos e oleato de etilo, também são aqui úteis, assim como lipossomas. 0 veículo adequadamente contém quantidades menores de aditivos, tais como substâncias que melhoram a isotonicidade e estabilidade química. Esses materiais são não tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações empregues e incluem tampões, tais como fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outros ácidos orgânicos ou seus sais; antioxidantes, tal como ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos), e. g., poliarginina ou tripéptidos; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou arginina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo celulose ou seus derivados, glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; iões homólogos, tal como sódio; e/ou surfactantes não iónicos, tais como polissorbatos, poloxâmeros ou PEG. 145 A proteína de fusão de albumina é tipicamente formulada nesses veículos, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a 100 mg/mL, de um modo preferido, 1-10 mg/mL, a um pH de cerca de 3 a 8. Será compreendido que a utilização de determinados dos excipientes, veículos ou estabilizantes anteriores irá resultar na formação de sais polipeptídicos.
Qualquer farmacêutico utilizado para administração terapêutica pode ser estéril. A esterilidade é facilmente alcançada por filtração através de membranas de filtração estéreis (e. g., membranas de 0,2 mícron) . As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos são, em geral, colocadas dentro de um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou frasquinho tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.
Habitualmente, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos serão armazenados em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas ou frascos-ampola selados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Como um exemplo de uma formulação liofilizada, frascos-ampola de 10 mL são enchidos com 5 mL de solução de proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido aquosa esterilizada por filtração a 1% (p/v) e a mistura resultante é liofilizada. A solução de infusão é preparada pela reconstituição da proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido liofilizado, utilizando Água para Injecção bacteriostática.
Numa forma de realização específica e preferida, as formulações de proteína de fusão de Albumina compreendem fosfato de sódio a 0,01 M, cloreto de sódio a 0,15 mM, 0,16 micromole de 146 octanoato de sódio/miligrama de proteína de fusão, 15 microgramas/mililitro de polissorbato 80, pH 7,2. Noutra forma de realização específica e preferida, as formulações de proteína de fusão de Albumina consistem em fosfato de sódio a 0,01 M, cloreto de sódio a 0,15 mM, 0,16 micromole de octanoato de sódio/miligrama de proteína de fusão,
15 microgramas/mililitro de polissorbato 80, pH 7,2. O pH e tampão são escolhidos para corresponderem às condições fisiológicas e o sal é adicionado como um tonificante. O octanoato de sódio foi escolhido devido à sua capacidade referida de aumentar a estabilidade térmica da proteína em solução. Finalmente, o polissorbato foi adicionado como um surfactante genérico, que baixa a tensão de superfície da solução e baixa a adsorção não específica da proteína de fusão de albumina ao sistema de oclusão do recipiente.
Também é divulgada uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção. Associada a esse(s) recipiente (s) pode estar uma advertência na forma prescrita por uma agência governamental regulando a preparação, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cuja advertência reflecte a aprovação pela agência de preparação, utilização ou venda para administração humana. Além disso, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos podem ser empregues em conjunto com outros compostos terapêuticos.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com adjuvantes. Os adjuvantes que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção 147 incluem alúmen, alúmen mais desoxicolato (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG (e. g., THERACYS®) , MPL e preparações não viáveis de Corynebacterium parvum. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com alúmen. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com QS-21. Além disso, os adjuvantes que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem,
Monofosforil-lípido imunomodulador, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sais de Alumínio, MF-59, e tecnologia de adjuvante Viresomal. As vacinas que podem ser administradas com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem vacinas dirigidas à protecção contra MMR (sarampo, papeira, rubéola), polio, varicela, tétano/difteria, hepatite A, hepatite B, Haemophilus influenzae B, tosse convulsa, pneumonia, influenza, doença de Lyme, rotavírus, cólera, febre amarela, encefalite Japonesa, poliomielite, raiva, febre tifoide e tosse convulsa. As combinações podem ser administradas concomitantemente, e. g., como uma mistura, separadamente mas simultaneamente ou concorrentemente ou sequencialmente. Isto inclui apresentações nas quais os agentes combinados são administrados em conjunto como uma mistura terapêutica e também processos nos quais os agentes combinados são administrados separadamente mas simultaneamente, e. g., como através de linhas intravenosas separadas no mesmo indivíduo. A administração "em combinação" inclui, ainda, a administração separada de um dos compostos ou agentes dados em primeiro lugar, seguida do segundo.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação 148 com outros agentes terapêuticos. Os agentes de proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem, mas não estão limitados a, agentes quimioterapêuticos, antibióticos, anti-inflamatórios esteróides e não esteróides, agentes imunoterapêuticos convencionais e/ou tratamentos terapêuticos descritos abaixo. As combinações podem ser administradas concomitantemente, e. g., como uma mistura, separadamente mas simultaneamente ou concorrentemente ou sequencialmente. Isto inclui apresentações nas quais os agentes combinados são administrados em conjunto como uma mistura terapêutica e também processos nos quais os agentes combinados são administrados separadamente mas simultaneamente, e. g., como através de linhas intravenosas separadas no mesmo indivíduo. A administração "em combinação" inclui, ainda, a administração separada de um dos compostos ou agentes dados em primeiro lugar, seguida pelo segundo.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com um anticoagulante. Os anticoagulantes que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não estão limitados a, heparina, heparina de baixo peso molecular, varfarina sódica (e. g., COUMADIN®) , dicumarol, 4-hidroxicumarina, anisindiona (e. g., MIRADON™), acenocumarol (e. g., nicumalona, SINTHROME™), indan-1,3-diona, fenprocumona (e. g., MARCUMAR™), biscumacetato de etilo (e. g., TROMEXAN™) e aspirina. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com heparina e/ou varfarina. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com varfarina. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com varfarina e aspirina. As composições da invenção podem ser administradas em combinação 149 com heparina. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com heparina e aspirina.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com fármacos trombolíticos. Os fármacos trombolíticos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não estão limitados a, plasminogénio, lys-plasminogénio, alfa2-antiplasmina, estreptocinae (e. g., KABIKINASE™), antiresplace (e. g. , EMINASE™), activador do plasminogénio tecidular (t-PA, altevase, ACTIVASE™), urocinase (e. g., ABBOKINASE™), sauruplase, (Prourokinase, urocinase de cadeia simples) e ácido aminocapróico (e. g. , AMICAR™) . As composições da invenção podem ser administradas em combinação com activador do plasminogénio tecidular e aspirina.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com fármacos antiplaquetários. Os fármacos antiplaquetários que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não estão limitados a, aspirina, dipiridamol (e. g., PERSANTINE™) e ticlopidina (e. g., TICLID™). A utilização de fármacos anticoagulantes, trombolíticos e/ou antiplaquetários em combinação com proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção pode ser contemplada para a prevenção, diagnóstico e/ou tratamento de trombose, trombose arterial, trombose venosa, tromboembolismo, embolismo pulmonar, aterosclerose, enfarte do miocárdio, ataque isquémico transiente, angina instável. A utilização de fármacos anticoagulantes, trombolíticos e/ou antiplaquetários em combinação com proteínas de fusão de 150 albumina e/ou polinucleótidos da invenção pode ser contemplada para a prevenção de oclusão de enxertos safenos, para redução do risco de trombose periprocedimental, como poderá acompanhar processos de angioplastia, para redução do risco de AVC em doentes com fibrilação atrial, incluindo fibrilação atrial não reumática, para redução do risco de embolismo associado a doença mecânica de válvulas do coração e ou válvulas mitrais. Outras utilizações para a terapêutica da invenção, isoladamente ou em combinação com fármacos antiplaquetários, anticoagulantes e/ou tromboliticos, incluem, mas não estão limitadas à prevenção de oclusões em dispositivos extracorpóreos (e. g., cânulas intravasculares, shunts de acesso vascular em doentes de hemodiálise, máquinas de hemodiálise e máquinas de bypass cardiopulmonar).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes anti-retrovirais, inibidores nucleósidos/nucleótidos de transcritase reversa (NRTI), inibidores não nucleósidos de transcritase reversa (NNRTI) e/ou inibidores de protease (PI). Os NRTI que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem, mas não estão limitados a, RETROVIR™ (zidovudina/AZT), VIDEX™ (didanosina/ddl), HIVID™ (zalcitabina/ddC), ZERTT™ (estavudina/d4T), EPIVIR™ (lamivudina/3TC) e COMBIVIR™ (zidovudina/lamivudina) . Os NNRTI que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem VIRAMUNE™ (nevirapina) , RESCRIPTOR™ (delavirdina) e SUSTIVA™ (efavirenz). Os inibidores de protease que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção 151 incluem CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (saquinavir) e VIRACEPT™ (nelfinavir).
Os agentes anti-retrovirais, inibidores nucleósidos de transcritase reversa, inibidores não nucleósidos de transcritase reversa e/ou inibidores de protease podem ser utilizados em qualquer combinação com proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção para tratar a SIDA e/ou para prevenir ou tratar a infecção por VIH. NRTI adicionais incluem LODENOSINE™ (F-ddA; um NRTI de adenosina ácido-estável; Triangle/Abbott; COVIRACIL™ (emtricitabina/FTC; estruturalmente relacionado com lamivudina (3TC) mas com actividade 3 a 10 vezes maior in vitro; Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, também estruturalmente relacionado com lamivudina mas retém actividade contra uma proporção substancial de isolados resistentes a lamivudina; Biochem Pharma); Adefovir (recusado para aprovação para terapia anti-VIH pela FDA; Gilead Sciences); PREVEON® (Adefovir Dipivoxil, o profármaco activo de adefovir; a sua forma activa é PMEA-pp); TENOFOVIR™ (bis-POC PMPA, um profármaco de PMPA; Gilead); DAPD/DXG (metabolito activo de DAPD; Triangle/Abbott); D-D4FC (relacionado com 3TC, com actividade contra vírus resistente a AZT/3TC); GW420867X (Glaxo Wellcome); ZIAGEN™ (abacavir/159U89; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3'azido-2',3 didesoxiuridina; documento WO 99/66936); e formas de profármaco contendo S-acil-2-tioetilo (SATE) de p-L-FD4C e β-L-FddC (documento WO 98/17281). NNRTI adicionais incluem COACTINON™ (Emivirina/MKC-442, potente NNRTI da classe de HEPT; Triangle/Abbott); CAPRAVIRINE™ (AG-15491/S-1153, um NNRTI da próxima geração com actividade 152 contra vírus contendo a mutação K103N; Agouron); PNU-142721 (tem actividade 20 a 50 vezes maior do que o seu predecessor delavirdina e é activo contra mutantes de K103N; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 e DPC-963 (derivado de segunda geração de efavirenz, concebido para ser activo contra vírus com a mutação de K103N; DuPont); GW-420867X (tem actividade 25 vezes maior do que HBY097 e é activo contra mutantes de K103N; Glaxo Wellcome); CALANOLIDE A (agente de ocorrência natural da árvore do látex; activo contra vírus contendo uma ou ambas as mutações de Y181C e K103N); e Propolis (documento WO 99/49830).
Inibidores de protease adicionais incluem LOPINAVIR™ (ABT378/r; Abbott Laboratories); BMS-232632 (um azapéptido; Bristol-Myres Squibb); TIPRANAVIR™ (PNU-140690, uma di-hidropirona não péptica; Pharmacia & Upjohn); PD-178390 (uma di-hidropirona não peptídica; Parke-Davis) ; BMS 232632 (um azapéptido; Bristol-Myers Squibb); L-756,423 (um análogo de indinavir; Merck); DMP-450 (um composto de ureia cíclico; Avid & DuPont); AG-1776 (um peptidomimético com actividade in vitro contra vírus resistentes a inibidores de protease; Agouron); VX-175/GW-433908 (profármaco de fosfato de amprenavir; Vertex & Glaxo Welcome); CGP61755 (Ciba); e AGENERASE™ (amprenavir; Glaxo Wellcome Inc.) .
Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores de fusão/ligantes de gp41. Os inibidores de fusão/ligantes de gp41 incluem T-20 (um péptido desde os resíduos 643-678 da proteína transmembranar de gp41 de VIH do ectodomínio que se liga a gp41 no seu estado de repouso e previne a transformação para o estado fusogénico; Trimeris) e T-1249 (um inibidor de fusão de segunda geração; Trimeris). 153
Agentes anti-retrovirais adicionais incluem antagonistas de inibidores de fusão/receptor de quimiocina. Os antagonistas de inibidores de fusão/receptor de quimiocina incluem antagonistas de CXCR4, tais como AMD 3100 (um biciclâmico) , SDF-1 e seus análogos e ALX40-4C (um péptido catiónico), T22 (um péptido de 18 aminoácidos; Trimeris) e os análogos T134 e T140 de T22; antagonistas de CCR5, tais como RANTES (9-68), AOP-RANTES, NNY-RANTES e TAK-779; e antagonistas de CCR5/CXCR4, tal como NSC 651016 (um análogo de distamicina) . Também estão incluídos os antagonistas de CCR2B, CCR3 e CCR6. Os agonistas de receptor de quimiocina, tais como RANTES, SDF-1, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, etc., também podem inibir a fusão.
Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores de integrase. Os inibidores de integrase incluem ácidos dicafeoilquínicos (DFQA); ácido L-quicórico (um ácido dicafeoiltartárico (DCTA)); quinalizarina (QLC) e antraquinonas relacionadas; ZINTEVIR™ (AR 177, um oligonucleótido que provavelmente actua na superfície celular, em vez de ser um verdadeiro inibidor de integrase; Arondex); e naftóis, tais como os divulgados no documento WO 98/50347.
Agentes anti-retrovirais adicionais incluem compostos semelhantes a hidroxiureia, tal como BCX-34 (um inibidor purínico de nucleósido fosforilase; Biocryst); inibidores de ribonucleótido redutase, tal como DIDOX™ (Molecules for Health); inibidores de inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH), tal como VX-497 (Vertex); e ácidos micofólicos, tal como CellCept (mofetilo de micofenolato; Roche).
Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores da integrase virai, inibidores da translocação nuclear do genoma 154 virai, tal como compostos de arileno bis(metilcetona) ; inibidores da entrada de VIH, tais como AOP-RANTES, NNY-RANTES, proteína de fusão de RANTES-IgG, complexos solúveis de RANTES e glicosaminoglicanos (GAG) e AMD-3100; inibidores de dedo de zinco da nucleocápside, tal como compostos de ditiano; alvos de Tat e Ver de VIH; e farmacoestimuladores, tal como ABT-378.
Outras terapias anti-retrovirais e terapias adjuntas incluem citocinas e linfocinas, tais como ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, SDF-la, IL-2, PROLEUKIN™ (aldesleucina/L2-7001; Chiron), IL-4, IL-10, IL-12 e IL-13; interferões, tais como IFN alfa2a, IFN alfa2b ou IFN beta; antagonistas de TNF, NFkB, GM-CSF, M-CSF e IL-10; agentes que modulam a activação imunitária, tal como ciclosporina e prednisona; vacinas, tal como Remune™ (HIV Immunogen), APL 400-003 (Apollon), gpl20 recombinante e fragmentos, glicoproteína de envelope recombinante bivalente (B/E), rgpl20CM235, MN rgpl20, SF-2 rgpl20, complexo de gpl20/CD4 solúvel, proteína Delta JR-FL, péptido sintético ramificado derivado do domínio de gpl20 C3/C4 descontínuo, imunogénios competentes para fusão e vacinas de Gag, Pol, Nef e Tat; terapias de base génica, tal como elementos supressores genéticos (GSE; documento WO 98/54366) e intracinas (quimiocinas CC geneticamente modificadas, direccionadas para o ER, para bloquear a expressão de superfície de CCR5 sintetizado de novo (Yang et al., PNAS 94:11567-72 (1997); Chen et al., Nat. Med. 3:1110-16 (1997)); anticorpos, tal como o anticorpo 12G5 anti-CXCR4, os anticorpos 2D7, 5C7, PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PAI 4 anti-CCR, os anticorpos Q4120 e RPA-T4 anti-CD4, o anticorpo 7B11 anti-CCR3, os anticorpos 17b, 48d, 447-52D, 257-D, 268-D e 50.1 anti-gpl20, anticorpos anti-Tat, anticorpos anti-TNF-a e anticorpo monoclonal 33A; agonistas e antagonistas do receptor de arilo de hidrocarboneto (AH), tais como TCDD, 155 3,3 ',4,4',5-pentaclorobifenilo, 3,3 ',4,4 '-tetraclorobifenilo e α-naftoflavona (documento WO 98/30213); e antioxidantes, tal como éster etílico de γ-L-glutamil-L-cisteína (γ-GCE; documento WO 99/56764).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com um agente antivírico. Os agentes antivíricos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, maxamina ou timalfasina.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes anti-infecção oportunista. Os agentes anti-oportunistas que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, ATOVAQUONE™, ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN, CLARITHROMYCIN™, AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™, FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastin/G-CSF), and LEUKINE™ (sargramostim/GM-CSF). As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™ e/ou ATOVAQUONE™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção de pneumonia de Pneumocystis carinii oportunista. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™ e/ou ETHAMBUTOL™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção do complexo de Mycobacterium avium oportunista. As 156 proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com RIFABUTIN™, C LARITHROMYCIN™ e/ou AZITHROMYCIN™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção de Mycobacterium tuberculosis oportunista. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com GANCICLOVIR™, FOSCARNET™ e/ou CIDOFOVIR™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção de citomegalovírus oportunista. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™ e/ou KETOCONAZOLE™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção fúngica oportunista. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com ACYCLOVIR™ e/ou FAMCICOLVIR™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção de vírus herpes simplex de tipo I e/ou tipo II oportunista. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com PYRIMETHAMINE™ e/ou LEUCOVORIN™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção de Toxoplasma gandii oportunista. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser utilizados em qualquer combinação com LEUCOVORIN™ e/ou NEUPOGEN™ para tratar ou prevenir profilacticamente uma infecção bacteriana oportunista.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com um agente antibiótico. Os agentes antibióticos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem amoxicilina, beta-lactamases, aminoglicósidos, betalactâmicos (glicopéptido) , beta-lactamases, Clindamicina, 157 cloranfenicol, cefalosporina, ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrolidas, metronidazole, penicilinas, quinolonas, rapamicina, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazole e vancomicina.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com imunoestimulantes. Os imunoestimulantes que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem levamisole (e. g., ERGAMISOL™), isoprinosina (e. g., INOSIPLEX™), interferões (e. g., interferão alfa) e interleucinas (e. g., IL-2) .
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes imunossupressores. Os agentes imunossupressores que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem esteróides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15-desoxispergualina e outros agentes imunossupressores que actuam pela supressão da função de células T em resposta. Outros agentes imunossupressores que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem prednisolona, metotrexato, talidomida, metoxsaleno, rapamicina, leflunomida, mizoribina (BREDININ™) , broquinar, desoxispergualina e azaspirano (SKF 105685), ORTHOCLONE OKT® 3 (muromonab-CD3), SANDIMMUNE™, NEORAL™, SANGDYA™ (ciclosporina), PROGRAF® (FK506, tacrolimus), CELLCEPT® (motefilo de micofenolato, do qual o metabolito activo é o ácido 158 micofenólico), IMURAN™ (azatioprina), glucocorticosteróides, esteróides adrenocortiçais, tais como DELTASONE™ (prednisona) e HYDELTRASOL™ (prednisolona), FOLEX™ e MEXATE™ (metotrexato), OXSORALEN-ULTRA™ (metoxsaleno) e RAPAMUNE™ (sirolimus). Os imunossupressores podem ser utilizados para prevenir a rejeição de transplantação órgão ou medula óssea.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com uma ou mais preparações intravenosas de globulina imune. As preparações intravenosas de globulina imune que podem ser administradas com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem, mas não estão limitadas a, GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/D™, ATGAM™ (globulina antitimócito) e GAMIMUNE™. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com preparações intravenosas de globulina imune em terapia de transplantação (e. g., transplante de medula óssea).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados isoladamente ou como parte de uma terapia de combinação, in vivo a doentes ou in vitro a células, para o tratamento do cancro. As proteínas de fusão de albumina podem ser administradas repetidamente durante imunoterapia passiva para cancro, tal como terapia de transferência de célula adoptiva para melanoma metastático, como descrito em Dudley et al. (Science Express, 19 de Setembro 2002, em www.scienceexpress.org).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação 159 com um agente anti-inflamatório. Os agentes anti-inflamatórios que podem ser administrados com as proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem corticosteróides (e. g., betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triamcinolona) , fármacos anti-inflamatórios não esteróides (e. g., diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofeno, floctafenina, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenamato, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofénico e tolmetina), assim como anti-histaminas, derivados de ácido aminoarilcarboxílico, derivados de ácido arilacético, derivados de ácido arilbutírico, ácidos arilcarboxílicos, derivados de ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados de ácido salicílico, e-acetamidocapróico, 3-amino-4-hidroxibutírico, bucolome, difenpiramida, nabumetona, nimesulida, perisoxal, pifoxima, tiazinocarboxamidas, ácido S-adenosilmetionina, ácido amixetrina, bendazac, benzidamina, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, orgoteína, oxaceprol, paranilina, proquazona, proxazole e tenidap.
As composições da invenção podem ser administradas isoladamente ou em combinação com um agente anti-angiogénico. Os agentes anti-angiogénicos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não estão limitados a, Angiostatina (Entremed, Rockville, MD), Troponina-1 (Boston Life Sciences, Boston, MA) , Factor anti-Invasivo, ácido retinóico e seus derivados, paclitaxel (Taxol), Suramina, Inibidor Tecidular de Metaloproteinase-1, Inibidor Tecidular de Metaloproteinase-2, VEGI, Inibidor-1 do Activador do Plasminogénio, Inibidor-2 do 160
Activador do Plasminogénio e diversas formas dos metais de transição do "grupo d" mais leves.
Os metais de transição do "grupo d" mais leves incluem, por exemplo, espécies de vanádio, molibdénio, tungsténio, titânio, nióbio e tântalo. Essas espécies de metais de transição podem formar complexos de metais de transição. Os complexos adequados das espécies de metais de transição acima mencionadas incluem oxo-complexos de metais de transição.
Exemplos representativos de complexos de vanádio incluem oxo-complexos de vanádio, tais como complexos de vanadato e vanadilo. Complexos de vanadato adequados incluem complexos de metavanadato e ortovanadato, tais como, por exemplo, metavanadato de amónio, metavanadato de sódio e ortovanadato de sódio. Complexos de vanadilo adequados incluem, por exemplo, acetilacetonato de vanadilo e sulfato de vanadilo, incluindo hidratos de sulfato de vanadilo, tais como mono- e tri-hidratos de sulfato de vanadilo.
Exemplos representativos de complexos de tungsténio e molibdénio também incluem oxo-complexos. Oxo-complexos de tungsténio adequados incluem complexos de tungstato e óxido de tungsténio. Complexos de tungstato adequados incluem tungstato de amónio, tungstato de cálcio, tungstato de sódio di-hidratado e ácido túngstico. Óxidos de tungsténio adequados incluem óxido de tungsténio (IV) e óxido de tungsténio (VI). Oxo-complexos de molibdénio adequados incluem complexos de molibdato, óxido de molibdénio e molibdenilo. Complexos de molibdato adequados incluem molibdato de amónio e seus hidratos, molibdato de sódio e seus hidratos e molibdato de potássio e seus hidratos. Óxidos de molibdénio adequados incluem óxido de molibdénio (VI), óxido 161 de molibdénio (VI) e ácido molíbdico. Complexos de molibdenilo adequados incluem, por exemplo, acetilacetonato de molibdenilo. Outros complexos de tungsténio e molibdénio adequados incluem derivados hidroxo derivados de, por exemplo, glicerol, ácido tartárico e açúcares.
Uma ampla variedade de outros factores anti-angiogénicos também pode ser utilizada. Exemplos representativos incluem factor 4 plaquetário; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatada (preparada a partir de carapaças de caranguejo das neves), (Murata et al., Câncer Res. 51:22-26, (1991)); Complexo de Polissacárido de Peptidoglicano Sulfatado (SP-PG) (a função deste composto pode ser melhorada pela presença de esteróides, tais como estrogénio e citrato de tamoxifeno); Estaurosporina; moduladores de metabolismo de matriz, incluindo, por exemplo, análogos de prolina, cis-hidroxiprolina, d,L-3,4-desidroprolina, Tiaprolina, alfa, alfa-dipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; Interferões; soro de 2 Macroglobulina; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); Quimostatina (Tomkinson et al., Biochem J. 286:475-480, (1992)); Tetradecassulfato de Ciclodextrina; Eponemicina; Camptotecina; Fumagilina (Ingber et al., Nature 348:555-557, (1990)); Tiomalato Sódico de Ouro ("GST"; Matsubara e Ziff, J. Clln. Invest. 79:1440-1446, (1987)); soro de anticolagenase; alfa2-antiplasmina (Holmes et al., J. Blol. Chem. 262(4):1659-1664, (1987)); Bisantreno (National Câncer Institute); Lobenzarit dissódico (ácido N-(2)-carboxifenil-4-cloroantronilico dissódico ou "CCA"; (Takeuchi et al., Agents Actions 36:312-316, (1992)); e inibidores de metaloproteinase, tal como BB94. 162
Factores anti-angiogénicos adicionais que também podem ser utilizados incluem Talidomida, (Celgene, Warren, NJ) ; esteróide Angiostático; AGM-1470 (H. Brem e J. Folkman, J Pediatr. Surg. 28:445-51 (1993)); um antagonista de integrina alfa v beta 3 (C. Storgard et al. , J Clin. Invest. 103:47-54 (1999)); carboxinaminolmidazole; Carboxiamidotriazole (CAI) (National Câncer Institute, Bethesda, MD); Conbretastatina A-4 (CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); Esqualamina (Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL); ZD-0101 AstraZeneca (Londres, UK) ; APRA (CT2584); Benefina, Birostatina-1 (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101; Dexrazoxano (ICRF187); DMXAA; Endostatina; Flavopridiol; Genesteina; GTE; ImmTher; Iressa (ZD1839); Octreotida (Somatostatina); Panretina; Penacilamina; Photopoint; PI-88; Prinomastat (AG-3340) Purlitina; Suradista (FCE26644); Tamoxifeno (Nolvadex); Tazaroteno; Tetratiomolibdato; Xeloda (Capecitabina); e 5-Fluorouracilo.
Os agentes anti-angiogénicos que podem ser administrados em combinação com os compostos da invenção podem funcionar através de uma variedade de mecanismos, incluindo inibição de proteólise da matriz extracelular, bloqueio da função de moléculas de adesão de matriz extracelular de célula endotelial, pela antagonização da função de indutores de angiogénese, tal como factores de crescimento e inibição de receptores de integrina expressos em células endoteliais em proliferação. Exemplos de inibidores anti-angiogénicos que interferem com proteólise de matriz extracelular e que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem AG-3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven, CT), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ), CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ) , Marimastat (British Biotech, Oxford, UK) e 163
Metastat (Aetema, St-Foy, Quebeque). Exemplos de inibidores anti-angiogénicos que actuam pelo bloqueio da função de moléculas de adesão de matriz extracelular de célula endotelial e que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem EMD-121974 (Merck KcgaA Darmstadt, Alemanha) e Vitaxina (Ixsys, La Jolla, CA/Medimmune, Gaithersburg, MD). Exemplos de agentes anti-angiogénicos que actuam pela antagonização ou inibição directa de indutores de angiogénese e que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem Angiozima (Ribozima, Boulder, CO) , anticorpo Anti-VEGF (Genentech, S. São Francisco, CA), PTK-787/ZK-225846 (Novartis, Basileia, Suíça), SU-101 (Sugen, S. São Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ) e SU-6668 (Sugen). Outros agentes anti-angiogénicos actuam para inibirem indirectamente a angiogénese. Exemplos de inibidores indirectos da angiogénese que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem IM-862 (Cytran, Kirkland, WA) , Interferão alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ) , e polissulfato de Pentosano (Universidade de Georgetown, Washington, DC). A utilização de composições da invenção em combinação com agentes anti-angiogénicos pode ser contemplada para tratamento, prevenção e/ou melhoramento de uma doença auto-imune, tal como, por exemplo, uma doença auto-imune aqui descrita. A utilização de composições da invenção em combinação com agentes anti-angiogénicos pode ser contemplada para tratamento, prevenção e/ou melhoramento de artrite. A utilização de composições da invenção em combinação com agentes anti-angiogénicos pode ser contemplada para tratamento, prevenção e/ou melhoramento de artrite reumatóide. 164
Os polinucleótidos codificando um polipéptido da presente invenção podem ser administrados em combinação com uma proteína angiogénica ou polinucleótidos codificando uma proteína angiogénica. Exemplos de proteínas angiogénicas que podem ser administradas com as composições da invenção incluem factores de crescimento de fibroblastos acídicos e básicos, VEGF-1, VEGF-2, VEGF-3, factor de crescimento epidérmico alfa e beta, factor de crescimento de célula endotelial derivado de plaquetas, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de necrose tumoral alfa, factor de crescimento de hepatócitos, factor de crescimento semelhante a insulina, factor de estimulação de colónias, factor de estimulação de colónias de macrófagos, factor de estimulação de colónias de granulócitos/macrófagos e óxido nítrico sintase.
As composições da invenção podem ser administradas em combinação com um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem agentes alquilantes, tais como iperites de azoto (por exemplo, Mecloretamina, ciclofosfamida, Ciclofosfamida Ifosfamida, Melfalano (L-sarcolisina) e Clorambucilo) , etileniminas e metilmelaminas (por exemplo, Hexametilmelamina e Tiotepa), sulfonatos de alquilo (por exemplo, Bussulfano), nitrosoureias (por exemplo, Carmustina (BCNU), Lomustina (CCNU), Semustina (metil-CCNU) e Estreptozocina (estreptozotocina)), triazenos (por exemplo, Dacarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazole carboxamida)), análogos de ácido fólico (por exemplo, Metotrexato (ametopterina)) , análogos de pirimidina (por exemplo, Fluorouacilo (5-fluorouracilo; 5-FU), Floxuridina (fluorodesoxiuridina; FudR) e Citarabina (citosina arabinósida)), análogos purínicos e inibidores relacionados (por 165 exemplo, Mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), Tioguanina (6-tioguanina; TG) e Pentostatina (2'-desoxicoformicina) ) , alcaloides da vinca (por exemplo, Vinblastina (VLB, sulfato de vinblastina)) e Vincristina (sulfato de vincristina)) , epipodofilotoxinas (por exemplo, Etoposido e Teniposido), antibióticos (por exemplo, Dactinomicina (actinomicina D) , Daunorubicina (daunomicina; rubidomicina) , Doxorubicina, Bleomicina, Plicamicina (mitramicina) e Mitomicina (mitomicina C) , enzimas (por exemplo, L-Asparaginase) , modificadores de resposta biológica (por exemplo, Interferão alfa e interferão alfa-2b), compostos de coordenação de platina (por exemplo, Cisplatina (cis-DDP) e Carboplatina), antracenodiona (Mitoxantrona) , ureias substituídas (por exemplo, Hidroxiureia), derivados de metil-hidrazina (por exemplo, Procarbazina (N-metil-hidrazina; MIH), adrenocorticosteróides (por exemplo, Prednisona), progestinas (por exemplo, caproato de Hidroxiprogesterona, Medroxiprogesterona, acetato de Medroxiprogesterona e acetato de Megestrol) , estrogénios (por exemplo, Dietilestilbestrol (DES), difosfato de Dietilestilbestrol, Estradiol e Etinilestradiol) , anti-estrogénios (por exemplo, Tamoxifeno) , androgénios (proprionato de Testosterona e Fluoximesterona), anti-androgénios (por exemplo, Flutamida), análogos de hormona de libertação de gonadotropina (por exemplo, Leuprolida), outras hormonas e análogos de hormonas (por exemplo, metiltestosterona, estramustina, fosfato de estramustina sódica, clorotrianiseno e testolactona) e outros (por exemplo, dicarbazina, ácido glutâmico e mitotano) .
As composições da invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais dos seguintes fármacos: infliximab (também conhecido como Remicade™, Centocor, Inc.), Trocade 166 (Roche, RO-32-3555), Leflunomida (também conhecido como Arava™, da Hoechst Marion Roussel), Kineret™ (um antagonista do Receptor de IL-1, também conhecido como Anakinra, da Amgen, Inc.)
As composições da invenção podem ser administradas em combinação com CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona) ou combinação de um ou mais dos componentes de CHOP. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-CD20 monoclonais humanos. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com anticorpos anti-CD20 e CHOP, ou anticorpos anti-CD20 e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida e/ou prednisona. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com Rituximab. As composições da invenção podem ser administradas com Rituximab e CHOP ou Rituximab e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida e/ou prednisona. As composições da invenção podem ser administradas em combinação com tositumomab. As composições da invenção podem ser administradas com tositumomab e CHOP ou tositumomab e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida e/ou prednisona. Os anticorpos anti-CD20 podem, opcionalmente, estar associados a radioisótopos, toxinas ou profármacos citotóxicos.
As composições da invenção podem ser administradas em combinação com Zevalin™. As composições da invenção podem ser administradas com Zevalin™ e CHOP ou Zevalin™ e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamida e/ou prednisona. A Zevalin™ pode 167 estar associada a um ou mais radioisótopos. Os isótopos podem ser 90Y e niIn.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com citocinas. As citocinas que podem ser administradas com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN gama e TNF alfa. As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados com qualquer interleucina, incluindo, mas não limitada a, IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16; 1L-17, IL-18, IL-19, IL-20 e IL-21 .
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com membros da família de TNF. As moléculas de TNF, relacionadas com TNF ou semelhantes a TNF que podem ser administradas com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem formas solúveis de TNF alfa, linfotoxina alfa (LT alfa, também conhecido como TNF beta) , LT beta (verificado no complexo de heterotrímero LT-alfa2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4- 1BBL , DcR3, OX40L, TNF gama (Publicação Internacional N° WO 96/14328), AIM-I (Publicação Internacional N° WO 97/33899), endocina alfa (Publicação Internacional N° WO 98/07880), OPG e neutrolina alfa (Publicação Internacional N° WO 98/18921, 0X40 e factor de crescimento nervoso (NGF) e formas solúveis de Fas, CD30, CD27, CD40 e 4-IBB, TR2 (Publicação Internacional N° WO 96/34095), DR3 (Publicação Internacional N° WO 97/33904), DR4 (Publicação Internacional N° WO 98/32856), TR5 (Publicação Internacional N° WO 98/30693), 168 TRANK, TR9 (Publicação Internacional N° WO 98/56892), TRIO (Publicação Internacional N° WO 98/54202), 312C2 (Publicação
Internacional N° WO 98/06842) e TR12 e formas solúveis de CD154, CD70 e CD153.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com proteínas angiogénicas. As proteínas angiogénicas gue podem ser administradas com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem Factor de Crescimento Derivado de Glioma (GDGF), como divulgado na Patente Europeia Número EP-399816; Factor A de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-A), como divulgado na Patente Europeia Número EP-682110;
Factor B de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-B), como divulgado na Patente Europeia Número EP-282317; Factor de Crescimento Placentário (PICF), como divulgado na Publicação Internacional Número WO 92/06194; Factor 2 de Crescimento Placentário (PIGF-2), como divulgado em Hauser et al. , Growth Factors, 4:259-268 (1993); Factor de Crescimento Endotelial
Vascular (VEGF), como divulgado na Publicação Internacional Número WO 90/13649; Factor A de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-A), como divulgado na Patente Europeia Número EP-506477;
Factor 2 de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-2), como divulgado na Publicação Internacional Número 96/39515; Factor B de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-3); Factor B-186 de
Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-B186), como divulgado na Publicação Internacional Número WO 96/26736; Factor D de
Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-D), como divulgado na
Publicação Internacional Número WO 98/02543; Factor D de
Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-D), como divulgado na
Publicação Internacional Número WO 98/07832; e Factor E de 169
Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-E), como divulgado na Patente Alemã Número DE19639601.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com Factores de Crescimento de Fibroblastos. Os Factores de Crescimento de Fibroblastos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 e FGF-15.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com factores de crescimento hematopoiéticos. Os factores de crescimento hematopoiéticos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem, mas não estão limitados a, factor de estimulação de colónias de macrófagos granulocíticos (GM-CSF) (sargramostim, LEUKINE™, PROKINE™), factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) (filgrastim, NEUPOGEN™) , factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF, CSF-1) eritropoietina (epoetina alfa, EPOGEN™, PROCRIT™), factor de células estaminais (SCF, ligando de c-kit, factor de Steel), factor de estimulação de colónias de megacariócitos, PIXY321 (uma proteína de fusão de GMCSF/IL-3), interleucinas, especialmente qualquer uma ou mais de IL—1 até IL-12, interferão gama ou trombopoietina.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da presente invenção podem ser administrados em combinação com bloqueadores adrenérgicos, tais como, por exemplo, acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, labetalol, 170 metoprolol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol e timolol.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com um fármaco antiarrítmico (e. g., adenosina, amidoarona, bretílio, digitalis, digoxina, digitoxina, diliazem, disopiramida, esmolol flecainida, lidocaína, mexiletina, moricizina, fenitoína, procainamida, N-acetilprocainamida, propafenona, propranolol, quinidina, sotalol, tocainida e verapamilo).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes diuréticos, tais como agentes de inibição de anidrase carbónica (e. g., acetazolamida, diclorfenamida e metazolamida), diuréticos osmóticos (e. g., glicerina, isosorbida, manitol e ureia), diuréticos que inibem o simporte de Na+-K+-2C1“ (e. g., furosemida, bumetanida, azosemida, piretanida, tripamida, ácido etacrínico, muzolimina e torsemida), tiazida e diuréticos semelhantes a tiazida (e. g., bendroflumetiazida, benzotiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, politiazida, tricormetiazida, clortalidona, indapamida, metolazona e quinetazona), diuréticos poupadores de potássio (e. g., amilorida e triamtereno) e antagonistas do receptor de mineralcorticóides (e. g., espironolactona, canrenona e canrenoato de potássio).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com tratamentos para distúrbios endócrinos e/ou de desequilíbrio hormonal. Os tratamentos para distúrbios endócrinos e/ou de desequilíbrio hormonal incluem 127I, isótopos radioactivos de iodo, tais como 171 131I e 123Ι; hormona do crescimento recombinante, tal como HUMATROPE™ (somatropina recombinante); análogos da hormona do crescimento, tal como PROTROPIN™ (somatrem); agonistas de dopamina, tal como PARLODEL™ (bromocriptina) ; análogos de somatostatina, tal como SANDOSTATIN™ (octreotida); preparações de gonadotropina, tais como PREGNYL™, A.P.L.™ e PROFASI™ (gonadotropina coriónica (CG)), PERGONAL™ (menotropinas) e METRODIN™ (urofolitropina (uFSH)); preparações de hormona de libertação de gonadotropina humana sintética, tais como FACTREL™ e LUTREPULSE™ (cloridrato de gonadorelina); agonistas de gonadotropina sintética, tais como LUPRON™ (acetato de leuprolida), SUPPRELIN™ (acetato de histrelina), SYNAREL™ (acetato de nafarelina) e ZOLADEX™ (acetato de goserelina); preparações sintéticas de hormona de libertação de tirotropina, tais como RELEFACT TRH™ e THYPINONE™ (protirelina); TSH humana recombinante, tal como THYROGEN™; preparações sintéticas dos sais de sódio dos isómeros naturais de hormonas da tiróide, tais como L-T4™, SYNTHROID™ e LEVOTHROID™ (levotiroxina sódica), L-T3™, CYTOMEL™ e TRIOSTAT™ (liotiroina sódica) e THYROLAR™ (liotrix); compostos anti-tiróide, tais como 6-n-propiltiouracilo (propiltiouracilo), l-metil-2-mercaptoimidazole e TAPAZOLE™ (metimazole) , NEO-MERCAZOLE™ (carbimazole); antagonistas de receptor beta-adrenérgico, tais como propranolol e esmolol; bloqueadores de canais de Ca2+; dexametasona e agentes de contraste radiológicos iodados, tais como TELEPAQUE™ (ácido iopanóico) e ORAGRAFIN™ (ipodato de sódio) .
Tratamentos adicionais para distúrbios endócrinos e/ou de desequilíbrio hormonal incluem estrogénios ou estrogénios conjugados, tais como ESTRACE™ (estradiol), ESTINYL™ (etinilestradiol), PREMARIN™, ESTRATAB™, ORTHO-EST™, OGEN™ e 172 estropipato (estrona) , ESTROVIS™ (quinestrol), ESTRADERM™ (estradiol), DELESTROGEN™ e VALERGEN™ (valerato de estradiol), DEPO-ESTRADIOL CYPIONATE™ e ESTROJECT LA™ (cipionato de estradiol); anti-estrogénios, tais como NOLVADEX™ (tamoxifeno) , SEROPHENE™ e CLOMID™ (clomifeno); progestinas, tal como DURALUTIN™ (caproato de hidroxiprogesterona), mpa™ e DEPO-PROVERA™ (acetato de medroxiprogesterona), PROVERÁ™ e CYCRIN™ (MPA), MEGACE™ (acetato de megestrol), NORLUTIN™ (noretindrona) e NORLUTATE™ e AYGESTIN™ (acetato de noretindrona); implantes de progesterona, tal como NORPLANT SYSTEM™ (implantes subdérmicos de norgestrel); antiprogestinas, tal como RU 486™ (mifepristona); contraceptivos hormonais, tais como ENOVID™ (noretinodrel mais mestranol), PROGESTASERT™ (dispositivo intra-uterino que liberta progesterona), LOESTRIN™, BREVICON™, MODICON™, GENORA™, NELONA™, NORINYL™, OVACON-35™ e OVACON-50™ (etinilestradiol/noretindrona), LEVLEN™, NORDETTE™, TRI-LEVLEN™ e TRIPHASIL-21™ (etinilestradiol/levonorgestrel) LO/OVRAL™ e OVRAL™ (etinilestradiol/norgestrel), DEMULEN™ (etinilestradiol/diacetato de etinodiol), NORINYL™, ORTHO-NOVUM™, NORETHIN™, GENORA™, e NELOVA™ (noretindrona/mestranol) , DESOGEN™ e ORTHO-CEPT™ (etinilestradiol/desogestrel) , ORTHO-CYCLEN™ e ORTHO-TRICYCLEN™ (etinilestradiol/norgestimato), MICRONOR™ e NOR-QD™ (noretindrona) e OVRETTE™ (norgestrel).
Tratamentos adicionais para distúrbios endócrinos e/ou de desequilíbrio hormonal incluem ésteres de testosterona, tais como acetato de metenolona e undecanoato de testosterona; androgénios parentéricos e orais, tais como TESTOJECT-50™ (testosterona), TESTEX™ (propionato de testosterona), DELATESTRYL™ (enantato de testosterona), DEPO-TESTOSTERONE™ (cipionato de testosterona), DANOCRINE™ (danazol), HALOTESTIN™ 173 (fluoximesterona) , ORETON METHYL™, TESTRED™ e VIRILON™ (metiltestosterona) e OXANDRIN™ (oxandrolona); sistemas transdérmicos de testosterona, tal como TESTODERM™; antagonista de receptor de androgénio e inibidores de 5-alfa-redutase, tais como ANDROCUR™ (acetato de ciproterona), EULEXIN™ (flutamida) e PROSCAR™ (finasterida); preparações de hormona adrenocorticotrópica, tal como CORTROSYN™ (cosintropina); esteróides adrenocorticais e seus análogos sintéticos, tais como ACLOVATE™ (dipropionato de alclometasona), CYCLOCORT™ (anicinonida), BECLOVENT™ e VANCERIL™ (dipropionato de beclometasona), CELESTONE™ (betametasona), BENISONE™ e UTICORT™ (benzoato de betametasona), DIPROSONE™ (dipropionato de betametasona), CELESTONE PHOSPHATE™ (fosfato de sódio de betametasona), CELESTONE SOLUSPAN™ (fosfato e acetato de sódio de betametasona) , BETA-VAL™ e VALISONE™ (valerato de betametasona), TEMOVATE™ (propionato de clobetasol), CLODERM™ (pivalato de clocortolona), CORTEF™ e HYDROCORTONE™ (cortisol (hidrocortisona)), HYDROCORTONE ACETATE™ (acetato de cortisol (hidrocortisona)), LOCOID™ (butirato de cortisol (hidrocortisona)), HYDROCORTONE PHOSPHATE™ (fosfato de sódio de cortisol (hidrocortisona)), A-HYDROCORT™ e SOLU CORTEF™ (succinato de sódio de cortisol (hidrocortisona)), WESTCORT™ (valerats de cortisol (hidrocortisona)), CORTISONE ACETATE™ (acetato de cortisona), DESOWEN™ e TRIDESILON™ (desonida), TOPICORT™ (desoximetasona), DECADRON™ (dexametasona), DECADRON LA™ (acetato de dexametasona), DECADRON PHOSPHATE™ e HEXADROL PHOSPHATE™ (fosfato de sódio de dexametasona), FLORONE™ e MAXIFLOR™ (diacetato de diflorasona), FLORINEF ACETATE™ (acetato de fludrocortisona), AEROBID™ e NASALIDE™ (flunisolida), FLUONID™ e SYNALAR™ (acetonido de fluocinolona), LIDEX™ (fluocinonida), FLUOR-OP™ e FML™ (fluommetolona), CORDRAN™ (flurandrenolida), HALOG™ (halcinonida), HMS LIZUIFILM™ 174 (medrisona), MEDROL™ (metilprednisolona) , DEPO-MEDROL™ e MEDROL ACETATE™ (acetato de metilprednisona), A-METHAPRED™ e SOLUMEDROL™ (succinato de sódio de metilprednisolona), ELOCON™ (furoato de mometasona), HALDRONE™ (acetato de parametasona), DELTA-CORTEF™ (prednisolona), ECONOPRED™ (acetato de prednisolona), HYDELTRASOL™ (fosfato de sódio de prednisolona), HYDELTRA-T.B.A™ (tebutato de prednisolona), DELTASONE™ (prednisona), ARISTOCORT™ e KENACORT™ (triamcinolona), KENALOG™ (acetomida de triamcinolona), ARISTOCORT™ e KENACORT DIACETATE™ (diacetato de triamcinolona) e ARISTOSPAN™ (hexacetonida de triamcinolona); inibidores da biossintese e acção de esteróides adrenocorticais, tais como CYTADREN™ (aminoglutetimida) , NIZORAL™ (cetoconazol), MODRASTANE™ (trilostano) e METOPIRONE™ (metirapona); insulina bovina, porcina ou humana ou suas misturas; análogos de insulina; insulina humana recombinante, tais como HUMULIN™ e NOVOLIN™; agentes hipoglicémicos orais, tais como ORAMIDE™ e ORINASE™ (tolbutamida), DIABINESE™ (clorpropamida), TOLAMIDE™ e TOLINASE™ (tolazamida), DYMELOR™ (aceto-hexamida), glibenclamida, MICRONASE™, DIBETA™ e GLYNASE™ (gliburida), GLUCOTROL™ (glipizida) e DIAMICRON™ (gliclazida), GLUCOPHAGE™ (metformina) , ciglitazona, pioglitazona e inibidores de alfa-glucosidase; glucagom bovino ou porcino; somatostatinas, tal como SANDOSTATIN™ (octreotida); e diazoxidas, tal como PROGLYCEM™ (diazoxida).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com tratamentos para distúrbios da motilidade uterina. Os tratamentos para distúrbios da motilidade uterina incluem fármacos de estrogénio, tais como estrogénios conjugados (e. g., PREMARIN® e ESTRATAB®) , estradióis (e. g., CLIMARA® e ALORA®) , estropipato e clorotrianiseno; fármacos de progestina (e. g., AMEN® 175 (medroxiprogesterona), MICRONOR® (acetato de noretidrona), PROMETRIUM®, progesterona e acetato de megestrol); e terapias de combinação de estrogénio/progesterona, tais como, por exemplo,
TM estrogénios conjugados/medroxiprogesterona (e. g., PREMPRO e PREMPHASE®) e acetato de noretindrona/etinilestradiol (e. g., FEMHRT™).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com fármacos eficazes no tratamento de deficiência de ferro e anemias hipocrómicas, incluindo, mas não limitadas a, sulfato ferroso (sulfato de ferro, FEOSOL™), fumarato ferroso (e. g., FEOSTAT™) , gluconato ferroso (e. g., FERGON™), complexo de polissacárido-ferro (e. g., NIFEREX™) , injecção de dextrano de ferro (e. g., INFED™), sulfato cúprico, piroxidina, riboflavina, Vitamina B12, injecção de ciancobalamina (e. g., REDISOL™, RUBRAMIN PC™), hidroxocobalamina, ácido fólico (e. g. , FOLVITE™), leucovorina (ácido folínico, 5-CHOH4PteGlu, factor citrovorum) ou WELLCOVORIN (sal de Cálcio ou leucovorina), transferrina ou ferritina.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes utilizados para tratar distúrbios psiquiátricos. Os fármacos psiquiátricos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem agentes antipsicóticos (e. g., clorpromazina, clorprotixeno, clozapina, flufenazina, haloperidol, loxapina, mesoridazina, molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, quetiapina, risperidona, tioridazina, tiotixeno, trifluoperazina e triflupromazina), agentes antimânicos (e. g., carbamazepina, divalproex sódico, carbonato de lítio e citrato de lítio), 176 antidepressivos (e. g., amitriptilina, amoxapina, bupropion, citalopram, clomipramina, desipramina, doxepina, fluvoxamina, fluoxetina, imipramina, isocarboxazide, maprotilina, mirtazapina, nefazodona, nortriptilina, paroxetina, fenelzina, protriptilina, esetralina, tranilcipromina, trazodona, trimipramina e venlafaxina), agentes anti-ansiedade (e. g., alprazolam, buspirona, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, halazepam, lorazepam, oxazepam e prazepam) e estimulantes (e. g., anfetamina d, metilfenidato e pemolina).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes utilizados para tratar distúrbios neurológicos. Os agentes neurológicos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem agentes antiepilépticos (e. g., carbamazepina, clonazepam, etossuximida, fenobarbital, fenitoína, primidona, ácido valpróico, divalproex sódico, felbamato, gabapentina, lamotrigina, levetiracetam, oxcarbazepina, tiagabina, topiramato, zonisamida, diazepam, lorazepam e clonazepam), agentes antiparkinsonianos (e. g., levodopa/carbidopa, selegilina, amantidina, bromocriptina, pergolida, ropinirole, pramipexole, benztropina; biperideno; etopropazina; prociclidina; tri-hexifenidilo, tolcapona) e terapêuticos de ALS (e. g., riluzole).
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes vasodilatadores e/ou agentes de bloqueio de canais de cálcio. Os agentes vasodilatadores que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem inibidores da Enzima de Conversão de Angiotensina (ACE) 177 isoxsuprina (e. g., papaverina, isoxsuprina, benazepril, captopril, cilazapril, enalapril, enalaprilato, fosinopril, lisinopril, moexipril, perindopril quinapril, ramipril, espirapril, trandolapril e nilidrina) e nitratos (e. g. , dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida e nitroglicerina) . Exemplos de agentes de bloqueio de canais de cálcio que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção incluem, mas não estão limitados a, amlodipina, bepridil, diltiazem, felodipina, flumarizina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina e verapamilo.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com tratamentos para distúrbios gastrointestinais. Os tratamentos para os distúrbios gastrointestinais que podem ser administrados com a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido da invenção incluem antagonistas do receptor de H2 histamina (e. g., TAGAMET™ (cimetidina), ZANTAC™ (ranitidina), PEPCID™ (famotidina) e AXID™ (nizatidina)); inibidores de H+, K+ ATPase (e. g., PREVACID™ (Iansoprazole) e PRILOSEC™ (omeprazole)); compostos de Bismuto (e. g., PEPTO-BISMOL™ (subsalicilato de bismuto) e DE-NOL™ (subcitrato de bismuto)); diversos antácidos; sucralfato; análogos de prostaglandina (e. g., CYTOTEC™ (misoprostol) ) ; antagonistas colinérgicos muscarínicos; laxantes (e. g., laxantes surfactantes, laxantes estimulantes, soro fisiológico e laxantes osmóticos); agentes antidiarreicos (e. g., LOMOTIL™ (difenoxilato) , MOTOFEN™ (difenoxina) e IMODIUM™ (cloridrato de loperamida)), análogos sintéticos de somatostatina, tal como SANDOSTATIN™ (octreotida), agentes antieméticos (e. g., ZOFRAN™ (ondansetron), KYTRIL™ (cloridrato de granisetron), tropisetron, dolasetron, metoclopramida, clorpromazina, perfenazina, 178 proclorperazina, prometazina, tietilperazina, triflupromazina, domperidona, haloperidol, droperidol, trimetobenzamida, dexametasona, metilprednisolona, dronabinol e nabilona); antagonistas D2 (e. g., metoclopramida, trimetobenzamida e clorpromazina); sais biliares; ácido quenodesoxicólico; ácido ursodesoxicólico; e preparações de enzimas pancreáticas, tais como pancreatina e pancrelipase.
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos da invenção podem ser administrados em combinação com outros regimes terapêuticos ou profilácticos, tal como, por exemplo, terapia de radiação.
Também é divulgada uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas compreendendo proteínas de fusão de albumina da invenção. Opcionalmente associada a esse(s) recipiente(s) pode estar uma advertência na forma prescrita por uma agência governamental regulando a preparação, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cuja advertência reflecte a aprovação pela agência de preparação, utilização ou venda para administração humana.
Um método de administração local é por injecção directa. Uma proteína de fusão de albumina da presente invenção que pode estar complexada com um veículo de distribuição é administrada por injecção directa ou localmente na área das artérias. A administração de uma composição localmente na área das artérias refere-se a injectar a composição centímetros e, de um modo preferido, milímetros dentro das artérias. 179 terapêuticas
As composições terapêuticas úteis na administração sistémica incluem proteínas de fusão da presente invenção complexadas a um veículo de distribuição direccionada da presente invenção. Os veículos de distribuição adequados para utilização com a administração sistémica compreendem lipossomas, compreendendo ligandos para direccionamento do veículo para um sítio particular.
Os veículos de distribuição adequados para utilização com a administração sistémica compreendem lipossomas, compreendendo proteínas de fusão de albumina da invenção para direccionamento do veículo para um sítio particular.
As proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser administradas a qualquer animal, de um modo preferido, a mamíferos e aves. Os mamíferos incluem humanos, cães, gatos, murganhos, ratos, coelhos, ovelhas, gado bovino, cavalos e porcos.
Actividades Biológicas
As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser utilizados em ensaios para testar para uma ou mais actividades biológicas. Se uma proteína de fusão de albumina e/ou polinucleótido exibir uma actividade num ensaio particular, é provável que a proteína Terapêutica correspondendo à proteína de fusão possa estar envolvida na doença associada à actividade biológica. Deste modo, a proteína de fusão poderia ser utilizada para tratar a doença associada. 180
Em formas de realização preferidas, a presente invenção abrange a utilização das proteínas de fusão de albumina definidas nas reivindicações para o tratamento de uma doença ou distúrbio listado na coluna "Indicação Preferida Y " da Tabela 1, compreendendo administrar a um doente, no qual esse tratamento de prevenção ou melhoramento é desejado, uma proteína de fusão de albumina da invenção que compreende a porção de proteína Terapêutica correspondendo à proteína Terapêutica divulgada na coluna "Proteína X Terapêutica" da Tabela I (na mesma fileira que a doença ou distúrbio a ser tratado é listado na coluna "Indicação Preferida Y" da Tabela 1) numa quantidade eficaz para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou distúrbio.
Numa forma de realização preferida acidional, a presente invenção abrange a utilização das proteínas de fusão de albumina definidas nas reivindicações para o tratamento de uma doença ou distúrbio listado para uma proteína Terapêutica particular na coluna "Indicação Preferida Y" da Tabela 1, compreendendo administrar a um doente, no qual esse tratamento, prevenção ou melhoramento é desejado, uma proteína de fusão de albumina da invenção que compreende a porção de proteína Terapêutica correspondendo à proteína Terapêutica, para a qual as indicações nos Exemplos são relacionadas, numa quantidade eficaz para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou distúrbio.
