CN105121462A - 稳定化的胰岛素样生长因子多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明属于IGF-1修饰领域。特别地,它涉及修饰的IGF-1多肽和修饰的IGF-1前体多肽,其中阻止E肽的切割。本发明还涉及这类多肽治疗肌肉疾病和病症的用途。
Description
技术领域
本发明属于胰岛素样生长因子1(IGF-1)修饰领域。特别地,它涉及与人免疫球蛋白Fc区连接的修饰的IGF-1多肽。
背景
胰岛素样生长因子(IGF)是细胞用来与其生理环境通讯的复杂系统的部分。这个复杂系统(经常称作胰岛素样生长因子轴)由两种细胞表面受体(IGF-1R和IGF-2R)、两种配体(IGF-1和IGF-2)、六种高亲和力IGF结合蛋白(IGFBP1-6)家族和相关的IGFBP降解酶(蛋白酶)组成。这个系统不仅对调节正常生理重要,还对许多病理状态重要(Glass,NatCellBiol5:87-90,2003)。
已经显示IGF轴在促进细胞增殖和抑制细胞死亡(凋亡)方面发挥重要作用。作为受人生长激素(hGH)刺激的结果,IGF-1主要由肝脏分泌。人体中的几乎每个细胞都受IGF-1影响,尤其肌肉、软骨、骨、肝、肾、神经、皮肤和肺中的细胞。除胰岛素样效应之外,IGF-1还能够调节细胞生长。IGF-1和IGF-2受称作IGF结合蛋白的基因产物家族调节。这些蛋白质以复杂方式帮助调节IGF的作用,所述复杂方式涉及通过阻止与IGF受体结合来抑制IGF作用以及通过辅助递送至受体和增加血流中的IGF半寿期来促进IGF作用。存在至少六种表征的结合蛋白(IGFBP1-6)。
在其成熟形式下,人IGF-1,也称作生长调节素,是70个氨基酸的小蛋白,其中已经显示所述小蛋白刺激广泛类型的培养细胞生长。IGF-1蛋白起初由三种已知的剪接变体mRNA编码。每种mRNA的开放阅读框编码前体蛋白,其含有70个氨基酸的IGF-1(SEQIDNO.:1)并且取决于具体的IGF-1mRNA,在C末端含有特定E肽。已经将这些E肽称作Ea肽(rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm;SEQIDNO.:2)、Eb肽(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk;SEQIDNO.:3)和Ec肽(svraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk;SEQIDNO.:4)并且范围从35至87个氨基酸长,并且包含在N末端的共同序列区和在C末端的可变序列区。例如,IGF-1-Ea的野生型可读框编码包含前导序列的135个氨基酸的多肽和无前导序列的105个氨基酸的多肽(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm;SEQIDNO.:5)。在生理表达时,E肽由内源蛋白酶从前体切去以产生成熟的70个氨基酸的IGF-1。人血清中IGF-1的利用度和半寿期主要受蛋白酶和IGF-1结合蛋白(IGFBP)影响和调节。IGFBP可以抑制或加强IGF-1活性(OhY等人,Characterizationoftheaffinitiesofinsulin-likegrowthfactor(IGF)-bindingproteins1-4forIGF-I,IGF-II,IGF-I/insulinhybrid,andIGF-Ianalogs.Endocrinology.1993Mar;132(3):1337-44)。现有技术中已经描述了增加IGF-1半寿期的策略。已经构思的策略是
(i)产生IGF-1变体,所述变体包含旨在阻止人血清中IGF-1被丝氨酸蛋白酶切割或减轻IGF-1结合蛋白对IGF-1可用度或血清半寿期的不利影响的特异性突变(WO200040613、WO05033134、WO2006074390、WO2007/146689);
(ii)产生IGF-1融合蛋白,其中成熟IGF-1蛋白与人免疫球蛋白Fc区融合(WO2005033134、WO200040613);
(iii)使用IGF-1前体蛋白,其中通过修饰前体蛋白减少蛋白酶从IGF-1切割E肽(WO2007146689);
(iv)上述策略的组合((i)/(ii)WO05033134、(i)/(ii)WO200040613、(i)/(iii)WO2007146689)。
尽管存在上述策略,但出于以下主要地两个原因,与人免疫球蛋白Fc区融合的IGF-1前体变体仍是差的候选药物:(i)哺乳动物生产系统中生产率低,和(ii)与未修饰的人野生型IGF-1相比,对胰岛素受体(INSR)的结合亲和力增加,这可以导致低血糖,一种具有治疗顾虑的不良事件。
因此,需要克服上述现有技术问题的技术。本发明在多个方面满足这个需要。
发明概述
本公开的第一主题涉及包含人IGF-1(hIGF-1)蛋白的多肽,其中将所述hIGF-1蛋白的位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或替换,并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:1。
本公开的额外实施方案涉及包含与人IgG的免疫球蛋白Fc区融合的人IGF-1蛋白的多肽,其中将人IGF-1蛋白的位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或替换,并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:1。
本公开的另一个主题涉及包含人IGF-1前体蛋白的多肽,其中将所述人hIGF-1前体蛋白的位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或替换,并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
本公开的额外实施方案涉及包含与人IgG的免疫球蛋白Fc区融合的人IGF-1前体蛋白的多肽,其中将人IGF-1前体蛋白的位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或替换,并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
在某个实施方案中,本公开涉及上述的多肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸被缺失或用丝氨酸替换。
在额外的实施方案中,上文提到的人IGF-1蛋白包含在氨基酸G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69和/或A70处额外的缺失或突变。
在额外的实施方案中,上文提到的人IGF-1前体蛋白包含Ea肽和以下氨基酸的额外缺失或突变:G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105。
在可以与本公开的前述实施方案组合的又一个实施方案中,人IGF-1前体蛋白和Fc区由肽铰链区分隔。
因此,本公开还涉及上述的人IGF-1前体蛋白,其中肽铰链区选自肽铰链1(SEQIDNO.:22)、铰链2(SEQIDNO.:23)和铰链3(SEQIDNO.:24)。
在具体实施方案中,上述的人IGF-1前体蛋白在Ea肽中氨基酸R74,R77和/或R104处突变时,所述氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
多肽包含如上文所述的人IGF-1蛋白或人IGF-1前体蛋白或由其组成,其中
a.氨基酸E3、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42缺失或由丝氨酸替换,并且
c.氨基酸R37突变成丙氨酸并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
本公开的另一个具体实施方案涉及上述的人IGF-1前体蛋白,其中E-肽是Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42缺失或突变成丝氨酸,并且
c.氨基酸R36、R74、R77和R104突变成谷氨酰胺,
d.氨基酸R37突变成丙氨酸并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
本公开的另一个具体实施方案涉及上述的人IGF-1前体蛋白,其中E-肽是Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71、S72、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105缺失,
b.氨基酸G42缺失或突变成丝氨酸,并且
c.氨基酸R36、R74和R77突变成谷氨酰胺,并且
d.氨基酸R37突变成丙氨酸并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
同样地,本公开涉及上述的人IGF-1前体蛋白,其中E-肽是Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42缺失或突变成丝氨酸,
c.氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺,并且
d.氨基酸R37突变成谷氨酸并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
同样地,本公开涉及上述的人IGF-1前体蛋白,其中E-肽是Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71、S72、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105缺失,
b.氨基酸G42缺失或突变成丝氨酸,
c.氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺,并且
d.氨基酸R37突变成谷氨酸并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
在另外的具体实施方案中,本公开涉及上述的人IGF-1前体Fc融合蛋白,其中E-肽是Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42缺失或突变成丝氨酸,并且
c.氨基酸R36、R74、R77和R104突变成谷氨酰胺,
d.氨基酸R37突变成丙氨酸,其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5,并且
e.其中IGF-1前体蛋白和Fc区由铰链肽铰链1(SEQIDNO.:22)分隔。
另外,本公开涉及上述的人IGF-1前体Fc融合蛋白,其中E-肽是Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42缺失或突变成丝氨酸,
c.氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺,并且
d.氨基酸R37突变成谷氨酸并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5,并且
e.其中IGF-1前体蛋白和Fc区由铰链肽铰链3(SEQIDNO.:24)分隔。
在某个实施方案中,本公开涉及上述的多肽,其中修饰Fc区以调节其与Fc受体的结合。
因此,本公开涉及上述的人IGF-1前体Fc融合蛋白,其中修饰Fc区以
I.减少其对Fc受体的亲和力;
II.减少ADCC活性;或
III.阻止ADCC活性。
本内容的另一个具体实施方案涉及上述的人IGF-1前体Fc融合蛋白,所述融合蛋白包含SEQIDNO.:8、或SEQIDNO.:9、或SEQIDNO.:10、或SEQIDNO.:11、或SEQIDNO.:12、或SEQIDNO.:13、或SEQIDNO.:14、或SEQIDNO.:27。
在可以与本公开的前述实施方案组合的某个实施方案中,人IGF-1前体Fc融合蛋白糖基化。
在另一个方面,本公开涉及多核苷酸,其包含编码上述的人IGF-1前体Fc融合蛋白的核酸分子。因此,本公开涉及多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:15或SEQIDNO.:16或SEQIDNO.:17或SEQIDNO.:18或SEQIDNO.:19或SEQIDNO.:20或SEQIDNO.:21中所述的核酸分子。
本公开另外提供用于治疗中的包含多肽的药物组合物,所述多肽包含任一种上文公开的人IGF-1前体蛋白。
在本公开的另一个实施方案中,上文提到的治疗性用途是治疗有需要的患者中的肌肉疾病。在本公开的具体实施方案中,治疗用途是治疗患有去脂体重损失和/或肌肉萎缩的烧伤患者或治疗COPD患者、或治疗肯尼迪病患者、或治疗慢性肾脏病患者。
在本公开的额外实施方案中,上文描述的肌肉疾病是肌肉萎缩。因此,在本公开的一些方面,治疗用途是治疗肥胖相关的少肌症、少肌症和糖尿病相关的肌肉萎缩。
本公开内容还提供治疗有需要的患者中肌肉疾病的方法,所述方法包括施用治疗有效量的本发明上述的人IGF-1前体蛋白。
因此,在一个具体实施方案中,本公开涉及治疗患有去脂体重损失和/或肌肉萎缩的烧伤患者的方法或治疗COPD患者的方法,或治疗肯尼迪病患者的方法,或治疗慢性肾脏病患者的方法。
另外,本公开提供治疗有需要的患者中肌肉疾病的方法,其中肌肉疾病是肌肉萎缩选自肥胖相关的少肌症、少肌症和糖尿病相关的肌肉萎缩。
在另一个实施方案中,本公开涉及如上文所述的IGF-1多肽或IGF-1前体多肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸缺失。在另一个实施方案中,本公开涉及如上文所述的IGF-1多肽或IGF-1前体多肽,其中所述蛋白质聚乙二醇化。
附图简述
图1:对IGF-1R的结合亲和力
使用表面等离子体共振法(Biacore)测量hIGF-1和IGF-1变体对rhIGF1R的高亲和力结合。
图2(A-D):NIH3T3-IGF-1R细胞转染子中IGF-1R的磷酸化
将过量表达人IGF-1受体(NIH3T3-IGF-1R)的NIH3T3细胞在生长培养基中培养24小时,在无血清培养基中饥饿18小时并且在37℃用等摩尔浓度的所示肽刺激10分钟。通过ELISA分析IGF-1R磷酸化水平。将受体磷酸化表述为对照%±标准偏差(SD)(NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞来自1962年在纽约大学医学院病理学系分离并开始的细胞系;TodaroGJ,GreenH.Quantitativestudiesofthegrowthofmouseembryocellsin培养物andtheirdevelopmentintoestablishedlines.J.CellBiol.17:299-313,1963)。
图3(A-D):NIH3T3-InsR细胞转染子中InsR的磷酸化
将过量表达人胰岛素受体的NIH3T3细胞(NIH3T3-InsR)在生长培养基中培养24小时,在无血清培养基中饥饿18小时并且在37℃用等摩尔浓度的所示肽刺激10分钟。通过ELISA分析InsR磷酸化水平。受体磷酸化表述为任意单位±标准偏差(SD)。
图4(A-C):人和食蟹猴原代成肌细胞中IGF-1R的磷酸化
将细胞在生长培养基中培养时,饥饿4小时并且在37℃用hIGF-1或hIGF-1变体刺激15分钟。使用DuoSetIC人磷酸化-IGF1R,通过ELISA分析IGF-1R磷酸化水平。受体磷酸化表述为对照%±标准偏差(SD)。
图5(A-D):小鼠肌管和脂肪细胞中的葡萄糖摄取
将3T3-L1脂肪细胞(B和D)和C2C12小鼠肌管细胞(A和C)接种到24孔板上并在无血清DMEM中培养4小时。随后将无血清DMEM替换为分别用于3T3-L1脂肪细胞和C2C12的KRP缓冲液或HBS。将细胞用指定的肽在37℃处理1小时。通过在室温添加0.4(脂肪细胞)或0.8(C2C12)μCi[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和0.1(脂肪细胞)或0.01(C2C12)mM2-脱氧-D-葡萄糖持续10分钟(脂肪细胞)或5分钟(C2C12),测量葡萄糖摄取。通过闪烁计数法分析放射性活度。
图6:葡萄糖摄取:脂肪细胞中的时间过程
将3T3-L1脂肪细胞接种到24孔板上并在无血清DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)中培养4小时。随后将无血清DMEM替换为KRP缓冲液并且将细胞用指定的肽在37℃处理15、60、90和120分钟。通过在室温添加0.4μCi的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和0.1mM2-脱氧-D-葡萄糖持续10分钟,测量葡萄糖摄取。通过闪烁计数法分析放射性活度。3T3-L1是从针对脂肪组织的生物学研究中使用的3T3细胞衍生的细胞系;GreenH,KehindeO(1975)."Anestablishedpreadiposecelllineanditsdifferentiationinculture.II.Factorsaffectingtheadiposeconversion".Cell5(1):19–27。
图7(A-B):
成年雄性大鼠(n=3/组)按10mg/kg接受hIGF-1-Ea-Fc_mut13/2_A或hIGF-1-Ea-Fc_mut04/2_E的静脉内(i.v.)团注或皮下(s.c.)注射。在施用试验材料后2、4、8、24、48、72、96、168和336小时采集连续血液标本。通过ELISA测定重组蛋白的血清浓度。
图8(A-C):hIGF-1-Ea-Fc_突变体针对地塞米松诱导的肌萎缩的效应。
(A)载体组、(B)Dex组、(C)Dex加3.8mg/kg/日皮下微泵输注hIGF-1组,(D)Dex加3mg/kg/日皮下eodhIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A组、(E)Dex加10mg/kg/日皮下eodhIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A组、和(F)Dex加3mg/kg/日皮下eodhIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A组的身体重变化(A)和肌肉重量变化(B和C)。值表述为平均数±SEM(n=4-6)。*:P<0.05,**:P<0.01,**:P<0.001相对于组B,###P<0.001相对于组A(ANOVA后的Dunnett多重比较检验)。
图9:在HEK293细胞中产生具有不同G42突变的IGF-1变体
生产数据来自用FuGene转染的100ml规模HEK293F培养物。通过分析性蛋白AHPLC从澄清的细胞培养上清液测量滴度。在蛋白A纯化后测量浓度。通过SEC-MALS测量纯化的蛋白质的聚集水平。
图10:从两个不同CHO细胞系表达的hIGF1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,77-fc(SEQIDNO.6)(深灰色)和hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A(SEQIDNO.9)(浅灰色)的剪切的物质的比例。从已转染的CHOK1衍生细胞以及CHO-DUX11衍生细胞的纯化的蛋白(蛋白A层析)确定剪切的物质的比例。通过反相LC-MS分析确定剪切的比例。对于hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A,剪切的物质的比例在两个细胞系中显著较低。
图11:表达重组抗体的CHO-K1衍生细胞(粗线)和表达hIGF-1Ea3mut(SEQIDNO.:27)的CHO-K1衍生细胞(点线)在生物反应器运行中的细胞生长。B:生物反应器运行中的活细胞百分数(粗线产生抗体的CHO-K1衍生克隆,点线表达hIGF-1Ea3mut的克隆)。
图12:活细胞数目:连续线显示CHO-K1衍生细胞的细胞生长。在与野生型IGF-1或hIGF-1Ea3mut共培养期间,细胞生长被抑制(分别是点划线和短划线)。显示3个生物重复的平均数。IGF-1/hIGF-1Ea3mut在第2日掺入(标定实验)。B:细胞活力:连续线显示CHO-K1衍生细胞的细胞活力,相应加点的短划线显示在掺入IGF-1/hIGF-1Ea3mut后降低的细胞活力。如果细胞与IGF-1/hIGF-1Ea3mut共孵育,则细胞活力提早2天降低。不能在IGF-1和hIGF-1Ea3mut之间在细胞生长或细胞活力方面检测到差异。
图13:显示CHO-DUXB11衍生细胞的细胞生长(粗线)和与IGF-1Ea3mut共培养期间减少的细胞生长(点线)。在添加IGF-1R酪氨酸激酶抑制剂NVPAEW541(带星号的粗线)后,细胞生长略微地减少。与IGF-1Ea3mut共培养以及添加IGF-1R酪氨酸激酶抑制剂未导致进一步的细胞生长抑制(带星号的点线)。
