JP6499080B2 - 安定化されたインスリン様成長因子ポリペプチド - Google Patents

安定化されたインスリン様成長因子ポリペプチド Download PDF

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Description

技術分野
本発明はインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）改変の分野にある。特に、本発明は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に連結している改変されたＩＧＦ−１ポリペプチドに関する。
背景
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、細胞がそれらの生理環境で連絡するために使用する複合系の部分である。この複合系（しばしばインスリン様成長因子軸と称される）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−２Ｒ）、２つのリガンド（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）のファミリー及び関連するＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）からなる。この系は、正常な生理の調節だけでなく、多くの病理学的状態にも重要である（Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003）。
ＩＧＦ軸は細胞増殖の促進及び細胞死（アポトーシス）の阻害において役割を果たすことが示されている。ＩＧＦ−１はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として肝臓によって主に分泌される。ヒトの身体におけるほとんど全ての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺における細胞は、ＩＧＦ−１による影響を受ける。インスリン様効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、細胞成長を調節できる。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２はＩＧＦ結合タンパク質として知られている遺伝子産物のファミリーによって調節される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合を阻止することによってＩＧＦ作用を阻害すること、及び受容体への送達を補助し、血流中のＩＧＦ半減期を増加させることによってＩＧＦ作用を促進することの両方を含む複雑な手段でＩＧＦ作用を調節するのに役立つ。少なくとも６つの特性付けされた結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）が存在する。
その成熟形態において、ソマトメジンとも呼ばれるヒトＩＧＦ−１は、培養物中の広範囲の細胞の成長を刺激することが示されている７０アミノ酸の小タンパク質である。ＩＧＦ−１タンパク質は３つの公知のスプライスバリアントｍＲＮＡによって最初にコードされる。各ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは、７０アミノ酸ＩＧＦ−１（配列番号１）及び特定のＩＧＦ−１ ｍＲＮＡに応じて、Ｃ末端における特定のＥ−ペプチドを含有する前駆タンパク質をコードする。これらのＥ−ペプチドは、
ペプチドと呼ばれており、３５〜８７アミノ酸長の範囲であり、Ｎ末端において共通配列領域及びＣ末端において可変配列領域を包含する。例えば、ＩＧＦ−１−Ｅａについての野生型オープンリーディングフレームは、リーダー配列を含む１３５アミノ酸のポリペプチド及びリーダー配列を含まない１０５アミノ酸のポリペプチド
をコードする。生理的発現において、Ｅ−ペプチドは内因性プロテアーゼによって前駆体から切断されて成熟７０アミノ酸ＩＧＦ−１を生じる。ヒト血清におけるＩＧＦ−１の利用可能性及び半減期は、プロテアーゼ及びＩＧＦ−１結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）によって主に影響を受け、調節される。ＩＧＦＢＰはＩＧＦ−１活性を阻害又は増強できる（Oh Y, et al., Characterization of the affinities of insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins 1-4 for IGF-I, IGF-II, IGF-I/insulin hybrid, and IGF-I analogs. Endocrinology. 1993 Mar;132(3):1337-44）。ＩＧＦ−１の半減期を増加させる戦略は従来技術に記載されている。意図されている戦略は、
（ｉ）セリンプロテアーゼによるヒト血清におけるＩＧＦ−１の切断を阻止すること、又はＩＧＦ−１の利用可能性若しくは血清半減期に対するＩＧＦ−１結合タンパク質の負の影響を軽減することを目的とする特異的変異を含むＩＧＦ−１バリアントの産生（ＷＯ２０００４０６１３、ＷＯ０５０３３１３４、ＷＯ２００６０７４３９０、ＷＯ２００７／１４６６８９）、
（ｉｉ）成熟ＩＧＦ−１タンパク質がヒト免疫グロブリンＦｃ領域に融合している、ＩＧＦ−１融合タンパク質の産生（ＷＯ２００５０３３１３４、ＷＯ２０００４０６１３）、
（ｉｉｉ）プロテアーゼによるＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの切断が前駆タンパク質の改変によって低下する、ＩＧＦ−１前駆タンパク質の使用（ＷＯ２００７１４６６８９）、
（ｉｖ）上記の戦略の組合せ（（ｉ）／（ｉｉ）ＷＯ０５０３３１３４、（ｉ）／（ｉｉ）ＷＯ２０００４０６１３、（ｉ）／（ｉｉｉ）ＷＯ２００７１４６６８９）である。
上記の戦略にも関わらず、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＩＧＦ−１前駆体バリアントは主に２つの理由のために不十分な薬物候補のままである：（ｉ）哺乳動物産生系における低い産生収率、及び（ｉｉ）低血糖、治療に関する有害事象を生じる可能性がある、未改変のヒト野生型ＩＧＦ−１と比較してインスリン受容体（ＩｎｓＲ）に対する増加した結合親和性。
従って、上記の従来技術の問題を克服する技術についての必要性が存在する。本発明は多くの態様においてこの必要性に対処するものである。
発明の要旨
本開示の第１の主題は、ヒトＩＧＦ−１（ｈＩＧＦ−１）タンパク質を含むポリペプチドであって、前記ｈＩＧＦ−１タンパク質の４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する、ポリペプチドに関する。
本開示のさらなる実施形態は、ヒトＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１タンパク質を含むポリペプチドであって、ヒトＩＧＦ−１タンパク質の４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する、ポリペプチドに関する。
本開示の別の主題は、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、
前記ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質の４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、ポリペプチドに関する。
本開示のさらなる実施形態は、ヒトＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質の４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、ポリペプチドに関する。
特定の実施形態において、本開示は、４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又はセリンによって置換されている、上記のポリペプチドに関する。
さらなる実施形態において、上述のヒトＩＧＦ−１タンパク質は、アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９及び／又はＡ７０においてさらなる欠失又は変異を含む。
さらなる実施形態において、上述のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質は、Ｅａ−ペプチド及びアミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５のさらなる欠失又は変異を含む。
本開示の上記の実施形態と組み合わせてもよい、さらに別の実施形態において、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質及びＦｃ領域はペプチドヒンジ領域によって分離している。
従って、本開示はまた、ペプチドヒンジ領域が、ペプチドヒンジ１（配列番号２２）、ヒンジ２（配列番号２３）及びヒンジ３（配列番号２４）からなる群から選択される、上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質に関する。
特定の実施形態において、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及び／又はＲ１０４にてＥａ−ペプチドにおいて変異している場合、前記アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している、上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質。
上記のヒトＩＧＦ−１タンパク質又はヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含む又はそれからなるポリペプチドであって、
ａ．アミノ酸Ｅ３、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンによって置換されており、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、ポリペプチド。
本開示の別の特定の実施形態は、Ｅ−ペプチドがＥａ−ペプチドであり、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンに変異しており、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３６、Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異しており、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、
上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質に関する。
本開示の別の特定の実施形態は、Ｅ−ペプチドがＥａ−ペプチドであり、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンに変異しており、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３６、Ｒ７４及びＲ７７がグルタミンに変異しており、かつ、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、
上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質に関する。
同様に、本開示は、Ｅ−ペプチドがＥａ−ペプチドであり、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンに変異しており、
ｃ．アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異しており、かつ、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸に変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、
上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質に関する。
同様に、本開示は、Ｅ−ペプチドがＥａ−ペプチドであり、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンに変異しており、
ｃ．アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミンに変異しており、かつ、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸に変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、
上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質に関する。
さらに特定の実施形態において、本開示は、Ｅ−ペプチドがＥａ−ペプチドであり、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンに変異しており、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３６、Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異しており、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応し、かつ、
ｅ．ＩＧＦ−１前駆タンパク質及びＦｃ領域がヒンジペプチドヒンジ１（配列番号２２）によって分離している、
上記のヒトＩＧＦ−１前駆Ｆｃ融合タンパク質に関する。
さらに、本開示は、Ｅ−ペプチドがＥａ−ペプチドであり、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はセリンに変異しており、
ｃ．アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異しており、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸に変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応し、かつ、
ｅ．ＩＧＦ−１前駆タンパク質及びＦｃ領域がヒンジペプチドヒンジ３（配列番号２４）によって分離している、
上記のヒトＩＧＦ−１前駆Ｆｃ融合タンパク質に関する。
特定の実施形態において、本開示は、Ｆｃ領域がＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されている、上記のポリペプチドに関する。
従って、本開示は、Ｆｃ領域が、
Ｉ．Ｆｃ受容体に対するその親和性を低下させ、
ＩＩ．ＡＤＣＣ活性を低下させ、又は
ＩＩＩ．ＡＤＣＣ活性を阻止する
ように改変されている、上記のヒトＩＧＦ−１前駆Ｆｃ融合タンパク質に関する。
本開示の別の特定の実施形態は、配列番号８又は配列番号９又は配列番号１０又は配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号１３又は配列番号１４又は配列番号２７を含む上記のヒトＩＧＦ−１前駆Ｆｃ融合タンパク質に関する。
本開示の上記の実施形態と組み合わせてもよい、特定の実施形態において、ヒトＩＧＦ−１前駆Ｆｃ融合タンパク質はグリコシル化される。
別の態様において、本開示は、上記のヒトＩＧＦ−１前駆Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子を含むポリヌクレオチドに関する。
従って、本開示は、配列番号１５又は配列番号１６又は配列番号１７又は配列番号１８又は配列番号１９又は配列番号２０又は配列番号２１に記載される核酸分子を含むポリヌクレオチドに関する。
本開示は、治療に使用するための上記に開示したヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質のいずれか１つを含むポリペプチドを含む医薬組成物をさらに提供する。
本開示の別の実施形態において、上述の治療的使用は、それを必要とする患者における筋障害の治療である。本開示の特定の実施形態において、治療的使用は、除脂肪体重（lean body mass）の喪失及び／若しくは筋肉疲労を患っている熱傷患者の治療又はＣＯＰＤ患者の治療又はケネディ病（Kennedy disease）患者の治療又は慢性腎疾患患者の治療である。
本開示のさらなる実施形態において、上記の筋障害は筋萎縮である。従って、本開示のいくつかの態様において、治療的使用は、肥満関連サルコペニア、サルコペニア及び糖尿病関連筋萎縮の治療である。
本開示は、必要とする患者における筋障害を治療する方法であって、治療有効量の本発明の上記のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を投与する工程を含む、方法をさらに提供する。
従って、１つの特定の実施形態において、本開示は、除脂肪体重の喪失及び／若しくは筋肉疲労を患っている熱傷患者を治療する方法又はＣＯＰＤ患者を治療する方法又はケネディ病患者を治療する方法又は慢性腎疾患患者を治療する方法に関する。
さらに、本開示は、必要とする患者における筋障害を治療する方法であって、筋障害が、肥満関連サルコペニア、サルコペニア及び糖尿病関連筋萎縮からなる群から選択される筋萎縮である、方法を提供する。
別の実施形態において、本開示は、４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失している、上記のＩＧＦ−１ポリペプチド又はＩＧＦ−１前駆ポリペプチドに関する。別の実施形態において、本開示は、前記タンパク質がペグ化される、上記のＩＧＦ−１ポリペプチド又はＩＧＦ−１前駆ポリペプチドに関する。
ＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性 ｒｈＩＧＦ１Ｒに対するｈＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１バリアントの高親和性結合は表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定した。 （Ａ〜Ｄ）：ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ細胞形質転換体におけるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化 ヒトＩＧＦ−１受容体（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を成長培地中で２４時間培養し、無血清培地中で１８時間飢餓し、等モル濃度の示したペプチドにより３７℃にて１０分間刺激した。ＩＧＦ−１Ｒリン酸化レベルをＥＬＩＳＡによって分析した。受容体リン酸化を対照の％±標準偏差（ＳＤ）として表す（New York University School of Medicine Department of Pathologyにて１９６２年に単離され、開始された細胞株由来のＮＩＨ ３Ｔ３マウス胎児線維芽細胞;Todaro GJ, Green H . Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J. Cell Biol. 17: 299-313, 1963）。 （Ａ〜Ｄ）：ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ細胞形質転換体におけるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化 ヒトＩＧＦ−１受容体（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を成長培地中で２４時間培養し、無血清培地中で１８時間飢餓し、等モル濃度の示したペプチドにより３７℃にて１０分間刺激した。ＩＧＦ−１Ｒリン酸化レベルをＥＬＩＳＡによって分析した。受容体リン酸化を対照の％±標準偏差（ＳＤ）として表す（New York University School of Medicine Department of Pathologyにて１９６２年に単離され、開始された細胞株由来のＮＩＨ ３Ｔ３マウス胎児線維芽細胞;Todaro GJ, Green H . Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J. Cell Biol. 17: 299-313, 1963）。 （Ａ〜Ｄ）：ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞形質転換体におけるＩｎｓＲのリン酸化 ヒトインスリン受容体（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を成長培地中で２４時間培養し、無血清培地中で１８時間飢餓し、等モル濃度の示したペプチドにより３７℃にて１０分間刺激した。ＩｎｓＲリン酸化レベルをＥＬＩＳＡによって分析した。受容体リン酸化を任意の単位±標準偏差（ＳＤ）として表す。 （Ａ〜Ｄ）：ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞形質転換体におけるＩｎｓＲのリン酸化 ヒトインスリン受容体（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を成長培地中で２４時間培養し、無血清培地中で１８時間飢餓し、等モル濃度の示したペプチドにより３７℃にて１０分間刺激した。ＩｎｓＲリン酸化レベルをＥＬＩＳＡによって分析した。受容体リン酸化を任意の単位±標準偏差（ＳＤ）として表す。 （Ａ〜Ｃ）：ヒト及びカニクイザル初代筋芽細胞におけるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化 細胞を成長培地中で培養し、４時間飢餓し、次いで３７℃にて１５分間、ｈＩＧＦ−１又はｈＩＧＦ−１バリアントにより刺激した。ＩＧＦ−１Ｒリン酸化レベルを、ＤｕｏＳｅｔ ＩＣヒト蛍光体−ＩＧＦ１Ｒを使用してＥＬＩＳＡによって分析した。受容体リン酸化を対照の％±標準偏差（ＳＤ）として表す。 （Ａ〜Ｄ）：マウス筋管及び含脂肪細胞におけるグルコース取り込み ３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞（Ｂ及びＤ）及びＣ２Ｃ１２マウス筋管（Ａ及びＣ）細胞を２４ウェルプレート上に播種し、無血清ＤＭＥＭ中で４時間培養した。次いで無血清ＤＭＥＭを、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２のそれぞれについてＫＲＰ緩衝液又はＨＢＳと置き換えた。細胞を３７℃にて指定したペプチドにより１時間処理した。グルコース取り込みを、０．４（含脂肪細胞）又は０．８（Ｃ２Ｃ１２）μＣｉの［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び０．１（含脂肪細胞）又は０．０１（Ｃ２Ｃ１２）ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを、室温にて１０分間（含脂肪細胞）又は５分間（Ｃ２Ｃ１２）加えることによって測定した。放射線をシンチレーション計数によって分析した。 グルコース取り込み：含脂肪細胞における経時変化 ３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞を２４ウェルプレート上に播種し、無血清ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で４時間培養した。次いで無血清ＤＭＥＭをＫＲＰ緩衝液と置き換え、細胞を３７℃にて指定したペプチドにより、１５、６０、９０及び１２０分の間、処理した。グルコース取り込みを、０．４μＣｉの［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び０．１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを、室温にて１０分間加えることによって測定した。放射線をシンチレーション計数によって分析した。３Ｔ３−Ｌ１は脂肪組織に関する生物学的研究において使用される３Ｔ３細胞由来の細胞株である；Green H, Kehinde O (1975). "An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion". Cell 5 (1): 19-27。 （Ａ〜Ｂ）： 成体のオスのラット（ｎ＝３／群）に、１０ｍｇ／ｋｇにて、ｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ又はｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅの静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス又は皮下（ｓ．ｃ．）注射を与えた。一連の血液検体を、試験物質の投与後、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８及び３３６時間に採取した。組換えタンパク質の血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。 （Ａ〜Ｃ）：デキサメタゾン誘導性筋萎縮に対するｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿変異体の効果。 群（Ａ）ビヒクル、（Ｂ）Ｄｅｘ、（Ｃ）３．８ｍｇ／ｋｇ／日、ｓ．ｃ．ミニポンプ注入にてｈＩＧＦ−１とＤｅｘ、（Ｄ）３ｍｇ／ｋｇ／日、ｓ．ｃ．ｅｏｄにてｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿ＡとＤｅｘ、（Ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ／日、ｓ．ｃ．ｅｏｄにてｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿ＡとＤｅｘ、及び（Ｆ）３ｍｇ／ｋｇ／日、ｓ．ｃ．ｅｏｄにてｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿ＡとＤｅｘの身体（Ａ）及び筋肉（Ｂ及びＣ）の体重変化。値を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜６）として表す。