Estão especificamente contempladas proteínas de fusão de albumina produzidas por uma célula quando codificadas pelos polinucleótidos que codificam a SEQ ID N°: Y. Quando estes polinucleótidos são utilizados para expressar as proteínas codificadas a partir de uma célula, a secreção natural da célula e as etapas de processamento produzem uma proteína que está desprovida da sequência sinal explicitamente listada nas colunas 181 4 e/ou 11 da Tabela 2. A sequência de aminoácidos específica da sequência sinal listada é mostrada na descrição ou é bem conhecida na técnica. Deste modo, as formas de realização muito preferidas da presente invenção incluem a proteína de fusão de albumina produzida por uma célula (que seria desprovida da sequência líder mostrada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2). Também são muito preferidos os polipéptidos compreendendo a SEQ ID N°: Y, sem a sequência líder específica listada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2. As composições compreendendo estas duas formas de realização preferidas, incluindo composições farmacêuticas, também são preferidas. Estas proteínas de fusão de albumina estão especificamente contempladas para tratar, prevenir ou melhorar uma doença ou distúrbio listado para uma proteína Terapêutica particular na coluna "Indicação Preferida:Y" da Tabela 1.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão da presente invenção podem ser utilizadas no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou distúrbios referentes a doenças e distúrbios do sistema endócrino (ver, por exemplo, a secção "Distúrbios Endócrinos" abaixo), do sistema nervoso (ver, por exemplo, a secção "Distúrbios Neurológicos" abaixo), do sistema imunitário (ver, por exemplo, a secção "Actividade Imunitária" abaixo), sistema cardiovascular (ver, por exemplo, a secção "Distúrbios Cardiovasculares" abaixo), sistema reprodutivo (ver, por exemplo, a secção "Distúrbios do Sistema Reprodutivo" abaixo) e/ou sistema digestivo (ver, por exemplo, a secção "Distúrbios Gastrointestinais" abaixo)).
Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão de albumina da presente invenção pode ser utilizada para 182 diagnosticar e/ou prognosticar doenças e/ou distúrbios associados a(s) tecido(s) no(s) qual(quais) o gene correspondendo à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da invenção é expresso.
Deste modo, as proteínas de fusão da invenção e polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção são úteis no diagnóstico, detecção e/ou tratamento de doenças e/ou distúrbios associados a actividades que incluem, mas não estão limitadas a, activação de pro-hormona, actividade de neurotransmissor, sinalização celular, proliferação celular, diferenciação celular e migração celular.
Mais em geral, as proteínas de fusão da invenção e polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser úteis para o diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou distúrbios associados aos seguintes sistemas.
Actividade Imunitária
As proteínas de fusão de albumina da invenção e polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção, diagnóstico e/ou prognóstico de doenças, distúrbios e/ou estados do sistema imunitário, por exemplo, pela activação ou inibição da proliferação, diferenciação ou mobilização (quimiotaxia) de células imunitárias. As células imunitárias desenvolvem-se através de um processo denominado hematopoiese, produzindo células mielóides (plaquetas, glóbulos vermelhos, neutrófilos e macrófagos) e linfóides (linfócitos B e T) a partir de células 183 estaminais pluripotentes. A etiologia destas doenças, distúrbios e/ou estados imunitários pode ser genética, somática, tais como cancro e algumas doenças auto-imunes, adquirida (e. g. , por quimioterapia ou toxinas) ou infecciosa. Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados como um marcador ou detector de uma doença ou distúrbio particular do sistema imunitário.
Noutra forma de realização, a proteína de fusão da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção pode ser utilizado para tratar doenças e distúrbios do sistema imunitário e/ou para inibir ou estimular uma resposta imunitária gerada por células associadas ao(s) tecido(s) no(s) qual(quais) o polipéptido da invenção é expresso.
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção, diagnóstico e/ou prognóstico de imunodeficiências, incluindo imunodeficiências congénitas e adquiridas.
As doenças ou distúrbios auto-imunes que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados por proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide, espondilite anquilosante, esclerose múltipla, tiroidite auto-imune, tiroidite de Hashimoto, anemia hemolítica auto-imune, anemia hemolítica, trombocitopenia, púrpura trombocitopénica auto-imune, 184 trombocitopenia neonatal auto-imune, púrpura trombocitopénica idiopática, púrpura (e. g., púrpura de Henloch-Scoenlein), auto-imunocitopenia, síndrome de Goodpasture, Pênfigo Vulgar, miastenia grave, doença de Grave (hipertiroidismo) e diabetes mellitus resistente a insulina.
Distúrbios adicionais que são susceptíveis de ter um componente auto-imune que pode ser tratado, apresentado e/ou diagnosticado com as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem, mas não estão limitados a, artrite induzida por colagénio de tipo II, síndrome de antifosfolípido, dermatite, encefalomielite alérgica, miocardite, policondrite recorrente, doença cardíaca reumática, nevrite, uveíte oftálmica, poliendocrinopatias, doença de Reiter, Síndrome de Stiff-Man, inflamação pulmonar auto-imune, autismo, Síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependente de insulina e distúrbios oculares inflamatórios auto-imunes.
Distúrbios adicionais que são susceptíveis de ter um componente auto-imune que pode ser tratado, apresentado, diagnosticado e/ou prognosticado com as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem, mas não estão limitados a, esclerodermia com anticorpos anti-colagénio (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos nucleolares e outros anticorpos nucleares) , doença mista do tecido conjuntivo (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos para antigénios nucleares extractáveis (e. g., ribonucleoproteína)), polimiosite (frequentemente caracterizada, e. g., por ANA de não histona) , anemia perniciosa (frequentemente caracterizada, e. g., por célula antiparietal, 185 microssomas e anticorpos de factor intrínseco) , doença de Addison idiopática (frequentemente caracterizada, e. g., por citotoxicidade supra-renal de mediação humoral e celular, infertilidade (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos antiespermatozoários) , glomerulonefrite (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos de membrana basal glomerular ou complexos imunitários) , penfigóide bolhoso (frequentemente caracterizado, e. g., por IgG e complemento na membrana basal), Síndrome de Sjogren (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos de múltiplos tecidos e/ou um ANA de não histona específico (SS-B)), diabetes mellitus (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos de célula de ilhéu humorais e de mediação celular) e resistência a fármacos adrenérgicos (incluindo resistência a fármacos adrenérgicos com asma ou fibrose quística) (frequentemente caracterizada, e. g., por anticorpos de receptor adrenérgico beta).
Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção têm utilizações no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de estados inflamatórios. Por exemplo, visto que as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem inibir a activação, proliferação e/ou diferenciação de células envolvidas numa resposta inflamatória, estas moléculas podem ser utilizadas para prevenir e/ou tratar estados inflamatórios crónicos e agudos. Esses estados inflamatórios incluem, mas não estão limitados, por exemplo, a inflamação associada a infecção (e. g., choque séptico, sépsis ou síndrome de resposta inflamatória sistémica), lesão de isquemia-reperfusão, letalidade de endotoxina, rejeição hiperaguda mediada por 186 complemento, nefrite, lesão pulmonar induzida por citocina ou quimiocina, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, sobreprodução de citocinas (e. g., TNF ou IL-1), distúrbios respiratórios (e. g., asma e alergia); distúrbios gastrointestinais (e. g., doença inflamatória intestinal); cancros (e. g., gástrico, ovariano, pulmão, bexiga, figado e mama); distúrbios do SNC (e. g., esclerose múltipla; lesão cerebral isquémica e/ou AVC, lesão cerebral traumática, distúrbios neurodegenerativos (e. g., doença de Parkinson e doença de Alzheimer); demência relacionada com SIDA; e doença do prião); distúrbios cardiovasculares (e. g., aterosclerose, miocardite, doença cardiovascular e complicação de bypass cardiopulmonar); assim como muitas doenças, estados e distúrbios adicionais que são caracterizados por inflamação (e. g., hepatite, artrite reumatóide, gota, trauma, pancreatite, sarcoidose, dermatite, lesão de isquemia-reperfusão renal, doença de Grave, lúpus eritematoso sistémico, diabetes mellitus e rejeição de transplante alógeno).
Noutra forma de realização, as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção são utilizados numa ou mais das aplicações aqui descritas, visto que podem aplicar-se à medicina veterinária.
Noutra forma de realização específica, as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser empregues, por exemplo, para inibir a quimiotaxia de polipéptido e a activação de macrófagos e seus precursores e de neutrófilos, basófilos, linfócitos B e alguns subconjuntos de células T, e. g., células T activadas e CD8 citotóxicas e células 187 assassinas naturais, em determinadas doenças inflamatórias e infecciosas auto-imunes e crónicas. Os exemplos de doenças auto-imunes são aqui descritos e incluem esclerose múltipla e diabetes dependente de insulina.
Distúrbios Renais
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar distúrbios do sistema renal. Os distúrbios renais que podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos e/ou tratados com composições da invenção incluem insuficiência renal, nefrite, distúrbios de vasos sanguíneos do rim, distúrbios metabólicos e congénitos do rim, distúrbios urinários do rim, distúrbios auto-imunes, esclerose e necrose, desequilíbrio de electrólito e cancros do rim.
As doenças do rim que podem ser diagnosticadas, prognosticadas, prevenidas e/ou tratadas com composições da invenção incluem insuficiência renal aguda, insuficiência renal crónica, insuficiência renal ateroembólica, doença renal de estádio final, doenças inflamatórias do rim (e. g., glomerulonefrite aguda, glomerulonefrite pós-infecciosa, glomerulonefrite rapidamente progressiva, síndrome nefrótica, glomerulonefrite membranosa, síndrome nefrótica familiar, glomerulonefrite I e II membranoproliferativa, glomerulonefrite proliferativa mesangial, glomerulonefrite crónica, nefrite túbulo-intersticial aguda, nefrite túbulo-intersticial crónica, glomerulonefrite pós-estreptocócica aguda (PSGN), pielonefrite, nefrite de lúpus, nefrite crónica, nefrite intersticial e 188 vasos glomerulonefrite pós-estreptocócica), distúrbios dos sanguíneos dos rins (e. g., enfarte do rim, doença ateroembólica do rim, necrose cortical, nefroesclerose maligna, trombose de veia renal, sobperfusão renal, retinopatia renal, isquemia-reperfusão renal, embolismo de artéria renal e estenose de artéria renal) e distúrbios do rim resultantes de doença do aparelho urinário (e. g., pielonefrite, hidronefrose, urolitíase (litíase renal, nefrolitíase), nefropatia de refluxo, infecções do aparelho urinário, retenção urinária e uropatia obstrutiva unilateral aguda ou crónica).
Além disso, as composições da invenção podem ser utilizadas para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar distúrbios metabólicos e congénitos do rim (e. g., uremia, amiloidose renal, osteodistrofia renal, acidose tubular renal, glicosúria renal, diabetes insipidus nefrogénica, cistinúria, síndrome de Fanconi, osteose fibrocística renal (raquitismo renal), doença de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de Liddie, doença poliquística do rim, doença quística medular, rim de esponja medular, síndrome de Alport, síndrome de unha-patela, síndrome nefrótica congénita, síndrome de CRUSH, rim em ferradura, nefropatia diabética, diabetes insipidus nefrogénica, nefropatia analgésica, pedras do rim e nefropatia membranosa) e distúrbios auto-imunes do rim (e. g., lúpus eritematoso sistémico (SLE), síndrome de Goodpasture, nefropatia de IgA e glomerulonefrite proliferativa mesangial de IgM) .
Distúrbios Cardiovasculares
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da 189 invenção podem ser utilizados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar distúrbios cardiovasculares, incluindo, mas não limitados a, doença de artéria periférica, tal como isquemia do membro.
Os distúrbios cardiovasculares incluem, mas não estão limitados a, anomalias cardiovasculares, tais como fistula arterio-arterial, fistula arteriovenosa, malformações arteriovenosas cerebrais, defeitos congénitos do coração, atresia pulmonar e sindrome de Scimitar. Os defeitos congénitos do coração incluem, mas não estão limitados a, coarctação aórtica, cor triatriatum, anomalias dos vasos coronários, coração cruzado, dextrocardia, canal arterioso patente, anomalia de Ebstein, complexo de Eisenmenger, sindrome do coração esquerdo hipoplásico, levocardia, tetralogia de Fallot, transposição dos grandes vasos, dupla via de saida de ventrículo direito, atresia tricúspide, tronco arterioso persistente e defeitos septais do coração, tais como defeito septal aortopulmonar, defeitos das almofadas endocárdicas, Sindrome de Lutembacher, trilogia de Fallot, defeitos septais do coração ventricular.
Os distúrbios cardiovasculares também incluem, mas não estão limitados a, doença cardíaca, tais como arritmias, doença cardíaca carcinóide, débito cardíaco elevado, débito cardíaco baixo, tamponamento cardíaco, endocardite (incluindo bacteriana), aneurisma do coração, paragem cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia congestiva, dispneia paroxística, edema cardíaco, hipertrofia do coração, cardiomiopatia congestiva, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia ventricular direita, ruptura do coração pós-enfarte, ruptura septal ventricular, doenças das válvulas do coração, 190 doenças do miocárdio, isquemia do miocárdio, efusão pericardíaca, pericardite (incluindo constritiva e tuberculosa), pneumopericárdio, sindrome pós-pericardiotomia, doença cardíaca pulmonar, doença cardíaca reumática, disfunção ventricular, hiperemia, complicações cardiovasculares da gravidez, Sindrome de Scimitar, sífilis cardiovascular e tuberculose cardiovascular.
As arritmias incluem, mas não estão limitadas a, arritmia sinusal, fibrilação atrial, palpitação atrial, bradicardia, extra-sístole, Sindrome de Adams-Stokes, bloqueio de ramo, bloqueio sinoatrial, sindrome do QT longo, parassístole, Sindrome de Lown-Ganong-Levine, sindrome de pré-excitação de tipo Mahaim, sindrome de Wolff-Parkinson-White, sindrome do nó sinusal, taquicardias e fibrilação ventricular. As taquicardias incluem taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia juncional ectópica, taquicardia de reentrada nodal sinoatrial, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes e taquicardia ventricular.
As doenças das válvulas do coração incluem, mas não estão limitadas a, insuficiência da válvula aórtica, estenose da válvula aórtica, sopros do coração, prolapso da válvula aórtica, prolapso da válvula mitral, prolapso da válvula tricúspide, insuficiência da válvula mitral, estenose da válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiência da válvula pulmonar, estenose da válvula pulmonar, atresia tricúspide, insuficiência da válvula tricúspide e estenose da válvula tricúspide. 191
As doenças miocárdicas incluem, mas não estão limitadas a, cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia congestiva, cardiomiopatia hipertrófica, estenose subvalvular aórtica, estenose subvalvular pulmonar, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia de Chagas, fibroelastose endocárdica, fibrose endomiocárdica, Sindrome de Kearns, lesão de reperfusão miocárdica e miocardite.
As isquemias miocárdicas incluem, mas não estão limitadas a, doença coronária, tais como angina de peito, aneurisma coronário, arteriosclerose coronária, trombose coronária, vasoespasmo coronário, enfarte do miocárdio e sideração miocárdica.
As doenças cardiovasculares também incluem doenças vasculares, tais como aneurismas, angiodisplasia, angiomatose, angiomatose bacilar, Doença de Hippel-Lindau, Sindrome de Klippel-Trenaunay-Weber, Sindrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, doenças aórticas, Arterite de Takayasu, aortite, Sindrome de Leriche, doenças oclusivas arteriais, arterite, enarterite, poliarterite nodosa, distúrbios cerebrovasculares, angiopatias diabéticas, retinopatia diabética, embolias, trombose, eritromelalgia, hemorróides, doença veno-oclusiva hepática, hipertensão, hipotensão, isquemia, doenças vasculares periféricas, flebite, doença veno-oclusiva pulmonar, doença de Raynaud, sindrome de CREST, oclusão de veia retiniana, sindrome de Scimitar, sindrome de veia cava superior, telangiectasia, ataxia-telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditária, varicocele, veias varicosas, úlcera varicosa, vasculite e insuficiência venosa.
Os aneurismas incluem, mas não estão limitados a, aneurismas de dissecção, falsos aneurismas, aneurismas 192 com hérnia aneurismas aórticos, coronários, aneurismas do infectados, aneurismas aneurismas cerebrais, aneurismas coração e aneurismas ilíacos.
As doenças oclusivas arteriais incluem, mas não estão limitadas a, arteriosclerose, claudicação intermitente, estenose da carótida, displasias fibromusculares, oclusão vascular mesentérica, doença de Moyamoya, obstrução da artéria renal, oclusão da artéria retiniana e trombangeíte obliterante.
Os distúrbios cerebrovasculares incluem, mas não estão limitados a, doenças da artéria carótida, angiopatia amilóide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, malformação arteriovenosa cerebral, doenças de artéria cerebral, embolia e trombose cerebral, trombose da artéria carótida, trombose sinusal, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnóide, enfarte cerebral, isquemia cerebral (incluindo transiente) , síndrome de roubo da subclávia, leucomalacia periventricular, cefaleia vascular, cefaleia histamínica, enxaqueca e insuficiência vertebrobasilar.
As embolias incluem, mas não estão limitadas a, embolias de ar, embolias de fluido amniótico, embolias de colesterol, síndrome do dedo do pé azul, embolias gordas, embolias pulmonares e tromoboembolias. As tromboses incluem, mas não estão limitadas a, trombose coronária, trombose de veia hepática, oclusão de veia retiniana, trombose de artéria carótida, trombose sinusal, síndrome de Wallenberg e tromboflebite. 193
Os distúrbios isquémicos incluem, mas não estão limitados a, isquemia cerebral, colite isquémica, sindromes de compartimento, sindrome de compartimento anterior, isquemia miocárdica, lesões de reperfusão e isquemia de membro periférico. A vasculite inclui, mas não está limitada a, aortite, arterite, Sindrome de Behcet, Sindrome de Churg-Strauss, sindrome de nódulo linfático mucocutâneo, trombangeite obliterante, vasculite de hipersensibilidade, púrpura de Schoenlein-Henoch, vasculite cutânea alérgica e granulomatose de Wegener.
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser administrados utilizando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, injecção de agulha directa no sítio de distribuição, injecção intravenosa, administração tópica, infusão de cateter, injectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de espuma-gel, outros materiais de depósito comercialmente disponíveis, bombas osmóticas, formulações farmacêuticas orais ou de supositório sólidas, aplicações de decantação ou tópicas durante a cirurgia, distribuição de aerossol. Esses métodos são conhecidos na técnica. Os métodos de distribuição de polinucleótidos são aqui descritos em maior detalhe.
Actividade Anti-Angiogénese 0 equilíbrio de ocorrência natural entre estimuladores e inibidores endógenos da angiogénese é aquele em que predominam as influências inibitórias. Rastinejad et ai., Cell 56:345-355 (1989). Nos casos raros nos quais a neovascularização ocorre sob 194 condições fisiológicas normais, tais como cicatrização, regeneração de órgãos, desenvolvimento embrionário e processos reprodutivos femininos, a angiogénese é rigorosamente regulada e delimitada espacial e temporalmente.
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser úteis no tratamento de outros distúrbios, além de cancros, que envolvem a angiogénese. Estes distúrbios incluem tumores benignos, por exemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogénicos; placas arteroscléricas; doenças angiogénicas oculares, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, degenerescência macular, rejeição de enxerto corneano, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeose, retinoblastoma, uveíte e Pterígia (crescimento anómalo de vaso sanguíneo) do olho; artrite reumatóide; psoríase; cicatrização retardada; endometriose; vasculogénese; granulações; cicatrizes hipertróficas (quelóides); fracturas de não união; esclerodermia; tracoma; adesões vasculares; angiogénese miocárdica; colaterais coronários; colaterais cerebrais; malformações arteriovenosas; angiogénese de membro isquémico; Síndrome de Osler-Webber; neovascularização de placa; telangiectasia; articulações hemofilíacas, angiofibroma; displasia fibromuscular; granulação de feridas; doença de Crohn; e aterosclerose.
Como notado acima, a presente invenção também proporciona métodos para tratamento de doenças neovasculares do olho, incluindo, por exemplo, neovascularização corneana, glaucoma neovascular, retinopatia diabética proliferativa, fibroplasia retrolenticular e degenerescência macular. 195
Além disso, os distúrbios Oculares associados a neovascularização que podem ser tratados com as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem, mas não estão limitados a: glaucoma neovascular, retinopatia diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolenticular, uveíte, retinopatia de degenerescência macular de prematuridade, neovascularização de enxerto corneano, assim como outras doenças inflamatórias do olho, tumores oculares e doenças associadas a neovascularização coróide ou da íris. Ver, e. g., revisões por Waltman et al., Am. J. Ophthal. 85:704-710 (1978) e Gartner et al. , Surv. Ophthal 22:291-312 (1978) .
Noutro aspecto da presente invenção, os compostos da invenção podem ser utilizados para o tratamento de retinopatia diabética proliferativa, pela administração a um doente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção aos olhos, de modo a que a formação de vasos sanguíneos seja inibida.
Em formas de realização particularmente preferidas da invenção, a retinopatia diabética proliferativa pode ser tratada por injecção no humor aquoso ou vítreo, de modo a aumentar a concentração local do polinucleótido, polipéptido, antagonista e/ou agonista na retina. De um modo preferido, este tratamento deve ser iniciado antes da aquisição de doença grave requerendo fotocoagulação.
Além disso, os distúrbios e/ou estados que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados com as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos 196 codificando proteínas de fusão de albumina da invenção da invenção incluem tumores sólidos, tumores de origem sanguínea, tal como leucemias, metástase tumoral, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por exemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogénicos, artrite reumatóide, psoríase, doenças angiogénicas oculares, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, degenerescência macular, rejeição de enxerto corneano, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeose, retinoblastoma e uveíte, cicatrização retardada, endometriose, vascluogénese, granulações, cicatrizes hipertróficas (quelóides), fracturas de não união, esclerodermia, tracoma, adesões vasculares, angiogénese miocárdica, colaterais coronários, colaterais cerebrais, malformações arteriovenosas, angiogénese de membro isquémico, Síndrome de Osler-Webber, neovascularização de placa, telangiectasia, articulações hemofilíacas, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulação de feridas, doença de Crohn, aterosclerose, agente de controlo de nascimento, pela prevenção da vascularização requerida para implantação de embrião controlando menstruação, doenças que têm a angiogénese como uma consequência patológica, tais como doença da arranhadura do gato (Rochele minalia quintosa) , úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelose e angiomatose bacilar.
Cicatrização e Proliferação Celular Epitelial
Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção poderiam ser utilizados tratar ou prevenir o começo da diabetes mellitus. Em doentes com diabetes Tipos I e II diagnosticadas de novo, onde permanece alguma função de célula 197 de ilhéu, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção poderiam ser utilizados para manter a função de ilhéu, de modo a aliviar, retardar ou prevenir a manifestação permanente da doença. Igualmente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção poderiam ser utilizados como um auxiliar na transplantação de célula de ilhéu para melhorar ou promover a função de célula de ilhéu.
Actividade Neuronal e Doenças Neurológicas
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para o diagnóstico e/ou tratamento de doenças, distúrbios, dano ou lesão do cérebro e/ou sistema nervoso. Os distúrbios do sistema nervoso que podem ser tratados com as composições da invenção (e. g., proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção) incluem, mas não estão limitados a, lesões do sistema nervoso e doenças ou distúrbios que resultam numa desconexão de axónios, uma diminuição ou degenerescência de neurónios ou desmielinização. As lesões do sistema nervoso que podem ser tratadas num doente (incluindo doentes mamíferos humanos e não humanos) de acordo com os métodos da invenção, incluem, mas não estão limitadas às seguintes lesões dos sistemas nervosos central (incluindo medula espinal, cérebro) ou periférico: (1) lesões isquémicas, nas quais uma ausência de oxigénio numa porção do sistema nervoso resulta em lesão ou morte neuronal, incluindo enfarte ou isquemia cerebral, ou enfarte ou isquemia de medula espinal; (2) lesões traumáticas, 198 incluindo lesões causadas por ferida física ou associada a cirurgia, por exemplo, lesões que decepam uma porção do sistema nervoso, ou feridas de compressão; (3) lesões malignas, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou ferida por tecido maligno que é uma malignidade associada a sistema nervoso ou uma malignidade derivada de tecido de não sistema nervoso; (4) lesões infecciosas, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou ferida como resultado de infecção, por exemplo, por um abcesso ou associada a infecção por vírus da imunodeficiência humana, herpes zóster ou vírus herpes simplex ou com doença de Lyme, tuberculose ou sífilis; (5) lesões degenerativas, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou ferida como resultado de um processo degenerativo, incluindo, mas não limitado a, degenerescência associada a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, coreia de Huntington ou esclerose lateral amiotrófica (ALS); (6) lesões associadas a doenças ou distúrbios nutricionais, nos quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou ferida por um distúrbio nutricional ou distúrbio do metabolismo, incluindo, mas não limitado a, deficiência de vitamina B12, deficiência de ácido fólico, doença de Wernicke, ambliopia de tabaco-álcool, doença de Marchiafava-Bignami (degenerescência primária do corpo caloso) e degenerescência cerebelar alcoólica; (7) lesões neurológicas associadas a doenças sistémicas, incluindo, mas não limitadas a, diabetes (neuropatia diabética, paralisia de Bell), lúpus eritematoso sistémico, carcinoma ou sarcoidose; (8) lesões causadas por substâncias tóxicas incluindo álcool, chumbo ou neurotoxinas particulares; e (9) lesões desmielinizadas, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou ferida por uma doença desmielinizante, incluindo, mas não limitada a, esclerose múltipla, mielopatia associada a vírus da imunodeficiência humana, mielopatia transversa de diversas 199 etiologias, leucoencefalopatia multifocal progressiva e mielinólise pôntica central.
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para proteger células neuronais dos efeitos prejudiciais da hipoxia. Numa forma de realização preferida adicional, as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção são utilizados para proteger células neuronais dos efeitos prejudiciais da hipoxia cerebral. De acordo com esta forma de realização, as composições da invenção são utilizadas para tratar ou prevenir a lesão de célula neuronal associada a hipoxia cerebral.
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir lesão de célula neuronal associada a isquemia cerebral. As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir lesão de célula neuronal associada a enfarte cerebral.
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir lesão de célula neuronal associada a AVC. As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir lesão de célula neuronal cerebral associada a AVC. 200
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir lesão de célula neuronal associada a ataque cardíaco. As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir lesão de célula neuronal cerebral associada a ataque cardíaco.
As composições da invenção que são úteis para o tratamento ou prevenção de um distúrbio sistema nervoso podem ser seleccionadas por testagem para actividade biológica na promoção da sobrevivência ou diferenciação de neurónios. Por exemplo e não a título de limitação, as composições da invenção que deduzem qualquer dos seguintes efeitos podem ser úteis de acordo com a invenção: (1) tempo de sobrevivência aumentado de neurónios em cultura na presença ou ausência de hipoxia ou condições hipóxicas; (2) germinação aumentada de neurónios em cultura ou in vivo; (3) produção aumentada de uma molécula associada a neurónio em cultura ou in vivo, e. g. , colina acetiltransferase ou acetilcolinesterase com respeito a neurónios motores; ou (4) sintomas diminuídos de disfunção de neurónio in vivo. Esses efeitos podem ser medidos por qualquer método conhecido na técnica. Em formas de realização preferidas, não limitativas, a sobrevivência aumentada de neurónios pode ser rotineiramente medida utilizando um método aqui exposto ou, de outro modo, conhecido na técnica, tal como, por exemplo, em
Zhang et al. , Proc Natl Acad Sei USA 97:3637-42 (2000) ou em
Arakawa et al., J. Neurosci., 10:3507-15 (1990); a germinação aumentada de neurónios pode ser detectada por métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, os métodos expostos em Pestronk et al., Exp. Neurol., 70:65-82 (1980) ou Brown et al., 201 Άηη. Rev. Neurosci., 4:17-42 (1981); a produção aumentada de moléculas associadas a neurónios pode ser medida por bioensaio, ensaio enzimático, ligação de anticorpo, ensaio de transferência de Northern, etc., utilizando técnicas conhecidas na matéria e dependendo da molécula a ser medida; e a disfunção de neurónio motor pode ser medida pela avaliação da manifestação física de distúrbio de neurónio motor, e. g., fraqueza, velocidade de condução de neurónio motor ou incapacidade funcional.
Os distúrbios de neurónio motor que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, distúrbios, tais como enfarte, infecção, exposição a toxina, trauma, lesão cirúrgica, doença degenerativa ou malignidade que possa afectar neurónios motores, assim como outros componentes do sistema nervoso, assim como distúrbios que selectivamente afectam neurónios, tal como esclerose lateral amiotrófica e incluindo, mas não limitada a, atrofia muscular espinal progressiva, paralisia bulbar progressiva, esclerose lateral primária, atrofia muscular infantil e juvenil, paralisia bulbar progressiva da infância (síndrome de Fazio-Londe), poliomielite e a síndrome de pós-polio e Neuropatia Motorsensorial
Hereditária (Doença de Charcot-Marie-Tooth).
Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem desempenhar um papel na sobrevivência neuronal; formação de sinapse; conductância; diferenciação neuronal, etc. Deste modo, as composições da invenção (incluindo proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção) podem ser utilizadas para diagnosticar e/ou tratar ou prevenir doenças ou distúrbios associados a estes papéis, incluindo, mas não limitados a, 202 distúrbios da aprendizagem e/ou cognição. As composições da invenção também podem ser úteis no tratamento ou prevenção de estados de doença neurodegenerativos e/ou distúrbios do comportamento. Esses estados de doença neurodegenerativos e/ou distúrbios do comportamento incluem, mas não estão limitados a, Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Doença de Huntington, Síndrome de Tourette, esquizofrenia, mania, demência, paranoia, distúrbio obsessivo compulsivo, distúrbio de pânico, incapacidades de aprendizagem, ALS, psicoses, autismo e comportamentos alterados, incluindo distúrbios na alimentação, padrões de sono, equilíbrio e percepção. Além disso, as composições da invenção também podem desempenhar um papel no tratamento, prevenção e/ou detecção de distúrbios do desenvolvimento associados ao embrião em desenvolvimento ou distúrbios sexualmente ligados.
Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser úteis na protecção das células neuronais das doenças, dano, distúrbios ou lesões, associados a distúrbios cerebrovasculares, incluindo, mas não limitados a, doenças da artéria carótida (e. g., trombose de artéria carótida, estenose de carótida ou Doença de Moyamoya), angiopatia amilóide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, malformações arteriovenosas cerebrais, doenças de artéria cerebral, embolia e trombose cerebral (e. g., trombose de artéria carótida, trombose sinusal ou Síndrome de Wallenberg), hemorragia cerebral (e. g. , hematoma epidural ou subdural ou hemorragia subaracnóidea), enfarte cerebral, isquemia cerebral (e. g., isquemia cerebral transiente, Síndrome de Roubo da Subclávia ou insuficiência vertebrobasilar), demência vascular (e. g., multienfarte), leucomalacia, cefaleia 203 periventricular e vascular (e. g., cefaleia histamínica ou enxaqueca). É proporcionado um processo para a utilização de proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção para efeitos terapêuticos, por exemplo, para estimular a proliferação e/ou diferenciação celular neurológica. Por conseguinte, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar e/ou detectar doenças neurológicas. Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados como um marcador ou detector de uma doença ou distúrbio particular do sistema nervoso.
Os exemplos de doenças neurológicas que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem doenças do cérebro, tais como doenças cerebrais metabólicas que incluem fenilcetonúria, tal como fenilcetonúria materna, deficiência de piruvato carboxilase, deficiência de complexo de piruvato desidrogenase, Encefalopatia de Wernicke, edema do cérebro, neoplasmas do cérebro, tais como neoplasmas cerebelosos que incluem neoplasmas infratentoriais, neoplasmas de ventrículo cerebral, tais como neoplasmas do plexo coróide, neoplasmas hipotalâmicos, neoplasmas supratentoriais, doença de canavan, doenças cerebelosas, tais como ataxia cerebelosa que inclui degenerescência espinocerebelosa, tal como ataxia telangiectasia, dissinergia cerebelosa, Ataxia de Friederich, Doença de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelosa, neoplasmas cerebelosos, tal como neoplasmas infratentoriais, 204 esclerose cerebral difusa, tal como encefalite periaxialis, leucodistrofia de célula globóide, leucodistrofia metacromática e panencefalite esclerosante sub-aguda.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem distúrbios cerebrovasculares (tais como doenças de artéria carótida que incluem trombose de artéria carótida, estenose de carótida e Doença de Moyamoya) , angiopatia amilóide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, malformações arteriovenosas cerebrais, doenças de artéria cerebral, embolia e trombose cerebral, tal como trombose de artéria carótida, trombose sinusal e Síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, tal como hematoma epidural, hematoma subdural e hemorragia subaracnóidea, enfarte cerebral, isquemia cerebral, tal como isquemia cerebral transiente, Síndrome de Roubo da Subclávia e insuficiência vertebrobasilar, demência vascular, tal como demência de multienfarte, leucomalacia periventricular, cefaleia vascular, tais como cefaleia histamínica e enxaqueca.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem demência, tal como Complexo de Demência de SIDA, demência pré-senil, tais como Doença de Alzheimer e Síndrome de Creutzfeldt-Jakob, demência senil, tais como Doença de Alzheimer e paralisia supranuclear progressiva, demência vascular, tal como demência de multienfarte, encefalite, que inclui encefalite periaxialis, encefalite virai, tal como encefalite epidémica, Encefalite Japonesa, Encefalite de 205
St. Louis, encefalite da carraça e febre do Nilo Ocidental, encefalomielite disseminada aguda, meningoencefalite, tal como sindrome uveomeningoencefalitica, Doença de Parkinson Pós-encefalitica e panencefalite esclerosante subaguda, encefalomalacia, tal como leucomalacia periventricular, epilepsia, tal como epilepsia generalizada que inclui espasmos infantis, epilepsia de ausência, epilepsia mioclónica que inclui Sindrome de MERRF, epilepsia tónico-clónica, epilepsia parcial, tal como epilepsia parcial complexa, epilepsia de lobo frontal e epilepsia de lobo temporal, epilepsia pós-traumática, status epilepticus, tal como Epilepsia Partialis Continua e Sindrome de Hallervorden-Spatz.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem hidrocefalia, tais como Sindrome de Dandy-Walker e hidrocefalia de pressão normal, doenças hipotalâmicas, tal como neoplasmas hipotalâmicos, malária cerebral, narcolepsia que inclui cataplexia, poliomielite bulbar, pseudotumor cerebral, Sindrome de Rett, Sindrome de Reye, doenças talâmicas, toxoplasmose cerebral, tuberculoma intracraniano e Sindrome de Zellweger, infecções do sistema nervoso central, tais como Complexo de Demência de SIDA, Abcesso Cerebral, empiema subdural, encefalomielite, tais como Encefalomielite Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Hemorrágica Necrosante, Visna e malária cerebral.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da 206 invenção incluem meningite, tal como aracnoidite, meningite asséptica, tal como meningite virai que inclui coriomeningite linfocitica, meningite Bacteriana que inclui Meningite de Haemophilus, Meningite de Listeria, Meningite Meningocócica, tais como Sindrome de Waterhouse-Friderichsen, Meningite Pneumocócica e tuberculose meningea, meningite fúngica, tal como Meningite Criptocócica, efusão subdural, meningoencefalite, tal como sindrome uveomeningoencefalitica, mielite, tal como mielite transversa, neurosifilis, tal como tabes dorsalis, poliomielite que inclui poliomielite bulbar e sindrome pós-poliomielite, doenças do prião (tais como Sindrome de Creutzfeldt-Jakob, Encefalopatia Espongiforme Bovina, Sindrome de Gerstmann-Straussler, Kuru, Tremblante) e toxoplasmose cerebral.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem neoplasmas do sistema nervoso central, tal como neoplasmas do cérebro, que incluem neoplasmas cerebelosos, tal como neoplasmas infratentoriais, neoplasmas de ventrículo cerebral, tal como neoplasmas de plexo coróide, neoplasmas hipotalâmicos e neoplasmas supratentoriais, neoplasmas meníngeos, neoplasmas de medula espinal que incluem neoplasmas epidurais, doenças desmielinizantes, tais como Doenças de Canavan, esclerose cerebral difusa que inclui adrenoleucodistrofia, encefalite periaxialis, leucodistrofia de célula globóide, esclerose cerebral difusa, tais como leucodistrofia metacromática, encefalomielite alérgica, encefalomielite hemorrágica necrosante, leucoencefalopatia multifocal progressiva, esclerose múltipla, mielinólise pôntica central, mielite transversa, neuromielite óptica, Tremblante, Lordose, Sindrome de Fadiga Crónica, Visna, Sindrome Nervosa de 207
Pressão Elevada, Meningismo, doenças da medula espinal, tais como amiotonia congénita, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, tal como Doença de Werdnig-Hoffmann, compressão de medula espinal, neoplasmas de medula espinal, tais como neoplasmas epidurais, siringomielia, Tabes Dorsalis, Sindrome de Stiff-Man, retardação mental, tais como Sindrome de Angelman, Sindrome de Grito do Gato, Sindrome de De Lange, Sindrome de Down, Gângliosidoses, tal como gângliosidoses G(M1), Doença de Sandhoff, Doença de Tay-Sachs, Doença de Hartnup, homocistinúria, Sindrome de Laurence-Moon-Biedl, Sindrome de Lesch-Nyhan, Doença de Urina de Xarope de Acer, mucolipidose, tais como fucosidose, lipofuscinose ceróide neuronal, sindrome oculocerebrorenal, fenilcetonúria, tal como fenilcetonúria materna, Sindrome de Prader-Willi, Sindrome de Rett, Sindrome de Rubinstein-Taybi, Esclerose Tuberosa, Sindrome de WAGR, anomalias do sistema nervoso, tal como holoprosencefalia, defeitos de tubo neuronal, tal como anencefalia que inclui hidrangencefalia, Deformidade de Arnold-Chairi, encefalocelo, meningocelo, meningomielocelo, disrafismo espinal, tais como espinha bífida quística e espinha bífida oculta.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem neuropatias motoras e sensoriais hereditárias que incluem Doença de Charcot-Marie, atrofia óptica Hereditária, Doença de Refsum, paraplegia espástica hereditária, Doença de Werdnig-Hoffmann, Neuropatias Sensorais e Autonômicas Hereditárias, tais como Analgesia Congénita e Disautonomia Familiar, Manifestações Neurológicas (tal como agnosia que inclui Sindrome de Gerstmann, Amnésia, tal como amnésia retrógrada, apraxia, bexiga neurogénica, cataplexia, distúrbios 208 comunicativos, tal como distúrbios de audição que incluem surdez, perda de audição parcial, restabelecimento de sonoridade e acufenos, distúrbios de linguagem, tal como afasia que inclui agrafia, anomia, afasia de broca e Afasia de Wernicke, Dislexia, tal como Dislexia Adquirida, distúrbios de desenvolvimento de linguagem, distúrbios da linguagem, tal como afasia que inclui anomia, afasia de broca e Afasia de Wernicke, distúrbios de articulação, distúrbios comunicativos, tal como distúrbios da linguagem que incluem disartria, ecolalia, mutismo e gaguez, distúrbios da voz, tais como afonia e rouquidão, estado descerebrado, delírio, fasciculação, alucinações, meningismo, distúrbios de movimento, tais como síndrome de angelman, ataxia, atetose, coreia, distonia, hipocinesia, hipotonia muscular, mioclono, tique, torticolo e tremor, hipertonia muscular, tal como rigidez muscular, tal como síndrome de stiff-man, espasticidade muscular, paralisia, tal como paralisia facial que inclui Herpes Zoster Oticus, Gastroparesia, Hemiplegia, oftalmoplegia, tal como diplopia, Síndrome de Duane, Síndrome de Horner, oftalmoplegia externa progressiva crónica, tal como Síndrome de Kearns, Paralisia Bulbar, Paraparesia Espástica Tropical, Paraplegia, tal como Síndrome de Brown-Sequard, quadriplegia, paralisia respiratória e paralisia das cordas vocais, paresia, membro fantasma, distúrbios do paladar, tais como ageusia e disgeusia, distúrbios da visão, tais como ambliopia, cegueira, defeitos de visão a cores, diplopia, hemianopsia, escotoma e visão subnormal, distúrbios do sono, tal como hipersónia que inclui Síndrome de Kleine-Levin, insónia e sonambulismo, espasmo, tal como trismo, inconsciência, tais como coma, estado vegetativo persistente e síncope e vertigem, doenças neuromusculares, tais como amiotonia congénita, esclerose lateral amiotrófica, Síndrome Miasténica de Lambert-Eaton, doença do neurónio motor, atrofia muscular, tal como 209 atrofia muscular espinal, Doença de Charcot-Marie e Doença de Werdnig-Hoffmann, Sindrome Pós-poliomielite, Distrofia Muscular, Miastenia Grave, Miotonia Atrófica, Miotonia Congénita, Miopatia da Nemalina, Paralisia Periódica Familiar, Paramiloclono Multiplex, Paraparesia Espástica Tropical e Sindrome de Stiff-Man, doenças do sistema nervoso periférico, tais como acrodinia, neuropatias amilóides, doenças do sistema nervoso autónomo, tais como Sindrome de Adie, Sindrome de Barre-Lieou, Disautonomia Familiar, Sindrome de Horner, Distrofia Simpática de Reflexo e Sindrome de Shy-Drager, Doenças do Nervo Craniano, tal como Doenças do Nervo Acústico, tal como Neuroma Acústico que inclui Neurofibromatose 2, Doenças do Nervo Facial, tais como Nevralgia Facial, Sindrome de Melkersson-Rosenthal, distúrbios de motilidade ocular que incluem ambliopia, nistagmo, paralisia do nervo oculomotor, oftalmoplegia, tal como sindrome de Duane, Sindrome de Horner, Oftalmoplegia Externa Progressiva Crónica que inclui Sindrome de Kearns, Estrabismo, tais como Esotropia e Exotropia, Paralisia do Nervo Oculomotor, Doenças do Nervo Óptico, tal como Atrofia Óptica que inclui Atrofia Óptica Hereditária, Drusen do Disco Óptico, Nevrite Óptica, tal como Neuromielite Óptica, Papiledema, Nevralgia Trigeminal, Paralisia das Cordas Vocais, Doenças Desmielinizantes, tais como Neuromielite Óptica e Lordose e Neuropatias Diabéticas, tal como pé diabético.
Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção incluem síndromes de compressão, tais como sindrome do túnel cárpico, sindrome do túnel társico, sindrome de descarga torácica, tal como sindrome de costela cervical, sindrome de compressão do nervo ulnar, nevralgia, tais como causalgia, 210 nevralgia cervico-braquial, nevralgia facial e nevralgia trigeminal, nevrite, tal como nevrite alérgica experimental, nevrite óptica, polinevrite, poliradiculonevrite e radiculites, tal como polirradiculite, neuropatias motoras e sensoriais hereditárias, tais como Doença de Charcot-Marie, Atrofia Óptica Hereditária, Doença de Refsum, Paraplegia Espástica Hereditária e Doença de Werdnig-Hoffmann, Neuropatias Sensorais e Autonômicas Hereditárias que incluem Analgesia Congénita e Disautonomia Familiar, Síndrome de POEMS, Ciática, Sudorese Gustativa e Tetania).
Distúrbios Endócrinos
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar distúrbios e/ou doenças relacionados com desequilíbrio hormonal e/ou distúrbios ou doenças do sistema endócrino.
As hormonas segregadas pelas glândulas do sistema endócrino controlam o crescimento físico, função sexual, metabolismo e outras funções. Os distúrbios podem ser classificados de dois modos: distúrbios na produção de hormonas e a incapacidade de os tecidos responderem às hormonas. A etiologia deste desequilíbrio hormonal ou doenças, distúrbios ou estados do sistema endócrino pode ser genética, somática, tais como cancro e algumas doenças auto-imunes, adquirida (e. g., por quimioterapia, lesão ou toxinas) ou infecciosa. Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados como um marcador ou 211 detector de uma doença ou distúrbio particular relacionado com o desequilíbrio do sistema endócrino e/ou hormonal. 0 desequilíbrio do sistema endócrino e/ou hormonal e/ou doenças abrangem distúrbios de motilidade uterina, incluindo: complicações com gravidez e parto (e. g., parto pré-termo, gravidez pós-termo, aborto espontâneo e parto lento ou interrompido); e distúrbios e/ou doenças do ciclo menstrual (e. g., dismenorreia e endometriose).
Os distúrbios e/ou doenças de desequilíbrio do sistema endócrino e/ou hormonal incluem distúrbios e/ou doenças do pâncreas, tais como, por exemplo, diabetes mellitus, diabetes insipidus, agenesia pancreática congénita, síndrome de tumor de célula de ilhéu de feocromocitoma; distúrbios e/ou doenças das glândulas supra-renais, tais como, por exemplo, doença de Addison, deficiência corticosteróide, doença virilizante, hirsutismo, Síndrome de Cushing, hiperaldosteronismo, feocromocitoma; distúrbios e/ou doenças da glândula pituitária, tais como, por exemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, nanismo pituitário, adenoma pituitário, pan-hipopituitarismo, acromegalia, gigantismo; distúrbios e/ou doenças da tiróide, incluindo, mas não limitados a, hipertiroidismo, hipotiroidismo, doença de Plummer, doença de Graves (bócio difuso tóxico), bócio nodular tóxico, tiroidite (tiroidite de Hashimoto, tiroidite granulomatosa subaguda e tiroidite linfocítica silenciosa), Síndrome de Pendred, mixedema, cretinismo, tireotoxicose, defeito de ligação de hormona tireóidea, aplasia tímica, tumores de célula de Hurthle da tiróide, cancro da tiróide, carcinoma da tiróide, Carcinoma medular da tiróide; distúrbios e/ou doenças da paratiróide, tais como, por exemplo, hiperpatatiroidismo, hipoparatioidismo; distúrbios e/ou doenças do hipotálamo. 212
Além disso, os distúrbios e/ou doenças de desequilíbrio do sistema endócrino e/ou hormonal também podem incluir distúrbios e/ou doença dos testículos ou ovários, incluindo cancro. Outros distúrbios e/ou doenças dos testículos ou ovários incluem, ainda, por exemplo, cancro ovariano, síndrome do ovário poliquístico, síndrome de Klinefelter, síndrome do testículos desaparecidos (anorquia bilateral), ausência congénita de células de Leydig, criptorquidismo, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma capilar do testículo (benigna), neoplasias do testículo e neotestículo.
Além disso, os distúrbios e/ou doenças de desequilíbrio do sistema endócrino e/ou hormonal também podem incluir distúrbios e/ou doenças, tais como, por exemplo, síndromes de deficiência poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia Endócrina múltipla e distúrbios e/ou cancros de tecidos endócrinos.
Noutra forma de realização, as proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar doenças e/ou distúrbios endócrinos associados a(os) tecido(s) no(s) qual(quais) a proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica da proteína de albumina da invenção é expressa.
Distúrbios do Sistema Reprodutivo
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da 213 invenção podem ser utilizados para o diagnóstico, tratamento ou prevenção de doenças e/ou distúrbios do sistema reprodutivo.
Outros distúrbios e/ou doenças do sistema reprodutivo masculino incluem, por exemplo, síndrome de Klinefelter, síndrome de Young, ejaculação prematura, diabetes mellitus, fibrose quística, síndrome de Kartagener, febre elevada, esclerose múltipla e ginecomastia.
Além disso, as doença e/ou distúrbios do sistema reprodutivo incluem distúrbios e/ou doenças da gravidez, incluindo aborto e nado-mortos, diabetes gestacional, diabetes mellitus.
Distúrbios Gastrointestinais
As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar distúrbios gastrointestinais, incluindo doenças e/ou estados inflamatórios, infecções, cancros (e. g. , neoplasmas intestinais (tumor carcinóide do intestino delgado, linfoma não Hodgkin do intestino delgado, linfoma do intestino delgado)) e úlceras, tal como úlceras pépticas.
Os distúrbios gastrointestinais incluem disfagia, odinofagia, inflamação do esófago, esofagite péptica, refluxo gástrico, fibrose submucosal e estritura, lesões de Mallory-Weiss, leiomiomas, lipomas, cancros epidérmicos, adeoncarcinomas, distúrbios de retenção gástrica, gastroenterite, atrofia gástrica, cancros gástricos/estomacais, 214 pólipos do estômago, distúrbios auto-imunes, tais como anemia perniciosa, estenose pilórica, gastrite (bacteriana, virai, eosinofílica, induzida por stress, erosiva crónica, atrófica, celular plasmática e de Ménétrier), e doenças peritoneais (e. g., coleperitoneu, hemoperitoneu, quisto mesentérico, linfadenite mesentérica, oclusão vascular mesentérica, paniculite, neoplasmas, peritonite, pneumoperitoneu, abcesso subfrénico).
Os distúrbios gastrointestinais também incluem distúrbios associados ao intestino delgado, tais como sindromes de má absorção, distensão, sindrome do intestino irritável, intolerância ao açúcar, doença celíaca, úlceras duodenais, duodenite, psilose tropical, Doença de Whipple, linfangiectasia intestinal, doença de Crohn, apendicite, obstruções do íleo, divertículo de Meckel, divertículo múltiplo, falha de rotação completa do intestino delgado e grosso, linfoma e doenças bacterianas e parasíticas (tais como diarreia do Viajante, tifoide e paratifóide, cólera, infecção por Lombrigas (Ascariasis lumbricoides), Ancilóstomos (Ancylostoma duodenale), Ascárides (Enterobius vermicularis), Ténias (Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp. e T. solium).
As doenças e/ou distúrbios do fígado incluem colestase intra-hepática (sindrome de Alagille, cirrose hepática biliar), fígado gordo (fígado gordo alcoólico, sindrome de Reye), trombose de veia hepática, degenerescência hepatolentricular, hepatomegalia, sindrome hepatopulmonar, sindrome hepatorrenal, hipertensão porta (varizes esofágicas e gástricas), abcesso hepático (abcesso hepático amébico), cirrose hepática (alcoólica, biliar e experimental), doenças alcoólicas do fígado (fígado gordo, hepatite, cirrose), parasítica (equinococose 215 hepática, fasciolíase, abcesso hepático amébico), icterícia (hemolítica, hepatocelular e colestática), colestase, hipertensão porta, hipertrofia do fígado, ascites, hepatite (hepatite alcoólica, hepatite animal, hepatite crónica (auto-imune, hepatite B, hepatite C, hepatite D, induzida por fármaco), hepatite tóxica, hepatite humana virai (hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatitis E) , doença de Wilson, hepatite granulomatosa, cirrose biliar secundária, encefalopatia hepática, hipertensão porta, varizes, encefalopatia hepática, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, adenoma hepatocelular, hemangiomas, cálculos biliares, insuficiência hepática (encefalopatia hepática, insuficiência hepática aguda) e neoplasmas do fígado (angiomiolipoma, metástases hepáticas calcificadas, metástases hepáticas quísticas, tumores epiteliais, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia nodular focal, adenoma hepático, cistadenoma hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cancro do fígado, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimatoso, tumores mesenquimatosos do fígado, hiperplasia regenerativa nodular, tumores benignos do fígado (quistos Hepáticos [quistos Simples, doença hepática Poliquística, cistadenoma Hepatobiliar, quisto Coledocal], Tumores mesenquimatosos [hamartoma Mesenquimatoso, hemangioendotelioma Infantil, Hemangioma, Peliose hepática, Lipomas, pseudotumor Inflamatório, Diversos], tumores Epiteliais [epitélio de canal Biliar (hamartoma de canal Biliar, adenoma de canal Biliar), Hepatócito (Adenoma, hiperplasia nodular Focal, hiperplasia regenerativa Nodular)], tumores malignos do fígado [hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma, tumores de vasos sanguíneos, angiossarcoma, sarcoma de Karposi, hemangioendotelioma, outros tumores, sarcoma embrionário, 216 rabdomiossarcoma, fibrossarcoma, leiomiossarcoma, carcinossarcoma, teratoma, carcinóide, carcinoma escamoso, linfoma primário]), peliose hepática, porfiria eritro-hepática, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda, porfiria cutânea tardia), sindrome de Zellweger).
As doenças e/ou distúrbios pancreáticos incluem pancreatite aguda, pancreatite crónica (pancreatite necrosante aguda, pancreatite alcoólica), neoplasmas (adenocarcinoma do pâncreas, cistadenocarcinoma, insulinoma, gastrinoma e glucagonoma, neoplasmas quisticos, tumores de célula de ilhéu, pancreoblastoma) e outras doenças pancreáticas (e. g., fibrose quistica, quisto (pseudoquisto pancreático, fistula pancreática, insuficiência)).
As doenças da vesícula biliar incluem cálculos biliares (colelitíase e coledocolitíase) , sindrome de pós-colecistectomia, diverticulose da vesícula biliar, colecistite aguda, colecistite crónica, tumores de canal biliar e mucocele.
As doenças e/ou distúrbios do intestino grosso incluem colite associada a antibiótico, diverticulite, colite ulcerativa, megacólon adquirido, abcessos, infecções fúngicas e bacterianas, distúrbios anorectais (e. g., fissuras, hemorróides), doenças colónicas (colite, neoplasmas colónicos [cancro do cólon, pólipos de cólon adenomatoso (e. g., adenoma viloso), carcinoma do cólon, cancro colorrectal], diverticulite colónica, diverticulose colónica, megacólon [doença de Hirschsprung, megacólon tóxico]; doenças sigmóides [proctocolite, neoplasmas sigmóides]) , constipação, doença de Crohn, diarreia (diarreia infantil, disenteria), doenças 217 duodenais (neoplasmas duodenais, obstrução duodenal, úlcera duodenal, duodenite), enterite (enterocolite), enteropatia de VIH, doenças do íleo (neoplasmas do íleo, ileíte), doença imunoproliferativa do intestino delgado, doença inflamatória intestinal (colite ulcerativa, doença de Crohn), atresia intestinal, doenças parasíticas (anisaquíase, balantidíase, infecções blastocistícas, criptosporidiose, dientamebíase, disenteria amébica, giardíase) , fístula intestinal (fístula rectal), neoplasmas intestinais (neoplasmas cecais, neoplasmas colónicos, neoplasmas duodenais, neoplasmas do íleo, pólipos intestinais, neoplasmas jejunais, neoplasmas rectais), obstrução intestinal (síndrome de ansa aferente, obstrução duodenal, fezes de impacção, pseudo-obstrução intestinal [vólvulo cecal], intussuscepção), perfuração intestinal,pólipos intestinais (pólipos colónicos, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers), doenças jejunais (neoplasmas jejunais), síndromes de má absorção (síndrome de ansa cega, doença celíaca, intolerância à lactose, síndrome de intestino curto, psilose tropical, doença de Whipple), oclusão vascular mesentérica, pneumatose cistóide intestinal, enteropatias de perda de proteína (linfangiectasia intestinal), doenças rectais (doenças do ânus, incontinência fecal, hemorróides, proctite, fistula rectal, prolapso rectal, retocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagite péptica, hemorragia, perfuração, úlcera do estômago, síndrome de Zollinger-Ellison), síndromes de pós-gastrectomia (síndrome de dumping), doenças do estômago (e. g., acloridria, refluxo duodenogástrico (refluxo biliar), ectasia vascular do antro gástrico, fístula gástrica, obstrução piloro-duodenal, gastrite (atrófica ou hipertrófica), gastroparesia, dilatação do estômago, divertículo do estômago, neoplasmas do estômago (cancro gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, pólipo gástrico hiperplástico), ruptura 218 do estômago, úlcera do estômago, vólvulo do estômago), tuberculose, visceroptose, vómitos (e. g., hematemese, hiperemese gravídica, náusea e vómitos pós-operatórios) e colite hemorrágica.
Doenças e/ou distúrbios adicionais do sistema gastrointestinal incluem doenças do tracto biliar, tais como gastrosquise, fístula (e. g., fístula biliar, fístula esofágica, fístula gástrica, fístula intestinal, fístula pancreática), neoplasmas (e. g., neoplasmas do tracto biliar, neoplasmas esofágicos, tais como adenocarcinoma do esófago, carcinoma espinocelular esofágico, neoplasmas gastrointestinais, neoplasmas pancreáticos, tais como adenocarcinoma do pâncreas, neoplasma quístico mucinoso do pâncreas, neoplasmas quísticos pancreáticos, pancreatoblastoma e neoplasmas peritoneais), doença esofágica (e. g., doenças bolhosas, candidíase, acantose glicogénica, ulceração, varizes do esófago de Barrett, atresia, quisto, divertículo (e. g., divertículo de Zenker), fístula (e. g., fístula traqueoesofágica), distúrbios de motilidade (e. g., sindrome de CREST, distúrbios de deglutição, acalasia, espasmo, refluxo gastroesofágico), neoplasmas, perfuração (e. g., sindrome de Boerhaave, sindrome de Mallory-Weiss), estenose, esofagite, hérnia diafragmática (e. g., hérnia do hiato); doenças gastrointestinais, tais como, gastroenterite (e. g., cholera morbus, infecção de vírus de norwalk), hemorragia (e. g., hematemese, melena, hemorragia de úlcera péptica), neoplasmas do estômago (cancro gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, cancro do estômago)), hérnia (e. g., hérnia diafragmática congénita, hérnia femoral, hérnia inguinal, hérnia obturadora, hérnia umbilical, hérnia ventral) e doenças intestinais (e. g., doenças cecais (apendicite, neoplasmas cecais)). 219
Actividade de Ligação
As proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser utilizadas para rastrear para moléculas que se ligam à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão ou para moléculas às quais se liga a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão. A ligação da proteína de fusão e da molécula pode activar (agonista), aumentar, inibir (antagonista) ou diminuir a actividade da proteína de fusão ou da molécula ligada. Exemplos dessas moléculas incluem anticorpos, oligonucleótidos, proteínas (e. g., receptores) ou moléculas pequenas.