图14:野生型(WT)CHO-K1衍生细胞的细胞生长以粗体显示,并且与IGF-1共培养期间减少的细胞生长以带圆圈的粗体显示。用点线显示三个IGF-1RKO克隆的细胞生长。与野生型CHO-K1衍生细胞相比,细胞生长略微改善。与IGF-1共培养导致仅较低细胞生长抑制,并且细胞生长类似于不与IGF-1共培养的野生型CHO-K1衍生细胞。
图15:显示14天分批培养物的IGF-1-Fc融合蛋白滴度(汇总水平)。突出显示7种不同IGF-1-Fc融合蛋白在5个不同细胞系中的表达。与CHO-K1或CHO-DUXB11衍生性野生型细胞系相比,IGF-1-Fc融合蛋白在CHO-K1衍生IGF-1R-KO细胞系、CHO-DUXB11衍生IGF-1R-KO细胞系以及在CHO-DUXB11衍生shRNA(IGF-1R和INSR表达减少)细胞系中的表达增长5-20倍。
图16:50ml摇瓶中14天分批培养物的IGF-1-Fc融合物滴度。与CHO-DUXB11衍生野生型细胞克隆中IGF-1-Fc融合蛋白:hIGF-1-Ea-Δ1-3,R37A,Δ71-72,R77Q-fc结构域的滴度相比,IGF-1-Fc融合蛋白:hIGF-1-Ea-fc_mut13/2_A在15个最佳CHO-DUXB11衍生IGF-1R-KO克隆中的滴度高大约6-7倍。
图17:HEK293F细胞中IGF-1变体的产生和蛋白质攻击。
生产数据来自用PEI转染的100ml规模HEK293T培养物。蛋白A纯化后的产率外推至1L培养物体积。在蛋白A纯化后通过SEC-MALS测量聚集作用。将纯化的蛋白质与来自CHOK1衍生的细胞的条件化CHO培养基孵育5日并且与来自CHODUXB11衍生细胞的条件化CHO培养基孵育20日。显示剩余全长蛋白质的百分数。实施例2中描述方法。
图18:NIH3T3-InsR细胞转染子中InsR的磷酸化
将过量表达人胰岛素受体的NIH3T3细胞(NIH3T3-InsR)在生长培养基中培养24小时,在无血清培养基中饥饿18小时并且在37℃用等摩尔浓度的所示肽刺激10分钟。通过ELISA分析InsR磷酸化水平。受体磷酸化表述为任意单位±标准偏差(SD)。
图19:小鼠肌管和脂肪细胞中的葡萄糖摄取
将3T3-L1脂肪细胞(A)和C2C12小鼠肌管细胞(B)接种到24孔板上并在无血清DMEM中培养4小时。随后将无血清DMEM替换为分别用于3T3-L1脂肪细胞和C2C12的KRP缓冲液或HBS。将细胞用指定的肽在37℃处理1小时。通过在室温添加0.4(脂肪细胞)或0.8(C2C12)μCi的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和0.1(脂肪细胞)或0.01(C2C12)mM2-脱氧-D-葡萄糖持续10分钟(脂肪细胞)或5分钟(C2C12),测量葡萄糖摄取。通过闪烁计数法分析放射性活度。
一般定义
为了可以更轻易地理解本发明,首先定义某些术语。额外的定义在详细描述中自始至终给出。
包含:术语“包含”意指“包括”,例如包含“X”的组合物可以完全由X组成或可以包括额外的某物,例如X+Y。
符号“Δ”或字母“d”或“D”:在描述蛋白质的情境下(例如“hIGF-1-Ea-Δ1-3,R37A,Δ71-72,R77Q-fc结构域”或“hIGF-1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,R77Q-fc结构域”)指氨基酸缺失。作为例子,术语“D71-72,77”(在蛋白质hIGF1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,77-fc情境下)描述氨基酸71,72和77已经缺失的事实。
胰岛素样生长因子1蛋白质或其变体:短语“胰岛素样生长因子1蛋白或其变体”指由胰岛素样生长因子1基因编码的蛋白质,特别优选人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)蛋白及其变体。IGF-1蛋白变体是与IGF-1野生型序列相差至少一个氨基酸的蛋白质,其中术语“野生型序列”指在至少一种天然存在生物中可获得的多肽或基因序列,或尚未经人类改变、突变或另外操作的多肽或基因序列。术语IGF-1变体和IGF-1模拟物在本文件通篇范围内互换使用。IGF-1变体还是包含肽前导序列的IGF-1前体蛋白或原IGF-1蛋白。IGF-1变体还是包含IGF-1蛋白的融合蛋白,例如包含与免疫球蛋白Fc区融合的IGF-1蛋白的蛋白质。IGF-1变体的例子尤其在专利申请WO05033134中公开(与免疫球蛋白Fc区融合的稳定化的IGF-1蛋白)和WO2007146689(稳定化的IGF-1前体蛋白)。如上文所述的IGF-1变体就可以将这种蛋白质视为野生型IGF-1的功能等同物的含义而言保留其生物活性。
功能等同物就IGF-1蛋白而言应理解为包含天然或人工突变的IGF-1蛋白。突变可以是不削弱IGF-1蛋白的生物活性的插入、缺失或替换一个或多个核酸。功能等同物与IGF-1野生型蛋白(例如人IGF-1蛋白SEQIDNO.:1)具有至少80%、优选地85%、更优选地90%、最优选地超过95%的同一性,非常特别优选地至少98%同一性,但是小于100%同一性。在如上文所述的融合蛋白情况下,100%同一性应当仅仅基于这种融合蛋白的IGF-1部分确定。
胰岛素样生长因子(IGF)是细胞用来与其生理环境通讯的复杂系统的部分。这个复杂系统(经常称作胰岛素样生长因子轴)由两种细胞表面受体(IGF-1R和IGF-2R)、两种配体(IGF-1和IGF-2)、六种高亲和力IGF结合蛋白(IGFBP1-6)家族和相关的IGFBP降解酶(蛋白酶)组成。这个系统不仅对调节正常生理重要,还对许多病理状态重要(Glass,NatCellBiol5:87-90,2003)。已经显示IGF轴在促进细胞增殖和抑制细胞死亡(凋亡)方面发挥重要作用。作为受人生长激素(hGH)刺激的结果,IGF-1主要由肝脏分泌。人体中的几乎每个细胞都受IGF-1影响,尤其肌肉、软骨、骨、肝、肾、神经、皮肤和肺中的细胞。除胰岛素样效应之外,IGF-1还可以调节细胞生长。IGF-1和IGF-2受称作IGF结合蛋白的基因产物家族调节。这些蛋白质以复杂方式有助于调节IGF的作用,所述复杂方式涉及通过阻止与IGF受体结合来抑制IGF作用以及通过辅助递送至受体和增加血流中的IGF半寿期来促进IGF作用。存在至少六种表征的结合蛋白(IGFBP1-6)。IGF-1用于广泛类型的治疗性应用中。Mecasermin(商标名IncrelexTM)是经批准用于治疗生长障碍的IGF-1的合成性类似物。几家企业已经在临床试验中对多种额外适应症评价IGF-1,所述额外适应症包括I型糖尿病,II型糖尿病,肌萎缩侧索硬化、严重烧伤和强直性肌营养不良。
出于清晰和一致性目的,在本申请通篇范围和在权利要求中,IGF-1前体或成熟蛋白中氨基酸残基的编号基于无信号肽的人胰岛素样生长因子1(生长调节素C)同种型CRA_c(登录号EAW97697)(即SEQIDNO.:5)的野生型前体蛋白序列编号。
哺乳动物细胞:术语“哺乳动物细胞”在所公开方法的情境下指适于以工业制造规模产生蛋白质的哺乳动物细胞。那些细胞是技术人员熟知的并且已经例如源自中国仓鼠(Cricetulusgriseus)、非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)、智人(Homosapiens)、金仓鼠(Mesocricetusauratus)、小家鼠(Musmusculus)和绿猴属(Chlorocebus)物种。相应的细胞系称作CHO-细胞(中国仓鼠卵巢)、COS-细胞(衍生自猴肾(非洲绿猴)的细胞系)、Vero-细胞(从非洲绿猴提取的肾上皮细胞)、Hela-细胞(该株系从取自HenriettaLacks的宫颈癌细胞衍生)、BHK-细胞(幼仓鼠肾细胞),HEK-细胞(人胚肾)、NS0-细胞(鼠骨髓瘤细胞系)、C127-细胞(非致瘤小鼠细胞系)、-细胞(人细胞系,Crucell)、CAP-细胞(CEVEC的羊水细胞生产)和Sp-2/0-细胞(小鼠骨髓瘤细胞)。
术语“稳定化的IGF-1现有技术蛋白的受体特异性”在本申请的情境下还指与现有技术IGF-1变体相比本发明的IGF-1分子诱导胰岛素受体磷酸化能力降低(效力和/或功效降低),这降低引起低血糖(带来治疗性顾虑的不良事件)的风险。
前体:在下文,术语“前体”在本发明的背景下使用时,应当指无信号肽、但分别包含Ea、Eb和Ec肽的成熟人IGF-1蛋白的前体。
发明详述
已经产生并测试了包含与免疫球蛋白Fc区融合的Ea肽分子,其中蛋白质残基G1、P2、E3、R71和S72已经缺失,氨基酸R77已经缺失或由谷氨酰胺替换和R37氨基酸已经由丙氨酸替换(hIGF1-Ea-del1-3,R37A,del71-72,77-fc结构域(SEQIDNO.:6)和hIGF1-Ea-del1-3,R37A,del71-72,R77Q-fc结构域(SEQIDNO.:7))。不可能在哺乳动物细胞系统中表达hIGF1-Ea-del1-3,R37A,del71-72del71-72,77-fc结构域(SEQIDNO.:6)因为聚集和降解问题(超过90%产生的蛋白质降解;参见图10)。
另外,在NIH3T3INSR磷酸化测定法中,与未修饰的成熟IGF-1相比,hIGF1-Ea-del1-3,R37A,del71-72del71-72,77-fc结构域(SEQIDNO.:6)蛋白质显示受体特异性下降(参见图3)。
因此,与人免疫球蛋白Fc区融合的IGF-1前体变体是差的候选药物,原因在于:(i)哺乳动物生产系统中生产率低,和(ii)与未修饰的人野生型IGF-1相比,对胰岛素受体(INSR)的结合亲和力增加,这可以导致低血糖,一种具有治疗顾虑的不良事件。
本发明基于以下令人惊讶的观察结果:天然IGF-1蛋白或稳定化的IGF-1现有技术蛋白(1)在哺乳动物细胞生产系统中的产生率和(2)其受体特异性可以通过引入额外的特异性氨基酸突变予以改善,其中不同的突变解决不同的问题并且可以组合所述突变以解决与产生率、功效和/或受体特异性相关的多种问题。
特别令人惊讶的结果是观察到与未修饰的人野生型IGF-1相比,在位置G42处(G42S替换)突变的人IGF-1蛋白(SEQIDNO.:1)在C2C12肌管和脂肪细胞(3T3-L1)体外系统中诱导较低的葡萄糖摄入,这可能降低体内IGF-1治疗的低血糖风险(图18)。
另一个特别令人惊讶的结果是观察到,在位置G42处突变(缺失或特异性替换)的人IGF-1前体现有技术蛋白显示与未修饰的人野生型IGF-1相似的刺激胰岛素受体(InsR)磷酸化的能力,这减低现有技术IGF-1变体的低血糖风险(图3)。甚至更令人惊讶的是观察到G42S突变对与免疫球蛋白Fc区融合的人IGF-1前体现有技术蛋白在哺乳动物细胞中的产生率具有额外的积极影响(图10/图17),即可以通过引入G42S突变大幅度减少不利影响产生率的聚集物形成(图9/17)。因此,本发明在某种程度上基于以下令人惊讶的研究结果:通过操纵人IGF-1蛋白或其人IGF-1前体变体中的氨基酸甘氨酸42,可能已经克服开发治疗性IGF-1变体时的两大技术障碍。在另一个方面,本发明针对以下问题提供解决方案:与人IgG的免疫球蛋白Fc区融合的现有技术IGF-1前体蛋白不能在哺乳动物细胞中以产业规模产生,因为所述融合蛋白容易遭哺乳动物细胞蛋白酶降解。因此,在另一个方面,本发明基于以下令人惊讶的研究结果:通过操纵IGF-1Ea肽前体变体中的特异性氨基酸,可能已经克服开发治疗性IGF-1前体变体时的额外主要技术障碍。
这类分子的例子包括但不限于以下多肽:
人IGF-1蛋白(SEQIDNo.:1),其中氨基酸G42缺失。
人IGF-1蛋白(SEQIDNo.:1),其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换。
人IGF-1蛋白(SEQIDNo.:1),其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换并且其中氨基酸
(a)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R36被替换或缺失;或
(b)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换;或
(c)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R37被替换或缺失;或
(d)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R37由谷氨酸(E)替换;或
(e)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R37由丙氨酸替换;或
(f)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R37由脯氨酸(P)替换;或
(g)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R36和R37被替换或缺失;或
(h)G1、P2、E3缺失并且氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换;或
(i)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且R37由丙氨酸替换。
人IGF-1蛋白(SEQIDNo.:1),其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换并且其中氨基酸E3缺失并且氨基酸R37由丙氨酸替换。
人IGF-1蛋白(SEQIDNO.:1),其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换并且其中氨基酸E3缺失并且氨基酸R37由丙氨酸替换,所述人IGF-1蛋白融合至免疫球蛋白Fc区、尤其经修饰的Fc区、尤其经修饰以调节其与Fc受体结合的Fc区,如下文描述。
本发明的另一种多肽是SEQIDNO.:117的人IGF-1蛋白。
本发明的另一种多肽是SEQIDNO.:118的人IGF-1前体蛋白。
已经发现,由哺乳动物细胞表达时,上文提到的现有技术IGF-1Ea肽前体蛋白的氨基酸R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105的突变或缺失导致不降解的蛋白质的更高产率。进一步发现所提到在位置R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105处的突变/缺失的组合产生协同效应。因此,在一个实施方案中,在修饰的IGF-1蛋白包含Ea肽(SEQIDNO.:2)的前提下,R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105在本文公开的修饰的IGF-1前体蛋白中缺失或突变。在一个实施方案中,R74、R77和/或R104在本文公开的IGF-1前体蛋白中突变成Q。在又一个实施方案中,K68、S69、A70、R71和/或R72可以在本文公开的修饰的IGF-1前体蛋白中额外地缺失或突变。
因此,本发明提供包含人IGF-1前体蛋白的多肽,即包含来自人IGF-1的Ea肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或由另一种氨基酸替换,并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。该E肽可以是Ea、Eb或Ec肽(SEQIDNOs:2-4)。在一个具体实施方案中,位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或由氨基酸或丝氨酸替换。
在一个实施方案中,如上文所述在位置G42处突变(缺失或突变成丝氨酸)的上述人IGF-1Ea肽前体蛋白包含在氨基酸G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105处的额外缺失和/或突变,其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
这类分子的例子包括但不限于以下多肽:
包含人IGF-1Ea肽前体蛋白的多肽,其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换并且其中氨基酸
(1)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失。
(2)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(3)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失。
(4)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(5)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(6)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(7)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失。
(8)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(9)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(10)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(11)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(12)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和Q104突变成谷氨酰胺(Q)。
(13)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(14)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(15)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(16)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(17)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(18)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(19)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(20)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(21)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺
(22)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(23)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(24)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺
(25)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(26)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(27)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(28)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(29)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(1a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被取代或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(2a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(3a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(4a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(5a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(6a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(7a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(8a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(9a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(10a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(11a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(12a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和Q104突变成谷氨酰胺(Q)。