群Ｂに対して、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１、群Ａに対して、＃＃＃Ｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡに従ったダネット多重比較検定）。 ＨＥＫ２９３細胞における異なるＧ４２変異を有するＩＧＦ−１バリアントの産生 ＦｕＧｅｎｅでトランスフェクトした１００ｍｌスケールＨＥＫ２９３Ｆ培養物からの産生データ。清浄した細胞培養上清物から分析プロテインＡ ＨＰＬＣによって力価を測定した。プロテインＡ精製後、濃度を測定した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって精製タンパク質の凝集レベルを測定した。 ２つの異なるＣＨＯ細胞株から発現したｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、７７−ｆｃ（配列番号６）（濃い灰色）及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３／２＿Ａ（配列番号９）（明るい灰色）の短縮された物質の割合。トランスフェクトしたＣＨＯＫ１派生細胞及びＣＨＯ−ＤＵＸ１１派生細胞の精製タンパク質（プロテインＡクロマトグラフィー）から短縮された物質の割合を決定した。逆相ＬＣ−ＭＳ分析によって短縮の割合を決定した。短縮された物質の割合は、両方の細胞株においてｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３／２＿Ａについて顕著に低い。 バイオリアクターの試行における組換え抗体を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞（太線）及びｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔ（配列番号２７）を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞（点線）の細胞成長。Ｂ：バイオリアクターの試行における生存細胞の百分率（太線、ＣＨＯ−Ｋ１派生クローンを産生する抗体、点線、ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔを発現するクローン）。 生存細胞数：実線はＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の細胞成長を示す。野生型ＩＧＦ−１又はｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔとの共培養の間、細胞成長は阻害される（それぞれ点線及び破線）。３回の生物学的反復の平均を示す。ＩＧＦ−１／ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔは２日目に急上昇した（急上昇実験）。Ｂ：細胞生存率：実線はＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の細胞生存率を示し、点線、破線は、それぞれ、ＩＧＦ−１／ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔ急上昇後に低下した細胞生存率を示す。細胞生存率は、細胞をＩＧＦ−１／ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔと共インキュベートした場合、２日早く下降する。細胞成長又は細胞生存率においてＩＧＦ−１とｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔとの相違は検出できなかった。 ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞の細胞成長（太線）及びＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔとの共培養の間に低下した細胞成長（点線）を示す。ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＮＶＰＡＥＷ５４１（アスタリスクを有する太線）を加えた後、細胞成長はわずかに低下する。ＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔとの共培養及びＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼ阻害剤の添加により、さらなる細胞成長阻害は生じなかった（アスタリスクを有する点線）。 太線において野生型（ＷＴ）ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の細胞成長及び円を有する太線においてＩＧＦ−１との共培養の間の低下した細胞成長を示す。点線により、３つのＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローンの細胞成長を示す。細胞成長は野生型ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞と比較してわずかに改善した。ＩＧＦ−１との共培養により、少しのみの細胞成長阻害が生じ、細胞成長はＩＧＦ−１と共培養していない野生型ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞と同様である。 １４日のバッチ培養のＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質力価を示す（プールレベル）。５つの異なる細胞株における７つの異なるＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を強調する。ＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質の発現は、ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生野生型細胞株と比較して、ＣＨＯ−Ｋ１派生ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯ細胞株、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯ細胞株及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生ｓｈＲＮＡ（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの発現は低下した）細胞株において５〜２０倍増加した。 ５０ｍｌ振盪フラスコ中の１４日のバッチ培養のＩＧＦ−１−Ｆｃ融合物の力価。ＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質の力価：１５個の最適なＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生ＩＧＦ−１Ｒ−ＫＯクローンにおけるｈＩＧＦ−１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａは、ＩＧＦ−１−Ｆｃ融合タンパク質：ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生野生型細胞クローンにおけるｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメインの力価と比較して約６〜７倍高かった。 ＨＥＫ２９３Ｆ細胞におけるＩＧＦ−１バリアントの産生及びタンパク質チャレンジ。 ＰＥＩでトランスフェクトした１００ｍｌスケールＨＥＫ２９３Ｔ培養物からの産生データ。プロテインＡ精製後の収率を１Ｌ培養体積に対して外挿した。プロテインＡ精製後にＳＥＣ−ＭＡＬＳによって凝集を測定した。精製タンパク質を、５日間、ＣＨＯＫ１由来細胞及び２０日間、ＣＨＯＤＵＸＢ１１由来細胞からの馴化ＣＨＯ培地とインキュベートした。残存している完全長タンパク質の百分率を示す。方法は実施例２に記載されている。 ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞形質転換体におけるＩｎｓＲのリン酸化 ヒトインスリン受容体（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、成長培地中で２４時間培養し、無血清培地中で１８時間飢餓し、等モル濃度の示したペプチドにより３７℃にて１０分間刺激した。ＩｎｓＲリン酸化レベルをＥＬＩＳＡによって分析した。受容体リン酸化を任意の単位±標準偏差（ＳＤ）として表す。 マウス筋管及び含脂肪細胞におけるグルコース取り込み ３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞（Ａ）及びＣ２Ｃ１２マウス筋管（Ｂ）細胞を２４ウェルプレート上に播種し、無血清ＤＭＥＭ中で４時間培養した。次いで無血清ＤＭＥＭを、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２のそれぞれについてＫＲＰ緩衝液又はＨＢＳと置き換えた。細胞を３７℃にて指定したペプチドにより１時間処理した。０．４（含脂肪細胞）又は０．８（Ｃ２Ｃ１２）μＣｉの［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び０．１（含脂肪細胞）又は０．０１（Ｃ２Ｃ１２）ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを室温にて１０分間（含脂肪細胞）又は５分間（Ｃ２Ｃ１２）加えることによってグルコース取り込みを測定した。放射線をシンチレーション計数によって分析した。 マウス筋管及び含脂肪細胞におけるグルコース取り込み ３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞（Ａ）及びＣ２Ｃ１２マウス筋管（Ｂ）細胞を２４ウェルプレート上に播種し、無血清ＤＭＥＭ中で４時間培養した。次いで無血清ＤＭＥＭを、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２のそれぞれについてＫＲＰ緩衝液又はＨＢＳと置き換えた。細胞を３７℃にて指定したペプチドにより１時間処理した。０．４（含脂肪細胞）又は０．８（Ｃ２Ｃ１２）μＣｉの［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び０．１（含脂肪細胞）又は０．０１（Ｃ２Ｃ１２）ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを室温にて１０分間（含脂肪細胞）又は５分間（Ｃ２Ｃ１２）加えることによってグルコース取り込みを測定した。放射線をシンチレーション計数によって分析した。
一般的定義
本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載される。
含む：「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなってもよいか、又は追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
「Δ」という記号又は「ｄ」若しくは「Ｄ」という文字：タンパク質を記載している文脈（例えば、「ｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン」又は「ｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン」）において、アミノ酸欠失を指す。一例として、「Ｄ７１−７２、７７」（タンパク質の文脈において、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、７７−ｆｃ）という用語は、アミノ酸７１、７２及び７７が欠失しているという事実を記載している。
インスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアント：「インスリン様成長因子１タンパク質又はそのバリアント」という語句は、インスリン様成長因子１遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、特に、ヒトインスリン様成長因子１（ｈＩＧＦ−１）タンパク質及びそのバリアントが好ましい。ＩＧＦ−１タンパク質バリアントはＩＧＦ−１野生型配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なるタンパク質であり、「野生型配列」という用語は、少なくとも１つの天然に存在する生物において利用可能なポリペプチド若しくは遺伝子配列又はヒトにより変化、変異若しくは別様で操作されていないポリペプチド若しくは遺伝子配列を指す。ＩＧＦ−１バリアント及びＩＧＦ−１模倣物という用語は、本文献全体を通して交換可能に使用される。ＩＧＦ−１バリアントはまた、ペプチドリーダー配列を含むＩＧＦ−１前駆タンパク質又はｐｒｏ−ＩＧＦ−１タンパク質である。ＩＧＦ−１バリアントはまた、ＩＧＦ−１タンパク質を含む融合タンパク質、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＩＧＦ−１タンパク質を含むタンパク質である。ＩＧＦ−１バリアントの例は、とりわけ、特許出願ＷＯ０５０３３１３４（stabilized IGF-1 protein fused to an immunoglobulin Fc region）及びＷＯ２００７１４６６８９（stabilized IGF-1 precursor proteins）に開示されている。上記のＩＧＦ−１バリアントは、このようなタンパク質が野生型ＩＧＦ−１の機能的等価物としてみなされ得るという意味でその生物活性を保持する。
ＩＧＦ−１タンパク質に関する機能的等価物は、天然又は人工変異を含むＩＧＦ−１タンパク質として理解されなければならない。変異は、ＩＧＦ−１タンパク質の生物活性を減少しない１つ又は複数の核酸の挿入、欠失又は置換であってもよい。少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％超の同一性、非常に特に好ましくは１００％未満であるが、少なくとも９８％の同一性を有する機能的等価物は、ＩＧＦ−１野生型タンパク質、例えばヒトＩＧＦ−１タンパク質配列番号１と同一である。上記の融合タンパク質の場合、１００％同一性はこのような融合タンパク質のＩＧＦ−１部分に基づいてのみ定義される。
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、細胞がそれらの生理環境で連絡するために使用する複合系の部分である。この複合系（しばしばインスリン様成長因子軸と称される）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−２Ｒ）、２つのリガンド（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）のファミリー及び関連するＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）からなる。この系は、正常な生理の調節だけでなく、多くの病理学的状態にも重要である（Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003）。ＩＧＦ軸は細胞増殖の促進及び細胞死（アポトーシス）の阻害において役割を果たすことが示されている。ＩＧＦ−１はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として肝臓によって主に分泌される。ヒトの身体におけるほとんど全ての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺における細胞は、ＩＧＦ−１による影響を受ける。インスリン様効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、細胞成長を調節できる。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２はＩＧＦ結合タンパク質として知られている遺伝子産物のファミリーによって調節される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合を阻止することによってＩＧＦ作用を阻害すること、及び受容体への送達を補助し、血流中のＩＧＦ半減期を増加させることによってＩＧＦ作用を促進することの両方を含む複雑な手段でＩＧＦ作用を調節するのに役立つ。少なくとも６つの特性付けされた結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）が存在する。ＩＧＦ−１は広範囲の治療用途に使用される。メカセルミン（商標名Ｉｎｃｒｅｌｅｘ（商標））は成長阻害の治療に承認されているＩＧＦ−１の合成類似体である。複数の会社が、１型糖尿病、２型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、重度の熱傷及び筋強直性ジストロフィーを含む、種々のさらなる症状について臨床試験においてＩＧＦ−１を評価している。明確性及び一貫性のために、本出願及び請求項を通してＩＧＦ−１前駆体又は成熟タンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けは、ヒトインスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）、シグナルペプチドを有さないアイソフォームＣＲＡ＿ｃ（受託番号ＥＡＷ９７６９７）（すなわち配列番号５）の野生型前駆タンパク質配列の番号付けに基づく。
哺乳動物細胞：開示されている方法の文脈において「哺乳動物細胞」という用語は、工業的製造規模でタンパク質産生に適切である哺乳動物細胞を指す。これらの細胞は当業者に周知であり、例えば、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ミドリザル（Cercopithecus aethiops）、ホモサピエンス（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ハツカネズミ（Mus musculus）及びオナガザル種（Chlorocebus species）に由来する。それぞれの細胞株は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞（サルの腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞株、ベロ細胞（アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞）、ヒーラ細胞（この株はＨｅｎｒｉｅｔｔａ Ｌａｃｋｓから得た子宮頸癌細胞に由来した）、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓）、ＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞株）、Ｃ１２７細胞（非腫瘍形成性マウス細胞株）、ＰｅｒＣ６（登録商標）細胞（ヒト細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＣＡＰ細胞（ＣＥＶＥＣ’ｓ Ａｍｎｉｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）及びＳｐ−２／０細胞（マウス骨髄腫細胞）として知られている。
本出願の文脈において「安定化されたＩＧＦ−１の従来技術のタンパク質の受容体特異性」という用語はまた、低血糖、治療に関する有害事象を誘導するリスクを低下させる従来技術のＩＧＦ−１バリアントと比較して本発明のＩＧＦ−１分子のインスリン受容体リン酸化を誘導する低下した能力（減少した効力及び／又は有効性）を指す。
前駆体：以下において、本発明の文脈に使用される場合、「前駆体」という用語は、シグナルペプチドを有さないが、Ｅａ、Ｅｂ及びＥｃペプチドのそれぞれを含む、成熟ヒトＩＧＦ−１タンパク質の前駆体を指す。
発明の詳細な説明
免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＥａ−ペプチドを含む分子であって、タンパク質残基Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７が欠失し又はグルタミンによって置換されており、Ｒ３７アミノ酸がアラニンによって置換されている、分子（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌ１−３、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌ７１−７２、７７−ｆｃドメイン（配列番号６）及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌ１−３、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン（配列番号７））が、産生され、試験された。哺乳動物細胞系におけるｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌ１−３、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌ７１−７２ｄｅｌ７１−７２、７７−ｆｃドメイン（配列番号６）の発現は凝集及び分解の問題のために可能ではなかった（産生タンパク質の９０％超が分解した；図１０を参照のこと）。
さらに、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌ１−３、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌ７１−７２ｄｅｌ７１−７２、７７−ｆｃドメイン（配列番号６）タンパク質は、ＮＩＨ３Ｔ３ ＩｎｓＲリン酸化アッセイにおいて未改変の成熟ＩＧＦ−１と比較して受容体特異性の減少を示した（図３を参照のこと）。
それ故、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＩＧＦ−１前駆体バリアントは、（ｉ）哺乳動物産生系における低い産生収率、及び（ｉｉ）低血糖、治療に関する有害事象を生じる可能性がある、未改変のヒト野生型ＩＧＦ−１と比較してインスリン受容体（ＩｎｓＲ）に対する増加した結合親和性のために、不十分な薬物候補である。
本発明は、（１）哺乳動物細胞産生系における産生収率及び（２）天然ＩＧＦ−１タンパク質又は安定化されたＩＧＦ−１の従来技術のタンパク質の受容体特異性が、さらなる特定のアミノ酸変異を導入することによって改善され得るという驚くべき観察に基づき、異なる変異は異なる問題を解決し、前記変異は、産生収率、効果及び／又は受容体特異性に関連する複数の問題を扱うために組み合わせてもよい。
特定の驚くべき結果は、Ｇ４２位にて変異している（Ｇ４２Ｓ置換）ヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１）が、未改変のヒト野生型ＩＧＦ−１と比較して、インビトロ系でのＣ２Ｃ１２筋管及び含脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）において、より低いグルコース取り込みを誘導し、インビボでのＩＧＦ−１治療の低血糖のリスクを低下させ得るという観察であった（図１８）。
さらに特定の驚くべき結果は、Ｇ４２位にて変異している（欠失又は特定の置換）ヒトＩＧＦ−１前駆体の従来技術のタンパク質が、未改変のヒト野生型ＩＧＦ−１と同様のインスリン受容体（ＩｎｓＲ）リン酸化を刺激する能力を示し、従来技術のＩＧＦ−１バリアントの低血糖のリスクを減少させるという観察であった（図３）。さらにより驚くべきことは、Ｇ４２Ｓ変異が、哺乳動物細胞における免疫グロブリンＦｃ領域に融合しているヒトＩＧＦ−１前駆体の従来技術のタンパク質の産生収率に対してさらなるプラスの影響を有し（図１０／１７）、すなわち、産生収率にマイナスの影響を与える凝集体の形成が、Ｇ４２Ｓ変異を導入することによって劇的に低下され得るという観察であった（図９／１７）。従って、本発明は、ある程度まで、ヒトＩＧＦ−１タンパク質又はそのヒトＩＧＦ−１前駆体バリアントにおけるアミノ酸グリシン４２を操作することによって、治療的ＩＧＦ−１バリアントの開発における２つの主要な技術的障害を克服できるという驚くべき発見に基づく。別の態様において、本発明は、前記融合タンパク質が哺乳動物細胞プロテアーゼによって容易に分解されるので、ヒトＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域に融合している従来技術のＩＧＦ−１前駆タンパク質が、哺乳動物細胞において工業規模で産生できないという問題についての解決策を提供する。従って、別の態様において、本発明は、ＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆体バリアントにおける特定のアミノ酸を操作することによって、治療的ＩＧＦ−１前駆体バリアントの開発におけるさらなる主要な技術的障害が克服できるという驚くべき発見に基づく。
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
アミノ酸Ｇ４２が欠失しているヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１）。
アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されているヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１）。
アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸が以下である、ヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１）
（ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され若しくは欠失しており、又は
（ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、又は
（ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され若しくは欠失しており、又は
（ｄ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、又は
（ｅ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、又は
（ｆ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、又は
（ｇ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され若しくは欠失しており、又は
