KR20210121137A

KR20210121137A - 부갑상선 호르몬 변이체

Info

Publication number: KR20210121137A
Application number: KR1020217027077A
Authority: KR
Inventors: 클라크 팬; 앤젤라 노턴; 케빈 홈즈; 데이비드 로이드; 브라이언 굿윈; 롱신 시; 수지트 자인; 추안 셴
Original assignee: 샤이어-엔피에스 파마슈티칼즈, 인크.
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2021-10-07
Also published as: CA3128027A1; JP2022519061A; US20230340057A1; EP3917577A1; WO2020160118A1; EP3917577A4; AU2020216361A1; US11634468B2; US20200247865A1; CN113840625A

Abstract

본 발명은 부갑상선 호르몬 (PTH) 변이체, 및 상기를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 혈청 반감기 및 피크-트로프 비가 개선된 PTH 조성물, 및 본 발명의 PTH 변이체 및 조성물을 이용하여 혈청 칼슘 수준을 제어하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 PTH 변이체 및 조성물을 이용하여 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

부갑상선 호르몬 변이체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 1월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/798,113, 2019년 2월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/800,744, 및 2019년 8월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/884,730을 우선권 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본 발명은 부갑상선 호르몬 변이체, 및 상기를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 혈청 반감기가 개선된 부갑상선 호르몬 변이체 및 조성물, 및 본 발명의 부갑상선 호르몬 조성물을 이용하여 혈청 칼슘 수준을 제어하는 방법에 관한 것이다.

부갑상선 호르몬 (PTH)은 골을 비롯한 다양한 조직에 대해 작용함으로써 혈청 칼슘 수준을 제어하는, 포유동물의 부갑상선의 분비된, 84개 아미노산으로 이루어진 생성물이다. 특정 형태의 PTH를 이용한 인간에서의 연구는 골에 대한 동화작용 효과를 입증하였고, 골다공증 및 관련된 골 장애 뿐만 아니라, 부갑상선기능저하증 치료를 위한 그의 사용에 대한 상당한 관심을 불러일으켰다.

처음 34개의 N-말단 아미노산은 PTH에 대한 유일의 공지된 수용체인 "PTH1R"에서 전장 PTH(1-84)와 동일한 활성화를 보이는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Potts et al., Amer. Journ. of Med., 50: 639-649 (1971)]; [Potts et al., Proceed. of the 3rd Intern. Symp. of Endocrin., London, pp 333-349 (1971)]; [Tregear et al., Endocrin., 93: 1349-1353 (1973)]을 참조한다. 추가로, C-말단 단편, 예컨대 39-84 및 53-84는 수용체 결합에 대하여 1-34 단편과 경쟁하지 않는 것으로 제시된 바 있다. 추가로, 상기 C-말단 단편은 아데닐레이트 시클라제를 활성화시키지 않았으며, 이들 모두를 통해 PTH 펩티드의 C-말단부는 관련이 없다는 결론에 이르게 되었다. 문헌 [Segre et al., Journ. of Bio. Chem., 254: 6980-6986 (1979)]; [Nissenson et al., Journ. of Bio. Chem., 254: 1469-1475 (1979)]; [Potts et al., Adv. in Prot. Chem., 35: 323-396 (1982)]을 참조한다.

그러나, 비록 PTH의 C-말단 단부가 생물학적 활성에는 관련이 없는 것으로 간주되었지만, 정상적인 수송과 프로세싱을 위해서는 펩티드의 C-말단부가 필요한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Kemper et al., Proceed. of the Nat. Acad. of Sciences, 71: 3731-3735 (1974)]; [Freeman et al., Molec. Endocrin., 1: 628-638 (1987)]; [Wiren et al., Journ. of Bio. Chem., 263: 19771-19777 (1988)]; [Cioffi et al., Journ. of Bio. Chem., 264: 15052-15058 (1989)]; [Karaplis et al., Journ. of Bio. Chem., 270: 1629-1635 (1995)]; [Lim et al., Endocrin., 131: 2325-2330 (1992)]을 참조한다. 특히, 전장 PTH가 부갑상선 내에서 C-말단 단편으로 절단되고, 이들 단편은 혈중 증가된 칼슘 이온 농도에 대한 반응으로 분비된다는 증거가 존재한다. 무손상 PTH 형태를 제외한 N-말단 단편이 부갑상선 내에 저장되거나 또는 그로부터 분비된다는 증거는 현재까지 없었다. 문헌 [Habener et al., Nature-New Biol., 238: 152-154 (1972)]; [Flueck et al., Journ. of Clin. Invest., 60: 1367-1375 (1977)]; [Mayer et al., Endocrin., 104: 1778-1784 (1979)]; [Chu et al., Endocrin., 93: 915-924 (1973)]; [Habener et al., Endocrin., 97: 431-441 (1975)]; [Russell et al., Journ. of Clin. Invest., 72: 1851-1855 (1983)]; [Heinrich et al., Endocrin., 112: 449-458 (1983)]; [Brookman et al., Journ. of Bone & Min. Res., 1: 529-537 (1986)]; [Sherwood et al., Proceed. of the Nat. Acad. of Sciences, 67: 1631-1638 (1970)]; [Arnaud et al., Amer. Journ. of Med., 50: 630-638 (1971)]; [Hanley et al., Journ. of Clin. Invest., 62: 1247-1254 (1978)]; [Di Bella et al., Journ. of Clin. Endocrin. & Metab., 46: 604-612 (1978)]; [Roos et al., Journ. of Clin. Endocrin. & Metab., 53: 709-721 (1981)]; [MacGregor et al., Endocrin., 112: 1019-1025 (1983)]; [Hanley et al., Journ. of Clin. Endocrin. & Metab., 63: 1075-1079 (1986)]; [Morrissey et al., Endocrin., 107: 164-171 (1980)]; [MacGregor et al., Journ. of Biol. Chem., 261: 1929-1934 (1986)]; [MacGregor et al., Journ. of Biol. Chem., 254: 4428-4433 (1979)]; [Kubler et al., Experim. & Clin. Endocrin., 88: 101-108 (1986)]; [Schachter et al., Surgery, 110: 1048-1052 (1991)]; [Tanguay et al., Endocrin., 128: 1863-1868 (1991)]을 참조한다.

추가로, 현재 PTH의 C-말단 영역은 상기 호르몬의 이 영역에 대해 특이적인 신규한 수용체를 갖는다는 것은 자명하다. 예를 들어, 문헌 [Hodsman et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 88, pp. 5212-5220 (2003)]을 참조한다. 따라서, 전장 PTH는 N-말단 PTH 유사체의 것과는 상이한 생물학적 특성을 갖는다.

그러나, 골 성장, 칼슘 생리 및 보충에 대한 전장 부갑상선 호르몬의 중요성 및 효과는 예를 들어, 칼슘의 영향일 수도 있지만, 그렇게 쉽게 이해되지 못하고 있다. 혈중 PTH 수준의 정상적인 일일 상승 및 하강은 골에 지대한 영향을 미치며, PTH 주사는 골다공증으로 골이 소실된 경우 새로운 골의 성장을 자극할 수 있다.

부갑상선기능저하증은 부갑상선에 의한 부갑상선 호르몬 (PTH)의 부적절한 생산을 특징으로 하는 평생의 질환이다. PTH는 칼슘 및 포스페이트 수준 조절에 중요하기 때문에, PTH의 손실은 혈액과 골의 칼슘 수준을 감소시키고, 포스페이트 수준을 증가시킨다 (저칼슘혈증 및 고인산혈증). 저칼슘혈증은 예컨대 감각이상, 근육 경련, 후두 연축 (의료 제공자에게 근본적인 의학적 상태에 대해 말을 할 수 없고, 알리지 못하게 불능에 이르게 할 수 있으며, 이는 치료 지연 또는 잘못된 치료로 이어질 수 있음), 및 가능하게는 테타니 및 발작을 비롯한 신경근 과민성과 같은 증상을 일으킨다.

성공적으로 제제화된 다른 단백질과 달리, PTH는 특히 다양한 형태의 분해에 대해 감수성이다. 예를 들어, 위치 8 및 18의 메티오닌 잔기에서 산화가 발생할 수 있고, 이로써, 산화된 PTH 종 ox-M(8)-PTH 및 ox-M(18)-PTH가 생성되는 반면, 위치 16의 아스파라긴에서는 탈아미드화가 발생할 수 있고, 이로써, d16-PTH가 생성될 수 있다. 폴리펩티드 쇄는 N- 및 C-말단 둘 다에서 펩티드 결합의 절단에 의해 말단절단된다. 추가로, PTH는 또한 표면에 흡착되고/거나, 비특이적 응집체를 형성하고/거나, 침전함으로써 약물의 이용가능한 농도를 감소시킬 수 있다. 이러한 모든 분해 반응, 및 그의 조합이 PTH 생체활성의 부분적인 또는 완전한 손실을 초래한다. 따라서, PTH 제제는 이러한 분해 반응을 막아야 한다.

테리파라티드 (상표명 프로테오(Forteo)® 하에 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Co)에 의해 판매되고 있는 PTH(1-34))는 부갑상선기능저하증을 위한 칼시트리올 칼시트리올 요법에 대한 효과적인 대안인 것으로 확인되었고, 고칼슘뇨증 없이 정상적인 혈청 칼슘 수준을 유지시킬 수 있다.

최근, 전장 PTH(1-84)는 부갑상선기능저하증을 위한 안전한고 효과적인 치료로 승인을 받았다 (상표명 나트파라(NATPARA)® 하에 샤이어-NPS 파마슈티칼즈(Shire-NPS Pharmaceuticals)에 의해 판매). 이는 부갑상선기능저하증을 위한 최초의 특정의 호르몬 대체제이고, 1일 1회 피하 주사가능하고, 칼슘 및 비타민 D에 대한 보조제로서 복용되고 있다. 그러나, 생체내 반감기가 짧기 때문에, 나트파라의 인간 약동학적 프로파일은 빠른 클리어런스, 및 높은 피크-트로프 비를 나타내고, 그 결과로 상당한 일중 혈청 칼슘 변동, 및 소변 중 칼슘 수준 상승과 연관된 병태인 칼슘뇨 제어 불량을 초래한다.

따라서, 개선된 PTH 수용체 효능제, 특히, PTH 수용체에서 장기간의 활성을 갖고, 보다 정상 상태의 생리학적 프로파일을 갖는 효능제가 요구되고 있다. 문헌 [Winer KK et al., J. Clin . Endocrinol . Metab, 2003, 88(9), 4214-20]을 참조한다.

본 발명의 비-제한적인 다양한 측면 및 실시양태를 하기 기재한다.

한 측면에서, 부갑상선 호르몬 (PTH) 변이체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 PTH 변이체는 인간 IgG 항체의 Fc 영역, 또는 그의 유도체에 화학적으로 연결된 PTH, 또는 그의 변이체를 포함하는 PTH-Fc 융합 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH, 또는 그의 변이체는 전장 PTH (즉, PTH(1-84)), 또는 말단절단된 PTH, 예를 들어, C-말단 말단절단된 PTH 또는 그의 변이체일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-74), 또는 PTH(1-64), 또는 PTH(1-54), 또는 PTH(1-44)일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-34)가 아니다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 전장 PTH(1-84), 예를 들어, 돌연변이된 PTH (1-84)일 수 있다.

한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-35) 내지 PTH(1-83)의 임의의 길이의 것일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-33)일 수 있다.

한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-84), 또는 PTH(1-83), 또는 PTH(1-82), 또는 PTH(1-81), 또는 PTH(1-80), 또는 PTH(1-79), 또는 PTH(1-78), 또는 PTH(1-77), 또는 PTH(1-76), 또는 PTH(1-75), 또는 PTH(1-74), 또는 PTH(1-73), 또는 PTH(1-72), 또는 PTH(1-71), 또는 PTH(1-70), 또는 PTH(1-69), 또는 PTH(1-68), 또는 PTH(1-67), 또는 PTH(1-66), 또는 PTH(1-65), 또는 PTH(1-64), 또는 PTH(1-63), 또는 PTH(1-62), 또는 PTH(1-61), 또는 PTH(1-60), 또는 PTH(1-59), 또는 PTH(1-58), 또는 PTH(1-57), 또는 PTH(1-56), 또는 PTH(1-55), 또는 PTH(1-54), 또는 PTH(1-53), 또는 PTH(1-52), 또는 PTH(1-51), 또는 PTH(1-50), 또는 PTH(1-49), 또는 PTH(1-48), 또는 PTH(1-47), 또는 PTH(1-46), 또는 PTH(1-45), 또는 PTH(1-44), 또는 PTH(1-43), 또는 PTH(1-42), 또는 PTH(1-41), 또는 PTH(1-40), 또는 PTH(1-39), 또는 PTH(1-38), 또는 PTH(1-37), 또는 PTH(1-36), 또는 PTH(1-35), 또는 PTH(1-33)일 수 있다.

한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH의 아미노산 서열은 아미노산 치환, 부가, 또는 결실로부터 선택되는 추가 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 F34A 치환, F34D 치환, V35S 치환, 또는 V35T 치환, 또는 그의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는, 예를 들어, PEG화, 글리코실화되는 등의 변형으로 추가로 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PEG화된다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 글리코실화된다. 한 실시양태에서, Fc는 천연 Fc 형태이다. 또 다른 실시양태에서, Fc는 아미노산 치환, 부가, 또는 결실로부터 선택되는 추가 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc는 L234A 및 L235A 치환을 포함하는 hFcLALA이다. 다른 실시양태에서, Fc는 증가된 반감기 연장을 위해, 예를 들어, 문헌 [Yang et al., mAbs, 2017, 9, 1105]에 기재된 바와 같이, 및 관련 기술분야에 보편적으로 알려져 있는 다른 방법에 따라 변형될 수 있다.