(13a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(14a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(15a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(16a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(17a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(18a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(19a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(20a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(21a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺
(22a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(23a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S7272缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(24a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺
(25a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(26a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(27a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(28a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(29a)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
在另一个实施方案中,本公开涉及包含多肽(1)-(29a)的上述蛋白质,其中所述分子不在位置1-3处突变,仅氨基酸E3缺失(例如分子(28a)还可能指包含人IGF-1Ea肽前体蛋白的多肽,其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换并且其中氨基酸E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q))。
另外,本公开涉及包含人IGF-1前体蛋白(即包含来自人IGF-1的Ea肽)的多肽,其与免疫球蛋白Fc区融合并且其中位置42处的氨基酸甘氨酸由另一种氨基酸替换并且其中所述蛋白质的IGF-1部分的氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。该E肽可以是Ea、Eb或Ec肽并且在位置42处替换甘氨酸的氨基酸是是丝氨酸。
因此,在一个实施方案中,本公开涉及包含人IGF-1前体蛋白的多肽;(a)其中氨基酸G42缺失或由氨基酸丝氨酸替换;和(b)所述多肽连接至免疫球蛋白Fc区、尤其修饰的Fc区、尤其经修饰以调节其与Fc受体结合的Fc区。例如,一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基替换,从而Fc区对Fc受体或补体的C1组分具有改变的亲和力。本领域已经描述所谓沉默的免疫球蛋白Fc区:LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.第20(6)卷:685-691)和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.181:6664-69;Strohl,W.,上文)。沉默的FcIgG1抗体的例子包含所谓LALA突变体,该突变体在IgG1Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变。沉默的IgG1抗体的另一个例子包含D265A突变。另一个沉默的IgG1抗体包含N297A突变,该突变导致无糖基化/非糖基化的抗体。
上文提到的LALA方案在US5,624,821和US5,648,260二者中由Winter等人更详细地描述。因此在一个实施方案中,公开的hIGF-1前体蛋白与包含L234A和L235A突变或D265A突变或N297A突变的Fc区融合。这类FcLALA、D265A或N297A构建体具有减低的ADCC活性。
在一个实施方案中,含有与免疫球蛋白Fc区融合的人IGF-1Ea肽前体蛋白的多肽,其中位置42处的氨基酸甘氨酸由氨基酸丝氨酸替换,包含在氨基酸G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77和/或R104处的额外缺失和/或突变。
这类分子的例子包括但不限于以下多肽:
含有与免疫球蛋白Fc区融合的人IGF-1Ea肽前体蛋白的多肽,其中位置42处的氨基酸甘氨酸由氨基酸丝氨酸替换,其中所述蛋白质的IGF-1部分的氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5并且其中氨基酸
(1b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失。
(2b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(3b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失。
(4b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(5b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(6b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(7b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失。
(8b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(9b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
(10b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(11b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(12b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和Q104突变成谷氨酰胺(Q)。
(13b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(14b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(15b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(16b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(17b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(18b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(19b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(20b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(21b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(22b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(23b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(24b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(25b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(26b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(27b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(28b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(29b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(1c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(2c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(3c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(4c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(5c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(6c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(7c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(8c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(9c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
(10c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(11c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(12c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36被替换或缺失并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和Q104突变成谷氨酰胺(Q)。
(13c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(14c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(15c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(16c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(17c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(18c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。(19c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(20c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(21c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸(A)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺
(22c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(23c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S7272缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(24c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(25c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
(26c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(27c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
(28c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
(29c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
在另一个实施方案中,本公开涉及包含上述多肽(1b)-(29c)的上述蛋白质,其中所述分子不在位置1-3处突变,仅氨基酸E3缺失(例如分子(28c)还可指包含与免疫球蛋白Fc区融合的人IGF-1Ea肽前体蛋白的多肽,其中氨基酸G42由氨基酸丝氨酸替换并且其中氨基酸E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q))。
在另一个实施方案中,本公开涉及包含突变的E肽的上述多肽(例如多肽1-29c),所述突变E肽由以下氨基酸组成
a)VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG(SEQID.NO.:25),或
b)VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS(SEQID.NO.:26)
c)VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYQM(SEQNO:115)。
在又一个实施方案中,本公开提供与Fc区融合的上述IGF-1前体蛋白,其中Fc区可以与修饰的IGF-1前体多肽直接融合或可以使用本领域熟知的重组DNA技术由铰链区连接。如果使用DNA铰链区,Fc区可以与修饰的IGF-1前体多肽的任何部分连接。在一个实施方案中,Fc区直接融合至修饰的IGF-1前体多肽的C末端。在另一个实施方案中,Fc区通过GlySer(-GS-)接头与修饰的IGF-1前体多肽的C末端连接。
DNA接头可以用来在组件之间提供便利操作的限制性位点。也可以提供接头以增强从宿主细胞表达多肽、减少空间位阻,从而组分可以采取其最佳三级或四级结构和/或与其靶分子适当地相互作用。对于接头和鉴定所需间隔子的方法,参见,例如,George等人,(2003)ProteinEngineering15:871-879。
接头序列可以包含天然与受体组分连接的一个或多个氨基酸,或可以是用来提高融合蛋白表达的附加序列,提供具体需要的目的位点,从而允许组分结构域以形成最佳三级结构和/或增强组分与其靶分子的相互作用。在一个实施方案中,接头包含一个或多个为1-100个氨基酸长、优选地1-25个氨基酸长的肽序列。在一个实施方案中,接头为1-5个氨基酸长。在一个实施方案中,接头是三氨基酸序列;更具体地,该三氨基酸序列为GlyProGly。在另一个实施方案中,接头是GlySer。
这类铰链分子的例子包括但不限于以下多肽:
铰链1:CPPCPA(SEQIDNO.:22)
铰链2:DKTHTCPPCPA(SEQIDNO.:23)
铰链3:EPKSCDKTHTCPPCPA(SEQIDNO.:24)
因此,本公开涉及含有人IGF-1Ea肽前体蛋白的多肽,所述前体蛋白融合至免疫球蛋白Fc区、尤其修饰的Fc区、尤其经修饰、优选地通过如上文所述将氨基酸234和235之一或两者替换成丙氨酸来修饰以调节其与Fc受体结合的Fc区,其中位置42处的氨基酸甘氨酸由丝氨酸替换,其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5并且其中免疫球蛋白Fc区通过铰链区与IGF-1前体蛋白融合。
这类分子的例子包括但不限于以下多肽:
hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_E(SEQIDNO.:8)
hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A(SEQIDNO.:9)
hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_C(SEQIDNO.:10)
hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F(SEQIDNO.:11)
hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_E(SEQIDNO.:12)
hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_A(SEQIDNO.:13)
hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_F(SEQIDNO.:14)
在本公开的一个具体的实施方案中,上述IGF-1前体蛋白的氨基酸R71和S72可以如下突变:
(1)缺失R71和S72之一或两者,和/或
(2)将R71和S72之一或两者突变成非碱性氨基酸,如丙氨酸,和/或
(3)在R71和S72之间插入一个或多个非碱性氨基酸,和/或
(4)在R71和S72附近安置足以掩蔽蛋白酶位点的糖基化位点,和/或
(5)用非天然氨基酸替换R71或S72,或在R71和S72附近或其之间插入非天然氨基酸进行位点定向PEG化。
用于蛋白质修饰的方法如位点定向诱变、引入糖基化位点或位点定向PEG化是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中,修饰Fc区以调节其与Fc受体的结合。在一个实施方案中,修饰Fc区以减少其对Fc受体的亲和力。在一个实施方案中,修饰Fc区以减少ADCC活性。在一个实施方案中,修饰Fc区以阻止ADCC活性。
在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:8(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_E)的多肽。在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:9(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A)的多肽。在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:10(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_C)的多肽。在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:11(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F)的多肽。
在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:12(hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_E)的多肽。