（ｈ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、又は
（ｉ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されている。
アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されている、ヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１）。
アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が、免疫グロブリンＦｃ領域、特に改変されたＦｃ領域、特に以下に記載されているようにＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されているＦｃ領域に融合したアラニンによって置換されている、ヒトＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１）。
本発明の別のポリペプチドは配列番号１１７のヒトＩＧＦ−１タンパク質である。
本発明の別のポリペプチドは配列番号１１８のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質である。
上述の従来技術のＩＧＦ−１ Ｅａペプチド前駆タンパク質のアミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５の変異又は欠失は、哺乳動物細胞によって発現される場合、分解されていないタンパク質のより高い収率を導くことが発見されている。さらに、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５位の上述の変異／欠失の組合せは相乗効果を生じることが発見されている。従って、一実施形態において、改変されたＩＧＦ−１タンパク質がＥａ−ペプチド（配列番号２）を含むならば、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５は、本明細書に開示されている改変されたＩＧＦ−１前駆タンパク質において欠失し又は変異している。一実施形態において、Ｒ７４、Ｒ７７及び／又はＲ１０４は本明細書に開示されているＩＧＦ−１前駆タンパク質においてＱに変異している。さらなる実施形態において、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及び／又はＲ７２はさらに、本明細書に開示されている改変されたＩＧＦ−１前駆タンパク質において欠失していてもよい又は変異していてもよい。
従って、本発明は、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含有する、すなわち、ヒトＩＧＦ−１由来のＥａ−ペプチドを含む、ポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は別のアミノ酸によって置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、ポリペプチドを提供する。Ｅ−ペプチドは、Ｅａ、Ｅｂ又はＥｃペプチド（配列番号２〜４）であってもよい。特定の実施形態において、４２位におけるアミノ酸グリシンは欠失し又はアミノ酸若しくはセリンによって置換されている。
一実施形態において、上記のＧ４２位にて変異している（欠失し又はセリンに変異している）上記のヒトＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質は、アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５におけるさらなる欠失及び／又は変異を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応する。
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸が以下である、ヒトＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含むポリペプチド。
（１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２２ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２ ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２５ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ａ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
別の実施形態において、本開示はポリペプチド（１）〜（２９ａ）を含む上記タンパク質であって、１〜３位にて変異している代わりに前記分子が、アミノ酸Ｅ３のみが欠失している、タンパク質に関する（例えば、分子（２８ａ）はまた、ヒトＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している、ポリペプチドを指すことができる）。
さらに、本開示は、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含有する、すなわち、免疫グロブリンＦｃ領域に融合しているヒトＩＧＦ−１由来のＥａ−ペプチドを含む、ポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンが別のアミノ酸によって置換されており、前記タンパク質のＩＧＦ−１部分のアミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、ポリペプチドに関する。Ｅ−ペプチドは、Ｅａ、Ｅｂ又はＥｃペプチドであってもよく、４２位におけるグリシンが置換されているアミノ酸はセリンである。
従って、一実施形態において、本開示は、ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、（ａ）アミノ酸Ｇ４２が欠失し又はアミノ酸セリンによって置換されており、（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域、特に改変されたＦｃ領域、特にＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されているＦｃ領域に連結している、ポリペプチドに関する。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、Ｆｃ領域がＦｃ受容体又は相補体のＣ１成分に対して変化した親和性を有するように、異なるアミノ酸残基と置き換えてもよい。いわゆる発現停止した免疫グロブリンＦｃ領域が当該分野において記載されている：ＬＡＬＡ及びＮ２９７Ａ（Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691）;及びD265A（Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W.,上記）。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む、いわゆるＬＡＬＡ変異体を含む。サイレントＩｇＧ１抗体の別の例はＤ２６５Ａ変異を含む。別のサイレントＩｇＧ１抗体はＮ２９７Ａ変異を含み、これにより、無グルコシル化（aglycosylated）／非グリコシル化（non-glycosylated）抗体が得られる。
上述のＬＡＬＡアプローチは、両方、Ｗｉｎｔｅｒらによる、ＵＳ５，６２４，８２１及びＵＳ５，６４８，２６０にさらに詳細に記載されている。従って、一実施形態において、開示されているｈＩＧＦ−１前駆タンパク質は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異又はＤ２６５Ａ変異又はＮ２９７Ａ変異を含むＦｃ領域に融合している。このようなＦｃ ＬＡＬＡ、Ｄ２６５Ａ又はＮ２９７Ａ構築物はＡＤＣＣ活性を低下させる。
一実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンがアミノ酸セリンによって置換されている、ポリペプチドは、アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７及び／又はＲ１０４においてさらなる欠失及び／又は変異を含む。
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンがアミノ酸セリンによって置換されており、前記タンパク質のＩＧＦ−１部分のアミノ酸の番号付けが配列番号５に対応し、アミノ酸が以下である、ポリペプチド
（１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失している。
（１０ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され又は欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異している。
（２２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２ ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
２７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している。
別の実施形態において、本開示は、上記のポリペプチド（１ｂ）〜（２９ｃ）を含む上記のタンパク質であって、１〜３位にて変異している代わりに、前記分子が、アミノ酸Ｅ３のみが欠失している、タンパク質に関する（例えば、分子（２８ｃ）はまた、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含む、ポリペプチドであって、アミノ酸Ｇ４２がアミノ酸のアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に変異している、ポリペプチドを指すことができる）。
別の実施形態において、本開示は、アミノ酸
からなる変異したＥ−ペプチドを含む、上記のポリペプチド（例えばポリペプチド１〜２９ｃ）に関する。
さらなる実施形態において、本開示は、Ｆｃ領域に融合している上記のＩＧＦ−１前駆タンパク質であって、Ｆｃ領域が改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドに直接融合していてもよい又は当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を使用してヒンジ領域によって結合していてもよい、ＩＧＦ−１前駆タンパク質を提供する。ＤＮＡヒンジ領域が使用される場合、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドの任意の部分に結合していてもよい。一実施形態において、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドのＣ末端に直接融合している。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｇｌｙ Ｓｅｒ（−ＧＳ−）リンカーによって改変されたＩＧＦ−１前駆ポリペプチドのＣ末端に連結している。
ＤＮＡリンカーは、操作を容易にするように成分の間に制限部位を提供するために使用してもよい。リンカーはまた、宿主細胞からポリペプチドの発現を向上させるため、成分がその最適な三次又は四次構造を推測でき、且つ／又はその標的分子と適切に相互作用できるように立体障害を減少させるために提供してもよい。所望のスペーサーを識別するリンカー及び方法に関しては、例えば、George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879を参照のこと。
リンカー配列は、受容体成分に天然に結合した１つ又は複数のアミノ酸を含んでもよく、又は融合タンパク質の発現を向上させるために使用される付加配列であってもよく、成分ドメインが最適な三次構造を形成でき、且つ／又はその標的分子との成分の相互作用を向上させることができる、目的の特に望まれる部位を提供する。一実施形態において、リンカーは、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜２５アミノ酸長の間にある１つ又は複数のペプチド配列を含む。一実施形態において、リンカーは１〜５アミノ酸長である。一実施形態において、リンカーは３アミノ酸配列であり、より具体的には、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙの３アミノ酸配列である。別の実施形態において、リンカーはＧｌｙ Ｓｅｒである。
このようなヒンジ分子の例は、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる：
従って、本開示は、好ましくは上記のようにアミノ酸２３４及び２３５の一方又は両方をアラニンに置換することによって、免疫グロブリンＦｃ領域、特に改変されたＦｃ領域、特にＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されているＦｃ領域に融合しているヒトＩＧＦ−１ Ｅａ−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンがセリンによって置換され、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応し、免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域を介してＩＧＦ−１前駆タンパク質に融合している、ポリペプチドに関する。
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチド：
が含まれる。
本開示の１つの特定の実施形態において、上記のＩＧＦ−１前駆タンパク質のアミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は以下のように変異していてもよい：
（１）Ｒ７１及びＳ７２の一方若しくは両方の欠失、並びに／又は
（２）Ｒ７１及びＳ７２の一方若しくは両方をアラニンなどの非塩基性アミノ酸に変異すること、並びに／又は
（３）Ｒ７１とＳ７２の間に１つ若しくは複数の非塩基性アミノ酸を挿入すること、並びに／又は
（４）プロテアーゼ部位をマスクするのに十分にＲ７１及びＳ７２に近接してグリコシル化部位を配置すること、並びに／又は
（５）非天然アミノ酸による、Ｒ７１若しくはＳ７２のいずれかの置換、又はＲ７１とＳ７２に近接した若しくは間の挿入を使用した部位特異的ペグ化。
部位特異的変異誘発法、グリコシル化部位の導入又は部位特異的ペグ化のようなタンパク質改変のための方法は当業者に周知である。
一実施形態において、Ｆｃ領域はＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されている。一実施形態において、Ｆｃ領域はＦｃ受容体に対するその親和性を低下させるように改変されている。一実施形態において、Ｆｃ領域はＡＤＣＣ活性を低下させるように改変されている。一実施形態において、Ｆｃ領域はＡＤＣＣ活性を阻止するように改変されている。
一実施形態において、本発明は、配列番号８（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ）を含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号９（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ）を含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号１０（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ）を含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明は配列番号１１（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ）を含むポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、配列番号１２（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ）を含むポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、配列番号１３（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ）を含むポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、配列番号１４（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｆ）を含むポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３又は１４からなるポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明のポリペプチドはグリコシル化される。
アミノ酸変異
上記で参照したように、種々のアミノ酸は別のアミノ酸に変異してもよい。典型的には、アミノ酸はアラニン残基と置換される。しかしながら、別の基（すなわち、極性、酸性、塩基性又は非極性）由来の非天然アミノ酸又は天然アミノ酸などの他のアミノ酸を使用してもよい。変異をタンパク質のアミノ酸内に導入する方法は当業者に周知である。例えば、Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと）。方法は、限定されないが、変異原性プライマーにより行われるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるポリペプチドの機能的に活性なバリアント又はその断片をコードし、必要とされる場合、アセンブリＰＣＲ又は「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ．ＴＭ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販のキットを使用する変異の導入によって断片を構築するＤＮＡの増幅を含む。例えば、Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと）。さらに、変異配列は、営利会社（例えば、Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって提供されるサービスである合成遺伝子の合成によって得られ得る。ポリペプチドの機能に影響を与えないアミノ酸を置換することによるポリペプチドに対するポリペプチドの機能的に活性なバリアント又は誘導体の生成は当業者によって達成され得る。
免疫グロブリンＦｃ領域
一実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ由来である。一実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧに由来する。ＩｇＧのＦｃドメインは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４並びに各々のアイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択してもよい。一実施形態において、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。
Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を変化させるために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基によって置換することによって変化してもよい。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、Ｆｃ領域がＦｃ受容体又は相補体のＣ１成分に対して変化した親和性を有するように、異なるアミノ酸残基によって置換してもよい。このアプローチは、Ｗｉｎｔｅｒらによる、ＵＳ５，６２４，８２１及びＵＳ５，６４８，２６０の両方にさらに詳細に記載されている。特に、残基２３４及び２３５は変異してもよい。特に、これらの変異はアラニンであってもよい。従って、一実施形態において、本発明の抗体はアミノ酸２３４及び２３５の一方又は両方においてＦｃ領域における変異を有する。別の実施形態において、アミノ酸２３４及び２３５の一方又は両方はアラニンに置換してもよい。残基２３４及び２３５がアラニンに置換されているこのようなＦｃバリアントは一般に「ＬＡＬＡ」と称される。このようなＦｃ ＬＡＬＡ構築物は低下したＡＤＣＣ活性を有する。一実施形態において、ＩＧＦ−１前駆タンパク質はＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｆｃに連結している。
連結
免疫グロブリンＦｃ領域に融合した／連結した開示されているタンパク質の文脈において本明細書に使用される場合、「に融合した」又は「に連結した」とは、同じポリペプチドにおいて天然に存在しない２つのポリペプチドを結合することを意味する。
免疫グロブリンＦｃ領域は、改変されたＩＧＦ−１ポリペプチドに直接融合してもよく、又は当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を使用してリンカーによって結合してもよい。ＤＮＡリンカーが使用される場合、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１ポリペプチドの任意の部分に結合してもよい。一実施形態において、Ｆｃ領域は改変されたＩＧＦ−１ポリペプチドのＣ末端に直接融合している。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｇｌｙ Ｓｅｒ （−ＧＳ−）リンカー及び／又はｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ（配列番号８）、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ（配列番号９）、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ（配列番号１０）、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ（配列番号１１）、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ（配列番号１２）、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ（配列番号１３）又はｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｆ（配列番号１４）についてのようなヒンジ領域（配列番号２２〜２４）によって改変されたＩＧＦ−１ポリペプチドのＣ末端に連結している。
ＤＮＡリンカーは、操作を容易にするように成分の間に制限部位を提供するために使用してもよい。リンカーはまた、宿主細胞からポリペプチドの発現を向上させるため、成分がその最適な三次又は四次構造を推測でき、且つ／又はその標的分子と適切に相互作用できるように立体障害を減少させるために提供してもよい。所望のスペーサーを識別するリンカー及び方法に関しては、例えば、George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879を参照のこと。
リンカー配列は、受容体成分に天然に結合した１つ又は複数のアミノ酸を含んでもよく、又は融合タンパク質の発現を向上させるために使用される付加配列であってもよく、成分ドメインが、最適な三次構造を形成でき、且つ／又はその標的分子との成分の相互作用を向上させることができる、目的の特に望まれる部位を提供する。一実施形態において、リンカーは、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜２５アミノ酸長の間にある１つ又は複数のペプチド配列を含む。一実施形態において、リンカーは１〜５アミノ酸長である。一実施形態において、リンカーは３アミノ酸配列であり、より具体的には、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙの３アミノ酸配列である。別の実施形態において、リンカーはＧｌｙ Ｓｅｒである。
核酸
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。好ましい核酸配列は、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ又はｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｆ（配列番号１５〜２１）をコードするものである。本発明の核酸分子はｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態又は例えばｃＤＮＡ若しくは合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。核酸分子は、二本鎖であってもよく、又は一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られているコード鎖であってもよく、又はそれは、アンチセンス鎖とも称される非コード鎖であってもよい。
遺伝コードの縮重は周知である。従って、２つ以上の異なる核酸配列は同じポリペプチド配列をコードできる。このようなバリアント核酸配列は本出願の範囲内に含まれる。実際に、本発明のポリペプチドの発現を改善するために核酸配列に対して保存的改変を行うことは好適であり得る。
本発明は本発明の核酸を含むベクターをさらに提供する。ベクターはクローニング又は発現ベクターであってもよい。一実施形態において、核酸は当業者に周知の効果的な発現に必要とされるエレメントを保有する発現ベクター内に含まれてもよい。エレメントは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーターなどの例えばプロモーター、分泌を促進することが知られている天然又は任意の他の配列などの分泌のためのシグナル配列、例えばウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター、エピソーム複製及び原核生物（例えばＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１又は当該分野において知られている他のもの）内の複製を可能にするエレメント並びにアンピシリン耐性遺伝子及びゼオシン又はハイグロマイシンマーカーなどの選択を可能にするエレメントを含む。