한 실시양태에서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 8-11의 아미노산 서열을 갖는 Fc-연결된 PTH 변이체를 제공한다.

한 실시양태에서, 2가 구조체로서, 즉, 2개 카피의 PTH 및 1개 카피의 Fc를 갖는 본 발명에 따른 Fc-연결된 PTH 변이체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 1가 구조체로서, 즉, 1개 카피의 PTH 및 1개 카피의 Fc를 갖는 본 발명에 따른 Fc-연결된 PTH 변이체를 제공한다. 한 실시양태에서, 1가 PTH-Fc 변이체는 관련 기술분야에 공지된 중쇄 돌연변이 (예를 들어, 놉 앤드 홀(knob and hole) 등)를 사용하여 제조될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,679,785에 기재되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 1가 PTH-Fc 변이체는 단량체성 Fc를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 2개의 Fc 모이어티가 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 통해 연결될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기는 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 더 길다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질은 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 2배 더 긴, 또는 3배 더 긴, 또는 5배 더 긴, 또는 10배 더 긴, 또는 20배 더 긴, 또는 30배 더 긴, 또는 40배 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질은 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 40배 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, PTH-Fc 융합 단백질의 피크-트로프 비는 외인성 PTH(1-84)의 피크-트로프 비보다 더 낮다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질은 PTH(1-84)의 피크-트로프 비보다 적어도 2배 낮은 피크-트로프 비를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질는 PTH(1-84)의 피크-트로프 비보다 적어도 10배 낮은 피크-트로프 비를 갖는다.

일부 실시양태에서, PTH 변이체는, PTH 변이체와 직접 연결된 신호 펩티드를 포함하는 PTH 변이체 전구체 폴리펩티드로부터 프로세싱된다. 폴리펩티드 상의 신호 펩티드는 PTH 변이체를 생산하는데 사용되는 포유동물 숙주 세포로부터의 PTH 변이체 분비를 촉진시킬 수 있으며, 신호 펩티드는 분비 후 PTH 변이체로부터 절단될 수 있다. 임의의 개수의 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 하기 서열 (IgK 신호 펩티드): METPAQLLFLLLLWLPDTTG (서열식별번호: 3)를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 신호 펩티드는 하기 서열 (IgG 중쇄 신호 펩티드): MEFGLSWLFLVAILKGVQC (서열식별번호: 4)를 가질 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 신호 펩티드는 하기 서열 (CD33 신호 펩티드): MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 5)를 가질 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 5)를 갖는 CD33 신호 펩티드는 PTH 변이체의 위치 1을 무손상 상태 그대로 유지시키면서, 최적의 신호 펩티드 절단을 제공할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 적어도 하나의 PTH-Fc 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 적어도 하나의 PTH-Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 투여 형태 또는 본 발명의 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 투여 형태는 액체 투여 형태이다. 한 실시양태에서, 제약 투여 형태는 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합하다.

또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 PTH 변이체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, PTH-Fc 융합 변이체 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 PTH 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, PTH-Fc 융합 변이체 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 PTH 변이체를 코딩하는 발현 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, PTH-Fc 융합 변이체 단백질을 코딩하는 발현 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.

또 다른 측면에서, 혈청 칼슘 및 포스페이트 수준의 제어를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 PTH 변이체, 또는 본 발명의 PTH 변이체를 포함하는 제약 조성물, 또는 본 발명의 PTH 변이체를 포함하는 제약 투여 형태를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈청 칼슘 및 포스페이트 수준을 제어하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 소변 칼슘 수준의 제어를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 PTH 변이체, 또는 본 발명의 PTH 변이체를 포함하는 제약 조성물, 또는 본 발명의 PTH 변이체를 포함하는 제약 투여 형태를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 소변 칼슘 수준을 제어하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 부갑상선기능저하증을 가진 대상체에게 본 발명의 PTH 변이체, 또는 본 발명의 PTH 변이체를 포함하는 제약 조성물, 또는 본 발명의 PTH 변이체를 포함하는 제약 투여 형태의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 1일 2회, 또는 1일 1회, 또는 2일마다, 또는 3일마다, 또는 5-8일마다 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 1일 1회 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 주 1회 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 피하로 투여된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체의 용량은 집단내 변동에 기인하여 개체에 맞게 적정될 필요가 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 약 1 μg/일 내지 약 500 μg/일, 또는 약 2 μg/일 내지 약 250 μg/일, 또는 약 5 μg/일 내지 약 100 μg/일, 또는 약 10 μg/일 내지 약 80 μg/일, 또는 약 20 μg/일 내지 약 100 μg/일, 또는 약 50 μg/일 내지 약 100 μg/일, 또는 약 50 μg/일, 또는 약 60 μg/일, 또는 약 70 μg/일, 또는 약 80 μg/일, 또는 약 90 μg/일, 또는 약 100 μg/일의 양으로 투여된다.

본 발명의 이들 및 다른 측면은 첨부된 청구범위를 포함하는 본 발명의 하기 상세한 설명을 읽은 후에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해질 것이다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 수수료 납부시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 래트에게로의 단일 피하 투여 후 시간의 함수로서 상이한 C-말단 말단절단된 PTH-Fc 융합 변이체의 혈청 농도의 비교이다.
도 2(a-b)는 마우스에서의 단일 피하 투여 후 비히클 (포스페이트 완충제) 대조군과 비교하여 PTH-66 (PTH(1-74)-Fc 융합물)에 대한 시간의 함수로서 혈청 칼슘 (도 2a) 및 소변 칼슘 (도 2b) 농도를 제시한다.
도 3(a-b)는 다양한 농도로 단일 피하 주사 후 TxPTx 래트에서의 혈청 칼슘에 대한 PTH-66 (PTH(1-74)-Fc) 융합물의 PK (도 3a) 및 PD (도 3b) 데이터를 제시한다.
도 4(a-b)는 PTH-66을 PTH(1-84)와 비교하는 TPTx 래트로부터의 단일 투약 PK (도 4a) 및 PD (도 4b) 연구 데이터를 제시한다.
도 5(a-d)는 TPTx 래트에게 PTH-66을 매일 피하 투여한 것으로부터의 다회 투약 PK (도 5a) 및 PD (도 5b-d) 연구 데이터를 제시한다.
도 6(a-b)는 PTH-66을 PTH(1-84)와 비교하는 야생형 시노몰구스 원숭이로부터의 단일 투약 PK (도 6a) 및 PD (도 6b) 연구 데이터를 제시한다.
도 7은 매일 피하 투여한 후의, PTH-66을 비히클과 비교하는 야생형 시노몰구스 원숭이로부터의 다회 투약 PK 및 PD 연구 데이터를 제시한다.
도 8a는 2x 5 mL 맙 셀렉트 슈어(Mab Select Sure) 칼럼을 이용하여 PTH-66을 발현하는 ~900 mL CM의 미량의 크로마토그래피 정제를 도시한다. 도 8b는 본 발명의 실시양태에 따른 PTH-66의 정제 단계를 개략적으로 보여주는 흐름도이다.
도 9a는 PTH-66의 맙 셀렉트 조 용출 분획을 도시한다. 도 9b는 PTH-66의 맙 셀렉트 조 용출 분획에 대한 쿠마시 블루 염색을 도시한다.
도 10은 최종 PTH-66 생성물의 SDS-PAGE 쿠마시 염색을 도시한다.
도 11은 PTH-66 하류 프로세스 플로우를 도시한다.
도 12는 10% 미만의 단편화 표적을 충족시키는 PTH-66에 대한 생산 프로세스의 흐름도이다.
도 13a는 PTH-66 정제의 폴리싱 단계 개발에 대한 흐름도이고; 도 13b는 프로세스 플로우의 흐름도이다.
도 14a는 캅토(Capto) MMC ImpRes의 고처리량 스크리닝의 플롯이고; 도 14b는 최적의 결합 조건을 결정하는 캅토 어드히어(Capto Adhere) ImpRes의 고처리량 스크리닝의 플롯이고; 도 14c는 캅토 MMC의 화학 구조이고; 도 14d는 캅토 어드히어의 화학 구조이다.
도 15는 캅토 MMC ImpRes 프로세스 플로우를 도시한다.
도 16은 캅토 어드히어 ImpRes 프로세스 플로우를 도시한다.
도 17a는 캅토 MMC ImpRes를 이용한 PTH-66 구배 용출의 플롯이고; 도 17b는 캅토 어드히어 ImpRes를 이용한 PTH-66 유동-통과의 플롯이다.
도 18a는 PTH-66에 대한 하류 폴리싱 단계 디자인을 도시하고; 도 18b는 불순물 클리어런스 및 프로세스 수율에 기초한 안정한 풀을 이용하여 프로세스 강건성을 제시하는 그래프이다.
도 19a-f는 PTH-66의 파일럿 규모의 생산을 위한 프로세스 개발로부터의 수율 대비의 PTH-66의 정제를 위한 파일럿 플랜트 작동으로부터의 단계 수율을 도시한다.

본 발명의 상세한 실시양태가 본원에 개시되지만; 개시된 실시양태는 단지 다양한 형태로 구현될 수 있는 본 발명을 예시하는 것에 불과하다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명의 다양한 실시양태와 관련하여 제공된 각각의 예는 예시를 위한 것이며, 제한적인 것이 아니다. 그러므로, 본원에 개시된 구체적인 구조적 및 기능적 세부 사항은 제한적인 것으로 해석되어서는 안 되며, 단지 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 다양하게 이용할 수 있도록 교시하기 위한 대표적인 근거로서만 해석되어야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태는 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"이라고 언급하는 것은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법들, 및/또는 단계들을 포함하고/거나, 이는 본 개시내용을 읽을 때, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해질 것이다.

상태, 장애 또는 병태를 "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 (1) 상태, 장애 또는 병태에 걸릴 수 있거나, 또는 그에 취약할 수 있지만, 아직 상태, 장애 또는 병태의 임상적 또는 준임상적 증상을 경험하거나, 또는 보이지는 않은 대상체에서 발생할 수 있는 상태, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상의 발병 및/또는 출현 가능성을 예방, 지연 또는 감소시키거나; 또는 (2) 상태, 장애 또는 병태를 억제, 즉, 질환의 발생, 또는 그의 재발, 또는 그의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상을 정지, 감소 또는 지연시키거나; 또는 (3) 질환을 완화, 즉, 상태, 장애 또는 병태, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상들 중 적어도 하나를 퇴행시키는 것을 포함한다. 치료하고자 하는 대상체에 대한 이점은 통계학상 유의하거나 또는 적어도 환자 또는 의사에게 인지가능한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, "대상체" 또는 "환자" 또는 "개체" 또는 "동물"은 인간, 수의학 동물 (예를 들어, 고양이, 개, 소, 말, 양, 돼지 등) 및 질환을 가진 실험용 동물 모델 (예를 들어, 마우스, 래트)을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용량 또는 양에 적용되는 "유효한"이라는 용어는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하였을 때 원하는 활성을 일으키기 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 수량을 지칭한다. 활성 성분의 조합이 투여될 때, 조합의 유효량은 개별적으로 투여되는 경우 효과적이었을 각 성분의 양을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있음에 유의한다. 필요한 정확한 양은 개체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 사용되는 특정한 약물 또는 약물들, 투여 모드 등에 따라 대상체마다 달라질 것이다.

본 발명의 조성물과 관련하여 사용되는 "제약상 허용되는"이라는 어구는 생리학적으로 허용되고, 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여될 때 전형적으로 부작용을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 상기 조성물의 다른 성분을 지칭한다. 바람직하게, 본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는"이라는 용어는 포유동물, 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 것으로 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인을 받은 것이거나 또는 미국 약전, 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거되어 있다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, "담체" 및 "희석제"라는 용어는 제약 제제의 제조에 유용한 제약상 허용되는 (예를 들어, 인간에게 투여하기에 안전하고 비독성인) 담체 또는 희석 물질을 지칭한다. 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충처리된 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충처리된 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "융합 단백질" 및 "키메라 단백질"이라는 용어는 원래 별개인 2개 이상의 단백질 또는 그의 일부분의 연결을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 각 단백질 사이에 존재할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, "반감기"라는 용어는 단백질 농도 또는 활성과 같은 소정의 수량이 기간 시작 시점에 측정된 상기 값의 절반으로 떨어지는데 소요되는 시간이다.

본원에 사용된 바와 같은, "개선시키다", "증가시키다" 또는 "감소시키다"라는 용어, 또는 문법적 상당 어구는 기준선 측정값, 예컨대 본원에 기재된 치료를 시작하기 전에 동일한 개체에서의 측정값, 또는 본원에 기재된 치료 부재 하의 대조군 대상체 (또는 다수의 대조군 대상체)에서의 측정값 대비의 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료받는 대상체와 동일한 형태의 질환을 앓고 있으며, 치료받는 대상체와 거의 동일한 연령의 대상체이다.

본원에 사용된 바와 같은, "시험관내"라는 용어는 다세포 유기체 내보다는 인공 환경, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기 내에서, 세포 배양물 등에서 일어나는 이벤트를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "생체내"라는 용어는 다세포 유기체, 예컨대 인간 및 비-인간 동물 내에서 일어나는 이벤트를 지칭한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템과 대조되는) 살아있는 세포 내에서 일어나는 이벤트를 지칭하는데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "링커"라는 용어는 융합 단백질에서, 천연 단백질 내의 특정한 위치에 출현하는 것 이외의 다른 아미노산 서열 또는 유도체를 지칭하고, 일반적으로 가요성이 되도록 또는 2개의 단백질 모이어티 사이에 예컨대 α-나선과 같은 구조를 개재하도록 디자인된다. 링커는 또한 스페이서로서 지칭되기도 한다. 링커 또는 스페이서는 전형적으로 그 자체로는 생물학적 기능을 갖지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적 쇄를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하는데 사용되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 용어가 너무 긴 쇄로 제한되지 않고, 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 2개의 아미노산을 포함하는 최소 쇄를 지칭할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 폴리펩티드는 프로세싱되고/거나 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. "폴리펩티드"라는 용어는 또한 단백질을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "PTH 변이체"라는 용어는, 제한 없이, 아미노산 부가, 결실, 및/또는 치환을 포함하는 PTH(1-84) 유도체, 말단절단된 (예를 들어, C-말단 말단절단된) PTH(1-84), 직접, 또는 링커 또는 스페이서를 통해 펩티드 또는 단백질 또는 단백질 도메인에 융합된 PTH, 및 관련 기술분야에 공지된 임의의 방식으로 번역 후 변형된 PTH (예를 들어, 글리코실화된 PTH, PEG화된 PTH 등), 또는 그의 임의의 조합을 비롯한, 천연 PTH(1-84)의 임의의 유도체를 지칭한다.