在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:13(hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_A)的多肽。
在一个实施方案中,本发明提供包含SEQIDNO.:14(hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_F)的多肽。
在一个实施方案中,本发明提供由SEQIDNO.:8、9、10、11、12、13或14组成的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供与SEQIDNO:8至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供一种与SEQIDNO:9至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供一种与SEQIDNO:10至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供一种与SEQIDNO:11至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供一种与SEQIDNO:12至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供一种与SEQIDNO:13至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本公开提供一种与SEQIDNO:14至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同的多肽。
在一个实施方案中,本发明的多肽被糖基化。
氨基酸突变
如上文所提及,多个氨基酸可以突变成另一种氨基酸。一般,将氨基酸替换为丙氨酸残基。然而,可以使用其他氨基酸,如来自另一个组的非天然氨基酸或天然氨基酸(即极性、酸性、碱性或非极性氨基酸)。向蛋白质的氨基酸引入突变的方法是本领域技术人员熟知的。参见,例如,Ausubel(编著),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.(1994);T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborlaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))。方法包括,但不限于,通过用诱变引物实施的聚合酶链反应(PCR)扩增编码多肽功能活性变体或其片段的DNA,并如果需要,通过装配PCR法装配片段或使用市售试剂盒如“QuikChangeTM位点定向诱变试剂盒(Stratagene)”引入突变。参见,例如,Ausubel(编著),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.(1994);T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborlaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))。进一步,可以通过商业公司(例如Geneart、LifeTechnology)提供的合成的基因合成服务获得突变的序列。可以由本领域技术人员通过替换不影响多肽功能的氨基酸完成生产多肽的多肽功能活性变体或衍生物。
免疫球蛋白Fc区
在一个实施方案中,Fc区来自IgG、IgM或IgA。在一个实施方案中,Fc区衍生自IgG。IgG的Fc结构域可以选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及每个同种型组内部的任何同种异型。在一个实施方案中,Fc区是人Fc区。
可以通过以下方式改变Fc区:将至少一个氨基酸残基替换为不同氨基酸残基以改变Fc区的效应子功能。例如,一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基替换,从而Fc区对Fc受体或补体的C1组分具有改变的亲和力。这种方法在US5,624,821和US5,648,260二者中由Winter等人更详细地描述。特别地,可以将残基234和235突变。特别地,这些突变可以是突变成丙氨酸。因此在一个实施方案中,本发明的抗体具有在Fc区内氨基酸234和235之一或两者处的突变。在另一个实施方案中,可以将氨基酸234和235之一或两者替换成丙氨酸。其中残基234和235已经替换为丙氨酸的这种Fc变体常称作“LALA”。这类FcLALA构建体具有减低的ADCC活性。在一个实施方案中,GF-1前体蛋白与IgG1LALAFc连接。
连接
如本文在融合至/连接至免疫球蛋白Fc区的公开的蛋白质情境下所用,“融合至”或“连接至”应当意指组合在相同多肽中不天然存在的两种多肽。
免疫球蛋白Fc区可以直接融合至修饰的IGF-1多肽或可以使用本领域熟知的重组DNA技术,通过接头连接。如果使用DNA接头,Fc区可以与修饰的IGF-1多肽的任何部分连接。在一个实施方案中,Fc区直接融合至修饰的IGF-1多肽的C末端。在另一个实施方案中,通过GlySer(-GS-)接头和/或铰链区(SEQIDsNO.:22至24)如hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_E(SEQIDsNO.:8)、hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A(SEQIDsNO.:9)、hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_C(SEQIDsNO.:10)、hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F(SEQIDsNO.:11)、hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_E(SEQIDsNO.:12)、hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_A(SEQIDsNO.:13)或hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_F(SEQIDsNO.:14),将Fc区与修饰的IGF-1多肽的C末端连接。
DNA接头可以用来在组件之间提供便利操作的限制性位点。也可以提供接头以增强从宿主细胞表达多肽、减少空间位阻,从而组分可以采取其最佳三级或四级结构和/或与其靶分子适当地相互作用。对于接头和鉴定所需间隔子的方法,参见,例如,George等人,(2003)ProteinEngineering15:871-879。
接头序列可以包含天然与受体组分连接的一个或多个氨基酸,或可以是用来提高融合蛋白表达的附加序列,提供具体需要的目的位点,从而允许组分结构域以形成最佳三级结构和/或增强组分与其靶分子的相互作用。在一个实施方案中,接头包含一个或多个为1-100个氨基酸长、优选地1-25个氨基酸长的肽序列。在一个实施方案中,接头为1-5个氨基酸长。在一个实施方案中,接头是三氨基酸序列;更具体地,该三氨基酸序列为GlyProGly。在另一个实施方案中,接头是GlySer。
核酸
本发明也提供编码本发明多肽的核酸分子。优选的核酸序列是编码hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_E、hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A、hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_C、hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F、hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_E、hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_A或hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_F的那些(SEQIDNO.:15-21)。
本发明的核酸分子可以处于RNA如mRNA形式,或处于DNA形式,例如包含cDNA或合成的DNA。核酸分子可以是双链或单链的。单链DNA可以是编码链,也称作有义链,或它可以是非编码链,也称作反义链。
遗传密码的简并性是熟知的。因此两个或更多个不同的核酸序列可以编码相同的多肽序列。本申请的范围内包括这类变体核酸序列。实际上,可以优选对核酸序列进行保守修饰以提高本发明多肽的表达。
本发明还提供包含本发明核酸的载体。该载体可以是克隆载体或表达载体。在一个实施方案中,核酸可以包含于表达载体内部,所述表达载体携带本领域技术人员熟知的高效表达需要的元件。元件例如包括启动子(例如巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、分泌信号序列(如已知促进分泌的天然序列或任何其他序列)、多聚腺苷化信号和转录终止子(例如衍生自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体复制和原核生物中复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件,如氨苄青霉素抗性基因和博莱霉素或潮霉素标志物。
在一个实施方案中本发明提供分离的核酸分子,其包含选自如下的核苷酸序列:
a)SEQIDNO.:15中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
b)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:15中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列;
c)SEQIDNO.:16中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
d)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:16中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列;
e)SEQIDNO.:17中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
f)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:17中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列;
g)SEQIDNO.:18中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
h)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:18中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列;
i)SEQIDNO.:19中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
j)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:19中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列;
k)SEQIDNO.:20中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
l)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:20中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列;
m)SEQIDNO.:21中所述的多核苷酸序列或其互补序列;
n)多核苷酸序列,其包含与SEQIDNO.:21中所示的整个序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
在另一个实施方案中,本公开涉及上述的IGF-1变体多肽,其中所述人IGF-1前体蛋白是聚乙二醇化的。对于不与人IgG的免疫球蛋白Fc区融合的IGF-1前体蛋白,PEG化是特别优选的。已经证明与聚(乙二醇)(PEG;PEG化)的缀合在延长治疗性蛋白质药物的半寿期方面有益。预期本发明IGF前体多肽的PEG化可以产生相似的药用优点。IGF-1PEG化的方法是本领域熟知的。参见,例如,美国专利申请公开2006/0154865,所述文献描述了赖氨酸-单PEG化的IGF-1的有益特性。这种赖氨酸-单PEG化可以适用于本发明的前体IGF多肽。此外,可以通过引入非天然的氨基酸,在本发明多肽的任何部分实现PEG化。可以通过Deiters等人,JAmChemSoc125:11782-11783,2003;Wang和Schultz,Science301:964-967,2003;Wang等人,Science292:498-500,2001;Zhang等人,Science303:371-373,2004或在美国专利号7,083,970中描述的技术引入某些非天然氨基酸。简而言之,这些表达系统中的某些系统包括位点定向诱变以将无义密码子如琥珀TAG引入编码本发明多肽的开放阅读框中。随后将此类表达载体引入宿主中,其中所述宿主可以利用对所引入的无义密码子特异并且装载有所选择的非天然氨基酸的tRNA。对缀合多个部分至本发明多肽的目的有益的特别的非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮基侧链的那些非天然氨基酸。含有这些新氨基酸的IGF前体多肽随后可以在该蛋白质中的所选位点处PEG化。此外,无E肽的这类聚乙二醇化的IGF分子还可用作治疗药。
在哺乳动物细胞中产生本发明的IGF-1变体
在原核表达系统中产生天然人IGF-1是本领域技术人员熟知的。有时优选在真核细胞中、尤其哺乳动物宿主细胞中表达,因为这类哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配并分泌正确折叠和有免疫活性的蛋白质。
用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括Urlaub和Chasin,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220描述的dhfr-CHO细胞,该细胞随DHFR可选择标记一起使用,例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中所述)、HEK293细胞(人胚肾293细胞)、NSO鼠骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。优选的宿主细胞是CHOK1衍生细胞。但是,重组IGF-1在CHO细胞系中的表达导致细胞生长抑制和低滴度(参见图11/12)。使用“锌指核酸酶”技术稳定敲低/敲除CHO细胞中的IGF-1-R导致改善的细胞生长和更高的IGF-1蛋白滴度(图14、图15、图16)。与稳定转染的野生型CHO细胞相比,用编码IGF-1的质粒稳定转染的IGF-1-R表达减少(si/shRNA敲低)的CHO细胞产生约5倍更高的汇总滴度。可以在稳定转染IGF-1-R敲除细胞系后测量到甚至更高的汇总滴度。与野生型CHO细胞系相比,可以检测到重组IGF-1的滴度增加5-20倍。总之,这些数据显示敲低或敲除哺乳动物细胞系中的IGF-1受体基因可以显著地改善IGF-1及其变体的产生。
因此,在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中产生重组IGF-1或其变体的合适方法,其中所述哺乳动物细胞在表达有功能的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)方面存在缺陷,包括以下步骤:
a.产生在表达胰岛素样生长因子1受体方面存在缺陷的哺乳动物细胞;
b.用包含编码IGF-1或其变体的核酸分子的表达载体转化步骤a.的细胞;
c.选择正在被转化的步骤b.的细胞;
d.在允许IGF-1或其变体表达的条件下培育步骤c.中选择的细胞;和
e.从步骤d.中所培育的哺乳动物细胞收获IGF-1或其变体,
其中可选地,步骤a.和b.的顺序可以逆转或两个步骤可以在相同的时间进行。
技术人员知道如何转化、选择和培育基因修饰的哺乳动物细胞,例如CHO细胞,如CHO-K1衍生细胞、CHO-DUXB11衍生细胞或CHO-DG44细胞。选择方案常规地用来促进选择可能已经整合编码所需治疗性蛋白(如生长因子,例如IGF-1)的重组DNA的细胞。常规地使用由在转化载体上共整合的基因赋予的抗生素抗性或在营养性选择培养基中生长的能力(参见Weber,W.和Fussenegger,M.(2003)Induciblegeneexpressioninmammaliancells,inGenetransferandexpressioninmammaliancells,(Makrides,S.C.编著),Elsevier:Amsterdam,第589-604页)(Efficientselectionforhigh-expressiontransfectantswithanoveleukaryoticvector:NiwaHitoshi,YamamuraKen-ichi,MiyazakiJun-ichi)。用于重组蛋白生产的两种最常见CHO表达系统利用基于二氢叶酸还原酶(DHFR)的甲氨蝶呤(MTX)选择或基于谷氨酰胺合成酶(GS)的甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)选择(RitaCostaA,ElisaRodriguesM,HenriquesM,AzeredoJ,OliveiraR.EurJPharmBiopharm.2010Feb;74(2):127-38.Epub2009Oct22.Guidelinestocellengineeringformonoclonalantibodyproduction)。
特别适合产生多肽在哺乳动物细胞、尤其啮齿类细胞如CHO和DHFR基因缺陷型CHO细胞中的载体已经在专利申请WO09080720A中公开。存在现有技术中已知的将表达载体引入哺乳动物宿主细胞中的几种适宜方法。相应的方法包括但不限于磷酸钙转染法、电穿孔法、脂质体转染、生物射弹介导和聚合物介导的基因转移。上文描述了合适的宿主细胞。将表达载体核酸引入宿主细胞后,将获得的转化体在适于验定表达盒中包含的哺乳动物可选择标记基因(MSM)表达的选择性条件下培养。这意味例如当哺乳动物可选择标记基因是抗生素抗性基因时,将转化体在含有哺乳动物细胞里有活性的相应抗生素的培养基中培养并且选择在这类条件下活下来的转化体,因此使得能够获得表达标记基因并且因此并入载体的转化体。另外,可以通过在适于选择表达盒中所含的可扩增选择标记基因(MASM)的选择培养基中培养转化体,实施第二选择步骤。例如,在使用DHFR作为可扩增、可选择标记基因的情况下,可以在DHFR抑制剂存在下在无核苷酸或无嘌呤培养基中培养转化体。在至少一个表达盒中使用诱导型启动子的情况下,应当提供相应的诱导信号以启动多肽的表达。为了利用DHFR选择/扩增系统,可以在DHFR抑制剂存在下培养所述宿主细胞。合适的DHFR抑制剂是抗叶酸剂类如例如MTX。所用的抗叶酸剂/MTX浓度取决于宿主细胞和并入载体中的DHFR变体。可以对DHFR"宿主细胞中多步骤扩增程序选择浓度范围,例如在约5nM-20nM的值,范围到500nM至1000nM的值或甚至更高值,对于第二或进一步扩增步骤。对于DHFR+细胞,起始浓度通常较高,在100nM至750nM范围内,优选地在第一步骤中是500nM并且对于其他扩增步骤,是500nM至1000nM及以上。上文描述合适的DHFR变体。
为了利用GS选择/扩增系统,可以在例如MSX存在下培养所述宿主细胞。所用的MSX浓度取决于宿主细胞。可以选择浓度范围在约15至150微摩尔、20至100微摩尔和25至50微摩尔之间。这些范围特别合用于NSO细胞和CHO细胞。
药物组合物
在另一个方面,本发明提供组合物,例如,药物组合物,所述组合物含有与可药用载体一起配制的一种上述IGF-1变体或组合。本发明的药物组合物也可以在联合疗法中施用,即,与其他活性剂组合。例如,本发明的IGF-1变体可以与至少一种肌肉质量/力量增进剂组合例如抗-ActRIIB抗体、IGF-2或变体sIGF-2、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素前肽、结合ActRIIB但不激活它的肌肉生长抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、胃饥饿素激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或卵泡抑素。下文在关于本发明IGF-1变体用途的部分中更详细地描述可以在联合疗法中使用的治疗药的例子。