De um modo preferido, a molécula é estreitamente relacionada com o ligando natural da porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da invenção, e. g., um fragmento do ligando, ou um substrato natural, um ligando, um mimético estrutural ou funcional. (Ver, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2):Capítulo 5 (1991)). De modo semelhante, a molécula pode ser estreitamente relacionada com o receptor natural ao qual a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção se liga ou, pelo menos, um fragmento do receptor capaz de ser ligado pela porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção (e. g., sítio activo) . Em qualquer caso, a molécula pode ser racionalmente concebida utilizando técnicas conhecidas.
De um modo preferido, o rastreio para estas moléculas envolve a produção de células apropriadas que expressam as proteínas de fusão de albumina da invenção. As células preferidas incluem células de mamíferos, levedura, Drosophila ou E. coli. 220 0 ensaio pode simplesmente testar a ligação de um composto candidato a uma proteína de fusão de albumina da invenção, em que a ligação é detectada por um marcador, ou num ensaio envolvendo competição com um competidor marcado. Além disso, o ensaio pode testar se o composto candidato resulta num sinal gerado pela ligação à proteína de fusão.
Alternativamente, o ensaio pode ser efectuado utilizando preparações isentas de células, proteína de fusão/molécula afixa a um suporte sólido, bibliotecas químicas ou misturas de produtos naturais. 0 ensaio também pode simplesmente compreender as etapas de mistura de um composto candidato com uma solução contendo uma proteína de fusão de albumina, medição da actividade ou ligação da proteína de fusão/molécula e comparação da actividade ou ligação da proteína de fusão/molécula a um padrão.
De um modo preferido, um ensaio de ELISA pode medir o nível ou actividade de proteína de fusão numa amostra (e. g., amostra biológica) utilizando um anticorpo monoclonal ou policlonal. 0 anticorpo pode medir o nível ou actividade de proteína de fusão pela ligação, directamente ou indirectamente, à proteína de fusão de albumina ou pela competição com a proteína de fusão de albumina por um substrato.
Além disso, o receptor ao qual a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção se liga pode ser identificado por numerosos métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, enriquecimento de ligando e triagem de FACS (Coligan, et ai., Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991)). Por exemplo, nos casos em que a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão corresponde 221 a FGF, pode ser empregue a clonagem de expressão, em que ARN poliadenilado é preparado a partir de uma célula responsiva à proteína de fusão de albumina, por exemplo, células NIH3T3, que são conhecidas por conterem múltiplos receptores para as proteínas da família de FGF, e células SC-3, e uma biblioteca de ADNc criada a partir deste ARN é dividida em agregados e utilizada para transfectar célula COS ou outras células que não são responsivas à proteína de fusão de albumina. As células transfectadas que são cultivadas em lâminas de vidro são expostas à proteína de fusão de albumina da presente invenção depois de terem sido marcadas. As proteínas de fusão de albumina podem ser marcadas por uma variedade de meios, incluindo iodinação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma proteína cinase específica de sítio.
Após fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise auto-radiográfica. Os agregados positivos são identificados e são preparados e retransfectados subagregados utilizando um processo iterativo de subagregação e re-rastreio produzindo, eventualmente, um único clone que codifica o putativo receptor.
Como uma abordagem alternativa para identificação de receptor, uma proteína de fusão de albumina marcada pode ser ligada ligada por fotoafinidade com preparações de membrana ou extracto celular que expressam a molécula de receptor para o componente de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão de albumina da invenção, o material ligado pode ser resolvido por análise de PAGE e exposto a filme de raios X. 0 complexo marcado contendo os receptores da proteína de fusão pode ser excisado, resolvido em fragmentos peptídicos e submetido a microssequenciação de proteína. A sequência de aminoácidos 222 obtida da microssequenciação seria utilizada para conceber um conjunto de sondas oligonucleotidicas degeneradas, para rastrear uma biblioteca de ADNc, para identificar os genes codificando os putativos receptores.
Além disso, podem ser empregues técnicas de rearranjo de gene, rearranjo de motivo, rearranjo de exão e/ou rearranjo de codão (colectivamente referidas como "rearranjo de ADN") para modular as actividades da proteína de fusão e/ou porção de proteína Terapêutica ou componente de albumina de uma proteína de fusão de albumina da presente invenção gerando eficazmente, desse modo, agonistas e antagonistas de uma proteína de fusão de albumina da presente invenção. Ver, de um modo geral, as Patentes U.S. N° 5605793, 5811238, 5830721, 5834252 e 5837458 e
Patten, P. A., et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, S. Trends Beotechnol. 16(2):76-82 (1998);
Hansson, L. O., et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); e
Lorenzo, Μ. M. e Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13 (1998); cada destas patentes e publicações são por este meio incorporadas por referência). Numa forma de realização, a alteração de polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção e, deste modo, as proteínas de fusão de albumina desse modo codificadas, pode ser alcançada por rearranjo de ADN. O rearranjo de ADN envolve o agrupamento de dois ou mais segmentos de ADN numa molécula desejada por recombinação homóloga ou específica de sítio. Noutra forma de realização, os polinucleótidos codificando proteínas de fusão de albumina da invenção e, deste modo, as proteínas de fusão de albumina desse modo codificadas, antes da recombinação, podem ser alterados pela sua submissão a mutagénese aleatória por PCR propenso a erros, inserção nucleotídica aleatória ou outros métodos. Noutra forma de realização, um ou mais componentes, 223 motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc., de uma proteína de fusão de albumina da presente invenção podem ser recombinados com um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma uma ou mais moléculas heterólogas. Em formas de realização preferidas, as moléculas heterólogas são membros de família. Em formas de realização preferidas adicionais, a molécula heteróloga é um factor de crescimento, tais como, por exemplo, factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), factor de crescimento transformante (TGF) alfa, factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF), TGF beta, proteína morfogenética óssea (BMP)-2, BMP-4, BMP-5, ΒΜΡ-β, BMP-7, activinas A e B, decapentaplégico(dpp), 60A, OP-2, dorsalina, factores de diferenciação de crescimento (GDF), nodal, MIS, inibina alpha, TGF betai, TGF beta2, TGF beta3, TGF betaõ e factor neurotrófico de derivação glial (GDNF).
Outros fragmentos preferidos são os fragmentos biologicamente activos da porção de proteína Terapêutica e/ou componente de albumina das proteínas de fusão de albumina da presente invenção. Os fragmentos biologicamente activos são aqueles exibindo actividade semelhante, mas não necessariamente idêntica, a uma actividade de uma porção de proteína Terapêutica e/ou componente de albumina das proteínas de fusão de albumina da presente invenção. A actividade biológica dos fragmentos pode incluir uma actividade desejada melhorada ou uma actividade indesejável diminuída.
Além disso, esta invenção proporciona um método de rastreio de compostos para identificar os que modulam a acção de uma proteína de fusão de albumina da presente invenção. Um exemplo 224 desse ensaio compreende a combinação de uma célula de fibroblasto de mamífero, uma proteína de fusão de albumina da presente invenção e o composto a ser rastreado e 3[H]timidina, sob as condições de cultura celular onde a célula de fibroblasto normalmente proliferaria. Um ensaio de controlo pode ser realizado na ausência do composto a ser rastreado e comparado com a quantidade de proliferação de fibroblasto na presença do composto a determinar se o composto estimula a proliferação, pela determinação da absorção de 3[H]timidina em cada caso. A quantidade de proliferação celular de fibroblasto é medida por cromatografia de cintilação líquida que mede a incorporação de 3[H]timidina. Por este processo podem ser identificados os compostos agonista e antagonista.
Noutro método, uma célula de mamífero ou preparação de membrana expressando um receptor para o componente de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da invenção é incubada com uma proteína de fusão marcada da presente invenção na presença do composto. A capacidade do composto estimular ou bloquear esta interacção poderia ser, depois, medida. Alternativamente, é medida a resposta de um sistema de segundo mensageiro conhecido após interacção de um composto a ser rastreado e do receptor e a capacidade do composto se ligar ao receptor e deduzir uma resposta de segundo mensageiro é medida para determinar se o composto é uma potencial proteína de fusão. Esses sistemas de segundo mensageiro incluem, mas não estão limitados a, cAMP guanilato ciclase, canais iónicos ou hidrólise de fosfoinositídeo.
Todos estes ensaios acima podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico ou prognóstico. As moléculas descobertas utilizando estes ensaios podem ser utilizadas para 225 tratar doença ou para conduzir a um resultado particular num doente (e. g., crescimento de vaso sanguíneo), pela activação ou inibição da proteína de fusão/molécula. Além disso, os ensaios podem descobrir agentes que podem inibir ou estimular a produção das proteínas de fusão de albumina da invenção a partir de células ou tecidos adequadamente manipulados.
Por conseguinte, a invenção inclui um método de identificação de compostos que se ligam a uma proteína de fusão de albumina da invenção, compreendendo as etapas de: (a) incubar um composto de ligação candidato com uma proteína de fusão de albumina da presente invenção; e (b) determinar se a ligação ocorreu. Além disso, a divulgação inclui um método de identificação de agonistas/antagonistas, compreendendo as etapas de: (a) incubar um composto candidato com uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, (b) ensaiar uma actividade biológica e (b) determinar se uma actividade biológica da proteína de fusão foi alterada.
Distribuição Direccionada
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de distribuição de composições a células visadas expressando um receptor para um componente de uma proteína de fusão de albumina da invenção.
Como aqui discutido, as proteínas de fusão da invenção podem estar associadas a polipétidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas ou profármacos, por meio de interacções hidrófobas, hidrófilas, iónicas e/ou covalentes. Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para 226 a distribuição especifica de composições da invenção a células, pela administração de proteínas de fusão da invenção (incluindo anticorpos) que estão associadas a polipéptidos ou ácidos nucleicos heterólogos. Num exemplo, a invenção proporciona um método para a distribuição de uma proteína Terapêutica na célula alvo. Noutro exemplo, a invenção proporciona um método para a distribuição de um ácido nucleico de cadeia simples (e. g., anti-sentido ou ribozimas) ou ácido nucleico de cadeia dupla (e. g., ADN que pode integrar-se no genoma da célula ou replicar-se epissomalmente e que pode ser transcrito) para a célula alvo.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método para a destruição específica de células (e. g., a destruição de células tumorais), pela administração de uma proteína de fusão de albumina da invenção (e. g., polipéptidos da invenção ou anticorpos da invenção), em associação com toxinas ou profármacos citotóxicos.
Por "toxina" entende-se compostos que se ligam e activam sistemas efectores citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas ou quaisquer moléculas ou enzimas não normalmente presentes na superfície de uma célula que, sob condições definidas, causam a morte da célula. As toxinas que podem ser utilizadas de acordo com os métodos da invenção incluem, mas não estão limitadas a, radioisótopos conhecidos na técnica, compostos, tais como, por exemplo, anticorpos (ou de fixação de complemento contendo suas porções) que se ligam a um sistema efector citotóxico endógeno, inerente ou induzido, timidina cinase, endonuclease, RNAse, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da difteria, saporina, 227 momordina, gelonina, proteína antivírica da erva-tintureira, sarcina alfa e toxina da cólera. Por "profármaco citotóxico" entende-se um composto não tóxico que é convertido por uma enzima, normalmente presente na célula, num composto citotóxico. Os profármacos citotóxicos que podem ser utilizados de acordo com os métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, derivados de glutamilo do agente alquilante de mostarda de ácido benzóico, derivados de fosfato de etoposido ou mitomicina C, citosina arabinósida, daunorrubisina e derivados de fenoxiacetamida de doxorrubicina.
Rastreio de Fármaco
Está ainda contemplada a utilização das proteínas de fusão de albumina da presente invenção ou os polinucleótidos codificando estas proteínas de fusão, para rastrear para moléculas que modificam as actividades da proteína de fusão de albumina da presente invenção ou proteínas correspondendo à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão de albumina. Esse método incluiria a colocação da proteína de fusão em contacto com (um) composto(s) seleccionado(s) suspeito (s) de ter(em) actividade de antagonista ou agonista e o ensaio da actividade da proteína de fusão após a ligação.
Esta invenção é particularmente útil para rastrear para compostos terapêuticos, pela utilização das proteínas de fusão de albumina da presente invenção ou seus fragmentos de ligação, em qualquer de uma variedade de técnicas de rastreio de fármacos. A proteína de fusão de albumina empregue nesse teste pode ser fixa a um suporte sólido, expressa na superfície de uma célula, livre em solução ou localizada intracelularmente. Um 228 método de rastreio de fármacos utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas que são transformadas, de um modo estável, com ácidos nucleicos recombinantes expressando a proteína de fusão de albumina. Os fármacos são rastreados contra essas células transformadas ou sobrenadante obtido do cultivo dessas células, em ensaios de ligação competitiva. Pode medir-se, por exemplo, a formação de complexos entre o agente sendo testado e uma proteína de fusão de albumina da presente invenção.
Deste modo, a presente invenção proporciona métodos de rastreio para fármacos ou quaisquer outros agentes que afectam as actividades mediadas pelas proteínas de fusão de albumina da presente invenção. Estes métodos compreendem a colocação desse agente em contacto com uma proteína de fusão de albumina da presente invenção ou um seu fragmento e o ensaio para a presença de um complexo entre o agente e a proteína de fusão de albumina ou um seu fragmento, por métodos bem conhecidos na técnica. Nesse ensaio de ligação competitiva, os agentes a rastrear estão, tipicamente, marcados. Após incubação, o agente livre é separado daquele presente na forma ligada e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade de um agente particular se ligar à proteína de fusão de albumina da presente invenção.
Outra técnica para rastreio de fármacos proporciona rastreio de alta capacidade para compostos tendo afinidade de ligação adequada para uma proteína de fusão de albumina da presente invenção e é descrita em grande detalhe no Pedido de Patente Europeia 84/03564, publicado a 13 de Setembro de 1984, que é aqui incorporado por referência. Exposto de um modo resumido, um grande número de diferentes compostos de teste de 229 péptidos pequenos é sintetizado num substrato sólido, tal como pinos de plástico ou qualquer outra superfície. Os compostos de teste peptídicos são colocados em reacção com uma proteína de fusão de albumina da presente invenção e lavados. Os péptidos ligados são, depois, detectados por métodos bem conhecidos na técnica. A proteína de fusão de albumina purificada pode ser revestida directamente em placas para utilização nas técnicas de rastreio de fármacos mencionadas acima. Além disso, podem ser utilizados anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e imobilizá-lo no suporte sólido.
Esta invenção também contempla a utilização de ensaios de rastreio competitivo de fármacos, nos quais anticorpos neutralizantes, capazes de se ligarem a uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, competem especificamente com um composto de teste para ligação à proteína de fusão de albumina ou seus fragmentos. Neste modo, os anticorpos são utilizados para detectar a presença de qualquer péptido que partilhe um ou mais epitopos antigénicos com uma proteína de fusão de albumina da invenção. Péptidos de Ligação e Outras Moléculas A invenção também abrange métodos de rastreio para a identificação de polipéptidos e não polipéptidos que se ligam a proteínas de fusão de albumina da invenção e às moléculas de ligação desse modo identificadas. Estas moléculas de ligação são úteis, por exemplo, como agonistas e antagonistas das proteínas de fusão de albumina da invenção. Esses agonistas e antagonistas podem ser utilizados, de acordo com a invenção, nas formas de realização terapêuticas descritas em detalhe abaixo. 230
Este método compreende as etapas de: colocação de uma proteína de fusão de albumina da invenção em contacto com uma pluralidade de moléculas; e identificação da molécula que se liga à proteína de fusão de albumina. A etapa de colocação da proteína de fusão de albumina da invenção em contacto com a pluralidade de moléculas pode ser efectuada num número de modos. Por exemplo, pode contemplar-se a imobilização da proteína de fusão de albumina num suporte sólido e colocar uma solução da pluralidade de moléculas em contacto com os polipéptidos imobilizados. Esse processo seria análogo a um processo cromatográfico de afinidade, com a matriz de afinidade sendo constituída pela proteína de fusão de albumina da invenção imobilizada. As moléculas tendo uma afinidade selectiva para a proteína de fusão de albumina podem ser, depois, purificadas por selecção de afinidade. A natureza do suporte sólido, processo para conjugação da proteína de fusão de albumina ao suporte sólido, solvente e condições do isolamento ou selecção de afinidade são largamente convencionais e bem conhecidos para aqueles com conhecimentos gerais na técnica.
Alternativamente, também pode separar-se uma pluralidade de polipéptidos em fracções substancialmente separadas compreendendo um subconjunto de polipéptidos individuais. Por exemplo, pode separar-se a pluralidade de polipéptidos por electroforese em gel, cromatografia de coluna ou método semelhante conhecido de alguém com conhecimentos gerais para a separação de polipéptidos. Os polipéptidos individuais também podem ser produzidos por uma célula hospedeira transformada, de modo a que sejam expressos sobre ou próximo da sua superfície 231 externa (e. g., um fago recombinante) . Os isolados individuais podem ser, depois, "sondados" por uma proteína de fusão de albumina da invenção, opcionalmente na presença de um indutor, caso seja requerido para expressão, para determinar se ocorre qualquer interacção de afinidade selectiva entre a proteína de fusão de albumina e o clone individual. Antes da colocação da proteína de fusão de albumina em contacto com cada fracção compreendendo polipéptidos individuais, os polipéptidos poderiam ser, em primeiro lugar, transferidos para um suporte sólido para conveniência adicional. Esse suporte sólido pode ser, simplesmente, um pedaço de membrana filtrante, tal como uma feita de nitrocelulose ou nylon. Neste modo, os clones positivos poderiam ser identificados a partir de uma colecção de células hospedeiras transformadas de uma biblioteca de expressão, que alberga uma construção de ADN codificando um polipéptido tendo uma afinidade selectiva para uma proteína de fusão de albumina da invenção. Além disso, a sequência de aminoácidos do polipéptido tendo uma afinidade selectiva para uma proteína de fusão de albumina da invenção pode ser determinada directamente por meios convencionais ou a sequência codificante do ADN codificando o polipéptido pode ser, frequentemente, determinada mais convenientemente. A sequência primária pode ser, depois, deduzida a partir da correspondente sequência de ADN. Se a sequência de aminoácidos se destina a ser determinada a partir do próprio polipéptido, podem utilizar-se técnicas de microssequenciação. A técnica de sequenciação pode incluir espectroscopia de massa.
Em determinadas situações, antes de se tentar determinar ou detectar a presença de uma interacção de afinidade selectiva, pode ser desejável remover por lavagem quaisquer polipéptidos não ligados de uma mistura de uma proteína de fusão de albumina 232 da invenção e da pluralidade de polipéptidos. Essa etapa de lavagem pode ser particularmente desejável quando a proteína de fusão de albumina da invenção ou a pluralidade de polipéptidos estiver ligada a um suporte sólido. A pluralidade de moléculas proporcionada de acordo com este método pode ser proporcionada por meio de bibliotecas de diversidade, tais como bibliotecas peptídicas ou não peptídicas, aleatórias ou combinatórias, que podem ser rastreadas para moléculas que se ligam especificamente a uma proteína de fusão de albumina da invenção. Conhecem-se na técnica muitas bibliotecas que podem ser utilizadas, e. g., bibliotecas quimicamente sintetizadas, recombinantes (e. g., bibliotecas de apresentação fágica) e bibliotecas baseadas em tradução in vitro. Os exemplos de bibliotecas quimicamente sintetizadas são descritos em Fodor et al., Science 251:767-773 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991); Lam et al., Nature 354:82-84 (1991); Medynski, Bio/Technology 12:709-710 (1994); Gallop et al., J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994); Ohlmeyer et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA 90:10922-10926 (1993) ; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:11422-11426 (1994) ; Houghten et al., Biotechniques 13:412 (1992); Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:1614-1618 (1994); Salmon et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11708-11712 (1993); Publicação PCT N° WO-93/20242; e Brenner e Lerner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5381-5383 (1992).
Os exemplos de bibliotecas de apresentação fágica são descritos em Scott et al., Science 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Christian et al., 1992, j. Mol. BioL 227:711-718 1992); Lenstra, J. Immunol. Meth. 233 152:149-157 (1992); Kay et al., Gene 128:59-65 (1993); e
Publicação PCT N° WO 94/18318, datada de 18 de Agosto de 1994.
As bibliotecas baseadas em tradução in vitro incluem, mas não estão limitadas, às descritas na Publicação PCT N° WO 91/05058, datada de 18 de Abril de 1991; e Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9022-9026 (1994). A titulo exemplificativo de bibliotecas não peptídicas, uma biblioteca de benzodiazepina (ver, e. g., Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:4708-4712 (1994)) pode ser adaptada para utilização. As bibliotecas de peptóides (Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:9367-9371 (1992)) também podem ser utilizadas. Outro exemplo de uma biblioteca que pode ser utilizada, na qual as funcionalidades de amida em péptidos foram permetiladas para gerar uma biblioteca combinatória quimicamente transformada, é descrito por Ostresh et al. (Proc. NatL Acad. Sei. USA 91:11138-11142 (1994)). É grande a variedade de bibliotecas não peptídicas que são úteis na presente invenção. Por exemplo, Ecker e Crooke (Bio/Technology 13:351-360 (1995), listam benzodiazepinas, hidantoínas, piperazinodionas, bifenilos, análogos de açúcar, beta-mercaptocetonas, ácidos arilacéticos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas e oxazolonas como entre as espécies químicas que formam a base de diversas bibliotecas.
As bibliotecas não peptídicas podem ser classificadas, em traços largos, em dois tipos: monómeros decorados e oligómeros. As bibliotecas de monómeros decorados empregam uma estrutura de esqueleto relativamente simples, sobre a qual é adicionada uma 234 variedade de grupos funcionais. Frequentemente, o esqueleto será uma molécula com uma actividade farmacológica útil conhecida. Por exemplo, o esqueleto poderá ser a estrutura de benzodiazepina.
As bibliotecas de oligómeros não peptídicos utilizam um grande número de monómeros que são agrupados em conjunto, em modos que criam novas formas que dependem da ordem dos monómeros. Entre as unidades de monómero que têm sido utilizadas estão os carbamatos, pirrolinonas e morfolinos. Os peptóides, oligómeros semelhantes a péptidos, nos quais a cadeia lateral está conjugada ao grupo amino alfa, em vez do carbono alfa, formam a base de outra versão de bibliotecas de oligómeros não peptídicos. As primeiras bibliotecas de oligómeros não peptídicos utilizavam um único tipo de monómero e, deste modo, continham um esqueleto de repetição. As bibliotecas recentes têm utilizado mais de um monómero, conferindo às bibliotecas flexibilidade adicionada. 0 rastreio das bibliotecas pode ser alcançado por qualquer de uma variedade de métodos geralmente conhecidos. Ver, e. g., as seguintes referências, que divulgam o rastreio de bibliotecas peptídicas: Parmley et al., Adv. Exp. Med. BioL 251:215-218 (1989); Scott et al, . Science 249:386-390 (1990); Fowlkes et al. , BioTechniques 13:422-427 (1992); Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5393-5397 (1992); Yu et ai., Cell 76:933-945 (1994); Staudt et ai., Science 241:577-580 (1988); Bock et ai., Nature 355:564-566 (1992); Tuerk et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6988-6992 (1992); Ellington et al., Nature 355:850-852 (1992); Pat. U.S. N° 5096815, Pat. U.S. N° 5223409 e Pat. U.S. N° 5198346, todas de Ladner et ai.; 235
Rebar et al., Science 263:671-673 (1993); e Publicação PCT N° WO 94/18318.
Numa forma de realização especifica, o rastreio para identificar uma molécula que se liga a uma proteína de fusão de albumina da invenção pode ser efectuado pela colocação dos membros de biblioteca em contacto com uma proteína de fusão de albumina da invenção imobilizada numa fase sólida e recolha desses membros de biblioteca que se ligam à proteína de fusão de albumina. Os exemplos desses métodos de rastreio, designados técnicas de "enriquecimento", são descritos, a título de exemplo, em Parmley et al., Gene 73:305-318 (1988); Fowlkes et al., BioTechniques 13:422-427 (1992); Publicação PCT N° WO 94/18318; e em referências aqui citadas.
Noutra forma de realização, o sistema de duplo híbrido para selecção de proteínas de interacção em levedura (Fields et ai., Nature 340:245-246 (1989); Chien et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:9578-9582 (1991), pode ser utilizado para identificar moléculas que se ligam especificamente a polipéptidos da invenção.
Onde a molécula de ligação é um polipéptido, o polipéptido pode ser convenientemente seleccionado de qualquer biblioteca peptídica, incluindo bibliotecas peptídicas aleatórias, bibliotecas peptídicas combinatórias ou bibliotecas peptídicas enviesadas. O termo "enviesada" é aqui utilizado para significar que o método de geração da biblioteca é manipulado de modo a restringir um ou mais parâmetros que governam a diversidade da colecção de moléculas resultante, neste caso, péptidos. 236
Deste modo, uma biblioteca peptídica verdadeiramente aleatória geraria uma colecção de péptidos, em que a probabilidade de encontrar um aminoácido particular numa dada posição do péptido é a mesma para todos os 20 aminoácidos. Contudo, um enviesamento pode ser introduzido na biblioteca especificando, por exemplo, que uma lisina ocorre a cada quinto aminoácido ou que as posições 4, 8 e 9 de uma biblioteca decapeptidica sejam fixas para incluir apenas arginina. Claramente, muitos tipos de enviesamentos podem estar contemplados e a presente invenção não está restringida a qualquer enviesamento particular. Além disso, a presente invenção contempla tipos específicos de bibliotecas peptídicas, tais como bibliotecas peptídicas de apresentação fágica e as que utilizam uma construção de ADN compreendendo um vector de fago lambda com um inserto de ADN.
Como mencionado acima, no caso de uma molécula de ligação que é um polipéptido, o polipéptido pode ter cerca de 6 a menos de cerca de 60 resíduos de aminoácido, de um modo preferido, cerca de 6 a cerca de 10 resíduos de aminoácido e, de um modo muito preferido, cerca de 6 a cerca de 22 aminoácidos. Noutra forma de realização, um polipéptido de ligação tem na gama de 15-100 aminoácidos ou 20-50 aminoácidos. O polipéptido de ligação seleccionado pode ser obtido por síntese química ou expressão recombinante.
Outras Actividades
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da 237 invenção podem ser empregues no tratamento para estimulação de revascularização de tecidos isquémicos, devido a diversos estados de doença, tais como trombose, arteriosclerose e outros estados cardiovasculares. As proteínas de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótidos codificando proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser empregues para estimular a angiogénese e regeneração de membro, como discutido acima.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser empregues para tratamento de feridas devido a lesões, queimaduras, reparação de tecido pós-operativo e úlceras, visto serem mitogénicos para diversas células de diferentes origens, tais como células de fibroblasto e células de músculo esquelético e, por conseguinte, facilitarem a reparação ou substituição de tecido danificado ou doente.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser empregues para estimular o crescimento neuronal e para tratar e prevenir a lesão neuronal que ocorre em determinados distúrbios neuronais ou estados neurodegenerativos, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e complexo relacionado com SIDA. Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção podem ter a capacidade para estimular o crescimento de condrócitos, por conseguinte, podem ser empregues para estimular a regeneração óssea e periodontal e auxiliar em transplantes tecidulares ou enxertos ósseos.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da 238 invenção também podem ser empregues para prevenir o envelhecimento da pele devido a queimadura solar, pela estimulação do crescimento de queratinócitos.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser empregues para prevenir a perda de cabelo, visto que os membros da família de FGF activam as células de formação de cabelo e promovem o crescimento de melanócitos. Na mesma linha, uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção podem ser empregues para estimular o crescimento e diferenciação de células hematopoiéticas e células da medula óssea quando utilizados em combinação com outras citocinas.
Na mesma linha, uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser empregues para manter os órgãos antes da transplantação ou para o suporte de cultura celular de tecidos primários. Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser empregues para a indução da diferenciação de tecido de origem mesodérmica em embriões prematuros.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também pode aumentar ou diminuir a diferenciação ou proliferação de células estaminais embrionárias, além, como discutido anteriormente, da linhagem hematopoiética. 239
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser utilizados para modular características de mamífero, tais como altura corporal, peso, cor de cabelo, cor dos olhos, pele, percentagem de tecido adiposo, pigmentação, tamanho e forma (e. g., cirurgia cosmética). De modo semelhante, uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para modular metabolismo de mamífero afectando catabolismo, anabolismo, processamento, utilização e armazenamento de energia.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção podem ser utilizados para alterar o estado mental ou estado físico de um mamífero, pela influência de biorritmos, ritmos cardíacos, depressão (incluindo distúrbios depressivos), tendência para a violência, tolerância à dor, capacidades reprodutivas (de um modo preferido, por actividade de Activina ou semelhante a Inibina), níveis hormonais ou endócrinos, apetite, libido, memória, stress ou outras qualidades cognitivas.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção também podem ser utilizados como um aditivo ou conservante alimentar, de modo a aumentar ou diminuir capacidades de armazenamento, teor de gordura, lípido, proteína, hidrato de carbono, vitaminas, minerais, cofactores ou outros componentes nutricionais. 240
As aplicações recitadas acima têm utilizações numa ampla variedade de hospedeiros. Esses hospedeiros incluem, mas não estão limitados a, humano, murino, coelho, cabra, cobaio, camelo, cavalo, murganho, rato, hámster, porco, microporco, galinha, cabra, vaca, ovelha, cão, gato, primata não humano e humano. Em formas de realização especificas, o hospedeiro é um murganho, coelho, cabra, cobaio, galinha, rato, hámster, porco, ovelha, cão ou gato. Em formas de realização preferidas, o hospedeiro é um mamífero. Em formas de realização muito preferidas, o hospedeiro é um humano.
Tendo a invenção sido descrita na generalidade, a mesma irá ser mais facilmente compreendida por referência aos seguintes exemplos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Geração de pScNHSA e pScCHSA.
Os vectores pScNHSA (Depósito ATCC N° PTA-3279) e pScCHSA (Depósito ATCC N° PTA-3276) são derivados de pPPC0005 (Depósito ATCC N° PTA-3278) e são utilizados como vectores de clonagem, dentro dos quais os polinucleótidos codificando uma proteína terapêutica ou seu fragmento ou variante são inseridos, adjacentes e em fase de tradução, com polinucleótidos codificando albumina sérica humana "HSA". 0 pScCHSA pode ser utilizado para geração de fusões de proteína Terapêutica-HSA, enquanto o pScNHSA pode ser utilizado para gerar fusões de HSA-proteína Terapêutica. 241
Geração de pScCHSA: fusão de albumina com a fracção de albumina C-terminal em relação à porção terapêutica.
Para facilitar a clonagem de ADN codificando uma proteína Terapêutica N-terminal em relação ao ADN codificando a proteína de albumina madura, foi preparado um vector pela alteração da sequência de ácidos nucleicos que codifica o péptido sinal de HSA quimérico em pPPC0005 para incluir os sítios de restrição Xho I e Cia I.
Em primeiro lugar, os sítios Xho I e Cia I inerentes a pPPC0005 (localizados a 3' da sequência terminadora de ADH1) foram eliminados pela digestão de pPPC0005 com Xho I e Cia I, preenchendo as extremidades coesivas com T4 ADN polimerase e religando as extremidades rombas para criar o pPPCOOOô.
Em segundo lugar, os sítios de restrição Xho I e Cia I foram manipulados na sequência de ácidos nucleicos que codifica o péptido sinal de HSA (uma quimera do líder de HSA e um sítio de kex2 do factor alfa de cruzamento, "MAF") em pPPCOOOô, utilizando dois ciclos de PCR. No primeiro ciclo de PCR, foi realizada a amplificação com os iniciadores mostrados como SEQ ID N°: 1039 e SEQ ID N°: 1040. O iniciador, cuja sequência é mostrada como SEQ ID N°: 1039, compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica parte da sequência de péptido sinal de HSA, um sítio de kex2 da sequência líder do factor alfa de cruzamento e parte da terminação amino da forma madura de HSA. Quatro mutações pontuais foram introduzidas na sequência, criando os sítios Xho I e Cia I verificados na junção do péptido sinal quimérico e na forma madura de HSA. Estas quatro mutações estão sublinhadas na sequência mostrada abaixo. Em pPPCOOOô, os 242 nucleótidos nestas quatro posiçoes de 5' para 3' são T, G, T e G. 5'-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGT TGC TCATCGATT TAAAGAT TTGGG- 3' (SEQ ID N°: 1039) e 5'-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAA TAAGC-3' (SEQ ID N°: 1040). Um segundo ciclo de PCR foi, depois, realizado com um iniciador flanqueante a montante, 5'-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3' (SEQ ID N° : 1041) e um iniciador flanqueante a jusante 5'-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3' (SEQ ID N°: 1042). O produto de PCR resultante foi, depois, purificado e digerido com Afl II e Xba I e ligado nestes mesmos sitios em pPPC0006, criando pScCHSA. O plasmideo resultante tem os sitios Xho I e Cia I manipulados na sequência sinal. A presença do sitio Xho I cria uma única alteração de aminoácido na extremidade da sequência sinal de LDKR para LEKR. A alteração de D em E não estará presente no plasmideo de expressão de proteína de fusão de albumina final, quando uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um polinucleótido codificando a porção Terapêutica da proteína de fusão de albumina com um sítio Sal I em 5' (que é compatível com o sítio Xho I) e um sítio Cia
I em 3' que está ligado nos sítios Xho I e Cia I de pScCHSA. A ligação de Sal I a Xho I restaura a sequência de aminoácidos original da sequência de péptido sinal. . 0 ADN codificando a porção Terapêutica da proteína de fusão de albumina pode ser inserido a seguir ao sítio de Kex2 (a Kex2 cliva a seguir à sequência de aminoácidos KR dibásica na extremidade do péptido sinal) e antes do sítio Cia I. 243
Geração de pScNHSA: fusão de albumina com a fracção de albumina N-terminal em relação à porção terapêutica.
Para facilitar a clonagem de ADN codificando uma porção de proteína Terapêutica C-terminal em relação ao ADN codificando a proteína de albumina madura, foi preparado um vector pela adição três sítios de restrição, de oito pares de bases, a pScCHSA. Os sítios de restrição Asc I, Fse I e Pme I, foram adicionados entre os sítios Bsu36 I e Hind III na extremidade da sequência de ácidos nucleicos codificando a proteína de HSA madura. Isto foi alcançado através da utilização de dois iniciadores sintéticos complementares contendo os sítios de restrição Asc I, Fse I e Pme I sublinhados (SEQ ID N° : 1043 e SEQ ID N° : 1044). 5'-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCT TAATTCT-3' (SEQ ID N°: 1043) e 5-AGAAWAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCCTATTATAAGCCTAAG GCAGCTT-3' (SEQ ID N°: 1044). Estes iniciadores foram emparelhados e digeridos com Bsu36 I e Hind III e ligados nos mesmos sítios em pScCHSA, criando pScNHSA. EXEMPLO 2: Geração de Construção Geral para Transformação de Levedura.
Os vectores pScNHSA e pScCHSA podem ser utilizados como vectores de clonagem, dentro dos quais os polinucleótidos codificando uma proteína Terapêutica ou seu fragmento ou variante são inseridos, adjacentes aos polinucleótidos codificando albumina sérica humana madura "HSA". O pScCHSA é utilizado para geração de fusões de proteína Terapêutica-HSA, enquanto o pScNHSA pode ser utilizado para gerar fusões de HSA-proteína Terapêutica. 244
Geraçao de construções de fusão de albumina compreendendo produtos de fusão de HSA-proteína Terapêutica, 0 ADN codificando uma proteína Terapêutica (e. g. , sequências mostradas na SEQ ID N° : X ou conhecidas na técnica) pode ser amplificado por PCR utilizando os iniciadores que facilitam a geração de uma construção de fusão (e. g., pela adição de sítios de restrição, codificando fusões sem interrupção, codificando sequências ligantes, etc.)· Por exemplo, um especialista na técnica poderia conceber um iniciador 5' que adiciona polinucleótidos codificando os últimos quatro aminoácidos da forma madura de HSA (e contendo o sítio Bsu361) na extremidade 5' de ADN codificando uma proteína Terapêutica; e um iniciador 3' que adiciona um codão de TERMINAÇÃO e sítios de clonagem apropriados na extremidade 3' da sequência codificante de proteína Terapêutica. Por exemplo, o iniciador directo utilizado para amplificar ADN codificando uma proteína Terapêutica poderá ter a sequência 5 ' -aagctGCCTTAGGCTTA (N) i5-3 ' (SEQ ID N° : 1045), onde a sequência sublinhada é um sítio Bsu361, os nucleótidos em letra maiúscula codificam os últimos quatro aminoácidos da proteína madura de HSA (ALGL) e o (N) 15 é idêntico aos primeiros 15 nucleótidos codificando a proteína Terapêutica de interesse. De modo semelhante, o iniciador inverso utilizado para amplificar ADN codificando uma proteína Terapêutica poderá ter a sequência, 5'-GCGCGCGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTA(N)i5-3 ' (SEQ ID N°: 1046), onde a sequência em itálico é um sítio Pme I, a sequência duplamente sublinhada é um sítio Fse I, a sequência com um único sublinhado é um sítio Asc I, os nucleótidos dentro de caixas são o complemento inverso de dois codões de terminação em tandem e o (N) 15 é idêntico ao complemento inverso dos últimos 15 nucleótidos codificando a proteína Terapêutica de interesse. 245
Uma vez amplificado o produto de PCR, pode ser cortado com Bsu36l e uma de (Asc I, Fse I ou Pme I) e ligado em pScNHSA. A presença do sítio Xho I na sequência líder quimérica de HSA cria uma única alteração de aminoácido na extremidade da sequência sinal quimérica, i. e., a sequência sinal de HSA-kex2, de LDKR (SEQ ID N°: 2139) em LEKR (SEQ ID N°: 2140).
Geração de construções de fusão de albumina compreendendo produtos de fusão de gene-HSA.
De modo semelhante ao método descrito acima, o ADN codificando uma proteína Terapêutica pode ser amplificado por PCR, utilizando os seguintes iniciadores: Um iniciador 5', que adiciona polinucleótidos contendo um sítio Sall e codificando os últimos três aminoácidos da sequência líder de HSA, DKR, na extremidade 5' de ADN codificando uma proteína Terapêutica; e um iniciador 3' que adiciona Polinucleótidos codificando os primeiros poucos aminoácidos da HSA madura contendo um sítio Cia I na extremidade 3' de ADN codificando uma proteína Terapêutica. Por exemplo, o iniciador directo utilizado para amplificar o ADN codificando uma proteína Terapêutica poderá ter a sequência 5'-aggagcgtcGACAAAAGA(N) ί5-3' (SEQ ID N°: 1047), onde a sequência sublinhada é um sítio Sal I, os nucleótidos em letra maiúscula codificam os últimos três aminoácidos da sequência líder de HSA (DKR) e o (N)15 é idêntico aos primeiros 15 nucleótidos codificando a proteína Terapêutica de interesse. De modo semelhante, o iniciador inverso utilizado para amplificar o ADN codificando uma proteína Terapêutica poderá ter a sequência 5'-CTTTAAArCGArGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N) 15-3'(SEQ ID N° : 1048), onde a sequência em itálico é um sítio 246
Cia I, os nucleótidos sublinhados são o complemento inverso do ADN codificando os primeiros 9 aminoácidos da forma madura de HSA (DAHKSEVAH, SEQ ID N°: 1106) e o (N) 15 é idêntico ao complemento inverso dos últimos 15 nucleótidos codificando a proteína Terapêutica de interesse. Uma vez amplificado o produto de PCR, pode ser cortado com Sal I e Cia I e ligado em pScCHSA digerido com Xho I e Cia I. Uma sequência sinal ou líder diferente pode ser desejada, por exemplo, invertase "INV" (Acesso Swiss-Prot P00724), factor alfa de cruzamento "MAF" (Acesso GenBank AAA18405), MPIF (Geneseq AAF82936), Fibulina B (Acesso Swiss-Prot P23142), Clusterina (Acesso Swiss-Prot P10909), Proteína 4 de Ligação do Factor de Crescimento Semelhante a Insulina (Acesso Swiss-Prot P22692) e as permutações da sequência líder de HSA podem ser subclonadas no vector apropriado por meio de métodos correntes conhecidos na técnica.
Geração da construção de fusão de albumina compatível para expressão na levedura S. cerevisiae. O fragmento de Not I contendo o ADN codificando uma proteína de fusão de albumina N-terminal ou C-terminal gerado a partir de pScNHSA ou pScCHSA pode ser, depois, clonado no sítio Not I de pSAC35 que tem um marcador seleccionável de LEU2. O vector resultante é, depois, utilizado na transformação de um sistema de expressão da levedura S. cerevisiae. 247 EXEMPLO 3: Expressão Geral na Levedura S. cerevisiae.
Um vector de expressão compatível com expressão de levedura pode ser transformado na levedura S. cerevisiae por transformação com acetato de lítio, electroporação ou outros métodos conhecidos na técnica e/ou como descrito, em parte, em Sambrook, Fritsch e Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição", volumes 1-3 e em Ausubel et al. 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medicai School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4. Os vectores de expressão são introduzidos nas estirpes DXY1, D88 ou BXP10 de S. cerevisiae por transformação, os transformantes individuais podem ser cultivados, por exemplo, durante 3 dias, a 30 °C, em 10 mL de YEPD (extracto de levedura a 1%, p/v, peptona a 2%, p/v, dextrose a 2%, p/v) e as células podem ser recolhidas na fase estacionária após 60 horas de crescimento. Os sobrenadantes são recolhidos pela clarificação das células a 3000 g, durante 10 minutos. O pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42 e ver a Figura 3) compreende, além do marcador seleccionável de LEU2, o plasmídeo 2 ym de levedura integral, para proporcionar funções de replicação, o promotor de PRB1 e o sinal de terminação de ADH1. EXEMPLO 4: Purificação Geral de uma Proteína de Fusão de Albumina Expressa a partir de uma Fusão de Albumina na Levedura S. cerevisiae.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem a forma madura de HSA 248 fundida à terminação N ou C da forma madura de uma proteína terapêutica ou suas porções (e. g., a forma madura de uma proteína terapêutica listada na Tabela 1 ou a forma madura de uma proteína terapêutica mostrada na Tabela 2 como SEQ ID N°: Z) . Numa forma de realização da invenção, as proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem, ainda, uma sequência sinal que dirige o polipéptido de fusão nascente nas vias secretórias do hospedeiro utilizado para expressão. Numa forma de realização preferida, o péptido sinal codificado pela sequência sinal é removido e a proteína de fusão de albumina madura é segregada directamente no meio de cultura. As proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem, de um modo preferido, sequências sinal heterólogas (e. g., a sequência sinal não nativa de uma proteína terapêutica particular), incluindo, mas não limitadas a, MAF, INV, Ig, Fibulina B, Clusterina, Proteína 4 de Ligação do Factor de Crescimento Semelhante a Insulina, sequências líder variantes de HSA, incluindo, mas não limitadas a, uma sequência líder de HSA/MAF quimérica ou outras sequências sinal heterólogas conhecidas na técnica. São especialmente preferidas as sequências sinal listadas na Tabela 2 e/ou a sequência sinal listada nas secções "Expressão de Proteínas de Fusão" e/ou "Métodos Adicionais de Produção Recombinante e Sintética de Proteínas de Fusão de Albumina" da descrição acima. Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão da invenção compreendem, ainda, um resíduo de metionina N-terminal. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos, incluindo fragmentos e/ou variantes, também estão abrangidos pela invenção.
As proteínas de fusão de albumina expressas na levedura, como descrito acima, podem ser purificadas, em pequena escala, numa coluna de afinidade peptídica Dyax, como se segue. Os 249 sobrenadantes de levedura expressando uma proteína de fusão de albumina são diafiltrados contra tampão de fosfatos a 3 mM, pH 6,2, NaCl a 20 mM e Tween 20 a 0,01%, para reduzir o volume e remover os pigmentos. A solução é, depois, filtrada através de um dispositivo de 0,22 pm. O filtrado é carregado numa coluna de afinidade peptídica Dyax. A coluna é eluída com tampão de Tris/HCl a 100 mM, pH 8,2. As fracções de pico contendo proteína são recolhidas e analisadas em SDS-PAGE, após concentração de 5 vezes.
Para purificação de grande escala, pode ser utilizado o seguinte método. O sobrenadante, superior a 2 L, é diafiltrado e concentrado para 500 mL em Tris/HCl a 20 mM, pH 8,0. A solução de proteína concentrada é carregada numa coluna de DEAE-Sepharose Fast Flow de 50 mL pré-equilibrada, a coluna é lavada e a proteína é eluída com um gradiente linear de NaCl de 0 até 0,4 M de NaCl, em Tris/HCl a 20 mM, pH 8,0. As fracções contendo a proteína são agregadas, ajustadas para pH 6,8 com fosfato de sódio a 0,5 M (NaH2P04) . Uma concentração final de (NH4)2S04 a 0,9 M é adicionada à solução de proteína e a solução intacta é carregada numa coluna de Butyl650S de 50 mL pré-equilibrada. A proteína é eluída com um gradiente linear de sulfato de amónio ((NH4)2S04 a 0,9 até 0 M) . As fracções com a fusão de albumina são novamente agregadas, diafiltradas contra tampão de Na2HP04/ácido cítrico a 10 mM, pH 5,75 e carregadas numa coluna de SP-Sepharose Fast Flow de 50 mL pré-equilibrada. A proteína é eluída com um gradiente linear de NaCl de 0 até 0,5 M. As fracções contendo a proteína de interesse são combinadas, o tampão é alterado para Na2BP04/ácido cítrico a 10 mM, pH 6,25, com um concentrador Amicon, a condutividade é < 2,5 mS/cm. Esta solução de proteína é carregada numa coluna de alta resolução Q-Sepharose de 15 mL pré-equilibrada, a coluna é lavada e a 250 proteína é eluída com um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,15 M de NaCl. A proteína purificada pode ser, depois, formulada numa composição tampão específica por troca de tampão. EXEMPLO 5: Geração de Construção Geral para Transfecção de Célula de Mamífero.
Geração da construção de fusão de plalbumina compatível para expressão em linhas celulares de mamífero.
As construções de fusão de albumina podem ser geradas em vectores de expressão para utilização em sistemas de cultura de células de mamífero. O ADN codificando uma proteína terapêutica pode ser clonado no terminal N ou terminação C em relação a HSA num vector de expressão de mamífero, por métodos correntes conhecidos na técnica (e. g. , amplificação por PCR, digestão de restrição e ligação) . Uma vez construído o vector de expressão, a transfecção num sistema de expressão de mamífero pode prosseguir. Os vectores adequados são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados, por exemplo, ao vector pC4 e/ou os vectores disponíveis da Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). O ADN codificando albumina sérica humana foi clonado no vector pC4 que é adequado para sistemas de cultura de mamífero, criando o plasmídeo pC4:HSA (Depósito ATCC N° PTA-3277). Este vector tem um gene da Di-Hidrofolato Redutase, "DHFR", que permitirá a selecção na presença de metotrexato. O vector pC4:HSA é adequado para expressão de proteínas de fusão de albumina em células CHO. Para expressão noutros sistemas de cultura de células de mamífero, pode ser desejável 251 subclonar um fragmento compreendendo ou, alternativamente, consistindo em ADN que codifica para uma proteína de fusão de albumina num vector de expressão alternativo. Por exemplo, um fragmento compreendendo ou, alternativamente, consistindo em ADN que codifica para uma proteína de fusão de albumina madura pode ser subclonado noutro vector de expressão, incluindo, mas não limitado a, quaisquer dos vectores de expressão de mamífero aqui descritos.
Numa forma de realização preferida, ADN codificando uma construção de fusão de albumina é subclonado em vectores proporcionados pela Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH), por processos conhecidos na técnica para expressão em células NSO.
Geração de construções de fusão de albumina compreendendo produtos de fusão de HSA-Proteína Terapêutica
Utilizando pC4:HSA (Depósito ATCC N° PTA-3277), podem ser geradas construções de fusão de albumina, nas quais a porção de proteína Terapêutica está C terminal em relação à sequência de albumina madura. Por exemplo, pode clonar-se ADN codificando uma proteína Terapêutica ou seu fragmento ou variante entre os sítios de restrição Bsu 361 e Asc I do vector. Quando se clona em Bsu 361 e Asc I, pode ser empregue a mesma concepção de iniciador utilizada para clonar no sistema vector de levedura (SEQ ID N°: 1045 e 1046) (ver o Exemplo 2). 252
Geração de construções de fusão de albumina compreendendo produtos de fusão de gene-HSA.
Utilizando pC4:HSA (Depósito ATCC N° PTA-3277), podem ser geradas construções de fusão de albumina, nas quais uma porção de proteína Terapêutica é clonada N terminal em relação à sequência de albumina madura. Por exemplo, pode clonar-se ADN codificando uma proteína Terapêutica que tenha a sua própria sequência sinal entre os sítios Bam Hl (ou Hind III) e Cia I de pC4:HSA. Quando se clona no sítio Bam Hl ou Hind III, prefere-se incluir uma sequência de Kozak (CCGCCACCATG, SEQ ID N° : 1107) antes do codão de iniciação de tradução do ADN codificando a proteína Terapêutica. Se uma proteína Terapêutica não tiver uma sequência sinal, o ADN codificando essa proteína Terapêutica pode ser clonado entre os sítios Xho I e Cia I de pC4:HSA. Quando se utiliza o sítio Xho I, podem ser utilizados os seguintes iniciadores 5' (SEQ ID N°: 1052) e 3' (SEQ ID N°: 1053) de PCR exemplificativos: 5 ' -CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N) i8-3' (SEQ ID N°: 1052) 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N) 18-3 ' (SEQ ID N°: 1053)
No iniciador 5' (SEQ ID N°: 1052), a sequência sublinhada é um sítio Xho I; e o sítio Xho I e o ADN a seguir ao sítio Xho I codificam para os últimos sete aminoácidos da sequência líder de albumina sérica humana natural. Na SEQ ID N°: 1052, o "(N) is" é ADN idêntico aos primeiros 18 nucleótidos codificando a proteína Terapêutica de interesse. No iniciador 3' (SEQ ID N°: 1053), a sequência sublinhada é um sítio Cia I; e o sítio Cia I e o ADN que lhe segue é o complemento inverso do ADN codificando os primeiros 10 aminoácidos da proteína de HSA madura 253 (SEQ ID N°: 1038). Na SEQ ID N°: 1053, o "(N)i8" é o complemento inverso do ADN codificando os últimos 18 nucleótidos codificando a proteína Terapêutica de interesse. Utilizando estes dois iniciadores, pode amplificar-se por PCR a proteína Terapêutica de interesse, purificar o produto de PCR, digeri-lo com as enzimas de restrição Xho I e Cia I e cloná-lo nos sítios Xho I e Cia I no vector pC4:HSA.
Se for desejada uma sequência líder alternativa, a sequência líder de albumina nativa pode ser substituída com o líder de albumina quimérico, 1. e., o péptido sinal de HSA-kex2, ou um líder alternativo, por métodos correntes conhecidos na técnica. (Por exemplo, um especialista na técnica poderia rotineiramente amplificar por PCR um líder alternativo e subclonar o produto de PCR numa construção de fusão de albumina no lugar do líder de albumina mantendo, simultaneamente, a fase de leitura). EXEMPLO 6: Expressão Geral em Linhas Celulares de Mamífero.
Uma construção de fusão de albumina, gerada num vector de expressão compatível com a expressão em linhas celulares de mamífero, pode ser transfectada em linhas celulares apropriadas por precipitação por fosfato de cálcio, lipofectamina, electroporação ou outros métodos de transfecção conhecidos na técnica e/ou como descrito em Sambrook, Fritsch e Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição" e em Ausubel et al. 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard
Medicai School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4. As células transfectadas são, depois, seleccionadas 254 pela presença de um agente de selecçao, determinado pelo marcador seleccionável no vector de expressão. 0 vector de expressão pC4 (Acesso ATCC N° 209646) é um derivado do plasmídeo pSV2-DHFR (Acesso ATCC N° 37146). O pC4 contém o forte promotor Repetições Terminais Longas "LTR" do Vírus do Sarcoma de Rous (Cullen et al., Março de 1985, Molecular and Cellular Biology, 438-447) e um fragmento do estimulador do CitoMegaloVírus "CMV" (Bosbart et al., 1985, Cell 41: 521-530). O vector também contém o intrão 3', o sinal de poliadenilação e terminação do gene de pré-proinsulina de rato e o gene de DHFR de murganho sob controlo do promotor precoce de SV40. As células de ovário de hámster Chinês (CHO) ou outras linhas celulares desprovidas de um gene de DHFR activo são utilizadas para transfecção. A transfecção de uma construção de fusão de albumina em pC4 em células CHO, por métodos conhecidos na técnica, permitirá a expressão da proteína de fusão de albumina em células CHO, seguida de clivagem da sequência líder e secreção no sobrenadante. A proteína de fusão de albumina é, depois, ainda, purificada do sobrenadante. O vector de expressão pEE12.1 é proporcionado pela Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) e é um derivado de pEE6 (Stephens e Cockett, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 7110). Este vector compreende um promotor, estimulador e região não traduzida 5' completa do gene Precoce Imediato Principal do CitoMegaloVírus humano, "hCMV-MIE" (Publicação Internacional N° W089/01036), a montante de uma sequência de interesse e um gene da Glutamina Sintetase (Murphy et al., 1991, Biochem J. 227: 277-279; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169-175; patente US 5122,464), para efeitos de selecção de células transfectadas em meio selectivo contendo metionina sulfoximina. 255 A transfecçao de construções de fusão de albumina preparadas em
pEE12.1 em células NSO (Publicação Internacional N° W086/05807) , por métodos conhecidos na técnica, permitirá a expressão da proteína de fusão de albumina em células NSO, seguida de clivagem da sequência líder e secreção no sobrenadante. A proteína de fusão de albumina é, depois, ainda, purificada do sobrenadante, utilizando técnicas aqui descritas ou, de outro modo, conhecidas na matéria. A expressão de uma proteína de fusão de albumina pode ser analisada, por exemplo, por SDS-PAGE e transferência de Western, análise de HPLC de fase reversa ou outros métodos conhecidos na técnica.
As linhas celulares CHO e NSO estáveis, transfectadas com construções de fusão de albumina, são geradas por métodos conhecidos na técnica (e. g. , transfecção de lipofectamina) e seleccionadas, por exemplo, com metotrexato a 100 nM para vectores tendo o gene da Di-HidroFolato Redutase "DHFR" como um marcador seleccionável ou através de crescimento na ausência de glutamina. Os níveis de expressão podem ser examinados, por exemplo, por imunotransferência, em primeiro lugar com um soro anti-HSA como anticorpo primário ou, em segundo lugar, com soro contendo anticorpos dirigidos para a porção de proteína Terapêutica de uma dada proteína de fusão de albumina como anticorpo primário.