PTH

부갑상선 호르몬 (PTH)은 포유동물의 부갑상선에 의해 분비되는 폴리펩티드이다. 천연 PTH 길이는 84개 아미노산 길이이고, 하기 서열 (서열식별번호: 1)을 갖는다:

본원에 사용된 바와 같은, "인간 PTH" 또는 "hPTH"라는 용어는 PTH 또는 부갑상선 호르몬이라는 용어에 포함된다. 인간 PTH는 생체내에서, (세포 내에서) 재조합적으로, 또는 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 합성에 의해 합성될 수 있다.

PTH - Fc 융합물

일부 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 PTH-Fc 융합 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같은, "Fc"는 인간 IgG 항체의 Fc 영역을 의미한다. Fc-융합 단백질 (Fc 키메라 융합 단백질, Fc-Ig, Ig-기반 키메라 융합 단백질 및 Fc-태그 단백질로도 공지됨)은 관심 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, PTH)에 화학적으로 연결된 IgG의 Fc 도메인으로 구성된다.

임의의 IgG로부터의 Fc 도메인이 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, IgG1, 또는 IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgG4의 Fc 도메인 뿐만 아니라, 예컨대, 예를 들어, 절반 IgG2 및 절반 IgG4로 이루어진 것과 같은, 상이한 IgG로부터 기원하는 Fc 도메인의 다양한 조합도 사용될 수 있다. 하나의 비-제한적인 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질은 인간 IgG1 항체의 Fc 도메인을 갖는다.

항체의 Fc 영역에서의 돌연변이에 의해 침묵화된 이펙터 기능을 수득할 수 있고, 상이한 IgG가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 상이한 사일런서 영역을 가질 수 있다. 예를 들어, IgG1의 경우, 하기 사일런서 영역이 공지되어 있고, 관련 기술분야에 기재되어 있다: LALA 및 N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); 및 D265A ([Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69]; [Strohl, W., 상기와 동일]). 침묵 Fc IgG1 항체의 예로 IgG1 Fc 아미노산 서열 중에 L234A 및 L235A (EU 넘버링) 돌연변이를 포함하는, 소위 LALA 돌연변이체 ("hFcLALA")라고 하는 것을 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 N297A 돌연변이를 포함하는데, 이를 통해 비글리코실화된/비-글리코실화된 항체가 생성된다.

본원에 사용된 바와 같은, IgG1 hFcLALA는 하기 서열을 가지며, 여기서 LALA 돌연변이는 밑줄로 표시되어 있다 (서열식별번호: 2):

PTH 서열은 Fc 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, PTH는 Fc 도메인에 직접적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, PTH는 아미노산 링커에 의해 Fc 도메인에 연결된다.

일부 실시양태에서, Fc 영역은 융합 단백질의 반감기를 추가로 연장시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 반감기 연장 기술, 예를 들어, ArGenX에 의한 NHance 기술이 본 발명의 PTH-Fc 변이체와 함께 조합하여 사용될 수 있다. NHance 기술은, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,163,881에 기재되어 있으며, 상기 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 Fc-연결된 PTH 변이체는 2가 구조체로서, 즉, 2개 카피의 PTH 및 1개 카피의 Fc를 갖는 구조체로서 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 Fc-연결된 PTH 변이체는 1가 구조체로서, 즉, 1개 카피의 PTH 및 1개 카피의 Fc를 갖는 구조체로서 제공된다. 한 실시양태에서, 1가 PTH-Fc 변이체는 관련 기술분야에 공지된 중쇄 돌연변이 (예를 들어, 놉 앤드 홀 등)를 사용하여 제조될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,679,785에 기재되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 1가 PTH-Fc 변이체는 단량체성 Fc를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 2개의 Fc 모이어티가 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 통해 연결될 수 있다.

신호 펩티드 및 프로테아제 태그

일부 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 PTH 변이체와 직접 연결된 신호 펩티드를 포함하는 PTH 변이체 전구체 폴리펩티드로부터 프로세싱된다. 폴리펩티드 상의 신호 펩티드는 PTH 변이체를 생산하는데 사용된 포유동물 숙주 세포로부터의 PTH 변이체의 분비를 촉진시킬 수 있으며, 상기 신호 펩티드는 분비 후 PTH 변이체로부터 절단된다. 다수의 신호 펩티드가 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 하기 서열 (서열식별번호: 3)을 갖는 IgK 리더 서열이 본 발명의 변이체에 존재한다:

METPAQLLFLLLLWLPDTTG.

일부 실시양태에서, 하기 서열 (서열식별번호: 4)을 갖는 IgG 중쇄 신호 펩티드가 본 발명의 변이체에 존재한다:

MEFGLSWLFLVAILKGVQC.

일부 실시양태에서, 하기 서열 (서열식별번호: 5)을 갖는 CD33 신호 펩티드가 본 발명의 변이체에 존재한다:

MPLLLLLPLLWAGALA.

하나의 특정한 실시양태에서, 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 5)를 갖는 CD33 신호 펩티드는 PTH 변이체의 위치 1을 무손상 상태 그대로 유지시키면서, 최적의 신호 펩티드 절단을 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리-히스티딘 태그 (HIS 태그)는 HIS 태그를 인식하고, 그에 결합하는 친화성 크로마토그래피 수지를 이용하는 PTH 단백질 정제가 수월하게 이루어질 수 있도록 하기 위해 본 발명의 변이체에 존재한다. 한 실시양태에서, TEV-HIS 태그는 본 발명의 PTH 변이체의 C-말단에 존재한다. TEV 성분은 단백질 정제 후 HIS 태그의 제거를 허용하는 프로테아제 인식 부위이다. 한 실시양태에서, TEV-HIS 태그의 서열은 ENLYFQSHHHHHH (서열식별번호: 6)이다. 한 실시양태에서, TEV 인식 서열의 일부분인 ENLYFQ (서열식별번호: 7)는 단백질 말단 상에 그대로 유지되며, 단백질의 활성에는 영향을 주지 않는다.

단백질 글리코실화

본원에 사용된 바와 같은, 글리코실화는 탄수화물 (글리칸)이 펩티드 또는 단백질에 부착되는 반응이다. 상이한 부류의 글리칸이 인정되는데, 가장 두드러진 2가지는 질소 또는 아르기닌 측쇄에 부착된 N-연결된 글리칸과 세린, 트레오닌, 티로신, 히드록시리신 또는 히드록시프롤린 측쇄의 히드록실 산소에 부착된 O-연결된 글리칸이다.

일부 실시양태에서, 글리코실화 부위를 삽입하기 위한 아미노산 치환이 본 발명의 PTH 변이체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 치환은 세린 모이어티를 PTH 변이체 내로 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 글리칸 부위를 PTH 변이체에 삽입하기 위해 F34A, F34D, 및/또는 V35S, 또는 V35T 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, F34 (예를 들어, F34A 또는 F34D) 및/또는 V35 (예를 들어, V35S 또는 V35T)에서의 아미노산 변이는 특정한 세포 유형, 예를 들어, CHO 세포에서 분자 발현 동안 이 부위에서 관찰되는 단백질분해를 최소화하기 위해 이루어질 수 있다. F34A 및 F34D 돌연변이는 단백질분해를 감소시킨다. F34A 및 V35S (또는 V35T) 돌연변이 조합이 단백질분해를 훨씬 더 큰 정도로 감소시킨다. 이러한 돌연변이는 위치 N33을 포함하는 컨센서스 N-연결된 글리코실화 부위를 생성한다. 이는 위치 N33에서 글리코실화를 초래하고, 이 위치에서의 단백질분해를 크게 감소시킨다.

일부 실시양태에서, N33에서의 글리칸 부위의 삽입은 숙주 세포 발현 동안 단백질 절단을 감소시킨다. 글리칸은 PTH 변이체에 추가 크기 및 부피를 도입한다. 글리칸 부위는 또한 PTH 변이체의 용해도를 개선시킬 수 있다. 글리칸 부위는 또한 PTH 변이체의 반감기 (T1/2)를 연장시킬 수 있다. 단백질 돌연변이 부위에의 글리칸 삽입은 또한 돌연변이된 서열의 잠재적인 면역원성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실화 부위를 삽입하기 위한 아미노산 치환은 PTH 변이체에 대한 다른 돌연변이 또는 서열 말단절단 또는 번역 후 변형과 함께 조합될 수 있다.

일부 실시양태에서, L59에서 아미노산 변이가 이루어질 수 있다 (예를 들어, L59S 또는 L59T). 상기 돌연변이는 위치 N57에 글리코실화 부위를 생성하며, 이는 숙주 세포 발현 동안 단백질 절단을 감소시킬 수 있다.

다른 변이체: 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 PTH 변이체로 도입되어 개발 가능성 특징을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 치환은 발현 동안 PTH 변이체 절단을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 치환은 PTH 변이체의 용해도를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 치환은 글리칸 삽입을 초래한다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 치환은 아스파르테이트를 서열 내로 도입할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 PTH 변이체는 발현 동안 단백질 절단을 감소시키기 위해 F34D 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, F34D를 함유하는 PTH 변이체는 PTH 변이체에 대한 다른 돌연변이 또는 서열 말단절단 또는 번역 후 변형과 함께 조합될 수 있다.

전형적으로, 적합한 PTH 변이체는 약 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 36시간, 38시간, 40시간, 42시간, 44시간, 46시간, 또는 48시간 이상의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체는 2 내지 48시간, 2 내지 44시간, 2 내지 40시간, 3 내지 36시간, 3 내지 32시간, 3 내지 28시간, 4 내지 24시간, 6 내지 24시간, 및 6 내지 18시간의 생체내 반감기를 갖는다.

선택된 부갑상선 호르몬 변이체의 목록

하기 목록 및 본 명세서 전반에 걸쳐, 하기 약어가 사용된다:

PTH(1-N)은 부갑상선 호르몬 펩티드 잔기 1부터 N까지를 의미하며, 여기서 N은 84 (천연 길이의 PTH 및 변이체의 경우), 또는 84 미만 (C-말단 말단절단된 PTH 변이체의 경우)일 수 있다. 예를 들어, PTH(1-84)는 부갑상선 호르몬 펩티드 잔기 1 내지 84 (전장 서열)를 의미하고; PTH(1-74)는 부갑상선 호르몬 펩티드 잔기 1 내지 74, 즉, 마지막 잔기 10개가 제거된 PTH의 처음 74개 잔기인 PTH(1-84)의 C-말단 말단절단된 변이체를 의미하고; PTH(1-34)는 부갑상선 호르몬 펩티드 잔기 1 내지 34, 즉, 마지막 잔기 50개가 제거된 처음 34개 잔기인 PTH(1-84)의 C-말단 말단절단된 변이체를 의미하는 등이다.

변이체 서열에서 점 돌연변이는 표준 협약에 따라 명명되고; 예를 들어, F34A는 위치 34의 페닐알라닌이 알라닌 아미노산에 의해 대체된 것을 의미하고; F34D는 위치 34의 페닐알라닌이 아스파르테이트 잔기에 의해 대체된 것을 의미하고, V35S는 위치 35의 발린이 세린에 의해 대체된 것을 의미하는 등이다.

Δ는 [결실된 서열]을 의미하고, 예를 들어, ΔLys는 리신 잔기가 제거된 것을 의미한다. 여기 포함된 구축물의 경우, 특히 약물 제품의 균질성 개선을 위해 Fc 분자의 C-말단 영역에서 Lys가 제거된다.

한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 전장 PTH(1-84), 예를 들어, 돌연변이된 PTH(1-84)일 수 있다.

한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-35) 내지 PTH(1-83)의 임의의 길이의 말단절단된 PTH일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-33)일 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, Fc에 연결된 PTH는 PTH(1-84), 또는 PTH(1-83), 또는 PTH(1-82), 또는 PTH(1-81), 또는 PTH(1-80), 또는 PTH(1-79), 또는 PTH(1-78), 또는 PTH(1-77), 또는 PTH(1-76), 또는 PTH(1-75), 또는 PTH(1-74), 또는 PTH(1-73), 또는 PTH(1-72), 또는 PTH(1-71), 또는 PTH(1-70), 또는 PTH(1-69), 또는 PTH(1-68), 또는 PTH(1-67), 또는 PTH(1-66), 또는 PTH(1-65), 또는 PTH(1-64), 또는 PTH(1-63), 또는 PTH(1-62), 또는 PTH(1-61), 또는 PTH(1-60), 또는 PTH(1-59), 또는 PTH(1-58), 또는 PTH(1-57), 또는 PTH(1-56), 또는 PTH(1-55), 또는 PTH(1-54), 또는 PTH(1-53), 또는 PTH(1-52), 또는 PTH(1-51), 또는 PTH(1-50), 또는 PTH(1-49), 또는 PTH(1-48), 또는 PTH(1-47), 또는 PTH(1-46), 또는 PTH(1-45), 또는 PTH(1-44), 또는 PTH(1-43), 또는 PTH(1-42), 또는 PTH(1-41), 또는 PTH(1-40), 또는 PTH(1-39), 또는 PTH(1-38), 또는 PTH(1-37), 또는 PTH(1-36), 또는 PTH(1-35), 또는 PTH(1-33)일 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시양태에 관한 하기 설명에서, 신호 펩티드는 이탤릭체로 표시되고, PTH 영역을 볼드체로 표시되고, 그 안의 임의의 돌연변이는 밑줄 표시되고, 임의의 융합 서열은 물결 밑줄 (~~~)로 표시되어 있다.