术语“可药用的”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者列于美国药典或其他普遍认可的药典中,用于动物并且更具体适用于人类中。术语“载体”指与治疗药一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体。这类药用载体可以是无菌液体,如水和油,包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些油,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要,组合物也可以含有微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、持续释放制剂等形式。用传统粘合剂和载体如甘油三酯,可以将组合物配制为栓剂。口服制剂可以包含标准载体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药用载体的例子在E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述。
在优选实施方案中,将组合物根据常规方法配制为适应于静脉内施用至人类的药物组合物。如果需要,组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉药,如利多卡因,以便减轻注射部位处的疼痛。在组合物待通过输注施用的情况下,可以将它用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分散。在组合物通过输注射施用的情况下,可以提供含有无菌注射用水或盐水的安瓿,从而成分可以在施用之前混合。
“可药用载体”包括生理上相容性的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应当适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如,通过注射或输注)。取决于施用途径,可以将活性化合物即抗体、免疫缀合物或双特异性分子包覆在材料中以保护该化合物免遭可能使这种化合物失活的酸和其他天然条件作用。
本发明的药物组合物也可以包括可药用的抗氧化剂。可药用抗氧化剂的例子包括:水溶性抗氧化剂,如抗坏血酸、次氯酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等;油溶性抗氧化剂,如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和金属螯合剂,如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以在本发明的药物组合物中使用的合适水质和非水质载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如,甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持要求的粒径和通过使用表面活性剂,维持适宜的流动性。
这些组合物也可以含有佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒方法和通过纳入多种抗菌剂和抗真菌剂例如,尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止存在微生物。还可能想要将等渗剂如糖、氯化钠等纳入所述组合物。此外,可注射药物形式的延长吸收可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶引起。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和活性剂的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况下之外,构思了所述介质或试剂在本发明药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。
治疗性组合物一般必须是无菌和在制造和储存条件下稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散介质,及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒径和通过使用表面活性剂,维持适宜的流动性。在许多情况下,可以在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可注射组合物的延长的吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的活性剂例如单硬脂酸盐和明胶而引起。
可以通过将活性化合物以要求的量连同上文所列举的一种药物或药物组合在合适的溶剂中并入,根据需要,随后无菌微量过滤,制备无菌可注射溶液剂。通常,通过将所述活性化合物并入无菌载体中来制备分散剂,所述无菌载体含有基础分散介质和所要求的来自上文所列举那些中的其他活性剂。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末情况下,制备方法是真空干燥法和冷冻干燥(冻干)法,所述方法产生有活性的活性剂的粉末,以及来自其先前无菌过滤的溶液中的任何额外的想要的活性剂。
可以与载体材料组合以产生单次剂型的有活性的活性剂的量将根据正在治疗的对象和具体施用模式变动。可以与载体材料组合以产生单次剂型的有活性的活性剂的量通常将是组合物的产生治疗效果的量。总体上,以100%计,这个量将是与可药用载体组合时约0.01%至约99%的有活性的活性剂,约0.1%至约70%、或约1%至约30%的有活性的活性剂。
调整剂量方案以提供想要的最佳反应(例如,治疗反应)。例如,可以施用单次大丸剂,可以随时间施用几个分开的剂量,或可以如治疗情况的危急性所示,按比例减少或增加该剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗对象的单位剂量的物理分散的单元;每个单元含有预定量的活性化合物,所述的预定量经计算与所要求的药用载体结合时产生所需的治疗效果。用于本发明剂量单位形式的说明由活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果决定并且完全取决于此,并且限制作用是这种活性化合物用于治疗个体中敏感性的领域内固有的。
在施用本公开的IGF-1变体或包含所述IGF-1变体的组合物的情境下,多肽的治疗有效量范围从约0.001至100mg/kg、或0.01至30mg/kg并更通常地是0.1至10mg/kg宿主体重。例如,剂量可以是约0.1mg/kg体重,可以是约0.2mg/kg体重,可以是约0.3mg/kg体重,可以是约1mg/kg体重,可以是约3mg/kg体重,可以是约5mg/kg体重或约10mg/kg体重。技术人员知道确定将根据施用途径(例如静脉内或皮下)变动的合适有效剂量。示例性治疗方案进行每日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用。这种施用可以按静脉内或皮下方式实施。本发明IGF-1变体的剂量方案包括静脉内施用0.1mg/kg体重或0.2mg/kg体重或0.3mg/kg体重或0.5mg/kg体重或1mg/kg体重或3mg/kg体重或10mg/kg体重。备选地,该组合物可以是持续释放制剂,在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半寿期变动。施用的剂量和频率可以根据治疗是否为预防性或治疗性而变动。在预防性应用中,相对低的剂量以相对地不频繁的间隔期在长的时间范围内施用。一些患者继续接受治疗持续其余生。在治疗性应用中,有时需要在相对短的间隔期的相对高的剂量直至疾病的进展减低或终止或直至患者显示出部分或完全的疾病症状改善。此后,患者可以按预防性方案施用。
可以变动有活性的活性剂在本发明药物组合物中的实际剂量水平,从而以获得有活性的活性剂的量,其中对于特定患者、组合物和施用模式,所述的量有效实现想要的治疗反应,而对患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素,包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域熟知的因素。
施用本发明组合物中所包含的治疗有效剂量的IGF-1变体可以导致疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加或防止因疾病侵袭所致的损伤或无能,即肌肉质量和/或功能增长或烧伤患者中伤口面积缩减/减少。
患者将接受多肽活性成分的有效量,即足以检测、治疗、改善或防止所讨论疾病或病症的量。治疗作用还可以包含身体症状减少。治疗性蛋白对于任何特定对象的最佳有效量和浓度将取决于多种因素,包括患者的年龄、体格、健康和/或性别、疾病的性质和程度、特定治疗性蛋白的活性、身体清除该蛋白的速率并且还取决于与治疗性蛋白联合施用的任何可能其他治疗药。针对给定情形递送的有效量可以通过例行实验确定并且处于临床医生的判断范围内。剂量可以通过单剂量方案或多剂量方案给予。
本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种,通过一种或多种施用途径施用。如技术人员将理解,施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变动。本发明治疗性蛋白的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径,例如通过注射或输注。如本文所用,短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式,通常通过注射施用,并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中,静脉内施用包含抗体的组合物。在另一个实施方案中,皮下施用抗体。
备选地,包含IGF-1变体的本发明组合物可以通过非肠胃外途径,如局部、表皮或粘膜施用途径,例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。
活性化合物可以连同将保护该化合物免于快速释放的载体一起制备,所述载体如控释制剂,包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物,如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的多种方法是专利授权的或总体上是本领域技术人员已知的。参见,例如,SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,编著,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。
可以用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。例如,在一个实施方案中,本发明的治疗性组合物可以用无针头皮下注射装置如美国专利号5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824或4,596,556中所示的装置施用。可用于本发明中的熟知植入物和模块的例子包括:美国专利号4,487,603,其显示用于以受控速率分散药物的可植入式微量输注泵;美国专利号4,486,194,其显示用于经皮肤施用药物的治疗装置;美国专利号4,447,233,其显示用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵;美国专利号4,447,224,其显示用于连续递送药物的可变流量的可植入式输注装置;美国专利号4,439,196,其显示具有多腔区室的渗透性药物递送系统;和美国专利号4,475,196,其显示渗透性药物递送系统。许多其他的此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的并且包括MicroCHIPSTM(Bedford,MA)制造的那些。
在某些实施方案中,可以配制包含人IGF-1变体的本发明的组合物以确保在体内的正确分布。例如,血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要);可以将它们例如在脂质体中配制。对于制造脂质体的方法,参见例如,美国专利4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分,因而增强靶向的药物递送(参见,例如V.V.Ranade,1989J.ClinPharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见,例如美国专利5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等人,1988Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman等人,1995FEBSLett.357:140;M.Owais等人,1995Antimicrob.AgentsChernother.39:180);表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人,1995Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier等人,1994J.Biol.Chem.269:9090);还参见K.Keinanen;M.L.Laukkanen,1994FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler,1994Imrnunomethods4:273。
目标疾病和病症
本发明提供用于治疗的本发明多肽、核酸或药物组合物。本发明还提供用于治疗病理学病症的本发明多肽、核酸或药物组合物。本发明还提供本发明多肽、核酸或药物组合物在制造用于治疗病理学病症的药物中的用途。本发明还提供一种治疗患有病理学病症的患者的方法,包括向所述患者施用治疗有效量的本发明多肽、核酸或药物组合物。
病理学病症可以是肌肉骨骼疾病或病症,如肌肉萎缩。存在许多肌肉萎缩病因、包括因采用糖皮质激素类如皮质醇、地塞米松、倍他米松、泼尼松、甲泼尼龙或泼尼松龙(prednisolone)治疗所致。肌肉萎缩也可以是因神经创伤所致的去神经化的结果或是退行性、代谢性或炎性神经病(例如,Guillian-Barré综合征、周围神经病或暴露于环境毒素或药物)的结果。
此外,肌肉萎缩可以是以下肌病的结果,如肌强直;先天性肌病,包括nemalene肌病、多空/微空肌病和肌管性(中央核性)肌病;线粒体肌病;家族性周期性麻痹;炎性肌病;代谢性肌病,如由糖原或脂质贮积病引起;皮肌炎;多发性肌炎;包涵体肌炎;骨化性肌炎;横纹肌溶解和肌红蛋白尿。
在本公开的另一个实施方案中,本发明的药物组合物可以用于治疗肯尼迪病或慢性肾脏疾病。
肌病可以由引起肌营养不良综合征如Duchenne肌营养不良、Becker肌营养不良、强直性肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良、眼咽型肌营养不良、肩胛肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、Fukuyama肌营养不良(一种先天性肌营养不良)或遗传性远端肌病。肌肉骨骼疾病也可以是骨质疏松症、骨折、身材矮小症或侏儒症。
此外,肌肉萎缩可以是如下情况的结果:成年运动神经元疾病如肌萎缩侧索硬化;婴儿脊髓性肌萎缩、幼年期脊髓性肌萎缩、自身免疫运动神经病伴多灶性传导阻滞、因卒中或脊锥损伤所致的瘫痪、因创伤所致的骨骼固定、卧床休息延长、自主性不活动、非自主性不活动、代谢性应激或营养不足、癌症、艾滋病、禁食、甲状腺或肾上腺或脑垂体病、糖尿病、良性先天性张力减退、中央轴空病、肝病(例子如纤维化、肝硬化)、败血症、肾衰竭、充血性心力衰竭、衰老、空间旅行或零重力环境下度过的时间。
在特别的实施方案中,本发明的药物组合物可以用于治疗患有去脂体重损失和/或肌肉萎缩的烧伤(包括成人和儿科烧伤)患者。
可治疗的年龄相关疾病的例子包括少肌症、皮肤萎缩、肌肉萎缩、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松症、骨关节炎、免疫无能、高血压、痴呆、亨廷顿病、阿尔茨海默病、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、卒中、预期寿命削减、衰弱、记忆丧失、皱纹、受损肾功能和年龄相关的听力损失;代谢病症,包括II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖症。
在特别的实施方案中,本发明的药物组合物可以用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)患者。
在本公开的另一个实施方案中,本发明的药物组合物可以用于治疗肌肉萎缩。在特别的具体实施方案中,本公开涉及本发明药物组合物治疗肌肉萎缩的用途,其中萎缩选自肥胖相关的少肌症、少肌症和糖尿病相关的肌肉萎缩。
可以治疗的其他疾病包括急性和/或慢性肾疾病或衰竭、肝纤维化或肝硬化、癌症如胰腺癌,胃肠道癌(包括食管癌、胃癌和结肠癌)、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤或乳腺癌;帕金森病;与神经元死亡相关的疾病如ALS(肌萎缩侧索硬化),脑萎缩,或痴呆和贫血;慢性感染如结核病,无论由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或由非典型分枝杆菌引起;慢性真菌性感染;和免疫抑制背景下机会性感染,是否是医源性机会感染或归因于艾滋病的机会性感染。
其他疾病包括恶病质、与类风湿性关节炎相关的恶病质和与癌症相关的恶病质。
在另一个实施方案中,本公开涉及治疗肌肉疾病的方法,所述方法包括施用治疗有效量(如上文所述)的本发明多肽。用所公开的多肽或包含它们的组合物治疗以增加肌肉质量的需要可以源于上文提到的疾病之一,尤其因肌肉骨骼疾病或病症如肌肉萎缩,其中肌肉疾病是选自肥胖相关的少肌症、少肌症和糖尿病相关的肌肉萎缩的肌肉萎缩。
另外,本公开涉及治疗烧伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、年龄相关性疾病如少肌症、肯尼迪病或慢性肾脏疾病的方法,所述方法包含向患者施用治疗有效量(如上文所述)的本发明多肽。
在另一个实施方案中,本公开涉及用于增加肌肉质量的方法。在特别的实施方案中,本公开涉及用于增加有需要的患者中肌肉质量的方法。增加肌肉质量的需要可以源于上文提到的疾病之一,尤其因肌肉骨骼疾病或病症如肌肉萎缩。增加肌肉质量的需要还可以源于烧伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、年龄相关性疾病如少肌症、肯尼迪病或慢性肾脏疾病。
患者给药
本发明的药物组合物可以施用至患者。施用一般将借助注射器进行。因此本发明提供包含本发明药物组合物的递送装置(例如注射器)。
多种递送系统是已知的并且可以用来施用本发明的多肽,例如,脂质体中囊化、微粒子、微胶囊、能够表达蛋白质的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见,例如,Wu和Wu,JBiolChem262:4429-4432,1987)、构建作为逆转录病毒之部分的核酸、腺联病毒、腺病毒、痘病毒(例如,禽痘病毒、尤其鸡痘病毒)或其他载体等。引入方法可以是肠内或肠胃外方法并且包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、肺、鼻内、眼球内、硬膜外和口服途径。这些肽可以通过任何便利的途径,例如通过输注或团注、通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如,口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收来施用,并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部性的。此外,可能想要通过任何合适途径,包括室内和鞘内注射,将本发明的药物组合物引入中枢神经系统中;可以通过室内导管,例如,与储器如Ommaya储器连接,协助室内注射。在具体实施方案中,可能想要局部地施用本发明的药物组合物至需要治疗的区域;这可以通过例如且不限于以下方式实现:手术期间局部输注、局部施用,例如通过注射、借助导管或借助植入物,所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料,包括膜和基质,如sialastic膜、纤维或商业皮肤代用品。