Os níveis de expressão são examinados por detecção de imunotransferência com soro anti-HSA como anticorpo primário. As taxas de produtividade específica são determinadas por meio de ELISA, no qual o anticorpo de captura pode ser um anticorpo monoclonal para a porção de proteína Terapêutica da fusão de 256 albumina e o anticorpo de detecção pode ser o anticorpo monoclonal biotinilado anti-HSA (ou vice-versa) , seguido de ligação e análise de peroxidase de rábano/estreptavidina de acordo com o protocolo do fabricante. EXEMPLO 7: Purificação Geral de uma Proteína de Fusão de Albumina Expressa a partir de uma Construção de Fusão de Albumina em Linhas Celulares de Mamifero.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem a forma madura de HSA fundida à terminação N ou C da forma madura de uma proteína terapêutica ou suas porções (e. g., a forma madura de uma proteína terapêutica listada na Tabela 1 ou a forma madura de uma proteína terapêutica mostrada na Tabela 2 como SEQ ID N° : Z) . Numa forma de realização da invenção, as proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem, ainda, uma sequência sinal que dirige o polipéptido de fusão nascente nas vias secretórias do hospedeiro utilizado para expressão. Numa forma de realização preferida, o péptido sinal codificado pela sequência sinal é removido e a proteína de fusão de albumina madura é segregada directamente no meio de cultura. As proteínas de fusão de albumina da invenção compreendem, de um modo preferido, sequências sinal heterólogas (e. g., a sequência sinal não nativa de uma proteína terapêutica particular), incluindo, mas não limitadas a, MAF, INV, Ig, Fibulina B,
Clusterina, Proteína 4 de Ligação do Factor de Crescimento Semelhante a Insulina, sequências líder variantes de HSA, incluindo, mas não limitadas a, uma sequência líder de HSA/MAF quimérica ou outras sequências sinal heterólogas conhecidas na técnica. São especialmente preferidas as sequências sinal 257 listadas na Tabela 2 e/ou a sequência sinal listada nas secções "Expressão de Proteínas de Fusão" e/ou "Métodos Adicionais de Produção Recombinante e Sintética de Proteínas de Fusão de Albumina" da descrição acima. Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão da invenção compreendem, ainda, um resíduo de metionina N-terminal. Os polinucleótidos codificando estes polipéptidos, incluindo fragmentos e/ou variantes, também estão abrangidos pela invenção.
As proteínas de fusão de albumina de sobrenadantes de linhas celulares de mamífero são purificadas de acordo com diferentes protocolos, dependendo do sistema de expressão utilizado.
Purificação a partir das linhas celulares CHO e 293T. A purificação de uma proteína de fusão de albumina a partir de sobrenadante de células CHO, ou de sobrenadante de células 293T transfectadas de um modo transiente, pode envolver a captura inicial com uma resina aniónica de HQ, utilizando um tampão de fosfato de sódio e uma eluição de gradiente de fosfato, seguido de cromatografia de afinidade numa coluna Blue sepharose FF, utilizando uma eluição de gradiente salino. A Blue Sepharose FF remove os principais contaminantes de BSA/fetuina. A purificação adicional numa resina Poros PI 50 com um gradiente de fosfato pode remover e baixar a contaminação de endotoxina, assim como concentrar a proteína de fusão de albumina. 258
Purificação a partir da linha celular NSO. A purificação de uma proteína de fusão de albumina a partir de um sobrenadante celular de NSO pode envolver cromatografia de permuta aniónica de Q-Sepharose, seguida de purificação de SP-sepharose com uma etapa de eluição, seguida de purificação de Phenyl-650M com uma etapa de eluição e, por fim, diafiltração. A proteína purificada pode ser, depois, formulada por troca de tampão.
Exemplo 40: Isolamento de um Clone de ADNc Seleccionado da Amostra Depositada.
Muitas das construções de fusão de albumina da invenção foram depositadas com a ATCC, como mostrado na Tabela 3. As construções de fusão de albumina podem compreender qualquer um dos seguintes vectores de expressão: o vector de expressão pSAC35 da levedura S. cerevisiae, o vector de expressão pC4 de mamífero ou o vector de expressão pEE12.1 de mamífero.
Os vectores pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42), pC4 (Acesso ATCC N° 209646; Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (1985); Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)) e pEE12.1 (Lonza Biologics, Inc.; Stephens e Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110 (1989); Publicação Internacional N° W089/01036; Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992); patente US 5122464; Publicação Internacional N° WO86/05807) compreendem um gene de resistência a ampicilina para crescimento em células bacterianas. Estes vectores e/ou uma construção de 259 fusão de albumina compreendendo-os podem ser transformados numa estirpe de E. coli, tal como Stratagene XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037) utilizando técnicas descritas no campo técnico, tal como Hanahan, propagação em placas de ágar Luria-Broth contendo ampicilina a 100 pg/mL e cultivadas, de um dia para o outro, a 37 °C. O material depositado na amostra, a que foi atribuído o Número de Depósito ATCC citado na Tabela 3, para qualquer dada construção de fusão de albumina também pode conter uma ou mais construções de fusão de albumina, cada codificando diferentes proteínas de fusão de albumina. Deste modo, os depósitos partilhando o mesmo Número de Depósito ATCC contêm, pelo menos, uma construção de fusão de albumina identificada na correspondente fileira da Tabela 3.
Podem ser utilizadas duas abordagens para isolar uma construção de fusão de albumina particular a partir da amostra depositada de ADN plasmídicos citada para essa construção de fusão de albumina na Tabela 3. Método 1: Rastreio
Em primeiro lugar, uma construção de fusão de albumina pode ser directamente isolada pelo rastreio da amostra de ADN plasmídicos depositados, utilizando uma sonda polinucleotídica correspondendo à SEQ ID N°: X para um número de construção ID individual na Tabela 1, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um polinucleotido específico com sintetizado, utilizando 30-40 nucleótidos pode ser um 260 sintetizador de ADN da Applied Biosystems, de acordo com a sequência referida. 0 oligonucleótido pode ser marcado, por exemplo, com 32Ρ-γ-ΑΤΡ, utilizando T4 polinucleótido cinase e purificado de acordo com métodos de rotina. (E. g., Maniatis et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, N.I. (1982)). A construção de fusão de albumina de um dado depósito ATCC é transformada num hospedeiro adequado, como indicado acima (tal como XL-1 Blue (Stratagene)), utilizando técnicas conhecidas dos especialistas na técnica, tal como as proporcionadas pelo fornecedor de vector ou em publicações ou patentes relacionadas, citadas acima. Os transformantes são plaqueados em placas de ágar a 1,5% (contendo o agente de selecção apropriado, e. g., ampicilina) até uma densidade de cerca de 150 transformantes (colónias) por placa. Estas placas são rastreadas utilizando membranas de Nylon, de acordo com métodos de rotina para rastreio de colónias bacterianas (e. g. , Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 193 a 1104) , ou outras técnicas conhecidas dos especialistas na técnica.
Método 2: PCR
Alternativamente, ADN codificando uma dada proteína de fusão de albumina pode ser amplificado a partir de uma amostra de uma construção de fusão de albumina depositada com SEQ ID N°: X, por exemplo, pela utilização de dois iniciadores de 17-20 nucleótidos que se hibridam à construção de fusão de albumina 5' e 3' depositada ao ADN codificando uma dada proteína de fusão de albumina. A reacção de polimerização em cadeia é efectuada sob condições de rotina, por exemplo, em 25 pL de 261 mistura reaccional com 0,5 pg do molde de ADNc acima. Uma mistura reaccional conveniente é MgCl2 a 1,5- -5 mM, gelatina a 0,01% (p/v), 20 μΜ de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol de cada iniciador e 0,25 Unidades de Taq polimerase. São realizados trinta e cinco ciclos de PCR (desnaturação a 94 °C, durante 1 min; emparelhamento a 55 °C, durante 1 min; elongamento a 72 °C, durante 1 min) com um termociclador automatizado Cetus da Perkin-Elmer. O produto amplificado é analisado por electrof orese em gel de agarose e a banda de ADN com o peso molecular esperado é excisada e purificada. O produto de PCR é verificado como sendo a sequência seleccionada por subclonagem e sequenciação do produto de ADN.
Estão disponíveis vários métodos para a identificação das porções não codificantes 5' ou 3' de um gene que pode não estar presente no clone depositado. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, sondagem de filtro, enriquecimento de clone utilizando sondas específicas e protocolos semelhantes ou idênticos a protocolos "RACE" 5' e 3' que são conhecidos na técnica. Por exemplo, um método semelhante a RACE 5' está disponível para gerar a extremidade 5' em falta de um transcrito de tamanho total desejado. (Fromont-Racine et ai., Nucleic Acids Res., 21(7):1683-1684 (1993)).
Resumidamente, um oligonucleótido de ARN específico é ligado às extremidades 5' de uma população de ARN, presumivelmente contendo transcritos de ARN de gene de tamanho total. Um conjunto de iniciadores, contendo um iniciador específico para o oligonucleótido de ARN ligado e um iniciador específico para uma sequência conhecida do gene de interesse, é utilizado para amplificar por PCR a porção 5' do gene de tamanho 262 total desejado. Este produto amplificado pode ser, depois, sequenciado e utilizado para gerar o gene de tamanho total.
Este método acima começa com ARN total isolado da fonte desejada, embora possa ser utilizado ARN poli-A+. A preparação de ARN pode ser, depois, tratada com fosfatase, se necessário, para eliminar grupos fosfato 5' em ARN degradado ou danificado que podem interferir com a etapa de ARN ligase posterior. A fosfatase deve ser, depois, inactivada e o ARN tratado com pirofosfatase ácida do tabaco, de modo a remover a estrutura cap presente nas extremidades 5' de ARN mensageiros. Esta reacção deixa o grupo fosfato 5' na extremidade 5' do ARN com cap clivado que pode ser, depois, ligado a um oligonucleótido de ARN utilizando T4 ARN ligase.
Esta preparação de ARN modificada é utilizada como um molde para a síntese de primeira cadeia de ADNc, utilizando um oligonucleótido específico de gene. A reacção de síntese de primeira cadeia é utilizada como um molde para a amplificação por PCR da extremidade 5' desejada, utilizando um iniciador específico para o oligonucleótido de ARN ligado e um iniciador específico para a sequência conhecida do gene de interesse. 0 produto resultante é, depois, sequenciado e analisado, para confirmar que a sequência de extremidade 5' pertence ao gene desejado.
Exemplo 41: Ensaio de Absorção de [3H] -2-Desoxi(Tlucose.
Adiposo, músculo esquelético e fígado são tecidos sensíveis a insulina. A insulina pode estimular a absorção/transporte de glucose para estes tecidos. No caso de adiposo e músculo 263 esquelético, a insulina inicia a transdução de sinal que, eventualmente, conduz à translocação da molécula 4 transportadora de glucose, GLUT4, de um compartimento intracelular especializado para a superfície celular. Uma vez na superfície celular, a GLUT4 permite a absorção/transporte de glucose.
Absorção de [3H]-2-Desoxiglucose
Um número de linhas celulares relacionadas com adiposo e músculo pode ser utilizado para testar para actividade de absorção/transporte de glucose na ausência ou presença de uma combinação de qualquer um ou mais dos fármacos terapêuticos listados para o tratamento da diabetes mellitus. Em particular, as células de fibroblastos murinos 3T3-L1 e as células de músculo esquelético murinas L6 podem ser diferenciadas em adipócitos 3T3-L1 e em miotubos, respectivamente, para servir como modelos in vitro apropriados para o ensaio de absorção de [3H]-2-desoxiglucose (Urso et ai., J Biol Chem, 274(43): 30864-73 (1999); Wang et al., J Mol Endocrinol, 19(3): 241-8 (1997);
Haspel et al.r J Membr Biol, 169 (1): 45-53 (1999); Tsakiridis et al., Endocrinology, 136(10): 4315-22 (1995)). Resumidamente, 2 x 105 células/100 pL de adipócitos ou células L6 diferenciadas são transferidas para placas de 96 poços tratadas com Cultura de Tecidos, "TC", i. e., revestidas com 50 pg/mL de poli-L-lisina, em meio de pós-diferenciação e são incubadas, de um dia para o outro, a 37 °C, em C02 a 5%. As células são, em primeiro lugar, lavadas uma vez com meio DMEM pobre em glucose isento de soro e são, depois, submetidas a inanição com 100 pL/poço do mesmo meio e com 100 pL/poço de tampão ou de uma combinação de qualquer um ou mais dos fármacos terapêuticos listados para o tratamento de 264 diabetes mellitus, por exemplo, concentrações crescentes de 1 nM, 10 nM e 100 nM dos terapêuticos da invenção submetida (e. g., as fusões especificas divulgadas como SEQ ID N°: Y e seus fragmentos e variantes) , durante 16 horas, a 37 °C, na ausência ou presença de insulina a 1 nM. As placas são lavadas três vezes com 100 pL/poço de soro fisiológico tamponada com HEPES. A insulina é adicionada a 1 nM em soro fisiológico tamponada com HEPES, durante 30 min, a 37 °C, na presença de [3H]-2-desoxiglucose a 10 μΜ marcada (Amersham, N° TRK672) e 2-desoxiglucose a 10 μΜ não marcada (SIGMA, D-3179). Como controlo, são efectuadas as mesmas condições, excepto na ausência de insulina. Uma concentração final de citocalasina B a 10 μΜ (SIGMA, C6762) é adicionada a 100 pL/poço, num poço separado, para medir a absorção não especifica. As células são lavadas três vezes com soro fisiológico tamponada com HEPES. São adicionadas [3H]-2-desoxiglucose marcada, i. e., a 10 μΜ e 2-desoxiglucose não marcada, i. e., a 10 μΜ, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. As células são lavadas três vezes com Soro fisiológico Tamponada com Fosfatos, "PBS". As células são lisadas, depois, adição de 150 pL/poço de NaOH a 0,2 N e subsequente incubação, com agitação, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. As amostras são, depois, transferidas para um frasquinho de cintilação, ao qual são adicionados 5 mL de fluido de cintilação. Os frascos-ampola são contados num contador de Cintilação Beta. Absorção em condições duplicadas, sendo a diferença a ausência ou presença de insulina, é determinada com a seguinte equação: [(contagens de Insulina por minuto "cpm" - cpm Não Especif icas) / (Sem cpm de Insulina - cpm Não Especificas)]. As respostas médias enquadram-se nos limites de cerca de 5 vezes e 3 vezes dos controlos para adipócitos e miotubos, respectivamente. 265
Diferenciação de Células
As células são deixadas tornar-se totalmente confluentes num frasco T-75 cm2. 0 meio é removido e substituido com 25 mL de meio de pré-diferenciação, durante 48 horas. As células são incubadas, a 37 °C, em C02 a 5%, 85% de humidade. Após 48 horas, o meio de pré-diferenciação é removido e substituido com 25 mL de meio de diferenciação, durante 48 horas. As células são novamente incubadas, a 37 °C, em C02 a 5%, 85% de humidade. Após 48 horas, o meio é removido e substituido com 30 mL de meio de pós-diferenciação. O meio de pós-diferenciação é mantido durante 14-20 dias ou até que a diferenciação completa seja alcançada. O meio é trocado a cada 2-3 dias. Os adipócitos humanos podem ser adquiridos à Zen-Bio, INC (N° SA-1096).
Exemplo 42: Ensaio In vitro de Incorporação de [3H]-Timidina em Linhas Celulares Pancreáticas.
Foi recentemente mostrado que o GLP-1 induz a diferenciação da linha celular ARIP epitelial ductal pancreática de rato, num modo dependente de tempo e dose, que está associada a um aumento nos níveis de ARNm de Homeobox 1 de Ilhéu Duodenal (IDX-1) e insulina (Hui et al., 2001, Diabetes, 50(4): 785-96). A IDX-1, por sua vez, aumenta os níveis de ARNm do receptor de GLP-1.
Tipos Celulares Testados Células RIN-M: Estas células estão disponíveis da American Type Tissue Culture Collection (Linha Celular ATCC Número CRL-20577). A linha celular RIN-M foi derivada de um tumor de célula 266 de ilhéu de rato transplantável induzido por radiação. A linha foi estabelecida a partir de um xenoenxerto de murganho nu do tumor. As células produzem e segregam hormonas de polipéptidos de ilhéu e produzem L-dopa descarboxilase (um marcador para células tendo actividade de absorção e descarboxilação de precursor de amina ou APUD). Células ARIP: Estas são células exócrinas pancreáticas de morfologia epitelial, disponíveis da American Type Tissue Culture Collection (Linha Celular ATCC Número CRL-1674). Ver, também, as referências: Jessop, N.W. e Hay, R.J., "Características de duas linhas celulares exócrinas pancreáticas de rato derivadas de tumores transplantáveis", In Vitro 16: 212, (1980); Cockell, M. et al., "Identificação de uma actividade de ligação de ADN específica de célula que interage com um activador de transcrição de genes expressos no pâncreas acinoso", Mol. Cell. Biol. 9: 2464-2476, (1989); Roux, E., et al. "O factor PTF1 de transcrição específico de célula contém duas subunidades diferentes que interagem com o ADN", Genes Dev. 3: 1613-1624, (1989); e Hui, H., et al., "O péptido 1 semelhante a glucagom induz a diferenciação de células ductais pancreáticas positivas para homeobox 1 duodenal de ilhéu em células segregando insulina", Diabetes 50: 785-796 (2001).
Preparação de Células A linha celular RIN-M é cultivada em meio RPMI 1640 (Hyclone, N° SH300027.01) com soro bovino fetal a 10% (HyClone, N° SH30088.03) e é subcultivada a cada 6 a 8 dias, a uma razão de 1:3 a 1:6. O meio é trocado a cada 3 a 4 dias. 267 A linha celular ARIP (ATCC N° CRL-1674) é cultivada em meio F12K de Ham (ATCC, N° 30-2004) , com L-glutamina a 2 mM, ajustado para conter bicarbonato de sódio a 1,5 g/L e soro bovino fetal a 10%. A linha celular ARIP é subcultivada a uma razão de 1:3 a 1:6, duas vezes por semana. 0 meio é trocado a cada 3 a 4 dias.
Protocolo de Ensaio
As células são inoculadas a 4000 células/poço em placas de 96 poços e cultivadas, durante 48 a 72 horas, até 50% de confluência. As células são trocadas para meios isentos de soro, a 100 pL/poço. Após incubação durante 48-72 horas, o soro e/ou os terapêuticos da invenção submetida (e. g., proteínas de fusão de albumina da invenção e seus fragmentos e variantes) são adicionados ao poço. A incubação persiste durante 36 horas adicionais. A [3H]-Timidina (5-20 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia, N° TRK120) é diluída para 1 microCurie/5 microlitros. Após a incubação de 36 horas, são adicionados 5 microlitros por poço, durante 24 horas adicionais. A reacção é terminada por lavagem das células, suavemente, com Soro fisiológico Tamponada com Fosfatos, "PBS", uma vez. As células são, depois, fixas com 100 microlitros de TCA gelado a 10%, durante 15 min, a 4 °C. A PBS é removida e são adicionados 200 microlitros de NaOH a 0,2 N. As placas são incubadas, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação. A solução é transferida para um frasquinho de cintilação e 5 mL de fluido de cintilação compatível com solução aquosa são adicionados e misturados vigorosamente. Os frascos-ampola são contados num contador de cintilação beta. Como controlo negativo, utiliza-se apenas tampão. Como controlo positivo, utiliza-se soro de vitelo fetal. 268
Exemplo 43: Ensaio para Glicosúria. A glicosúria (i. e., açúcar em excesso na urina), pode ser facilmente ensaiada para proporcionar um índice do estado de doença de diabetes mellitus. A urina em excesso numa amostra de doente, em comparação com uma amostra de doente normal, é sintomática de IDDM e NIDDM. A eficácia do tratamento desse doente tendo IDDM e NIDDM é indicada por uma diminuição resultante na quantidade de glucose em excesso na urina. Numa forma de realização preferida para monitorização de IDDM e NIDDM, as amostras de urina de doentes são ensaiadas para a presença de glucose, utilizando técnicas conhecidas na matéria. A glicosúria em humanos é definida por uma concentração de glucose urinária excedendo 100 mg por 100 mL. Os niveis de açúcar em excesso nos doentes exibindo glicosúria podem ser medidos de um modo ainda mais preciso, pela obtenção de amostras sanguíneas e ensaiando a glucose sérica.
Exemplo 44: Ocorrência de Diabetes em Murganhos NOD.
Os murganhos fêmea NOD (não obeso diabético) são caracterizados por exibirem IDDM, com um decurso que é semelhante ao verificado em humanos, embora a doença seja mais pronunciada em murganhos NOD fêmea do que em machos. A seguir, salvo indicação em contrário, o termo "murganho NOD" refere-se a um murganho NOD fêmea. Os murganhos NOD têm uma destruição progressiva de células beta que é causada por uma doença auto-imune crónica. Deste modo, os murganhos NOD começam a vida com euglicemia ou níveis de glucose sanguíneos normais. Às cerca das 15 a 16 semanas de idade, contudo, os murganhos NOD começam a ficar hiperglicémicos, indicando a destruição da maioria das 269 suas células beta pancreáticas e a correspondente incapacidade do pâncreas produzir insulina suficiente. Deste modo, a causa e a progressão da doença são semelhantes a doentes de IDDM humanos.
Os ensaios de eficácia in vivo dos regimes de imunização podem ser avaliados em murganhos NOD/LtJ fêmea (comercialmente disponíveis de The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.). Na literatura, é referido que 80% dos murganhos fêmea desenvolve diabetes às 24 semanas de idade e o começo da insulite inicia-se entre as 6-8 semanas de idade. Os murganhos NOD são consanguíneos e altamente responsivos a uma variedade de estratégias imunorregulatórias. Os murganhos NOD adultos (6-8 semanas de idade) têm uma massa média de 20-25 g.
Estes murganhos podem ser não tratados (controlo), tratados com os terapêuticos da invenção submetida (e. g., proteínas de fusão de albumina da invenção e seus fragmentos e variantes), isoladamente ou em combinação com outros compostos terapêuticos referidos acima. O efeito destes diversos tratamentos na progressão de diabetes pode ser medido como se segue: Às 14 semanas de idade, os murganhos NOD fêmea podem ser fenotipados de acordo com a tolerância à glucose. A tolerância à glucose pode ser medida com o teste de tolerância à glucose intraperitoneal (IPGTT). Resumidamente, o sangue é retirado do plexo paraorbital aos 0 minutos e 60 minutos, após a injecção intraperitoneal de glucose (1 g/kg de peso corporal) . A tolerância normal é definida como glucose plasmática aos 0 minutos inferior a 144%, em mg, ou aos 60 minutos inferior a 160%, em mg. Os níveis de glucose sanguíneos são determinados com um aparelho Glucometer Elite. 270
Com base nesta análise fenotípica, os animais podem ser atribuídos aos diferentes grupos experimentais. Em particular, os animais com níveis de glucose sanguíneos mais elevados podem ser atribuídos ao grupo de tolerância à glucose comprometido. Os murganhos podem ser alimentados ad libitum e pode-lhes ser proporcionada água acidificada (pH 2,3).
Os murganhos tolerantes e intolerantes à glucose podem ainda ser subdivididos em grupos de controlo, de proteína de fusão de albumina da invenção submetida e de combinação de proteínas de fusão de albumina/compostos terapêuticos. Os murganhos no grupo de controlo podem receber uma injecção interperitoneal de veículo, diariamente, seis vezes por semana. Os murganhos no grupo de albumina de fusão podem receber uma injecção interperitoneal dos terapêuticos da invenção submetida (e. g., proteínas de fusão de albumina da invenção e seus fragmentos e variantes) em veículo, diariamente, seis vezes por semana. Os murganhos no grupo de combinação de proteínas de fusão de albumina/compostos terapêuticos podem receber proteínas de fusão de albumina e combinações de compostos terapêuticos, como descrito acima. 0 nível de glucose de urina nos murganhos NOD pode ser determinado numa base bissemanal utilizando Labstix (Bayer Diagnostics, Hampshire, Inglaterra). 0 peso e ingestão de fluido também podem ser determinados numa base bissemanal. 0 começo da diabetes é definido após o surgimento de glucosúria em duas determinações consecutivas. Após 10 semanas de tratamento, um IPGTT adicional pode ser realizado e os animais podem ser sacrificados no dia seguinte. 271
Ao longo do curso de tratamento de 10 semanas, os animais de controlo nos grupos tolerante à glucose e intolerante à glucose desenvolvem diabetes, a uma taxa de 60% e 86%, respectivamente (ver a patente US N° 5866546, Gross et al.). Deste modo, se não for realizada intervenção, taxas elevadas de diabetes ocorrem mesmo em murganhos NOD que são inicialmente tolerantes à glucose.
Os resultados podem ser confirmados pela medição de níveis de glucose sanguíneos em murganhos NOD, antes e após tratamento. Os níveis de glucose sanguíneos são medidos, como descrito acima, em murganhos tolerantes e intolerantes à glucose em todos os grupos descritos.
Numa forma de realização alternativa, os terapêuticos da invenção submetida (e. g., fusões específicas divulgadas como SEQ ID N° : Y e seus fragmentos e variantes) podem ser quantificados utilizando análise espectrométrica e quantidades de proteína apropriadas podem ser ressuspenssas antes de injecção em 50 pL de soro fisiológico tamponada com fosfatos (PBS) por dose. Duas injecções, com uma semana de intervalo, podem ser administradas subcutaneamente sob a pele dorsal de cada murganho. A monitorização pode ser realizada em duas ocasiões separadas antes da imunização e pode ser realizada semanalmente durante o tratamento e continuada a seguir. A urina pode ser testada para glucose todas as semanas (Keto-Diastix.RTM.; Miles Inc., Kankakee, III.) e os murganhos glicosúricos podem ser pesquisados para glucose sérica (ExacTech.RTM., MediSense, Inc., Waltham, Mass.). A diabetes é diagnosticada quando a glicemia de jejum é superior a 2,5 g/L. 272
Exemplo 45: Examinação Histológica de Murganhos NOD. A examinação histológica de amostras de tecido de murganhos NOD pode demonstrar a capacidade de as composições da presente invenção, e/ou uma combinação das composições da presente invenção com outros agentes terapêuticos para a diabetes, aumentarem a concentração relativa de células beta no pâncreas. 0 método experimental é como se segue:
Os murganhos do Exemplo 44 podem ser sacrificados no final do período de tratamento e amostras de tecido podem ser retiradas do pâncreas. As amostras podem ser fixas em formalina a 10% em soro fisiológico 0,9% e embebidas em cera. Dois conjuntos de 5 secções em série de 5 pm podem ser cortados para imunomarcação, a um intervalo de corte de 150 pm. As secções podem ser imunomarcadas para insulina (diluição 1:1000 de anti-soros anti-insulina de cobaio, ICN Thames R.U.) e glucagom (diluição 1:2000 de anti-soros anti-glucagom pancreático de coelho) e detectadas com anti-soros anti-cobaio conjugado a peroxidase (Dako, High Wycombe, U.K.) ou anti-coelho conjugado a peroxidase (diluição 1:50, Dako). A composição da presente invenção pode, ou não, ter um efeito tão forte na massa visível de células beta como tem nas manifestações clínicas da diabetes em animais tolerantes à glucose e intolerantes à glucose. 273
Exemplo 46: Terapia de Combinação de Transplantação de Células Beta Pancreáticas. A transplantação é uma forma comum de tratamento de doença auto-imune, especialmente quando o tecido alvo próprio foi gravemente danificado. Por exemplo, e não a título de limitação, a transplantação de pâncreas e transplantação de células de ilhéu são opções de tratamento comuns para IDDM (Ver, e. g., Stewart et al., Journal of Clinicai Endocrinology & Metabolism 86 (3): 984-988 (2001); Brunicardi, Transplant. Proc. 28: 2138- 40 (1996); Kendall & Robertson, Diabetes Metab. 22: 157-163 (1996); Hamano et al., Kobe J. Med. Sei. 42: 93-104 (1996);
Larsen & Stratta, Diabetes Metab. 22: 139-146 (1996); and
Kinkhabwala, et al., Am. J. Surg. 171: 516-520 (1996)). Como com qualquer método de transplantação, as terapias de transplantação para doentes de doença auto-imune incluem tratamentos para minimizar o risco de rejeição de hospedeiro do tecido transplantado. Contudo, a doença auto-imune envolve o risco adicional, independente, de que a resposta auto-imune de hospedeiro preexistente que lesionou o tecido próprio original exercerá o mesmo efeito lesionado no tecido transplantado. Consequentemente, a presente invenção abrange métodos e composições para o tratamento de doença pancreática auto-imune, utilizando as proteínas de fusão de albumina da invenção submetida, em combinação com imunomoduladores/imunossupressores em indivíduos sujeitos a terapia de transplantação da doença auto-imune.
De acordo com a invenção, as composições e formulações baseadas em fusão de albumina descritas acima são administradas para prevenir e tratar a lesão ao órgão, tecido ou células transplantados, resultando da resposta auto-imune do indivíduo 274 hospedeiro, inicialmente dirigida contra o tecido próprio original. A administração pode ser efectuada antes e subsequente à transplantação em 2 a 4 doses, cada com uma semana de intervalo.
Os seguintes imunomoduladores/imunossupressores, incluindo, mas não limitados a, AI-401, CDP-571 (anticorpo monoclonal anti-TNF), CG-1088, Diamid (vacina da diabetes), ICM3 (anticorpo monoclonal anti-ICAM-3), linomida (Roquinimex) , NBI-6024 (ligando peptidico alterado), TM-27, VX-740 (HMR-3480), inibidores de protease de caspase 8, talidomida, hOKT3gammal (Ala-ala) (anticorpo monoclonal anti-CD3), Interferão Alfa Oral, lactobacilo oral e LymphoStat-B™ podem ser utilizados juntamente com os terapêuticos de fusão de albumina da invenção submetida, numa transplantação de célula de ilhéu ou pâncreas.
Exemplo 47: Modelo de Murganho In vivo de NIDDM.
Os murganhos C57BL/6J macho, de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), podem ser obtidos às 3 semanas de idade e alimentados a ração convencional ou dietas enriquecidas em gordura (35,5% p/p; Bioserv.Frenchtown, NJ) ou frutose (60% p/p; Harlan Teklad, Madison, WI). A ração regular é composta por gordura a 4,5%, p/p, proteína a 23%, p/p, amido a 31,9%, p/p, frutose a 3,7%, p/p e fibra a 5,3%, p/p. A dieta de elevado teor de gordura (banha) é composta por gordura a 35,5%, p/p, proteína a 20%, p/p, amido a 36,4%, p/p, frutose a 0,0%, p/p e fibra a 0,1%, ρ/ρ. A dieta de elevado teor de frutose é composta por gordura a 5%, p/p, proteína a 20%, p/p, amido a 0,0%, p/p, frutose a 60,0%, p/p e fibra a 9,4%, p/p. Não podem ser alojados mais de cinco murganhos por gaiola, numa sala com um controlo de 275 temperatura de 22° + /- 3 °C e 50% + /- 20% de humidade, com um ciclo de 12 horas de luz (das 6 da manhã até às 6 da tarde)/escurião (Luo et ai., 1998, Metabolism 47(6): 663-8, "Modelos de Murganho Não genéticos de diabetes mellitus não dependente de insulina"; Larsen et al., Diabetes 50(11): 2530-9 (2001), "A administração sistémica do derivado NN2211 de GLP-1 de longa actuação induz perda de peso duradoura e reversível em ratos normais e obesos"). Após exposição às respectivas dietas, durante 3 semanas, os murganhos podem ser injectados intraperitonealmente com estreptozotocina, "STZ" (Sigma, St. Louis, MO), at 100 mg/kg de peso corporal ou veiculo (0,05 mol/L de ácido cítrico, pH 4,5) e mantidos na mesma dieta durante as 4 semanas seguintes. Sob condições de não jejum, o sangue é obtido 1, 2 e 4 semanas pós-STZ, por corte da parte distai da cauda. As amostras são utilizadas para medir as concentrações plasmáticas de glucose e insulina de não jejum. O peso corporal e ingestão de alimento são registados semanalmente.
Para determinar directamente o efeito da dieta de elevado teor de gordura na capacidade de a insulina estimular a eliminação de glucose, as experiências podem ser iniciadas em três grupos de murganhos, alimentados a gordura, alimentados a ração injectados com veículo e alimentados a gordura injectados com STZ, no final do período de 7 semanas descrito acima. Os murganhos podem ser jejuados, durante 4 horas, antes das experiências. Na primeira série de experiências, os murganhos podem ser anestesiados com inalação de metoxiflurano (Pitman-Moor, Mundelein, IL) . Insulina regular (Sigma) pode ser injectada intravenosamente ([IV] 0,1 U/kg de peso corporal) através de uma veia da cauda e o sangue pode ser recolhido 3, 6, 9, 12 e 15 minutos após a injecção de uma veia da cauda diferente. As concentrações plasmáticas de glucose podem ser 276 determinadas nestas amostras e a meia-vida (tVê) de desaparecimento de glucose do plasma pode ser calculada utilizando o WinNonlin (Scientific Consulting, Apex, NC), um programa de software de farmacocinética/farmacodinâmica.
Na segunda série de experiências, os murganhos podem ser anestesiados com pentobarbital de sódio intraperitoneal (Sigma). A cavidade abdominal é aberta e a principal veia abdominal é exposta e cateterizada com um cateter de calibre 24 IV (Johnson-Johnson Medicai, Arlington, TX). 0 cateter é fixo a tecido muscular adjacente à veia abdominal, cortado na parte de baixo da ligação da seringa e preso a um tubo de plástico PE50 pré-carregado que, por sua vez, está ligado a uma seringa com solução de infusão. A cavidade abdominal é, depois, fechada com sutura. Com esta abordagem, não haveria bloqueio do refluxo do sangue da parte inferior do corpo. Os murganhos podem ser infundidos continuamente com glucose (24,1 mg/kg/min) e insulina (10 mU/kg/min) , a um volume de infusão de 10 pL/min. As amostras sanguíneas retro-orbitais (70 pL cada) podem ser retiradas 90, 105, 120 e 135 minutos após o início da infusão, para medição das concentrações plasmáticas de glucose e insulina. A média destas quatro amostras é utilizada para estimar as concentrações plasmáticas de estado estacionário de glucose (SSPG) e insulina (SSPI) para cada animal.
Finalmente, as experiências para avaliar a capacidade de as proteínas de fusão de albumina, as composições terapêuticas do presente pedido, isoladamente ou em combinação com qualquer um ou mais dos fármacos terapêuticos listados para o tratamento de diabetes mellitus, diminuírem a glucose plasmática podem ser realizadas nos seguintes dois grupos de modelos de murganhos de "NIDDM" que são injectados com STZ: (1) alimentados a gordura 277 C57BL/6J e (2) alimentados a frutose C57BL/6J. As concentrações plasmáticas de glucose dos murganhos para estes estudos podem variar entre 255 e 555 mg/dL. Os murganhos são atribuídos aleatoriamente para tratamento com veículo, terapêuticos de fusão de albumina da presente invenção, isoladamente ou em combinação com qualquer um ou mais dos fármacos terapêuticos listados para o tratamento de diabetes mellitus. Pode ser administrado um total de três doses. As amostras sanguíneas da veia da cauda podem ser retiradas para medição da concentração plasmática de glucose, antes da primeira dose e 3 horas após a dose final.
As concentrações plasmáticas de glucose podem ser determinadas utilizando o Kit Glucose Diagnostic da Sigma (Sigma N° 315), um ensaio colorimétrico enzimático. Os níveis plasmáticos de insulina podem ser determinados utilizando o Kit Rat Insulin RIA da Linco Research (N° RI-13K; St. Charles, MO).
Exemplo 51: Preparação de proteína de fusão de HA-hormona (tal como insulina, LH, FSH). 0 ADNc para a hormona de interesse, tal como insulina, pode ser isolado por uma variedade de meios, incluindo mas não exclusivamente a partir de uma biblioteca de ADNc, por RT-PCR e por PCR, utilizando uma série de iniciadores oligonucleotídicos sintéticos de sobreposição, todos utilizando métodos correntes. As sequências nucleotídicas para todas estas proteínas são conhecidas e estão disponíveis, por exemplo, em bases de dados públicas, tal como GenBank. 0 ADNc pode ser adaptado nas extremidades 5' e 3' para gerar sítios de restrição, de modo a que possam ser utilizados ligantes oligonucleotídicos, para 278 clonagem do ADNc num vector contendo o ADNc para HA. Isto pode ser no terminal N ou C, com ou sem utilização de uma sequência espaçadora. 0 ADNc de hormona é clonado num vector, tais como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA, a partir dos quais a cassete de expressão completa é, depois, excisada e inserida no plasmideo pSAC35, para permitir a expressão da proteína de fusão de albumina em levedura. A proteína de fusão de albumina segregada da levedura pode ser, depois, recolhida e purificada dos meios e testada para a sua actividade biológica. Para expressão e linhas celulares de mamífero, é adoptado um processo semelhante, com a excepção de que a cassete de expressão utilizada emprega um promotor, sequência líder e terminador de mamífero (ver o Exemplo 1). Esta cassete de expressão é, depois, excisada e inserida num plasmideo adequado para a transfecção de linhas celulares de mamífero.
Exemplo 57: Preparação de proteínas de fusão de HA direccionadas. 0 ADNc para a proteína de interesse pode ser isolado de biblioteca de ADNc ou pode ser preparado sinteticamente, utilizando vários oligonucleótidos de sobreposição utilizando métodos correntes de biologia molecular. Os nucleótidos apropriados podem ser manipulados no ADNc para formar sítios de restrição convenientes e também permitir a conjugação do ADNc de proteína a ADNc de albumina semelhante ao método descrito para hGH. Igualmente, uma proteína ou ADNc peptídico de direccionamento, tais como anticorpo de cadeia simples ou péptidos, tal como sinais de localização nuclear, que podem direccionar proteínas dentro das células podem estar fundidos à outra extremidade de albumina. A proteína de interesse e o 279 péptido de direccionamento são clonados num vector, tais como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA, que permite a fusão com ADNc de albumina. Neste modo, as extremidades N- e C-terminais de albumina estão fundidas a outras proteínas. 0 ADNc fundido é, depois, excisado de pPPC0005 e é inserido num plasmídeo, tal como pSAC35, para permitir a expressão da proteína de fusão de albumina em levedura. Todos os processos acima podem ser realizados utilizando métodos correntes em biologia molecular. A proteína de fusão de albumina segregada de levedura pode ser recolhida e purificada dos meios e testada para a sua actividade biológica e sua actividade de direccionamento, utilizando testes bioquímicos e biológicos apropriados.
Exemplo 59: Expressão Bacteriana de uma Proteína de Fusão de Albumina.
Um polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da presente invenção compreendendo uma sequência sinal bacteriana é amplificado utilizando iniciadores oligonucleotídicos de PCR, correspondendo às extremidades 5' e 3' da sequência de ADN, para sintetizar fragmentos de inserção. Os iniciadores utilizados para amplificar o polinucleótido codificando o inserto devem, de um modo preferido, conter sítios de restrição, tais como BamHI e Xbal, na extremidade 5' dos iniciadores, de modo a clonar o produto amplificado no vector de expressão. Por exemplo, BamHI e Xbal correspondem aos sítios de restrição enzimática no vector pQE-9 de expressão bacteriana. (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Este vector plasmídico codifica resistência antibiótica (Ampr) , uma origem de replicação bacteriana (ori), um promotor/operador (P/0) regulável por IPTG, 280 um sítio de ligaçao ribossómico (RBS), uma cauda de 6 histidinas (6-His) e sítios de clonagem de restrição enzimática. 0 vector pQE-9 é digerido com BamHI e Xbal e o fragmento amplificado é ligado no vector pQE-9, mantendo a fase de leitura iniciada no RBS bacteriano. A mistura de ligação é, depois, utilizada para transformar a estirpe M15/rep4 de E. coli (Qiagen, Inc.) que contém múltiplas cópias do plasmídeo pREP4, que expressa o repressor de lacl e também confere resistência a canamicina (Kanr) . Os transformantes são identificados pela sua capacidade de crescerem em placas de LB e as colónias resistentes a ampicilina/canamicina são seleccionadas. 0 ADN plasmídico é isolado e confirmado por análise de restrição.
Os clones contendo as construções desejadas são cultivados, de um dia para o outro (0/N), em cultura líquida em meios de LB, suplementados com Amp (100 pg/mL) e Kan (25 pg/mL) . A cultura de O/N é utilizada para inocular uma cultura grande, a uma razão de 1:100 a 1:250. As células são cultivadas para uma densidade óptica 600 (D.O. 600 ) compreendida entre 0,4 e 0,6. IPTG (Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido) é, depois, adicionado para uma concentração final de 1 mM. O IPTG induz pela inactivação do repressor de lacl, eliminando o P/O, conduzindo a expressão génica aumentada.
As células são cultivadas durante mais 3 a 4 horas. As células são, depois, recolhidas por centrifugação (20 min, a 6000 X g) . O sedimento celular é solubilizado no agente caotrópico 6 Molar Guanidina HC1 ou, de um modo preferido, em ureia a 8 M e concentrações superiores a 0,14 M de 2-mercaptoetanol por agitação, durante 3-4 horas, a 4 °C (ver, e. g. , Burton et al. , Eur. J. Biochem. 179:379-387 (1989)). Os 281 centrifugação e o resíduos celulares são removidos por sobrenadante contendo o polipéptido é carregado numa coluna de resina de afinidade de ácido de níquel-nitrilo-tri-acético ("Ni-NTA") (disponível a partir de QIAGEN, Inc., supra) . As proteínas com uma cauda de 6 x His ligam-se à resina de Ni-NTA com elevada afinidade e podem ser purificadas num simples processo de uma etapa (para detalhes ver: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., supra).
Resumidamente, o sobrenadante é carregado na coluna em guanidina-HCl a 6 M, pH 8. A coluna é, em primeiro lugar, lavada com 10 volumes de guanidina-HCl a 6 M, pH 8, depois, lavada com 10 volumes de guanidina-HCl a 6 M, pH 6 e, finalmente, o polipéptido é eluído com guanidina-HCl a 6 M, pH 5. A proteína purificada é, depois, renaturada pela sua diálise contra soro fisiológico tamponada com fosfatos (PBS) ou tampão de Na-acetato a 50 mM, pH 6, mais NaCl a 200 mM. Alternativamente, a proteína pode ser reenrolada com sucesso, enquanto imobilizada na coluna de Ni-NTA. As condições exemplificativas são como se segue: renaturar utilizando um gradiente linear de ureia a 6 M-l M, em NaCl a 500 mM, glicerol a 20%, Tris/HCl a 20 mM, pH 7,4, contendo inibidores de protease. A renaturação deve ser realizada ao longo de um período de 1,5 horas, ou mais. Após renaturação, as proteínas são eluídas pela adição de immidazole a 250 mM. 0 imidazole é removido por uma etapa de diálise final contra tampão de PBS ou de acetato de sódio a 50 mM, pH 6, mais NaCl a 200 mM. A proteína purificada é armazenada a 4o C ou congelada a -80° C.
Além do vector de expressão acima, a presente invenção inclui, ainda, um vector de expressão, denominado pHE4a (Acesso 282 ATCC Número 209645, depositado a 25 de Fevereiro de 1998) que contém elementos operadores e promotores de fago ligados operativamente a um polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, denominado pHE4a. (Acesso ATCC Número 209645, depositado a 25 de Fevereiro de 1998). Este vector contém: 1) um gene da neomicinafosfotransferase como um marcador de selecção, 2) uma origem de replicação de E. coli, 3) uma sequência promotora de fago T5, 4) duas sequências operadoras de lac, 5) uma sequência de Shine-Delgarno e 6) o gene repressor do operão da lactose (laclq). A origem de replicação (oriC) é derivada de pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD) . As sequências promotoras e operadoras são preparadas sinteticamente. 0 ADN pode ser inserido no pHE4a pela restrição do vector com Ndel e Xbal, BamHI, Xhol ou Asp718, correndo o produto restringido num gel e isolamento do fragmento maior (o fragmento de enchimento deve ter cerca de 310 pares de bases) . O inserto de ADN é gerado de acordo com protocolos de PCR aqui descritos ou, de outro modo, conhecidos na atécnica, utilizando iniciadores de PCR tendo sítios de restrição para Ndel (iniciador 5') e Xbal, BamHI, Xhol ou Asp718 (iniciador 3'). O inserto de PCR é purificado em gel e restringido com enzimas compatíveis. O inserto e vector são ligados de acordo com protocolos correntes. O vector manipulado pode ser substituído no protocolo acima para expressar proteína num sistema bacteriano. 283
Exemplo 60: Expressão de uma Proteína de Fusão de Albumina em Células de Mamífero.
As proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser expressas numa célula de mamífero. Um vector de expressão de mamífero típico contém um elemento promotor, que medeia a iniciação de transcrição de ARNm, uma sequência codificante de proteína e sinais requeridos para a terminação de transcrição e poliadenilação do transcrito. Elementos adicionais incluem estimuladores, sequências de Kozak e sequências intermédias flanqueadas por sítios dadores e aceitadores para excisão de ARN. A transcrição altamente eficiente é alcançada com os promotores precoce e tardio de SV40, as repetições terminais longas (LTR) de Retrovírus, e. g., RSV, HTLVI, HIVI e o promotor precoce do citomegalovírus (CMV). Contudo, também podem ser utilizados elementos celulares (e. g., o promotor de actina humana).
Os vectores de expressão adequados para utilização na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vectores, tais como pSVL e pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suécia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 e pCMVSport 3.0. As células hospedeiras de mamífero que poderiam ser utilizadas incluem, mas não estão limitadas a, células humanas Hela, 293, H9 e Jurkat, células de murganho NIH3T3 e C127, células Cos 1, Cos 7 e CV1, quail QC1-3, células L de murganho e células de ovário de hámster Chinês (CHO).
Alternativamente, a proteína de fusão de albumina pode ser expressa em linhas celulares estáveis contendo o polinucleótido codificando a proteína de fusão de albumina integrado num 284 cromossoma. A co-transfecção com um marcador seleccionável, tal como DHFR, gpt, neomicina ou higromicina, permite a identificação e isolamento das células transfectadas. 0 polinucleótido transfectado codificando a proteína de fusão também pode ser amplificado para expressar grandes quantidades da proteína de fusão codificada. 0 marcador de DHFR (di-hidrofolato redutase) é útil no desenvolvimento de linhas celulares que transportam várias centenas, ou mesmo vários milhares, de cópias do gene de interesse. (Ver, e. g., Alt et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin et al., Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 107-143 (1990); Page et al., Biotechnology 9:64-68 (1991)). Outro marcador de selecção útil é a enzima glutamina sintase (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992). Utilizando estes marcadores, as células de mamífero são cultivadas em meio selectivo e as células com a resistência mais elevada são seleccionadas. Estas linhas celulares contêm o gene(s) amplificado(s) integrado(s) num cromossoma. As células de ovário de hamster Chinês (CHO) e NSO são, frequentemente, utilizadas para a produção de proteínas.
Os derivados do plasmídeo pSV2-dhfr (Acesso ATCC N° 37146), os vectores de expressão pC4 (Acesso ATCC N° 209646) e pC6 (Acesso ATCC N° 209647) contêm o forte promotor (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Março de 1985)), mais um fragmento do estimulador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Os sítios de múltipla clonagem, e. g., com os sítios de clivagem de restrição enzimática BamHI, Xbal e Asp718, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vectores também contêm o intrão 3', o sinal de poliadenilação e terminação do gene de pré-proinsulina 285 de rato e o gene de DHFR de murganho sob controlo do promotor precoce de SV40.
Especificamente, o plasmídeo pC6, por exemplo, é digerido com enzimas de restrição apropriadas e, depois, desfosforilado utilizando fosfatases intestinais de vitelo por processos conhecidos na técnica. 0 vector é, depois, isolado a partir de um gel de agarose a 1%.
Um polinucleótido codificando uma proteína de fusão de albumina da presente invenção é gerado utilizando técnicas conhecidas na matéria e este polinucleótido é amplificado utilizando tecnologia de PCR conhecida na técnica. Se uma sequência sinal de ocorrência natural for utilizada para produzir a proteína de fusão de albumina da presente invenção, o vector não necessita de um segundo péptido sinal.
Alternativamente, se uma sequência sinal de ocorrência natural não for utilizada, o vector pode ser modificado para incluir uma sequência sinal heteróloga. (Ver, e. g., a Publicação Internacional N° WO 96/34891). 0 fragmento amplificado codificando a proteína de fusão da invenção é isolado a partir de um gel de agarose a 1%, utilizando um kit comercialmente disponível ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) . O fragmento é, depois, digerido com enzimas de restrição apropriadas e novamente purificado num gel de agarose a 1%. O fragmento amplificado codificando a proteína de fusão de albumina da invenção é, depois, digerido com a mesma enzima de restrição e purificado num gel de agarose a 1%. O fragmento isolado e o vector desfosforilado são, depois, ligados com T4 286 ADN ligase. As células HB101 ou XL-1 Blue de E. coli são, depois, transformadas e as bactérias que contêm o fragmento inserido no plasmideo pC6 são identificadas utilizando, por exemplo, análise de restrição enzimática.
As células de ovário de hámster Chinês desprovidas de um gene de DHFR activo são utilizadas para transfecção. Cinco pg do plasmideo de expressão pC6 ou pC4 são co-transfectados com 0,5 pg do plasmideo pSVneo, utilizando lipofectina (Felgner et al. , supra) . O plasmideo pSV2-neo contém um marcador seleccionável dominante, o gene neo de Tn5 codificando uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos, incluindo G418. As células são inoculadas em MEM alfa menos, suplementado com G418 a 1 mg/mL. Após 2 dias, as células são tripsinizadas e inoculadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em MEM alfa menos, suplementado com 10, 25 ou 50 ng/mL de metotrexato mais G418 a 1 g/mL. Após cerca de 10-14 dias, os clones únicos são tripsinizados e, depois, semeados em placas de Petri de 6 poços ou frascos de 10 mL, utilizando diferentes concentrações de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Os clones crescendo às concentrações mais elevadas de metotrexato são, depois, transferidos para novas placas de 6 poços contendo concentrações ainda maiores de metotrexato (1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 mM, 20 mM). O mesmo processo é repetido até que sejam obtidos clones que cresçam a uma concentração de 100 - 200 pM. A expressão da proteína de fusão desejada é analisada, por exemplo, por SDS-PAGE e transferência de Western ou por análise de HPLC de fase reversa. 287
Exemplo 69: Efeitos Biológicos de Proteínas de Fusão da Invenção.
Ensaios de Astrócitos e Neuronais.
As proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser testadas para actividade na promoção da sobrevivência, crescimento de neurite ou diferenciação fenotípica de células neuronais corticais e para a indução da proliferação de células imunopositivas de proteína glial fibrilar ácida, astrócitos. A selecção de células corticais para o bioensaio é baseada na expressão predominante de FGF-1 e FGF-2 em estruturas corticais e no melhoramento da sobrevivência neuronal cortical referida anteriormente resultando do tratamento de FGF-2. Um ensaio de incorporação de timidina, por exemplo, pode ser utilizado para elucidar uma actividade da proteína de fusão de albumina da invenção nestas células.
Além disso, referências anteriores descrevendo os efeitos biológicos de FGF-2 (FGF básico) em neurónios corticais ou hipocampais in vitro demonstraram aumentos na sobrevivência de neurónio e crescimento de neurite (Walicke et al., "0 factor de crescimento de fibroblastos promove a sobrevivência de neurónios hipocampais dissociados e melhora a extensão de neurite", Proc. NatL Acad Sei. USA 83:3012-3016. (1996)). Contudo, referências de experiências feitas em células PC-12 sugerem que estas duas respostas não são necessariamente sinónimo e podem depender, não apenas de que FGF está a ser testado, mas também de que receptor(es) é(são) expresso(s) nas células alvo. Utilizando o paradigma de cultura neuronal cortical primária, a capacidade de uma proteína de fusão de albumina da invenção induzir o crescimento de neurite pode ser comparada com a resposta 288 alcançada com FGF-2 utilizando, por exemplo, um ensaio de incorporação de timidina.
Ensaios de células de fibroblastos e endoteliais.
Os fibroblastos de pulmão humano são obtidos da Clonetics (San Diego, CA) e mantidos em meio de crescimento da Clonetics. As células endoteliais microvasculares dérmicas são obtidas da Cell Applications (San Diego, CA) . Para ensaios de proliferação, os fibroblastos de pulmão humano e células endoteliais microvasculares dérmicas podem ser cultivados a 5000 células/poço, numa placa de 96 poços, durante um dia, em meio de crescimento. As células são, depois, incubadas durante um dia em meio basal de BSA a 0,1%. Após substituição do meio com meio de BSA a 0,1% fresco, as células são incubadas com a proteína de fusão de teste da invenção proteína, durante 3 dias. Azul de Alamar (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) é adicionado a cada poço para uma concentração final de 10%. As células são incubadas durante 4 h. A viabilidade celular é medida pela leitura num leitor de fluorescência CytoFluor. Para os ensaios de PGE2, os fibroblastos de pulmão humano são cultivados a 5000 células/poço, numa placa de 96 poços, durante um dia. Após uma troca de meio para meio basal de BSA a 0,1%, as células são incubadas com FGF-2 ou proteína de fusão da invenção, com ou sem IL-Ια, durante 24 horas. Os sobrenadantes são recolhidos e ensaiados para PGE2 pelo kit EIA (Cayman, Ann Arbor, MI). Para os ensaios de IL-6, os fibroblastos de pulmão humano são cultivados a 5000 células/poço, numa placa de 966 poços, durante um dia. Após uma troca de meio para meio basal de BSA a 0,1%, as células são incubadas com FGF-2, ou com ou sem uma proteína de fusão de albumina da invenção e/ou IL-Ια, durante 24 horas. Os 289 sobrenadantes são recolhidos e ensaiados para IL-6 por kit de ELISA (Endogen, Cambridge, MA).
Os fibroblastos de pulmão humano são cultivados com FGF-2 ou uma proteína de fusão de albumina da invenção, durante 3 dias em meio basal, antes da adição de Azul de Alamar, para avaliar efeitos no crescimento dos fibroblastos. 0 FGF-2 deve mostrar uma estimulação a 10 - 2500 ng/mL, que pode ser utilizada para comparar a estimulação com a proteína de fusão da invenção.
Proliferação_celular baseada na incorporação de [3H]timidina O seguinte ensaio de incorporação de [3H]Timidina pode ser utilizado para medir o efeito de proteínas Terapêuticas, e. g., proteínas de factor de crescimento, na proliferação de células, tais como células de fibroblastos, células epiteliais ou células musculares imaturas.
As culturas subconfluentes são interrompidas na fase G1 por uma incubação de 18 h em meio isento de soro. As proteínas Terapêuticas são, depois, adicionadas durante 24 h e durante as últimas 4 h, as culturas são marcadas com [3H] timidina, a uma concentração final de 0,33 μΜ (25 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). A [3H]timidina incorporada é precipitada com ácido tricloroacético a 10% gelado, durante 24 h. Subsequentemente, as células são enxaguadas sequencialmente com ácido tricloroacético a 10% gelado e depois com água gelada. Após a lise em NaOH a 0,5 M, os lisados e enxaguamentos de PBS (500 mL) são agregados e a quantidade de radioactividade é NaOH, os lisados e 290 enxaguamentos de PBS (500 mL) são agregados e a quantidade de radioactividade é medida.
Modelos de Parkinson. A perda de função motora na doença de Parkinson é atribuída a uma deficiência da dopamina estriária resultante da degenerescência dos neurónios de projecção dopaminérgicos nigroestriários. Um modelo animal para Parkinson que foi extensamente caracterizado envolve a administração sistémica de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP). No SNC, a MPTP é absorvida por astrócitos e catabolizada por monoamina oxidase B em l-metil-4-fenil piridina (MPP+) e libertada. Subsequentemente, a MPP+ é activamente acumulada em neurónios dopaminérgicos pelo veículo de reabsorção de elevada afinidade para dopamina. A MPP+ é, depois, concentrada nas mitocôndrias pelo gradiente electroquímico e inibe selectivamente a nicotidamida adenina difosfato: ubiquinona oxidorredutionase (complexo I) interferindo, desse modo, com o transporte de electrões e, eventualmente, gerando radicais de oxigénio.
Foi demonstrado em paradigmas de cultura de tecidos que o FGF-2 (FGF básico) tem actividade trófica para neurónios dopaminérgicos nigrais (Ferrari et ai., Dev. Biol. 1989). Recentemente, o grupo do Dr. Unsicker demonstrou que a administração de FGF-2 em implantes de espuma-gel no estriado resulta na protecção quase completa dos neurónios dopaminérgicos nigrais da toxicicidade associada a exposição a MPTP (Otto e Unsicker, J. Neuroscience, 1990). 291
Com base nos dados com FGF-2, uma proteína de fusão de albumina da invenção pode ser avaliada para determinar se tem uma acção semelhante à de FGF-2 no melhoramento da sobrevivência neuronal dopaminérgica in vitro e também pode ser testada in vivo para protecção dos neurónios dopaminérgicos no estriado da lesão associada a tratamento de MPTP. 0 potencial efeito de uma proteína de fusão de albumina da invenção é, em primeiro lugar, examinado in vitro num paradigma de cultura celular neuronal dopaminérgica. As culturas são preparadas pela dissecção da placa da base do mesencéfalo de embriões de rato Wistar no dia 14 de gestação. 0 tecido é dissociado com tripsina e semeado, a uma densidade de 200000 células/cm2, em lamelas de vidro revestidas com poliortinina-laminina. As células são mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco e meio F12 contendo suplementos hormonais (Nl). As culturas são fixas com paraf ormaldeído após 8 dias in vitro e são processadas para coloração imuno-histoquímica de tirosina hidroxilase, um marcador específico para neurónios dopaminérgicos. As culturas celulares dissociadas são preparadas a partir de ratos embrionários. O meio de cultura é alterado de três em três dias e os factores também são adicionados nesse momento.