분자 명칭 'PTH-66' (서열식별번호: 8)

설명: PTH(1-74)-[F34A, V35S]-hFcLALA-ΔLys

신호 펩티드, PTH1 -74, 글리칸 부위를 삽입하는 돌연변이, Fc (물결 밑줄)

분자 명칭 'PTH-67' (서열식별번호: 9)

설명: PTH(1-64)-[F34A, V35S]-hFcLALA-ΔLys

신호 펩티드, PTH1 -64, 글리칸 부위를 삽입하는 돌연변이 , Fc (물결 밑줄)

분자 명칭 'PTH-68' (서열식별번호: 10)

설명: PTH(1-54)-[F34A, V35S]-hFcLALA-ΔLys

신호 펩티드, PTH1 -54, 글리칸 부위를 삽입하는 돌연변이 , Fc (물결 밑줄)

분자 명칭 'PTH-69' (서열식별번호: 11)

설명: PTH(1-44)-[F34A, V35S]-hFcLALA-ΔLys

신호 펩티드, PTH1 -44, 글리칸 부위를 삽입하는 돌연변이 , Fc (물결 밑줄)

분자 명칭 'PTH-11' (서열식별번호: 12)

설명: PTH(1-84)-hFcLALA

다른 PTH 변이체

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PTH 변이체는 알부민, 또는 알부민의 도메인에 직접, 또는 링커를 통해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PTH-알부민 융합물은 미국 특허 번호 7,592,010에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. PTH-알부민 변이체는 1가 구조체로서, 즉, 1개 카피의 PTH 및 1개 카피의 알부민, 또는 알부민의 도메인을 갖는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, PTH-알부민 융합 단백질의 혈청 반감기는 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 더 길다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-알부민 융합 단백질은 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 2배 더 긴, 또는 3배 더 긴, 또는 5배 더 긴, 또는 10배 더 긴, 또는 20배 더 긴, 또는 30배 더 긴, 또는 40배 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 PTH-Fc 융합 단백질은 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 40배 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.

한 실시양태에서, 알부민에 연결된 PTH는 돌연변이된 PTH(1-84), 또는 PTH(1-83), 또는 PTH(1-82), 또는 PTH(1-81), 또는 PTH(1-80), 또는 PTH(1-79), 또는 PTH(1-78), 또는 PTH(1-77), 또는 PTH(1-76), 또는 PTH(1-75), 또는 PTH(1-74), 또는 PTH(1-73), 또는 PTH(1-72), 또는 PTH(1-71), 또는 PTH(1-70), 또는 PTH(1-69), 또는 PTH(1-68), 또는 PTH(1-67), 또는 PTH(1-66), 또는 PTH(1-65), 또는 PTH(1-64), 또는 PTH(1-63), 또는 PTH(1-62), 또는 PTH(1-61), 또는 PTH(1-60), 또는 PTH(1-59), 또는 PTH(1-58), 또는 PTH(1-57), 또는 PTH(1-56), 또는 PTH(1-55), 또는 PTH(1-54), 또는 PTH(1-53), 또는 PTH(1-52), 또는 PTH(1-51), 또는 PTH(1-50), 또는 PTH(1-49), 또는 PTH(1-48), 또는 PTH(1-47), 또는 PTH(1-46), 또는 PTH(1-45), 또는 PTH(1-44), 또는 PTH(1-43), 또는 PTH(1-42), 또는 PTH(1-41), 또는 PTH(1-40), 또는 PTH(1-39), 또는 PTH(1-38), 또는 PTH(1-37), 또는 PTH(1-36), 또는 PTH(1-35), 또는 PTH(1-33)일 수 있다.

핵산

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 PTH 변이체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 서열은 서열식별번호: 8-12 중 임의의 것과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 추가의 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 지정된 단편, 변이체 또는 그의 컨센서스 서열, 또는 이들 서열 중 적어도 하나를 포함하는 기탁된 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 핵산 분자는 RNA, 예컨대 mRNA, hnRNA, tRNA의 형태 또는 임의의 다른 형태일 수 있거나, 또는 클로닝에 의해 수득되거나, 또는 합성에 의해, 예를 들어, AAV를 이용하는 유전자 요법을 통해 생산되는 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 DNA의 형태일 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 한 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 또한 공지된 코딩 가닥일 수 있거나, 또는 이는 안티센스 가닥으로도 또한 지칭되는 비코딩 가닥일 수 있다.

일부 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 핵산은 코딩된 PTH 변이체의 발현을 증가시키기 위해 변형될 수 있으며, 이는 또한 코돈 최적화로 지칭되기도 한다. 예를 들어, 트랜스진을 코딩하는 핵산은 코딩 서열에 대한 오픈 리딩 프레임을 변경함으로써 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "오픈 리딩 프레임"이라는 용어는 "ORF"와 동의어이며, 잠재적으로 단백질 또는 단백질의 일부분을 코딩할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 오픈 리딩 프레임은 일반적으로 출발 코돈 (예를 들어, RNA 분자의 경우, AUG로서 표시되고, 표준 코드의 DNA 분자에서는 ATG로서 표시됨)으로 시작하고, 프레임이 정지 코돈 (예를 들어, RNA 분자의 경우, UAA, UGA 또는 UAG로서 표시되고, 표준 코드의 DNA 분자에서는 TAA, TGA 또는 TAG로서 표시됨)으로 종료될 때까지 코돈-트리플렛으로 판독된다. 본원에 사용된 바와 같은, "코돈"이라는 용어는 단백질 합성 동안 특정한 아미노산을 지정하는 핵산 분자 중의 3개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 의미하고; 이는 또한 트리플렛 또는 코돈-트리플렛으로도 불린다. 예를 들어, 표준 유전자 코드 내의 64개의 가능한 코돈 중, GAA와 GAG라는 2개의 코돈은 아미노산 글루타민을 코딩하는 반면, 코돈 AAA와 AAG는 아미노산 리신을 지정한다. 표준 유전자 코드에서, 3개의 코돈은 아미노산을 지정하지 않는 정지 코돈이다. 본원에 사용된 바와 같은, "동의어 코돈"이라는 용어는 단일 아미노산을 코딩하는 임의의 모든 코돈을 의미한다. 메티오닌과 트립토판을 제외하고는, 아미노산은 2 내지 6개의 동의어 코돈에 의해 코딩된다. 예를 들어, 표준 유전자 코드에서 아미노산 알라닌을 코딩하는 4개의 동의어 코돈은 GCA, GCC, GCG 및 GCU이고, 글루타민을 지정하는 2개의 동의어 코돈은 GAA 및 GAG이며, 리신을 코딩하는 2개의 동의어 코돈은 AAA 및 AAG이다.

PTH 변이체의 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 핵산은 표준 코돈 최적화 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 다양한 상업적 알고리즘이 이용가능하고, 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 코딩된 아미노산 서열을 변경하지 않는다.

뉴클레오티드 변화는 PTH 변이체를 발현하도록 선택된 특정한 이종 세포에서 발견되는 내인성 코돈 사용빈도와 일치하도록 하기 위해 오픈 리딩 프레임 내에 있는 동의어 코돈을 변경할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 뉴클레오티드 변화는 이종 숙주 세포에 존재하는 내인성 핵산 서열에서 발견되는 오픈 리딩 프레임의 평균 G+C 함량과 더 잘 매칭되도록 오픈 리딩 프레임 내의 G+C 함량을 변경할 수 있다. 뉴클레오티드 변화는 또한 PTH 변이체 서열 내에서 발견되는 내부 조절 또는 구조적 부위 또는 폴리모노뉴클레오티드 영역을 변경할 수 있다. 따라서, 제한 없이, 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포에서의 PTH 변이체의 발현을 증가시키는 핵산 서열을 포함하는 다양한 변형 또는 최적화된 뉴클레오티드 서열이 구상된다.

본원에 명시된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 추가적 서열, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한, 전사, mRNA 프로세싱에서 역할을 하는 (예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정성) 전사된 비-번역 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가적 비-코딩 서열과 함께, 상기 언급된 추가적 코딩 서열, 예컨대 적어도 하나의 인트론이 있거나 또는 없는, 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 추가적 기능성을 제공하는 것과 같은 추가적 아미노산을 코딩하는 추가적 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, PTH 변이체 또는 지정된 부분를 코딩하는 서열은 PTH 변이체 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 PTH 변이체 또는 지정된 부분의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다.

핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위가 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열 (서열식별번호: 13)은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 임의적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.

트랜스진의 코딩 영역은 특정한 세포 유형에 대한 코돈 사용빈도를 최적화하기 위해 하나 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, PTH 변이체의 코돈은 척추동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체의 코돈은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체의 코돈은 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체의 코돈은 CHO 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.

본 출원에 기재된 바와 같은 PTH 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에서의 증식 또는 발현을 위해 적합한 벡터로 분자적으로 클로닝 (삽입)될 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서는 전체 플라스미드가 역시 합성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포로부터 PTH 변이체를 분비하는데 유효한 신호 펩티드를 포함하는 PTH 변이체 서열은 예컨대 서열식별번호: 8-12로부터 선택된 서열과 같은 적합한 벡터 내로 삽입된다. 제한 없이, 원핵 발현 벡터; 효모 발현 벡터; 곤충 발현 벡터 및 포유동물 발현 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 매우 다양한 발현 벡터가 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 예시적인 벡터는 바이러스 기반 벡터 (예를 들어, AAV 기반 벡터, 레트로바이러스 기반 벡터, 플라스미드 기반 벡터)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 적합한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로, PTH 변이체를 코딩하는 핵산은 다양한 조절 서열 또는 요소에 작동가능하게 연결된다.

다양한 조절 서열 또는 요소가 본 발명에 적합한 발현 벡터에 도입될 수 있다. 예시적인 조절 서열 또는 요소는 프로모터, 인핸서, 리프레서 또는 억제인자, 5' 비번역 (또는 비-코딩) 서열, 인트론, 3' 비번역 (또는 비-코딩) 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제와 (예를 들어, 직접적으로 또는 다른 프로모터 결합된 단백질 또는 물질을 통해) 결합할 수 있고, 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 일반적으로, 전사 개시 부위에 의해 그의 3' 말단에 결합되고, 임의의 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)로 연장된다. 프로모터는 인핸서 및 리프레서 서열을 비롯한 발현 제어 서열, 또는 발현되는 핵산과 작동가능하게 회합되거나 또는 그에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 단방향 또는 양방향일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터일 수 있으며, 여기서 전사 조절 영역을 함유하는 서열은 한 공급원으로부터 수득되고, 전사 개시 영역을 함유하는 서열은 제2 공급원으로부터 수득된다. 제어 요소를 트랜스진 내의 코딩 서열에 연결하기 위한 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (일반 분자 생물학적 및 재조합 DNA 기술은 문헌 [Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 설명되어 있음). 다양한 성장 및 유도 조건 하에서 다양한 숙주 세포에서의 발현을 위해 트랜스진을 삽입하기에 적합한 상업적 벡터 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포에서의 트랜스진의 발현을 제어하기 위한 특이적 프로모터, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, SRa-프로모터 (Takebe et al., Molec. and Cell. Bio. 8:466-472 (1988)), 인간 CMV 극초기 프로모터 ([Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)]; [Foecking et al., Gene 45:101-105 (1986)]), 인간 CMV 프로모터, 인간 CMV5 프로모터, 뮤린 CMV 극초기 프로모터, EF1-α-프로모터, 간 특이적 발현을 위한 하이브리드 CMV 프로모터 (예를 들어, 인간 α-1-항트립신 (HAT) 또는 알부민 (HAL) 프로모터 중 하나의 전사 프로모터 요소를 CMV 극초기 프로모터와 접합시킴으로써 제조), 또는 간암 특이적 발현을 위한 프로모터 (예를 들어, 여기서 인간 알부민 (HAL; 약 1,000 bp) 또는 인간 α-1-항트립신 (HAT, 약 2,000 bp) 중 하나의 전사 프로모터 요소가 인간 α-1-마이크로글로불린 및 비쿠닌 전구체 유전자 (AMBP)의 145개 길이의 인핸서 요소와 조합; HAL-AMBP 및 HAT-AMBP); SV40 조기 프로모터 영역 (Benoist et al., Nature 290:304-310 (1981)), 오르기이아 슈도트수가타(Orgyia pseudotsugata) 극초기 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)); 또는 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물의 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPTR) 프로모터, 아데노신 데아미나제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 베타-액틴 프로모터 뿐만 아니라, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 구성적 프로모터이다.

일부 실시양태에서, 원핵 숙주 세포에서는 트랜스진의 발현을 제어하기 위한 특이적 프로모터, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, β-락타마제 프로모터 (Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 (1978)); tac 프로모터 (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); T7 프로모터, T3 프로모터, M13 프로모터, 또는 M16 프로모터; 효모 숙주 세포에서는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, GAL1, GAL4 또는 GAL10 프로모터, ADH (알콜 데히드로게나제) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 III (TDH3) 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 II (TDH2) 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 I (TDH1) 프로모터, 피루베이트 키나제 (PYK), 에놀라제 (ENO), 또는 트리오스 포스페이트 이소머라제 (TPI)가 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 프로모터는 바이러스 프로모터일 수 있으며, 이들 중 다수는 포유동물 세포를 비롯한 여러 숙주 세포 유형에서의 트랜스진의 발현을 조절할 수 있다. 진핵 세포에서 코딩 서열의 구성적 발현을 구동시키는 것으로 제시되어 있는 바이러스 프로모터는, 예를 들어, 원숭이 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 프로모터, 유두종 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복부 (LTR), 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터 뿐만 아니라, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 바이러스 프로모터를 포함한다.