在另一个实施方案中,可以将药物组合物在小泡、尤其脂质体中递送(参见Langer,Science249:1527-1533,1990)。在又一个实施方案中,可以将有活性的活性剂在受控释放系统中递送。在一个实施方案中,可以使用泵。
患者组
可以从所提出的治疗获益的患者包括从需要重症监护或延长住院(超过1周)的急性或危重疾病恢复的患者;衰弱的老年少肌症患者;从严重创伤如机动车事故、严重烧伤、战争损伤和其他创伤性损伤恢复的青少年;具有如上文所列的已知造成恶病质的慢性疾病的患者;和患有如上文所列的肌肉疾病的患者。由于肌肉丧失是严重或延长的大多数疾病的共同并发症,所以预计肌肉萎缩的逆转将加速经历肌肉丧失的患者恢复和功能返回,无论这种丧失的根本原因是什么。
联合疗法
这种治疗可以与针对肌肉萎缩过程主要原因的任何治疗组合。这类组合可以包含皮质类固醇、免疫阻抑性剂、抗细胞因子剂、抗癌药物;生长因子如促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF或用于治疗糖尿病的其他药物(包括胰岛素和口服降血糖药)、抗结核病药物和抗生素类。组合可以包括小分子药和生物分子药。
本发明的药物组合物可以作为唯一的有活性的活性剂施用或例如作为佐剂与其他药物例如ActRIIB抗体、ActRIIA抗体、可溶性ActRIIB诱饵模拟物、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素前肽、结合但不激活ActRIIB的肌肉生长抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、胃饥饿素激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或卵泡抑素一起施用或与其组合施用。例如,本发明的药物可以与如WO2010125003中公开的ActRIIB抗体组合使用。
序列
用于实施本发明的模式
应当理解仅已经通过举例方式描述本发明并且可以在保持在本发明范围和精神内的情况下作出修改。
实施例
本文中公开的重组IGF-1变体具有野生型蛋白样受体亲和力(图1),但是显示比野生型IGF-1(图7)更好的药代动力学体内谱并且可以用来以更少给药频率防止肌肉萎缩(图8)。与刺激胰岛素受体(InsR)磷酸化导致低血糖风险的某些现有技术IGF-1变体相反,在位置G42处突变(缺失或特异性替换)的本公开IGF-1前体蛋白显示刺激胰岛素受体(InsR)磷酸化的野生型样能力,其削弱所述低血糖风险(图5/图6/图19)。另外,与野生型hIGF-1或其某些现有技术变体相反,本文公开的IGF-1变体可以以高滴度生产并在哺乳动物细胞体系中不降解,允许工业规模生产。
部分A:一般方法
A1试剂
重组人IGF-1来自NovartisAG并且重组人胰岛素购自Promocell(#C-60212)。
A2载体构建
根据本发明的教导,几种载体装配物是可行的。由于载体的各个元件是现有技术中已知的,所以可以例如通过测序或扩增并以所需的方向适宜克隆基本遗传元件和表达盒,装配出合适的载体。相应的克隆方法是现有技术状态,并且现有技术中也描述了上文所述的遗传元件的序列。随后,通过举例方式描述载体构建体的产生。然而,本领域技术人员理解,获得相应载体的几个其他实施方案和方式是合适和轻易可获得的。这个章节中描述的全部哺乳动物表达载体(例如pBW679)基于WO2009080720中描述的哺乳动物表达载体。WO2009080720的实施例部分、尤其图1、表1和实施例部分II:载体构建(第21-31页)通过引用方式并入本文。
在TheBlueHeronBiotech订购从头合成hIGF1-Ea-delGPE-R37A)(SEQIDNO.:87),侧翼为5’Kozak(CCCGCCCGCCCACC)(SEQIDNO.:112),并且在BlueHeronpUC载体中输送5’HindIII/BamHI和3’EcoRI限制性位点。通过与相容性5’BamHI和3’EcoRI克隆位点的连接反应,完成向pcDNA3.1载体(InvitrogenLifeTechnologies)中的再克隆。使用T7和BGHA特异性引物,充分控制构建体序列。随后使用先前的构建体hIGF1-Ea-delGPE-R37A/pCDNA3.1,进行位点定向诱变(QuickChangeII位点定向诱变试剂盒,Stratagene)以移除两个残基R71和S72。使用所产生的构建体hIGF1-Ea-delGPE-R37A-delRS将hIGF1-Ea(delGPE,R37A,delRS)再克隆到哺乳动物表达载体pRS5a(Novartis专利载体,NPL000961)中。PRS5a是处于CMV启动子、BGH基因(牛生长激素)多聚腺苷化位点和氨苄青霉素抗性下的哺乳动物表达载体。将hIGF1-Ea(delGPE,R37A,delRS)/pRS5a作为NPL009759(Novartis专利载体)归档。
hIGF1-Ea(delGPE,R37A,delRS)扩增自NPL009759。PCR产物由5’HindIII/3’BamHI消化并克隆至pRS5a-hIgG1LALA载体(NPL012935,Novartis专利载体)中。如上文所述进行几轮位点定向诱变以递送质粒至hIGF1-Ea(delGPE,R37A,delRS)-[R74Q-R78Q-R104Q](NPL017580,Novartis专利载体)。使用这个质粒作为下文描述的进一步克隆的基础。
hIGF1-Ea-hFc_mut2的质粒:使用诱变寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNO.:88)和(5’TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGATGCTTGTCTGAGGCGCCGCCC3’)(SEQIDNO.:89),从NPL017580扩增含有G42S突变的PCR片段。BlpI和BspEI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段克隆回NPL017580中。
hIGF1-Ea-hFc_mut3的质粒:使用诱变寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNO.:90)和(5’TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGATGGGTGTCTGAGGCGCCGCCC3’)(SEQIDNO.:91),从NPL017580扩增含有G42P突变的PCR片段。BlpI和BspEI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段克隆回NPL017580中。
hIGF1-Ea-hFc_mut4的质粒:使用诱变寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNO.:92)和(5’TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGATGCCTGTCTGAGGCGCMNNCCGACTGCTGGAGCCATACCCTGTGG)(SEQIDNO.:93),从NPL017580扩增含有A37E突变的PCR片段。变偶密码子按IUPAC命名法给出,其中M代表碱基A或C并且N代表碱基A、C、G或T。后一种寡聚物将携带位置37的变偶密码子。BlpI和BspEI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段克隆回NPL017580中。通过测序选出A37E替换。
hIGF1-Ea-hFc_mut12的质粒:使用诱变寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNO.:94)和(5’TGTCTGAGGCGCCCGCGCACTGCTGGAGCCATACCCTGTGGGC3’)(SEQIDNO.:95),从NPL017580扩增含有R36A-A37R突变的PCR片段。BlpI和SfoI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段克隆回NPL017580中。
hIGF1-Ea-hFc_mut13的质粒:使用诱变寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNO.:96)和(5’TGTCTGAGGCGCCGCCTGACTGCTGGAGCCATACCCTGTGG3’)(SEQIDNO.:97),从NPL017580(Novartis专利载体)扩增含有R36Q突变的PCR片段;BlpI和SfoI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段的克隆回NPL017580中。
进一步修饰变体hIGF1-Ea-hFcmut4和mut13以引入不同的接头(即SEQIDNO:17和23):在GeneArt订购跨越BspEI核酸内切酶限制性位点(对应于IGF1残基F49-R50)至AleI(Fc部分中)的接头序列。通过标准切割和粘贴,克隆接头以获得hIGF1-Ea-hFc_mut4_E、hIGF1-Ea-hFc_mut13_E和hIGF1-Ea-hFc_mut13_A的质粒。在下一个步骤中,引入突变G42S。
hIGF1-Ea-hFc_mut4/2_E和hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_E的质粒:使用寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNo.:88)和(5’CGGTACGTGCTGGCGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTG3’)(SEQIDNo.:98),从hIGF1-Ea-hFc_mut2的质粒扩增含有G42S突变的PCR片段。BspEI和SfoI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段克隆到hIGF1-Ea-hFc_mut4_E和hIGF1-Ea-hFc_mut13_E的质粒中。
hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A的质粒:使用寡聚物(5’TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC3’)(SEQIDNo.:88)和(5’CGGTACGTGCTGGCGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTG3’)(SEQIDNo.:98),从hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_E的质粒扩增含有G42S-R36Q突变的PCR片段。BspEI和SfoI核酸内切酶限制性位点用于将生成的PCR片段克隆到hIGF1-Ea-hFc_mut13_A的质粒中。
A3重组蛋白生产
小规模生产:
两个不同转染方法即基于FuGene和基于聚乙烯亚胺(PEI)的方法,用来产生IGF1-Fc变体。
将100mlHEK293F培养物用(PEI)如下转染:100μg在水中的质粒DNA在室温稀释于7mlFreeStyle表达培养基(GIBCO,目录号12338026)中持续10分钟。300μgPEI(来自1mg/mlPEI储液)在室温稀释于7mlFreeStyle表达培养基中持续10分钟。随后将DNA溶液和PEI溶液混合在一起并孵育15分钟,此后以约1.4x106个细胞/ml密度添加至在500ml摇瓶中的36mlHEK293F细胞培养物。该培养物在设定于100转/分钟、6%CO2和37℃的Kuehner-ShakerISF1-X(Kuehner)中孵育6日。随后使用HiTrapMabSelectSure1ml柱(GEHealthcare)在AKTAAvant(GEHealthcare)上,通过蛋白A层析从澄清的细胞培养上清液纯化IGF1-Fc变体。用PBS基线洗涤后,将结合的材料用50mM柠檬酸盐,pH3.0,150mMNaCl洗脱并立即中和。
将100mlHEK293F培养物用FuGENEHD转染试剂(Roche)如下转染:100μg在水中的质粒DNA稀释于保持在室温的1mlFreeStyle表达培养基(GIBCO,目录号12338026)中。添加400μlFuGENE至稀释的DNA,并且将混合物在室温孵育15分钟。随后添加1.4mlDNA-FuGENE混合物至具有细胞密度约0.5x106个细胞/ml的500ml烧瓶中的98.6mLHEK293F(Invitrogen)细胞培养物中。该培养物在设定于100转/分钟、6%CO2和37℃的Kuehner-ShakerISF1-X(Kuehner)中孵育7日。随后使用HiTrapMabSelectSure1ml柱(GEHealthcare)在AKTAAvant(GEHealthcare)上,通过蛋白A层析从澄清的细胞培养上清液纯化IGF1-Fc变体。用PBS基线洗涤后,将结合的材料用50mM柠檬酸盐,pH3.0,150mMNaCl洗脱并立即中和。
中等规模生产:
将9.5LHEK293培养物用聚乙烯亚胺(PEI)如下转染:将10mg在TE缓冲液中的质粒DNA在250mL室温OptiMEM1培养基[Gibco目录号#11058-021]中孵育5分钟。将20mg聚乙烯亚胺PEI(来自1mg/mLPEI储液)添加至250mL室温OptiMEM1培养基(Gibco目录号#11058-021)。随后将DNA溶液和PEI溶液混合在一起并孵育15分钟。随后将500mLDNA-PEI混合物添加至密度0.75x106个细胞/ml和1.25x106个细胞/ml之间的9.5LHEK培养物。将转染的细胞在37℃接种于20LWAVECellbag(GEHealthcare,#CB0020L10-03)中。将Cellbag置于设定在25转/分钟、7°摇摆角、7%CO2、0.50lpm空气和37℃的WaveSystem20/50EHT上。通过蛋白A层析从浓缩的培养上清液捕获Fc融合构建体。用PBS基线洗涤后,将结合的材料用50mM柠檬酸盐,pH2.7,140mMNaCl洗脱并立即中和。随后通过超滤法浓缩中和的级分并且在PBS中在Superdex200上分大小以移除某些污染性聚集物。材料纯度>95%,如通过SDS-PAGE分析和LC-MS分析二者判定。
A4通过SEC-MALS评估聚集水平
通过与多角度光散射探测器(SEC-MALS)偶联的大小排阻层析对蛋白A纯化的IGF-1-Fc变体检验聚集水平。在连接至三角度光散射探测器(miniDAWNTreos,WyattTechnology,SantaBarbara,CA,USA)的Agilent1200HPLC系统(AgilentTechnologies)上进行测量。使用比折射率增量(dn/dc)值0.186ml/g,用差示折射计(OptilabrEX,WyattTechnology)在线跟踪样品的浓度。将样品体积50μl注射在Superdex20010/300GL柱(GEHealthcare)上。记录数据并且使用ASTRAV软件(WyattTechnology)处理。为了确定MALS探测器的探测器延迟体积和归一化系数,使用BSA样品(Sigma,A8531)作为参考。不使用削峰或谱带加宽校正。
A5细胞培养物
人骨骼肌(skMC)细胞从Cambrex(#CC-2561)获得。在生长培养基[含有20%胎牛血清(FBS,#2-01F40-1,Amimed)和0.1%庆大霉素的SkGM]中培养人原代成肌细胞。在4-5日(在37℃,5%CO2和95%湿度)后,将细胞在生长培养基中以密度150,000个细胞/孔接种并且培育(在37℃,5%CO2和95%湿度)。在接种后第3日,skMC成肌细胞用于信号传导实验。在含有10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的D-MEM中维持NIH3T3-IGF-1R和NIH3T3-InsR。原代食蟹猴成肌细胞从食蟹猴的腓肠肌分离。在含有20%胎牛血清(FBS,#2-01F40-1,Amimed)和0.1%庆大霉素(LifeTechnologies,#15750-037)的SkBM中培养细胞。3T3-L1脂肪细胞和C2C12细胞从美国类型培养物保藏中心(分别是ATCC-CL-173和ATCC;#91031101)获得。在DMEM、高葡萄糖,1.5g/升NaHCO3(ATTC#30-2002)中维持3T3-L1脂肪细胞并且通过添加含有10%FCS、1%青霉素/链霉素、0.5mMIBMX、1μM地塞米松的DMEM,启动分化。在接种后第3日使C2C12成肌细胞分化。为此,将细胞用分化培养基(DM)洗涤1次,所述分化培养基由补充有2%热灭活马血清(HS;#US14-403F,Cambrex)、1%青霉素/链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM组成,并且随后在DM中在37℃,5%CO2和95%湿度孵育72小时。
A6Biacore
在25℃使用BiacoreT200仪,通过SPR表征结合特性。通过采用标准胺偶联法制备三块CM5芯片(GE,BR-1005-30)。将流动池1空白固定以充当参考,而将IGF-1和hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A固定在测量流动池2和3上。固定水平针对单独的相互作用调整并且范围从20–143RU(IGF-1)和从32–113RU(hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A)。在含有30mM柠檬酸盐和0.05%BSA的运行缓冲液1xHBS-EP+(Teknova,H8022)中制备重组人IGF-1R(R&DSystems,391-GR)的稀释系列物,并将稀释系列物以流速50μl/分钟注射在芯片上。分析物浓度范围针对单独的相互作用调整并且范围从1000-3.9nM(IGF-1R)。通过将Ag/Ab洗脱缓冲液(ThermoScientific,21027)以50μL/分钟温和注射90秒再生配体。通过将双参比传感图拟合为1:1结合模型,计算动力学速率常数和KD。
A7ELISA
为了分析IGF-1R磷酸化,将6孔板上铺种的细胞在生长培养基中培养24小时(NIH3T3-IGF-1R)或72小时(人原代成肌细胞和食蟹猴原代成肌细胞)。将细胞饥饿24小时(NIH3T3-IGF-1R)或4小时(人原代成肌细胞和食蟹猴原代成肌细胞)并且随后用所示的肽在37℃刺激15分钟。将细胞用含有多种蛋白酶抑制剂的PhosphoSafe缓冲液(CellSignaling)裂解并通过在4℃以14,000xg离心15分钟澄清,并且使用DuoSetIC人phosphor-IGF-1R试剂盒(R&DSystems),通过ELISA分析IGF-1R磷酸化水平。
为了分析胰岛素受体磷酸化,将NIH3T3-InsR细胞以密度6孔平板每孔0.2x106个细胞铺种并且在生长培养基中培养24小时。将细胞在无血清培养基中饥饿18小时并且随后在37℃用不同配体刺激10分钟。将细胞如上文所述裂解并且使用DuoSetIC人phosphor–InsRELISA试剂盒(R&DSystems),通过ELISA分析InsR磷酸化水平。
A8葡萄糖摄取
为了测量葡萄糖摄取,将3T3-L1脂肪细胞和C2C12小鼠肌管细胞接种到24孔板上并在无血清DMEM中培养4小时。随后对于r3T3-L1脂肪细胞和C2C12,将无血清DMEM分别替换为KRP缓冲液(130mMNaCl,1.3mMMgSO4,1.3mMCaCl,5mMKCl和10mMNa2HPO4)或HBS(140mMNaCl,2.5mMMgSO4,1.0mMCaCl,5mMKCl和10mMHepes)。将细胞用指定的肽在37℃处理1小时。通过在室温添加0.4(脂肪细胞)或0.8(C2C12)μCi[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和0.1(脂肪细胞)或0.01(C2C12)mM2-脱氧-D-葡萄糖为时10分钟(脂肪细胞)或5分钟(C2C12),测量葡萄糖摄取。吸出培养基并且通过添加含有1μM细胞松弛素B的KRP或HBS缓冲液,终止测定法。细胞随后用冰冷的PBS洗涤并使用0.2MNaOH裂解,并且通过闪烁计数法分析放射性活度(参见图5/图6)。
A9药代动力学曲线
成年雄性大鼠(n=3/组)接受静脉内(i.v.)团注或皮下注射10mg/kg的hIGF-1-Ea-Fc_mut13/2_A或hIGF-1-Ea-Fc_mut04/2_E或者hIGF-1(1mg/kg)。在施用IGF-1变体后2、4、8、24、48、72、96、168和336小时或在施用hIGF-1后0.083、0.25、0.5、2、4、8和24小时采集连续血液标本。通过ELISA测定重组蛋白的血清浓度。