一実施形態において、本発明は、
ａ）配列番号１５に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｂ）配列番号１５に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１６に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｄ）配列番号１６に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１７に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｆ）配列番号１７に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列、
ｇ）配列番号１８に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｈ）配列番号１８に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列、
ｉ）配列番号１９に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｊ）配列番号１９に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列、
ｋ）配列番号２０に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｌ）配列番号２０に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列、
ｍ）配列番号２１に記載されるポリヌクレオチド配列又はその相補体、
ｎ）配列番号２１に記載される配列全体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を提供する。
別の実施形態において、本開示は、前記ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質がペグ化される、上記のＩＧＦ−１バリアントポリペプチドに関する。ペグ化はヒトＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域に融合していないＩＧＦ−１前駆タンパク質にとって特に好ましい。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ；ペグ化）に対するコンジュゲーションは、治療タンパク質薬物の半減期を延長するのに有益であることが証明されている。本発明のＩＧＦ前駆ポリペプチドのペグ化は同様の医薬的利点（pharmaceutical advantage）を生じ得ることが予想される。ＩＧＦ−１をペグ化する方法は当該分野において周知である。例えば、リシン−モノペグ化ＩＧＦ−１の有益な特性を記載している、米国特許出願公開第２００６／０１５４８６５号を参照のこと。このようなリシン−モノペグ化は本発明の前駆ＩＧＦポリペプチドに適合され得る。加えて、ペグ化は非天然アミノ酸を導入することによって本発明のポリペプチドの任意の部分において達成され得る。特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004又は米国特許第７，０８３，９７０号に記載されている技術によって導入され得る。簡潔に述べると、これらの発現系のいくつかは、ａｍｂｅｒ ＴＡＧなどのナンセンスコドンを、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム内に導入するための部位特異的変異誘発法を含む。次いでこのような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用できる宿主内に導入され、最適な非天然アミノ酸が充填される。本発明のポリペプチドに部分をコンジュゲートする目的のために有益である特定の非天然アミノ酸はアセチレン及びアジド側鎖を有するものを含む。次いでこれらの新規アミノ酸を含有するＩＧＦ前駆ポリペプチドはタンパク質内のこれらの選択された部位でペグ化され得る。加えて、Ｅ−ペプチドを有さないこのようなペグ化ＩＧＦ分子もまた、治療剤として有用である。
哺乳動物細胞における本発明のＩＧＦ−１バリアントの産生
原核生物発現系における天然ヒトＩＧＦ−１の産生は当業者に周知である。真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞における発現は、このような真核細胞が、原核細胞より、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性なタンパク質を構築し、分泌しやすいので、時々好ましい。
本発明の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようなＤＨ ＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるUrlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓２９３細胞）、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。好ましい宿主細胞はＣＨＯ Ｋ１派生細胞である。しかしながら、ＣＨＯ細胞株における組換えＩＧＦ−１の発現は、細胞成長阻害及び低力価を生じる（図１１／１２を参照のこと）。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」技術を使用したＣＨＯ細胞におけるＩＧＦ−１−Ｒの安定なノックダウン／ノックアウトは、改善された細胞成長及びより高いＩＧＦ−１タンパク質力価を生じた（図１４、１５、１６）。ＩＧＦ−１をコードするプラスミドで安定にトランスフェクトされたＩＧＦ−１−Ｒ（ｓｉ／ｓｈＲＮＡノックダウン）の低下した発現を有するＣＨＯ細胞は、安定にトランスフェクトした野生型ＣＨＯ細胞と比較して約５倍高いプール力価を生じた。さらに高いプール力価がＩＧＦ−１−Ｒノックアウト細胞株の安定なトランスフェクション後に測定され得る。組換えＩＧＦ−１の５〜２０倍の力価増加が野生型ＣＨＯ細胞株と比較して検出され得る。要約すると、これらのデータは、哺乳動物細胞株におけるＩＧＦ−１受容体遺伝子のノックダウン又はノックアウトがＩＧＦ−１及びそのバリアントの産生を顕著に改善できることを示す。
従って、哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を欠いている、前記哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞において組換えＩＧＦ−１又はそのバリアントを産生するのに適した方法は、以下の工程：
ａ．インスリン様成長因子１受容体の発現を欠いている哺乳動物細胞を産生する工程、
ｂ．ＩＧＦ−１又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで工程ａの細胞を形質転換する工程、
ｃ．形質転換している工程ｂの細胞を選択する工程、
ｄ．ＩＧＦ−１又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で工程ｃにおいて選択された細胞を培養する工程、
ｅ．工程ｄにおいて培養された哺乳動物細胞からＩＧＦ−１又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程ａ．及びｂ．の順序は逆転してもよく、又は両方の工程は同時に実施してもよい。
当業者は、遺伝子組換えされた哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１派生細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のようなＣＨＯ細胞を形質転換し、選択し、培養する方法を知っている。選択プロトコルが、成長因子、例えばＩＧＦ−１のような所望の治療タンパク質をコードする組換えＤＮＡを組み込んでいる可能性のある細胞の選択を容易にするために通常使用されている。形質転換ベクターに同時に組み込まれた遺伝子によって付与される抗生物質耐性又は栄養選択培地中で成長する能力が通常使用される（Weber, W. and Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Amsterdam, pp. 589-604を参照のこと）（Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi）。組換えタンパク質産生のための２つの最も一般的なＣＨＯ発現系は、シヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）系メトトレキサート（ＭＴＸ）選択又はグルタミン合成酵素（ＧＳ）系メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）選択を利用する（Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb; 74(2):127-38. Epub 2009 Oct 22. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production）。
哺乳動物細胞、特にＣＨＯ及びＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞などの齧歯動物細胞においてポリペプチドを産生するのに特に適しているベクターは特許出願ＷＯ０９０８０７２０Ａに開示されている。哺乳動物宿主細胞内に発現ベクターを導入するための従来技術において知られているいくつかの適切な方法が存在する。それぞれの方法は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃により及びポリマーにより媒介される遺伝子導入を含む。適切な宿主細胞は上記されている。宿主細胞内への発現ベクター核酸の導入後、得られた形質転換体を、発現カセット（ＭＳＭ）内に含まれる哺乳動物選択可能マーカー遺伝子の発現をアッセイするのに適した選択的条件下で培養する。これは、例えば哺乳動物選択可能マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、形質転換体が、哺乳動物細胞内で対応する抗生物質活性を含有する培地中で培養され、このような条件下で生存する形質転換体が選択され、それによりマーカー遺伝子を発現する形質転換体の取得を可能にし、それによりベクターが組み込まれていることを意味する。さらに、第２の選択工程は、発現カセット（ＭＡＳＭ）に含まれる増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を選択するのに適合された選択培地中で形質転換体を培養することによって実施され得る。例えばＤＨＦＲが増幅可能な選択可能マーカー遺伝子として使用される場合、形質転換体はＤＨＦＲ阻害剤の存在下でヌクレオチド又はプリンを含まない培地中で培養され得る。誘導プロモーターが少なくとも１つの発現カセットに使用される場合、対応する誘導シグナルはポリペプチドの発現を開始するために提供されるべきである。ＤＨＦＲ選択／増幅系を使用するために、前記宿主細胞は、ＤＨＦＲ阻害剤の存在下で培養され得る。適切なＤＨＦＲ阻害剤は例えばＭＴＸなどの抗葉酸剤である。使用される抗葉酸剤／ＭＴＸの濃度は宿主細胞及びベクター内に組み込まれたＤＨＦＲバリアントに依存する。濃度範囲は、例えば約５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の値から５００ｎＭ〜１０００ｎＭの値又は二次若しくはさらなる増幅工程のためにさらに高い値にてＤＨＦＲ”宿主細胞において多工程の増幅手順のために選択され得る。ＤＨＦＲ＋について、細胞開始濃度は、最初の工程において１００ｎＭ〜７５０ｎＭ、好ましくは５００ｎＭ、さらなる増幅工程について５００ｎＭ〜１０００ｎＭ及びそれ以上の範囲で通常高い。適切なＤＨＦＲバリアントは上記されている。
ＧＳ選択／増幅系を使用するために、前記宿主細胞は例えばＭＳＸの存在下で培養され得る。使用されるＭＳＸの濃度は宿主細胞に依存する。濃度範囲は、約１５〜１５０マイクロモル、２０〜１００マイクロモル及び２５〜５０マイクロモルの間で選択され得る。これらの範囲はＮＳＯ及びＣＨＯ細胞に特に適している。
医薬組成物
別の態様において、本発明は、組成物、例えば医薬的に許容可能な担体と一緒に製剤化される、上記のＩＧＦ−１バリアントの１つ又は組合せを含有する、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明のＩＧＦ−１バリアントは、少なくとも１つの筋肉量／強度増加剤、例えば、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ＩＧＦ−２又はバリアントＩＧＦ−２、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、グレリンアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模倣物又はホリスタチンと組み合わせてもよい。併用療法に使用され得る治療剤の例は本発明のＩＧＦ−１バリアントの使用についての段落において以下により詳細に記載されている。
「医薬的に許容可能な」という用語は、連邦若しくは州政府の監督官庁により承認されている又は米国薬局方若しくは動物、より特にはヒトでの使用に関する他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤と一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。このような医薬担体は、水及び油（ピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物又は合成起源の油を含む）などの滅菌液であり得る。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望される場合、組成物はまた、少量の湿潤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態を取り得る。伝統的な結合剤及びトリグリセリドなどの担体と共に坐薬として組成物を製剤化することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
好ましい実施形態において、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として常法に従い組成物を製剤化する。必要な場合、組成物は、可溶化剤及び注射部位の痛みを緩和するためのリドカインなどの局所麻酔も含み得る。組成物を点滴により投与すべき場合、医薬グレードの滅菌水又は食塩水を含有する点滴ボトルを用いて投薬することができる。組成物を注射により投与する場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
医薬的に許容可能な担体には、生理学的に適合する任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。担体は、（例えば、注射又は注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、免疫コンジュゲート又は二重特異性分子を、化合物を不活性にし得る酸及び他の天然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングできる。
本発明の医薬組成物は、また、医薬的に許容可能な抗酸化剤を含み得る。医薬的に許容可能な抗酸化剤の例には、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールなど；及び金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。本発明の医薬組成物において利用され得る適切な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、植物油、例えば、オリーブ油及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング物質、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持及び界面活性剤の使用により維持することができる。
これらの組成物は、また、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有し得る。微生物の存在の阻止は、上記殺菌手順並びに種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方により確保され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含させることが望ましいこともある。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの包含により実現され得る。
医薬的に許容可能な担体には、無菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための無菌水溶液又は分散液及び無菌粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当該分野において知られている。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性化合物も組成物に包含することができる。
典型的に、治療用組成物は、製造及び保存の条件下で無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は他の高濃度の薬物に適した調整構造物として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及び適切なそれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことができる。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことにより実現することができる。
無菌注射可能溶液は、上記に挙げられた薬剤の１つ又は組合せと共に、適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を取り込み、必要な場合、次に無菌的精密濾過をすることにより調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒及び上記に挙げられたものから必要な他の薬剤を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、その事前に無菌濾過した溶液から活性剤プラス何らかのさらなる所望の薬剤の粉末が得られる、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
単回投薬形態を産生するために担体物質と組み合わせることができる活性剤の量は、治療される対象及び特定の投与様式に依存して変化する。単回投薬形態を産生するために担体物質と組み合わせることができる活性剤の量は、一般的に治療効果を引き起こす組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は、医薬的に許容可能な担体との組合せで活性剤が約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％又は活性剤が約１％から約３０％の範囲である。
投与レジメンは、所望の最適応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、又は治療状況の緊急性により指示されるとき、比例的に用量を減少又は増加してもよい。特に投与の容易性及び用量の均一性のため、非経口組成物を投薬単位形態（単位剤形（dosage unit form））で製剤化することが有利である。本明細書において使用される場合、投薬単位形態は、治療される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を指し、それぞれの単位は、必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、及び各個体における治療感受性に関して、このような活性化合物を配合する技術に固有の限界により規定され、直接的に依存する。
本開示のＩＧＦ−１バリアント又は前記ＩＧＦ−１バリアントを含む組成物の投与の文脈において治療有効量のポリペプチドは、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、さらに通常０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、約１ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、約３ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、約５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。当業者は、投与経路（例えば静脈内又は皮下）に依存して変化する、適切な有効量を識別することを知っている。例示的な治療レジメは、１日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回又は１カ月に１回の投与を必要とする。このような投与は静脈内又は皮下で実施してもよい。本発明のＩＧＦ−１バリアントについての投与レジメンには、静脈内投与により０．１ｍｇ／ｋｇ体重又は０．２ｍｇ／ｋｇ体重又は０．３ｍｇ／ｋｇ体重又は０．５ｍｇ／ｋｇ体重又は１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。或いは、組成物は持続放出製剤であってもよく、この場合、少ない投与頻度が必要とされる。用量及び頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。投薬量及び頻度は、治療が予防的又は治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用において、比較的低投薬量を比較的低頻度の間隔で長期間投与する。一部の患者は、残りの生涯、治療を受け続ける。治療的適用において、時々、比較的高投薬量が、比較的短間隔で、疾患の進行を遅らせるか若しくは停止させるまで、又は患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで必要とされる。その後、患者は予防レジメで投与され得る。
本発明の医薬組成物中の活性剤の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するために有効であり、患者に毒性がない、活性剤の量を得るために変化させることができる。選択された投薬量レベルは、利用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、利用される特定の化合物の排泄速度、治療の期間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態及び病歴並びに医薬分野で周知の因子を含む、種々の薬物動態因子に依存する。
本発明の組成物に含まれるＩＧＦ−１バリアントの治療有効量の投与は、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度及び持続時間の増加、又は疾患の苦痛による機能障害若しくは身体障害の予防、すなわち、筋肉量及び／若しくは機能の増加又は熱傷患者における創傷部の減少／低下をもたらすことができる。
患者は、有効量のポリペプチド活性成分、すなわち、問題のある疾患又は障害を検出、治療、改善又は予防するのに十分な量を受ける。治療効果はまた、身体症状の低下を含み得る。任意の特定の対象についての治療タンパク質の最適な有効量及び濃度は、患者の年齢、大きさ、健康及び／又は性別、状態の性質及び程度、特定の治療タンパク質の活性、身体によるそのクリアランスの速度及びまた、治療タンパク質と組み合わせて投与される任意の可能なさらなる治療剤を含む、様々な因子に依存する。所与の状況について送達される有効量は、慣用の実験により決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。投薬量は単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールによってもよい。
本発明の組成物は、当分野において知られている種々の方法のうちの１つ又は複数を使用して、１つ又は複数の投与経路により投与することができる。当業者により理解されているように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に依存して変化する。本発明の治療タンパク質についての投与の形路は、例えば注射又は注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口経路の投与を含む。本明細書に使用される場合、「非経口投与」という語句は、通常、注射による、経腸及び局所投与以外の投与の様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、組成物を含む抗体は静脈内に投与される。別の実施形態において、抗体は皮下に投与される。
或いは、本発明の組成物を含むＩＧＦ−１バリアントは、非経口ではない経路、例えば、局所、上皮又は粘膜経路の投与、例えば、鼻内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的又は局所的により投与することができる。
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、化合物を迅速な放出に対して保護する担体と共に調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許されているか、又は一般的に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