일부 실시양태에서, 발현 벡터의 유전자 제어 요소는 또한, 각각 전사 및 번역 개시와 관련된 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 코작(Kozak) 서열 등을 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위해 임의적으로 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서 작용하는 것으로 제시되어 있는 인핸서 요소의 예는 문헌 [Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761]에 기재된 바와 같은 SV40 조기 유전자 인핸서, 및 문헌 [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777]에 기재된 바와 같은 라우스 육종 바이러스 (RSV) 및 문헌 [Boshart et al., Cell (1985) 41:521]에 기재된 바와 같은 인간 시토메갈로바이러스의 긴 말단 반복부 (LTR)로부터 유래된 인핸서/프로모터를 포함한다. 발현 벡터의 유전적 제어 요소는 또한 각각 전사 및 번역 종결과 관련된 3' 비-전사 및 3' 비-번역 서열, 예컨대 프로모터로부터 전사된 mRNA의 3' 말단의 안정화 및 프로세싱을 위한 폴리아데닐화 (폴리A) 신호를 포함할 것이다. 예시적인 폴리A 신호는, 예를 들어, 토끼 베타 글로빈 폴리A 신호, 소 성장 호르몬 폴리A 신호, 닭 베타 글로빈 종결인자/폴리A 신호, 및 SV40 후기 폴리A 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 발현 벡터는 바람직하지만, 임의적으로, 적어도 하나의 선별가능한 마커를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 선별가능한 마커는 세포독성 화학물질 및/또는 약물의 존재 하에 성장할 때 생존능을 유지시킬 수 있는 능력을 숙주 세포에 부여하는, 하나 이상의 유전적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 내성 유전자를 코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 내에서의 발현 벡터의 보유를 유지시키기 위해 선별가능한 작용제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선별가능한 작용제는 발현 벡터 내에서의 트랜스진 서열의 변형 (즉, 메틸화) 및 /또는 침묵을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 내에서의 벡터의 에피솜 발현을 유지시키기 위해 선별가능한 작용제가 사용된다. 일부 실시양태에서, 선별가능한 작용제는 숙주 세포 게놈으로의 트랜스진 서열의 안정한 통합을 촉진시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 작용제 및/또는 내성 유전자는 진핵 숙주 세포의 경우, 메토트렉세이트 (MTX), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR, 미국 특허 번호 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017), 암피실린, 네오마이신 (G418), 제오마이신, 미코페놀산, 또는 글루타민 신테타제 (GS, 미국 특허 번호 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739); 원핵 숙주 세포의 경우, 테트라시클린, 암피실린, 카나마이신 또는 클로람페니콜; 및 효모 숙주 세포의 경우, URA3, LEU2, HIS3, LYS2, HIS4, ADE8, CUP1 또는 TRP1을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.

발현 벡터는 숙주 세포 내로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "형질감염", "형질전환" 및 "형질도입"이라는 용어는 모두 외인성 핵산 서열을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PTH Fc 융합물을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터는 동시에 숙주 세포 내로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터는 순차적으로 숙주 세포 내로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된다.

관련 기술분야에 널리 공지된 형질전환, 형질감염 및 형질도입 방법의 예는 리포솜 전달, 즉, 문헌 [Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193)]의 리포펙타민(Lipofectamine)™ (깁코(Gibco) BRL)방법, 전기천공, 문헌 [Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 CaPO₄ 전달 방법, DEAE-덱스트란 매개 전달, 미세주입, 바이오리스틱 입자 전달, 폴리브렌 매개 전달, 양이온성 매개 지질 전달, 형질도입, 및 바이러스성 감염, 예컨대, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 바큘로바이러스 (곤충 세포)를 포함한다.

일단 세포 내부에 도입되고 나면, 발현 벡터는 게놈에 안정적으로 통합되거나, 염색체외 구축물로서 존재할 수 있다. 벡터는 또한 증폭될 수 있고, 다중 카피가 게놈에 존재하거나 또는 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 PTH 변이체를 코딩하는 핵산의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 또는 그 초과의 카피를 함유할 수 있다.

숙주 세포

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 숙주 세포에서의 PTH 변이체의 발현을 허용하는 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있으며, 비-제한적인 예는 BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NSO/l, ECACC 번호: 85110503); 인간 망막모세포 [PER.C6, 크루셀 (CruCell: 네덜란드 라이덴)]; SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 HEK293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977]); 인간 섬유육종 세포주 (예를 들어, HT1080); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK21, ATCC CCL 10); CHO EBNA (Daramola O. et al., Biotechnol. Prog., 2014, 30(1):132-41) 및 CHO GS (Fan L. et al., Biotechnol. Bioeng. 2012, 109(4):1007-15)를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포일 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 발현 플라스미드 내에 있을 수 있다. 발현 플라스미드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 개수의 복제 기점을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 발현 플라스미드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방식에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 유동 전기천공 시스템, 예컨대 맥스사이트(MaxCyte) GT®, 맥스사이트 VLX® 또는 맥스사이트 STX® 형질감염 시스템을 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 발현 플라스미드를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 숙주 세포는 핵산을 발현한다. 숙주 세포는 유가식 세포 배양 규모 또는 다른 대규모에 충분한 수준으로 PTH 변이체를 발현할 수 있다. 대규모로 재조합 PTH 변이체를 생산하는 대체 방법은 롤러 병 배양, 생물반응기 배치 배양, 및 관류 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 PTH 변이체 단백질은 현탁 배양된 세포에 의해 생산된다. 일부 실시양태에서, 재조합 PTH 변이체 단백질은 부착 세포에 의해 생산된다.

생산

재조합 PTH 변이체는 임의의 이용가능한 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 재조합 PTH 변이체는 재조합 PTH 변이체-코딩 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포 시스템을 이용함으로써 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 재조합 PTH 변이체는 내인성 유전자를 활성화시킴으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 재조합 PTH 변이체는 화학적 합성에 의해 부분적으로 또는 완전히 제조될 수 있다. 대안적으로, 재조합 PTH 변이체는 mRNA 치료제 또는 AAV/렌티바이러스 유전자 요법에 의해 생체내에서 생산될 수 있다.

일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 재조합 PTH 변이체는 포유동물 세포에서 생산된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비-제한적인 예는 BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NSO/1, ECACC 번호: 85110503); 인간 망막모세포 [PER.C6, 크루셀: 네덜란드 라이덴)]; SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 HEK293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977]); 인간 섬유육종 세포주 (예를 들어, HT1080); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK21, ATCC CCL 10); CHO EBNA (Daramola O. et al., Biotechnol. Prog., 2014, 30(1):132-41) 및 CHO GS (Fan L. et al., Biotechnol. Bioeng. 2012, 109(4):1007-15)를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 재조합 PTH 변이체는 인간 세포로부터 생산된다. 일부 실시양태에서, 재조합 PTH 변이체는 CHO 세포 또는 HT1080 세포로부터 생산된다.

특정 실시양태에서, 숙주 세포는 세포 배양을 위해 선택된 특정한 조건 하에서 특정의 바람직한 속성 또는 성장에 기초하여 세포주를 생성하기 위해 선택된다. 이러한 속성은 확립된 세포주 (즉, 특징규명된 상업적으로 이용가능한 세포주)의 공지된 특징 및/또는 형질에 기초하여 또는 경험적 평가를 통해 확인될 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 세포의 피더 층에서 성장할 수 있는 능력에 대해 세포주를 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액에서 성장할 수 있는 능력에 대해 세포주를 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 부착성 단일층으로서 성장할 수 있는 능력에 대해 세포주를 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 우선적 번역 후 변형 (예를 들어, 글리코실화에 대해 세포주를 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 임의의 조직 배양 베슬 또는 적합한 접착 기질로 처리된 임의의 베슬과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 접착 기질은 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 I, II, II 또는 IV), 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 피브리노겐, BD 매트리겔(BD Matrigel)™, 기저막 매트릭스, 데르마탄 술페이트 프로테오글리칸, 폴리-D-리신 및/또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부착성 숙주 세포는 현탁액에서 성장하도록 특이적 성장 조건 하에서 선택 및 변형될 수 있다. 부착성 세포를 변형시켜 현탁액에서 성장시키는 상기 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 시간이 지남에 따라 성장 배지로부터 동물 혈청을 점진적으로 제거함으로써 현탁 배양에서 성장하도록 조절될 수 있다.

전형적으로, 재조합 PTH 변이체를 발현하도록 조작되는 세포는 본원에 기재된 재조합 PTH 변이체를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 재조합 PTH 변이체를 코딩하는 핵산은 조절 서열, 유전자 제어 서열, 프로모터, 비-코딩 서열 및/또는 재조합 PTH 변이체를 발현하기 위한 다른 적절한 서열을 함유할 수 있다는 것을 인식해야 한다. 전형적으로, 코딩 영역은 이들 핵산 성분 중 하나 이상과 작동가능하게 연결된다.

일부 실시양태에서, PTH 변이체는 배치 배양 방법을 사용하여 발현된다. 일부 실시양태에서, 배치 배양 기간은 7-14일 동안 지속될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배치 배양은 14-21일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체는 관류 배양 방법 (매일 시간이 경과함에 따라 배양 배지 수집)을 사용하여 발현된다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체는 가성관류 배양 방법 (새 배지로 교체하면서 매일 단일 시점에 배양 배지 수집)을 사용하여 발현된다. 일부 실시양태에서, 최적의 PTH 변이체 생산을 개선시키기 위해 (글리칸 개선, 클리핑 감소) 특정 피딩 요법/배지가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최적의 PTH 변이체 생산을 개선시키기 위해 (글리칸 개선/클리핑 감소) 세포 밀도가 제어/유지될 수 있다.

일부 실시양태에서, 재조합 PTH 변이체는 mRNA 치료제에 의해 생체내에서 생산된다. PTH 변이체를 코딩하는 mRNA를 제조하여 PTH 변이체를 필요로 하는 환자에게 투여한다. mRNA는 서열식별번호: 8-12의 DNA 서열에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 다양한 투여 경로, 예컨대 주사, 폐에서의 분무 및 피부 아래 전기천공이 사용될 수 있다. mRNA는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터에 캡슐화될 수 있다. 예시적인 비바이러스 벡터는 리포솜, 양이온성 중합체 및 큐보솜을 포함한다.

회수 및 정제

세포로부터 PTH 변이체를 정제하기 위한 다양한 수단이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 방법에 따라 생산된 PTH 변이체를 정제 또는 단리하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현된 단백질은 배지로 분비되는 바, 따라서, 예를 들어, 정제 프로세스의 제1 단계로서 원심분리 또는 여과에 의해 세포 및 다른 고체를 제거할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 발현된 단백질은 숙주 세포의 표면과 결합된다. 상기 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 숙주 세포는 정제를 위해 용해된다. 포유동물 숙주 세포의 용해는 유리 비드에 의한 물리적 파괴, 계면활성제 이용 및 높은 pH 조건에의 노출을 비롯한, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다수의 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, PTH 변이체는 불용성 분획 (봉입체)으로 발현될 수 있다. 상기 실시양태에서, 세포는, 예를 들어, 원심분리에 의해 수집되고, 관련 기술분야에 보편적으로 공지된 변성제를 이용하여 용해될 것이다.

PTH 변이체는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 크기 배제 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과, 원심분리 또는 차등 용해도, 에탄올 침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표준 방법에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 이용가능한 기술에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987]; [Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999]; 및 [Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997] (상기 문헌은 모두 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 특히 면역친화성 크로마토그래피의 경우, 단백질에 대하여 생성되고, 고정 지지체에 부착된 항체를 포함하는 친화성 칼럼에 결합시킴으로써 단백질을 단리할 수 있다. 대안적으로, 친화성 태그, 예컨대 인플루엔자 코트 서열, 폴리-히스티딘 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제는 적절한 친화성 칼럼을 통과하여 쉽게 정제할 수 있도록 표준 재조합 기술에 의해 단백질에 부착될 수 있다. 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF), 류펩틴, 펩스타틴 또는 아프로티닌은 정제 프로세스 동안 폴리펩티드 또는 단백질의 분해를 감소시키거나, 제거하기 위해 임의의 또는 모든 스테이지에서 부가될 수 있다. 프로테아제 억제제는 발현된 폴리펩티드 또는 단백질을 단리하고, 정제하기 위해 세포를 용해시켜야 하는 경우에 특히 바람직하다.

PTH 변이체 또는 지정된 부분은 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 (예를 들어, MEP 하이퍼셀(Hypercel)™), 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC") 또한 정제를 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1997-2003)]을 참조한다.

PTH-Fc 융합 단백질의 응집/침전을 회피하기 위해 단백질 A 정제 후 중화가 조심스럽게 수행되어야 한다.

본 발명의 PTH 변이체 또는 지정된 부분은 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 방법의 생성물, 및 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 방법에 이용된 숙주 및 특정 PTH 변이체에 따라, 본 발명의 PTH 변이체 또는 지정된 부분은 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다.

제제

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 적합한 허용되는 담체는 물, 염 용액 (예를 들어, NaCl), 염수, 완충처리된 염수, 알콜, 글리세롤, 에탄올, 아라비아 검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예컨대 락토스, 아밀로스 또는 전분, 당, 예컨대 만니톨, 수크로스 등, 덱스트로스, 스테아르산마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등 뿐만 아니라, 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약 제제는 원하는 경우, 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않거나 또는 그의 활성을 방해하지 않는 보조제 (예를 들어, 희석제, 완충제, 친유성 용매, 보존제, 아주반트, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 향미제 및/또는 방향족 물질 등)와 혼합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정맥내 투여에 적합한 수용성 담체가 사용된다.