Visto que os neurónios dopaminérgicos são isolados de animais no dia 14 de gestação, um tempo de desenvolvimento que seja depois do estádio quando as células precursoras dopaminérgicas estão em proliferação, um aumento no número de neurónios imunopositivos para tirosina hidroxilase representa um aumento no número de neurónios dopaminérgicos sobreviventes in vitro. Por conseguinte, se uma proteína Terapêutica da invenção actuar para prolongar a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos, sugeriria que a proteína de fusão pudesse estar envolvida na Doença de Parkinson. 292
Exemplo 70: Efeito de Proteínas de Fusão de Albumina da Invenção no Crescimento de Células Endoteliais Vasculares.
No dia 1, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são inoculadas, à densidade de 2-5xl04 células/placa de 35 mm, em meio M199 contendo soro bovino fetal a 4% (FBS) , 16 unidades/mL de heparina e 50 unidades/mL de suplementos de crescimento de célula endotelial (ECGS, Biotechnique, Inc.). No dia 2, o meio é substituído com M199 contendo FBS a 10%, 8 unidades/mL de heparina. As proteínas de fusão de albumina da invenção e controlos positivos, tais como VEGF e FGF básico (bFGF), são adicionados a concentrações variáveis. Nos dias 4 e 6, o meio é substituído. No dia 8, o número de células é determinado com um Contador Coulter.
Um aumento no número de células de HUVEC indica que a proteína de fusão pode proliferar células endoteliais vasculares, enquanto uma diminuição no número de células de HUVEC indica que a proteína de fusão inibe células endoteliais vasculares.
Exemplo 72: Modelos de Murganho Diabético e Cicatrização Comprometida por Glucocorticóide. Modelo de Murganho Diabético db+/db+.
Para demonstrar que uma proteína de fusão de albumina da invenção acelera o processo de cura, o modelo de murganho geneticamente diabético de cicatrização é utilizado. 0 modelo de cicatrização de espessura completa no murganho db+/db+ é um modelo bem caracterizado, clinicamente relevante e reproduzível, da cicatrização comprometida. A cura da ferida diabética está 293 e dependente da formação de tecido de granulação reepitelialização e não da contracção (Gartner, M.H. et ai., J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et ai., Am. J.
Pathol. 136:1235 (1990)).
Os animais diabéticos têm muitos dos traços caracteristicos observados na diabetes mellitus Tipo II. Os murganhos (db+/db+) homozigóticos são obesos em comparação com os da mesma ninhada heterozigóticos (db+/+m) normais. Os murganhos (db+/db+) diabéticos mutantes têm uma única mutação recessiva autossómica no cromossoma 4 (db+) (Coleman et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:283-293 (1982)). Os animais mostram polifagia, polidipsia e poliúria. Os murganhos (db+/db+) diabéticos mutantes têm glucose sanguínea elevada, níveis de insulina aumentados ou normais e imunidade de mediação celular suprimida (Mandei et ai., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. et ai., Clin. Exp.
Immunol. 51(1):1-7 (1983); Leiter et ai., Am. J. of Pathol. 114:46-55 (1985)). A neuropatia periférica, complicações do miocárdico e lesões microvasculares, espessamento de membrana basal e anomalias de filtração glomerular foram descritos nestes animais (Norido, F. et ai., Exp. Neurol. 83(2):221-232 (1984);
Robertson et ai., Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli et al. , Lab Invest. 40(4):460-473 (1979); Coleman, D.L.,
Diabetes 31 (Supl.):1-6 (1982)). Estes murganhos diabéticos homozigóticos desenvolvem hiperglicemia que é resistente a análogos de insulina para a diabetes tipo II humana (Mandei et al., J. Immunol. 120:1375-1377 (1978)). 294
As características observadas nestes animais sugerem que a cura neste modelo pode ser semelhante à cura observada na diabetes humana (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136:1235-1246 (1990)).
Os murganhos C57BL/KsJ (db+/db+) fêmea geneticamente diabéticos e os da mesma ninhada heterozigóticos não diabéticos (db+/+m) são utilizados neste estudo (Jackson Laboratories). Os animais são adquiridos às 6 semanas de idade e têm 8 semanas de idade no início do estudo. Os animais são indivídualmente alojados e receberam alimento e água ad libitum. Todas as manipulações são realizadas utilizando técnicas assépticas. As experiências são conduzidas de acordo com as regras e directrizes da Human Genome Sciences, Inc., Institutional Animal Care and Use Committee e as Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animais. O protocolo de ferimento é realizado de acordo com os métodos anteriormente referidos (Tsuboi, R. e Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990)). Resumidamente, no dia do ferimento, os animais são anestesiados com uma injecção intraperitoneal de Avertin (0,01 mg/mL), 2', 2,2-tribromoetanol e 2-metil-2-butanol dissolvido em água desionizada. A região dorsal dos animais é rapada e a pele lavada com solução de etanol a 70% e iodo. Antes do ferimento, a área cirúrgica é seca com gaze estéril. Uma ferida de 8 mm de espessura completa é, depois, criada utilizando um perfurador de tecidos Keyes. Imediatamente após o ferimento, a pele circundante é suavemente esticada para eliminar a expansão da ferida. As feridas são deixadas abertas durante a duração da experiência. A aplicação do tratamento é administrada topicamente, durante 5 dias consecutivos, começando no dia de ferimento. Antes do 295 tratamento, as feridas sao suavemente limpas com soro fisiológico estéril e esponjas de gaze.
As feridas são visualmente examinadas e fotografadas, a uma distância fixa no dia de cirurgia e a intervalos de dois dias a seguir. A oclusão da ferida é determinada por medição diária nos dias 1-5 e no dia 8. As feridas são medidas horizontalmente e verticalmente utilizando um compasso Jameson. As feridas são consideradas curadas se o tecido de granulação já não for visível e a ferida estiver coberta por um epitélio contínuo.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção é administrada, utilizando uma gama de diferentes doses, de 4 mg a 500 mg por ferida, por dia, durante 8 dias, em veículo. Os grupos de controlo de veículo receberam 50 mL de solução de veículo.
Os animais são eutanasiados no dia 8 com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (300 mg/kg). As feridas e pele circundante são, depois, recolhidas para histologia e imuno-histoquímica. Os espécimes de tecido são colocados em formalina tamponada neutra a 10% em cassetes de tecido entre esponjas de biopsia para processamento posterior.
Três grupos de 10 animais cada (5 diabéticos e 5 controlos não diabéticos) são avaliados: 1) Controlo de placebo de veículo, 2) grupo não tratado e 3) grupo tratado. A oclusão de ferida é analisada pela medição da área no eixo vertical e horizontal e obtenção da área quadrada total da ferida. A contracção é, depois, estimatada pelo estabelecimento das diferenças entre a área de ferida inicial (dia 0) e a do 296 pós-tratamento (dia 8). A área de ferida no dia 1 tem 64 mm2, o correspondente tamanho do perfurador dérmico. Os cálculos são realizados utilizando a seguinte fórmula: a. [Área aberta no dia 8] - [Área aberta no dia l]/[Área aberta no dia 1]
Os espécimes são fixos em formalina tamponada a 10% e os blocos embebidos em parafina são seccionados perpendicularmente à superfície de ferida (5 mm) e cortados utilizando um micrótomo Reichert-Jung. A coloração de hematoxilina-eosina (H&E) de rotina é realizada em secções transversais de feridas bissectadas. A examinação histológica das feridas é utilizada para avaliar se o processo de cura e o aspecto morfológico da pele reparada são alterados pelo tratamento com uma proteína de fusão de albumina da invenção. Esta avaliação incluiu a verificação da presença de acumulação de células, células inflamatórias, capilares, fibroblastos, reepitelialização e maturidade epidérmica (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). Um micrómetro de lente calibrada é utilizado por um observador cego.
As secções de tecido também são coradas imuno-histoquimicamente com um anticorpo de queratina policlonal de coelho anti-humano, utilizando o sistema de detecção ABC Elite. A pele humana é utilizada como um controlo de tecido positivo, enquanto a IgG não imune é utilizada como um controlo negativo. O crescimento de queratinócitos é determinado pela avaliação da extensão da reepitelialização da ferida utilizando um micrómetro de lente calibrada. 297 0 antigénio nuclear celular de proliferação/ciclina (PCNA) em espécimes de pele é demonstrado pela utilização de anticorpo anti-PCNA (1:50) com um sistema de detecção ABC Elite. O cancro do cólon humano serviu como um controlo de tecido positivo e tecido de cérebro humano é utilizado como um controlo de tecido negativo. Cada espécime incluiu uma secção com omissão do anticorpo primário e substituição com uma IgG de murganho não imune. A classificação destas secções é baseada na extensão de proliferação numa escala de 0-8, o lado inferior da escala reflectindo ligeira proliferação e o lado superior reflectindo proliferação intensa.
Os dados experimentais são analisados utilizando um teste t desemparelhado. Um valor de p de < 0,05 é considerado significativo.
Modelo de Rato Comprometido por Esteróide A inibição da cicatrização por esteróides tem sido bem documentada em diversos sistemas in vitro e in vivo (Wahl, Glucocorticóides e Cicatrização. Em: Acção Esteróide Anti-Inflamatória: Aspectos Básicos e Clínicos. 280-302 (1989);
Wahlet al. , J. Immunol. 115: 476-481 (1975); Werb et al. , J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978)). Os glucocorticóides retardam a cicatrização pela inibição da angiogénese, dimiuindo a permeabilidade vascular (Ebert et al., An. Intern. Med. 37:701-705 (1952)), proliferação de fibroblastos e síntese de colagénio (Beck et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978)) e produzindo uma redução transiente de monócitos em circulação (Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticóides e 298
Cicatrização", Em: Acção Esteróide Anti-Inflamatória: Aspectos Básicos e Clínicos, Academic Press, Nova Iorque, p. 280-302 (1989)).A administração sistémica de esteróides a cicatrização comprometida é um fenómeno bem estabelecido em ratos (Beck et al., Factores de Crescimento. 5: 295-304 (1991); Haynes et ai., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticóides e Cicatrização", Em: Acção Esteróide Anti-Inflamatória: Aspectos Básicos e Clínicos, Academic Press, Nova Iorque, p. 280-302 (1989); Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2229-2233 (1989)).
Para demonstrar que uma proteína de fusão de albumina da invenção pode acelerar o processo de cura, os efeitos de múltiplas aplicações tópicas da proteína de fusão em feridas de pele excisionais de espessura completa em ratos, nos quais a cura foi comprometida pela administração sistémica de metilprednisolona, são avaliados.
Neste exemplo, são utilizados ratos jovens adultos Spraque Dawley macho pesando 250-300 g (Charles River Laboratories). Os animais são adquiridos às 8 semanas de idade e têm 9 semanas de idade no início do estudo. A resposta de cura dos ratos é comprometida pela administração sistémica de metilprednisolona (17 mg/kg/rato, intramuscularmente) no momento do ferimento. Os animais são indivídualmente alojados e receberam alimento e água ad libitum. Todas as manipulações são realizadas utilizando técnicas assépticas. Este estudo é conduzido de acordo com as regras e directrizes da Human Genome Sciences, Inc., Institutional Animal Care and Use Committee e as Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animais. 299 0 protocolo de ferimento é seguido de acordo com aquele descrito acima. No dia do ferimento, os animais são anestesiados com uma injecção intramuscular de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) . A região dorsal do animal é rapada e a pele lavada com soluções de etanol a 70% e iodo. Antes do ferimento, a área cirúrgica é seca com gaze estéril. Uma ferida de 8 mm de espessura completa é criada utilizando um perfurador de tecidos Keyes. As feridas são deixadas abertas durante a duração da experiência. As aplicações dos materiais de testagem são dadas topicamente, uma vez por dia durante 7 dias consecutivos, começando no dia de ferimento e subsequente à administração de metilprednisolona. Antes do tratamento, as feridas são suavemente limpas com soro fisiológico estéril e esponjas de gaze.
As feridas são visualmente examinadas e fotografadas a uma distância fixa, no dia de ferimento e no final do tratamento. A oclusão de ferida é determinada por medição diária nos dias 1-5 e no dia 8. As feridas são medidas horizontalmente e verticalmente utilizando um compasso Jameson calibrado. As feridas são consideradas curadas se o tecido de granulação já não for visivel e a ferida estiver coberta por um epitélio continuo. A proteína de fusão de albumina da invenção é administrada, utilizando uma gama de diferentes doses, de 4 mg a 500 mg por ferida, por dia, durante 8 dias, em veículo. Os grupos de controlo de veículo receberam 50 mL de solução de veículo.
Os animais são eutanasiados no dia 8 com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (300 mg/kg). As feridas e pele circundante são, depois, recolhidas para 300 histologia. Os espécimes de tecido são colocados em formalina tamponada neutra a 10% em cassetes de tecido entre esponjas de biopsia para processamento posterior.
Três grupos de 10 animais cada (5 com metilprednisolona e 5 sem glucocorticóide) são avaliados: 1) Grupo não tratado, 2) Controlo de placebo de veiculo, 3) grupos tratados. A oclusão de ferida é analisada pela medição da área no eixo vertical e horizontal e obtenção da área total da ferida. A oclusão é, depois, estimatada pelo estabelecimento das diferenças entre a área de ferida inicial (dia 0) e a do pós-tratamento (dia 8). A área de ferida no dia 1 tem 64 mm2, o tamanho correspondente do perfurador dérmico. Os cálculos são realizados utilizando a seguinte fórmula: a. [Área aberta no dia 8] - [Área aberta no dia 1]/[Área aberta no dia 1]
Os espécimes são fixos em formalina tamponada a 10% e os blocos embebidos em parafina são seccionados perpendicularmente à superfície de ferida (5 mm) e cortados utilizando um micrótomo Olympus. A coloração de hematoxilina-eosina (H&E) de rotina é realizada em secções transversais de feridas bissectadas. A examinação histológica das feridas permmite avaliar se o processo de cura e o aspecto morfológico da pele reparada são melhorados pelo tratamento com uma proteína de fusão de albumina da invenção. Um micrómetro de lente calibrada é utilizado por um observador cego, para determinar a distância da abertura de ferida. 301
Os dados experimentais são analisados utilizando um teste t desemparelhado. Um valor de p de < 0,05 é considerado significativo.
Exemplo 75: Construção da Construção Repórter de GAS.
Uma via de transdução de sinal envolvida na diferenciação e proliferação de células é denominada as vias de Jaks-STAT. As proteínas activadas na via de Jaks-STAT ligam-se a elementos de "GAS" do sítio de activação gama ou elemento responsivo sensível a interferão ("ISRE"), localizados no promotor em muitos genes. A ligação de uma proteína a estes elementos altera a expressão do gene associado.
Os elementos de GAS e ISRE são reconhecidos por uma classe de factores de transcrição denominados Transdutores de Sinal e Activadores de Transcrição, ou "STAT". Existem seis membros da família de STAT. Os Statl e Stat3 estão presentes em muitos tipos de células, como está Stat2 (visto que a resposta a IFN alfa está disseminada). O Stat4 está mais restringido e não está em muitos tipos de células, embora se tenha verificado em células T auxiliares de classe I, após tratamento com IL-12. O Stat5 foi originalmente denominado factor de crescimento mamário, mas verificou-se em concentrações superiores em outras células, incluindo células mielóides. Pode ser activado em células de cultura de tecidos por muitas citocinas.
Os STAT são activados para se translocarem do citoplasma para o núcleo após, fosforilação de tirosina, por um conjunto de cinases, conhecidas como a família de Cinase Janus ("Jaks"). As Jaks representam uma família distinta de cinases de tirosina 302 solúveis e incluem Tyk2, Jakl, Jak2 e Jak3. Estas cinases exibem significativa semelhança de sequência e são, em geral, cataliticamente inactivas em células em repouso.
As Jaks são activadas por uma ampla gama de receptores, sumariados na Tabela abaixo. (Adaptado da revisão por Schidler e Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51 (1995)). Uma família de receptores de citocina, capaz de activar as Jaks, está dividida em dois grupos: (a) a Classe 1 inclui receptores para IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF. CNTF e trombopoietina; e (b) a Classe 2 inclui IFN-a, IFN-g e IL-10. Os receptores de Classe 1 partilham um motivo de cisteína conservado (um conjunto de quatro cisteínas conservadas e um triptofano) e um motivo WSXWS (uma região proximal de membrana codificando Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (SEQ ID N°: 1113) ) .
Deste modo, na ligação de um ligando a um receptor, as Jaks são activadas que, por sua vez, activam STAT que, depois, se translocam e ligam a elementos de GAS. Este processo integral está abrangido na via de transdução de sinal de Jaks-STAT. Por conseguinte, a activação da via de Jaks-STAT, reflectida pela ligação do elemento de GAS ou do elemento de ISRE, pode ser utilizada para indicar proteínas envolvidas na proliferação e diferenciação de células. Por exemplo, sabe-se que os factores de crescimento e citocinas activam a via de Jaks-STAT (Ver a Tabela 5 abaixo). Deste modo, pela tilização de elementos de GAS ligados a moléculas repórter, os activadores da via de Jaks-STAT podem ser identificados. 303
Tabela 5 JAKs Ligando STAT tvk2 Jakl Jak2 Jak3 GAS (elementos) ou ISRE Família de IFN IFN-a/B + + - 1,2,3 ISRE IFN-g + + - 1 GAS (IRFl>Lys6>IFP) 11-10 + ? ? - 1,3 Família de gpl30 IL-6 (Pleiotrópico) + + + Ί 1,3 GAS(IRFl>Lys6>IFP) 11-11(Pleiotrópico) Ί + ? Ί 1,3 OnM(Pleíotrópíco) ? + + ? 1,3 LIF(Pleiotrópico) Ί + + Ί 1,3 CNTF(Pleiotrópico) -/ + + + Ί 1,3 G-CSF(Pleiotrópico) Ί + ? Ί 1,3 IL-12(Pleiotrópico) + + + 1,3 (continuação)
Família de g-C IL-2 (linfócitos) IL-4 (linfo/mielóide) IL-7 (linfócitos) IL-9 (linfócitos) IL-13 (linfócito) IL-15
Família de gp!40 IL-3 (mielóide) IL-5 (mielóide) GM-CSF (mielóide)
Família da hormona do crescimento
GH
PRL
EPO + - + + - + + - + + - + + ? ? ? + ? + + + + ? - + ? +/- + ? - +
1,3,5 GAS 6GAS (IRFl=IFP»Ly6) (IgH) 5 GAS 5 GAS 6 GAS 5 GAS 5 GAS(IRFl>IFP»Ly6) 5 GAS 5 GAS 5 1,3,5 5 GAS (B-CAS>IRFl=IFP»Ly6) (continuação) U) o
Receptor Tirosínas Cinases EGF Ί \ + - 1,3 GAS (IRF1) PDGF Ί + + - 1,3 CSF-1 Ί + + - 1,3 GAS(não IRF1)
Para construir um elemento promotor contendo GAS sintético, que é utilizado nos Ensaios Biológicos descritos nos Exemplos 78-80, é empregue uma estratégia baseada em PCR para gerar uma sequência promotora de GAS-SV40. O iniciador 5' contém quatro cópias em tandem do sítio de ligação de GAS verificado no promotor de IRF1 e que se demonstrou anteriormente ligar-se a STAT, após indução com uma gama de citocinas (Rothman et ai., Immunity 1:457-468 (1994).), embora possam, em alternativa, ser utilizados outros elementos de GAS ou ISRE. O iniciador 5' também contém 18 pb de sequência complementar à sequência promotora precoce de SV40 e está flanqueada com um sítio Xhol. A sequência do iniciador 5' é: 5’ :GCGCCTCGAG ATTrcCCCGAAATCTAGATTTCXXXDGAAATGATTTCíXCGAAA TGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG:3’ (SEQID N°: 1114 O iniciador a jusante é complementar ao promotor de SV40 e está flanqueado com um sítio Hind III: 5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEQ ID N°: 1115) A amplificação por PCR é realizada utilizando o molde do promotor de SV40 presente no plasmídeo B-gal:promotor, obtido da Clontech. O fragmento de PCR resultante é digerido com Xhol/Hind III e subclonado em BLSK2-. (Stratagene.) A sequenciação com os iniciadores directo e inverso confirma que o inserto contém a seguinte sequência:
StCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTtXCCGAAATGATT TCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCrAACT CCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCT GACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTC CAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3 · (SEQ ID N°: 1116) 307
Com este elemento promotor de GAS ligado ao promotor de SV40, uma construção repórter de GAS:SEAP2 é manipulada em seguida. Agui, a molécula repórter é uma fosfatase alcalina segregada ou "SEAP". Claramente, contudo, pode ser qualquer molécula repórter em vez de SEAP, neste ou em qualquer dos outros Exemplos. As moléculas repórter bem conhecidas que podem ser utilizadas em vez de SEAP incluem cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase, fosfatase alcalina, B-galactosidase, proteína verde fluorescente (GFP) ou qualquer proteína detectável por um anticorpo. A sequência acima confirmou que o elemento promotor de GAS-SV40 sintético está subclonado no vector pSEAP-Promotor, obtido da Clontech, utilizando HindIII e Xhol, substituindo eficazmente o promotor de SV40 com o elemento promotor de GAS:SV40 amplificado, para criar o vector GAS-SEAP. Contudo, este vector não contém um gene de resistência a neomicina e, por conseguinte, não é preferido, para sistemas de expressão de mamífero.
Deste modo, de modo a gerar linhas celulares estáveis de mamífero expressando o repórter de GAS-SEAP, a cassete de GAS-SEAP é removida do vector GAS-SEAP utilizando Sall e Notl e inserida num vector de esqueleto contendo o gene de resistência a neomicina, tal como pGFP-1 (Clontech), utilizando estes sítios de restrição no sítio de múltipla clonagem, para criar o vector GAS-SEAP/Neo. Uma vez este vector transfectado em células de mamífero, este vector pode ser, depois, utilizado como uma molécula repórter para ligação de GAS, como descrito nos Exemplos 78-80. 308
Outras construções podem ser preparadas utilizando a descrição acima e substituindo GAS com uma sequência promotora diferente. Por exemplo, a construção de moléculas repórter contendo as sequências promotoras de EGR e NF-KB são descritas nos Exemplos 78-82. Contudo, muitos outros promotores podem ser substituídos utilizando os protocolos descritos nestes Exemplos. Por exemplo, os promotores de SRE, IL-2, NFAT ou Osteocalcina podem ser substituídos, isoladamente ou em combinação (e. g., GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, II-2/NFAT ou NF-KB/GAS). De modo semelhante, outras linhas celulares podem ser utilizadas para testar a actividade de construção repórter, tais como HELA (epitelial), HUVEC (endotelial), Reh (célula B) , Saos-2 (osteoblasto), HUVAC (aórtica) ou Cardiomiócito.
Exemplo 76: Ensaio para Actividade de SEAP.
Como uma molécula repórter para os ensaios descritos em Exemplos aqui divulgados, a actividade de SEAP é ensaiada utilizando o kit Tropix Phospho-light (Cat. BP-400), de acordo com seguinte processo geral. 0 kit Tropix Phospho-light proporciona a Diluição, Ensaio e Tampões de Reacção utilizados abaixo.
Iniciar um doseador com o Tampão de Diluição 2,5x e dispensar 15 pL de tampão de diluição 2,5x para dentro de placas Optiplate contendo 35 pL de uma solução contendo uma proteína de fusão de albumina da invenção. Selar as placas com um selante plástico e incubar, a 65 graus C, durante 30 min. Separar as placas Optiplate para evitar aquecimento desigual. 309
Arrefecer as amostras para temperatura ambiente, durante 15 minutos. Esvaziar o doseador e iniciar com o Tampão de Ensaio. Adicionar 50 mL de Tampão de Ensaio e incubar, à temperatura ambiente, 5 min. Esvaziar o doseador e iniciar com o Tampão de Reacção (ver a Tabela abaixo) . Adicionar 50 pL de Tampão de Reacção e incubar, à temperatura ambiente, 20 minutos. Visto que a intensidade do sinal quimioluminescente é dependente do tempo e demora cerca de 10 minutos a ler 5 placas no luminómetro devem, deste modo, tratar-se 5 placas de cada vez e começar o segundo conjunto 10 minutos mais tarde.
Ler a unidade de luz relativa no luminómetro. Marcar H12 como branco e imprimir os resultados. Um aumento em quimioluminescência indica actividade de repórter.
Tabela 6 N& de placas Diluente de tampão de Rxn (mL) CSPD (mL) Ns de placas Diluente de tampão de Rxn (mL) CSPD (mL) 10 60 3 31 165 8,25 11 65 3,25 32 170 8,5 12 70 3,5 33 175 8, 75 13 75 3, 75 34 180 9 14 80 4 35 185 9,25 15 85 4,25 36 190 9,5 16 90 4,5 37 195 9,75 17 95 4, 75 38 200 10 18 100 5 39 205 10,25 19 105 5, 25 40 210 10,5 310 (continuação)
Na de placas Dlluente de tampão de Rxn (mL) CSPD (mL) Na de placas Dlluente de tampão de Rxn (mL) CSPD (mL) 20 110 5, 5 41 215 10, 75 21 115 5, 75 42 220 11 22 120 6 43 225 11, 25 23 125 6, 25 44 230 11,5 24 130 6, 5 45 235 11, 75 25 135 6, 75 46 240 12 26 140 7 47 245 12,25 27 145 7, 25 48 250 12, 5 28 150 7,5 49 255 12, 75 29 155 7, 75 50 260 13 30 160 8
Exemplo 77: Ensaio Identificando Actividade Neuronal.
Quando as células sofrem diferenciação e proliferação, é activado um grupo de genes através de muitas vias de transdução de sinal diferentes. Um destes genes, EGR1 (gene 1 de resposta de crescimento precoce), é induzido em diversos tecidos e tipos de células após activação. 0 promotor de EGR1 é responsável por essa indução. Utilizando o promotor de EGR1 ligado a moléculas repórter, a capacidade de as proteínas de fusão da invenção activarem as células pode ser avaliada. 311
Particularmente, é utilizado o seguinte protocolo para avaliar a actividade neuronal em linhas celulares PC12. As células PC12 (células de fenocromocitoma de rato) são conhecidas por proliferarem e/ou diferenciarem por activação com um número de mitogénios, tais como TPA (acetato de tetradecanoilo de forbol), NGF (factor de crescimento nervoso) e EGF (factor de crescimento epidérmico). A expressão génica de EGR1 é activada durante este tratamento. Deste modo, pela transfecção estável de células PC12 com uma construção contendo um promotor de EGR ligado a repórter de SEAP, a activação de células PC12 por uma proteína de fusão de albumina da presente invenção pode ser avaliada. A construção repórter de EGR/SEAP pode ser agrupada pelo seguinte protocolo. A sequência promotora de EGR-1 (-633 a +1) (Sakamoto K et al.r Oncogene 6:867-871 (1991)) pode ser amplificada por PCR a partir de ADN genómico humano, utilizando os seguintes iniciadores:
Primeiro iniciador. 5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3' (SEQ ID N°: 1117)
Segundo iniciador: 5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3' (SEQ ID N°: 1118)
Utilizando o vector GAS:SEAP/Neo produzido no Exemplo 75, o produto amplificado de EGR1 pode ser, depois, inserido neste vector. Linearizar o vector GAS:SEAP/Neo utilizando as enzimas de restrição Xhol/HindIII, removendo o enchimento de GAS/SV40. Restringir o produto amplificado de EGR1 com estas mesmas enzimas. Ligar o vector e o promotor de EGR1. 312
Para preparar placas de 96 poços para cultura celular, dois mL de uma solução de revestimento (diluição 1:30 de colagénio tipo I (Upstate Biotech Inc. Cat N° 08-115) em etanol a 30% (esterilizado por filtração)) são adicionados por uma placa de 10 cm ou 50 mL por poço da placa de 96 poços e deixadas secar ao ar, durante 2 h.
As células PC12 são rotineiramente cultivadas em meio RPMI-1640 (Bio Whittaker) contendo soro de cavalo a 10% (JRH BIOSCIENCES, Cat. N° 12449-78P), soro bovino fetal (FBS) a 5% inactivado por calor, suplementado com 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina, numa placa de cultura de tecidos de 10 cm pré-revestida. Um a quatro subcultivos são realizados de três em três ou de quatro em quatro dias. As células são removidas das placas por raspagem e ressuspensas com pipetagem para cima e para baixo, durante mais de 15 vezes.
Transfectar a construção EGR/SEAP/Neo para PC12, utilizando técnicas conhecidas na matéria. As células EGR-SEAP/PC12 estáveis são obtidas pelo crescimento das células em G418 a 300 pg/mL. O meio isento de G418 é utilizado para crescimento de rotina mas, a cada mês ou de dois em dois meses, as células devem ser recultivadas em G418 a 300 pg/mL para duas passagens.
Para ensaiar para actividade neuronal, uma placa de 10 cm com células cerca de 70 a 80% confluentes é rastreada pela remoção do meio antigo. Lavar as células uma vez com PBS (Soro fisiológico tamponada com fosfatos). Depois, submeter as células a inanição em meio pobre em soro (RPMI-1640 contendo soro de cavalo a 1% e FBS a 0,5% com antibióticos), de um dia para o outro. 313
Na manhã seguinte, remover o meio e lavar as células com PBS. Raspar as células da placa, suspender as células do poço em 2 mL de meio pobre em soro. Contar o número de células e adicionar mais meio pobre em soro, para atingir uma densidade celular final de 5xl05 células/mL.
Adicionar 200 pL da suspensão celular a cada poço da placa de 96 poços (equivalente a lxlO5 células/poço) . Adicionar uma série de concentrações diferentes de uma proteína de fusão de albumina da invenção, 37 graus C, durante 48 a 72 h. Como um controlo positivo, pode ser utilizado um factor de crescimento conhecido por activar células PC12 através de EGR, tal como 50 ng/pL de Factor de Crescimento Neuronal (NGF). É tipicamente verificada uma indução de SEAP superior a cinquenta vezes nos poços de controlo positivo. 0 ensaio de SEAP pode ser rotineiramente realizado utilizando técnicas conhecidsa na matéria e/ou como descrito no Exemplo 76.
Exemplo 78: Ensaio para Actividade de Célula T. O seguinte protocolo é utilizado para avaliar a actividade de célula T, pela identificação de factores e determinar se uma proteína de fusão de albumina da invenção prolifera e/ou diferencia células T. A actividade de célula T é avaliada utilizando a construção GAS/SEAP/Neo, produzida no Exemplo 75. Deste modo, factores que aumentam a actividade de SEAP indicam a capacidade para activar a via de transdução de sinal de
Jaks-STAT. A célula T utilizada neste ensaio é células T de Jurkat (Acesso ATCC N° TIB-152), embora também possam ser utilizadas células Molt-3 (Acesso ATCC N° CRL-1552) e células Molt-4 (Acesso ATCC N° CRL-1582). 314
As células T de Jurkat são células auxiliares CD4+ Thl linfoblásticas. Para gerar linhas celulares estáveis, aproximadamente 2 milhões de células de Jurkat são transfectadas com o vector GAS-SEAP/neo, utilizando DMRIE-C (Life Technologies) (processo de transfecção descrito abaixo). As células transfectadas são inoculadas para uma densidade de, aproximadamente, 20000 células por poço e os transfectantes resistentes a 1 mg/mL de genticina seleccionados. As colónias resistentes são expandidas e, depois, testadas para a sua
resposta a concentrações crescentes de interferão gama. A resposta de dose de um clone seleccionado é demonstrada.
Especificamente, o seguinte protocolo produzirá células suficientes para 75 poços contendo 200 pL de células. Deste modo, é aumentada a escala ou realizado em múltiplo, para gerar células suficientes para múltiplas placas de 96 poços. As células de Jurkat são mantidas em RPMI + soro a 10% com
Pen-Strep a 1%. Combinar 2,5 mL de OPTI-MEM (Life Technologies) com 10 pg de ADN plasmídico num frasco T25. Adicionar 2,5 mL de OPTI-MEM contendo 50 pL de DMRIE-C e incubar, à temperatura ambiente, durante 15-45 min.
Durante o período de incubação, contar a concentração celular, centrifugar o número requerido de células (107 por transfecção) e ressuspender em OPTI-MEM para uma concentração final de 107 células/mL. Depois, adicionar 1 mL de 1 x 107 células em OPTI-MEM a um frasco T25 e incubar, a 37 graus C, durante 6 h. Após a incubação, adicionar 10 mL de RPMI + soro a 15%. 315
As linhas repórter estáveis de Jurkat:GAS-SEAP são mantidas em RPMI + soro a 10%, Genticina a 1 mg/mL e Pen-Strep a 1%. Estas células são tratadas com concentrações variáveis de uma ou mais proteínas de fusão da presente invenção.
No dia de tratamento com a proteína de fusão, as células devem ser lavadas e ressuspensas em novo RPMI + soro a 10%, para uma densidade de 500000 células por mL. O número exacto de células requerido irá depender do número de proteínas de fusão e do número de diferentes concentrações de proteínas de fusão sendo rastreadas. Para uma placa de 96 poços são requeridas, aproximadamente, 10 milhões de células (para 10 placas, 100 milhões de células).
As placas de poços contendo células de Jurkat tratadas com a proteína de fusão são colocadas numa incubadora, durante 48 h (nota: este tempo é variável entre 48-72 h) . Amostras de 35 pL de cada poço são, depois, transferidas para uma placa de 96 poços opaca, utilizando uma pipeta de 12 canais. As placas opacas devem ser cobertas (utilizando capas de celofane) e armazenadas a -20 graus C, até que sejam realizados os ensaios de SEAP, de acordo com o Exemplo 76. As placas contendo as restantes células tratadas são colocadas a 4 graus C e servem como uma fonte de material para repetir o ensaio num poço específico, se desejado.
Como um controlo positivo, podem ser utilizadas 100 Unidades/mL de interferão gama que se sabe que activa células T de Jurkat. É tipicamente observada uma indução superior a 30 vezes nos poços de controlo positivo. 316 0 protocolo acima pode ser utilizado na geração de células transfectadas de modo transiente, assim como estável, que seria evidente para os especialistas na técnica.
Exemplo 79: Ensaio para Actividade de Célula T. NF-KB (Factor Nuclear KB) é um factor de transcrição activado por uma ampla variedade de agentes, incluindo as citocinas inflamatórias IL-1 e TNF, CD30 e CD40, linfotoxina alfa e linfotoxina beta, por exposição a LPS ou trombina e por expressão de determinados produtos génicos virais. Como um factor de transcrição, o NF-KB regula a expressão de genes envolvidos na activação celular imunitária, controlo de apoptose (o NF-KB parece blindar as células da apoptose), desenvolvimento de células B e T, respostas antivíricas e antimicrobianas e respostas a múltiplo stress.
Em condições não estimuladas, o NF-KB é retido no citoplasma com I-KB (Inibidor KB). Contudo, após estimulação, o I-KB é fosforilado e degradado, causando o deslocamento de NF-KB para o núcleo activando, desse modo, a transcrição de genes alvo. Os genes alvo activados por NF-KB incluem IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 e MHC de classe 1.
Devido ao seu papel central e capacidade para responder a uma gama de estímulos, as construções repórter utilizando o elemento promotor de NF-KB são utilizadas para rastrear a proteina de fusão. Os activadores ou inibidores de NF-KB seriam úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de doenças. Por exemplo, os inibidores de NF-KB poderiam ser utilizados para 317 tratar as doenças relacionadas com a activação aguda ou crónica de NF-KB, tal como artrite reumatóide.
Para construir um vector contendo o elemento promotor de NF-KB, é empregue uma estratégia baseada em PCR. 0 iniciador a montante contém quatro cópias em tandem do sitio de ligação de NF-KB (GGGGACTTTCCC) (SEQ ID N°: 1119), 18 pb de sequência complementar à extremidade 5' da sequência promotora precoce de SV40 e está flanqueado com um sitio Xhol: 5 ’ :GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACnTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTC CATCCTGCCATCTCAATTAG:3’ (SEQ ID N°: 1120) O iniciador a jusante é complementar à extremidade 3' do promotor de SV40 e está flanqueado com um sitio Hind III: 5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEQ ID N°: 1115) A amplificação por PCR é realizada utilizando o molde do promotor de SV40 presente no plasmídeo pB-gal:promotor, obtido da Clontech. O fragmento de PCR resultante é digerido com Xhol e HindIII e subclonado em BLSK2-. (Stratagene) A sequenciação com os iniciadores T7 e T3 confirma que o inserto contém a seguinte sequência: 5’ :CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTG CCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCC CTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTAT TTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGG AGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3 ’ (SEQ ID N°: 1121) 318
Em seguida, substituir o elemento promotor mínimo de SV40, presente no plasmídeo promotor pSEAP2 (Clontech), com este fragmento NF-KB/SV40, utilizando Xhol e HindIII. Contudo, este vector não contém um gene de resistência a neomicina e, por conseguinte, não é preferido, para sistemas de expressão de mamífero.
De modo a gerar linhas celulares de mamífero estáveis, a cassete NF-KB/SV40/SEAP é removida do vector NF-KB/SEAP acima, utilizando as enzimas de restrição Sall e Notl e inserida num vector contendo resistência a neomicina. Particularmente, a cassete NF-KB/SV40/SEAP foi inserida em pGFP-1 (Clontech), substituindo o gene de GFP, após restrição de pGFP-1 com Sall e Notl.
Uma vez criado o vector NF-KB/SV40/SEAP/Neo, as células T de Jurkat estáveis são criadas e mantidas de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 76. De modo semelhante, o método para ensaiar proteínas de fusão com estas células T de Jurkat estáveis também é descrito no Exemplo 76. Como um controlo positivo, TNF alfa exógeno (0,1, 1, 10 ng) é adicionado aos poços H9, H10 e Hl 1, com uma activação de 5-10 vezes tipicamente observada. 319
Exemplo 80:_Ensaio Identificando Actividade Mielóide. 0 seguinte protocolo é utilizado para avaliar a actividade mielóide de uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, determinando se a proteína de fusão prolifera e/ou diferencia células mielóides. A actividade celular mielóide é avaliada utilizando a construção GAS/SEAP/Neo, produzida no Exemplo 75. Deste modo, factores que aumentam a actividade de SE AP indicam a capacidade para activar a via de transdução de sinal de Jaks-STAT. A célula mielóide utilizada neste ensaio é U937, uma linha celular pré-monocítica, embora possam ser utilizadas TF-1, HL60 ou KG1.
Para transfectar de modo transiente células U937 com a construção GAS/SEAP/Neo produzida no Exemplo 75, é utilizado um método de DEAE-Dextrano (Kharbanda et al., 1994, Cell Growth & Differentiation, 5:259-265). Em primeiro lugar, recolher 2xl07 células U937 e lavar com PBS. As células U937 são habitualmente cultivadas em meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal (FBS) a 10% inactivado por calor, suplementado com penicilina a 100 unidades/mL e estreptomicina a 100 mg/mL.
Em seguida, suspender as células em 1 mL de tampão Tris-HCl a 20 mM (pH 7,4) contendo DEAE-Dextrano a 0,5 mg/mL, 8 pg de ADN plasmídico de GAS-SEAP2, NaCl a 140 mM, KCI a 5 mM, Na2HP04.7H20 a 375 μΜ, MgCl2 a 1 mM e CaCl2 a 675 μΜ. Incubar a 37 graus C, durante 45 min.
Lavar as células com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% e, depois, ressuspender em 10 mL de meio completo e incubar, a 37 graus C, durante 36 h. 320
As células estáveis GAS-SEAP/U937 são obtidas pelo crescimento das células em G418 a 400 pg/mL. O meio isento de G418 é utilizado para crescimento de rotina mas, a cada mês ou de dois em dois meses, as células devem ser recultivadas em G418 a 400 pg/mL para duas passagens.
Estas células são testadas pela recolha de lxlO8 células (estas são suficientes para ensaio de dez placas de 96 poços) e lavar com PBS. Suspender as células em 200 mL do meio de crescimento descrito acima, com uma densidade final de 5xl05 células/mL. Plaquear 200 pL de células por poço na placa de 96 poços (ou lxlO5 células/poço).
Adicionar diferentes concentrações da proteína de fusão. Incubar a 3 7 graus C, durante 48 a 72 h. Como um controlo positivo, podem ser utilizadas 100 Unidades/mL de interferão gama que se sabe que activa células U937. É tipicamente observada uma indução superior a 30 vezes nos poços de controlo positivo. Ensaiar o sobrenadante com SEAP de acordo com métodos conhecidos na técnica e/ou o protocolo descrito no Exemplo 76.
Exemplo 81: Ensaio Identificando Alterações em Concentração e Permeabilidade de Membrana de Moléculas Pequenas.
Sabe-se que a ligação de um ligando a um receptor altera níveis intracelulares de moléculas pequenas, tal como cálcio, potássio, sódio e pH, assim como altera o potencial de membrana. Estas alterações podem ser medidas num ensaio, para identificar proteínas de fusão que se ligam a receptores de uma célula particular. Embora a seguinte protocolo descreva um ensaio para cálcio, este protocolo pode ser facilmente modificado para 321 detectar alterações em potássio, sódio, pH, potencial de membrana ou qualquer outra molécula pequena que seja detectável por uma sonda fluorescente. 0 seguinte ensaio utiliza Leitor de Placas de Imaqiologia Fluorométrica ("FLIPR") para medir alterações em moléculas fluorescentes (Molecular Probes) que se ligam a moléculas pequenas. Claramente, qualquer molécula fluorescente detectando uma molécula pequena pode ser utilizada no lugar da molécula fluorescente de cálcio, fluo-4 (Molecular Probes, Inc.; catálogo n° F-14202), aqui utilizada.
Para células aderentes, semear as células a 10000-20000 células/poço numa placa de 96 poços preta Co-star com fundo raso. A placa é incubada numa incubadora de CO2 durante 20 horas. As células aderentes são lavadas duas vezes numa lavadora Biotek com 200 pL de HBSS (Soro fisiológico Equilibrada de Hank), deixando 100 pL de tampão após a lavagem final.
Uma solução stock de fluo-4 a 1 mg/mL é preparada em ácido plurónico a 10% DMSO. Para carregar as células com fluo-4, 50 pL de fluo-4 a 12 pg/mL são adicionados a cada poço. A placa é incubada, a 37 graus C, numa incubadora de CO2, durante 60 min. A placa é lavada quatro vezes na lavadora Biotek com HBSS, deixando 100 pL de tampão.
Para células não aderentes, as células são separadas dos meios de cultura por concentração no fundo do tubo. As células são ressuspensas para 2-5xl06 células/mL com HBSS num tubo cónico de 50 mL. 4 pL de solução de fluo-4 a 1 mg/mL em de ácido plurónico a 10% DMSO são adicionados a cada mL de suspensão celular. O tubo é, depois, colocado num banho-maria, a 322 37 graus C, durante 30-60 min. As células são lavadas duas vezes com HBSS, ressuspendas para lxlO6 células/mL e dispensadas numa microplaca, 100 pL/poço. A placa é centrifugada, a 1000 rpm, durante 5 min. A placa é, depois, lavada uma vez em Denley Cell Wash com 200 pL, seguida de uma etapa de aspiração para 100 pL de volume final.
Para um ensaio não baseado em células, cada poço contém uma molécula fluorescente, tal como fluo-4. A proteína de fusão da invenção é adicionada ao poço e uma alteração em fluorescência é detectada.
Para medir a fluorescência de cálcio intracelular, o FLIPR é regulado para os seguintes parâmetros: (1) O ganho de sistema é 300-800 mW; (2) 0 tempo de exposição é 0,4 segundos; (3) O F/diafragma de câmara é F/2; (4) A excitação é 488 nm; (5) A emissão é 530 nm; e (6) A adição de amostra é 50 pL. O aumento de emissão a 530 nm indica um evento de sinalização extracelular causado por uma proteína de fusão de albumina da presente invenção ou uma molécula induzida por uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, que resultou num aumento na concentração de Ca++ intracelular.
Exemplo 82: Ensaio Identificando Actividade de Tirosina Cinase.
As Proteínas Tirosinas Cinases (PTK) representam um grupo diverso de cinases transmembranares e citoplasmáticas. Dentro do grupo de Receptores de Proteína Tirosina Cinase (RPTK) estão receptores para uma gama de factores de crescimento mitogénicos e metabólicos, incluindo os PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF e 323 subfamílias de receptores de Insulina. Além disso, há uma grande família de RPTK relativamente à qual o correspondente ligando é desconhecido. Os ligandos para RPTK incluem, principalmente, pequenas proteínas segregadas, mas também proteínas membranares e de matriz extracelular. A activação de RPTK por ligandos envolve a dimerização de receptor mediada por ligando, resultando na transfosforilação das subunidades de receptor e activação das tirosinas cinases citoplasmáticas. As tirosinas cinases citoplasmáticas incluem tirosinas cinases associadas a receptor da família de src (e. g. , src, yes, lck, lyn, fyn) e proteínas tirosinas cinases não ligadas a receptor e citosólicas, tal como a família de Jak, cujos membros medeiam a transdução de sinal desencadeada pela superfamília de citocina de receptores (e. g., as Interleucinas, Interferões, GM-CSF e Leptina).
Devido à ampla gama de factores conhecidos capazes de estimularem a actividade de tirosina cinase, é de interesse identificar se uma proteína de fusão de albumina da presente invenção ou uma molécula induzida por uma proteína de fusão da presente invenção é capaz de activar as vias de transdução de sinal de tirosina cinase. Por conseguinte, o seguinte protocolo é concebido para identificar essas moléculas capazes de activarem as vias de transdução de sinal de tirosina cinase.
Semear células alvo (e. g., queratinócitos primários) a uma densidade de, aproximadamente, 25000 células por poço em
Loprodyne Silent Screen Plates de 96 poços, adquiridas à Nalge Nunc (Naperville, IL) . As placas são esterilizadas com duas enxaguadelas de 30 minutos com etanol a 100%, enxaguadas com água e secas de um dia para o outro. Algumas placas são 324 revestidas, durante 2 h, com 100 mL de colagénio de tipo I de grau de cultura celular (50 mg/mL), gelatina (2%) ou polilisina (50 mg/mL), podendo ser todos adquiridos à Sigma Chemicals (St. Louis, MO), ou Matrigel a 10%, adquirido à Becton Dickinson (Bedf ord, MA) , ou soro de vitelo, enxaguadas com PBS e armazenadas a 4 graus C. O crescimento celular nestas placas é ensaiado pela sementeira de 5000 células/poço em meio de crescimento e quantificação indirecta do número de células, através da utilização de Azul de alamar, como descrito pelo fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA). Após 48 h, coberturas N° 3071 de placas Falcon da Becton Dickinson (Bedford, MA) são utilizadas para cobrir as Loprodyne Silent Screen Plates. As placas de cultura celular Falcon Microtest III também podem ser utilizadas em algumas experiências de proliferação.
Para preparar os extractos, as células A431 são inoculadas sobre as membranas de nylon de placas Loprodyne (20000/200 mL/poço) e cultivadas, de um dia para o outro, em meio completo. As células são submetidas a quiescência por incubação em meio basal isento de soro, durante 24 h. Após 5-20 minutos de tratamento com EGF (60 ng/mL), ou uma concentração diferente de proteína de fusão de albumina da invenção, o meio foi removido e 100 mL de tampão de extracção ((HEPES a 20 mM, pH 7,5, NaCl a 0,15 M, Triton X-100 a 1%, SDS a 0,1%, Na3P04 a 2 mM, Na4P207 a 2 mM e um cocktail de inibidores de protease (N° 1836170), obtido da Boeheringer Mannheim (Indianapolis, IN)), são adicionados a cada poço e a placa é agitada num agitador rotativo, durante 5 minutos, a 4 °C. A placa é, depois, colocada num colector de transferência a vácuo e o extracto filtrado através dos fundos de membrana de 0,45 mm de cada poço utilizando vácuo doméstico. Os extractos são recolhidos numa 325 placa de captura/ensaio de 96 poços no fundo do colector a vácuo e imediatamente colocados sobre gelo. Para obter-se extractos clarificados por centrifugação, o conteúdo de cada poço, após solubilização com detergente, durante 5 minutos, é removido e centrifugado, durante 15 minutos, a 4 graus C, a 16000 x g.
Testar os extractos filtrados para níveis de actividade de tirosina cinase. Embora sejam conhecidos muitos métodos de detecção de actividade de tirosina cinase, é aqui descrito um método.
Em geral, a actividade de tirosina cinase de uma proteína de fusão de albumina da invenção é avaliada pela determinação da sua capacidade para fosforilar um resíduo de tirosina num substrato específico (um péptido biotinilado). Os péptidos biotinilados que podem ser utilizados para este efeito incluem PSK1 (correspondendo aos aminoácidos 6-20 da cinase cdc2-p34 de divisão celular) e PSK2 (correspondendo aos aminoácidos 1-17 de gastrina) . Ambos os péptidos são substratos para uma gama de tirosinas cinases e estão disponíveis da Boehringer Mannheim. A reacção de tirosina cinase é implementada pela adição dos seguintes componentes, por ordem. Em primeiro lugar, adicionar 10 pL de Péptido Biotinilado a 5 μΜ, depois, 10 pL de ATP/Mg2+ (ATP a 5 mM/MgCl2 a 50 mM) , depois, 10 pL de Tampão de Ensaio 5x (cloridrato de imidazole a 40 mM, pH 7,3, beta-glicerofosfato a 40 mM, EGTA a 1 mM, MgCl2 a 100 mM, MnCl2 a 5 mM, BSA a 0,5 mg/mL) , depois, 5 pL de Vanadato de Sódio (1 mM) e, depois, 5 pL de água. Misturar os componentes suavemente e pré-incubar a mistura reaccional, a 30 graus C, durante 2 min. Iniciar a reacção pela adição de 10 pL da enzima de controlo ou do sobrenadante filtrado. 326 A reacção de ensaio de tirosina cinase é, depois, terminada pela adição de 10 pL de EDTA a 120 mM e colocar as reacções sobre gelo. A actividade de tirosina cinase é determinada pela transferência de alíquota de 50 pL de mistura reaccional para um módulo de placa de microtitulação (MTP) e incubação a 37 graus C, durante 20 min. Isto permite que a placa de 96 poços revestida com estreptavadina se associe com o péptido biotinilado. Lavar o módulo de MTP com 300 pL/poço de PBS quatro vezes. Em seguida, adicionar 75 pL de anticorpo anti-fosfotirosina conjugado a peroxidase de rábano (anti-P-Tyr-POD (0,5 pg/mL) ) a cada poço e incubar, a 37 graus C, durante uma hora. Lavar o poço como acima.
Em seguida, adicionar 100 pL de solução de substrato de peroxidase (Boehringer Mannheim) e incubar, à temperatura ambiente, durante, pelo menos, 5 min (até 30 min). Medir a absorvência da amostra a 405 nm pela utilização de leitor de ELISA. O nível de actividade de peroxidase ligada é quantificado utilizando um leitor de ELISA e reflecte o nível de actividade de tirosina cinase.
Exemplo 86: Proliferação de Fibroblastos Dérmicos Humanos e Células de Músculo Liso Aórtico.
Uma proteína de fusão de albumina da invenção é adicionada a culturas de fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) e células de músculo liso aórtico humano (AoSMC) e dois co-ensaios são realizados com cada amostra. O primeiro ensaio examina o efeito da proteína de fusão na proliferação de fibroblastos 327 dérmicos humanos normais (NHDF) ou células de músculo liso aórtico (AoSMC). 0 crescimento aberrante de fibroblastos ou células de músculo liso é uma parte de vários processos patológicos, incluindo fibrose e reestenose. 0 segundo ensaio examina a produção de IL6 por NHDF e SMC. A produção de IL6 é uma indicação de activação funcional. As células activadas terão uma produção aumentada de um número citocinas e outros factores que pode resultar num efeito proinflamatório ou imunomodulatório. Os ensaios são corridos com e sem co-estimulação de TNFa, de modo a pesquisar para actividade co-estimulatória ou inibitória.
Resumidamente, no dia 1, as placas de 96 poços pretas são implementadas com 1000 células/poço (NHDF) ou 2000 células/poço (AoSMC) em 100 pL de meios de cultura. Os meios de cultura de NHDF contêm: Meios basais de FB da Clonetics, hFGF a 1 mg/mL, insulina a 5 mg/mL, gentamicina a 50 mg/mL, FBS a 2, enquanto os meios de cultura de AoSMC contêm meios basais de SM da Clonetics, hEGF a 0,5 pg/mL, insulina a 5 mg/mL, hFGF a 1 pg/mL, gentamicina a 50 mg/mL, Anfotericina B a 50 pg/mL, FBS a 5%. Após incubação a 37 °C durante, pelo menos, 4-5 horas, os meios de cultura são aspirados e substituídos com meios de paragem de crescimento. Os meios de paragem de crescimento para NHDF contêm meios basais de fibroblastos, gentamicina a 50 mg/mL, FBS a 2%, enquanto os meios de paragem de crescimento para AoSMC contêm meios basais de SM, gentamicina a 50 mg/mL, Anfotericina B a 50 pg/mL, FBS a 0,4%. Incubar a 37 °C até ao dia 2. 328
No dia 2, as diluições em série e moldes de uma proteína de fusão de albumina da invenção são concebidos, de modo a que incluam sempre controlos de meios e controlos de proteínas conhecidos. Para as experiências de estimulação e inibição, as proteínas são diluídas em meios de paragem de crescimento. Para as experiências de inibição, é adicionado TNFa para uma concentração final de 2 ng/mL (NHDF) ou 5 ng/mL (AoSMC).
Adicionar 1/3, em vol., de meios contendo controlos ou uma proteína de fusão de albumina da invenção e incubar, a 37 graus C/CO2 a 5%, até ao dia 5.
Transferir 60 pL de cada poço para outra placa de 96 poços marcada, cobrir com um selante de placas e armazenar a 4 graus C até ao Dia 6 (para ELISA de IL6) . Para os restantes 100 pL na placa de cultura de células, adicionar, de modo asséptico, Azul de Alamar, numa quantidade igual a 10% do volume de cultura (10 pL) . Devolver as placas à incubadora, durante 3 a 4 horas. Depois, medir a fluorescência com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm, utilizando o CytoFluor. Isto produz os dados de estimulação/inibição de crescimento.
No dia 5, o ELISA de IL6 é realizado pelo revestimento de uma placa de 96 poços com 50-100 pL/poço de anticorpo Monoclonal de IL6 Anti-Humano, diluído em PBS, pH 7,4, incubar, DE UM DIA PARA O OUTRO, à temperatura ambiente.
No dia 6, esvaziar as placas no esgoto e transferir para toalhetes de papel. Preparar Tampão de Ensaio contendo PBS com BSA a 4%. Bloquear as placas com 200 pL/poço de tampão de bloqueio Super Block da Pierce em PBS, durante 1-2 h e, depois, lavar as placas com tampão de lavagem (PBS, Tween-20 a 0,05%). Transferir as placas em toalhetes de papel. Depois, adicionar 329 50 pL/poço de anticorpo Monoclonal diluído de IL-6 Anti-Humano, marcado com Biotina, a 0,50 mg/mL. Preparar diluições de stock de IL-6 em meios (30, 10, 3, 1, 0,3, 0 ng/mL). Adicionar amostras em duplicado à fileira de topo da placa. Cobrir as placas e incubar, durante 2 horas, à T.A., em agitador.
As placas são lavadas com tampão de lavagem e transferidas em toalhetes de papel. Diluir Estreptavidina marcada com EU, 1:1000, em tampão de Ensaio e adicionar 100 pL/poço. Cobrir a placa e incubar 1 h à T.A. As placas são novamente lavadas com tampão de lavagem e transferidas em toalhetes de papel.
Adicionar 100 pL/poço de Solução de Intensificação. Agitar durante 5 minutos. Ler a placa no Fluorómetro Wallac DELFIA. As leituras de amostras em triplicado em cada ensaio foram tabeladas e fez-se a média.