治療用組成物は、当該分野で知られている医療デバイスで投与することができる。例えば、一実施形態において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４又は４，５９６，５５６に示されているデバイスで投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、制御された速度で医薬を投薬するためのインプラント可能な微小注入ポンプを示す米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して医薬を投与するための治療デバイスを示す米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを示す米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための流量可変のインプラント可能な注入装置を示す米国特許第４，４４７，２２４号；複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４７５，１９６号を含む。他のこのような多数のインプラント、送達系及びモジュールは当業者に知られており、ＭｉｃｒｏＣＨＩＰＳＴＭ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）により製造されるものを含む。
特定の実施形態において、本発明の組成物を含むヒトＩＧＦ−１バリアントをインビボで適切な分布を確実にするため製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを（所望の場合）通過することを確実にするために、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関して、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；５，３７４，５４８；及び５，３９９，３３１を参照のこと。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に輸送される１つ又は複数の部分を含むことができ、それにより標的薬物送達を向上させる（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685を参照のこと）。例示的な標的化部分は、葉酸又はビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）を含む； K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273も参照のこと。
標的疾患及び障害
本発明は、治療に使用するための本発明のポリペプチド、核酸又は医薬組成物を提供する。本発明は、病理学的障害の治療に使用するための本発明のポリペプチド、核酸又は医薬組成物をさらに提供する。本発明は、病理学的障害の治療のための医薬の製造における本発明のポリペプチド、核酸又は医薬組成物の使用をさらに提供する。本発明は、治療有効量の本発明のポリペプチド、核酸又は医薬組成物を患者に投与することを含む、病理学的障害を患っている患者を治療する方法をさらに提供する。
病理学的障害は、筋萎縮などの筋骨格疾患又は障害であり得る。グルココルチコイド、例えば、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン又はプレドニゾロンでの治療の結果として含む、筋萎縮の多数の原因が存在する。筋萎縮はまた、神経外傷による脱神経の結果又は変性、代謝性若しくは炎症性神経障害（例えば、ギランバレー症候群、末梢性神経障害又は環境毒素若しくは薬物への暴露）の結果であり得る。
加えて、筋萎縮は、筋疾患、例えば、筋緊張症；先天性筋疾患、例えば、ネマリン筋疾患、マルチ／ミニコア筋疾患及び筋細管（中心核）筋疾患；ミトコンドリア性筋疾患；家族性周期性四肢麻痺；炎症性筋疾患；例えば、グリコーゲン又は脂質蓄積疾患により引き起こされる代謝性筋疾患；皮膚筋炎（dermatomyositisis）；多発性筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋融解症及びミオグロビン尿症の結果であり得る。
本開示の別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ケネディ病又は慢性腎疾患の治療のために使用され得る。
筋疾患は、筋ジストロフィー症候群、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張、顔面肩甲上腕、エメリードレフュス、眼咽頭筋、肩甲上腕、肢帯、福山、先天型筋ジストロフィー、又は遺伝的末梢性ミオパシーにより引き起こされ得る。筋骨格疾患はまた、骨粗鬆症、骨折、低身長症又は小人症であり得る。
加えて、筋萎縮は、成人運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症；乳児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症、多巣性伝導ブロックでの自己免疫性運動神経障害、卒中又は脊髄損傷による麻痺、外傷による骨格固定化、長期のベッド休養、自発的不活化、不随意不活化、代謝ストレス又は栄養不足、癌、ＡＩＤＳ、空腹時、甲状腺若しくは副腎若しくは下垂体障害、糖尿病、良性先天性低血圧、セントラルコア疾患、肝臓疾患（例えば、線維症、肝硬変症など）、敗血症、腎不全、鬱血性心不全、加齢、宇宙旅行又は無重力環境で過ごすことの結果であり得る。
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、除脂肪体重の喪失及び／又は筋肉疲労を患っている成人及び小児熱傷を含む熱傷患者の治療に使用され得る。
治療され得る加齢関連状態の例には、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、平均寿命の減少、衰弱、記憶障害、しわ、腎機能障害及び加齢性難聴；ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖及び肥満を含む、代謝障害が含まれる。
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の治療のために使用され得る。
本開示の別の実施形態において、本発明の医薬組成物は筋萎縮の治療のために使用され得る。特定の実施形態において、本開示は、筋萎縮の治療のための本発明の医薬組成物の使用であって、萎縮の群が、肥満に関連したサルコペニア、サルコペニア及び糖尿病に関連した筋萎縮からなる群から選択される、使用に関する。
治療され得る他の状態には、急性及び／又は慢性腎疾患又は不全、肝線維症又は肝硬変症、癌、例えば、膵臓、消化管（食道、胃及び結腸を含む）、肺、前立腺、リンパ腫又は乳癌；パーキンソン病；神経細胞死と関連する状態、例えば、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、脳萎縮又は認知症及び貧血；ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）により引き起こされるか、又は非定型抗酸菌（atypical mycobacteria）により引き起こされるかに関わらず、結核などの慢性感染症；慢性真菌感染症；及び医原性か、又はＡＩＤＳに起因するかに関わらず、免疫抑制の状況における日和見感染症が含まれる。
さらなる状態には、悪液質、関節リウマチに関連する悪液質及び癌に関連する悪液質が含まれる。
別の実施形態において、本開示は、筋障害を治療する方法であって、上記のように治療有効量の本発明のポリペプチドを投与することを含む、方法に関する。筋肉量を増加させるために開示されているポリペプチド又はそれらを含む組成物による治療の必要性は、特に、筋萎縮などの筋骨格疾患又は障害の結果として、上述の状態のうちの１つに起因し得、筋障害は、肥満に関連したサルコペニア、サルコペニア及び糖尿病に関連した筋萎縮からなる群から選択される筋萎縮である。
さらに、本開示は、熱傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコペニアのような加齢関連状態、ケネディ病又は慢性腎疾患を治療する方法であって、上記のように治療有効量の本発明のポリペプチドを患者に投与することを含む、方法に関する。
別の実施形態において、本開示は筋肉量を増加させる方法に関する。特定の実施形態において、本開示は、必要とする患者において筋肉量を増加させる方法に関する。筋肉量を増加させる必要性は、特に、筋萎縮などの筋骨格疾患又は障害の結果として、上述の状態のうちの１つに起因し得る。筋肉量を増加させる必要性はまた、熱傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコペニアのような加齢関連状態、ケネディ病又は慢性腎疾患に起因し得る。
患者投与
本発明の医薬組成物は患者に投与され得る。投与は典型的には注射器による。従って、本発明は本発明の医薬組成物を含む送達デバイス（例えば注射器）を提供する。
様々な送達系が知られており、本発明のポリペプチドを投与するために、例えばリポソーム中でのカプセル封入、微小粒子、マイクロカプセル、タンパク質を発現させることができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987を参照のこと）レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス（例えば、アビポックスウイルス、特に鶏痘ウイルス）又は他のベクターなどの一部としての核酸の構築物を使用することができる。導入方法は、腸内又は非経口であってもよく、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺、鼻内、眼内、硬膜外及び経口経路が含まれる。いずれかの好都合な経路により、例えば点滴又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通じた吸収によりポリペプチドを投与することができ、他の生物学的に活性のある薬剤と共に投与できる。投与は全身又は局所であってもよい。加えて、脳室内及び鞘内注射を含む任意の適切な経路により、中枢神経系に本発明の医薬組成物を導入することが所望され得；例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに連結した脳室内カテーテルにより脳室内注射を促進し得る。
特定の実施形態において、治療を必要とする部位に局所的に本発明の医薬組成物を投与することが所望され得、例えば、限定されないが、外科手術中の局所点滴、局所適用により、例えば注射によって、カテーテルによって、又はインプラントによって、多孔、非多孔又はゼラチン性材料であるインプラント（シアラスティック（sialastic）膜などの膜を含む）、繊維又は市販の皮膚代替物によって、これを遂行し得る。
別の実施形態において、小胞、特にリポソームにおいて、医薬組成物を送達することができる（Langer, Science 249:1527-1533, 1990を参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御放出系において活性剤を送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる。
患者群
提案された治療から恩恵を受け得る患者は、集中治療又は長期入院（１週超）を必要とする急性又は重症疾患から回復している患者；サルコペニアを有する虚弱高齢患者；交通事故、重度の熱傷、戦闘負傷などの重症外傷及び他の外傷から回復している若年成人；上記のように悪液質を引き起こすことが知られている慢性疾患を有する患者；及び上記のように筋肉疾患を有する患者を含む。筋肉の喪失は重度又は長期のいずれかであるほとんどの病気の一般的な合併症であるので、筋肉疲労の反転は回復を加速させ、この喪失の根本原因に関わらず、筋肉低下を経験している患者の機能を戻すことが予測される。
併用療法
この治療は筋肉疲労プロセスの主要な原因に向けられている任意の治療と組み合わせ得る。このような組合せは、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗サイトカイン剤、抗癌薬；エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ又はその他などの成長因子；糖尿病の治療に使用される薬物（インスリン及び経口血糖降下剤を含む）、抗結核薬及び抗生物質を含んでもよい。組合せは小分子及び生体分子剤の両方を含んでもよい。
本発明の医薬組成物は、唯一の活性剤として、又は例えばアジュバントと併せて、又は他の薬物、例えばＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢデコイ模倣物、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、グレリンアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模倣物又はホリスタチンと組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の薬物は、ＷＯ２０１０１２５００３に開示されているＡｃｔＲＩＩＢ抗体と組み合わせて使用してもよい。
本発明を実施する方法
本発明は例としてのみ記載されており、本発明の範囲及び趣旨の範囲内にある限り、改変がなされてもよいことは理解される。
本明細書に開示されている組換えＩＧＦ−１バリアントは野生型タンパク質様受容体親和性を有するが（図１）、野生型ＩＧＦ−１よりインビボプロファイルにおいて良好な薬物動態を示し（図７）、低頻度の投薬で筋萎縮を阻止するために使用され得る（図８）。低血糖のリスクを導くインスリン受容体（ＩｎｓＲ）リン酸化を刺激する、従来技術のＩＧＦ−１バリアントのいくつかと対照的に、Ｇ４２位において変異している（欠失又は特定の置換）本開示のヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質は、前記低血糖のリスクを減少させる、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）リン酸化を刺激する野生型と同様の能力を示す（図５／６／１９）。さらに、野生型ｈＩＧＦ−１又はいくつかの従来技術のそのバリアントと対照的に、本明細書に開示されているＩＧＦ−１バリアントは、高力価で、哺乳動物細胞系において分解せずに産生され得、工業規模の産生を可能にする。
パートＡ：一般的方法
Ａ１ 試薬
組換えヒトＩＧＦ−１はＮｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ製であり、組換えヒトインスリンはＰｒｏｍｏｃｅｌｌ（＃Ｃ−６０２１２）から購入した。
Ａ２ ベクター構築
本発明の教示に係るいくつかのベクター構築物は実現可能である。ベクターの個々のエレメントは従来技術において知られているので、適切なベクターが、例えば、基本的な遺伝エレメントのシークエンシング又は増幅及び適切なクローニング並びに所望の方向における発現カセットによって構築され得る。それぞれのクローニング法は従来技術の水準であり、また、上記の遺伝エレメントの配列も従来技術に記載されている。続いて、ベクター構築物の生成は例として記載されている。しかしながら、それぞれのベクターを得るためのいくつかの他の実施形態及び手段が適しており、容易に利用できることは当業者により理解される。この段落に記載されている全ての哺乳動物発現ベクター（例えばｐＢＷ６７９）は、ＷＯ２００９０８０７２０に記載されている哺乳動物発現ベクターに基づく。ＷＯ２００９０８０７２０の実施例の段落、特に図１、表１及び実施例の段落ＩＩ：ベクター構築物（２１〜３１ページ）は本明細書に参照として組み込まれる。
５’Ｋｏｚａｋ（CCCGCCCGCCCACC）（配列番号１１２）に隣接したｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌＧＰＥ−Ｒ３７Ａ）（配列番号８７）のデノボ合成をＴｈｅ Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈに注文し、５’ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ及び３’ＥｃｏＲＩ制限部位をＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ ｐＵＣベクター内に送達した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内への再クローニングを、適合性のある５’ＢａｍＨＩ及び３’ＥｃｏＲＩクローニング部位でのライゲーション反応によって完了した。構築物はＴ７及びＢＧＨＡ特異的プライマーを使用して制御された完全な配列であった。次いで部位特異的変異誘発法（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的変異誘発キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を行って、以前の構築物ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌＧＰＥ−Ｒ３７Ａ／ｐＣＤＮＡ３．１を使用して２つの残基Ｒ７１及びＳ７２を取り除いた。得られた構築物ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｄｅｌＧＰＥ−Ｒ３７Ａ−ｄｅｌＲＳを使用して、ｈＩＧＦ１−Ｅａ（ｄｅｌＧＰＥ、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌＲＳ）を哺乳動物発現ベクターｐＲＳ５ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター、ＮＰＬ０００９６１）内に再クローニングした。ＰＲＳ５ａは、ＣＭＶプロモーター下の哺乳動物発現ベクター、ＢＧＨ遺伝子（ウシ成長ホルモン）由来のポリアデニル化部位及びアンピシリン耐性である。ｈＩＧＦ１−Ｅａ（ｄｅｌＧＰＥ、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌＲＳ）／ｐＲＳ５ａをＮＰＬ００９７５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）として保存した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ（ｄｅｌ ＧＰＥ、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌ ＲＳ）をＮＰＬ００９７５９から増幅した。ＰＣＲ産物を５’ＨｉｎｄＩＩＩ／３’ＢａｍＨＩによって消化し、ｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡベクター（ＮＰＬ０１２９３５、Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）内にクローニングした。上記の部位特異的変異誘発法の数回のラウンドを実施して、ｈＩＧＦ１−Ｅａ（ｄｅｌＧＰＥ、Ｒ３７Ａ、ｄｅｌＲＳ）−［Ｒ７４Ｑ−Ｒ７８Ｑ−Ｒ１０４Ｑ］（ＮＰＬ０１７５８０、Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）についてのプラスミドを送達した。このプラスミドを以下に記載されているさらなるクローニングに基づいて使用した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ２のプラスミド：Ｇ４２Ｓ変異を含有するＰＣＲ断片を変異原性オリゴ
を使用してＮＰＬ０１７５８０から増幅した。ＢｌｐＩ及びＢｓｐＥＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、生成したＰＣＲ断片をクローニングしてＮＰＬ０１７５８０に戻すために使用した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ３のプラスミド：Ｇ４２Ｐ変異を含有するＰＣＲ断片を変異原性オリゴ
を使用してＮＰＬ０１７５８０から増幅した。ＢｌｐＩ及びＢｓｐＥＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、生成したＰＣＲ断片をクローニングしてＮＰＬ０１７５８０に戻すために使用した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ４のプラスミド：Ａ３７Ｅ変異を含有するＰＣＲ断片を変異原性オリゴ
を使用してＮＰＬ０１７５８０から増幅した。ゆらぎコドンはＩＵＰＡＣ命名法で与えられ、Ｍは塩基Ａ又はＣを表し、Ｎは塩基Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを表す。後者のオリゴは３７位についてゆらぎコドンを有する。ＢｌｐＩ及びＢｓｐＥＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、生成したＰＣＲ断片をクローニングしてＮＰＬ０１７５８０に戻すために使用した。Ａ３７Ｅ置換をシークエンシングによって選択した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１２のプラスミド：Ｒ３６Ａ−Ａ３７Ｒ変異を含有するＰＣＲ断片を変異原性オリゴ
を使用してＮＰＬ０１７５８０から増幅した。ＢｌｐＩ及びＳｆｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、生成したＰＣＲ断片をクローニングしてＮＰＬ０１７５８０に戻すために使用した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３のプラスミド：Ｒ３６Ｑ変異を含有するＰＣＲ断片を変異原性オリゴ
を使用してＮＰＬ０１７５８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）から増幅した。ＢｌｐＩ及びＳｆｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、生成したＰＣＲ断片をクローニングしてＮＰＬ０１７５８０に戻すために使用した。
バリアントｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ ｍｕｔ４及びｍｕｔ１３をさらに改変して、異なるリンカー（すなわち配列番号２２及び２３）を導入した：ＢｓｐＥＩエンドヌクレアーゼ制限部位（残基ＩＧＦ１ Ｆ４９−Ｒ５０に対応する）からＡｌｅＩ（Ｆｃ部分内）に及ぶリンカー配列をＧｅｎｅａｒｔに注文した。リンカーを標準的な切り貼りによりクローニングして、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ４＿Ｅ、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３＿Ｅ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３＿Ａについてのプラスミドを得た。次の工程において、変異Ｇ４２Ｓを導入した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ４／２＿Ｅ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３／２＿Ｅのプラスミド：Ｇ４２Ｓ変異を含有するＰＣＲ断片をオリゴ
を使用してｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ２のプラスミドから増幅した。ＢｓｐＥＩ及びＳｆｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ４＿Ｅ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３＿Ｅのプラスミド内に生成したＰＣＲ断片をクローニングするために使用した。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３／２＿Ａのプラスミド：Ｇ４２Ｓ−Ｒ３６Ｑ変異を含有するＰＣＲ断片をオリゴ
を使用してｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３／２＿Ｅのプラスミドから増幅した。ＢｓｐＥＩ及びＳｆｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｈＦｃ＿ｍｕｔ１３＿Ａのプラスミド内に生成したＰＣＲ断片をクローニングするために使用した。
Ａ３ 組換えタンパク質の産生
小規模産生：
ＦｕＧｅｎｅ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づいた２つの異なるトランスフェクション法を使用してＩＧＦ１−Ｆｃバリアントを産生した。
１００ｍｌのＨＥＫ２９３Ｆ培養物を以下のように（ＰＥＩ）でトランスフェクトした：水中の１００μｇのプラスミドＤＮＡを、室温にて１０分間、７ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．１２３３８０２６）中で希釈した。３００μｇのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩストック由来）を室温にて７ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地中で希釈した。次いでＤＮＡ及びＰＥＩ溶液を一緒に混合し、５００ｍｌの振盪フラスコ中で約１．４×１０６細胞／ｍＬの密度にて３６ｍｌのＨＥＫ２９３Ｆ細胞培養物に加える前に１５分間インキュベートした。６日間、１００ｒｐｍ、６％ＣＯ２及び３７℃に設定したＫｕｅｈｎｅｒ−Ｓｈａｋｅｒ ＩＳＦ１−Ｘ（Ｋｕｅｈｎｅｒ）中で培養物をインキュベートした。次いでＩＧＦ１−Ｆｃバリアントを、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ １ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したプロテインＡクロマトグラフィーによって、清浄した細胞培養物上清から精製した。ベースラインをＰＢＳで洗浄した後、結合した物質を５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、すぐに中和した。
１００ｍｌのＨＥＫ２９３Ｆ培養物を以下のようにＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクトした：水中の１００μｇのプラスミドＤＮＡを、室温に維持した１ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．１２３３８０２６）中で希釈した。４００μｌのＦｕＧＥＮＥを希釈したＤＮＡに加え、混合物を室温にて１５分間インキュベートした。次いで１．４ｍｌのＤＮＡ−ＦｕＧＥＮＥ混合物を、約０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有する５００ｍｌのフラスコ中の９８．６ｍＬのＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞培養物に加えた。７日間、１００ｒｐｍ、６％ＣＯ２及び３７℃に設定したＫｕｅｈｎｅｒ−Ｓｈａｋｅｒ ＩＳＦ１−Ｘ（Ｋｕｅｈｎｅｒ）中で培養物をインキュベートした。次いでＩＧＦ１−Ｆｃバリアントを、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ １ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したプロテインＡクロマトグラフィーによって、清浄した細胞培養物上清から精製した。ベースラインをＰＢＳで洗浄した後、結合した物質を５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、すぐに中和した。