제약상 허용되는 보조제가 바람직하다. 이러한 멸균 용액의 비-제한적인 예 및 제조 방법은, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 문헌 [Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^thEdition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990]에서와 같이, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 PTH 변이체 조성물의 투여 모드, 용해도 및/또는 안정성에 적합한 제약상 허용되는 담체가 통상적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 약산성 또는 생리적 pH의 멸균 염수 및 포스페이트 완충처리된 염수가 사용될 수 있다. pH 완충화제는 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), 중탄산암모늄, 디에탄올아민, 히스티딘 (바람직한 완충제), 아르기닌, 리신 또는 아세테이트 또는 그의 혼합물일 수 있다. 바람직한 완충제 범위는 pH 4-8, 또는 pH 6.5-8, 또는 pH 7-7.5이다. 보존제, 예컨대 파라, 메타 및 오르토-크레졸, 메틸- 및 프로필-파라벤, 페놀, 벤질 알콜, 벤조산 나트륨, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로판산, p-히드록시벤조산의 에스테르가 제약 조성물에 제공될 수 있다. 산화, 탈아미드화, 이성질화, 라세미화, 고리화, 펩티드 가수분해를 방지하는 안정화제, 예컨대, 예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 트립토판, EDTA, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 글루타민 및 글리신이 제약 조성물에 제공될 수 있다. 응집, 세동 및 침전을 방지하는 안정화제, 예컨대 소듐 도데실 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로스, 시클로덱스트린이 제약 조성물에 제공될 수 있다. 가용화 또는 응집 방지를 위한 유기 개질제, 예컨대 에탄올, 아세트산 또는 아세테이트 및 그의 염이 제약 조성물에 제공될 수 있다. 등장성 메이커, 예컨대 염, 예를 들어, 염화나트륨 또는 탄수화물, 예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 수크로스 또는 그의 혼합물이 제약 조성물에 제공될 수 있다.

본 조성물에 유용한 제약 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물 (예를 들어, 모노사카라이드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카라이드를 비롯한 당; 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 폴리사카라이드 또는 당 중합체)를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있고, 단독으로 또는 조합하여 1-99.99 중량% 또는 부피%로 포함된다. 예시적인 단백질 부형제는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카제인 등을 포함한다. 완충 능력에서도 작용할 수 있는 대표적인 아미노산/PTH 변이체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 하나의 바람직한 아미노산은 글리신이다.

탄수화물 부형제, 예를 들어, 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨, 소르비톨 (글루시톨), 미오이노시톨 등이 사용될 수 있다.

PTH 변이체 조성물은 또한 완충제 또는 pH 조정제를 포함할 수 있으며; 전형적으로, 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 예시적인 완충제는 유기 산 염, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스, 트로메타민 히드로클로라이드 또는 포스페이트 완충제를 포함한다.

추가적으로, 본 발명의 PTH 변이체 조성물은 중합체성 부형제/첨가제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 피콜 (중합체성 당), 덱스트레이트 (예를 들어, 시클로덱스트린, 예컨대 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미료, 항산화제, 정전기 방지제, 계면 활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 "트윈(TWEEN) 20" 및 "트윈 80"), 지질 (예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤), 및 킬레이트제 (예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 PTH 변이체 조성물에 사용하기 적합한 이들 및 추가적 공지된 제약 부형제 및/또는 첨가제는, 예를 들어, 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21^st ed., Williams & Williams, (2005)]에, 및 ["Physician's Desk Reference", 71^st ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2017)] (그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 열거된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 염 (예를 들어, 염화나트륨), 탄수화물 (예를 들어, 만니톨) 및 완충제 (예를 들어, 시트레이트)이다.

제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체로서 제제화될 수 있다. 이러한 액체는 하나 이상의 용매를 포함할 수 있다. 예시적인 용매는 물; 알콜, 예컨대 에탄올 및 이소프로필 알콜; 식물성 오일; 폴리에틸렌 글리콜; 프로필렌 글리콜; 및 글리세린 또는 그의 혼합 및 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 정맥내 투여에 적합한 수용성 담체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 정맥내 투여용 조성물은 전형적으로 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 수량을 표시하는 앰플 또는 사체트와 같은 밀폐된 용기에, 예를 들어, 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서의 단위 투여 형태로 별도로 공급되거나 또는 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 멸균 제약 등급의 물, 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병으로 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 이전에 성분이 혼합될 수 있도록, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 제제는 바람직하게, 염수 또는 선택된 염을 포함하는 적합한 완충제 뿐만 아니라, 보존제를 함유하는 임의적 보존된 용액 및 제제 뿐만 아니라, 제약상 허용되는 제제 중에 적어도 하나의 PTH 변이체를 포함하는, 제약 또는 수의학 용도에 적합한 다회용 보존된 제제를 포함할 수 있다. 보존된 제제는 적어도 하나의 공지된 보존제 또는 적어도 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 아질산페닐제2수은, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 6수화물), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 수성 희석제 중의 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 임의적으로 선택된 보존제를 함유한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 농도 또는 혼합물, 예컨대 0.001-5%, 또는 그 안에 있는 임의의 범위 또는 값, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4., 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안에 있는 임의의 범위 또는 값이 사용될 수 있다. 비-제한적인 예는 보존제 무함유, 0.1-2% m-크레졸 (예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜 (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1., 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티메로살 (예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001-2.0% 페놀 (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤(들) (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.

PTH 변이체는 비경구 투여용으로 제제화될 수 있으며, 통상의 부형제로서 멸균수 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라 적절한 유화제 또는 가습제 및 현탁화제를 사용함으로써 제조될 수 있다. 주사용 작용제는 수용액 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액과 같은 비-독성, 비경구 투여가능한 희석제일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장 염수 등이 허용되고; 통상적인 용매 또는 현탁화 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 디- 또는 트리-글리세리드를 비롯한, 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 통상적인 주사 수단, 미국 특허 번호 5,851,198에 기재된 바와 같은 가스 가압식 무바늘 주사 장치, 및 미국 특허 번호 5,839,446에 기재된 바와 같은 레이저 천공기 장치를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

제약 조성물은 연장 방출 제제일 수 있다. 제약 조성물은 또한, 예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 PTH 변이체의 지속 방출, 연장 방출, 지연 방출 또는 저속 방출용으로 제제화될 수 있다. 제어 방출 및 지속 방출로서도 공지된 연장 방출이 주사가능한 제제에 제공될 수 있다. 마이크로스피어, 나노스피어, 임플란트, 데포 및 중합체는 연장 방출 프로파일을 제공하기 위해 본원에 기재된 화합물, 방법 및 제제 중 임의의 것과 함께 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의, 예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 PTH 변이체는 약 0.001 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 0.005 내지 약 50 mg/mL, 또는 약 0.007 내지 약 20 mg/mL, 또는 약 0.01 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.05 내지 약 5.0 mg/mL, 또는 약 0.07 내지 약 2.0 mg/mL, 또는 약 0.1 내지 약 1.0 mg/mL의 농도로 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, PTH 변이체는 약 0.01 내지 약 10 mg/mL의 농도로 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, PTH 변이체는 약 0.1 내지 약 1.0 mg/mL의 농도로 제제화될 수 있다.

PTH 변이체를 포함하는 제제 및 조성물은 임의적으로, 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 약물, 항감염 약물, 심혈관 (CV) 계 약물, 중추 신경계 (CNS) 약물, 자율 신경계 (ANS) 약물, 호흡기 약물, 위장 (GI) 관 약물, 호르몬 약물, 유체 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역조정 약물, 눈, 귀 또는 비강용 약물, 국소 약물, 영양 약물 등 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효량으로 추가로 포함할 수 있다. 상기 약물은 본원에 각각에 대해 제시된 제제, 적응증, 투약 및 투여를 포함하여 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21^st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001]; [Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ]; [Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).

PTH 변이체는 또한 PTH 변이체의 연장 또는 지속 투여를 위한 저속 방출 이식 장치로서 제제화될 수 있다. 상기 지속 방출 제제는 신체 외부에 위치하는 패치의 형태일 수 있다. 지속 방출 제제의 예는 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 메틸셀룰로스, 히알루론산, 시알산, 실리케이트, 콜라겐, 리포솜 등의 복합체를 포함한다. PTH 변이체 펩티바디의 높은 국소 농도를 제공하는 것이 바람직한 경우, 지속 방출 제제가 특히 관심의 대상이 될 수 있다.

PTH 변이체 조성물 및 제제는 청정한 용액으로서 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함) 또는 지정된 부분 또는 변이체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 다회에 걸쳐 재사용할 수 있고, 1회 또는 다회의 여러 주기 동안 환자를 치료하는데 충분할 수 있는 바, 따라서, 현재 이용가능한 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.

PTH 변이체 조성물 및 제제는 약국, 클리닉 또는 상기와 같은 다른 기관 및 시설에 청정한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함) 또는 지정된 부분 또는 변이체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 제공함으로써 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이러한 경우 청정한 용액은 최대 1 리터 또는 그보다 훨씬 더 큰 크기일 수 있으며, 이는 큰 저장소를 제공하여 그로부터 PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함) 또는 지정된 부분 또는 변이체 용액 중 더 작은 소량을 1회 또는 다회에 걸쳐 회수하여 더 작은 바이알로 옮기고, 약국 또는 클리닉에서 고객 및/또는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 제품은 패키징 물질을 포함할 수 있다. 패키징 물질은 규제 기관에서 요구하는 정보 외에도, 제품이 사용할 수 있는 조건을 제공할 수 있다. 패키징 물질은 환자에게 PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함) 또는 지정된 부분 또는 변이체를 수성 희석제에서 재구성하여 용액을 형성하고, 상기 용액을 2개의 바이알, 습식/건식 제품에 대해 2-24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용하는 것에 대한 지침을 제공할 수 있다.

치료

또 다른 측면에서, 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 가진 대상체의 혈청 및 소변 칼슘 수준을 제어하는데 효과적인 투약 요법을 이용하여 본 발명의 PTH 변이체로 상기 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. PTH 변이체는 천연 PTH(1-84)보다 반감기가 더 길기 때문에, 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 치료하는 특히 효과적일 수 있다. 반감기가 더 큰 것에 기인하여 PTH 변이체를 보다 생리학적으로 적절한 수준에서 매일 투여하고 유지시킬 수 있고, 이로써, 혈청 및 소변 칼슘 둘 다에 대해 보다 지속적으로 제어할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체의 혈청 칼슘 수준을 제어하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 가진 대상체의 혈청 칼슘 수준을, 본 발명의 PTH 변이체 부재 하에서의 상기 대상체의 혈청 칼슘 수준과 비교하여 증가시키는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 대상체의 혈청 칼슘 수준을, 외인성 천연 PTH(1-84)를 받은 대상체의 혈청 칼슘 수준과 비교하여 더 낮은 피크-대-트로프 비로 유지시키는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 부갑상선기능저하증을 가진 대상체의 칼슘 보충제의 양을 감소시키는데 효과적이다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체의 소변 칼슘 분비를 제어하는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 소변 칼슘 방출량을 건강한 지원자의 수준으로 감소시키는데 (잠재적인 신장 합병증을 감소시키는데) 효과적이다.

예컨대 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 PTH 변이체는 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 다회 투여는 투약 요법에 따라 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은, "QD" 또는 "q.d."라는 용어는 1일 1회 투여를 의미하고, "Q2D"는 매 2일마다 투여를 의미하는 등이다. "QW"는 매주 투여를 의미한다. "BID"는 1일 2회 투여를 의미한다. 투약은 예를 들어, BID, 1일 1회 (QD), Q2D, Q3D, Q4D, Q5D, Q6D, QW, 8일마다 1회, 9일마다 1회, 10일마다 1회, 11일마다 1회, 12일마다 1회, 13일마다 1회, 2주마다 1회, 15일마다 1회, 16일마다 1회, 또는 17일마다 1회, 3주마다 1회 또는 월 1회로 이루어질 수 있다.

PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함)는 1일 2회, 또는 1일 1회, 또는 매 2일마다, 매 5-8일마다, 또는 매주 (QW) 0.001 μg 내지 1,000 μg의 투여량 요법에 따라 피하로 투여될 수 있다. 대안적으로, PTH 변이체는 예컨대 유지 목적으로 매 3주마다 또는 월 1회로 투여될 수 있다.

PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함)는 1일 1회 (QD) 약 1 μg/일 내지 약 500 μg/일, 또는 약 2 μg/일 내지 약 250 μg/일, 또는 약 5 μg/일 내지 약 100 μg/일, 또는 약 10 μg/일 내지 약 80 μg/일, 또는 약 20 μg/일 내지 약 100 μg/일, 또는 약 20 μg/일 내지 약 100 μg/일, 또는 약 50 μg, 또는 약 60 μg, 또는 약 70 μg, 또는 약 80 μg, 또는 약 90 μg, 또는 약 100 μg의 투여량 요법에 따라 피하로 투여될 수 있다. PTH 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함함)는 0.001 내지 1,000 μg/mL의 농도로 투여될 수 있다.

상기 투약 요법은 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 치료하기 위해 1개월, 또는 2개월, 6개월, 또는 1년, 또는 2년, 또는 5년, 또는 5년 초과인 기간 동안 수행될 수 있다. PTH 변이체는 유지를 위해 대상체의 평생 동안 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "피하 조직"이라는 용어는 피부 바로 아래에 있는 느슨하고 불규칙한 결합 조직의 층으로서 정의된다. 예를 들어, 피하 투여는 대퇴 부위, 복부 부위, 둔부 부위 또는 견갑골 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는 부위에 조성물을 주사함으로써 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 제제는 시린지를 사용하여 주사될 수 있다. 그러나, 제제의 투여를 위한 다른 장치, 예컨대 주사 장치 (예를 들어, 인젝트-이즈(Inject-ease)™ 및 젠젝트(Genject)™ 장치); 주사기 펜 (예컨대 Q-클리크(Q-Cliq)™ 및 젠펜(GenPen)™); 무바늘 장치 (예를 들어, 메디젝터(MediJector)™ 및 바이오젝터(BioJector)™); 및 피하 패치 전달 시스템이 이용가능하다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 PTH 변이체, 또는 상기를 포함하는 제약 조성물은 정맥내로 투여된다.