Neste ensaio, um resultado positivo sugere proliferação celular de AoSMC e que a proteína de fusão de albumina pode estar envolvida na proliferação de fibroblastos dérmicos e/ou proliferação de células de músculo liso. Um resultado positivo também sugere muitas potenciais utilizações da proteína de fusão e polinucleótidos codificando a proteína de fusão de albumina. Por exemplo, inflamação e respostas imunitárias, cicatrização e angiogénese, como detalhado em toda esta descrição.
Particularmente, as proteínas de fusão podem ser utilizadas na cicatrização e regeneração dérmica, assim como na promoção da vasculogénese dos vasos sanguíneos e vasos linfáticos. O crescimento dos vasos pode ser utilizado no tratamento de, por exemplo, doenças cardiovasculares. Além disso, as proteínas de fusão mostrando actividade de antagonista neste ensaio podem ser úteis no tratamento de doenças, distúrbios e/ou estados que 330 envolvem a angiogénese pela actuação como um agente anti-vascular (e. g., anti-angiogénese). Estas doenças, distúrbios e/ou estados são conhecidos na técnica e/ou são aqui descritos, tais como, por exemplo, malignidades, tumores sólidos, tumores benignos, por exemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogénicos; placas arteroscléricas; doenças angiogénicas oculares, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, degenerescência macular, rejeição de enxerto corneano, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeose, retinoblastoma, uveite e Pterigia (crescimento anómalo de vaso sanguíneo) do olho; artrite reumatóide; psoríase; cicatrização retardada; endometriose; vasculogénese; granulações; cicatrizes hipertróficas (quelóides); fracturas de não união; esclerodermia; tracoma; adesões vasculares; angiogénese miocárdica; colaterais coronários; colaterais cerebrais; malformações arteriovenosas; angiogénese de membro isquémico; Síndrome de Osler-Webber; neovascularização de placa; telangiectasia; articulações hemofilíacas, angiofibroma; displasia fibromuscular; granulação de feridas; doença de Crohn; e aterosclerose. Além disso, as proteínas de fusão de albumina que actuam como antagonistas neste ensaio podem ser úteis no tratamento de doenças anti-hiperproliferativas e/ou anti-inflamatórias conhecidas na técnica e/ou aqui descritas. 331
Exemplo 87: Expressão de Molécula de Adesão Celular (CAM) em Células Endoteliais. 0 recrutamento de linfócitos para áreas de inflamação e angiogénese envolve interacções de receptor-ligando específicas entre moléculas de adesão de superfície celular (CAM) em linfócitos e no endotélio vascular. 0 processo de adesão, em quadros normais e patológicos, segue uma cascata multietápica que envolve a expressão de molécula 1 de adesão intercelular (ICAM-1) , molécula 1 de adesão celular vascular (VCAM-1) e molécula 1 de adesão de leucócito endotelial (selectina E) em células endoteliais (EC) . A expressão destas e outras moléculas no endotélio vascular determina a eficiência com que os leucócitos podem aderir à vasculatura local e extravasar para o tecido local, durante o desenvolvimento de uma resposta inflamatória. A concentração local de citocinas e factor de crescimento participa na modulação da expressão destas CAM.
Resumidamente, as células endoteliais (e. g. , células Endoteliais de Veia Umbilical Humana (HUVEC)) são cultivadas numa placa de 96 poços padrão para confluência, o meio de crescimento é removido das células e substituído com 100 pL de Meio 199 (soro bovino fetal a 10% (FBS)). As amostras para testagem (contendo uma proteína de fusão de albumina da invenção) e os controlos positivo ou negativo são adicionados à placa em triplicado (em volumes de 10 pL). As placas são, depois, incubadas a 37 °C, durante 5 h (expressão de selectina e integrina) ou 24 h (apenas expressão de integrina). As placas são aspiradas para remover o meio e 100 pL de paraformaldeído-PBS a 0,1% (com Ca++ e Mg++) são adicionados a cada poço. As placas são mantidas a 4 °C, durante 30 min. O fixor é removido dos poços e os poços são lavados IX com PBS (+Ca,Mg) + BSA a 332 0,5% e drenados. São adicionados 10 pL de anticorpo primário diluido aos poços de teste e controlo. Anti-ICAM-l-Biotina, Anti-VCAM-l-Biotina e Anti-selectina E-Biotina são utilizados a uma concentração de 10 pg/mL (diluição 1:10 de anticorpo de stock a 0,1 mg/mL). As células são incubadas a 37 °C, durante 30 min, num ambiente humidificado. Os poços são lavados três vezes com PBS (+Ca,Mg) + BSA a 0,5%. São adicionados 20 pL de ExtrAvidina-Fosfatase Alcalina diluída (diluição 1:5000, aqui referida como a diluição de trabalho) a cada poço e incubados, a 37 °C, durante 30 min. Os poços são lavados três vezes com PBS (+Ca,Mg)+BSA a 0,5%. Dissolver 1 comprimido de p-Nitrofenol Fosfato pNPP por 5 mL de tampão de glicina (pH 10,4) . A cada poço de teste, são adicionados 100 pL de substrato de pNPP em tampão de glicina. Os poços de padrão em triplicado são preparados a partir da diluição de trabalho do tampão de ExtrAvidina-Fosfatase Alcalina em glicina: 1:5000 (10°) > 10~0,5 > 10-1 > 10~1,5. São adicionados 5 pL de cada diluição a poços em triplicado e o teor de AP resultante em cada poço é 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng, 0,18 ng. São, depois, adicionados 100 pL de reagente de pNNP a cada dos poços de padrão. A placa é incubada, a 37 °C, durante 4 h. Um volume de 50 pL de NaOH a 3 M é adicionado a todos os poços. A placa é lida num leitor de placas, a 405 nm, utilizando a opção de subtracção de fundo em poços em branco cheios apenas com tampão de glicina. Além disso, o molde é implementado para indicar a concentração de conjugado de AP em cada poço de padrão [5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng] . Os resultados são indicados como quantidade de conjugado de AP ligado em cada amostra. 333
Exemplo 88: Ensaio de Proliferação de Células Endoteliais de Azul de Alamar.
Este ensaio pode ser utilizado para determinar quantitativamente a inibição mediada por proteína da proliferação induzida por bFGF de Células Endoteliais Linfáticas Bovinas (LEC), Células Endoteliais Aórticas Bovinas (BAEC) ou Células Miometriais Uterinas Microvasculares Humanas (UTMEC). Este ensaio incorpora um indicador de crescimento fluorométrico baseado na detecção de actividade metabólica. Um Ensaio de Proliferação de Azul de Alamar padrão é preparado em EGM-2MV com 10 ng/mL de bFGF, adicionado como uma fonte de estimulação celular endotelial. Este ensaio pode ser utilizado com uma variedade de células endoteliais, com ligeiras alterações no meio de crescimento e concentração celular. As diluições de lotes de proteína a serem testadas são diluídas conforme apropriado. O meio isento de soro (GIBCO SFM) sem bFGF é utilizado como um controlo não estimulado e Angiostatina ou TSP-1 são incluídos como controlos inibitórios conhecidos.
Resumidamente, LEC, BAEC ou UTMEC são inoculadas em meio de crescimento, a uma densidade de 5000 a 2000 células/poço, numa placa de 96 poços e colocadas a 37 graus C, de um dia para o outro. Após a incubação de um dia para o outro das células, os meios de crescimento são removidos e substituídos com EC-SFM da GIBCO. As células são tratadas com as diluições apropriadas de uma proteína de fusão de albumina da invenção ou amostra(s) de proteína de controlo (preparadas em SFM) em poços em triplicado, com bFGF adicional para uma concentração de 10 ng/mL. Uma vez as células tratadas com as amostras, a(s) placa(s) é/são colocada(s) de volta na incubadora, a 37° C, durante três dias. Após três dias, 10 mL de stock de azul de alamar (Biosource Cat 334 N° DAL1100) são adicionados a cada poço e a(s) placa(s) é/são colocada (s) de volta na incubadora, a 37 °C, durante quatro horas. A(s) placa(s) é/são, depois, lida(s) a excitação de 530 nm e emissão de 590 nm, utilizando o leitor de fluorescência CytoFluor. A saida directa é registada em unidades de fluorescência relativa. O azul de Alamar é um indicador de oxidação-redução que fluoresce e altera a cor, em resposta a redução química do meio de crescimento resultante do crescimento celular. À medida que as células crescem em cultura, a actividade metabólica inata resulta numa redução química do ambiente circundante imediato. A redução relacionada com o crescimento faz com que o indicador se altere da forma oxidada (azul não fluorescente) para a forma reduzida (vermelho fluorescente) (i. e., - a proliferação estimulada irá produzir um sinal mais forte e a proliferação inibida irá produzir um sinal mais fraco e o sinal total é proporcional ao número total de células, assim como sua actividade metabólica). O nível de actividade de fundo é observado apenas com o meio de inanição. Este é comparado com a saída observada das amostras de controlo positivo (bFGF em meio de crescimento) e diluições de proteína.
Exemplo 92: Ensaios de Ligação de Ligando. O seguinte ensaio pode ser utilizado para avaliar a actividade de ligação de ligando de uma proteína de fusão de albumina da invenção. 335
Os ensaios de ligação de ligando proporcionam um método directo para verificar a farmacologia de receptor e são adaptáveis a um formato de alta capacidade. 0 ligando purificado para uma proteína de fusão de albumina da invenção é marcado radioactivamente para elevada actividade específica (50-2000 Ci/mmol) para estudos de ligação. Uma determinação é, depois, realizada para que o processo de marcação radioactiva não diminua a actividade do ligando para a proteína de fusão. As condições de ensaio para tampões, iões, pH e outros moduladores, tal como nucleótidos, são optimizadas para eestabelecer uma razão de sinal para ruído praticável para fontes polipeptídicas de membrana e célula intacta. Para estes ensaios, a ligação polipeptídica específica é definida como radioactividade associada total menos a radioactividade medida, na presença de um excesso de ligando de competição não marcado. Onde possível, mais de um ligando de competição é utilizado para definir a ligação não específica residual.
Exemplo 101; Suporte de Sobrevivência de Neurónio de Embrião de Galinha.
Para testar se a viabilidade celular neuronal simpática é suportada por uma proteína de fusão de albumina da invenção, o ensaio de sobrevivência neuronal de embrião de galinha de Senaldi et al. pode ser utilizado (Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 96:11458-63 (1998)).
Resumidamente, os neurónios motores e simpáticos são isolados de embriões de galinha, ressuspensos em meio L15 (com FCS a 10%, glucose, selenite de sódio, progesterona, conalbumina, putrescina e insulina; Life Technologies, 336
Rockville, MD.) e meio de Eagle modificado por Dulbecco [com FCS a 10%, glutamina, penicilina e tampão HEPES a 25 mM (pH 7,2); Life Technologies, Rockville, MD.], respectivamente, e incubados, a 37 °C, em CO2 a 5% na presença de diferentes concentrações da proteína de fusão da invenção purificada, assim como um controlo negativo desprovido de qualquer citocina. Após 3 dias, a sobrevivência de neurónio é determinada por avaliação de morfologia celular e através da utilização do ensaio colorimétrico de Mosmann (Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 65:55-63 (1983)). A viabilidade celular neuronal melhorada, em comparação com os controlos desprovidos de citocina, é indicativa da capacidade de a proteína de fusão de albumina melhorar a sobrevivência de células neuronais.
Exemplo 105: Imobilização de biomoléculas.
Este exemplo proporciona um método para a estabilização de uma proteína de fusão de albumina da invenção em construções de bicamada lipídica de célula não hospedeira (ver, e. g., Bieri et al. , Nature Biotech 17:1105-1108 (1999)) que pode ser adaptada para o estudo de proteínas de fusão da invenção nos diversos ensaios funcionais descritos acima. Resumidamente, a química específica de hidrato de carbono para biotina é utilizada para confinar uma cauda de biotina a uma proteína de fusão de albumina da invenção permitindo, deste modo, orientação uniforme após imobilização. Uma solução a 50 μΜ de uma proteína de fusão de albumina da invenção em membranas lavadas é incubada com NaI04 a 20 mM e BACH a 1,5 mg/mL (4 mM) ou biotina-hidrazida a 2 mg/mL (7,5 mM) , durante 1 h, à temperatura ambiente (volume reaccional, 150 pL) . Depois, a amostra é dialisada (Pierce Slidealizer Cassett, exclusão de 10 kDa; Pierce Chemical Co., 337
Rockford IL) , a 4 °C, primeiro durante 5 h, trocando o tampão após cada hora e, finalmente, durante 12 h, contra 500 mL de tampão R (NaCl a 0,15 M, MgCl2 a 1 mM, fosfato de sódio a 10 mM, pH 7) . Imediatamente antes da adição a uma cuveta, a amostra é diluída 1:5 em tampão ROG50 (Tampão R suplementado com octilglucósido a 50 mM).
Exemplo 116: Actividade da Construção 3070 (Fusão de Albumina de GLP-1) Medida por Estimulação In Vitro de ARNm de Insulina em Células INS-1
Foi recentemente mostrado que o GLP-1 aumenta a expressão de ARNm de insulina em células beta pancreáticas (Buteau et al., Diabetologia, Julho de 1999; 42(7):856-64). Deste modo, a capacidade de a proteína de fusão de albumina de GLP-1 codificada por CID 3070 estimular o ARNm de insulina foi avaliada utilizando a linha celular beta pancreática INS-1 (832/13) . A Figura 14 ilustra os níveis de estado estacionário de ARNm de insulina em células INS-1 (832/13) após tratamento com GLP-1 ou proteína de fusão de albumina de GLP-1 codificada pela construção ID 3070 (proteína CID 3070). O G1P-1 e a proteína CID 3070 estimulam a transcrição do gene de insulina. A primeira barra (preta) representa as células não tratadas. As barras 2-4 (brancas) representam células tratadas com as concentrações indicadas de GLP-1. As barras 5-7 (cinzentas) representam células tratadas com as concentrações indicadas de proteína CID 3070. 338 SEQL <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Proteínas de Fusão de Albumina
<130> PF564PCT <150> 60/341811 <151> 2001-12-21 <150> 60/360000 <151> 2002-02-28 <150> 60/378950 <151> 2002-05-10 <150> 60/398008 <151> 2002-07-24 <150> 60/411355 <151> 2002-09-18 <150> 60/414984 <151> 2002-10-02 <150> 60/417611 <151> 2002-10-11 339 <15Ο> 60/420246 <151> 2002-10-23 <150> 60/423623 <151> 2002-11-05 <150> 60/351360 <151> 2002-01-28 <150> 60/382617 <151> 2002-05-24 <150> 60/383123 <151> 2002-05-28 <150> 60/385708 <151> 2002-06-05 <150> 60/394625 <151> 2002-07-10 <150> 60/411426 <151> 2002-09-18 <150> 60/350358 <151> 2002-01-24 <150> 60/359370 <151> 2002-02-26 <150> 60/367500 <151> 2002-03-27 340 <15Ο> 60/402131 <151> 2002-08-09 <150> 60/402708 <151> 2002-08-13 <150> 60/370227 <151> 2002-04-08 <160> 2222 <170> Patentln Ver. 2.0
<210> 110 <211> 1203 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 110 atgaacaagt tgctgtgctg cgcgctcgtg caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcac tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta gtgtgcgecc cttgccctga ccactactac ctacactgca gccccgtgtg caaggagctg cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cataggagct gccctcctgg aettggagtg gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt cacgacaaca tatgttccgg aaacagcgaa ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaacggcaac acagctcaca agaacagact aacaaagacc aagatatagt caagaagatc gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc agcttaecgg gaaagaaagt gggagcagaa cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt. accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag gtcacccaga gcctaaagaa gaccatcagg tatcagaagC tatttttaga aatgataggt tta tctctggaca cccccatcaa gcggaccacc 60 tatgaogaag aaacctctca tcagctgttg 120 aaacaacact gtacageaaa gtggaagacc 180 acagacagct ggcacaecag tgacgagtgt 240 cagtacgtca ageaggagtg caategcace 300 cgceaccttg agatagagtt ccgcttgaaa 360 gcgcaagccg gaaccccaga gcgaaataca 420 tcaaatgaga cgtcatccaa agcaccctgC 480 ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540 tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 600 gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660 aaagtaaacg cagagagtgt agagaggaea 720 ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780 atccaagata ttgacctctg cgaaaacagc 840 accttcgagc agcttcgtag cccgatggaa 900 gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 960 ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1020 cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaacC 1080 ctccttcaca gcttcacaat gtaeaaattg 1140 aaccaggtcc aatcagtaaa aacaagctgc 1200 1203 341
<210> 198 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 198 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta ttcgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgtccccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcactct cagcttccca ggcagaccca 120 ctoagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccacc caeagggcac attcaecagt 180 gactacagca agtatetgga ctccaggcgt geceaagatt ttgtgcagtg gttgaCgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaactcatt 360 gcttggctgg cgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacacgc tgatggttct ttctctgatg agacgaacac catccttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 200 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 200 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatt caeagggcac attcaecagt 16o gactacagca agtatetgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagcg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaactcatt 360 gcttggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 201 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens 342 <400> 201 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttccctcc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagctcccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatt cacagggcac attcaccagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatC ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aacttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttettat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gctcggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacctggce gcagacacgc tgatggttct ttetctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aaccctgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 202 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 202 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattcc cagcttccca ggcagaccca 12o ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatt cacagggcac attcaccagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaactcggcc gcagacatgc tgatggttct ttetctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcctgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 414 <211> 639 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 414
Mat Lys Trp Vai Ser Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30
Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Xle Ala 35 40 45 343
Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ala His Lys Ser Olu Val Ala His Arg so ss 60 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 65 70 7S 80 Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu 85 90 95 Vai Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser 100 105 110 Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 115 120 125 Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cye 130 135 140 Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys 145 ISO 155 160 Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val 165 170 175 Met Cys Thr Ala Phe Hl s Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 180 185 190 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 195 200 205 Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin 210 215 220 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg 225 230 235 240 Asp Glu Gly Lys Ala ser ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser 245 250 255 Leu Gin Ly9 Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg 260 265 270 Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 275 280 28S Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 290 295 300
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cye Glu 305 310 31S 320
Aan Gin Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 325 330 335
Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Vai Glu Asn Asp Glu Met 340 34S 350 344
Pro Ala Asp 355 Leu Pro Ser Leu Ala 360 Val Cys 370 Lys Asn Tyr Ala Glu 375 Ala Leu 385 Tyr Glu Tyr Ala Arg 390 Arg His Leu Arg Leu Ala Lya 405 Thr Tyr Glu Ala Ala Asp Pro 420 Hia Glu Cya Tyr Pro Leu val 435 Glu Glu Pro Gin Asn 440 Phe Glu 450 Gin Leu Gly Glu Tyr 455 Lys Tyr 465 Thr Lys Lys Val Pro 470 Gin Val Ser Arg Asn Leu Gly 485 Lys Val Gly Ala Lys Arg Met SOO Pro Cya Ala Glu Gin Leu Cys SIS Val Leu His Glu Lya 520 Lys Cya 530 Cya Thr Glu Ser Leu 535 Val Leu 545 Glu Val Αβρ Glu Thr 550 Tyr Val Phe Thr Phe His Ala 565 Asp Ile Cys Xle Lya Lya Gin 580 Thr Ala Leu val
Ala Thr Lya Glu Gin Leu Lys Ala 595 600
Vai Glu Lys Cys Cya Lys Ala Asp 610 61S
Glu Gly Lys Lys Leu Vai Ala Ala 625 630
Ala Asp Phe Val Glu 365 Ser Lys Asp Lys Asp Val Phe 380 Leu Gly Met Phe Pro Asp Tyr 395 Ser Val Val Leu Leu 400 Thr Thr 410 Leu Glu Lys Cys Cys 415 Ala Ala 425 Lys val Phe Asp Glu Phe 430 Lys Leu ile Lys Gin Asn 445 Cys Glu Leu Phe Gin Asn Ala 460 Leu Leu Val Arg Ser Thr Pro 475 Thr Leu Val Glu Val 480 Ser Lys 490 Cys Cys Lys His Pro 495 Glu Asp 505 Tyr Leu Ser Val Val Leu 510 Asn Thr Pro val Ser Asp 525 Arg Val Thr Asn Arg Arg Pro 540 Cys Phe Ser Ala Pro Lys Glu 555 Phe Asn Ala Glu Thr S60 Thr Leu 570 Ser Glu Lys Glu Arg S7S Gin Glu 585 Leu Val Lys His Lys Pro 590 Lys Val Met Asp Asp Phe 605 Ala Ala Phe Asp Lys Glu Thr 620 Cys Phe Ala Glu Ser Gin Ala 635 Ala Leu Gly Leu 345 <210> 416 <211> 639 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 416 Met Lys Trp Vai Ser Phe Xle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu vai Ala 20 25 30
Mis Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu vai Leu 3S 40 45
Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Vai 50 55 60
Lys Leu Vai Asn Glu Vai Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Vai Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin 115 120 125 HiS Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu vai 130 135 140 Asp Vai Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 ISO 15S 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys 210 215 220 Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser 245 250 255 346
Lys Leu vai Thr ASp Leu Thr Lys Vai HiS Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Αβρ Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lie Ala Glu Vai Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Vai Glu Ser 325 330 335 Lys Asp Vai Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Vai Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Vai Vai 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cya 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Vai Phe Asp Glu 385 3 90 39S 400 Phe Lys Pro Leu Vai Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys 405 410 41S Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Vai Arg Tyr Thr Lys Lys Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Vai Ser Arg Asn Leu Gly Lys Vai Gly Ser Lys Cys Cys Lye His 4S0 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Mee Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Vai val 465 470 475 480 Leu Asn Gin Leu Cys vai Leu His Glu Lys Thr Pro Vai Ser Asp Arg 485 490 495 Vai Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Vai Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Vai Asp Glu Thr Tyr Vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu Vai Glu Leu Vai Lys His Lys 545 550 555 560 347
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Vai Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Aap Lys Glu Thr Cys Phe 580 S8S 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 610 61S 620
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Zle Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg 625 630 635
<210> 417 <211> 639 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 417
Met Lys Trp Vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 45 Trp Leu Vai Lys Gly Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Vai Ala His Arg 50 55 60 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Vai Leu Ile Ala 65 70 75 80 Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Vai Lys Leu 85 90 95 vai Asn Glu Vai Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Vai Ala Asp Glu Ser 100 105 110 Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 115 120 125 Cys Thr Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 130 135 140 Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys 145 150 155 160 348
Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu Vai Asp Vai 165 170 175 Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 180 185 190 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 195 200 205 Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin 210 215 220 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg 22S 230 235 240 Asp Glu Gly Lys Ala Ser ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser 245 250 255 Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Vai Ala Arg 260 265 270
Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 275 280 285 val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 290 29S 300 Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 305 310 315 320 Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 32S 330 335 Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met 340 345 350 Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp 355 360 365 val Cys Ly9 ASA Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe 370 375 380 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu 385 390 395 400 Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 405 410 415 Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe ASp Glu Phe Lys 420 425 430 Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu 435 440 44S Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu val Arg 450 455 460 349
Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu val Glu val 465 470 475 480 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys cys Lys His Pro Glu 485 490 495 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val val Leu Asn 500 505 510 Gin Leu Cys Val Leu HiS Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 515 520 525 Lya Cya Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 530 535 540 Leu Glu Vai Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 545 550 555 560 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys GlU Arg Gin S6S 570 575
Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu Vai Glu Leu Vai Lya His Lys Pro Lys 580 585 590
Ala Thr Lye Glu Gin Leu Lye Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 595 600 605
Vai Glu Lys Cye Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 610 615 620
Glu Gly Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635 <210> 418 <211> 639 <212> PRT <213> Homo <400> 418 Met Lys Trp 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys ser Glu vai Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu vai Leu 35 40 45 350 lie Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin 50 55
Lys Leu Vai Asn Glu Vai Thr Glu 65 70
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Aap Lye 85
Lys Leu Cys Thr vai Ala Thr Leu 100
Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu pro 115 120
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 130 135
Asp Vai Met Cys Thr Ala Phe His 145 150
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 165
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 180
Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala 195 200
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 210 215
Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu 225 230
Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro 245
Lye Leu vai Thr Asp Leu Thr Lys 260
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 27S 280
Cys Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser 290 295
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 305 310
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 325
Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Vai 60
Phe Ala Lys Thr Cys Vai Ala Asp 75 80
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 90 95
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 105 110
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin 125
Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu vai 140
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 155 160
Arg His Pro Tyr Phe Tyx Ala Pro 170 175
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 185 190
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 205
Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys 220
Arg Ala Phe Lye Ala Trp Ala Vai 235 240
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser 250 255
Vai His Thr Glu Cys Cys His Gly 265 270
Arg Ala Asp Leu Ala Lye Tyr Ile 285
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 300
Cys Ile Ala Glu Vai Glu Asn Asp 315 320
Leu Ala Ala Asp Phe Vai Glu Ser 330 335 351
Lys Asp Vai Cys Lys Asn 340 Tyr Ala Glu 345 Ala Lys A8p val Phe Leu Gly 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr 3S5 Ala Arg 360 Arg His pro Asp Tyr 365 Ser val val Leu Leu Leu Arg Leu Ala 370 Lys 375 Thr Tyr Glu Thr Thr 380 Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro 385 390 HiS Glu Cys Tyr Ala 395 Lys val Phe Asp Glu 400 Phe Lys Pro Leu Vai Glu 405 GlU Pro Gin Asn 410 Leu Ile Lys Gin Asn Cys 415 Glu Leu Phe Glu Gin Leu 420 Gly Glu Tyr 425 Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu 430 Vai Arg Tyr Thr Lys Lys 435 Val Pro 440 Gin val Ser Thr Pro 445 Thr Leu Val Glu Vai Ser Arg Asn Leu 450 Gly 455 Lys Val Gly Ser Lys 460 Cya Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Het 485 470 Pro cys Ala Glu Asp 475 Tyr Leu Ser val Val 480 Leu Asn Gin Leu Cys Vai 485 Leu His Glu Lys 490 Thr Pro Val Ser Asp Arg 495 val Thr Lys Cys Cys Thr 500 Glu Ser Leu 50S Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp 51S Glu Thr 520 Tyr Val Pro Lys Glu 525 Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His 530 Ala 535 Asp He Cys Thr Leu 540 Ser Glu Lys Glu Arg Gin Xle Lys Lys Gin 545 550 Thr Ala Leu val Glu 555 Leu Val Lys His Lys 560 Pro Lys Ala Thr Lys Glu 565 Gin Leu Lys Ala 570 Val Met Asp Asp Phe Ala 575 Ala Phe Val Glu Lys Cys 580 Cys Lys Ala 585 Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys 595 Leu Val 600 Ala Ala Ser Gin Ala 605 Ala Leu Gly Leu His Gly Glu Gly Thr 610 Phe 615 Thr Ser Asp Val Ser 620 Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu 625 630 Phe Xle Ala Trp Leu 635 Val Lys Gly Arg 352 <210> 630
<211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 630
Met Lya Ser Xle Tyr Phe Vai Ala 1 5 Gly Ser Trp Gin Arg Ser Leu Gin 20 Phe Ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro 35 40 Glu Asp Lya Arg His Ser Gin Gly 50 55 Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin €5 70 Thr Lye Arg Asn Arg Asn Asn Xle 85 Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 100 Gly Gin Ala Ala Lye Glu Phe xle 115 120 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val 130 135 Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser 145 ISO Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Xle 165 Thr Asp Arg Lya
Gly Leu 10 Phe val Met Leu Val 15 Gin Αβρ 25 Thr Glu Glu Lys Ser 30 Arg Ser Leu Ser Asp Pro Asp 45 Gin Met Asn Thr Phe Thr Ser 60 Asp Tyr Ser Lys Asp Phe Val 75 Gin Trp Leu Met Asn 80 Ala Lya 90 Arg His Asp Glu Phe 95 Glu Ser 105 Asp Val Ser Ser Tyr 110 Leu Glu Ala Trp Leu val Lys 125 Gly Arg Gly Ala Xle Val Glu 140 Glu Leu Gly Arg Αβρ Glu Met 155 Asn Thr Xle Leu Asp 160 Asn Trp 170 Leu xle Gin Thr Lye 175 Xle
<210> 632 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens 353 <4Ο0> 632
Met Lya Ser Xle Tyr Phe Vai Ala Gly Leu Phe Vai Met Leu Vai Gin 15 10 15
Gly Ser Tzp Gin Arg Ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lye Ser Arg Ser 20 25 30
Phe Ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gin Met Asn 35 40 45
Glu Asp Lys Arg Hls Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lye 50 55 60
Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp Phe Vai Gin Trp Leu Met Asn 65 70 75 80
Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg Hi9 Asp Glu Phe Glu 85 90 95
Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 100 105 110
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly 115 120 125
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu vai Ala Xle Vai Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140
Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp 145 150 1S5 160
Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe ile Asn Trp Leu Ile Gin Thr Lys ile 165 170 175
Thr Asp Arg Lys 180 <210> 633 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 633 Met Lys Ser Ile Tyr Phe Vai Ala Gly Leu Phe Vai Met Leu Vai Gin 1 5 10 15 Gly Ser Trp Gin Arg Ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 20 25 30 354
Phe Ser Ala Ser 35 Gin Ala Asp Pro Leu Ser Asp 40 Pro Asp 45 Gin Met Asn Glu Asp 50 Lys Arg His Ser Gin Gly Thr Phe 55 Thr Ser 60 Asp Tyr Ser Lys Tyr 65 Leu Αβρ Ser Arg Arg Ala 70 Gin Asp Phe Vai 75 Gin Trp Leu Met Asn 80 Thr Lys Arg Asn Arg 85 Asn Asn Xle Ala Lys Arg 90 His Asp Glu Phe 95 Glu Arg His Ala Glu 100 Gly Thr Phe Thr Ser Asp 105 Vai Ser Ser Tyr 110 Leu Glu Gly Gin Ala Ala 115 Lys Glu Phe Ile Ala Trp 120 Leu Vai Lys 125 Gly Arg Gly Arg Arg 130 Asp Phe Pro Glu Glu 135 Vai Ala Ile Vai Glu 140 Glu Leu Gly Arg Arg 145 His Ala Asp Gly Ser 150 Phe Ser Asp Glu Met 155 Asn Thr Ile Leu Asp 160 Asn Leu Ala Ala Arg 165 Asp Phe Ile Asn Trp 170 Leu Ile Gin Thr Lys 175 Ile
Thr Αβρ Arg Lys 180 <210> 634 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 634 Met Lys Ser Ile Tyr Phe Vai Ala Gly Leu Phe Vai Met Leu Vai Gin 15 10 15
Gly Ser Trp Gin Arg Ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 20 25 30
Phe Ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gin Met Asn 35 40 45
Glu Asp Lys Arg His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys 50 55 60 355
Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp Phe Vai Gin Trp Leu Met Asn 65 70 75 80 Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe GlU 85 90 95 Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 100 103 110 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly 115 120 125 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Vai Ala Ile Vai Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140 Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Zle Leu Asp 145 ISO 155 160 Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gin Thr Lys Ile 165 170 175
Thr Asp Arg Lys 180
<210> 988 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 988 aggagcgtcg acaaaagaca cgctgaaggt actttcactt ctgatgtttc ttcttacttg eo gaaggtcaag ctgctaagga attcattgct 90
<210> 989 <211> 75 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 989 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct acccttaacc aaccaagcaa 60 tgaattcctt agcag 75 356 <210> 992 <211> 89
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 992 aagctgectt aggcttacac gctgaaggta ctttcacttc tgatgtttct tcttacttgg 60 aaggtcaagc tgctaaggaa ttcattgct 89
<210> 993 <211> 49 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 993 ggcgcgcctc atctaccctt aaccaaccaa gcaatgaatt ccttagcag 42
<210> 994 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 994 aggagcgtcg acaaaagaca cggtgaaggt actttcactt ctgatgtttc ttcttacttg 60 gaaggtcaag ctgctaagga attcattgct 90
<210> 995 <211> 75 <212> ADN <213> Homo sapiens 357 < 4 Ο Ο > 995 60 75 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct acccttaacc aaccaagcaa tgaattcctt agcag
<210> 996 <211> 89 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 996 aagctgcctt aggcttacac ggtgaaggta ctttcacttc tgatgcttct tcttacttgg 60 aaggtcaage tgotaaggaa ttcattget 89
<210> 997 <211> 49 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 997 ggcgcgcctc atctaccctt aaccaaccaa gcaatgaatt ccttagcag 49 <210> 1037 <211> 1782 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1037 gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaacttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tge“tttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aactgtgaca aatcacttca taccctttte ggagacaaat tacgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcCtgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccecc gathggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagaeatce ttacttttaC gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 358 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaaatgt 600 gccagtctcc aaaaatctgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtggc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcea tggagatctg cttgaatgtg ctgatgaeag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaggattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ecactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgot 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacctgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 cgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aactgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacecca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca caaaatgctg cacagagtcc 1440 ttggtgaaca ggcgaccatg ctttteaget ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaaeatt eaectteeat geagatatat gcacacttte tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaae tgcaettgtt gagcttgtga aacacaagce caaggcaaca 1620 aaagagcaae tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctctgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttataaca tctacattta aaagcatctc ag 1782 <210> 1038 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1038
Asp Ala Híb Lye Ser Qlu Vai Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 15 10 15
Glu Asn Phe Lye Ala Leu Vai Leu ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin 20 25 30
Gin Cys Pro Phe Glu Asp Hl 8 Vai Lys Leu Vai Asn Glu Vai Thr Glu 35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys vai Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Vai Ala Thr Leu 65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro 85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110
Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu Vai Asp vai Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 359
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg HÍ8 Pro Tyr phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cya Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lye Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Vai Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser Lys Leu Vai Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Vai Hls Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin Asp Ser ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 27S 280 285 Cye Ile Ala Glu Vai Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Vai Glu Ser Lys Asp Vai Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Olu Ala Lye Asp Vai Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg Hie Pro Asp Tyr Ser Vai Vai Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Qlu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala ASp Pro Hls Glu 355 360 365 Cye Tyr Ala Lys Vai Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Vai Glu Glu Pro 370 375 380 Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lya Phe Gin Asn Ala Leu Leu Vai Arg Tyr Thr Lys Lys Vai Pro 405 410 415 Qln vai Ser Thr Pro Thr Leu Vai Glu Vai Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 360 val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lye Thr Pro Val Ser ASp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lye Glu Arg Gin ile Lys Lys Gin Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys GlU Gin Leu 530 535 540 Lye Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lye Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lye Lys Leu Val 565 570 S7S Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 580 585
<210> 1039 <211> 58 <212> ADN <213> Sequência Artificial. <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador utilizado para gerar sitios Xhol e Ciai em PPPC0006 <400> 1039 gcctcgagaa aagagatgca cacaagagtg aggttgctca tcgatt-taaa gatttggg 361 <210> 1040 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador utilizado na geração de sítios Xhol e Ciai em pPPC0006 <400> 1040 aatcgatgag caacctcact cttgtgtgca tctcttttct cgaggctcct ggaataagc 59 <210> 1041 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador utilizado na geração de sítios Xhol e Ciai em pPPC0006 <400> 1041 tacaaactta agagtccaat tagc <210> 1042 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial 362 <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador utilizado na geração de sítios Xhol e Ciai em pPPC0006 <400> 1042 cacttctcta gagtggtttc atatgtctt 29
<210> 1043 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> Estrutura_Misc <223> oligonucleótido sintético utilizado para alterar sítios de restrição em pPPC0007 <400> 1043 aagctgcctt aggcttataa taaggcgcgc cggccggccg tttaaactaa gcttaattct 60
<210> 1044 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> Estrutura_Misc <223> oligonucleótido sintético utilizado para alterar sítios de restrição em pPPC0007 363 <4 Ο 0> 1044 agaattaagc ttagtttaaa cggccggccg gcgcgcctta ttataagcct aaggcagctt 60 <210> 1045 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador directo útil para a geração de proteína de fusão de albumina, na qual a fracção de albumina é N- terminal em relaçao à Proteína Terapêutica <22 0> <221> característica_misc <222> (18) <223> n igual a a, t, g ou c <22 0> <221> característica_misc <222> (19) <223> n igual a a, t, g ou c <22 0> <221> característica_misc <222> (20) <223> n igual a a, t, g ou c 364 <220> <221> característica. <222> (21) <223> n igual a a, t, <220> <221> caracterí st ica_ <222> (22) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterí st ica_ <222> (23) <223> n igual a a, t <2 2 0> <221> caracterí st ica. <222> (24) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterí st ica. <222> (25) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterí st ica. <222> (26) <223> n igual a a, t mi sc g ou c mi sc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c 365 <220> <221> característica_misc <222> (27) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (28) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (29) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (30) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (31) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (32) <223> n igual a a, t, g ou c <400> 1045 aaactgcctt aggcttannn nnnnnnnnnn nn 366 <210> 1046 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador inverso útil para a geração de proteína de fusão de albumina, na qual a fracção de albumina é N-terminal em relaçao à Proteína Terapêutica <220> <221> característica_misc <222> (37) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (38) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (39) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (40) <223> n igual a a, t, g ou c 367 <220> <221> característica_misc <222> (41) <223> η igual a a, t, g ou c <220> <2 21> característica_misc <222> (42) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (43) <223> n igual a a, t, g ou c <2 2 0> <221> característica_misc <222> (44) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (45) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (46) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc 368 <222> (47) <223> η igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (48) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> caracteristica_misc <222> (49) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> caracteristica_misc <222> (50) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> caracteristica_misc <222> (51) <223> n igual a a, t, g ou c <400> 1046
gcgcgcgttt aaacggccgg ccggcgcgcc ttattairann nnnnniumnn n SI
<210> 1047 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial 369 <220> <223> iniciador directo útil para a geração de proteína de fusão de albumina, na qual a fracção de albumina é c-terminal em relação à Proteína Terapêutica <220> <221> característica_misc <222> (19) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (20) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (21) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (22) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (23) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc 370 <222> (24) <223> η igual a a, t, <220> <221> característica_ <222> (25) <223> n igual a a, t, <220> <221> caracteristica_ <222> (26) <223> n igual a a, t <220> <221> caracteristica_ <222> (27) <223> n igual a a, t <220> <221> caracteristica. <222> (28) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (29) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <2 2 2> (30) <223> n igual a a, t g ou c mi sc g ou c mi sc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c 371 <220> <221> característica_misc <222> (31) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (32) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (33) <223> n igual a a, t, g ou c <400> 1047 aggagcgtcg acaaaagann nrmnnnimnn rmn 33 <210> 1048 <211> 52 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador inverso útil para a geração de proteína de fusão de albumina, na qual a fracção de albumina é c-terminal em relaçao à Proteína Terapêutica <220> <221> característica_misc <222> (38) 372 <223> η igual a a, t, g ou c <220> <221> característica. <222> (39) <223> n igual a a, t, <220> <221> caracteristica_ <222> (40) <223> n igual a a, t <220> <221> caracteristica_ <222> (41) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (42) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <2 2 2> (43) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (44) <223> n igual a a, t mi sc g ou c mi sc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c 373 <220> <221> característica_misc <222> (45) <223> η igual a a, t, g ou c <220> <2 21> característica_misc <222> (46) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (47) <223> n igual a a, t, g ou c <2 2 0> <221> característica_misc <222> (48) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (49) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (50) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc 374 <222> (51) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (52) <223> n igual a a, t, g ou c <400> 1048 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnrmnimnim nn 52 <210> 1049 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> sinal <223> péptido sinal da proteína de albumina sérica humana natural <400> 1049
Met Lys Trp Vai Ser Phe zle Ser Leu Leu Phe Leu phe Ser Ser Ala 15 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg 20 <210> 1052 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência Artificial 375 <220> <221> ligação de iniciador
<223> iniciador directo útil para a inserção de proteína Terapêutica no vector pC4:HSA <220> <221> característica_misc <222> (29) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (30) <223> n igual a a, t, g ou c <2 2 0> <221> característica_misc <222> (31) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (32) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <2 2 2> (33) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc 376 <222> (34) <223> η igual a a, t, <220> <221> característica_ <222> (35) <223> n igual a a, t, <220> <221> caracteristica_ <222> (36) <223> n igual a a, t <220> <221> caracteristica_ <222> (37) <223> n igual a a, t <220> <221> caracteristica. <222> (38) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (39) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (40) <223> n igual a a, t g ou c mi sc g ou c mi sc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c 377 <220> <221> característica_misc <222> (41) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (42) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (43) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (44) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (45) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (46) <223> n igual a a, t, g ou c <400> 1052 46 ccgccgctcg aggggtgtgt ttcgtcgann nnnnnnnnnn nnnnnn 378
<211> 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> ligação de_iniciador <223> iniciador inverso útil para a inserção de proteína
Terapêutica no vector pC4:HAS <220> <221> característica_misc <222> (38) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (39) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (40) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (41) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (42) 379 <223> η igual a a, t, g ou c <220> <221> característica. <222> (43) <223> n igual a a, t, <220> <221> caracteristica_ <222> (44) <223> n igual a a, t <220> <221> caracteristica_ <222> (45) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (46) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <2 2 2> (47) <223> n igual a a, t <220> <221> caracterist ica. <222> (48) <223> n igual a a, t <220> mi sc g ou c mi sc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c misc g ou c 380 <221> característica_misc <222> (49) <223> η igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <2 2 2> (50) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (51) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <2 21> característica_misc <222> (52) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (53) <223> n igual a a, t, g ou c <2 2 0> <221> característica_misc <222> (54) <223> n igual a a, t, g ou c <220> <221> característica_misc <222> (55) 381 <223> n igual a a, t, g ou c <400> 1053 agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnmummmn nnnnn 55 <210> 1054 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> sinal <223> Péptido sinal de estaniocalcina <400> 1054
Met Leu Gin Asn Ser Ala Vai Leu Leu Leu Leu Vai Ile Ser Ala Ser 15 10 IS
Ala <210> 1055 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> sinal <223> Péptido sinal sintético 382 <4 Ο 0> 1055
Met Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Vai Leu Leu Leu Ala Leu 1 S 10 15
Trp Ma Pro Ala Arg Gly 20 <210> 1093 <211> 1830 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1093 atgaagtggg taacctttat gtgtttcgtc gagatgcaca gaaaatttca aagccttggt gaagatcatg taaaattagt gagtcagctg aaaattgtga gttgcaactc ttcgtgaaac gagagaaatg aatgcttctt agaccagagg ttgatgtgat aaatacttat atgaaattgc tttgctaaaa ggtataaagc tgcctgttgc caaagctcga agaeteaagt gtgccagtct getcgcctga gccagagatt gatcttacca aagtccacac agggeggacc ttgeeaagta gaatgctgtg aaaaacctct gagatgcetg ctgacttgcc aaaaaccacg ctgaggcaaa aggcatcctg attactctgt ctagagaagt gctgtgccgc tttaaacctc ttgtggaaga cagcttggag agtacaaatt caagtgtcaa ctccaactct tgttgtaaac atcctgaagc ctgaaccagt tatgtgtgtt tgcacagaat ccttggtgaa tacgttccca aagagtttaa tctgagaagg agagacaaat cccaaggcaa caaaagagca aagtgctgca aggctgacga gctgcaagtc aagctgcctt ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga ttCgggagaa 120 gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180 gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240 caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300 ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360 gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420 gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480 cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc S40 tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600 tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660 ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720 tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780 ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840 tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900 gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960 tteattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020 ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080 cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140 tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200 gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260 ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320 tgtagaggte tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380 aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440 gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500 caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560 tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620 caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680 actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740 taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800 aggcttataa 1830
<210> 1094 <211> 609 <212> PRT 383 <213> Homo sapiens <400> 1094 Met 1 Lys Trp Vai Thr 5 Phe Ile ser Tyr Ser Arg Gly 20 Vai Phe Arg Arg His Arg Phe 35 Lys Asp Leu Gly Glu 40 Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin 50 55 Lya Leu Vai Asn 65 Glu Vai 70 Thr Glu Phe Ala Glu Ser Ala Glu Asn 85 Cys Asp Lys Ser Leu 90 Lys Leu Cys Thr 100 Vai Ala Thr Leu Arg 105 Glu Asp Cys Cys Ala 115 Lys Gin GlU Pro 120 Glu Arg His Lys Asp Asp 130 Asn Pro Asn 135 Leu Pro Arg Asp Vai Met Cys 145 Thr Ala 150 Phe His Asp Asn Lys Tyr Leu Tyr Glu 165 Ile Ala Arg Arg His 170 Glu Leu Leu Phe 180 Phe Ala Lys Arg Tyr 185 Lys Cys Gin Ala Ala 195 Asp Lys Ala Ala 200 Cys Leu Leu Arg Asp Glu 210 Gly Lys Ala 215 Ser Ser Ala Ala Ser Leu Gin 225 Lys Phe 230 Gly Glu Arg Ala Ala Arg Leu Ser Gin 245 Arg Phe Pro Lys Ala 250 Lys Leu Vai Thr 260 Asp Leu Thr Lys Vai 265 Hie Glu Phe Ala Glu Thr Glu Cys cys 270
Leu Leu 10 Phe Leu Phe Ser Ser 15 Ala Asp 25 Ala His Lys Ser Glu 30 Vai Ala Glu Asn Phe Lys Ala 45 Leu Vai Leu Gin Cys Pro Phe Glu Asp HlS vai 60
Lys Thr Cya Vai 75
Hla Thr Leu Phe
Thr Tyr Gly Glu 110
Asn Glu Cya Phe 125
Leu Vai Arg Pro 140
Glu Glu Thr Phe 155
Pro Tyr Phe Tyr
Ala Ala Phe Thr 190
Leu Pro Lys Leu 205
Lys Gin Arg Leu 220
Phe Lys Ala Trp 235
Ala Asp 80 Gly Asp 95 Met Ala Leu Gin Glu Vai
Leu Lys 160 Ala Pro 175 Glu Cys Asp Glu Lys Cys Ala Vai 240 Vai Ser 255 His Gly 384
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Αβρ Arg Ala Αβρ Leu Ala Lys Tyr Ile 27S 280 285 Cys Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Qlu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lye Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys 405 410 415 Qlu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu 420 42S 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cye Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe Hl a Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gin ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys S45 550 555 560 385
Pro Lys Ala Thr Lya Glu Gin Leu Lya Ala Vai Met Asp Aep Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Vai Glu Lys Cys Cys Lys Ala Aep Asp Lys Glu Thr Cys Phe 560 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu
<210> 1095 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1095
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Vai His Ser <210> 1096 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1096
Met Olu Arg Ala Ala Pro Ser Arg Arg Vai Pro Leu Pro Leu Leu Leu 15 10 15
Leu Gly Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Gly Vai Aep Ala 20 25
<210> 1097 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens 386 <4 Ο 0> 1097
Met Met LVB Thr Leu Leu Leu Phe Vai Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu 1 s 10 15
Ser Gly Gin vai I<eu Gly 20 <210> 1098 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1098
Mac Leu Pro Leu Cya Leu Vai Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro 15 10 15
Gly Pro Ser Leu Gly 20 <210> 1099 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> MUTAGÉNIO <222> (14) a (18) <223> variante do líder nativo de HSA <40 0> 1099
Met Lya Trp Vai Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Vai 1 S 10 15
Leu Gly
<210> 1100 <211> 18 <212> PRT 387 <213> Sequência Artificial <220> <221> MUTAGENIO <222> (14) a (18) <223> Variante do líder nativo de HSA <400> 1100
Met Lya Trp Vai Tbr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Qly Vai 1 S 10 15
Leu Gly <210> 1101 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> MUTAGENIO <222> (14) a (18) <223> Variante do líder nativo de HSA <400> 1101
Met Lys Trp Vai Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Vai 15 10 15
Leu Gly <210> 1102 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial 388 <220> <221> MUTAGENIO <222> (14) a (18) <223> Variante do líder nativo de HSA <400> 1102
Met Lya Trp Vai Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Vai 15 10 15
Ser Gly <210> 1103 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> MUTAGENIO <222> (14) a (18) <223> Variante do líder nativo de HSA <400> 1103
Met Lys Trp Vai Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gly Vai 15 10 15
Ser Gly <210> 1104 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> MUTAGENIO <222> (14) a (18) 389 <223> Variante do líder nativo de HSA <400> 1104
Mec Lys Trp Vai Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Vai 15 10 15
Ser Gly <210> 1105 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> MUTAGÉNIO <222> (14) a (23) <223> Variante do líder nativo de HSA <400> 1105
Met Lys Trp vai Thr Phe ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Qly Gly Vai 15 10 15
Leu Gly Asp Leu His Lys Ser 20 <210> 1106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1106
Asp Ala His Lys Ser Glu Vai Ala His 1 5 <210> 1107 <211> 11 390
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1) a (11) <223> sequência de Kozak <400> 1107 ccgccaccat g 11
<210> 1108 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1108
Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 S 10 15 lie Ser Ala
<210> 1109 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SÍTIO <2 2 2> (84) <223> Xaa igual a qualquer um de Glu ou Asp 391 <4 Ο 0> 1109
Met 1 Arg Phe Pro Ser 5 Ile Phe Thr Ala vai 10 Leu Ala Phe Ala Ala 15 Ser Ser Ala Leu Ala 20 Ala Pro Vai Asn Thr 25 Thr Thr Glu Aap Glu 30 Thr Ala Gin Ile Pro 15 Ala Glu Ala Vai Ile 40 Gly Tyr Ser Asp Leu 45 Glu Gly Asp Phe Aap Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60 Leu 65 Phe lie Asn Thr Thr 70 Ile Ala Ser Ile Ala 75 Ala Lys Glu Glu Gly 80 Vai Ser Leu Xaa Lye Θ5 Arg
<210> 1110 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1110
Met Lys Trp vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 S 10 15
Tyr Ser Axg Ser Leu Glu Lys Arg 20
<210> 1111 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1111
Met Lys Trp vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15
Tyr ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg 20 392 <210> 1113 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Sitio <222> (3) <223> Xaa igual a qualquer dos vinte L-aminoácidos de ocorrência natural <400> 1113
Trp Ser Xaa Trp Ser 1 S <210> 1114 <211> 86 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> Ligação de_Iniciador <223> Sequência sintética com 4 cópias em tandem do sitio de ligação de GAS verificado no promotor de IRF1 (Rothman et al. , Immunity 1:457-468 (1994)), 18 nucleótidos complementares ao promotor precoce de SV40 e um sitio de restrição Xho I. <400> 1114 gcgcctcgag atttceccga aatctagafct tcccegaaat gatttccccg aaatgatttc 60 cccgaaatat ctgccatctc aattag 86 393 <210> 1115 <211> 27
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> Ligação de_Iniciador <223> Sequência sintética complementar ao promotor de SV40; inclui um sitio de restrição Hind III. <400> 1115 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27
<210> 1116 <211> 271 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> Ligação de_Proteína <223> Promotor sintético para utilização em ensaios biológicos; inclui sítios de ligação de GAS verificados no promotor de IRF1 (Rothman et ai., Immunity 1:457-468 (1994)). <400> 1116 ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg 60 aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 120 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 180 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctaetc cagaagtagt gaggaggctt 240 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t 271 394 <210> 1117 <211> 32 <212> ADN. <213> Sequência Artificial <220> <221> Ligação de_Iniciador <223> Iniciador sintético complementar à sequência promotora de EGR-1 genómica humana (Sakamoto et al. , Oncogene 6:867-871 (1991)); inclui um sitio de restrição