中規模産生：
９．５ＬのＨＥＫ２９３培養物を以下のようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でトランスフェクトした：ＴＥ緩衝液中の１０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、２５０ｍＬの室温のＯｐｔｉＭＥＭ１培地［Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ＃１１０５８−０２１］中で５分間インキュベートした。２０ｍｇのポリエチレンイミンＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩストック由来）を、２５０ｍＬの室温のＯｐｔｉＭＥＭ１培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．ｎｏ＃１１０５８−０２１）に加えた。次いでＤＮＡ及びＰＥＩ溶液を一緒に混合し、１５分間インキュベートした。次いで５００ｍＬのＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を、０．７５×１０６細胞／ｍＬから１．２５×１０６細胞／ｍＬの間の密度にて９．５ＬのＨＥＫ培養物に加えた。トランスフェクトした細胞を２０Ｌ Ｗａｖｅ Ｃｅｌｌｂａｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＣＢ００２０Ｌ１０−０３）中に３７℃にて接種した。Ｃｅｌｌｂａｇを、２５ｒｐｍ、７度の振盪角度、７％ＣＯ２、０．５０ｌｐｍ空気、及び３７℃に設定したＷａｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ ２０／５０ＥＨＴ上に置いた。Ｆｃ融合構築物を、プロテインＡクロマトグラフィーによって、濃縮した培養物上清から収集した。ベースラインをＰＢＳで洗浄した後、結合した物質を５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ２．７、１４０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、すぐに中和した。次いで中和した画分を限外濾過によって濃縮し、いくらかの汚染凝集体を除去するためにＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００上でサイズ合わせした。物質の純度はＳＤＳ−ＰＡＥＧ及びＬＣ−ＭＳ分析の両方で判断して＞９５％であった。
Ａ４ ＳＥＣ−ＭＡＬＳによる凝集レベルの評価
プロテインＡで精製したＩＧＦ−１−Ｆｃバリアントを、多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）に連結したサイズ排除クロマトグラフィーによって凝集レベルについて試験し、測定を、３角度光散乱検出器（ｍｉｎｉＤＡＷＮ Ｔｒｅｏｓ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に接続したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施した。試料の濃度を、０．１８６ｍｌ／ｇの特定の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を使用した示差屈折計（Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてオンラインで追跡した。５０ｕｌの試料体積をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入した。データを記録し、ＡＳＴＲＡ Ｖソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して処理した。ＭＡＬＳ検出器についての検出器遅延体積及び規格化係数を決定するために、ＢＳＡ試料（Ｓｉｇｍａ、Ａ８５３１）を参照として使用した。デスパイキングもバンド広がり補正もどちらも適用しなかった。
Ａ５ 細胞培養
ヒト骨格筋（ｓｋＭＣ）細胞をＣａｍｂｒｅｘ（＃ＣＣ−２５６１）から得た。ヒト初代筋芽細胞を成長培地［２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、＃２−０１Ｆ４０−１、Ａｍｉｍｅｄ）及び０．１％ゲンタマイシンを含有するＳｋＧＭ］中で培養した。（３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度にて）４〜５日後、細胞を、１５０．０００細胞／ウェルの密度にて成長培地中に播種し、（３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度にて）成長させた。播種後３日において、ｓｋＭＣ筋芽細胞をシグナル伝達実験のために使用した。ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ及びＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲを、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤ−ＭＥＭ中に維持した。初代カニクイザル筋芽細胞を、オナガザル科（Macaca fascicularis）であるカニクイザルの腓腹筋から単離した。細胞を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、＃２−０１Ｆ４０−１、Ａｍｉｍｅｄ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１５７５０−０３７）を含有するＳｋＢＭ中で培養した。３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（それぞれＡＴＣＣ−ＣＬ−１７３及びＡＴＣＣ；＃９１０３１１０１）から得た。３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞を、ＤＭＥＭ、高グルコース、１．５ｇ／リットルのＮａＨＣＯ３（ＡＴＣＣ＃３０−２００２）中に維持し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭを加えることによって分化を開始した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は播種後３日に分化した。そうするまで、細胞を、２％加熱不活性化ウマ血清（ＨＳ；＃ＵＳ １４−４０３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％グルタミンを追加したＤＭＥＭからなる分化培地（ＤＭ）で１回洗浄し、次いでＤＭ中で３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度にて７２時間インキュベートした。
Ａ６ Ｂｉａｃｏｒｅ
結合特性を、２５℃にてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用してＳＰＲにより特性付けした。３つのＣＭ５チップ（ＧＥ、ＢＲ−１００５−３０）を、標準的なアミンカップリング手順を適用することによって調製した。フローセル１は参照として与えるために固定したブランクであり、一方、ＩＧＦ−１及びｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａを測定フローセル２及び３に固定した。固定レベルは個々の相互作用に適合し、２０〜１４３ＲＵ（ＩＧＦ−１）及び３２〜１１３ＲＵ（ｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａ）の範囲であった。ｒｅｃ．ヒトＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３９１−ＧＲ）の希釈系列を、３０ｍＭクエン酸塩及び０．０５％ＢＳＡを含有するランニング緩衝液、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈ８０２２）中で調製し、５０μｌ／分の流速にてチップ上に注入した。検体濃度範囲は個々の相互作用に適合し、１０００〜３．９ｎＭ（ＩＧＦ−１Ｒ）の範囲であった。リガンドを、Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１０２７）を５０μｌ／分にて９０秒間穏やかに注入することによって再生した。運動速度係数及びＫＤを、二重に参照したセンサーグラムを１：１結合モデルに適合することによって算出した。
Ａ７ ＥＬＩＳＡ
ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の分析のために、６ウェルプレート上にプレーティングした細胞を、成長培地中で２４時間（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ）又は７２時間（ヒト及びカニクイザル初代筋芽細胞）培養した。細胞を２４時間（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ）又は４時間（ヒト及びカニクイザル初代筋芽細胞）飢餓し、次いで示したペプチドで３７℃にて１５分間刺激した。細胞を、種々のプロテアーゼ阻害剤を含有するＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で溶解し、１４，０００×ｇ、４℃にて１５分間の遠心分離によって清浄し、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化レベルを、ＤｕｏＳｅｔ ＩＣヒト蛍光体−ＩＧＦ−１Ｒキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡによって分析した。
インスリン受容体リン酸化の分析のために、ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞を、６ウェルプレートの１つのウェル当たり０．２×１０６細胞の密度にてプレーティングし、成長培地中で２４時間培養した。細胞を無血清培地中で１８時間飢餓し、次いで異なるリガンドで３７℃にて１０分間刺激した。細胞を上記のように溶解し、ＩｎｓＲリン酸化レベルを、ＤｕｏＳｅｔ ＩＣヒト蛍光体−ＩｎｓＲ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡによって分析した。
Ａ８ グルコース取り込み
グルコース取り込みを測定するために、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２マウス筋管細胞を２４ウェルプレート上に播種し、無血清ＤＭＥＭ中で４時間培養した。次いで無血清ＤＭＥＭを、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２のそれぞれについて、ＫＲＰ緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４）又はＨＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．０ｍＭ ＣａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）と置き換えた。細胞を指定したペプチドで３７℃にて１時間処理した。グルコース取り込みを、０．４（含脂肪細胞）又は０．８（Ｃ２Ｃ１２）μＣｉの［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び０．１（含脂肪細胞）又は０．０１（Ｃ２Ｃ１２）ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを室温にて１０分間（含脂肪細胞）又は５分間（Ｃ２Ｃ１２）加えることによって測定した。培地を吸引し、１μＭのサイトカラシンＢを含有するＫＲＰ又はＨＢＳ緩衝液を加えることによってアッセイを終了した。次いで細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、０．２Ｍ ＮａＯＨを使用して溶解し、シンチレーション計数によって放射線分析した（図５／６を参照のこと）。
Ａ９ 薬物動態プロファイル
成体のオスのラット（ｎ＝３／群）に、１０ｍｇ／ｋｇにてｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ若しくはｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ又はｈＩＧＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス又は皮下注射を与えた。一連の血液検体を、ＩＧＦ−１バリアントの投与の２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８及び３３６時間後又はｈＩＧＦ−１投与の０．０８３、０．２５、０．５、２、４、８及び２４時間後に採取した。組換えタンパク質の血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。
Ａ１０ デキサメタゾン誘導性筋萎縮に対するｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ ｍｕｔ １３／２ Ａの効果
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）をＰＢＳ中に溶解して、Ａｌｚｅｔモデル２ＭＬ２を用いて２８日間、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日の用量を達成した。Ｄｅｘを群Ｃにおいて３．８ｍｇ／ｋｇ／日の用量にてミニポンプ中でｈＩＧＦ−１と組み合わせた。Ｄｅｘ処置を、群Ｄ、Ｅ及びＦにおいてそれぞれ３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇの用量にてｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿１３／２＿Ａの皮下処置と一日おきに組み合わせた。ポンプを溶液で満たし、外科的移植までＰＢＳ中で３７℃にて数時間維持した。ラットを、外科手術の少なくとも３０分前に、１ｍＬ／ｋｇの体積で０．０２ｍｇ／ｋｇの用量にてＴｅｍｇｅｓｉｃで皮下処置し、次いで上記に示した溶液で満たしたポンプを、３％の濃度にてイソフルランによる麻酔下でラットの背部内に皮下移植した。外科手術の２４時間及び４８時間後、Ｔｅｍｇｅｓｉｃをラットに皮下投与した。群Ａ、Ｂ及びＣにおけるラットを毎日のＰＢＳの皮下注射により処置した。体重を１週間に２回測定した。処置の４週間後、ラットをＣＯ２で安楽死させ、筋肉を切断し、秤量した。
パートＢ：作業実施例
タンパク質残基Ｅ３、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、Ｒ３７アミノ酸がアラニンによって置換されている、Ｅａ−ペプチド（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ−ｍｕｔ ３）（配列番号２７）を含む従来技術の分子を産生し、試験した。
ＤＮＡ発現ベクターの調製
１．１ 以下の改変を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを上記のように構築した：ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ（エフェクター機能サイレンシング変異Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）（配列番号９）を有するｈＩｇＧ１由来のＦｃ部分を含む）；ここで、Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異しており；ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｆｃ領域に連結している。
これにより以下の分泌タンパク質配列が得られる：
１．２ 以下の改変を含むｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを上記の段落Ａ２に記載されているように構築した：
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ（ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｆｃ領域を含む）：ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質、ここで、Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異しており；ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｆｃ領域に連結している。
これにより以下の分泌タンパク質配列が得られる：
上記に概説した原理に基づいて、以下のさらなるタンパク質が産生された：
実施例５４（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ；配列番号８）
実施例５６（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ；配列番号１０）
実施例５０（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ；配列番号１１）
実施例５８（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ；配列番号１３）
実施例５９（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｆ；配列番号１４）
１．３ 以下の改変を含有するｈＩＧＦ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを、当該分野において知られているＤＮＡベクター構築物／ＤＮＡ操作法を使用して構築した：ｈＩｇＦ１ Ｇ４２Ｓ（配列番号１１７）；
これにより以下のタンパク質配列が得られる：
１．４ 以下の改変を含有するｈＩＧＦ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを、当該分野において知られているＤＮＡベクター構築物／ＤＮＡ操作法を使用して構築した：ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｍｕｔ ０３−Ｇ４２Ｓ（配列番号１１８）；
これにより以下のタンパク質配列が得られる：
ＩＧＦ−１−Ｆｃバリアントのプロテアーゼチャレンジ
例えばＣＨＯなどの哺乳動物細胞発現系において産生したタンパク質は、発現の間にタンパク質分解に悩まされ得る。標準化手段における産生の間に潜在的なプロテアーゼ感受性を効果的に評価するために、本発明者らは、精製タンパク質及びＣＨＯ細胞培養物由来の馴化培地を使用してプロテアーゼチャレンジアッセイを開発した。切断パターンとのそのアッセイの比較により、アッセイ検証の条件でＣＨＯ細胞において産生されたＩＧＦ−１−Ｆｃバリアントが観察された。手短に述べると、ＣＨＯ細胞を、１Ｅ７細胞／ｍｌまでの密度で２Ｅ５細胞／ｍｌ由来のＣＨＯＤＭ１２２培地中で培養した（３７℃、６％ＣＯ２、８５％相対湿度、９０〜１５０ｒｐｍ）。清浄した上清をアッセイに使用される馴化培地に提供する。ＩＧＦ−１−Ｆｃバリアントを上記（Ａ３）のように精製し、馴化培地又は対照としてＰＢＳ中で１００ｕｇ／ｍｌの濃度において急上昇した。濾過滅菌後、試料を３７℃にて２０日までインキュベートし、種々の時点で分析する試料を得た。異なる分解産物は標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により十分に単離でき、分解バンドの強度を濃度測定により定量した。この結果を図１７に示す。
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒに対するｈＩＧＦ−１及び類似体の高親和性結合
ｒｈＩＧＦ１Ｒに対するｈＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１バリアントの高親和性結合を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定した。直接結合アッセイを実施した。ヒトＩＧＦ−１−Ｅａ＿Ｆｃ＿Ｍｕｔ＿１３／２＿Ａ及びｈＩＧＦ−１をチップに固定し、ＩＧＦ−１受容体を溶液中の検体として与えた。得られたセンサーグラムを１：１相互作用モデルに適合して平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。この結果により、ＩＧＦ−１Ｒに対するｈＩＧＦ−１−Ｅａ＿Ｆｃ＿Ｍｕｔ＿１３／２＿Ａの結合がｈＩＧＦ−１と同等であることが示される（図１）。
ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の誘導
ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を刺激するｈＩＧＦ−１及びｈＩＧＦ−１バリアントの能力を、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＧＦ−１Ｒ（ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞において最初に評価した。これらの細胞において、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を全ての試験したペプチドによって濃度依存的に誘導した。平均化したＥＬＩＳＡデータのロジスティック曲線適合により、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−Ｆｃ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０４／２＿Ｅの効力（ＥＣ５０）がｈＩＧＦ−１と比較して減少したことが示された（図２Ａ〜Ｂ）。しかしながら、平均化したＥＬＩＳＡデータのロジスティック曲線適合により、全ての試験したペプチドについて非常に同等の最大応答値が生じた（図２Ｃ〜Ｄ）。内因性ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を刺激するｈＩＧＦ−１バリアント及びｈＩＧＦ−１の能力を、初代ヒト筋芽細胞及びカニクイザル筋芽細胞において評価した。これらの細胞において、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を全ての試験したペプチドによって濃度依存的に誘導した（図４Ｂ〜Ｃ）。平均化したＥＬＩＳＡデータのロジスティック曲線適合により、ｈＩＧＦ−１バリアントの効力（ＥＣ５０）はｈＩＧＦ−１と比較して減少したことが示された（図４Ａ）。しかしながら、平均化したＥＬＩＳＡデータのロジスティック曲線適合により、全ての試験したペプチドについて非常に同等の最大応答値が生じた（図４）。
インスリン受容体に対する特異性
ＩＧＦ−１バリアントのアミノ酸改変が受容体特異性に影響を与えるかどうかを試験するために、ＩｎｓＲリン酸化に対するＩＧＦ−１バリアントペプチドの効果を、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｎｓＲを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３において分析した。本発明者らは、異なる濃度のＩＧＦ−１バリアント、ｈＩＧＦ−１及びインスリンを用いてＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞形質転換体を処理した。等モル濃度の示したペプチドを使用した。これらの実験の結果を図３／１８に示す。改変は、受容体特異性を維持し、インスリンが最大応答を与える濃度でさえＩｎｓＲリン酸化の弱い（week）誘導因子であることが示されたＧ４２Ｓ変異（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０２、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０３、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０４／２＿Ｅ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａ）を有するバリアントを除いて大部分のＩＧＦ−１バリアントの受容体特異性に影響を与えた。驚くべきことに、ｈＩＧＦ１−Ｅａ Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０４／２＿Ｅは、図５Ｂ及びＤ並びに図６に示されるように急速なインスリン受容体結合（例えば分化した含脂肪細胞におけるグルコース取り込み）によって駆動されるエフェクター機能に対してＩＧＦ−１より顕著に低い効力であることが示された。対照的に、ｈＩＧＦ１−Ｅａ Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０４／２＿Ｅ及びｈＩＧＦ−１は、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるグルコース取り込みなどのＩＧＦ−１Ｒ媒介性機能について等効力であった（図５Ａ及びＣ）。ＩＧＦ−１タンパク質（配列番号１１７のＩＧＦ−１ Ｇ４２Ｓバリアントを生じる）内及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｍｕｔ ０３タンパク質（配列番号１１８のｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｍｕｔ ０３−Ｇ４２Ｓバリアントを生じる）内へのＧ４２Ｓ変異の導入は、ＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞におけるＩｎｓＲリン酸化を低下させた（図１８）。さらに、前記変異は含脂肪細胞及びＣ２Ｃ１２筋管のそれぞれにおけるグルコース取り込みに対して影響を与えた（図１９）。