A10hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A针对地塞米松诱导的肌萎缩的效应
将地塞米松(Dex)溶解于PBS中以实现采用Alzet模型2ML2时为时28日的剂量0.075mg/kg/日。在组C中,将Dex在微型泵中与剂量3.8mg/kg/日的hIGF-1合并。在组D、E和F中,Dex治疗分别与以3、10和30mg/kg剂量的每隔1日hIGF1-Ea-Fc_13/2_A皮下治疗组合。将泵填满溶液并且在37℃在PBS中保持几小时直至外科植入。在手术之前,将大鼠用Temgesic按剂量0.02mg/kg以体积1mL/kg皮下处理至少30分钟,并且随后将用如上所示溶液灌满的泵皮下植入用浓度3%的异氟烷麻醉下的大鼠的背部。在手术24小时和48小时后,将Temgesic皮下施用至大鼠。将组A、B和C中的大鼠用每日皮下注射PBS处理。每周2次测量体重。在治疗后4周,将大鼠用CO2安乐死,并且将肌肉剖取并称重。
部分B:工作实施例
已经产生并测试包含Ea肽的现有技术分子,其中蛋白质残基E3、R71和S72已经缺失并且R37氨基酸已经由丙氨酸替换(hIGF1-Ea-Fc-mut3)(SEQIDNO.:27)。
实施例1:DNA表达载体的制备
1.1如上文所述构建了编码含有以下修饰的hIGF-1-Ea前体多肽的DNA表达载体:hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A(包括来自hIgG1的携带效应子功能沉默突变L234AL235A(”LALA”)的Fc部分(SEQIDNo.:9);其中G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q);并且其与IgG1LALAFc区连接。
这导致以下分泌型蛋白序列:
(SEQIDNO.:9)
TLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSQAAPQTSIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAVQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYQMCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1.2如上文第A2节中所述构建了编码包含以下修饰的hIGF-1-Ea前体多肽的DNA表达载体:
hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_E(包含hIgG1LALAFc区):人IGF-1前体蛋白,其中G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q);并且其与IgG1LALAFc区连接。
这导致以下分泌型蛋白序列:
(SEQIDNO.:12)
TLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSREAPQTSIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAVQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYQMDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
基于上文所概述的原理,已经产生以下额外的蛋白质:
实施例54(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_E;SEQIDNO.:8)
实施例56(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_C;SEQIDNO.:10)
实施例50(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F;SEQIDNO.:11)
实施例58(hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_A;SEQIDNO.:13)
实施例59(hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_F;SEQIDNO.:14)
1.3使用本领域已知的DNA载体构建/DNA操作方法,构建了编码包含以下修饰的hIGF-1多肽的DNA表达载体:hIgF1G42S(SEQIDNo.:117);
这导致以下蛋白序列:
(SEQIDNO.:117)
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTSIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
1.4使用本领域已知的DNA载体构建/DNA操作方法,构建了编码包含以下修饰的hIGF-1多肽的DNA表达载体:hIGF1-Ea-mut03-G42S(SEQIDNo.:118);
这导致以下蛋白序列:
(SEQIDNO.:118)
GPTLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRAAPQTSIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYRM
实施例2:IGF-1-Fc变体的蛋白酶攻击
在哺乳动物细胞表达系统例如CHO中产生的蛋白质可能在表达期间遭遇蛋白酶解性降解。为了有效评估以标准化方式生产期间的潜在蛋白酶易感性,我们已经开发一种使用纯化的蛋白质和来自CHO细胞培养物的条件化培养基的蛋白酶攻击测定法。比较这种测定法与CHO细胞中产生的IGF-1-Fc变体观察到的切割样式,提供了测定法验证。简言之,将CHO细胞在来自2E5细胞/ml的CHODM122培养基中培育(37℃,6%CO2,85%相对湿度,90-150转/分钟)到多至1E7细胞/ml的密度。澄清的上清液提供用于该测定法的条件化培养基。将IGF-1-Fc变体如上文所述(A3)纯化并且以100μg/ml浓度在条件化培养基或PBS中掺入作为对照。在无菌过滤后,将样品在37℃孵育多至20天,并且在多个时间点取得待分析样品。可以通过标准SDS-PAGE技术(NuPAGEBis-Tris,Invitrogen)良好分离不同的降解产物,并且以光密度测定方式对降解条带的强度定量。图17中显示结果。
实施例3:hIGF-1和类似物对重组人IGF-1R的高亲和结合
使用表面等离子体共振法(Biacore)测量hIGF-1和IGF-1变体对rhIGF1R的高亲和结合。进行直接结合测定法。将人IGF-1-Ea_Fc_Mut_13/2_A和hIGF-1固定在芯片上并且IGF-1受体充当溶液中的分析物。将所得的传感图对1:1相互作用模型拟合以计算平衡解离常数(KD)。结果显示hIGF-1-Ea_Fc_Mut_13/2_A与IGF-1R的结合可比于hIGF-1(图1)。
实施例4:IGF-1R磷酸化的诱导
首先在过量表达人IGF-1R的NIH3T3细胞(NIH3T3-IGF-1R)中通过ELISA评价hIGF-1和hIGF-1变体刺激IGF-1R磷酸化的能力。在这些细胞中,IGF-1R磷酸化由全部测试的肽以浓度依赖性方式诱导。平均化的ELISA数据的逻辑曲线拟合显示,与hIGF-1相比,hIGF1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,R77Q-Fc和hIGF1-Ea-Fc_mut_04/2_E的效力(EC50)降低(图2A-B)。但是对于全部测试的肽,平均化的ELISA数据的逻辑曲线拟合产生非常可比较的最大响应值(图2C-D)。在原代人成肌细胞中和在食蟹猴成肌细胞中评价hIGF-1变体和hIGF-1刺激内源IGF-1R磷酸化的能力。在这些细胞中,IGF-1R磷酸化由全部测试的肽以浓度依赖性方式诱导(图4B-C)。平均化ELISA数据的逻辑曲线拟合显示,与hIGF-1相比,hIGF-1变体的效力(EC50)降低(图4A)。但是对于全部测试的肽,平均化的ELISA数据的逻辑曲线拟合产生非常可比较的最大响应值(图4)。
实施例5:特异性对比胰岛素受体
为了检验IGF-1变体的氨基酸修饰是否影响受体特异性,通过ELISA在过量表达人InsR的NIH3T3中分析IGF-1变体肽对InsR磷酸化的影响。我们用不同浓度的IGF-1变体、hIGF-1和胰岛素处理NIH3T3-InsR细胞转染子。使用等摩尔浓度的所示肽。图3/图18中显示这些实验的结果。修饰的确影响大多数IGF-1变体的受体特异性,例外是携带G42S突变的变体(hIGF1-Ea-Fc_mut_02、hIGF1-Ea-Fc_mut_03、hIGF1-Ea-Fc_mut_04/2_E和hIGF1-Ea-Fc_mut_13/2_A),这些变体显示维持受体特异性并且是InsR磷酸化的弱诱导物,甚至在胰岛素将产生最大反应的浓度处也是如此。令人惊讶地,显示hIGF1-EaFc_mut_13/2_A和hIGF1-EaFc_mut_04/2_E对由快速胰岛素受体结合作用驱动的效应子功能(例如已分化脂肪细胞中的葡萄糖摄取)的效力显著弱于IGF-1,如图5B和D中和图6中所显示。相反,对于IGF-1R-介导的功能如C2C12肌管中的葡萄糖摄取,hIGF1-EaFc_mut_13/2_A和hIGF1-EaFc_mut_04/2_E及hIGF-1是等效力的(图5A和图5C)。将G42S突变引入IGF-1蛋白中(产生SEQIDNO.:117的IGF-1G42S变体)以及引入hIGF1-Ea-mut03蛋白中(产生SEQIDNO.:118的hIGF1-Ea-mut03-G42S变体)减少NIH3T3-InsR细胞中的InsR磷酸化(图18)。另外,所述突变分别对脂肪细胞和C2C12肌管中的葡萄糖摄取产生影响(图19)。
实施例6:血清浓度测定
通过对hIGF-1Ea3mut特异的ELISA测定在雄性Fischer大鼠(n=3)中单次静脉内和皮下给药后hIGF1-Ea-Fc-mut_13/2_A和hIGF1-Ea.Fc_mut_04/2_E的血清浓度(详见上文A5)。图7-A和图7-B中显示这些实验的结果。终末半寿期分别是约75.3小时和50.1小时。最大浓度分别在皮下给药8小时和24小时后达到(Tmax)。相反,在静脉内施用hIGF-1(1.0mg/kg)之后,hIGF-1水平在0-8小时的时间范围内可定量。在Tmax(0.083小时)达到后,观察到肽的血清浓度快速下降,产生表观终末半寿期1.81小时。在皮下施用hIGF-1(1.0mg/kg)之后,血清水平直至给药后8小时是可定量的,并且在给药后0.5小时观察到最大浓度。因此,与人IGF-1相比,IGF-1类似物显示大大改善的药代动力学谱。
实施例7:hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A针对地塞米松诱导的肌萎缩的效应
由于已经显示IGF-1在骨骼肌中刺激蛋白质合成并抑制蛋白质降解,我们检验在地塞米松处理的大鼠中施用hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A是否可能防止肌肉萎缩。经Alzet泵,将75μg地塞米松/kg/日单独或与载体(PBS),或hIGF-1一起连续输注雄性Wistar大鼠。如上文所述以地塞米松输注的额外的动物组每隔1日接受hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A皮下注射。将全部动物处理28日并且随后处死。在开始实验时并且随后在注射后第28日监测体重。
如预期,与载体对照相比,在地塞米松处理的大鼠中观察到体重和肌肉重量的显著降低(图8)。hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A的注射显著地减少体重和肌肉重量的丧失(图8)。
除上述的hIGF-1-Ea前体多肽变体之外,可以根据本发明产生并使用以下额外的蛋白质变体:
实施例8
(2b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:32).
实施例9
(4b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:33).
实施例10
(5b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:34).
实施例11
(6b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:35).
实施例12
(8b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:36).
实施例13
(9b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:37).
实施例14
(13b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:38).
实施例15
(14b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:39).
实施例16
(15b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:40).
实施例17
(16b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:41).
实施例18
(17b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:42).
实施例19
(18b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:43).
实施例20
(19b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换(A),G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:44).
实施例21
(20b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换(A),G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:45).
实施例22
(21b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换(A),G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:46).
实施例23
(22b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:47).
实施例24
(23b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:48).
实施例25
(24b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:49).
实施例26
(25b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:50).
实施例27
(26b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkrasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:51).
实施例28
(27b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:52).
实施例29
(28b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:53).
实施例30
(29b)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:54).
实施例31
(2c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:55).
实施例32
(4c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:56).
实施例33
(5c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:57).
实施例34
(6c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:58).
实施例35
(8c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaqvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:59).
实施例36
(9c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:60).
实施例37
(13c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:61).
实施例38
(14c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换并且氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:62).
实施例39
(15c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:63).
实施例40
(16c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:64).
实施例41
(17c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:65).
实施例42
(18c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由谷氨酸(E)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:66).
实施例43
(19c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换(A),G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:67).
实施例44
(20c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换(A),G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:68).
实施例45
(21c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由丙氨酸替换(A),G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:69).
实施例46
(22c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:70).
实施例47
(23c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S7272缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:71).
实施例48
(24c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R37由脯氨酸(P)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:72).
实施例49
(25c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:73).
实施例50
(26c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:74).
实施例51
(27c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO.:75).
实施例52
(28c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36和R37均由谷氨酰胺(Q)替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:76).