Xho I. <400> 1117 gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg 32 <210> 1118 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> Ligação de_Iniciador <223> Iniciador sintético complementar à sequência promotora de EGR-1 genómica humana (Sakamoto et al., Oncogene 6:867-871 (1991)); inclui um sitio de restrição
Hind III. <400> 1118 gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c 31 <210> 1119 <211> 12 395
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1119 ggggactttc cc 12
<210> 1120 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> Ligação de_Iniciador <223> Iniciador sintético com 4 cópias em tandem do sitio de ligação de NF-KB (GGGGACTTTCCC), 18 nucleótidos complementares à extremidade 5' da sequência promotora precoce de SV40 e um sítio de restrição Xhol. <40 0> 1120 gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg £0 ccatctcaat tag 73
<210> 1121 <211> 256 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> Ligação de Proteína <223> Promotor sintético para utilização em ensaios biológicos; inclui sítios de ligação de NP-KB. 396 <400> 1121 60 120 180 240 256 ctcgagggga cttCcccggg gactttccgg ggactttccg ggactttcca tctgccatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aaccccgccc atcccgcccc taactcogcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctt
<210> 1167 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1167
Met Lys Trp Vai Ser Pbe Xle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 IS
Tyx ser Arg Gly Vai Phe Arg Arg 20
<210> 1168 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1168
Met Lya Trp Vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15
Tyr Ser
<210> 1169 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens 397 <4 Ο 0> 1169
Mac Asn Ile Phe Tyr He phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Vai Gin Gly 15 10 15
Ser Leu Asp Lya Arg 20
<210> 1176 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1176
Het Lya Trp Vai Thr phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15
Tyr Ser Arg Gly Vai Phe Arg Arg 20
<210> 1177 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1177
Met Lys Trp Vai Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 IS
Tyr Ser
<210> 1216 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens 398 <400> 1216 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccea 120 etcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccacc cacagggcac attcaceagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gctgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggetgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacccggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggacct tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1217 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1217 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa €0 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 etcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgceatt cacagggcac attcaceagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggetgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggacct tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1218 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1218 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 etcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgceatt cacagggcac attcaceagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggetgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 343 399
<210> 1219 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1219 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgctcccttc aagaeacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatC cacagggcac attcaccagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatCtcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttet ttctctgatg agatgaacae cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1220 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1220 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatt cacagggcac attcaccagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagetcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcceag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacae cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1221 <211> 180 <212> ADN <213> Homo sapiens 400
<4 Ο 0> 1221 cacgctgaag gtactttcac ttctgatgtt tcttettact eggaaggtca agctgctaag 60 gaactcattg cttggttggt taagggtaga catgcagagg gaacatttac atcagacgtc 120 tcatcatatt tagagggaca ggcagcaaaa gagtttatag catggttagt aaaaggaagg ISO
<210> 1222 <211> 180 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1222 cacggtgaag gtactttcac ttctgatgtt tcttettact tggaaggtca agctgctaag 60 gaattcattg cttggttggt taagggtaga catgcagagg gaacatttac atcagacgtc 120 tcatcatatt tagagggaca ggcagcaaaa gagtttatag catggttagt aaaaggaagg 180
<210> 1231 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1231
Met Lys Trp Vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 IS Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 4S Trp Leu Vai Lya Gly Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai 50 55 60 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 65 70 75 80 Vai Lys Gly Arg Asp Ala Kls Lys Ser Glu Vai Ala His Arg Phe Lys as 90 95 401
Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 100 105 110 Gin Tyr Leu Gin Gin Cya Pro Phe Glu Asp His val Lys Leu val Asn 115 120 125 Glu Vai Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cya Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 130 135 140 Asn Cya Asp Lys Ser Leu KlS Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 145 150 155 160 Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 165 170 175 Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn GlU Cys Phe Leu Gin His Lys ASp Asp ISO 185 190 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu val Asp Val Met Cys 195 200 205 Thr Ala Phe Hls Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 210 215 220 Glu Xle Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala 245 250 255 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 260 265 270 Gly Lya Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser ’ Leu Gin 275 280 285 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser 290 295 300 Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys Leu Val Thr 305 310 315 320 Asp Leu Thr Lys vai His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu , Leu Glu 325 330 335 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin 340 345 350 Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 355 360 365 Glu Lys Ser Hls Cys ile Ala Glu val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 370 375 380 402
Asp Leu 38S Pro Ser Leu Ala 3 90 Ala Asp Lys Asn Tyr Ala Glu 405 Ala Lys Asp Glu Tyr Ala Arg 420 Arg His Pro Asp Leu Ala Lye 435 Thr Tyr Glu Thr Thr 440 Asp Pro 4S0 His Glu Cys Tyr Ala 455 Lys Vai 465 Glu Glu Pro Gin Asn 470 Leu Ile Gin Leu Gly Glu Tyr 485 Lys Phe Gin LyB Lys val Pro 500 Gin. Val Ser Thr Asn Leu Gly S15 Lys Val Gly Ser Lys 520 Arg Met 530 Pro Cys Ala Glu Asp 535 Tyr Cys Vai 545 Leu His Glu Lys 550 Thr Pro Cya Thr Glu ser Leu 565 val Asn Arg Val Asp GIU Thr 580 Tyr Val Pro Lys Phe His Ala 535 Asp Ile Cys Thr Leu 600 Lya Gin 610 Thr Ala Leu Val Glu 615 Leu Lye 625 Glu Gin Leu Lys Ala 630 Val Met Lys Cys Cys Lys Ala 645 Asp Asp Lys Lys Lys Leu Val 660 Ala Ala Ser Gin
Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 395 400 Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 410 415 Tyr Ser Val val Leu Leu Leu Arg 425 430 Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 445 Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 460 Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu 475 480 Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 490 495 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 505 510 Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lye 525 Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu S40 Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 555 560 Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 570 575 Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 585 590 Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lye 605 val Lye His Lys pro Lye Ala Thr 620 Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 63S 640 Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 650 655 Ala Ala Leu Gly Leu 665 403
<210> 1232 <211> 6 6 9 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 1232
Met Lye Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Hia Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 45 Trp Leu val Lys Gly Arg Hls Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val 50 55 60 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 65 70 75 80 Vai Lya Gly Arg Asp Ala Hls Lys Ser Glu val Ala His Arg Phe Lys 85 90 95 Asp Leu Gly Glu GlU Asn Phe Lye Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 100 105 110 Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp Hls Val Lys Leu Val Asn 115 120 125 Glu val Thr Glu Phe Ala Lya Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 150 135 140 Asn Cys Asp Lys Ser Leu HÍS Thr Leu Phe Gly Αβρ Lys Leu Cys Thr 14S 150 155 160 Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 165 170 175 Lya Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp iao 185 190 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys 195 200 205 Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 210 215 220 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 225 230 235 240 404
Phe Ala Lys Arg tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala 245 250 255 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 260 26S 270 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala Ser Leu Gin 275 280 285 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Vai Ala Arg Leu Ser 290 295 300 Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser Lys Leu Vai Thr 305 310 315 320 ASp Leu Thr Lys Vai Hls Thr Glu Cys Cys Hls Gly Asp Leu Leu Glu 325 330 335 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys Glu Asn Gin 340 345 350 Asp Ser ria Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 355 350 365 Glu Lys Ser KiS Cys Ile Ala Glu Vai Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 370 375 380 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Vai Glu Ser Lys Asp Vai Cys 365 390 395 400 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Vai Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 405 410 415 Glu Tyr Ala Arg Arg Hls Pro Asp Tyr Ser vai Vai Leu Leu Leu Arg 420 425 430
Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 43S 440 445 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 450 455 460 Vai Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu 465 470 475 480 Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 485 490 495 Lys Lys Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg SOO SOS S10 405
Aen Leu Gly Lys Vai Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lye 515 520 S2S
Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Vai Vai Leu Asn Gin Leu 530 535 540
Cys Vai Leu His Glu Lys Thr Pro Vai Ser Asp Arg Vai Thr Lys Cys 545 550 555 560
Cys Thr Glu Ser Leu Vai Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 565 570 575
Vai Asp Glu Thr Tyr vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 580 585 590
Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin lie Lys 595 600 605
Lys Gin Thr Ala Leu Vai Glu Leu Vai Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 610 615 620
Lys Glu Gin Leu Lys Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Vai Glu 625 630 635 640
Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 645 650 655
Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 <210> 1233 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1233 665
Met Lys Trp Vai Ser Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 s 10 15 Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 45 Trp Leu Vai Lys Gly Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai 50 55 60 406
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 65 70 7S 80 Vai Lys Gly Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Vai Ala His Arg Phe Lys 85 90 95 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu val Leu Ile Ala Phe Ala 100 105 110 Gin Tyr Leu Gin. Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu val Asn 115 120 12S Glu Vai Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Vai Ala Asp Glu Ser Ala Glu 130 135 140 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 145 150 1SS 160 Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 16S 170 175 Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin KiS Lys Asp Asp 180 185 190 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys 195 200 2 0S Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 210 215 220 Glu Ile Ala Arg Arg HiS Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala 245 250 255 Asp Lys ALa Ala cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg A9p Glu 260 265 270 Gly Lys Ala ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin 275 280 285 Lys Phe Gly Clu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser 290 295 300
Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser Lys Leu Vai Thr 30S 310 315 320
Asp Leu Thr Lys Vai His Thr Glu Cys Cya His Gly Asp Leu Leu Glu 325 330 335
Cys Ala Asp Aap Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin 340 345 350 407
Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 355 360 365 Glu Lys Ser HiS Cys Xle Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 370 375 380 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 385 390 395 400 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 405 410 415 Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 420 425 430 Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 435 440 445 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 450 455 460 Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu Xle Lys Gin Asn Cya Glu Leu Phe Glu 465 470 475 480 Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 485 490 495 Lys Lys Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 500 505 510 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 515 520 525 Arg Het Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu 530 535 540 Cya Vai Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 545 550 5SS 560 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu S65 570 57S Vai Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 5Θ0 585 590 Phe Hls Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Xle Ly9 595 600 605 Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 610 615 620 408
Lys Glu Gin Leu Lya Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe vai Glu 625 630 635 640
Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 645 650 655
Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 665
<210> 1234 <211> 667 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1234
Met 1 Lys Trp Val Ser 5 Phe lie Ser Leu Leu 10 Phe Leu Phe Ser Ser 15 Ala Tyr Ser Arg Ser 20 Leu Asp Lys Arg Glu Gly 25 Thr Phe Thr Ser Asp 30 Val Ser Ser Tyr Leu 35 GlU Gly Gin Ala 40 Ala Lys Glu Phe ile 45 Ala Trp Leu Val Lys 50 Gly Arg His Ala Glu 55 Gly Thr Phe Thr Ser 60 Asp Val Ser Ser Tyr 65 Leu Glu Gly Gin Ala Ala 70 Lys Glu Phe lie 75 Ala Trp Leu Val Lys 80 Gly Arg Asp Ala «is 85 Lys Ser Glu Val Ala 90 His Arg Phe Lys Asp 95 Leu Gly Glu Glu Asn 100 Phe Lys Ala Leu Val Leu 105 Ile Ala Phe Ala 110 Gin Tyr Leu Gin Gin Cys 115 Pro Phe Glu Asp 120 His val Lys Leu Val 125 Asn Glu Val Thr Glu 130 Phe Ala Lys Thr Cys 135 Val Ala Asp Glu Ser 140 Ala Glu Asn Cys Asp 145 Lys Ser Leu His Thr Leu 150 Phe Gly Asp Lys 155 Leu Cys Thr Val Ala 160 Thr Leu Arg Glu Thr 165 Tyr Gly Glu Met Ala 170 Asp Cys Cys Ala Lys 175 Gin 409
Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin HiS Dl a Asp Asp Asn Pro 180 1SS 190 Asn Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala 195 200 205 Phe Hie Aap Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lya Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile 210 21S 220 Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala 225 230 235 240 Lya Arg Tyr Lya Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lya 245 250 255 Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lya 260 265 270 Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cya Ala Ser Leu Gin Lya Phe 275 280 285 Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val Ala Arg Leu Ser Gin Arg 290 295 300 Phe Pro Lya Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu 305 310 315 320 Thr Lya Vai Hla Thr Glu Cys Cys His Gly Αβρ Leu Leu Glu Cya Ala 325 330 335 Aap Aap Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cye Glu Asn Gin Asp Ser 340 345 350 Ile Ser Ser Lye Leu Lya Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys 355 360 365 Ser Hla Cya Ile Ala Glu Vai Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu 370 37S 380 Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Vai Glu Ser Lys Aap val Cya Lys Asn 385 390 395 400 Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Vai Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr 405 410 415 Ala Arg Arg Hla Pro Asp Tyr ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala 420 425 430 Lya Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cya Ala Ala Ala Asp Pro 435 440 445 His Glu Cys Tyr Ala Lya Vai Phe Aap Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu 450 455 460 Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cya Glu Leu Phe Glu Gin leu 465 470 475 480 410
Gly Glu Tyr Lye phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lye 485 490 495 Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu val Ser Arg Asn Leu 500 SOS 510 Gly Lya Vai Gly Ser Lye Cys cye Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met 515 520 525 Pro Cya Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys Val 530 535 540 Leu His Glu Lys Thr Pro val Ser Asp Arg val Thr Lys Cys Cys Thr 545 S50 555 S60 Glu Ser Leu Vai Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp 565 570 575 Glu Thr Tyr Vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His SBO 585 S90 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin 595 600 605 Thr Ala Leu val Glu Leu val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu €10 615 620 Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys 625 630 635 640 Cys Lya Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys 645 650 655 Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 665 <210> 1235 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1235 Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lya Arg His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser 30 25 30 Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 45 411
Trp Leu Vai Lye Gly Arg Hls Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser ASp Val 50 55 60 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu 65 70 75 80 Vai Lye Gly Arg ASp Ala Hls Lys Ser Glu Val Ala Hls Arg Phe Lys 85 90 95 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 100 105 110 Gin Tyr Leu Gin Gin Cye Pro Phe Glu Asp His val Lys Leu Val Aen 115 120 125 Glu vai Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 130 135 140 Asn Cye Asp Lys Ser Leu Hls Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 14S ISO 155 160 Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 165 170 175 Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin HiS Lys Asp Asp 180 185 190 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu val Asp val Met cys 195 200 205 Thr Ala Phe Hls Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 210 215 220 Glu Ile Ala Arg Arg Hls Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Lye Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala 24S 2S0 255 Αβρ Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 260 265 270 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin 275 280 285 Lys Phe Gly GlU Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val Ala Arg Leu Ser 290 29S 300 Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys Leu Val Thr 305 310 315 320 Asp Leu Thr Lys Vai Hls Thr Glu Cys Cys Hls Gly Asp Leu Leu Glu 32S 330 335 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin 340 345 350 412
Asp Ser Ile 355 Ser Ser Lys Leu Lys 360 Glu Lys 370 Ser His Cys Ile Ala 375 Glu Asp 385 Leu Pro Ser Leu Ala 390 Ala Asp Lys Asn Tyr Ala Glu 405 Ala Lys Asp Glu Tyr Ala Arg 420 Arg His Pro Asp Leu Ala Lys 435 Thr Tyr Glu Thr Thr 440 Asp Pro 450 Hls Glu Cys Tyr Ala 4SS Lys Vai 465 Glu Glu Pro Gin Asn 470 Leu Ile Gin Leu Gly Glu Tyr 485 Lys Phe Gin Lys Lys Val Pro 500 Gin val Ser Thr Asn Leu Gly 515 Lys val Gly Ser Lys 520 Arg Met 530 Pro Cys Ala Glu Asp 535 Tyr Cys 545 Vai Leu His Glu Lys 550 Thr Pro Cys Thr Glu Ser Leu 565 Val Asn Arg Vai Asp Glu Thr 580 Tyr Val Pro Lys Phe His Ala S9S Asp lie Cys Thr Leu 600 Lys Gin 610 Thr Ala Leu val Glu 615 Leu Lys 62S Glu Gin Leu Lys Ala 630 val Met
Glu Cys Cys Glu Lys 365 Pro Leu Leu val Glu Asn Asp 380 Glu Met Pro Ala Phe Val Glu 395 Ser Lys Asp Val Cys 400 val Phe 410 Leu Gly Met Phe Leu Tyr 415 Tyr 425 Ser Val Val Leu Leu 430 Leu Arg Leu Glu Lys Cys Cys 445 Ala Ala Ala Val Phe Asp Glu 460 Phe Lys Pro Leu Lys Gin Asn 475 Cys Glu Leu Phe Glu 480 Asn Ala 490 Leu Leu val Arg Tyr Thr 495 Pro 505 Thr Leu Val Glu val 510 Ser Arg Cys cys Lys His Pro 525 Glu Ala Lys Leu Ser Val Val 540 Leu Asn Gin Leu Val Ser Asp 555 Arg Val Thr Lys Cys 560 Arg Pro 570 Cys Phe Ser Ala Leu Glu 575 Glu 585 Phe Asn Ala Glu Thr 590 Phe Thr Ser Glu Lys Glu Arg 605 Gin Ile Lys Val Lys His Lys 620 Pro Lys Ala Thr Asp Asp Phe 635 Ala Ala Phe val Glu 640 413
Lya Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly $45 650 $55
Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gla Ala Ala Leu Gly Leu $60 $65
<210> 1236 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1236
Met Lys Trp Val Ser Phe ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 S 10 15 Tyr ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Xle Ala 35 40 45 Trp Leu Val Lys Gly Arg Hls Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 50 55 60 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Xle Ala Trp Leu 65 70 75 80 Vai Lys Gly Arg Asp Ala HÍS Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys 85 90 95 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Xle Ala Phe Ala 100 105 110 Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn 115 120 125 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Qlu 130 135 140 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 145 150 155 160 Vai Ala Thr Leu Arg Qlu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 165 170 175 Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp ISO 185 190 414
Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu Vai Asp Vai Met Cys 195 200 205
Thr Ala Phe Hls Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 210 215 220 Glu 225 Zle Ala Arg Arg HiS 230 Pro Tyr Phe Tyr Ala 235 Pro Glu Leu Leu Phe 240 Phe Ala Lys Arg Tyr 245 Lys Ala Ala Phe Thr 250 Glu Cys Cys Gin Ala 255 Ala Asp Lys Ala Ala 260 Cys Leu Leu Pro Lys 265 Leu Asp Glu Leu Arg 270 Aap Glu Gly Lys Ala 275 Ser Ser Ala Lys Gin 280 Arg Leu Lys Cys Ala 285 Ser Leu Gin Lya Phe 290 Gly Glu Arg Ala Pha 295 Lys Ala Trp Ala Val 300 Ala Arg Leu Ser Gin 305 Arg Phe Pro Lys Ala 310 Glu Phe Ala Glu Val 315 Ser Lys Leu Val Thr 320 Asp Leu Thr Lys Val 325 His Thr Glu cys Cys 330 His Gly Asp Leu Leu 335 Glu Cys Ala Asp Asp 340 Arg Ala Asp Leu Ala 345 Lys Tyr Ile Cys Glu 350 Aan Gin Asp ser Xle 355 Ser Ser Lys Leu Lys 360 Glu Cys Cys Glu Lys 365 Pro Leu Leu Glu Lya 370 Ser Hle Cys Ile Ala 375 Glu Val Glu Asn Asp 380 Glu Met Pro Ala Asp 385 Leu Pro Ser Leu Ala 390 Ala Asp Phe Val Glu 3 95 Ser Lys Asp Val Cys 400 Lys Asn Tyr Ala Glu 405 Ala Lya Asp Val Phe 4X0 Leu Gly Met Phe Leu 415 Tyr Glu Tyr Ala Axg 420 Arg His Pro Asp Tyr 425 Ser Val Val Leu Leu 430 Leu Arg Leu Ala Lys 435 Thr Tyr Glu Thr Thr 440 Leu Glu Lys Cys Cys 445 Ala Ala Ala Asp pro 450 H1S Glu Cys Tyr Ala 455 Lys val Phe Asp Glu 460 Phe Lys Pro Leu Vai 465 Glu Glu Pro Gin Asn 470 Leu Ile Lya Gin Aan Cys 475 Glu Leu Phe Glu 480 Gin Leu Gly Glu Tyr 483 Lys Phe Gin Asn Ala 490 Leu Leu Val Arg Tyr 495 Thr Lys Lys Val Pro 500 Gin Val Ser Thr Pro 505 Thr Leu Val Glu Val 510 Ser Arg 415
Aan Leu Gly Lys 515 val >* H O Ser Lys 520 Cys Cys Lys Hls Pro 525 Glu Ala Lys Arg Mec 530 Pro Cys Ala Glu Asp Tyr 535 Leu Ser val val 540 Leu Asn Gin Leu Cys S4S Val Leu Hls Glu Lys 550 Thr Pro Val Ser Asp 555 Arg Val Thr Lys cys 560 Cye Thr Glu Ser Leu S6S Val Aszi Arg Arg Pro 570 Cys Phe Ser Ala Leu 575 Glu Vai Asp Glu Thr 5B0 Tyr val Pro Lys Glu 585 Phe Aen Ala Glu Thr 590 Phe Thr Phe His Ala 595 Asp Zle Cys Thr Leu 600 Ser Glu Lys Glu Arg 605 Gin Ile Lys Lys Gin 610 Thr Ala Leu Val Glu 615 Leu val Lys Hls Lys 620 Pro Lys Ala Thr Lya 625 Glu Gin Leu Lya Ala 630 Val Met ASP Asp Phe 635 Ala Ala Phe Val Glu 640 Lys Cye Cys Lys Ala 645 Asp Asp Lys Glu Thr 650 cys Phe Ala Glu Glu Gly 65S Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 665
<210> 1237 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 237 Met 1 Lys Trp Val Ser 5 Phe Zle Ser Leu Leu 10 Phe Leu Phe Ser Ser 15 Ala Tyr Ser Arg Ser 20 Leu Asp Lys Arg His Gly Glu 25 Gly Thr Phe 30 Thr Ser Asp Val Ser Ser 35 Tyr Leu Glu Gly Gin Ala 40 Ala Lys Glu 45 Phe Ile Ala Trp Leu 50 Val Lys Gly Arg Hls 55 Ala Glu Gly Thr Phe 60 Thr Ser Asp val Ser 65 Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys 70 GlU 75 Phe ile Ala Trp Leu 80 Val Lys Gly Arg Asp 85 Ala Hls Lys Ser Glu 90 Val Ala Hls Arg Phe 95 Lys 416
Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu val Leu Ile Ala Phe Ala 100 105 110 Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn 115 120 125 Glu Vai Thr Glu Phe Ala LyS Thr Cye Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 130 135 140 Asa Cys Asp Lys Ser Leu HiS Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 145 150 155 160 Vai Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Het Ala Asp Cys Cys Ala 16S 170 175 Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp 180 ias 190 Aan Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys 195 200 205 Thr Ala Phe Hl8 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 210 215 220 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 22S 230 235 240 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala 245 250 255 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lye Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 260 265 270 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala Ser Leu Gin 275 2Θ0 285 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lya Ala Trp Ala val Ala Arg Leu Ser 290 295 300 Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 305 310 315 320 Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu 325 330 335 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Aâp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin 340 345 350 Asp Ser Xle Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 355 360 365 Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met pro Ala 370 375 380 417
Asp 38S Leu Pro Ser Leu Ala 390 Ala Asp Lya Aan Tyr Ala Glu 405 Ala Lys Asp Glu Tyr Ala Arg 420 Arg His Pro Asp Leu Ala Lys 435 Thr Tyr Glu Thr Thr 440 Asp Pro 450 His Glu Cys Tyr Ala 455 Lys Vai 46S Glu Glu Pro Gin Asn 470 Leu 11* Gin Leu Gly Glu Tyr 485 Lys Phe Gin Lys Lys Vai Pro SOO Gin Val Ser Thr Asn Leu Gly 515 Lys Vai Gly Ser Lys 520 Arg Met 530 Pro Cys Ala Glu Asp 535 Tyr cys 545 Vai Leu Hls Glu Lys 550 Thr Pro Cya Thr Glu Ser Leu 565 Val Asn Arg Vai Asp Glu Thr 580 Tyr Val Pro Lys Phe Hl 8 Ala 595 Asp Ile Cys Thr Leu 600 Lya Gin 610 Thr Ala Leu Val Glu 615 Leu Lys 625 Glu Gin Leu Lys Ala 630 val Mec Lys Cys Cya Lys Ala 64S Asp Asp Lya Lya Lya Leu Vai 660 Ala Ala Ser Gin
Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 395 400 Val Phe Leu Gly Het Phe Leu Tyr 410 415 Tyr Ser Val val Leu Leu Leu Arg 42S 430 Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 445 Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 460 Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu 475 480 Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 490 495 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 505 510 Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys S35 Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu 540 Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 555 560 Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 570 575 Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 585 590 Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys 605 Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 620 Asp ASp Phe Ala Ala Phe Val Glu 635 640 Glu Thr Cya Phe Ala Glu Glu Gly 650 655 Ala Ala Leu Gly Leu 665 418
<210> 1246 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1246
Mec Lya Ser lie Tyr Phe Vai Ala Gly Leu Phe Val Mec Leu Val Gin 1 5 10 15 Gly Ser Trp Gin Arg Ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lya Ser Arg Ser 20 25 30 Phe ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro Leu Ser Aap Pro Asp Gin Met Asn 35 40 45 Glu Asp Lya Arg Hia Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys 50 55 60 Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn 65 70 75 80 Thr Lya Arg Asn Arg Asn Aan Ile Ala Lya Arg Hie Asp Glu Phe Glu as 90 95 Arg Kla Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val ser Ser Tyr Leu Glu 100 10S 110 Gly Gin Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly 115 120 125 Arg Arg Asp Phe Pr© Glu Glu Vai Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140 Arg Hie Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp 145 150 1SS 160 Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu lie Gin Thr Lys Ile 165 170 175
Ttir Asp Arg Lya ISO <2 Λ O \—1 1247 <2 Λ i—1 t—1 180 <2 Λ CXI I-1 PRT <2 13> Homo sapiens 419 <4 Ο 0> 1247
Met 1 Lya Ser Xle Tyr Phe 5 Val Ala Gly Leu 10 Phe Val Met Leu Val 15 Gin Gly Ser Trp Gin 20 Arg Ser Leu Gin Aap 25 Thr Glu Glu Lya Ser Arg 30 Ser Phe Ser Ala 35 Ser Gin Ala ASp Pro 40 Leu Ser Aap Pro Asp Gin Met 45 Asn Glu Aap 50 Lys Arg Hia ser Gin Gly S5 Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser 60 Lys Tyr 65 Leu Aap Ser Arg Arg 70 Ala Gin Aap Phe Val Gin Trp Leu Met 75 Asn 80 Thr Lya Arg Asn Arg Aan 85 Asn Ile Ala Lya 90 Arg Hia Asp Glu Phe 95 Glu Arg Hia Ala Glu 100 Gly Thr Phe Thr Ser 105 Aap Val Ser Ser Tyr Leu 110 Glu Gly Gin Ala 115 Ala Lya Glu Phe Ile 120 Ala Trp Leu Val Lya Gly Arg 125 Gly Arg Arg 130 Aap Phe Pro Glu GlU 135 val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly 140 Arg Arg 14S His Ala Aap Gly Ser ISO Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu 155 Asp 160 Asn Leu Ala Ala Arg Aap 165 Phe Ile Asn Trp 170 Leu Ile Gin Thr Lys 175 Ile Thr Aap Arg [ Lya 1Θ0
<210> 1248 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1248
Met 1 Lys Ser Ile Tyr 5 Phe Val Ala Gly Leu 10 Phe Val Met Leu Val 15 Gin Gly Ser Trp Gin 20 Arg Ser Leu Gin Asp 25 Thr Glu Glu Lys Ser 30 Arg Ser Phe Ser Ala 3S Ser Gin Ala Asp Pro Leu 40 Ser Asp Pro Aap Gin 45 Met Asn 420
Glu Αβρ Lya Arg 50 Tyr Leu Asp Ser 65 Thr Lys Arg Aen
Arg His Ala Glu 100 Gly Gin Ala Ala 115 Arg Arg Asp Phe 130 Arg Hie Ala Asp 145 Asn Leu Ala Ala
Hla Ser Gin Gly Thr phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys 55 60
Arg Arg Ala Gin Asp Phe Vai Gin Trp Leu Met Asn 70 75 80
Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe Glu 85 90 95
Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai Ser Ser Tyr Leu Glu 105 110
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly 120 125
Pro Glu Glu Vai Ala Ile Vai Glu Glu Leu Gly Arg 135 140
Gly Ser Phe ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp 150 155 160
Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gin Thr Lys Ile 165 170 175
Thr Asp Arg Lys 180
<210> 1249 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1249
Met Lys Ser Ile Tyr Phe Vai Ala Gly Leu Phe Vai Met Leu Vai Gin 1 5 10 15 Gly Ser Trp Gin Arg Ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 20 25 30 Phe Ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gin Met Asn 35 40 45 Glu ASp Lys Arg His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys 50 55 60 421
Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Oln Asp Phe Vai Gin Trp Leu Met Asn 65 70 75 80
Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe Glu 8S 90 95
Arg Hia Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 100 105 110
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Xle Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly 115 120 125
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Vai Ala Ile Vai Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140
Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp 145 150 155 160
Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gin Thr Lys Ile 165 170 175
Thr Asp Arg Lys 180
<210> 1250 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens Λ O D> 1 250 Met Lys Ser Ile Tyr Phe val Ala Gly Leu Phe Val Met Leu Val o f» 1 5 10 15 Gly Ser Trp Gin Arg ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 20 25 30 Phe Ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gin Met Asn 35 40 45 Glu Asp Lys Arg His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser ASp Tyr Ser Lys 50 55 60 Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn 65 70 75 80 422
Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe Glu 85 90 95 Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 100 105 110 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 115 120 125 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Vai Ala Ile Vai Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140 Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp 145 150 155 160 Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gin Thr Lys Ile 165 170 175 Thr Asp Arg Lys 180
<210> 1251 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1251
Gly Ala Ala
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai Ser ser Tyr Leu Glu 15 10 IS
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu vai Lya Gly Arg His 20 25 30
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Aap Vai Ser ser Tyr Leu Glu Gly Gin 35 40 45
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu vai Lys Gly Arg S0 55 50 <210> 1252 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens 423 <4 Ο 0> 1252
Hia Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 S 10 15
Gin Ala Ala Lye Glu Phe Xle Ala Trp Leu Vai Lye Gly Arg Hls Ala 20 25 30
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala 35 40 45
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg 50 55 60
<210> 1261 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1261 aggagcgccg acaaaagaca cg 22
<210> 1262 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1262 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc 26
<210> 1263 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1263 aggagcgtcg acaaaagaca cg 22 424 <210> 1264 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1264
ctttaaatcg atgagcaacc tcactc 2S <210> 1265 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1265 aggagcgtcg acaaaagaca cg 22 <210> 1266 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1266 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc 26 <210> 1267 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1267 aggagcgtcg acaaaagaga ag 22 425 <210> 1268 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1268 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc <210> 1269 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1269 aggaqcgtcg acaaaagaca ca <210> 1270 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1270 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc <210> 1271 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> '1271 agcgtcgaca aaagacacgc tgaaggtac 426
<210> 1272 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1272 catgatcttc aaatggacac t 21 <210> 1273 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1273 aggagcgtcg acaaaagaca <210> 1274 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1274 catgatcttc aaatggacac <210> 1280 <211> 674 <212> PRT <213> Homo sapiens 427 <4 Ο 0> 1280
Met 1 Asn Ile Phe Tyr 5 Ile Phe Leu Phe Leu 10 Leu Ser Phe Val Gin 15 Gly Leu Glu HiS Thr 20 HiS Arg Arg Gly Ser 25 Leu Asp Lys Arg Hls 30 Gly Glu Gly Thr Phe 35 Thr Ser Asp Val Ser 40 Ser Tyr Leu Glu Gly 45 Gin Ala Ala Lys Glu SO Phe Zle Ala Trp Leu 55 Val Lys Gly Arg His 60 Gly Glu Gly Thr Phe 65 Thr Ser Asp vai Ser 70 Ser Tyr Leu Glu Gly 75 Gin Ala Ala Lys Glu 80 Phe lie Ala Trp Leu 85 Vai Lys Gly Arg Asp 90 Ala His Lys Ser Glu 95 Val Ala Hls Arg Phe 100 Lys Asp Leu Gly Glu 105 Glu Asn Phe Lys Ala 110 Leu Val Leu Ile Ala 115 Phe Ala Gin Tyr Leu 120 Gin Gin Cys Pro Phe 125 Glu Asp His vai Lys 110 Leu Vai Asn Glu Val 13S Thr Glu Phe Ala Lys 140 Thr Cys Val Ala Asp 14S Glu Ser Ala Glu Asn ISO Cys Asp Lys Ser Leu 155 His Thr Leu Phe Gly 160 Asp Lys Leu Cys Thr 165 Vai Ala Thr Leu Arg 170 Glu Thr Tyr Gly Glu 175 Met Ala Asp Cys Cys 180 Ala Lys Gin Glu Pro 185 Glu Arg Asn Glu Cys 190 Phe Leu Gin His Lys 195 Asp Asp Asn Pro Asn 200 Leu Pro Arg Leu Val 205 Arg Pro Glu Vai Asp 210 vai Met Cys Thr Ala 215 Phe Hls Aap Asn Glu 220 Glu Thr Phe Leu Lys 225 Lys Tyr Leu Tyr Glu 230 Ile Ala Arg Arg His 235 Pro Tyr Phe Tyr Ala 240 Pro Glu Leu Leu Phe 245 Phe Ala Lys Arg Tyr 250 Lys Ala Ala Phe Thr 255 Glu Cys Cys Gin Ala 260 Ala Asp Lys Ala Ala 265 Cys Leu Leu Pro Lys 270 Leu Asp Glu Leu Arg 275 Asp Glu Gly Lys Ala 280 Ser Ser Ala Lys Gin 285 Arg Leu Lys Cys Ala 290 Ser Leu Gin Lys Phe 29S Gly Glu Arg Ala Phe 300 Lys Ala Trp Ala 428
Vai Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val 305 310 315 320 Ser Lys Leu Vai Thr Asp Leu Thr Lye Val His Thr Glu Cys Cys His 325 330 335 Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 340 345 350 Ile Cys Glu Asn Gin Asp ser lie Ser ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys 3SS 360 365 Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His cys Ile Ala Glu Val Glu Asn 370 375 380 Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu 385 390 395 400 Ser Lys Asp Vai Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu 40S 410 415 Gly Met phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg Kis Pro Asp Tyr Ser Val 420 425 430 Vai Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys 435 440 445 Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe Asp 450 455 460 Glu Phe Lys Pro Leu Vai Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn 465 470 475 480 Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu 485 490 495 Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Vai Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu 500 505 510 Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys 515 520 525 His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val 530 535 540 val Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro val Ser Asp 545 550 555 560 Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys 565 570 575 Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn S80 585 590 429
Ala Glu Thr Phe Thr phe His Ala Aep Ile Cys Thr Leu ser Glu Lys S9S 600 605
Glu Arg Gin lie Lys Lys Gin Thr Ala Leu Vai Glu Leu Vai Lys His 610 61S 620
Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Vai Met Asp Asp Phe 625 630 635 640
Ala Ala Phe Vai Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys
645 650 65S
Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu 660 665 670
Gly Leu
<210> 1281 <211> 267 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1281 atgaacattt tctacatttt cttgttcttg ttgtctttcg ttcaaggttt ggaacacact 60 cacagaagag gttctttgga taagagacac ggtgaaggta cttccacttc tgatgtttct 120 tctcacttgg aaggtcaagc tgctaaggaa ttcattgett ggttggttaa gggtagacat 180 ggagagggaa caCttacatc agacgtctca tcatatttag agggacagge agcaaaagag 240 tttatagcac ggttagtaaa aggaagg 267
<210> 1282 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens 10 <40 0> 1282
Met Asn Ile Phe Tyr Zle Phe Leu l 5
Leu Glu His Thr His Arg Arg Gly 20
Phe Leu Leu Ser Phe v&l Gin Gly 15
Ser Leu Asp Lys Arg His Gly Glu 25 30 430
Gly Thr Phe 35 Lys Glu Phe 50 Phe Thr Ser 65 Phe Ile Ala <210> 1283 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 1283
Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala 40 4S Ile Ala Trp Leu Vai Lye Gly Arg His Gly Glu Gly Thr 55 60 Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu 70 75 80 Trp Leu vai Lys Gly Arg 85 sapiens gtcaatacct tcttgaacca
<210> 1284 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1284 ctcccaaacc tttaaatcga tgagcaa
<210> 1391 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens 431 <4 Ο 0> 1391 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttccccte aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatt cacagggcac attcaccagC 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gtbgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttafc ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1395 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1395 gctggttgta agaacttctt ctggaagact ttcacttctt gt 42
<210> 1439 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1439 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgttcccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagcttccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagat gaacgaggac aagcgccatt cacagggcac atccaccagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt ttgtgcagtg gttgatgaat 240 accaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aatttgagag acatgctgaa 300 gggaccttta ccagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggctgg tgaaaggccg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc cattgttgaa 420 gaacttggcc gcagacatgc tgatggttct ttctctgatg agatgaacac cattcttgat 480 aatcttgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1440 <211> 543 <212> ADN <213> Homo sapiens 432 <400> 1440 atgaaaagca tttactttgt ggctgggtta tttgtaatgc tggtacaagg cagctggcaa 60 cgtccccttc aagacacaga ggagaaatcc agatcattct cagctcccca ggcagaccca 120 ctcagtgatc ctgatcagac gaacgaggac aagcgccatt cacagggcac attcaccagt 180 gactacagca agtatctgga ctccaggcgt gcccaagatt: ctgtgcagtg gttgatgaat 240 aceaagagga acaggaataa cattgccaaa cgtcacgatg aactcgagag acatgctgaa 300 gggacctcta ceagtgatgt aagttcttat ttggaaggcc aagctgccaa ggaattcatt 360 gcttggctgg tgaaaggceg aggaaggcga gatttcccag aagaggtcgc eattgttgaa 420 gaacteggcc gcagacatgc tgabggttct ttctctgatg agatgaacae cattcttgat 480 aatctxgccg ccagggactt tataaactgg ttgattcaga ccaaaatcac tgacaggaaa 540 taa 543
<210> 1452 <211> 825 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1452 atgaagatct ecgtggctgc aattccctcc ttcctcctca tcaccaccgc cctagggacc 60 aagactgaat cctcctcacg gggaccttac caccccccag agtgctgctt cacetacaet 120
acccacaaga tcccgcgcca gcggactatg gattactatg agaceaacag ccagcgctcc 1BO aageccggaa ccgtcttcat caccaaaagg ggccattccg ectgtaecaa ccccagtgac 240 aagtgggccc aggactatat caaggaeatg aaggagaact gaatgaaaag catttacttt 300 gtggctgggt tattegtaat gccggtacaa ggcagctggc aacgttccct tcaagacaca 360 gaggagaaac ccagatcate ctcagcttcc caggcagacc cactcagtga tcctgatcag 420 acgaacgagg acaagcgeca Ctcacagggc acatccacca gcgactacag caagtacctg 4Θ0 gactccaggc gtgcccaaga ttttgtgcag tggttgatga ataccaagag gaacaggaat 540 aacatcgcca aacgtcacga tgaatttgag agacatgctg aagggacctt taccagtgat 600 gtaagttctt atttggaagg ccaagctgcc aaggaattca ttgcttggct ggtgaaaggc 660 cgaggaaggc gagatttccc agaagaggtc gccattgttg aagaacttgg ccgcagacat 720 gctgatggtc ctttctctga tgagatgaac accattcttg ataatcttgc cgccagggac 780 tttataaact ggttgattca gaccaaaate actgacagga aataa 825
<210> 1453 <211> 249 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1453 atgaagctag catactccct cctgcttcca etggcaggag tcagtgcctc agttatcaat 60 tacaagagac acggtgaagg cactctcact tctgatgttt cttctcactt ggaaggtcaa 120 gctgccaagg aattcattgc ttggttggtt aagggtagac atggagaggg aacatttaca 180 tcagacgtct caccatattt agagggacag gcagcaaaag agtttatagc atggttagta 240 aaaggaagg 248 433
<210> 1454 <211> 435 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1454 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catectccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tctcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cageacaaat 180 aacgggttae tgtttataaa taceaceabt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaca aaagacacgg tgaaggtact ttcacttctg atgtttcttc tcacttggaa 300 ggtcaagctg ccaaggaatt cattgcttgg ttggttaagg gcagacatgg agagggaaca 360 tttacatcag acgtctcatc atatttagag ggacaggcag caaaagagtt tatagcatgg 420 tcagtaaaag gaagg 435
<210> 1455 <211> 231 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1455 atgttcaagt ctgttgttta ctctattttg gctgcttctt Cggctaacgc tcacggtgaa 60 ggtacettca ettctgatgt ttcttcttac ttggaaggtc aagctgctaa ggaattcatt 120 gcttggttgg ctaagggtag acatggagag ggaacattta catcagacgt ctcatcatat 180 ttagagggac aggcagcaaa agagtttata gcatggttag taaaaggaag g 23i
<210> 1456 <211> 435 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1456 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 taeeeagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cageacaaat 180 aacgggttae tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tcectcgaca aaagacacgg tgaaggtact ttcacttctg atgtttcttc ttacttggaa 300 ggtcaagctg ctaaggaatt cattgcttgg ttggttaagg gtagacatgc agagggaaca 360 tttacatcag acgtctcatc atatttagag ggacaggcag caaaagagtt tatagcatgg 420 tcagtaaaag gaagg 435 434 <210> 1457 <211> 249
<212> ADN <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 1457 acgaagttag catactccct cttgcttcca ttggcaggag tcagtgcttc agtCatcaat tacaagagac acggtgaagg taccttcact tctgatgttt cttcttactt ggaaggtcaa gctgctaagg aactcaCtgc eeggttggtt aagggtagac acgcagaggg aacattcaca tcagacgtcC catcatattt agagggacag gcagcaaaag agtttatagc atggctagta aaaggaagg
<210> 1458 <211> 231 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1458 atgttcaagt ctgttgttta ctctattttg gctgcttctt tggctaacgc tcacggtgaa ggtactttca cttctgatgt; ttcttcttac ctggaaggtc aagctgctaa ggaattcatt gcttggttgg ttaagggtag acatgcagag ggaacattta catcagacgt ctcatcatat ttagagggac aggcagcaaa agagtttiaCa gcatggttag taaaaggaag g
<210> 1472 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 1472 cacggtgaag gtaetttcac ttetgatgtt tettcttact tggaaggtca agctgctaag gaatecattg cttggttggt taagggtaga
<210> 1559 <211> 654 <212> PRT <213> Homo sapiens 435 <400> 1559
Met Lys Trp Vai Ser Phe Zle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 S 10 15 Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ses 20 25 30 Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 45 Trp Leu Val Lye Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala 50 55 60 Ue Val Glu Glu Leu Asp Ala His Lys Ser Glu val Ala His Arg Phe 65 70 75 80 Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu ile Ala Phe 85 90 95 Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val 100 10S 110 Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys 130 135 140 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys 145 ISO 155 160 Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp 165 170 175 Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu val Asp Val Met 180 185 190 Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu 195 200 205 Tyr Glu He Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu 210 215 220 Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala 225 230 235 240 Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu 260 265 270 Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu 275 280 285 436
Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val 290 295 300 Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu 30S 310 31S 320 Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn 325 330 335 Gin Aap Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu 340 345 350 Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro 355 360 365 Ala Aap Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser Lys Asp Val 370 375 380 Cye Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser val Val Leu Leu Leu 405 410 41S Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala 420 425 430 Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe ASp Glu Phe Lys Pro 435 440 445 Leu Vai Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe 450 455 460 Glu Glu Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu val Arg Tyr 465 470 475 480 Thr Lys Lys Vai Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 485 490 495 Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala SOO 505 510 Ly9 Arg Met Pro cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin 515 520 525 Leu Cys Vai Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys 530 535 540 Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu 545 5S0 555 560 437
Glu Vai Asp Glu Thr Tyr Vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe 565 570 575
Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile 580 583 590
Lys Lys Gin Thr Ala Leu Vai Glu Leu Vai Lya His Lys Pro Lys Ala 595 600 605
Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Vai Mee Asp Asp Phe Ala Ala Phe vai S10 615 620
Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 625 630 635 640
Gly Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 645 650
<210> 1563 <211> 623 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1563
Met 1 Lys Trp Vai Ser 5 Phe Ile Ser Leu Leu 10 Phe Leu Phe Ser Ser 15 Ala Tyr Ser Arg Ser 20 Leu Asp Lys Arg Asp 25 Ala His Lys Ser Glu 30 Vai Ala His Arg Phe 35 Lys ASp Leu Gly Glu 40 Glu Asn. Phe Lys Ala 45 Leu Vai Leu lie Ala 50 Phe Ala Gin Tyr Leu 55 Gin Gin Cys Pro Phe 60 GlU Asp His Vai Lys 65 Leu vai Asn Glu vai 70 Thr Glu Phe Ala Lys 75 Thr Cys Vai Ala Asp 80 Glu Ser Ala Glu Aen 85 Cys Asp Lys Ser Leu 90 His Thr Leu Phe Gly Asp 9S Lys Leu Cys Thr 100 Vai Ala Thr Leu Arg 105 Glu Thr Tyr Gly Glu 110 Met Ala Asp Cys Cys 115 Ala Lys Gin. Glu Pro 120 Glu Arg Asn Glu Cys 12S Phe Leu Gin 438 HÍS Lys 130 Asp Asp Asn Pro Asn 13S Leu Pro Arg Leu Val 140 Arg Pro Glu Val A3p 145 Vai Met Cys Thr Ala ISO Phe His Asp Asn Glu 155 Glu Thr Phe Leu Lys 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu 165 Ile Ala Arg Arg His 170 Pro Tyr Phe Tyr Ala 175 Pro Glu Leu Leu Phe 180 Phe Ala Lys Arg Tyr 185 Lys Ala Ala Phe Thr 190 Glu Cys Cys Gin Ala 195 Ala Asp Lys Ala Ala 200 Cys Leu Leu Pro Lys 205 Leu Asp Glu Leu Arg 210 Asp Glu Gly Lys Ala 215 Ser Ser Ala Lys Gin 220 Arg Leu Lys Cys Ala 225 Ser Leu Gin Lys Phe 230 Gly Glu Arg Ala Phe 23 S Lys Ala Trp Ala Val 240 Ala Arg Leu Ser Gin 245 Arg Phe Pro Lya Ala 250 Glu Phe Ala Glu Val 2S5 ser Lys Leu Val Thr 260 Asp Leu Thr Lys Val 265 His Thr Glu Cys Cys 270 His Gly Asp Leu Leu 275 Glu Cys Ala Asp Asp 280 Arg Ala Asp Leu Ala 285 Lys Tyr Ile Cys Glu 290 Asn Gin Asp Ser He 295 Ser Ser Lys Leu Lys 300 Glu Cys Cys Glu Lys 305 Pro Leu Leu Glu Lys 310 ser His Cys Ile Ala 315 Glu Val Glu Asn Asp 320 Glu Met Pro Ala Asp 325 Leu Pro Ser Leu Ala 330 Ala Asp Phe Val Glu 335 Ser Lys Asp Val Cys 340 Lys Asn Tyr Ala Glu 345 Ala Lys Asp Val Phe 350 Leu Gly Met Phe Leu 355 Tyr Glu Tyx Ala Arg 360 Arg His Pro Asp Tyr 365 Ser Val val Leu Leu 370 Leu Arg Leu Ala Lys 375 Thr Tyx Glu Thr Thr 380 Leu Glu Lys Cys Cys 355 Ala Ala Ala Asp Pro 390 Mis Glu Cys Tyr Ala 395 Lys Val Phe Asp Glu 400 Phe Lys Pro Leu val 405 Glu Glu Pro Gin Asn 410 Leu Ile Lys Gin Asn 415 Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu 420 425 430 439 val Arg Tyr 435 Thr Lys Lys Val Pro 440 Gin Val Ser Thr pro 445 Thr Leu val Glu Val 450 Ser Arg Asn Leu Gly 455 Lys val Gly Ser Lys 460 Cys Cys Lys His Pro 465 Glu Ala Lys Arg Met 470 Pro Cys Ala Glu Asp Tyr 475 Leu Ser Val Val 480 Leu Asn Gin Leu Cye 485 val Leu His Glu Lys 490 Thr Pro Val Ser Asp Arg 495 Val Thr Lys Cys 500 Cys Thr Glu Ser Leu 505 Val Asn Arg Arg Pro 510 Cys Phe Ser Ala Leu 515 Glu Val Asp Glu Thr 520 Tyr Val Pro Lys Glu 525 Phe Asn Ala Glu Thr S30 Phe Thr Phe His Ala 535 Asp Ile Cys Thr Leu 540 Ser Glu Lys Glu Arg 545 Gin Ile Lys Lys Gin 550 Thr Ala Leu val Glu 555 Leu val Lys His Lys 560 Pro Lys Ala Thr Lys 565 Glu Gin Leu Lys Ala 570 Val Mee Asp Asp Phe 575 Ala Ala Phe Val Glu 580 Lys Cys Cys Lys Ala Asp 585 Asp Lys Glu Thr 590 Cys Phe Ala Glu Glu 595 Gly Lys Lys Leu Val 600 Ala Ala Ser Gin Ala 605 Ala Leu Gly Leu Ala 610 Gly Cys Lys Asn Phe 615 Phe Trp Lys Thr Phe 620 Thr Ser Cys <210> 1607 <211> 6 6 4 <212> PRT <213> Homo <40 0> 1607
Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 15 10 15
Ile Ser Ala Hi9 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly 35 40 45 440
Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 50 55 60 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lye Gly Arg Asp 65 70 75 80 Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys ASp Leu Gly Glu Glu 85 90 95 Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin 100 105 110 Cys Pro Phe Glu Αβρ His Val Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu Phe 115 120 125 Ala Lys Thr Cys val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser 130 135 140 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg 145 150 155 160 Glu Thr Tyr Gly Glu Mee Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu 165 170 175 Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro iao 185 190 Arg Leu Vai Arg Pro Glu Val Asp val Met Cys Thr Ala Phe His Asp 195 200 205 Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg 210 215 220 His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 225 230 235 240 Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys 245 250 255 Leu Leu Pro Ly9 Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 260 265 270 Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg 275 280 285 Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys 290 29S 300 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys Val 305 310 315 320 Hla Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg 325 330 335 441
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys Glu Asn Gin Aep Ser lie Ser Ser 340 345 350 Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser Kis Cys 355 360 365 Ile Ala Glu val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 370 375 380 Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu 385 390 39S 400 Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg 405 410 415 His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 420 425 430 Glu Thr Thr Leu GlU Lys Cys cys Ala Ala Ala Αβρ Pro His Glu Cys 435 440 445 Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gin 450 455 460 Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr 465 470 475 480 Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin 485 490 495 Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val 500 505 510 Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 515 520 525 Glu Asp Tyr Leu Ser Val val Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His Glu S30 535 540 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 545 550 555 560 Vai Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr 565 570 57S Vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 580 585 590
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu 595 600 605 442
Vai Glu Leu Vai Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys 610 615 620
Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Vai Glu Lys Cys Cye Lys Ala 625 630 635 640
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Vai Ala 645 650 655
Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 <210> 1608 <211> 66 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1608 Mec Leu Leu Gin Ala Phe 10 15
Ile Ser Ala His 20 Gly Glu Gly Thr Phe 25 Thr Ser Asp Vai Ser Ser 30 Tyr Leu Glu Gly Gin 35 Ala Ala Lys Glu 40 Phe Ile Ala Trp Leu 45 Vai Lys Gly Arg His SO Ala Glu Gly Thr Phe 55 Thr Ser Asp vai Ser 60 Ser Tyr Leu Glu Gly 65 Gin Ala Ala Lys Glu Phe 70 He Ala Trp Leu Vai 75 Lys Gly Arg Asp 80 Ala His Lys Ser Glu 85 Vai Ala His Arg Phe 90 Lys Asp Leu Gly GLu 95 Glu Asn Phe Lye Ala 100 Leu Vai Leu Ile Ala 105 Phe Ala Gin Tyr Leu Gin 110 Gin Cys Pro Phe Glu 115 Asp His Vai Lys 120 Leu Vai Asn Glu Vai 125 Thr Glu Phe Ala Lye 130 Thr Cys Vai Ala Asp 135 Glu Ser Ala Glu Asn 140 Cys Asp Lys Ser Leu 14 5 Hie Thr Leu Phe Gly Asp 150 Lye Leu Cys Thr Vai 155 Ala Thr Leu Arg 160 443
Glu Thr Tyr Gly Glu 165 Met Ala Asp Cys Cys 170 Ala Lys Gin Glu Pro 175 Glu Arg Asn GlU Cys 180 Phe Leu Gin His Lys 185 Asp Asp Asn Pro Asn 190 Leu Pro Arg Leu val 195 Arg Pro Glu Val Asp 200 val Met Cys Thr Ala 205 Phe His Asp asn Glu 210 Glu Thr Phe Leu Lys 215 Lys Tyr Leu Tyr Glu 220 Ile Ala Arg Arg Hie ΡΓΟ 225 Tyr Phe Tyr Ala 230 Pro Glu Leu Leu Phe 235 Phe Ala Lys Arg Tyr 240 Lys Ala Ala Phe Thr 245 Glu Cys Cys Gin Ala 2S0 Ala Asp Lys Ala Ala 2S5 Cys Leu Leu Pro Lys 260 Leu Asp Glu Leu Arg 265 Asp Glu Gly Lys Ala 270 Ser Ser Ala Lys Gin 275 Arg Leu Lys Cys Ala 280 Ser Leu Gin Lys Phe 285 Gly Glu Arg Ala Phe 290 Lys Ala Trp Ala Val 295 Ala Arg Leu Ser Gin 300 Arg Phe Pro Lys Ala Glu 305 Phe Ala Glu Val 310 Ser Lys Leu val Thr 315 Asp Leu Thr Lys val 320 His Thr Glu Cys Cys 32S His Gly Asp Leu Leu 330 Glu Cys Ala Asp Asp 335 Arg Ala Asp Leu Ala 340 Lys Tyr Ile Cys Glu 345 Asn Gin Asp ser Ile 350 Ser Ser Lys Leu Lys 355 Glu Cys Cys Glu Lys 360 Pro Leu Leu Glu Lya 365 Ser His Cys Xle Ala 370 Glu Val Glu Asn. Asp 375 Glu Met Pro Ala Asp 380 Leu Pro Ser Leu Ala Ala 385 Asp Phe val Glu 390 Ser Lys Asp val Cys 395 Lys Asn Tyr Ala Glu 400 Ala Lys Asp Val Phe 405 Leu Gly Met Phe Leu 410 Tyr Glu Tyr Ala Arg 41S Arg His Pro Asp Tyr 420 Ser Val Val Leu Leu 425 Leu Arg Leu Ala Lys 430 Thr Tyr Glu Thr Thr 435 Leu Glu Lys Cys Cys 440 Ala Ala Ala Asp Pro 445 His Glu Cys Tyr Ala 450 Lys Val Phe Asp Glu 455 Phe Lys Pro Leu Val 460 Glu Glu Pro Gin 444
Asn 465 Leu ile Lys Gin Asn Cys Glu 470 Leu Phe Glu Gin 475 Leu Gly Glu Tyr 480 Lys Phe Gin Asn Ala 485 Leu Leu Val Arg Tyr 490 Thr Lys Lys Val Pro 495 Gin val Ser Thr Pro 500 Thr Leu Val Glu Val 505 Ser Arg Asn Leu Gly Lys 510 Val Gly Ser Lys 51S Cys Cys Lys His Pro 520 Glu Ala Lys Arg Met 525 Pro Cys Ala Glu Asp 530 Tyr Leu Ser val Val 535 Leu Asn Gin Leu Cys 540 Val Leu His Glu Lys 545 Thr Pro Val Ser Aap 550 Arg Val Thr Lys Cys 555 Cys Thr Glu Ser Leu 560 Val Asn Arg Arg Pro 565 Cys Phe Ser Ala Leu 570 GlU Val Asp Glu Thr 575 Tyr Val Pro Lys Glu 580 Phe Asn Ala Glu Thr sas Phe Thr Phe His Ala Asp 590 Xle Cys Thr Leu 595 Ser Glu Lys Glu Arg 600 Gin He Lys Lys Gin 605 Thr Ala Leu Val Glu 610 Leu Val Lys His Lys 615 Pro Lys Ala Thr Lys 620 Glu GlU Leu Lys Ala 625 val Met Asp Asp Phe 630 Ala Ala Phe Val Glu Lys 635 Cys Cys Lys Ala 640 Asp Asp Lys Glu Thr 645 Cys Phe Ala Glu Glu 650 Gly Lys Lys Leu Val 655 Ala Ala Ser Gin Ala 660 Ala Leu Gly Leu
<210> 1609 <211> 663 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1609
Met Lys Trp Vai Ser Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 lo 15
Tyr ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu 20 25 30 445
Glu Gly Gin 35 Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala 40 Trp Leu Val 45 Lya Gly Arg HIb Gly 50 Glu Gly Thr Phe Thr 55 Ser Asp Val Ser Ser 60 Tyr Leu Glu Gly Gin Ala 65 Ala Lye Glu Phe 70 Ile Ala Trp Leu val 7S Lys Gly Arg Asp Ala 80 Hia Lya Ser Glu Vai 85 Ala His Arg Phe Lya 90 Asp Leu Gly Glu Glu 95 Asn Phe Lya Ala Leu 100 val Leu Ile Ala Phe Ala 105 Gin Tyr Leu Gin. 110 Gin Cya Pro phe Glu 115 Aap Hia Val Lya Leu Val Asn 120 Glu Val Thr 125 Glu Phe Ala Lya Thr 130 Cys Vai Ala Asp Glu 135 Ser Ala Glu Asn Cys 140 Asp Lys Ser Leu Hia Thr 14S Leu Phe Gly Asp ISO Lye Leu Cye Thr val 155 Ala Thr Leu Arg Glu 160 Thr Tyr Gly Glu Met 165 Ala Asp Cye Cys Ala 170 Lys Gin Glu Pro Glu 175 Arg Aan Glu Cye Phe iao Leu Gin Hia Lys Aap Asp 185 Asn Pro Asn Leu 190 Pro Arg Leu Vai Arg 195 Pro Glu Val Asp val Mec Cys 200 Thr Ala Phe 205 His Asp Asn Glu Glu 210 Thr Phe Leu Lye Lys 215 Tyr Leu Tyr Glu Ile 220 Ala Arg Arg HiS Pro Tyr 225 Phe Tyr Ala Pro 230 Glu Leu Leu Phe Phe 235 Ala Lys Arg Tyr Lya 240 Ala Ala Phe Thr Glu 24S Cys Cye Gin Ala Ala 250 Asp Lys Ala Ala Cye 255 Leu Lau Pro Lya Leu 250 Asp Glu Leu Arg Asp Glu 265 Gly Lys Ala Ser 270 Ser Ala Lya Gin Arg 275 Leu Lya Cys Ala Ser Leu Gin 280 Lys Phe Gly 285 Glu Arg Ala Phe Lya 290 Ala Trp Ala Val Ala 2 9S Arg Leu Ser Gin Arg 300 Phe Pro Lys Ala Glu Phe 305 Ala Glu val Ser 310 Lya Leu Val Thr Asp 315 Leu Thr Lya Val His 320 Thr Glu Cys Cys Hi9 325 Gly Asp Leu Leu Glu 330 Cys Ala Asp Asp Arg 335 Ala 446