血清濃度の決定
オスのＦｉｓｃｈｅｒラット（ｎ＝３）における単回ｉ．ｖ．及びｓ．ｃ．用量投与の後、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｆｃ−ｍｕｔ＿１３／２＿Ａ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ．Ｆｃ＿ｍｕｔ＿０４／２＿Ｅの血清濃度を、ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔに特異的なＥＬＩＳＡによって決定した（詳細については上記のＡ５を参照のこと）。これらの実験の結果を図７−Ａ及び７−Ｂに示す。終末相半減期はそれぞれ約７５．３及び５０．１時間である。最大濃度はそれぞれ、ｓ．ｃ．用量投与の８時間及び２４時間後（Ｔｍａｘ）に到達した。対照的に、ｈＩＧＦ−１（１．０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与後、ｈＩＧＦ−１のレベルを、０〜８時間の範囲にわたって定量できた。Ｔｍａｘ（０．０８３ｈ）に到達した後、ペプチドの血清濃度の急激な低下を観察し、１．８１時間の見かけの終末相半減期を生じた。ｈＩＧＦ−１（１．０ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与後、血清レベルは投与後８時間まで定量でき、最大濃度を投与後０．５時間で観察した。従って、ＩＧＦ−１類似体はヒトＩＧＦ−１と比較して非常に改善された薬物動態プロファイルを示す。
デキサメタゾン誘導性筋萎縮に対するｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａの効果
ＩＧＦ−１は、骨格筋においてタンパク質合成を刺激し、タンパク質分解を阻害することが示されているので、本発明者らは、デキサメタゾン処置したラットにおけるｈＩＧＦ−１−Ｅａ＿Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａの投与が筋萎縮を阻止することができるかどうかを試験した。オスのウィスターラットを、単独で、又はビヒクル（ＰＢＳ）若しくはｈＩＧＦ−１と一緒のいずれかで７５μｇのデキサメタゾン／ｋｇ／日でＡｌｚｅｔポンプを介して連続的に注入した。上記のようにデキサメタゾンを注入した動物のさらなる群に、ｈＩＧＦ−１−Ｅａ＿Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａのｓ．ｃ．注射を一日おきに与えた。全ての動物を２８日間処置し、次いで屠殺した。体重を実験の開始、及び次いで注射後２８日にモニターした。
予想されるように、体重及び筋肉重量の顕著な低下が、ビヒクル対照と比較してデキサメタゾン処置したラットにおいて観察された（図８）。ｈＩＧＦ−１−Ｅａ＿Ｆｃ＿ｍｕｔ＿１３／２＿Ａの注射は体重及び筋肉重量の喪失を顕著に低下させた（図８）。
上記のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆ポリペプチドバリアントに加えて、以下のさらなるタンパク質バリアントを本発明に従って産生でき、使用できる：
（２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（１３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニン（Ａ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニン（Ａ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニン（Ａ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２２ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２５ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ｂ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失している。
（１３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（１９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニン（Ａ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２０ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニン（Ａ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２１ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニン（Ａ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミンに変異している。
（２２ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２３ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２ ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２４ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はプロリン（Ｐ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２５ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２６ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２７ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２８ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
（２９ｃ）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３６はグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７はアラニンによって置換されており、Ｇ４２はセリンによって置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２は欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４はグルタミン（Ｑ）に変異している。
ＣＨＯ ＩＧＦ−１受容体欠損細胞株における組換えＩＧＦ−１の発現。
ＣＨＯ細胞株における組換えＩＧＦ−１の発現により、細胞成長阻害及び低力価が生じた。図１１において、バイオリアクタープロセスの間のｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔ（配列番号２７）の力価測定を示す。ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔの最大力価測定は８ｕｇ／ｍｌであり、これは１００ｍｇ／Ｌの抗体力価（モル質量に基づく）に対応する。バイオリアクタープロセスにおける組換え抗体の平均力価測定は約３ｇ／Ｌである。ＩＧＦ−１の低力価の１つの原因はＩＧＦ−１発現細胞の低下した細胞成長及び低い細胞生存率である。抗体発現プロセスの間、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞は２〜２．５×１０７細胞／ｍｌまで成長し、細胞生存率は、最初の２３０〜２６０時間の培養時間の間、９７％超である。対照的に、ＩＧＦ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞は０．５〜０．９×１０７細胞／ｍｌまでしか成長せず、細胞生存率は８０時間後で既に９７％未満に低下する（図１１を参照のこと）。
低下した細胞成長はまた、ＩＧＦ−１と非トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の共培養の間に検出され得る。図１２は、親ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞が２．５×１０７細胞／ｍｌまで成長することを示す。野生型ＩＧＦ−１又はｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔ（５０ｍｇ／Ｌ）とＣＨＯ−Ｋ１派生細胞の共培養の間、細胞成長はまた顕著に阻害された（０．９×１０７細胞／ｍｌ）。
次の工程において、特異的ＩＧＦ−ＩＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＮＶＰＡＥＷ５４１（ＮＶＰＡＥＷ５４１−ＩＧＦ−ＩＲキナーゼの新規で有効な選択的阻害剤のインビボ抗腫瘍活性；Carlos Garcia-Echeverria et al.; Cancer Cell;２００４年２月２６日にオンラインで公開されたDOI:10.1016/S1535610804000510）を、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞におけるＩＧＦ−１共培養実験の間に加えた。細胞成長阻害は阻止することができた（図１３を参照のこと）。これにより、ＩＧＦ−１−Ｒが、細胞成長阻害を生じる細胞内にシグナルを誘発することが検証される。
次の工程において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術（ＺＦＮ）を使用したＩＧＦ−１Ｒのノックアウトを、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞株において実施した。ＩＧＦ−１Ｒのエクソン３の領域において特異的に結合するＺＦＮを設計した。２つのプラスミド（それらの各々はＩＧＦ−１Ｒ特異的ＺＦＮの１つのサブユニットをコードする）をＣＨＯ−Ｋ１派生細胞又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞において共トランスフェクトした。各ＺＦＮサブユニットは特異的な１８塩基対長の配列に結合し、従って全体で３６ｂｐ配列が特異的認識される（ゲノムの他の位置におけるランダム切断を回避する）。ＦｏｋＩのエンドヌクレアーゼドメインを、ＤＮＡを切断するためにヘテロダイマーとしてのみ機能するように再操作する。ＺＦＮダイマーはＩＧＦ−１Ｒのエクソン３において標的化した二本鎖切断を生じる。非相同末端結合のエラープローン細胞プロセスによって、この二本鎖切断はＤＮＡ配列の改変を生じることができ、そのために標的遺伝子の機能的ノックアウトを生成する。ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞について、３つのノックアウトクローンを生成した（両方の対立遺伝子及びフレームシフト変異でのノックアウト）：クローン１：Δ２（配列番号９９）、クローン２：Δ５（配列番号１００）及びクローン３：Δ２（配列番号１０１）、クローン１：＋１８（及び１４ｂｐｓ置換）（配列番号１０３）、クローン２：Δ２２（配列番号１０２）及びクローン３：Δ１１４（配列番号１０４）。
ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ポリクローナル及びＩＧＦ−１Ｒチャレンジングのノックアウトを生じた倍数性と対照的である（２つより多いＩＧＦ−１Ｒコピー／ゲノムがノックアウトされなければならない）。本発明者らはフレームシフト変異を有するいくつかの特有のノックアウトクローンを生成し、ＴＯＰＯクローニング及びシークエンシングを用いてそれらの２つを検証した。クローン１２：Δ７（５０％）（配列番号１０６）／Δ２２（５０％）（配列番号１０５）、クローン１９：Δ７（１４．５％）／Δ１６（４４％）／Δ２２（１８％）／Δ２２ｍｕｔ（１５％）。括弧内の百分率は、この変異が３２個の配列決定した細菌コロニーからどれくらいの頻度で発生するかに基づく。クローン１９について、６つのＩＧＦ−１Ｒ対立遺伝子（３×Δ１６、１×Δ７、１×Δ２２、１×Δ２２ｍｕｔ）が存在すると想定され得る。３つの生成したＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローンをＩＧＦ−１と共培養し、細胞成長阻害は検出できなかった（図１４を参照のこと）。
２つの生成したＩＧＦ−１Ｒ ＫＯ ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来のクローンもまた、ＩＧＦ−１の存在／非存在下で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１ ＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローンと同様に、改善された細胞成長を、野生型ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞と比較してＫＯクローンについて検出することができた（図１５を参照のこと）。ＫＯクローンの１つは、ＩＧＦ−１の存在下で細胞成長阻害が存在せず、他のＫＯクローンは、ＩＧＦ−１の存在下で、ＩＧＦ−１と共培養していないＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞と同様の最大の生存細胞数を有したことを示した。
ベクターｐＢＷ８０６（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ）のクローニング戦略
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿ＡをコードするベクターｐＢＷ８０６を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０６を得た。
ベクターｐＢＷ８０７（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ）のクローニング戦略
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿ＣをコードするベクターｐＢＷ８０７を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＷＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｃ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０７を得た。
ベクターｐＢＷ８０８（ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ）のクローニング戦略
ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）をコードするベクターｐＢＷ８０８を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＹＣ＿ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆｃ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩｇＦ１−Ｅａ−Ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｆ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０８を得た。
ベクターｐＢＷ８０９（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ）のクローニング戦略
ＨＩＧＦ１−ＥＡ−ＦＣ＿ＭＵＴ ０４／２＿Ｅ Ｆｃ融合配列をコードする、ベクターｐＢＷ８０９を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮ２Ｃ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８０９を得た。
ベクターｐＢＷ８１０（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ）のクローニング戦略
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿ＡをコードするベクターｐＢＷ８１０を２つの連続したクローニング工程に従って調製した。第１の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮＳＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ｅ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したＦｃ領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行して、ｐＢＷ６７９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターｐＢＷ８０５を得た。第２の工程において、プラスミド１１ＡＡＲＮ２Ｃ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ融合タンパク質のｎ末端領域を抽出するためにＸｂａＩ及びＳｓｅ２３２Ｉを用いて消化した。並行して中間体ベクターｐＢＷ８０５を続いて、Ｓｓｅ２３２Ｉ及びＸｂａＩを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを１１ＡＡＲＮＵＣ＿ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ａ＿ｐＭＡ−Ｔ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ８１０を得た。
ベクターｐＢＷ４１０（ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔ）のクローニング戦略。
ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔ配列をコードする、ベクター０６１０９００ｐＧＡ４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したコードＩＧＦ配列を抽出するためにＸｂａＩ及びＭｌｕＩを用いて消化した。並行してｐＢＷ１６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＭｌｕＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ４１０を得た。
ベクターｐＢＷ６６４（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、７７−ｆｃドメイン）のクローニング戦略。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、７７−ｆｃドメイン配列をコードする、ベクター０９０５９１５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したコードＩＧＦ配列を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行してｐＢＷ５９６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ６６４を得た。
ベクターｐＢＷ６６６（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン）のクローニング戦略。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−Δ１−３、Ｒ３７Ａ、Δ７１−７２、Ｒ７７Ｑ−ｆｃドメイン配列をコードする、ベクター０９５０９１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、デノボ合成したコードＩＧＦ配列を抽出するためにＸｂａＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。並行してｐＢＷ５９６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売のベクター）を、転写及び翻訳調節エレメント並びにＧ４１８／ＤＨＦＲ選択／増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するＡｓｃＩ及びＸｂａＩを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターｐＢＷ６６６を得た。
Δ５／Δ２２ ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローン及びΔ７／Δ２２ ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞由来ＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローンを、５つの異なるＩＧＦ−１−ＦＣ融合物候補でトランスフェクトした（図１５を参照のこと）。組換えＩＧＦ−１−ＦＣタンパク質の５〜１７倍の力価の増加を、異なるＩＧＦ−１−ＦＣ融合物候補でトランスフェクトした野生型ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞／ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞由来細胞株と比較してプールレベルで検出することができた。
ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ１Ｒ−ＫＯ又はＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ１Ｒ−ＫＯ細胞株において発現したＩＧＦ−１−ＦＣ融合物候補（ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ及びｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ ０４／２＿Ｅ）の２つを、１００Ｌのウェーブバイオリアクター（フェドバッチプロセス及び温度変化）において培養した。ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ／４を発現するＣＨＯ−Ｋ１派生細胞ＩＧＦ１ＲＫＯプールを３×１０７細胞／ｍｌの最大生存細胞密度まで成長させ、これは平均ＡＢプロセスより高い（平均細胞密度は２．２×１０７細胞／ｍｌである。ＩＧＦ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞と比較して、これは生存細胞数において３〜６倍高い（図１１を参照のこと）。ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａ／４を発現するＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ１ＲＫＯ細胞を１．５〜２×１０７細胞／ｍｌの最大細胞密度まで成長させ、これは野生型ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来細胞株と比較してより高い最大細胞密度である。
ｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａを発現するＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ１Ｒ ＫＯ細胞が分類した単一細胞であり、２４ウェル及び５０ｍｌのバッチ培養物中のバッチ力価を決定した。図１５において、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来ＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローンにおける３０個の最適なｈＩＧＦ１−Ｅａ−ｆｃ＿ｍｕｔ １３／２＿Ａクローン及び３０個の最適なｈＩＧＦ−１−Ｅａ−Ｄ１−３、Ｒ３７Ａ、Ｄ７１−７２、７７−ｆｃドメインを発現する野生型ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１由来クローンの２４ウェル力価を示し；図１６において、各群由来の１５個の最適なクローンの振盪フラスコ力価を示す。ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１細胞由来ＩＧＦ−１Ｒ ＫＯクローンの全ては８倍高い２４ウェル力価及び７倍高い振盪フラスコ力価を有する。
バイオリアクターにおいてＩＧＦ−１を発現する形質転換したＣＨＯ細胞の培養。
バイオリアクターにおいてＩＧＦ−１を発現する形質転換した細胞を培養するために、フェドバッチプロセスを適用した。細胞成長を補助し、生存率を維持することによって産生期を延ばすように供給開始及び温度変化などのプロセス事象の時間を決めた（Niraj Kumar, Patrick Gammell, Martin Clynes (2007) Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture; Cytotechnology (2007) 53:33-46）。
ＣＨＯ細胞からのＩＧＦ−１の収集。
収集手段として、深層濾過、続いて濾過滅菌を用いる標準的な細胞分離技術を適用した。ＣＨＯ細胞を培養し、当業者に知られている標準的な方法に従って収集した（例えば、Curr. Protoc. Protein Sci. 2001 May;Chapter 5: Unit 5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S; (Mahesh Prashada, Klaus Tarrach (2006) Depth filtration: Cell clarification of bioreactor offloads, Filtration & Separation Volume 43, Issue 7, September 2006, Pages 28-30）。
ＩＧＦ−１Ｒのエクソン３に特異的であるＺＦＮの設計／産生及び使用：
ＩＧＦ−１Ｒのエクソン３及び隣接するイントロンを本発明者らのＣＨＯ細胞株において配列決定した（配列番号１１０／１１１）。最初に、エクソン３を含むＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡの一部を覆うハムスターＤＮＡコンティグ及びＩＧＦ−１Ｒ遺伝子のマウス配列を使用してエクソン３を配列決定した。