다양한 실시양태에서, 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 치료하는 상기 방법은 부갑상선기능저하증 및/또는 부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 치료하는 다른 방법과 함께 사용된다.

실시예

하기 실시예는 본 설명의 구체적인 측면을 예시한다. 본 실시예는 단지 실시양태 및 그의 다양한 측면에 대한 구체적인 이해 및 실행을 제공할 뿐인 바, 본 실시예는 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예 1: Fc 융합 PTH 변이체 (PTH-66에 의해 예시됨) 생산 및 정제

PTH-66을 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰고, 조절 배지를 추가 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. 조절 배지를 25℃ 수조에서 해동시키고, 0.2 μm 병 상단 필터 장치를 통해 여과시켰다. PTH-66 단백질을 단백질 A-유도 수지 맙셀렉트 슈어 상에서 제조사의 프로토콜에 따라 정제하였다 (도 8). 맙셀렉트 슈어 칼럼을 PBS로 미리 평형화시켰다. 해동된 조절 배지를 칼럼 상에 로딩한 후, 이어서, PBS로 철저히 세척하였다. PTH-66 단백질을 100 mM 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.2)를 이용하여 단계 용출에 의해 용출시켰다. 용출 분획을 SDS-PAGE에서 분석하였다 (도 9). 풀링된 용출 분획의 pH를 1 M 트리스 (pH 10)를 이용하여 약 pH 6으로 만들었다. 중화된 풀링된 용출 분획을 PTH-66 보관 완충제 20 mM 인산나트륨 완충제, 50 mM 염화나트륨, 26 mg/ml 만니톨 (pH 6.0)로 투석하고, -80℃에서 보관하였다.

도 8a는 2x 5 mL 맙 셀렉트 슈어 칼럼을 이용하여 PTH-66을 발현하는 ~900 mL CM의 미량의 크로마토그래피 정제를 도시한다. 도 8b는 본 발명의 실시양태에 따른 PTH-66의 정제 단계를 개략적으로 보여주는 흐름도이다.

도 9a는 PTH-66의 맙 셀렉트 조 용출 분획을 도시한다. 도 9b는 PTH-66의 맙 셀렉트 조 용출 분획에 대한 쿠마시 블루 염색을 도시한다.

도 10은 최종 PTH-66 생성물의 SDS-PAGE 쿠마시 염색을 도시한다. 최종 수율은 900 mL 세포 배지 (CM)당 약 75 mg이었다. 단백질은 PTH 보관 완충제 중 3 mg/mL이다. 단백질을 분취하고, -80℃에서 보관하였다.

실시예 2: PTH-Fc 융합물의 C-말단 말단절단의 효과

다양한 길이의 말단절단된 PTH를 포함하는 PTH-Fc 융합 변이체를 실시예 1에 개략적으로 설명된 방법에 따라 제조하였다. 하기 PTH-Fc 융합 변이체를 생성하였다: PTH-66 (PTH(1-74)-Fc), PTH-67 (PTH(1-64)-Fc), PTH-68 (PTH(1-54)-Fc), PTH-69 (PTH(1-44)-Fc), 및 PTH(1-34)-Fc.

말단절단된 변이체 및 전장 PTH(1-84)-Fc를 0.25 mg/kg으로 이용하여 스프라크-돌리(Spraque-Dawley) 래트를 단일 피하 처리한 후의 PTH의 혈청 농도를 이뮤노토픽스(Immunotopics) 생체활성 ELISA 키트 (60-3000)를 이용하여 평가하였고, 그 결과는 도 1에 제시되어 있다.

도 1에 제시되어 있는 바와 같이, PTH의 C-말단 말단절단은 놀랍게도 예상 밖으로 PTH-Fc 융합물의 노출 및 약동학적 성질을 개선시킨다.

도면에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 말단절단된 PTH-Fc 융합 변이체는 천연-길이의 PTH(1-84)-Fc 융합물 및 테리파라티드-Fc (PTH(1-34)-Fc 융합물) 둘 다를 능가한다. 더욱 더 놀랍게도, PTH(1-74)는 천연-길이의 PTH(1-84)-Fc 및 다른 유사체와 비교하였을 때, 특히 긴 생체내 반감기를 갖는다.

실시예 3: 정상 마우스에서의 PTH-66

PTH-66을 50 nmol/kg의 용량으로 정상 마우스에 투여하였다. 샘플을 투여 후 2, 8, 24, 48, 및 72시간째에 채취하고, 칼슘 농도를 플롯팅하고, 포스페이트 완충제 (비히클) 대조군과 비교하였다.

도 2는 마우스에서 PTH-66 (50 nmol/kg 용량)에 대한 투약 후 시간의 함수로서 혈청 칼슘 수준 (도 2a) 및 소변 칼슘 수준 (도 2b)을 도시한다. 도 2a에 제시되어 있는 바와 같이, PTH-66은 PTH(1-84) 및 비히클 대조군과 비교하였을 때, 혈청 칼슘의 장기간 지속되는 증가를 유도한다. 도 2b, PTH-66은 PTH(1-84)보다 더 긴 소변 칼슘 수준의 유지를 제시한다. PTH(1-84) 처리 결과, 처음 몇 시간 이내에 소변 칼슘의 급등을 초래하며, 이는 혈청 칼슘의 상승과 상기 분자의 일시적 노출과 일관되는 것이다. 그에 반해, 혈청 칼슘 수준 상승에도 불구하고, PTH-66은 12-24시간 동안 비히클과 유사한 수준으로 유지시키면서, 소변 칼슘 수준을 보다 장기간 지속적으로 제어하는 것으로 보인다. 요약하면, PTH-66 처리가 칼슘 수준에 지속적으로 영향을 줄 수 있도록 유도한다.

실시예 4: TxPTx 래트에서의 PTH-66

PTH-66을 정상 (무손상) 및 갑상선-부갑상선 적출 (TxPTx) 래트에게 5, 20, 및 60 nmol/kg의 다양한 용량으로 투여하였다. 투여 후 1, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간째에 연속 샘플을 채취하고, 비히클 대조군과 비교하였다.

도 3a 및 b에 제시되어 있는 바와 같이, PTH-66으로 처리된 TxPTx 래트는 투여 후 최대 72시간 동안 상승 및 유지되는, 용량-의존적 혈청 Ca++ 수준에 따른 용량 선형 PK/PD 반응을 제시한다. 도 3b는 5 nmol/kg PTH-66을 받은 TxPTx 래트는 무손상 래트의 것으로 복귀하는 정상화된 혈청 칼슘 수준을 제시하는 반면, 위약 비히클을 받은 무손상 래트와 비교하면 20 및 60 nmol/kg PTH-66으로 처리한 것은 투여 후 12-48시간째에 더 높은 혈청 칼슘 수준을 나타낸다는 것을 제시한다.

도 4(a-b)는 PTH-66을 PTH(1-84)와 비교하는 TPTx 래트로부터의 단일 투약 PK (도 4a) 및 PD (도 4b) 연구 데이터를 제시한다. 래트 TPTx 데이터는PTH(1-84)를 넘어서는 명백한 PK 연장, 및 오직 매우 일시적으로만 혈청 칼슘 증가를 제시한 PTH(1-84)와 비교하였을 때, 5 nmol/kg의 PTH-66이 혈청 칼슘을 정상 수준으로 복귀시킬 수 있다는 것을 제시한다.

별도의 다회 투약 연구에서, PTH-66을 2 및 4 nmol/kg의 용량으로 정상 (무손상) 및 갑상선-부갑상선 적출 (TxPTx) 래트에게 10일 동안 매일 피하로 투여하였다. 샘플을 투약 전에 1일 1회 채취하였고, 비히클 대조군과 비교하였다.

도 5(a-d)는 TPTx 래트에게 PTH-66을 매일 피하 투여한 것으로부터의 다회 투약 PK (도 5a) 및 PD (도 5b-d) 연구 데이터를 제시한다. 도 5a PK 데이터는 PTH-66은 정상 상태 수준에 가깝게 달성된, 용량 선형 PK 반응을 제시한다. 도 5b에 제시되어 있는 바와 같이, 2 및 4 nmol/kg PTH-66은 혈청 칼슘을 정상 범위 (무손상) 수준으로 복귀시키고, 유지시킨다. 도 5c는 PTH-66을 매일 투여하는 것 또한 혈청 포스페이트 수준을 정상화시킨다는 것을 제시한다. 도 5d는 PTH-66은 도 5a에 제시된 바와 같이 정상 혈청 칼슘 수준을 유지시킴과 동시에, 상기 분자는 또한 정상 소변 칼슘 수준도 유지시킨다는 것을 제시한다. 이들 데이터는 PTH-66을 매일 피하 투여하는 것이 혈청 칼슘 및 포스페이트, 및 중요하게는 소변 칼슘을 완전히 정상화시킨다는 것을 제시한다.

실시예 5: 영장류에서의 PTH-66

PTH-66을 2 mmol/kg의 투여량으로 단일 투약으로서 야생형 시노몰구스 원숭이에게 투여한 반면, 다른 원숭이들은 5 mmol/kg의 나트파라 (PTH(1-84))를 단일 투약 받았다. 투여 후 0, 1, 3, 6, 9 12, 18 24, 36, 48, 및 72시간째에 연속 샘플을 채취하고, 나트파라 뿐만 아니라, 비히클 대조군과 비교하였다.

도 6(a-b)는 PTH-66을 PTH(1-84)와 비교하는 야생형 시노몰구스 원숭이로부터의 단일 투약 PK (도 6a) 및 PD (도 6b) 연구 데이터를 제시한다.

도 6의 데이터는 나트파라를 넘어서는 PTH-66의 명백한 PK 연장, 및 2 nmol/kg의 PTH-66은 PTH(1-84) 이용시 수득된 것을 넘어서서 혈청 칼슘 수준을 자극시키고, 유지시킬 수 있다는 것을 제시한다. PTH-66과 비교하여, 나트파라는 수명이 짧고, 혈청 칼슘에 대해 보다 일시적으로 영향을 미친다.

별도의 다회 투약 연구에서, PTH-66을 1 nmol/kg의 투여량으로 야생형 시노몰구스 원숭이에게 9일 동안 매일 피하로 투여하였다. 샘플을 투약 전 매일 및 최종 투약 후 24, 48, 72, 및 120 hr에 채취하였고, 비히클 대조군과 비교하였다.

도 7은 1 nmol/kg PTH-66을 이용하여 야생형 시노몰구스 원숭이를 매일 피하로 처리한 것으로부터의 다회 투약 PK 및 PD 연구 데이터를 제시한다. PK 데이터는, PTH-66이 연구 기간 동안 비히클 대조군과 비교하였을 때, 혈청 칼슘 증가 및 혈청 포스페이트 감소인 결과를 나타내며, 상대적으로 평탄한 PK 프로파일을 달성하였다는 것을 보여준다.

실시예 6: PTH cAMP 효능 검정법

하기 표 1은 본 발명에 따른 예시적인 PTH 변이체에 대한 cAMP 효능 (EC₅₀) 검정법의 결과를 요약한 것이다. 하기 표 2는 PTH 변이체에 대한 관련 PK 데이터를 요약한 것이다.

표 1: 선택된 PTH - Fc 변이체에 대한 EC ₅₀ 데이터

표 2: 선택된 PTH - Fc 변이체에 대한 PK 데이터

표 1 및 2에 제시된 바와 같이, 모든 PTH-Fc 샘플은 나노몰 이하의 EC₅₀으로 활성을 띠고, PTH1-84의 값에 비해 유의적으로 개선된 PK 특성을 갖는다.

실시예 6: PTH-66 정제에서의 다중모드 크로마토그래피

초기 포획 단계로서 단백질 A 크로마토그래피를 도 11에 도시된 하류 플랫폼에 따라 수행하였다. 바이러스 불활성화를 위해 1시간 동안 낮은 pH 3.5에서 용출을 유지시킨 후, pH 6으로 중화시키고, -80℃에서 냉동시킨다. 클리핑된 종 및 숙주 세포 단백질을 제외한 불순물 대부분이 충분히 제거되었다. 잔류 숙주 세포 및 프로세스 불순물을 제거하기 위해 하기 기재되는 폴리싱 단계를 개발하게 되었다.

매질이 다양한 상호작용을 통해 고효율로 화합물을 분리할 수 있다는 점에서 다중모드 (혼합 모드로도 공지됨) 크로마토그래피 적용이 항체 정제에서 빠르게 성장하고 있다. 하류 폴리싱 개발에서 두 다중모드 칼럼 단계, 양이온성 캅토™ MMC ImpRes 및 음이온성 캅토™ 어드히어 ImpRes가 고려되고 있다. 그러나, 복잡한 매질 특이적 상호작용을 감안할 때, 정제 프로세스는 완충제 성분, 이온 강도, pH, 및 염 유형에 의해 결정된다. 최적의 결합 및 용출 조건은 추정하기 어려운 바, 최적의 프로세스 성능을 달성할 수 있도록 하기 기재된 단계를 통해 상기 두 수지의 분리 조건이 결정되었다.