Asp Leu Ala Lya 340 Tyr lie Cys Glu Asn 345 Gin Asp Ser Xle Ser 350 Ser Lys Leu Lys Glu 355 Cys Cys Glu Lya Pro 360 Leu Leu Glu Lys Ser 365 HÍ9 Cys Ile Ala Glu 370 Vai Glu Asn Asp Glu 37S Met Pro Ala ASp Leu 3B0 Pro ser Leu Ala Ala 385 Asp Phe Val Glu Ser 390 Lys Asp Val Cys Lys 395 Asn Tyr Ala Glu Ala 400 Lys Asp Vai Phe Leu 405 Gly Met Phe Leu Tyr 410 Glu Tyr Ala Arg Arg 415 His Pro Aep Tyr Ser 420 Val Val Leu Leu Leu 425 Arg Leu Ala Lys Thr 430 Tyr Glu Thr Thr Leu 435 Glu Lys Cys Cys Ala 440 Ala Ala Asp Pro His 445 Glu Cys Tyr Ala Lya 450 val Phe Asp Glu Phe 4S5 Lys Pro Leu Val Glu 460 Glu Pro Gin Asn Leu 465 Xle Lys Gin Asn Cys 470 Glu Leu Phe Glu Gin 475 Leu Gly Glu Tyr Lys 480 Phe Gin Asn Ala Leu 485 Leu Val Arg Tyr Thr 490 Lys Lys val Pro Gin 495 Val Ser Thr Pro Thr 500 Leu val Glu Val Ser 505 Arg Asn Leu Gly Lys 510 Val Gly ser Lys Cys 515 Cys Lys HlS Pro Glu 520 Ala Lys Arg Met Pro 525 Cys Ala Glu Asp Tyr 530 Leu Ser val val Leu 535 Asn Gin Leu Cys Val 540 Leu His GlU Lys Thr S45 Pro Val Ser Asp Arg 550 val Thr Lys Cys Cys 555 Thr Glu Ser Leu val 560 Asn Arg Arg Pro Cys 565 Phe Ser Ala Leu Glu 570 val Asp Glu Thr Tyr 575 val Pro Lys Glu Phe 580 Asn Ala Glu Thr Phe 585 Thr Phe His Ala Asp 590 Xle Cys Thr Leu Ser 595 Glu Lys Glu Arg Gin 600 Xle Lys Lys Gin Thr 605 Ala Leu Val Glu Leu 610 Val Lys His Lys Pro 615 Lys Ala Thr Lys Glu 620 Gin Leu Lys Ala 447
Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Vai Glu Lye Cys Cys Lyg Ala Asp 625 630 635 640
Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lye Lys Leu Vai Ala Ala 645 650 655
Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660
<210> 1610 <211> 663 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1610 Met 1 Lye Trp Vai Ser 5 Phe Ila Ser Leu Leu 10 Phe Leu Phe Ser Ser IS Ala Tyr Ser His Gly 20 Glu Gly Thr Phe Thr 25 Ser Asp Val Ser Ser 30 Tyr Leu Glu GLy Gin 35 Ala Ala Lys Glu Phe 40 Ile Ala Trp Leu Val 45 Lys Gly Arg His Ala 50 Glu Gly Thr Phe Thr 55 Ser Asp Val Ser Ser 60 Tyr Leu Glu Gly Gin 65 Ala Ala Lys Glu Phe 70 Xle Ala Trp Leu Val 75 Lys Gly Arg Asp Ala 80 His Lys Ser Glu Vai 85 Ala His Arg Phe Lys 90 Asp Leu Gly Glu Glu 95 Asn Phe Lys Ala Leu 100 Vai Leu Ile Ala Phe 105 Ala Gin Tyr Leu Gin 110 Gin Cys Pro Phe Glu A6p 115 Hia Vai Lys Leu 120 val Asn Glu val Thr 125 Glu Phe Ala Lys Thr 130 Cys vai Ala Asp Glu 135 Ser Ala Glu Asn Cys 140 Asp Lys Ser Leu His 145 Thr Leu phe Gly Asp 150 Lys Leu Cys Thr Val 155 Ala Thr Leu Arg Glu 160 Thr Tyr Gly Glu Mec 165 Ala Asp Cys Cys Ala 170 Lys Gin GlU Pro Glu 17S Arg Asn Glu Cys phe 180 Leu Gin His Lye ASp Asp 185 Asn Pro Asn Leu 190 Pro Arg Leu vai Arg Pro Glu Vai Asp Vai Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn 195 200 205 448
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<210> 1620 <211> 700 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1620
Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 15 10 15
Ile Ser Ala Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys Cyg Phe Thr Tyr Thr 20 25 30
Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gin Arg He Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Aen 35 40 45 450
Ser Gin Cye Ser Lys Pro Gly Ile Vai Phe Ile Thr Lys Arg Gly Hls 50 55 60 Ser Vai Cy8 Thr Asn Pro Ser ASp Lys Trp Vai Gin Asp Tyr Ile Lys €5 70 75 80 Asp Met Lys Glu Asn Hls Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser 85 90 95 Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lyg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai 100 105 110 Lye Gly Arg Asp Ala Hls Lys Ser Glu Vai Ala Hls Arg Phe Lys Asp
11S 120 12S
Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gin 130 135 140 Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp Hls Val Lys Leu Val Asn Glu 145 150 155 160 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn 165 170 175 Cye Asp Lye Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lye Leu Cys Thr Val 180 185 190 Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys 195 200 205 Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn 210 215 220 Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr 22S 230 235 240 Ala Phe Hls Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu 245 250 255 Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe 260 265 270 Ala Lys Arg Tyr LyS Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp 27S 280 285 Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly 290 295 300 Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys 305 310 315 320 451
Pha Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin 325 330 335 Arg Phe Pro Lye Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp 340 345 350 Leu Thr Lys val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys 355 360 365 Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin Asp 370 375 380 Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu 38S 3 90 395 400 Lys Ser His Cys ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala ASp 405 410 415 Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys 420 425 430 Asn Tyr Ala GlU Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu 435 440 445 Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser val val Leu Leu Leu Arg Leu 450 45S 460 Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp 465 470 475 480 Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val 485 490 495 Glu Glu Pro Gin Asn Leu Zle Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin soo 505 510 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 515 520 525 Lys Vai Pro Gin val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn S30 535 540 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys cys Cys Lys Kie Pro Glu Ala Lys Arg 54S 5S0 555 560 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser val Val Leu Asn Gin Leu Cys 565 570 575 Vai Leu His Glu Lys Thr Pro val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 580 585 590 Thr Glu Ser Leu val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 595 600 605 452
Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 610 615 620 His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lye Glu Arg Gin Ile Lys Lys 625 630 635 640 Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 645 650 655 Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 660 665 670 Cys Cys Lys Ala Aap Asp Lys Glu Thr Cya Phe Ala Glu GlU Gly Lys 675 680 685 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 690 695 700 <210> 1621 <211> 668 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1621
Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala 10 15 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 30 Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp 45 Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser 60 Glu Phe He Ala Trp Leu Val 75 80 Val Ala His Arg Phe Lys Asp 90 95 Val Leu Ile Ala Phe Ala Gin 110
Met Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu 1 5
Ser Val lie Asn Tyr Lys Arg Hie Gly 20 25
Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala 35 40
Leu Val Lys Gly Arg His Gly Glu Gly S0 SS
Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys 65 70
Lys Gly Arg Asp Ala Hia Lys Ser Glu 85
Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lya Ala Leu 100 105 453
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Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly 260 265 270 Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys 275 280 285 Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin 290 295 300 Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp 305 310 315 320 Leu Thr Lys Vai His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys 325 330 335 Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin Asp 340 345 350 Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu 355 360 365 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Vai Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp 370 375 380 Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys 385 390 395 400 454
Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Vai Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu 405 410 415 Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu 420 425 430 Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp 43S 440 44S Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe ASp Glu Phe Lys Pro Leu Val 450 455 460 Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin 465 470 475 480 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 485 490 495 Lys Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 500 505 510 Leu Gly Lys Vai Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 515 520 525 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys 530 535 540
Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 545 550 5SS 560 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 565 S70 575 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 580 S8S S90 His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys 595 600 605 Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 610 61S 620 Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 625 630 635 640 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 645 650 655 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 665 455 <210> 1622 <211> 730 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1622
Met Arg Phe Pro Ser ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Arg HiS Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser ASp val ser 95 90 95 Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val 100 10S 110 Lys Gly Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr 11S 120 12S Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 130 135 140 Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu 165 170 175 Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr 180 185 190 Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp 19S 200 205 Lys Ser Leu HiS Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cye Thr Val Ala Thr 210
21S 220
Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lya Gin Glu 225 230 235 240 456
Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin HiS Lys Asp Asp Asn Pro Asn 245 250 255 Leu Pro Arg Leu Vai Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe 260 26S 270 Kis Asp Asn Glu GlU Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala 275 280 285 Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 290 295 300 Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala 305 310 315 320 Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala 325 330 335 Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly 340 345 350 Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe 355 360 365 Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Vai Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr 370 375 380 Lys Vai His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp 385 390 395 400 Aap Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys Glu Asn Gin Asp Ser Ile 405 410 41S
Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser 420 425 430 His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro 43S 440 445 Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp val cys Lys Asn Tyr 450 455 460 Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 465 470 475 480 Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys 485 490 495 Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His 500 505 510 Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu val GlU Glu 515 520 525 457
Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly 530 535 540 Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Vai Arg Tyr Thr Lys Lys vai S4S 550 555 560 Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Vai Glu Vai Ser Arg Asn Leu Gly 565 570 57S Lys Vai Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 580 585 590 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Vai Vai Leu Asn Gin Leu Cys Vai Leu 59S 600 605 Hls Glu Lye Thr Pro Vai Ser Asp Arg Vai Thr Lys Cys Cys Thr Glu 610 615 620 Ser Leu Vai Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Vai Asp Glu 625 630 635 640 Thr Tyr vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 645 650 655 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr 660 665 670 Ala Leu Vai Glu Leu Vai Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin 675 680 685 Leu Lys Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Vai Glu Lye Cys Cys 690 695 700 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 705 710 715 720
Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 725 730 <210> 1623 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens 458 <400> 1623
Mec Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn 1 5 10 15 Ala Hia Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val ser Ser Tyr Leu Glu 20 25 30 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg ftie 35 40 45 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 50 55 60 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ala His 65 70 75 80 Lys Ser Glu Vai Ala Hia Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe 8S 90 95 Lys Ala Leu Vai Leu Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro 100 105 110 Phe Glu Asp Hia Val Lya Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys 115 120 125 Thr Cys Vai Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His 130 135 140 Thr Leu Phe Gly ASp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn 165 170 175 Glu Cys Phe Leu Gin Hls Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu 180 1Θ5 190 Vai Arg Pro Glu val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu 195 200 205 Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro 210 21S 220 459
Tyr ptie Tyr Ala Pro GlU Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala 225 230 235 240 Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu 245 250 255 Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lya 260 265 270 Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe 275 280 285 Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu 290 295 300 Phe Ala Glu Vai Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr 305 310 315 320 Glu Cye Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp 325 330 335 Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu 340 345 350 Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala 355 360 365 Glu Vai Glu Asn ASp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala 370 37S 380 Asp Phe Vai Glu Ser Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys 385 390 395 400 Asp Vai Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro 405 410 415 Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr 420 425 430 Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro HiS Glu Cys Tyr Ala 435 440 445 Lys Vai Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu 450 455 460 Ile Lys Gin Asn cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe 465 470 475 480 Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser 485 490 495 Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lya Val Gly Ser 500 S05 510 Lys Cys Cys Lys KiS Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp 515 520 525 460
Tyr Leu 530 Ser Vai Vai Leu Asn 535 Gin Leu Cye Vai Leu 540 HlS Glu Lys Thr Pro 545 Vai Ser Asp Arg Vai 550 Thr Lys Cye Cya Thr 555 Glu Ser Leu Val Asn 560 Arg Arg Pro Cya Phe 565 Ser Ala Leu Glu Vai 570 Asp Glu Thr Tyr Val 575 Pro Lys Glu Phe Asn sao Ala Glu Thr Phe Thr 505 Phe HlS Ala Asp Zle 590 Cys Thr Leu Ser Glu 59S Lys Glu Arg Gin ile 600 Lys Lys Gin Thr Ala 605 Leu val Glu Leu Vai 610 Lys HlS Lys Pro Lys 615 Ala Thr Lys Glu Gin 620 Leu Lys Ala Val Met S25 Asp Asp Phe Ala Ala 630 Phe vai Glu Lys Cys 635 Cys Lye Ala ASp Asp 640 Lys Glu Thr Cya Phe 645 Ala Glu Glu Gly Lys 650 Lys Leu Val Ala Ala 655 Ser Gin Ala Ala Leu 660 Gly Leu
<210> 1624 <211> 730 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1624 Met Arg Phe 1 Pro Ser S Ile Phe Thr Ala Val 10 Leu Phe Ala Ala Ser 15 Ser Ala Leu Ala Ala 20 Pro Val Asn Thr Thr 25 Thr Glu Asp Glu Thr Ala 30 Gin Ile Pro Ala 35 Glu Ala Val ile Gly Tyr 40 Ser Asp Leu Glu Gly Asp 45 Phe Asp Val 50 Ala Val Leu Pro Phe 55 ser Asn Ser Thr Asn 60 Asn Gly Leu Leu Phe 65 He Asn Thr Thr Ile 70 Ala Ser Ile Ala Ala Lys 75 Glu Glu Gly val 80 Ser Leu Asp Lys Arg 85 His Gly Glu Gly Thr 90 Phe Thr Ser Aep Val 95 Ser 461
Ser Tyr Leu Glu 100 Gly Gin Ala Ala Lys 10S Glu Phe He Ala Trp 110 Leu Val Lya Gly Arg 115 Hia Ala Glu Gly Thr 120 Phe Thr Ser Asp Val 125 ser ser Tyr Leu Glu 130 Gly Gin Ala Ala Lya 135 Glu Phe Ile Ala Trp 140 Leu Val Lya Gly Arg 145 Asp Ala Hia Lys Ser 150 Glu Vai Ala His Arg 155 Phe Lya Asp Leu Gly 160 Glu Glu Asn Phe Lya ies Ala Leu Vai Leu Ile 170 Ala Phe Ala Gin Tyr 175 Leu Gin Gin Cya Pro 180 Phe Glu Aap His Val ias Lya Leu Val Asn Glu 190 Val Thr Glu Pha Ala 195 Lya Thr Cya Vai Ala 200 λβρ Glu Ser Ala Glu 205 Asn Cye Aap Lya Ser 310 Leu Hia Thr Leu Phe 21S Gly Aap Lya Leu Cya 220 Thr Val Ala Thr Leu 325 Arg Glu Thr Tyr Gly 230 Glu Met Ala Asp Cya 235 Cya Ala Lya Gin Glu 240 Pro Glu Arg Aan Glu 245 Cya Phe Leu Gin Hia 250 Lya Aop Aap Aan Pro 255 Aan Leu Pro Arg Leu 280 vai Arg Pro Glu Val 265 Asp Val Mec Cya Thr 270 Ala Phe His Asp Asn 275 Glu Glu Thr Phe Leu 280 Lya Lya Tyr Leu Tyr 285 Glu Ile Ala Arg Arg 290 His Pro Tyr Phe Tyr 295 Ala Pro Glu Leu Leu 300 Phe Phe Ala Lya Arg 305 Tyr Lys Ala Ala Phe 310 Thr Glu Cya Cya Gin 315 Ala Ala Asp Lya Ala 320 Ala Cya Leu Leu Pro 325 Lya Leu Asp Glu Leu 330 Arg Asp Glu Gly Lya 335 Ala Ser Ser Ala Lya 340 Gin Arg Leu Lys Cya 345 Ala Ser Leu Gin Lya 350 Phe Gly Glu Arg Ala 355 Phe Lya Ala Trp Ala 360 Val Ala Arg Leu Ser 365 Gin Arg Phe Pro Lya 370 Ala Glu Phe Ala GlU 375 val Ser Lys Leu val 380 Thr Asp Leu Thr Lys 385 Vai His Thr Glu cya 390 Cya Hia Gly Asp Leu 395 Leu Glu Cya Ala Asp 400 462 Αβρ Arg Ala Asp Leu 405 Ala Lys Tyr Ile Cye 410 Glu Asn Gin Aap Ser 415 Ile Ser Ser Lya Leu 420 Lya Glu Cya Cys Glu 425 Lys Pro Leu Leu Glu 430 Lya Ser Hie Cye Zle 435 Ala Glu Val Glu Asn 440 Aap Glu Met Pro Ala 445 Aap Leu Pro Ser Leu 450 Ala Ala Asp Phe Val 455 Glu ser Lys Aap Val 460 Cys Lys Aan Tyr Ala 465 Glu Ala Lys Aap Val 470 Phe Leu Gly Met Phe Leu 47S Tyr Glu Tyr Ala 480 Arg Arg H±9 Pro Aap 485 Tyr Ser Val val Leu 490 Leu Leu Arg Leu Ala 49S Lys Thr Tyr Glu Thr 500 Thr Leu Glu Lys cys 505 Cya Ala Ala Ala Asp 510 Pro HiS Glu Cys Tyr SIS Ala Lys Val Phe Aap 520 Glu Phe Lys Pro Leu 525 Val Glu GlU Pro Gin 510 Asa Leu Ile Lys Gin 535 Asn Cys Glu Leu Phe 540 Glu Gin Leu Gly Glu Tyr 54S Lys Phe Gin Asn 550 Ala Leu Leu Val Arg Tyr SS5 Thr Lya Lys Val 560 Pro G1U Vai Ser Thr 565 Pro Thr Leu Val Glu S70 Val Ser Arg Asn Leu S7S Gly Lys Vai Gly Ser 5Θ0 Lys Çys Cys Lys Mis 585 Pro Glu Ala Lya Arg 590 Met Pro Cye Ala Glu 595 Asp Tyr Leu Ser val 600 Val Leu Asn Gin Leu S05 Cya Val Leu His Glu 610 Lys Thr Pro Val Ser 615 Asp Arg Val Thr Lys 620 Cys Cys Thr Glu Ser 625 Leu Vai Asn Arg Arg 630 Pro Cys Phe ser Ala Leu 635 Glu Val Asp Glu 640 Thr Tyr Vai Pro Lys 64S Glu Phe Asn Ala Glu 650 Thr Phe Thr Phe His 65S Ala Asp lie Cya Thr 660 Leu Ser Glu Lya Glu 66 5 Arg Gin Ile Lys Lys 670 Gin Thr Ala Leu Val 675 Glu Leu Val Lys His 6S0 Lys Pro Lya Ala Thr 685 Lys Glu Gin 463
Leu Lys Ala Vai Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Vai Glu Lys Cye Cys 690 695 700
Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 70S 710 71S 720
Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 725 730
<210> 1625 <211> 668 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1625 Met Lys Leu 1 Ala Tyr s Ser Leu Leu Leu Pro 10 Leu Ala Gly val Ser 15 Ala Ser Vai Ile Asn 20 Tyr Lye Arg His Gly Glu 25 Gly Thr Phe Thr 30 Ser ASp Vai Ser Ser 35 Tyr Leu Glu Gly Gin 40 Ala Ala Lys Glu Phe 45 lie Ala Trp Leu val 50 Lys Gly Arg HiS Ala 55 Glu Gly Thr Phe Thr 60 Ser Asp Val Ser Ser 65 Tyr Leu Glu Gly Gin 70 Ala Ala Lys Glu Phe 75 lie Ala Trp Leu Val 80 Lys Gly Arg Asp Ala 85 His Lys Ser Glu Val 90 Ala His Arg Phe Lys 95 Asp Leu Gly Glu Glu 100 Asn Phe Lys Ala Leu 105 Val Leu Ile Ala Phe 110 Ala Gin Tyr Leu Gin 115 Gin Cys Pro Phe Glu 120 Asp His val Lys Leu 125 Val Asn Glu Vai Thr 130 Glu Phe Ala Lys Thr 135 Cys Val Ala Asp Glu 140 Ser Ala Glu Asn Cys 145 Asp Lys Ser Leu His 150 Thr Leu Phe Gly Asp 155 Lys Leu Cys Thr Val 160 Ala Thr Leu Arg Glu 165 Thr Tyr Gly Glu Met 170 Ala Asp Cys Cys Ala 175 Lys Gin Glu Pro Glu 180 Arg Asn Glu Cys Phe 185 Leu Gin His Lys Asp 190 Asp Asn Pro ksn Leu 195 Pro Arg Leu Val Arg 200 Pro Glu Val Asp Val Met 205 Cys Thr 464
Ala Phe 210 HÍS Asp Asn Glu Glu 215 Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 220 Leu Tyr Glu Ile 225 Ala Arg Arg HiS Pro 230 Tyr Phe Tyr Ala Pro 235 Glu Leu Leu Phe Phe 240 Ala Lys Arg Tyr Lys 245 Ala Ala Phe Thr Glu 250 cys Cys Gin Ala Ala 255 ASp Lys Ala Ala Cys 260 Leu Leu Pro Lys Leu 265 Asp Glu Leu Arg Asp 270 Glu Gly Lys Ala Ser 275 Ser Ala Lys Gin Arg 280 Leu Lys Cys Ala Ser 285 Leu Gin Lys Phe Gly 290 Glu Arg Ala Phe Lys 2SS Ala Trp Ala Vai Ala 300 Arg Leu Ser Gin Arg 305 Phe Pro Lys Ala Glu 310 Phe Ala Glu Vai Ser 315 Lya Leu Val Thr Asp 320 Leu Thr Lys vai HiS 325 Thr Glu Cys Cys Kis 330 Gly Asp Leu Leu Glu 335 Cys Ala Asp Asp Arg 340 Ala Asp Leu Ala Lys 34S Tyr Ile Cys Glu Asn 350 Gin Asp Ser Ile Ser 35S Ser Lys Leu Lys Glu 360 Cys Cys Glu Lys Pro 365 Leu Leu Glu Lys Ser 370 His Cys lie Ala Glu 37S Vai Glu Asn Asp Glu 380 Met Pro Ala Asp Leu 38S Pro Ser Leu Ala Ala 3 90 Asp Phe Vai Glu Ser 39S Lys Asp Val Cys Lys 400 Asn Tyr Ala Glu Ala 405 Lys Asp Vai Phe Leu 410 Gly Ket Phe Leu Tyr 415 Glu Tyr Ala Arg Arg 420 His Pro Asp Tyr Ser 425 Vai Val Leu Leu Leu 430 Arg Leu Ala Lya Thr 43S Tyr Glu Thr Thr Leu 440 Glu Lys Cys Cys Ala 445 Ala Ala Asp Pro His 450 Glu Cys Tyr Ala Lys 455 Vai Phe Asp Glu Phe 460 Lys Pro Leu val Glu 465 Glu Pro Gin Asn Leu 470 Ile Lys Gin Aen Cys 475 Glu Leu Phe Glu Gin 480 Leu Gly Glu Tyr Lys 435 Phe Gin Asn Ala Leu 490 Leu Val Arg Tyr Thr 495 Lys 465
Lys Vai Pro Gin 500 Vai Ser Thr Pro Thr 50S Leu Vai Glu Val Ser Arg 510 Asn Leu Gly Lye 51S vai Gly Ser Lys Cys 520 Cys Lys Hls Pro Glu 52S Ala Lys Arg Met PcO 530 Cys Ala Glu Aep Tyr 53 5 Leu ser vai Vai Leu 540 Asn Gin Leu cys val 545 Leu Hia Glu Lys Thr 550 Pro vai Ser Asp Arg 555 Val Thr Lys Cys Cys 560 Thr Glu Ser Leu vai 565 Asn Arg Arg Pro cys 570 Phe Ser Ala Leu Glu 575 Val Asp GlU Thr Tyr 580 Vai Pro Lys Glu phe sas Asn Ala Glu Thr Phe 590 Thr Phe Hia Ala Asp 595 Ile Cys Thr Leu Ser 600 Glu Lye Glu Arg Gin 605 Ile Lys Lys Gin Thr 610 Ala Leu Vai Glu Leu 615 Vai Lys His Lys Pro 620 Lys Ala Thr Lys Glu 625 Gin Leu Lye Ala Vai 630 Met Asp Asp Phe Ala €35 Ala Phe Val Glu Lys 640 Cys Cys Lys Ala Asp 645 Asp Lys Glu Thr Cys 650 Phe Ala Glu Glu Gly 65S Lys Lys Leu vai Ala Ala ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 665
<210> 1626 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1626
Met Phe Lya Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn 1 5 10 15 Ala His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 20 25 30 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Hls 35 40 45 Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 50 SS 60 Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ala His 65 70 75 80 466
Lye Ser Glu Vai Ala 8S His Arg Phe Lys Asp 90 Leu Gly Glu Glu Asn 95 Phe Lys Ala Leu Vai 100 Leu Ile Ala Phe Ala 10S Gin Tyr Leu Gin Gin 110 Cys Pro Phe Glu Aap 115 Mis val Lys Leu val 120 Asn Glu val Thr Glu 125 Phe Ala Lys Thr Cye 130 Vai Ala Asp Glu Ser 135 Ala Glu Asn Cys Asp 140 Lys ser Leu His Thr 145 Leu Phe Gly A8p Lys 150 Leu cys Thr Val Ala 15S Thr Leu Arg Glu Thr 160 Tyr Gly Glu Mec Ala 165 Asp Cys Cys Ala Lys 170 Gin Glu Pro Glu Arg 17S Asn Glu Cys Phe Leu 180 Gin His Lys Asp Asp 185 Asn Pro Asn Leu Pro 190 Arg Leu Vai Arg Pro 195 Glu Val Asp Val Mec 200 Cys Thr Ala Phe His 205 Asp Asn. Glu Glu Thr 210 Phe Leu Lys Lys Tyr 215 Leu Tyr Glu Ile Ala 220 Arg Arg His Pro Tyr 225 Phe Tyr Ala Pro Glu 230 Leu Leu Phe Phe Ala 235 Lys Arg Tyr Lys Ala 240 Ala Phe Thr Glu Cys 245 Cys Gin Ala Ala Asp 250 Lys Ala Ala Cys Leu 255 Leu Pro Lys Leu Αβρ 260 Glu Leu Arg Asp Glu 265 Gly Lys Ala Ser Ser 270 Ala Lys Gin Arg Leu 275 Lya Cys Ala Ser Leu 280 Gin Lys Phe Gly Glu 285 Arg Ala Phe Lys Ala 290 Trp Ala Val Ala Arg 295 Leu Ser Gin Arg Phe 300 Pro Lys Ala Glu Phe 305 Ala Glu vai Ser Lya 310 Leu Val Thr Asp Leu 315 Thr Lys Val His Thr 320 Glu Cye Cys His Gly 325 Asp Leu Leu Glu Cys 330 Ala ASp ASp Arg Ala 335 Asp Leu Ala Lys Tyr 340 Zle Cys Glu Asn Gin 345 Asp Ser lie Ser Ser 350 Lys Leu Lys Glu Cys 355 Cys Glu Lys Pro Leu 360 Leu Glu Lys Ser His 365 Cys Ile Ala 467
GlU Vai 370 Glu Asn Asp Glu Met 375 Pro Ala Asp Leu Pro 380 Ser Leu Ala Ala Asp 385 Phe Vai Glu Ser Lye 390 Asp Val Cys Lys Asn 395 Tyr Ala Glu Ala Lys 400 Asp vai Phe Leu Gly 405 Met Phe Leu Tyr Glu 410 Tyr Ala Arg Arg His 415 Pro Asp Tyr Ser Vai 420 val Leu Leu Leu Arg 425 Leu Ala Lys Thr Tyr 43 0 Glu Thr Thr Leu Glu Lys 435 Cys Cys Ala Ala 440 Ala Asp Pro His Glu 445 Cys Tyr Ala Lys Vai 450 Phe Asp Glu Phe Lys 455 Pro Leu Val Glu Glu 460 Pro Gin Asn Leu lie 465 Lys Gin Asn Cys Glu 470 Leu Phe Glu Gin Leu 475 Gly Glu Tyr Lys Phe 460 Gin Asn Ala Leu Leu 485 Val Arg Tyr Thr Lys 490 Lys Val Pro Gin Val 495 Ser Thr Pro Thr Leu 500 val Glu Val Ser Arg 505 Asn Leu Gly Lys val 510 Gly Ser Lys Cys Cys 515 Lys His Pro Glu Ala S20 Lys Arg Met Pro Cys 525 Ala Glu Asp Tyr Leu 530 ser Vai Val Leu Asn 535 Gin Leu Cys Val Leu 540 His Glu Lys Thr Pro 545 Vai Ser Asp Arg val 550 Thr Lys Cys Cys Thr 555 Glu Ser Leu Val Asn 560 Arg Arg Pro cys Phe 565 Ser Ala Leu Glu val 570 Asp Glu Thr Tyr Val 575 Pro Lys GlU Phe Asn 580 Ala Glu Thr Phe Thr 585 Phe His Ala ASP Ile 590 Cys Thr Leu Ser Glu Lys 595 Glu Arg Gin Ile 600 Lys Lys Gin Thr Ala 605 Leu Val Glu Leu Vai 610 Lys His Lys Pro Lys 615 Ala Thr Lys Glu Gin 620 Leu Lys Ala Val Met Asp 625 Asp Phe Ala Ala 630 Phe Val Glu Lys Cys 635 Cys Lys Ala Asp Asp 640 Lys Glu Thr Cys Phe 645 Ala Glu Glu Gly Lys 650 Lys Leu Val Ala Ala 655 Ser
Gin Ala Ala Leu Gly Leu 660 468 <210> 1640
<211> 655 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1640
Met Lys Trp Val Ser Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lya Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Aap Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 35 40 45 Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 50 55 60 Phe Lys Aap Leu ciy Glu Αβρ Ala His Lys Ser Glu Val Ala Hia Arg 65 70 75 80 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 85 90 95 Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cya Pro Phe Glu Asp Hia Val Lys Leu 100 105 110 val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lya Thr Cys Val Ala Aap Glu Ser 115 120 125 Ala Glu Asn. Cya Asp Lya Ser Leu Hia Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 130 135 140 Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 145 150 1SS 160 Cys Ala Lya Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys 165 170 175 Aap Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu Val Asp Val ISO 18S 190 469
Met Cys Thr Ala Phe Kis Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 195 200 205 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 210 21S 220 Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin 22S 230 235 240 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg 245 250 255 Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser 260 265 270 Leu Gin Lya Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val Ala Arg 275 280 285 Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lya Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 290 295 300 Vai Thr Asp Leu Thr Lys Vai His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 305 310 315 320 Leu Glu Cya Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 325 330 335 Asn Gin Asp ser Ue Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 340 345 350 Leu Leu Glu Lys Ser His Cye Ile Ala Glu Vai Glu Asn ASp Glu Met 355 360 365 Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp 370 375 380 Vai Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu 405 410 415 Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 420 425 430 Ala Ala Asp Pro Mis Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys 435 440 445 Pro Leu Vai Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lya Gin Asn Cys Glu Leu 450 455 460 Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe GLn Asn Ala Leu Leu val Arg 465 470 475 480 Tyr Thr Lys Lys Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 485 490 495 470 ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 500 505 510 Ala Lye Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 515 520 525 Gin Leu Cye Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg val Thr 530 535 540 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 545 Ξ50 555 560 Leu Glu Val Aap Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ma Glu Thr 565 570 575 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin 580 585 590 Ile Lya Lya Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 595 600 605 Ala Thr Lya Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ma Ma Phe 610 615 620 Val Glu Lys Cye Cye Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ma Glu 625 630 635 640 Glu Gly Lye Lys Leu Val Ala Ma Ser Gin Ma Ma Leu Gly Leu 645 650 655 <210> 1727 <211> 180 <212> PRT <213> Homo 471 <400> 1727
Met Lys Ser Zle Tyr Phe Vai Ala Gly Leu Phe Val Met Leu Val Gin 1 5 10 15 Gly Ser Trp Gin Arg Ser Leu Gin Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 20 25 30 Phe Ser Ala Ser Gin Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gin Mee Asn 35 40 45 Glu Asp Lys Arg Mie Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lye 50 55 60 Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn 65 70 75 80 Thr Lys Arg Aen Arg Aen Asn xie Ala Lys Arg Hls Asp Glu Phe Glu 85 90 95 Arg Kis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 100 105 110 Gly Gin Ala Ala Lya Glu Phe Xle Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 115 120 125 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu val Ala Ile val Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140 Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Xle Leu Asp 14S 150 155 160 Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gin Thr Lys ile 165 170 175
Thr Asp Arg Lys 180 <210> 1731 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1731
Ala Qly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lya Thr Pha Thr Ser Cya 1 S 10 472
< 210 > 1775 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens < 9 0 0 > 1775
Met 1 Lys Ser ile Tyr 5 Phe Vai Ala Gly Ser Trp Gin 20 Arg Ser Leu Gin phe ser Ala 3S Ser Gin Ala Aap Pro 40 Glu Aap 50 Lya Arg Hia Ser Gin 55 Gly Tyr 65 Leu Asp Ser Arg Arg 70 Ala Gin Thr Lya Arg Aan Arg 85 Aan Asn ile Arg Hia Ala Glu 100 Gly Thr Phe Thr Gly Gin Ala 115 Ala Lya Glu Phe Xle 120 Arg Arg 130 Aap Phe Pro Glu Glu 135 Vai Arg 145 His Ala Aep Gly Ser 150 Phe Ser Asn Leu Ala Ala Arg 165 Asp Phe Ile Thr Asp Arg Lya ISO
Gly Leu 10 Phe Vai Met Leu Vai 15 Gin Asp 25 Thr Glu Glu Lya Ser 30 Arg Ser Leu Ser Asp Pro Aap 45 Gin Met Asn Thr Phe Thr ser 60 Asp Tyr Ser Lys Asp Phe Vai 75 Gin Trp Leu Mee Aan 80 Ala Lya 90 Arg Hia Aap Glu Phe 95 Glu Ser 10S Asp Vai Ser Ser Tyr 110 Leu Glu Ala Trp Leu Vai Lya 125 Gly Arg Gly Ala Ile Vai Glu 140 Glu Leu Gly Arg Asp Glu Mee 155 Aan Thr Ile Leu Aap 160 Asn Trp 170 Leu Ile Gin Thr Lys 175 Ile
<210> 1776 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens 473 <4 Ο 0> 1776
Met 1 Lys Ser Xle Tyr Phe 5 Vai Ala Gly Leu 10 Phe Val Met Leu Val 15 Gin Gly Ser Trp Gin 20 Arg Ser Leu Gin Asp Thr 2S Glu Glu Lya Ser 30 Arg Ser Phe Ser Ala 35 Ser Gin Ala Asp Pro 40 Leu Ser Asp Pro Asp 45 Gin Met Asn Glu Asp SO Lya Arg Hia Ser Gin Gly 5S Thr Phe Thr Ser 60 Asp Tyr Ser Lys Tyi 65 Leu Asp Ser Arg Arg 70 Ala Gin Asp Phe Vai 75 Gin Trp Leu Met Asn 80 Thr Lye Arg Asn Arg Asn 85 Asn He Ala Lys 90 Arg Mis Asp Glu Phe 95 Glu Arg Hia Ala Glu 100 Gly Thr Phe Thr Ser Aap 105 vai ser Ser Tyr 110 Leu Glu Gly Gin Ala 115 Ala Lys Glu Phe Ile 120 Ala Trp Leu Val Lys 12S Gly Arg Gly Arg Arg 130 Asp Phe Pro Glu Glu 135 Vai Ala Xle Val Glu 140 Glu Leu Gly Arg Arg 145 Hia Ala Asp Gly Ser 150 Phe Ser Asp Glu Met 155 Asn Thr ile Leu Asp 160 Asn Leu Ala Ala Arg Asp 165 Phe zle Asn Trp 170 Leu Ile Gin Thr Lys 175 Ile Thr Asp Arg Lye ISO <210> 1788 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1788
Met 1 Lys Ile Ser Val 5 Ala Ala Ile Pro Phe 10 Phe Leu Leu Ile Thr 15 Ile Ala Leu Gly Thr 20 Lys Thr Glu Ser Ser 25 Ser Arg Gly Pro Tyr 30 Hia Pro Ser Glu Cya 35 Cya Phe Thr Tyr Thr 40 Thr Tyr Lya Xle Pro 45 Arg Gin Arg Xle Met 50 Aap Tyr Tyr Glu Thr 55 Asn Ser Gin Cys Ser 60 Lya Pro Gly Ile 474
Vai Phe ile Thr Lya Arg Gly Mis 65 70
Lys Trp Vai Gin Asp Tyr tle Lys 85
<210> 1789 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1789
Met Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 1 S
Ser Vai Ile Aen Tyr Lys Arg Hia 20
Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 35 40
Leu Val Lys Gly Arg His Gly Glu 50 55
Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala 65 70
Lys Gly Arg
Ser val cys Thr Asn Pro Ser Asp 75 eo
Asp Met Lys Glu Asn 90
Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala 10 15
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 25 30
Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala Txp 45
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser 60
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val 75 80 <210> 1790 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1790 Met Arg Phe 1 Pro Ser Ile Phe Thr 5
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr 20
Xle Pro Ala Glu Ala Val Xle Gly 35 40
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser 50 55
Ala val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 10 15
Thr Thr- Glu Asp Glu Thr Ala Gin 25 30
Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 45
Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 60 475
Phe ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai 65 70 75 80
Ser Leu Asp Lys Arg Hia Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser 85 90 95
Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai 100 105 110
Lys Gly Arg Hia Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai Ser Ser Tyr 115 120 125
Leu Glu Gly Glxi Ala Ala Lys Glu Phe Xle Ala Trp Leu Vai Lys Gly 130 135 140
Arg 145
<210> 1791 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1791
Met Phe Lys Ser Vai Val Tyr Ser lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn 1 s 10 15 Ala Hls Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 20 25 30 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Hia 35 40 45 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 50 55 60 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 65 70 75
<210> 1792 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens 476 <400> 1792
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro val Aan Thr Thr Thr GlU Asp Glu Thr Ala Gin 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala val ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Aan ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe ile Aan Thr Thr Ile Ala Ser ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Aap Lye Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val Ser as 90 95 Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lye Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val 100 105 110 Lya Gly Arg HiS Ala Glu Gly Thr Phe Thr ser Aap Val ser Ser Tyr 115 120 125 Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lya Gly 130 135 140 Arg 145
<210> 1793 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 1 793 Met Lye Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser Val Ile Aan Tyr Lys Arg His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 20 25 30 Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp 35 40 45 Leu Val Lys Gly Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser 50 ss 60 477
Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai
Met Phe Lys ser Vai vai Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn 1 5 10 15 Ala His Gly oiu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 20 25 30 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg His 35 40 4S Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin so 55 60 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg 65 70 75 65 70 Lys Gly Arg <210> 1794 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1794
<210> 1808 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1808
Hia Gly Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp Vai Ser ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala Trp Leu vai Lys Gly Arg 20 2S 30 478 35 <210> 1922 <211> 35 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1922 aagctgcctt aggcttagct <210> 1923 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1923 cggccggggc gcgccttaac <210> 2004 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2004 gcacacggtg aaggtacttt <210> 2005 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2005 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc 39 26 26 479
<210> 2006 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2006 gcacacggtg aaggtacttt cãcttc 26
<210> 2007 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2007 ctttaaatcg atgagcaacc tcactc 26 <210> 2008 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2008 actgçtgatg cagçggccgc ccgtaatg 28 <210> 2009 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2009 catgatcttc aaatggacac t 480 <210> 2010 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2010 actgctgatg cagcggccgc ccgtaatg 28 <210> 2011 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 2011 catgatcttc aaatggacac t 21 <210> 2030 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2030 gcaggacctt accacccctc ag 22 <210> 2031 <211> 58 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2031 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct acccttaacc aaccaagc 58 481 20 <210> 2032 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2032 aattaaccct cactaaaggg <210> 2033 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2033 27 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa <210> 2034 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2034 gtcaatacct tcttgaacca <210> 2035 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2035 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 20 482 27 20 <210> 2036 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2036 gtcaatacct tcttgaacca <210> 2037 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2037 ctcccaaatc tttaaatcga <210> 2038 <211> 20 <212> ADN. <213> Homo sapiens <400> 2038 gtcaatacct tcttgaacca <210> 2039 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens 27 20 <400> 2039 27 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 483 20 <210> 2040
<211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2040 aattaaccct cactaaaggg <210> 2041 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2041 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 27 <210> 2042 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2042 gtcaatacct tcttgaacca <210> 2043 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens 20 <400> 2043 27 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa 484
<210> 2064 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2064 eatacaaact taacracrtcca
<210> 2065 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2065 ctcccaaatc tttaaatcga tgagcaa
<210> 2128 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2128
Met Lys Leu Lye Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala 1 5 10 15 Ser Gin Vai Leu Gly Gin Pro lie Asp Asp Thr Glu Ser Gin Thr Thr 20 25 30 Ser Val Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ala Thr Gla 35 40 45 Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Val Val Gly Leu Xle Ser Met Ala Lys 50 55 €0
Arg 65 485
<210> 2129 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2129
Mac Lys Leu Lys Thr val Arg ser Ala val Leu Ser Ser Leu Phe Ala 1 5 10 IS ser Gin Vai Leu Gly Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Gin Thr Thr 20 25 30 Ser Vai Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ala Thr Gin 35 40 45 Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Val Val Gly Leu Ile Ser Met Ala Glu 50 ss 60 Glu Gly Glu Pro Lys Arg 65 70
<210> 2132 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2132
Met Lys Vai Ser Vai Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Vai Thr Ala 15 10 15
Leu Gly Ser Gin Ala 20
<210> 2133 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens 486 <4Ο0> 2133
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Vai i S 10 IS
Ser Gly <210> 2134 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2134
Met Lya Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val 15 10 15
Ser Gly
<210> 2135 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2135
Met Phe l*ys Ser Val Val Tyr Ser lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn 1 5 Ala <210> 2136 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens 487 <400> 2136
Het Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Vai Gin Gly 15 10 15
Leu Glu Hia Thr Hl8 Arg Arg Gly Ser Leu Asp Lys Arg 20 25
<210> 2137 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2137
Met Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Vai Ser Ala 15 10 15 ser Vai Ile Asn Tyr Lys Arg 20
<210> 2138 <211> 394 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2138 gcggccgccg gatgcaaggg ttcgaatcce ctagctctca ttattttttg ctttttctct 60 cgaggtcaca tgatcgcaaa atggcaaatg gcacgtgaag ctgtcgatat tggggaactg 120 tggtggttgg caaatgacca attaagctag ccaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta 180 acataataac cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa 240 aaaataagat atatataagg ttaagtaaag cgtctgctag aaaggaagtt tttccttttt 300 cttgctctct tgtcttttca tctactattt cctfcegtgta atacagggtc gtcagataca 360 tagatacaat tctattaccc ccatccatac aatg 394 <210> 2139
<211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens 488 <4Ο0> 2139
Leu Asp Lys Arg 1 <210> 2140 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2140
Leu Glu Lys Axg 1 <210> 2160 <211> 180 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2160 cacggtgaag gtactttcac ttctgatgtt tcttcttact tggaaggtca agctgctaag 60 gaattcattg cttggttggt taagggtaga catggagagg gaacatttac atcagacgtc 120 tcatcatatt tagagggaca ggcagcaaaa gagtttatag catggttagt aaaaggaaga 130 <210> 2170 <211> 673 <212> PRT <213> Homo sapiens 489 <4Ο Ο> 2170
Mac Asn ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Vai Gin Gly 1 5 10 15 Leu Glu Hls Thr Hia Arg Arg Gly Ser Leu Αβρ Lys Arg His Gly Glu 20 25 30 Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala 35 40 45 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lya Gly Arg Hls Gly Glu Gly Thr 50 55 60 Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lya Glu 65 70 75 80 Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Glu Ala Hls Lys Ser Glu Ile 85 90 95 Ala Hia Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gin His Phe Lys Gly Leu Val 100 105 110 Leu Ile Ala Phe Ser Qln Tyr Leu Gin Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His 115 120 125 Ala Lys Leu Vai Gin Glu Vai Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cya val Ala 130 135 140 Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lya Ser Leu Hia Thr Leu Phe Gly 145 150 155 160 Asp Lya Leu Cya Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu 165 170 175 Ala Asp Cya Cya Thr Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu 180 185 190 Gin Kls Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu 195 200 205 Ala Glu Ala Met Cya Thr Ser Phe Lya Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met 210 215 220 Gly Hia Tyr Leu Hia Glu Vai Ala Arg Arg Hia Pro Tyr Phe Tyr Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gin Tyr Aan Glu Ile Leu Thr Gin 245 250 255 Cys Cya Ala Glu Ala Asp Lys Glu ser Cya Leu Thr Pro Lys Leu Asp 260 265 270 490
Oly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gin Arg Met Lys 275 280 285 Cys Ser Ser Met Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala 290 295 300 Val Ala Arg Leu Ser Gin Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile 305 310 31S 320 Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys val Asn Lys Glu Cys Cys His 325 330 335 Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr 340 345 350 Met Cys Glu Asn Gin Ala Thr ile Ser Ser Lys Leu Gin Thr Cys cys 355 360 365 Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala Hls Cys Leu Ser Glu val Glu His 370 375 380 Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu 3Θ5 390 395 400 Asp Gin Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu 405 410 415 Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg BiS Pro Asp Tyr Ser Val 420 425 430 Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys 435 440 445 Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala 450 4SS 460 Glu Phe Gin Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn 465 470 475 480 Cye Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gin Asn Ala Ile 48S 490 495 Leu Val Arg Tyr Thr Gin Lys Ala Pro Gin val Ser Thr Pro Thr Leu 500 SOS 510 Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr 515 520 S25 Leu Pro Glu Asp Gin Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala 530 535 540 Ile Leu Asn Arg val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu 54S 550 555 560 491
His Vai Thr Lys Cye 565 Cys ser Gly Ser Leu 570 Vai Glu Arg Arg Pro 575 Cys Phe Ser Ala Leu 580 Thr Vai Asp Glu Thr Tyr S8S Vai Pro Lya Glu 590 Phe Lya Ala Glu Thr 59S Phe Thr Phe His ser Asp Ile 600 Cys Thr Leu 605 Pro Glu Lya Olu Lya 610 Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu 615 Ala Glu 620 Leu vai Lya His Lys 62S Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gin Leu Lya 630 Thr 635 Vai Met Asp Aep Phe 640 Ala Gin Phe Leu Aep 645 Thr Cya Cye Lys Ala 6S0 Ala Asp Lys ASP Thr 655 Cys Phe Ser Thr Glu 660 Gly Pro Asn Leu Vai Thr 665 Ser Cys Lys Asp 670 Ala Leu
Ala
<210> 2180 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens
Glu Gly 15 His Gly Gin Ala <400> 2180 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr 1 5 Gin Ala Ala Ly9 Glu Phe Ile 20 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Aep 35 Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp 50 55
Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu 10 Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg 2S 30 Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 40 45 Leu Vai Lys Gly Arg 60 <210> 2194
<211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens 492 <4Ο0> 2194 29 aaacttaaga gtccaattag cttcatcgc <210> 2195 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2195 ccggaattcc ttagcagctt gacc 24
Lisboa, 9 de Agosto de 2013 493

Claims (31)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão de albumina compreendendo dois ou mais polipéptidos de GLP-1 orientados em tandem, em que (i) os referidos polipéptidos de GLP-1 são seleccionados de (a) GLP-1 de tipo selvagem; (b) GLP-1 (9-36); (c) GLP-1 (7-36); (d) GLP-1 (7-36(A8G)); (e) GLP-1 (7-36(A8S)); e (f) outros fragmentos de GLP-1 e/ou variantes de GLP-1, tendo actividade de GLP-1; fundidos a albumina compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1038, um fragmento de albumina ou seu variante de albumina, (ii) O referido fragmento de albumina ou variante de albumina aumenta a meia- -vida plasmática sérica dos polipéptidos de GLP-1 e (iii) a referida proteína de fusão tem actividade de GLP-1. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 1, em que os referidos polipéptidos de GLP-1 orientados em tandem são seleccionados de 1 (i) pelo menos uma sequência de GLP-1 de tipo selvagem fundida a, pelo menos, uma sequência de fragmento de GLP-1 tendo actividade de GLP-1; (ii) pelo menos uma sequência de GLP-1 de tipo selvagem fundida a, pelo menos, uma sequência de variante de GLP-1 tendo actividade de GLP-1; e (iii) pelo menos uma sequência de fragmento de GLP-1 fundida a, pelo menos, uma sequência de variante de GLP-1 tendo actividade de GLP-1.
  2. 3. Proteina de fusão de albumina da reivindicação 1, em que os referidos polipéptidos de GLP-1 orientados em tandem são seleccionados de dois GLP-1 orientados em tandem (7-36(A8G)).
  3. 4. Proteina de fusão de albumina da reivindicação 1, em que a referida proteína de fusão de albumina é produzida a partir de uma célula hospedeira compreendendo uma construção que expressa a referida proteína de fusão de albumina, em que a referida construção é seleccionada das seguintes construções, como definido na Tabela 2: (a) construção ID 2900; (b) construção ID 2964; (c) construção ID 2803; (d) construção ID 2804; (e) construção ID 2945; (f) construção ID 2982; (g) construção ID 3070; (h) construção ID 3027; (i) construção ID 3028; (j) construção ID 3045; 2 (k) construção ID 3 0 46; (D construção ID 3028; (m) construção ID 3071; (n) construção ID 3 0 72; (o) construção ID 3085; (p) construção ID 3086; (q) construção ID 3 0 8 7; (r) construção ID 3309; e (s) construção ID 2904.
  4. 5. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 1, em que a referida proteína de fusão de albumina compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada de (a) aminoácidos 1 a 30 da SEQ ID N°: 1808; (b) aminoácidos 100 a 127 da SEQ ID N°: 1249; e (c) aminoácidos 98 a 127 da SEQ ID N°: 630; em que a referida proteína de fusão tem actividade de GLP-1.
  5. 6. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 5, em que os referidos polipéptidos de GLP-1 compreendem (i) pelo menos duas sequências de aminoácidos de (a); (ii) pelo menos duas sequências de aminoácidos de (b); (iii) pelo menos duas sequências de aminoácidos de (c); (iv) pelo menos uma sequência de aminoácidos de (b) e, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de (c); ou (v) pelo menos uma sequência de aminoácidos de (a) e, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de (c). 3 7. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 1, em que a referida proteína de fusão de albumina compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em: (a) aminoácidos 25 a 669 da SEQ ID N° : 1231; (b) aminoácidos 25 a 669 da SEQ ID N° : 1232; (c) aminoácidos 25 a 669 da SEQ ID N° : 1233; (d) aminoácidos 25 a 667 da SEQ ID N° : 1234; (e) aminoácidos 25 a 669 da SEQ ID N° : 1235; (f) aminoácidos 25 a 66 9 da SEQ ID N° : 1236; (g) aminoácidos 25 a 667 da SEQ ID N° : 1237; (h) aminoácidos 30 a 674 da SEQ ID N° : 1280; (i) aminoácidos 20 a 6 6 4 da SEQ ID N° : 16 0 7; (j) aminoácidos 20 a 66 4 da SEQ ID N° : 1608; (k) aminoácidos 19 a 663 da SEQ ID N° : 1609; (D aminoácidos 19 a 663 da SEQ ID N° : 1610; (m) aminoácidos 24 a 6 6 8 da SEQ ID N° : 1621; (n) aminoácidos 87 a 730 da SEQ ID N° : 1622; (o) aminoácidos 18 a 662 da SEQ ID N° : 1623; (p) aminoácidos 87 a 730 da SEQ ID N° : 1624; (q) aminoácidos 24 a 668 da SEQ ID N° : 1625; (r) aminoácidos 18 a 662 da SEQ ID N° : 1626; (S) aminoácidos 30 a 673 da SEQ ID N° : 2170; e em que a referida proteína de fusão tem actividade de GLP-1.
  6. 8. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 1, em que a referida proteína de fusão é produzida a partir de uma célula hospedeira compreendendo a sequência de aminoácidos da construção 3070 contida no Depósito ATCC N° PTA-4671. 4 9. Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que os referidos polipéptidos de GLP-1 estão fundidos, no terminal N ou no terminal C, a albumina.
  7. 10. Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a referida proteína de fusão de albumina é qlicosilada ou não glicosilada.
  8. 11. Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a referida proteína de fusão de albumina é expressa em levedura.
  9. 12. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 11, em que a referida levedura é S. cerevisiae, K. lactis ou P. pastoris.
  10. 13. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 11 ou 12, em que a referida levedura é deficiente em glicosilação.
  11. 14. Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que a referida levedura é deficiente em glicosilação e protease.
  12. 15. Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a referida proteína de fusão de albumina é expressa por uma célula de mamífero.
  13. 16. Proteína de fusão de albumina da reivindicação 15, em que a referida célula de mamífero é uma célula CHO, uma célula COS ou uma célula NSO. 5
  14. 17 . Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 , em que a referida proteína de fusão de albumina compreende, ainda, uma sequência líder de secreção. 18 . Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a proteína de fusão de albumina é formulada com um veículo farmaceuticamente aceitável.
  15. 19. Polinucleótido codificando a proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
  16. 20. Vector compreendendo o polinucleótido da reivindicação 19.
  17. 21. Método de produção de uma proteína de fusão de albumina, compreendendo (a) a transformação de uma célula hospedeira compreendendo, pelo menos, um vector da reivindicação 20; (b) o cultivo da célula hospedeira em condições adequadas para a expressão da proteína de fusão de albumina; e (c) o isolamento da proteína de fusão de albumina.
  18. 22. Composição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
  19. 23. Proteína de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para utilização como um medicamento. 6
  20. 24. Proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para utilização no tratamento de hiperglicemia; diabetes; diabetes insipidus; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistência à insulina; deficiência de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM); obesidade; retinopatia; úlceras; supressão de peso corporal; supressão de apetite; síndrome X, distúrbios metabólicos, imunes e vasculares associados a diabetes e distúrbios cardiovasculares.
  21. 25. Utilização da proteína de fusão de albumina de qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para a preparação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia; diabetes; diabetes insipidus; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistência à insulina; deficiência de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM); obesidade; retinopatia; úlceras; supressão de peso corporal; supressão de apetite; síndrome X, distúrbios metabólicos, imunes e vasculares associados a diabetes e distúrbios cardiovasculares.
  22. 26. Proteína de fusão da reivindicação 24 ou utilização da reivindicação 25, em que o distúrbio é diabetes Tipo 2.
  23. 27. Proteína de fusão da reivindicação 24 ou utilização da reivindicação 25, em que o referido distúrbio cardiovascular é seleccionado do grupo consistindo em fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, 7 malformações arteriovenosas cerebrais, defeitos congénitos do coração, atresia pulmonar e Sindrome de Scimitar.
  24. 28. Proteína de fusão ou utilização da reivindicação 27, em que o referido defeito congénito do coração é seleccionado do grupo consistindo em coarctação aórtica, cor triatriatum, anomalias dos vasos coronários, coração cruzado, dextrocardia, canal arterioso patente, anomalia de Ebstein, complexo de Eisenmenger, sindrome do coração esquerdo hipoplásico, levocardia, tetralogia de Fallot, transposição dos grandes vasos, dupla via de saída de ventrículo direito, atresia tricúspide, tronco arterioso persistente e defeitos septais do coração, tais como defeito septal aortopulmonar, defeitos das almofadas endocárdicas, sindrome de Lutembacher, trilogia de Fallot e defeitos septais do coração ventricular.
  25. 29. Proteína de fusão da reivindicação 24 ou utilização da reivindicação 25, em que o referido distúrbio cardiovascular é seleccionado do grupo consistindo em doença cardíaca, arritmias, doença cardíaca carcinóide, débito cardíaco elevado, débito cardíaco baixo, tamponamento cardíaco, endocardite, aneurisma do coração, paragem cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, dispneia paroxística, edema cardíaco, hipertrofia do coração, cardiomiopatia congestiva, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia ventricular direita, ruptura do coração pós-enfarte, ruptura septal ventricular, doenças das válvulas do coração, doenças miocárdicas, isquemia miocárdica, efusão pericardíaca, pericardite, pneumopericárdio, sindrome pós-pericardiotomia, doença cardíaca pulmonar, doença cardíaca reumática, disfunção 8 ventricular, hiperemia, complicações cardiovasculares da gravidez, Sindrome de Scimitar, sífilis cardiovascular e tuberculose cardiovascular.
  26. 30. Proteína de fusão ou utilização da reivindicação 29, em que a referida arritmia é seleccionada do grupo consistindo em arritmia sinusal, fibrilação atrial, palpitação atrial, bradicardia, extra-sístole, sindrome de Adams-Stokes, bloqueio de ramo, bloqueio sinoatrial, sindrome do QT longo, parassístole, sindrome de Lown-Ganong-Levine, sindrome de pré-excitação de tipo Mahaim, sindrome de Wolff-Parkinson-White, sindrome do nó sinusal, taquicardias e fibrilação ventricular.
  27. 31. Proteína de fusão ou utilização da reivindicação 30, em que a referida taquicardia é seleccionada do grupo consistindo em taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia juncional ectópica, taquicardia de reentrada nodal sinoatrial, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes e taquicardia ventricular.
  28. 32. Proteína de fusão ou utilização da reivindicação 29, em que a referida doença das válvulas do coração é seleccionada do grupo consistindo em insuficiência da válvula aórtica, estenose da válvula aórtica, sopros do coração, prolapso da válvula aórtica, prolapso da válvula mitral, prolapso da válvula tricúspide, insuficiência da válvula mitral, estenose da válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiência da válvula pulmonar, estenose da válvula pulmonar, atresia 9 tricúspide, insuficiência da válvula tricúspide e estenose da válvula tricúspide.
  29. 33. Proteína de fusão ou utilização da reivindicação 29, em que a referida doença miocárdica é seleccionada do grupo consistindo em cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia congestiva, cardiomiopatia hipertrófica, estenose subvalvular aórtica, estenose subvalvular pulmonar, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia de Chagas, fibroelastose endocárdica, fibrose endomiocárdica, síndrome de Kearns, lesão de reperfusão miocárdica e miocardite.
  30. 34. Proteína de fusão ou utilização da reivindicação 29, em que a referida isquemia miocárdica é seleccionada do grupo consistindo em doença arterial coronária, angina de peito, aneurisma coronário, arteriosclerose coronária, trombose coronária, vasoespasmo coronário, enfarte do miocárdio, sideração miocárdica.
  31. 35. Proteína de fusão da reivindicação 24 ou utilização da reivindicação 25, em que o referido distúrbio cardiovascular é seleccionado do grupo consistindo em aneurismas, angiodisplasia, angiomatose, angiomatose bacilar, Doença de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, doenças aórticas, Arterite de Takayasu, aortite, síndrome de Leriche, doenças oclusivas arteriais, arterite, enarterite, poliarterite nodosa, distúrbios cerebrovasculares, angiopatias diabéticas, retinopatia diabética, embolias, trombose, eritromelalgia, hemorróides, doença veno-oclusiva hepática, hipertensão, hipotensão, isquemia, doenças vasculares periféricas, flebite, doença 10 doença de Raynaud, síndrome de veno-oclusiva pulmonar, CREST, oclusão de veia retiniana, síndrome de Scimitar, síndrome de veia cava superior, telangiectasi ataxia-telangiectasia, telangiectasia hemorrági hereditária , varicocele, veias varicosas, úlcera varicos vasculite e insuf iciênci a venosa. Lisboa, 9 de Agosto de 2013 11
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