ＰＣＲプライマーを保存部分において設計し、得られたＰＣＲ産物を配列決定した。得られたエクソン３配列をＳｉｇｍａに提供して、エクソン３の隣接するイントロンを配列決定し、２つの操作したＺＦＮ標的化ＩＧＦ−１Ｒエクソン３を設計した。各ＺＦＮは、それぞれリバース（５’上）、フォワード（３’上）ＤＮＡ鎖における１８ヌクレオチドを標的とし、結合する。２つの結合部位は切断部位の５つのヌクレオチドによって分離している（配列番号１０７）。産物の詳細及び方法は、「74188 CompoZr Custom ZFN Tech Bulletin」と呼ばれる文献においてＳｉｇｍａにて入手可能である。Ｓｉｇｍａはまた、周囲のイントロン配列（配列番号１０８及び１０９）においてフォワード及びリバースＰＣＲプライマーを設計して、ｇＤＮＡにおいてＩＧＦ−１Ｒエクソン３を増幅して、５０１ｂｐ ＰＣＲ産物を生成した。Ｓｉｇｍａは、それぞれリバース（ｐＺＦＮ１）、フォワード（ｐＺＦＮ２）鎖認識操作したＺＦＮをコードする、２０〜２５μｇの２つのＤＮＡベクターを含む、キットＣｏｍｐｏＺｒＴＭ（Ｃｕｓｔｏｍ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、製品番号ＣＳＴＺＦＮ−１ＫＴ、ロット番号０８０２１０１９ＭＮ）を提供した。
いずれかのベクターを用いて周知の形質転換プロトコルに従って大腸菌（E.coli）を形質転換し、アガロースプレートを含有する２５μｇ／ｍｌのカナマイシン上に播いた。各ベクターについて、４つの細菌コロニーを選択し、増殖した。各ｐＺＦＮの４つの精製したＤＮＡプラスミド試料のＺＦＮ配列を、Ｔ７フォワード及びＢＨＧリバースプライマーを使用して検証し、プールした。環状ｐＺＦＮ１及びｐＺＦＮ２ベクターの６μｇ又は１０μｇの均一の混合物を、ＣＨＯ−Ｋ１派生細胞及びＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生親細胞において、各量について３回、トランスフェクトし、それにより各細胞株を有する６つのプール（プラストランスフェクションの陰性対照）を生成した。プールにおけるＺＦＮの切断効率を測定するために、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ、カタログ７０６０２５）を、Ｓｉｇｍａにより提供されている機密プロトコルに記載されているようにトランスフェクション（ゼロ日と数える）の３日及び１０日後に使用した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ、カタログＧ１Ｎ７０−１ＫＴ）を使用してプールのゲノムＤＮＡを単離し、隣接するイントロン配列中に存在するＩＧＦ−１Ｒのフォワード及びリバースシークエンシングプライマーを使用したＰＣＲ反応においてエクソン３を増幅した。次いでＰＣＲ産物を高温下で変性させた。温度を徐々に低下させた場合、いくつかの野生型及び変異産物をハイブリダイズして、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）と呼ばれる酵素によって切断された切断部位周囲にミスマッチを有する二本鎖ＤＮＡを形成させた。ｌａｂ９０１と呼ばれるゲル電気泳動系を使用して最終産物を分析した。６つ全ての形質転換したプールについて、５０１ｂｐの完全一致ＰＣＲ産物に加えて、切断部位のいずれかの側における断片に対応する、約２７７ｂｐ及び２２４ｂｐの２つのより小さなバンドを検出し、従って、本発明者らの細胞においてＺＦＮ活性を証明した。トランスフェクションの７日後、プールは１０×９６ウェルプレートにおいてクローニングした単一の細胞であった。
ｐＺＦＮでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１派生細胞株において、５０７個のクローンを９６ウェルプレート中で成長させ、上記のＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイを使用して変異について評価した（クローンのゲノムＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ製のＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＰＣＲキット、カタログＸＮＡＢ２を使用して９６ウェルプレート中で抽出する）。４２個のクローンは陽性であり（２つのより小さなバンドが検出された）、これらのゲノムがエクソン３の少なくとも１つの変異コピーを含有し、それらのＰＣＲ増幅ＩＧＦ−１Ｒエクソン３が配列決定されていることを意味している。偽２倍体ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株から生成したクローンについて予想されるように、ＤＮＡシークエンシングクロマトグラムは、標的配列の２つのコピーを示す、最大で２つの重複する同じ強度のシグナルを示した。６つのクローンは両方のコピーにおいて変異を有し、そのうちの３つのクローンは、両方のコピー（配列番号９９及び１００）において近接して停止コドン又は１つのコピーにおいて近接して停止コドン及びその他において大きな欠失（配列番号１０１）を誘発する変異を有した。これらの３つのクローンにおける２つのコピーの配列をＴＯＰＯクローニング（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．Ｋ４５７５−４０；６つの細菌コロニーを選択した）によって確認した。３つ全てのＫ．Ｏ．クローンを親細胞より顕著に高い細胞密度で成長させ、ＩＧＦ−１（「ｈＩＧＦ−１Ｅａ ３ｍｕｔ」（配列番号２７）が標準培地中で５０ｍｇ／Ｌにて急上昇した場合、標準培地中で親細胞と同様の密度で成長させた（図８）。遺伝子型Δ５／Δ２２（配列番号１００／１０２）を有するクローンを、インスリン様成長因子１タンパク質、例えばヒトＩＧＦ−１（配列番号１又は５）又はそのバリアント（例えば配列番号８〜１４）でのトランスフェクションのために選択した。
ｐＺＦＮでトランスフェクトしたＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞株において、１１７個のみのクローンを９６ウェルプレート中で成長させ、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いて変異について評価した。２８個のクローンは、エクソン３の少なくとも１つの変異コピー（２つのより小さなバンドが検出された）を有したが、シークエンシングにより、全てのこれらのクローンは依然として野生型コピーを有することが示され、野生型配列は、シークエンシングクロマトグラムにおいて変異配列より高い強度を有した。ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞株は変異誘発され、ポリクローナルであり、核型はいくつかの細胞において染色体の８個までのコピーを示し、遺伝子の予想されるコピー数の推定を困難にする。近接して停止コドンを誘発する変異配列が検出された２つのクローン（Δ２２又はΔ１６）を、ｐＺＦＮでのトランスフェクションの第２ラウンドのために選択し、１０μｇの混合ｐＺＦＮを使用して元のクローンにつき３つのプールを生成した。トランスフェクションの７日後、プールは６×９６ウェルプレートにおいてクローニングしたＦＡＣＳであった。３７９個のクローンを成長させ、それから２１１個をＩＧＦ−１Ｒエクソン３について配列決定し（既に変異した配列であるのでＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイはもはや可能ではない）、重複配列をクロマトグラムで視覚的に分析した。配列決定したクローンのほとんどは野生型及び予想される変異配列（Δ２２又はΔ１６）を有するヘテロ接合体であり、クローンの約２０％は野生型及び２つの変異配列を有し（大部分は切断部位周囲に欠失を有する）、２つのクローンにおいて４つの異なる配列が検出され（ＴＯＰＯクローニングにより確認したが、配列の１つは野生型又は１つのみのヌクレオチド挿入のいずれかであり）、２つのクローンは両方とも、検出された２つの配列（Δ１６／Δ２２及びΔ１６／Δ５）を有するＫ．Ｏ．クローンであったが、ＩＧＦ−１の存在下でのそれらの成長は、親ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１派生細胞株におけるよりごくわずかだけ良好であった。従って、遺伝子型Δ２２／Δ７／野生型、Δ１６／Δ７／野生型及びΔ１６／Δ２２／野生型を有する３つのクローンを、ｐＺＦＮでの第３ラウンドのトランスフェクションのために選択した（これらの配列はＴＯＰＯクローニングによって確認され、３２個の細菌コロニーを選択し、１つのクローンにつき配列決定した）。３つのクローンの各々を８μｇのｐＺＦＮで２回トランスフェクトした。一旦、各クローンから２つのプールを回収し（生存率＞９１％、７〜９日後）、それらをプールし、（より耐性のある細胞を選択するために）５０ｍｇ／ｌのＩＧＦ−１の存在下で約６〜８週間、共培養した。ＦＡＣＳクローニングの２日前に、それらを、（ＩＧＦ−１−Ｃｙ５の結合を可能にし、５％未満の蛍光細胞を選択するために）ＩＧＦ−１を有さずに分離した。３つのプールは全部で９×９６ウェルプレートにおいてクローニングしたＦＡＣＳであった。
ＩＧＦ−１Ｒエクソン３における野生型切断部位配列に結合するＰＣＲプライマーを設計し、変異クローンの効果的なスクリーニングを可能にした。ＩＧＦ−１Ｒについてのフォワードシークエンシングプライマーと一緒にＰＣＲを実施し、クローンがＰＣＲ陰性であった場合、ＰＣＲが常に作用していると仮定し、野生型配列は存在せず、又はクローンは十分に成長しなかった（ごくわずかのＤＮＡを抽出したので、少しの細胞が成長した）。このようにスクリーニングした３８９個の成長したクローンから、５８個は陰性であり、配列決定した。これらのクローンの３０個において、野生型配列は検出されず、２２個のクローンについて変異はフレームシフトであった（クローンΔ２２／Δ７／野生型由来の２つの配列Δ２２／Δ７を有する１３個のクローン）。５０ｍｇ／ｌのＩＧＦ−１を有する及び有さないこれらの成長を評価し、ＩＧＦ−１を有する最適な成長クローン（また、そのうちＩＧＦ−１を有さない最適な成長クローン）、配列Δ２２／Δ７（ＴＯＰＯクローニングによって検証した）を有する最適な成長クローンを、配列番号８〜１４のタンパク質をコードするＤＮＡ構築物でのトランスフェクションのために選択した。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ヒトＩＧＦ−１タンパク質を含むポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は変異しており、前記ヒトＩＧＦ−１タンパク質のアミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する、ポリペプチド。
［２］
ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又は変異しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、ポリペプチド。
［３］
前記ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質がヒトＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域に融合している、上記［２］に記載のポリペプチド。
［４］
前記４２位におけるアミノ酸グリシンがセリンに変異している、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［５］
前記ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質が、Ｅａペプチド、及び、Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及びＭ１０５からなる群から選択されるアミノ酸のさらなる欠失又は変異を含む、上記［２］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド。
［６］
前記ＩＧＦ−１前駆タンパク質及びＦｃ領域がペプチドヒンジ領域によって分離している、上記［３］〜［５］のいずれかに記載のポリペプチド。
［７］
前記ペプチドヒンジ領域が、ペプチドヒンジ１（配列番号２２）、ヒンジ２（配列番号２３）及びヒンジ３（配列番号２４）からなる群から選択される、上記［６］に記載のポリペプチド。
［８］
前記ヒトＩＧＦ−１タンパク質が、
ａ．アミノ酸Ｅ３が欠失し、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異し、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異している
改変を含み、前記ヒトＩＧＦ−１タンパク質のアミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する、上記［１］に記載のポリペプチド。
［９］
前記ポリペプチドが、Ｅ−ペプチドを含み、
ａ．アミノ酸Ｅ３、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異しており、
前記ヒトＩＧＦ−１タンパク質のアミノ酸の番号付けが配列番号５に対応する、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［１０］
前記ポリペプチドが、Ｅａペプチドを含み、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、かつ、
ｃ．アミノ酸Ｒ３６、Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異しており、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異している、
上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［１１］
前記ポリペプチドが、Ｅａペプチドを含み、
ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１及びＳ７２が欠失しており、
ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、
ｃ．アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７及びＲ１０４がグルタミンに変異しており、かつ、
ｄ．アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸に変異している、
上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［１２］
前記ポリペプチドが、Ｅａペプチドを含み、
ｅ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５が欠失しており、
ｆ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、かつ、
ｇ．アミノ酸Ｒ３６、Ｒ７４及びＲ７７がグルタミンに変異しており、かつ、
ｈ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異している、
上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［１３］
前記ポリペプチドが、Ｅａペプチドを含み、
ｅ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４及び／又はＭ１０５が欠失しており、
ｆ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、
ｇ．アミノ酸Ｒ７４及びＲ７７がグルタミンに変異しており、かつ、
ｈ．アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸に変異している、
上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［１４］
前記ＩＧＦ−１前駆タンパク質及び前記Ｆｃ領域がヒンジ１ペプチド（配列番号２２）によって分離している、上記［１０］に記載のポリペプチド。
［１５］
前記ＩＧＦ−１前駆タンパク質及び前記Ｆｃ領域がヒンジ３ペプチド（配列番号２４）によって分離している、上記［１１］に記載のポリペプチド。
［１６］
前記Ｆｃ領域がＦｃ受容体へのその結合を調節するように改変されている、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［１７］
前記Ｆｃ領域が、
ＩＶ．Ｆｃ受容体に対するその親和性を低下させ、
Ｖ．ＡＤＣＣ活性を低下させ、又は
ＶＩ．ＡＤＣＣ活性を阻止する
ように改変されている、上記［１６］に記載のポリペプチド。
［１８］
配列番号８を含む、上記［１０］に記載のポリペプチド。
［１９］
配列番号９を含む、上記［１０］に記載のポリペプチド。
［２０］
配列番号１０を含む、上記［１２］に記載のポリペプチド。
［２１］
配列番号１１を含む、上記［１２］に記載のポリペプチド。
［２２］
配列番号１２を含む、上記［１１］に記載のポリペプチド。
［２３］
配列番号１３を含む、上記［１１］に記載のポリペプチド。
［２４］
配列番号１４を含む、上記［１３］に記載のポリペプチド。
［２５］
配列番号１１８を含む、上記［９］に記載のポリペプチド。
［２６］
前記ポリペプチドがグリコシル化されている、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［２７］
上記［１］〜［２５］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド。
［２８］
配列番号１５に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［２９］
配列番号１６に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［３０］
配列番号１７に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［３１］
配列番号１８に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［３２］
配列番号１９に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［３３］
配列番号２０に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［３４］
配列番号２１に示されている核酸分子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチド。
［３５］
治療に使用するための、上記［１］〜［２５］のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
［３６］
必要とする患者における筋障害を治療するための、上記［３５］に記載の医薬組成物。
［３７］
除脂肪体重の喪失及び／又は筋肉疲労を患っている熱傷患者を治療するための、上記［３５］に記載の医薬組成物。
［３８］
ＣＯＰＤ患者を治療するための、上記［３５］に記載の医薬組成物。
［３９］
球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ又はケネディ病）患者を治療するための、上記［３５］に記載の医薬組成物。
［４０］
慢性腎疾患患者を治療するための、上記［３５］に記載の医薬組成物。
［４１］
前記筋障害が筋萎縮である、上記［３６］に記載の医薬組成物。
［４２］
前記筋萎縮が、肥満関連サルコペニア、サルコペニア及び糖尿病関連筋萎縮からなる群から選択される、上記［４１］に記載の医薬組成物。
［４３］
必要とする患者における筋障害を治療する方法であって、治療有効量の上記項目のいずれかに記載のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法。
［４４］
除脂肪体重の喪失及び／又は筋肉疲労を患っている熱傷患者を治療する方法であって、治療有効量の上記項目のいずれかに記載のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法。
［４５］
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者を治療する方法であって、治療有効量の上記項目のいずれかに記載のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法。
［４６］
球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ又はケネディ病）患者を治療する方法であって、治療有効量の上記項目のいずれかに記載のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法。
［４７］
慢性腎疾患患者を治療する方法であって、治療有効量の上記項目のいずれかに記載のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法。
［４８］
前記筋障害が、肥満関連サルコペニア、サルコペニア及び糖尿病関連筋萎縮からなる群から選択される筋萎縮である、上記［４３］に記載の方法。
［４９］
前記４２位におけるアミノ酸グリシンが欠失している、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
［５０］
前記ヒトＩＧＦ−１前駆タンパク質がペグ化されている、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。

Claims (10)

  1. ヒトＩＧＦ−１バリアントを含むポリペプチドであって、
    前記ポリペプチドは、ヒトＩＧＦ−１の生物活性を有し、かつヒト野生型ＩＧＦ−１と比較して、インビトロ系でのＣ２Ｃ１２筋管及び含脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）において、より低いグルコース取り込みを誘導し、インビボでＩＧＦ−１治療の低血糖のリスクを低下させる活性を有し、
    前記ヒトＩＧＦ−１バリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列における４２位におけるアミノ酸グリシンがセリンに変異している、ヒトＩＧＦ−１バリアントを含むポリペプチド。
  2. 前記ヒトＩＧＦ−１バリアントが、
    ａ．アミノ酸Ｅ３が欠失し、
    ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異し、かつ、
    ｃ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異している
    改変を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ヒトＩＧＦ−１バリアントが、
    ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２及びＥ３が欠失しており、
    ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、かつ、
    ｃ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異している
    改変を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記ヒトＩＧＦ−１バリアントが、
    ａ．アミノ酸Ｇ１、Ｐ２及びＥ３が欠失しており、
    ｂ．アミノ酸Ｇ４２がセリンに変異しており、
    ｃ．アミノ談Ｒ３６がグルタミンに変異しており、かつ、
    ｄ．アミノ酸Ｒ３７がアラニンに変異している
    改変を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 配列番号１に示されるアミノ酸配列の４２位のアミノ酸グリシンがセリンに変異している、ヒトＩＧＦ−１バリアント。
  6. 配列番号１に示されるアミノ酸配列の４２位のアミノ酸グリシンがアミノ酸セリンによって置換されているヒトＩＧＦ−１バリアントであって、以下：
    （ａ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換され若しくは欠失しており、又は
    （ｂ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、又は
    （ｃ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換され若しくは欠失しており、又は
    （ｄ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、又は
    （ｅ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンによって置換されており、又は
    （ｆ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）によって置換されており、又は
    （ｇ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７が置換され若しくは欠失しており、又は
    （ｈ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６及びＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、又は
    （ｉ）アミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）によって置換されており、Ｒ３７がアラニンによって置換されている、ヒトＩＧＦ−１バリアント。
  7. 請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項５又は６に記載のバリアントをコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド。
  8. 治療に使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項５又は６に記載のバリアントを含む医薬組成物。
  9. 必要とする患者における筋障害を治療するための、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記筋障害が筋萎縮である、請求項９に記載の医薬組成物。
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