PTH-66 (PTH(1-74)-Fc 융합물)은 생물반응기로부터 중간 정도의 단편화를 보였으며, 이는 순환 반감기 증가에도 불구하고, 그의 효능에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 하류 프로세싱 이전에 수확된 세포 배양물 중 프로테아제 억제제를 첨가하는 것은 추후의 생성물 분해로부터 보호하는 것으로 제시된 바 있다. 세포 배양물 중의 재조합 단백질의 단편화는 약물 안전성 및 효능에 유해할 수 있다. 하류 프로세스 개발에서, 상류 프로세스로부터 생성된, 소수성 또는 전하가 변경된 단편 이소폼은 다중모드 크로마토그래피를 이용하여 무손상 Fc-융합 단백질로부터 성공적으로 분리되었다. 10% 미만의 단편화 표적을 충족시키는 생산 프로세스의 흐름도가 도 12에 도시되어 있다.

6 μL 프레딕터(PreDictor) 96-웰 플레이트를 이용하여 캅토 MMC 및 어드히어 ImpRes의 초기 작동 조건에 대한 철저한 고처리량 스크리닝 (HTS)을 수행함으로써 염 농도 및 pH를 포함한 광범위한 파라미터를 평가하였다 (도 13a 및 13b 참조).

고처리량 프로세스를 이용하여 결정된 양이온 교환 (양이온성) 캅토 MMC ImpRes 및 음이온 교환 (음이온성) 캅토 어드히어 ImpRes의 분리 조건이 도 14a 및 14b에 도시되어 있다. 캅토 MMC ImpRes에 대한 스크리닝된 실험 조건은 아세테이트, MES, 및 포스페이트 완충제 시스템, pH 5.0 내지 7.0 및 염 (NaCl) 농도 0 내지 750 mM, 50 g/L 수지 로드 및 1시간의 인큐베이션 시간을 포함하였다. 캅토 어드히어 ImpRes에 대한 스크리닝된 실험 조건은 아세테이트, MES, 포스페이트 및 트리스 완충제 시스템, pH 5.0 내지 8.0 및 염 (NaCl) 농도 0 내지 1500 mM, 50 g/L 수지 로드 및 1시간의 인큐베이션 시간을 포함하였다.

도 14c에 도시된 구조를 갖는 양이온성 수지인 캅토 MMC ImpRes에 대한 최적의 결합 조건은 염 부재 하의 pH 6.0의 50 mM MES를 포함하는 것으로 확인되었다. 도 14d에 도시된 구조를 갖는 음이온성 수지인 캅토 어드히어 ImpRes에 대한 최적의 유동-통과 조건은 염 부재 하의 pH 5.0의 50 mM 아세테이트 완충제를 포함하는 것으로 확인되었다.

제2 단계는 HTS 정적 결합능 결과에 의해 가속화되는 벤치-규모로 프로세스를 최적화하는 것이다. 캅토 MMC ImpRes를 결합-및-용출 모드로 수행하여 불순물 클리어런스 능력을 최대화시켰다. 불필요한 생성물 손실 없이 과도한 프로세스- 및 생성물-관련 불순물을 감소시키기 위해 세척 단계를 조사하였다 (도 15). 프로세스가 생성물 품질 표준을 충족시킬 수 있도록 허용하는 고속 유동-통과 (FT) 단계로서 후속 캅토 어드히어 ImpRes 단계가 개발되었다 (도 16). MMC 및 어드히어 벤치-탑 검증 실험을 수행하여 불순물 클리어런스 및 단계 수율에 관한 프로세스 강건성을 입증하였다. PTH-Fc 정량화는 MMC 및 어드히어에 대한 수율을 추적하는 UV280에 의존한다.

도 17-19에 제시된 바와 같이, 고처리량 연구로부터의 조건을 벤치 규모로 성공적으로 전환시켰다. 캅토 MMC ImpRes 구배 용출 트레이는 도 14a에 도시되어 있다. pH 6.0의 50 mM MES, 0 내지 1 M NaCl 구배 용출 하에 0.66 x 10 cm (3.4 mL) 칼럼을 이용하였을 때, 보다 우수한 분해능이 달성되었다. MMC는 효과적으로 HCP, DNA, HMW, 및 클리핑된 종 제거를 제공한다.

표 3: 캅토 MMC ImpRes 구배 용출

다른 프로세스- 및 생성물-관련 불순물을 감소시키기 위해 MMC 세척 단계를 조사하였다. MMC 세척 최적화는 하기 표 4에 제시되어 있다. 최적의 세척 조건은 6 CV의 200 mM NaCl 및 3 CV의 250 mM NaCl인 것으로 확인되었다.

표 4: MMC 세척 최적화

도 17b에 도시되고 하기 표 5에 제시된 캅토 어드히어 ImpRes 유동-통과는 추가적 HCP 및 HMW 제거 능력을 제공하는 것으로 제시한다. pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨 완충제 유동-통과 하에 0.66 x 10 cm (3.4 mL) 칼럼을 이용하였을 때, 보다 우수한 분해능이 달성되었다.

표 5: 캅토 어드히어 ImpRes 유동-통과

하류 폴리싱 단계 디자인은 도 18a에 도시되어 있다. 불순물 클리어런스 및 프로세스 수율에 기초하여 안정한 풀을 이용한 프로세스 강건성이 도 15b 뿐만 아니라, 하기 표 6에 제시되어 있다.

표 6: 프로세스 강건성

파일럿-규모 생산 품질 속성은 도 19a-f에 특징화되어 있다. 이들 도면에 제시된 바와 같이, 대규모 정제인 파일럿 플랜트 작동 (PPO)은 작은 실험 규모인 프로세스 개발 (PD))로부터의 수율과 유사한 단계 수율을 갖는다. 상기 두 수율을 비교함으로써 상기 제시된 파라미터를 이용하여 정제 프로세스를 성공적으로 규모 확장할 수 있다는 결론에 이를 수 있다.

MMC 용출액 및 어드히어 FT를 각각 5일 및 4일 동안 주변 온도 및 4-8℃에서 유지시킨 후, SEC-HPLC 및 무손상 질량 분석으로 분석하여 인-프로세스 샘플의 안정성을 측정하였다.

따라서, 다중모드 크로마토그래피를 이용함에 따라 Fc-융합 단백질 단편화 문제가 성공적으로 처리되었고, 강건한 불순물 클리어런스를 손상시키지 않으면서, 비교적 높은 회수율을 달성하는 선형 구배로부터의 단계 용출이 확립되었다.

상기 기재된 대상은 본 발명의 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 변형될 수 있는 바, 상기 설명에 포함되거나, 또는 첨부된 청구범위에서 정의되는 모든 대상은 본 발명을 설명하고, 예시하는 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다. 상기 교시내용에 비추어 본 발명은 다수 변형되고 수정될 수 있다. 따라서, 본 설명은 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 상기와 같은 모든 대안, 변형, 및 수정들을 포괄하는 것으로 의도된다.

본원에 인용된 모든 특허, 출원, 공개문헌, 시험 방법, 문헌, 및 다른 자료들은 마치 본 명세서에 물리적으로 존재하는 것과 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> SHIRE-NPS PHARMACEUTICALS, INC. <120> PARATHYROID HORMONE VARIANTS <130> 250501.000165 <140> PCT/US2020/015634 <141> 2020-01-29 <150> 62/884,730 <151> 2019-08-09 <150> 62/800,744 <151> 2019-02-04 <150> 62/798,113 <151> 2019-01-29 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 245 250 255 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 260 265 270 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 275 280 285 Pro Gly 290 <210> 12 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly 20 25 30 Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 35 40 45 Gln Asp Val His Asn Ala Ser Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg 50 55 60 Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val 65 70 75 80 Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn 85 90 95 Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 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Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 13 His His His His His His 1 5

Claims

부갑상선 호르몬 (PTH)-Fc 융합 단백질로서, 여기서 PTH-Fc 융합 단백질은 인간 IgG 항체의 Fc 영역, 또는 그의 유도체에 화학적으로 연결된, C-말단 돌연변이된 및/또는 말단절단된 PTH 또는 그의 변이체를 포함하며, 여기서 C-말단 돌연변이된 및/또는 말단절단된 PTH 또는 그의 변이체는 PTH(1-34)가 아닌 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서, C-말단 돌연변이된 및/또는 말단절단된 PTH 또는 그의 변이체가 돌연변이된 PTH(1-84), PTH(1-74), PTH(1-64), PTH(1-54), 및 PTH(1-44)로부터 선택되는 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서, C-말단 돌연변이된 및/또는 말단절단된 PTH 또는 그의 변이체가 돌연변이된 PTH(1-84), PTH(1-83), 또는 PTH(1-82), 또는 PTH(1-81), 또는 PTH(1-80), 또는 PTH(1-79), 또는 PTH(1-78), 또는 PTH(1-77), 또는 PTH(1-76), 또는 PTH(1-75), 또는 PTH(1-74), 또는 PTH(1-73), 또는 PTH(1-72), 또는 PTH(1-71), 또는 PTH(1-70), 또는 PTH(1-69), 또는 PTH(1-68), 또는 PTH(1-67), 또는 PTH(1-66), 또는 PTH(1-65), 또는 PTH(1-64), 또는 PTH(1-63), 또는 PTH(1-62), 또는 PTH(1-61), 또는 PTH(1-60), 또는 PTH(1-59), 또는 PTH(1-58), 또는 PTH(1-57), 또는 PTH(1-56), 또는 PTH(1-55), 또는 PTH(1-54), 또는 PTH(1-53), 또는 PTH(1-52), 또는 PTH(1-51), 또는 PTH(1-50), 또는 PTH(1-49), 또는 PTH(1-48), 또는 PTH(1-47), 또는 PTH(1-46), 또는 PTH(1-45), 또는 PTH(1-44), 또는 PTH(1-43), 또는 PTH(1-42), 또는 PTH(1-41), 또는 PTH(1-40), 또는 PTH(1-39), 또는 PTH(1-38), 또는 PTH(1-37), 또는 PTH(1-36), 또는 PTH(1-35), 또는 PTH(1-33)으로부터 선택되는 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 돌연변이된 및/또는 말단절단된 PTH 또는 그의 변이체가 PTH(1-74)인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역 또는 그의 유도체가 L234A 및 L235A 치환을 포함하는 hFcLALA인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, PTH 또는 그의 변이체가 F34A 치환, F34D 치환, V35S 치환, 또는 V35T 치환, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PTH 또는 그의 변이체가 글리코실화된 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질이 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 PTH-66인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질이 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 PTH-67인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질이 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 PTH-68인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질이 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 PTH-69인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 PTH-Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
제12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제12항의 핵산 또는 제13항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제14항에 있어서, 숙주 세포가 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포인 숙주 세포.
제14항 또는 제15항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 숙주 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 더 긴 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 적어도 2배 더 긴 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 적어도 10배 더 긴 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 PTH(1-84)의 혈청 반감기보다 적어도 20배 더 긴 것인 PTH-Fc 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 PTH-Fc 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 PTH-Fc 융합 단백질, 또는 제21항의 제약 조성물을 포함하는 제약 투여 형태.
제22항에 있어서, 투여 형태가 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체 투여 형태인 제약 투여 형태.
혈청 칼슘 수준의 제어를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 PTH-Fc 융합 단백질, 제21항의 제약 조성물, 또는 제22항 또는 제23항의 제약 투여 형태의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈청 칼슘 수준을 제어하는 방법.
제24항에 있어서, 대상체가 부갑상선기능저하증을 가진 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 피하로 투여되는 것인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 주 1회 투여되는 것인 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 대상체에게 PTH-Fc 융합 단백질의 약 20 μg/일 내지 약 100 μg/일의 양으로 제공되는 것인 방법.
부갑상선기능저하증을 가진 대상체에게 제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 PTH-Fc 융합 단백질, 제21항의 제약 조성물, 또는 제22항 또는 제23항의 제약 투여 형태의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
제30항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 피하로 투여되는 것인 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 대상체에게 PTH-Fc 융합 단백질의 약 20 μg/일 내지 약 100 μg/일의 양으로 제공되는 것인 방법.
부갑상선기능저하증에 기인하는 저칼슘혈증을 가진 대상체에게 제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 PTH-Fc 융합 단백질, 제21항의 제약 조성물, 또는 제22항 또는 제23항의 제약 투여 형태의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
제34항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 피하로 투여되는 것인 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태가 대상체에게 PTH-Fc 융합 단백질의 약 20 μg/일 내지 약 100 μg/일의 양으로 제공되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질이 1개 카피의 PTH 및 1개 카피의 Fc를 포함하는 것인 PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태.
제1항 내지 제11항 및 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PTH-Fc 융합 단백질이 2개 카피의 PTH 및 1개 카피의 Fc를 포함하는 것인 PTH-Fc 융합 단백질, 제약 조성물, 또는 제약 투여 형태.
다중모드 크로마토그래피 수지를 이용하여 부갑상선 호르몬 (PTH)-Fc 융합 단백질을 정제하는 것을 포함하는, PTH(1-74)를 포함하는 C-말단 말단절단된 (PTH)-Fc 융합 단백질 또는 그의 변이체를 제조하는 방법.
제40항에 있어서, 다중모드 크로마토그래피 수지가 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지를 포함하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 양이온 교환 수지가 캅토(Capto) MMC ImpRes인 방법.
제42항에 있어서, (PTH)-Fc 융합 단백질이 50 mM MES 완충제 중 pH 6.0에서 결합되는 것인 방법.
제41항에 있어서, 음이온 교환 수지가 캅토 어드히어(Capto Adhere) ImpRes인 방법.
제44항에 있어서, (PTH)-Fc 융합 단백질이 50 mM 아세테이트 완충제 중 pH 5.0에서 용출되는 것인 방법.
제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, (PTH)-Fc 융합 단백질을 다중모드 크로마토그래피 수지로부터 점진적으로 용출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 (PTH)-Fc 융합 단백질이 10% 미만의 총 단편화 불순물을 포함하는 것인 방법.