实施例53
(29c)G1、P2、E3缺失,氨基酸R36由谷氨酰胺(Q)替换,R37由丙氨酸替换,G42由丝氨酸替换,氨基酸K68、S69、A70、R71和S72缺失并且氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdnpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQIDNO.:77).
实施例54:重组IGF-1在CHOIGF-1受体缺陷型细胞系中的表达。
重组IGF-1在CHO细胞系中的表达导致细胞生长抑制和低滴度。图11中显示生物反应器过程期间hIGF-1Ea3mut(SEQIDNO.:27)的滴度量值。HIGF-1Ea3mut的最大滴度量值是8μg/ml,这对应于100mg/L的抗体滴度(基于摩尔质量)。生物反应器过程中重组抗体的平均滴度量值是大约3g/L。IGF-1的低滴度的一个原因是细胞生长减少和表达IGF-1的细胞的低细胞活力。在抗体表达过程期间,CHO-K1衍生细胞生长多至2-2.5x107个细胞/ml并且细胞活力在前230-260小时培养时间期间超过97%。相反,表达IGF-1的CHO-K1衍生细胞仅生长多至0.5-0.9x107个细胞/ml并且细胞活力在80小时后已经降低到97%以下(参见图11)。
还可以在未转染的CHO-K1衍生细胞与IGF-1共培养期间检测到减少的细胞生长。图12显示亲本CHO-K1衍生细胞生长多至2.5x107个细胞/ml。在CHO-K1衍生细胞与野生型IGF-1或hIGF-1Ea3mut(50mg/L)共培养期间,细胞生长也显著被抑制(0.9x107个细胞/ml)。
在下一个步骤中,将特别的IGF-IR酪氨酸激酶抑制剂(NVPAEW541(InvivoantitumoractivityofNVPAEW541-Anovel,potent,andselectiveinhibitoroftheIGF-IRkinase;CarlosGarcía-Echeverría等人;CancerCell;2004年2月26日在线出版DOI:10.1016/S1535610804000510)在CHO-DUXB11衍生细胞中的IGF-1共培养实验期间添加。可以阻止细胞生长抑制作用(参见图13)。这证实IGF-1-R触发导致细胞生长抑制的信号进入细胞中。
在下一个步骤中,在CHO-K1衍生细胞和CHO-DUXB11衍生的细胞系中使用锌指核酸酶技术(ZFN)进行IGF-1R的敲除。设计了在IGF-1R的外显子3区域中特异性结合的ZFN。将两种质粒(各自编码IGF-1R特异性ZFN的一个亚基)在CHO-K1衍生细胞和CHO-DUXB11衍生的细胞中共转染。每个ZFN亚基结合长18碱基对的特定序列;因此特异性识别总计36bp序列(避免在基因组的其他位置上随机切割)。将FokI的核酸内切酶结构域再工程化以仅作为异二聚体发挥作用以切割DNA。ZFN二聚体在IGF-1R的外显子3处产生靶向的双链断口。通过非同源末端接合的易错细胞过程,这种双链断口可以导致DNA序列的修饰并因此产生所靶向基因的功能性敲除。对于CHO-K1衍生细胞,产生三种敲除克隆(在两个等位基因上敲除和移码突变):克隆1:Δ2(SEQIDNO.:99),克隆2:Δ5(SEQIDNO.:100)和克隆3:Δ2(SEQIDNO.:101),克隆1:+18(和14bp替换)(SEQIDNO.:103),克隆2:Δ22(SEQIDNO.:102)和克隆3:Δ114(SEQIDNO.:104)。
CHO-DUXB11衍生的细胞系与致使敲除IGF-1R困难(必须敲除超过2个IGF-1R拷贝/基因组)的CHO-K1衍生细胞多克隆和多倍体形成对比。我们已经生成几种具有移码突变的独特敲除克隆并且用TOPO克隆和测序验证其中二者。克隆12:Δ7(50%)(SEQIDNO.:106)/Δ22(50%)(SEQIDNO.:105),克隆19:Δ7(14.5%)/Δ16(44%)/Δ22(18%)/Δ22mut(15%)。括号中的百分数基于这种突变在测序的32个细菌菌落中以多大频率出现。对于克隆19,可以假定存在6种IGF-1R等位基因(3xΔ16,1xΔ7,1xΔ22,1xΔ22mut)。将生成的三个CHO-K1衍生细胞IGF-1RKO克隆与IGF-1共培育,并且不能检测到细胞生长抑制作用(参见图14)。
还在IGF-1存在/不存在下培育两个生成的IGF-1RKOCHO-DUXB11衍生的克隆。与CHO-K1IGF-1RKO克隆相似,与野生型CHO-DUXB11衍生的细胞相比,可以对KO克隆检测到改进的细胞生长(参见图15)。KO克隆之一在IGF-1存在下未显示细胞生长抑制作用,并且另一个KO克隆在IGF-1存在下具有与没有IGF-1共培养时CHO-DUXB11衍生的细胞相似的最大活细胞计数。
载体pBW806(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A)的克隆策略。
按照两个连续的步骤,制备编码hIGF1-Ea-fc_mut13/2_A的载体pBW806。在第一步骤中,将质粒11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的Fc区。平行地,将pBW679(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生中间载体pBW805。在第二步骤中,将质粒11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_A_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和Sse232I消化以提取hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A融合蛋白的N端区域。平行地,将中间载体pBW805随后用Sse232I和XbaI消化,产生所需的骨架部分,所述骨架部分最终与11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_A_pMA-T片段连接,产生最终表达载体pBW806。
载体pBW807(hIGF1-Ea-fc_mut13/2_C)的克隆策略。
按照两个连续的步骤,制备编码hIGF1-Ea-fc_mut13/2_C的载体pBW807。在第一步骤中,将质粒11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的Fc区。平行地,将pBW679(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生中间载体pBW805。在第二步骤中,将质粒11AARNWC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_C_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和Sse232I消化以提取hIGF1-Ea-fc_mut13/2_C融合蛋白的N端区域。平行地,将中间载体pBW805随后用Sse232I和XbaI消化,产生所需的骨架部分,所述骨架部分最终与11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_C_pMA-T(Novartis专利载体)片段连接,产生最终表达载体pBW807。
载体pBW808(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F)的克隆策略。
按照两个连续的步骤,制备编码hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F的载体pBW808(Novartis专利载体)。在第一步骤中,将质粒11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的Fc区。平行地,将pBW679(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生中间载体pBW805。在第二步骤中,将质粒11AARNYC_hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和Sse232I消化以提取hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_Fc融合蛋白的N端区域。平行地,将中间载体pBW805随后用Sse232I和XbaI消化,产生所需的骨架部分,所述骨架部分最终与11AARNUC_hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_F_pMA-T(Novartis专利载体)片段连接,产生最终表达载体pBW808。
载体pBW809(hIGF1-Ea-fc_mut04/2_E)的克隆策略。
按照两个连续的步骤,制备编码HIGF1-EA-FC_MUT04/2_EFc融合序列的载体pBW809。在第一步骤中,将质粒11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的Fc区。平行地,将pBW679(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生中间载体pBW805。在第二步骤中,将质粒11AARN2C_hIGF1-Ea-fc_mut04/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和Sse232I消化以提取hIGF1-Ea-fc_mut04/2_E融合蛋白的N端区域。平行地,将中间载体pBW805随后用Sse232I和XbaI消化,产生所需的骨架部分,所述骨架部分最终与11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut04/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)片段连接,产生最终表达载体pBW809。
载体pBW810(hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_A)的克隆策略。
按照两个连续的步骤,制备编码hIGF1-Ea-fc_mut04/2_A的载体pBW810。在第一步骤中,将质粒11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut13/2_E_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的Fc区。平行地,将pBW679(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生中间载体pBW805。在第二步骤中,将质粒11AARN2C_hIGF1-Ea-fc_mut04/2_A_pMA-T(Novartis专利载体)用XbaI和Sse232I消化以提取hIGF1-Ea-fc_mut04/2_A融合蛋白的N端区域。平行地,将中间载体pBW805随后用Sse232I和XbaI消化,产生所需的骨架部分,所述骨架部分最终与11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut04/2_A_pMA-T(Novartis专利载体)片段连接,产生最终表达载体pBW810。
载体pBW410(hIGF-1Ea3mut)的克隆策略。
将编码hIGF-1Ea3mut序列的载体0610900pGA4(Novartis专利载体)用XbaI和MluI消化以提取从头合成的编码IGF的序列。平行地,将pBW165(Novartis专利载体)用MluI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生最终表达载体pBW410。
载体pBW664(hIGF1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,77-fc结构域)的克隆策略。
将编码hIGF1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,77-fc结构域序列的载体0905915(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的编码IGF的序列。平行地,将pBW596(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生最终表达载体pBW664。
载体pBW666(hIGF1-Ea-Δ1-3,R37A,Δ71-72,R77Q-fc结构域)的克隆策略。
将编码hIGF1-Ea-Δ1-3,R37A,Δ71-72,R77Q-fc结构域序列的载体0950919(Novartis专利载体)用XbaI和AscI消化以提取从头合成的编码IGF的序列。平行地,将pBW596(Novartis专利载体)用AscI和XbaI消化,产生携带转录及翻译调节元件以及G418/DHFR选择/扩增标志物的对应的骨架片段。将两种消化的元件通过其相容性末端连接,产生最终表达载体pBW666。
将Δ5/Δ22CHO-K1衍生细胞IGF-1RKO克隆以及Δ7/Δ22CHO-DUXB11细胞衍生的IGF-1RKO克隆用5种不同的IGF-1-FC融合候选物转染(参见图15)。与用不同的IGF-1-FC融合候选物转染的野生型CHO-K1衍生细胞/CHO-DUXB11细胞衍生的细胞系相比,可以在汇总水平检测到重组IGF-1-Fc蛋白的滴度增加5-17倍。
在100L摇袋式生物反应器中培育CHO-K1衍生细胞IGF1R-KO或CHO-DUXB11衍生的IGF1R-KO细胞系中表达的两种IGF-1-FC融合候选物(hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A和hIgF1-Ea-Fc_mut04/2_E)(分批补料法和温度变动)。表达hIGF1-Ea-fc_mut13/2_A/4的CHO-K1衍生细胞IGF1RKO汇集物生长直至最大活细胞密度3x107个细胞/ml,这高于平均AB法(平均细胞密度是2.2x107个细胞/ml)。与表达IGF-1的CHO-K1衍生的野生型细胞相比,这是活细胞数目增长3-6倍(参见图11)。表达hIGF1-Ea-fc_mut13/2_A/4的CHO-DUXB11衍生的IGF1RKO细胞生长直至最大细胞密度1.5-2x107个细胞/ml,这是与野生型CHO-DUXB11衍生的细胞系相比更高的最大细胞密度。
将表达hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A的CHO-DUXB11衍生的IGF1RKO细胞进行单细胞分选并且测定24板孔中以及50ml分批培养物中的批次滴度。在图15中,显示了CHO-DUXB11衍生的IGF-1RKO克隆中30个最佳hIgF1-Ea-Fc_mut13/2_A克隆的24孔滴度以及表达hIGF-1-Ea-D1-3,R37A,D71-72,77-fc结构域的30个最佳野生型CHO-DUXB11衍生的克隆的24孔滴度;在图16中显示来自每个组的15个最佳克隆的摇瓶滴度。总体上,CHO-DUXB11细胞衍生的IGF-1RKO克隆具有高8倍的24孔滴度和高7倍的摇瓶滴度。
实施例55:在生物反应器中培养经转化的表达IGF-1的CHO细胞。
为了在生物反应器中培养表达IGF-1的经转化的细胞,使用补料分批法。设定工艺事件如补料开始和温度变动的时间以支持细胞生长并通过维持活力延长生产阶段(NirajKumar,PatrickGammell,MartinClynes(2007)ProliferationcontrolstrategiestoimproveproductivityandsurvivalduringCHObasedproductionculture;Cytotechnology(2007)53:33–46)。
实施例56:从CHO细胞收获IGF-1
作为收获方法,使用采用深层过滤随后无菌过滤的标准细胞分离技术。根据本领域技术人员已知的标准方法培育并收获CHO细胞(例如Curr.Protoc.ProteinSci.2001年5月;第5章:单元5.10.Productionofrecombinantproteinsinmammaliancells.ChenS,GrayD,MaJ,SubramanianS;(MaheshPrashada,KlausTarrach(2006)Depthfiltration:Cellclarificationofbioreactoroffloads,Filtration&Separation第43卷,第7期,2006年9月,第28–30页)。
实施例57:IGF-1R的外显子3特异性的ZFN的设计/生产和使用:
对我们的CHO细胞系中的IGF-1R外显子3和侧翼内含子(SEQIDNO.:110/111)测序。首先,使用覆盖包含外显子3的IGF-1RcDNA部分的仓鼠DNA重叠群以及IGF-1R基因小鼠序列,对外显子3测序。PCR引物基于保守的部分设计并且对所得的PCR产物测序。获得的外显子3序列提交给Sigma以进行外显子3侧翼内含子测序以及设计靶向IGF-1R外显子3的两种工程化的ZFN。每种ZFN分别靶向并结合至反向DNA链(在5’方向)和正向DNA链(在3’方向)上的18个核苷酸。两个结合位点由切割位点(SEQIDNO.:107)的5个核苷酸分隔。产品描述和方法是在Sigma在称作‘74188CompoZrCustomZFNTechBulletin’的文件中可获得的。Sigma还设计在周围内含子的序列中的正向和反向PCR引物(SEQIDNO.:108和109)以扩增gDNA中的IGF-1R外显子3,产生501bpPCR产物。Sigma提供试剂盒CompoZrTM(订制锌指核酸酶,产品编号CSTZFN-1KT,批号08021019MN),其包含20-25μg分别编码识别反向链(pZFN1)和正向链(pZFN2)的工程化ZFN的两种DNA载体。
根据熟知的转化方案,将大肠杆菌用任一种载体转化并涂布在含有25μg/ml卡那霉素的琼脂糖平板上。对于每种载体,挑取4个细菌菌落并扩充。使用T7正向引物和BHG反向引物,验证每种pZFN的4份纯化的DNA质粒样品的ZFN序列并汇总。在CHO-K1衍生细胞和CHO-DUXB11衍生物亲本细胞中转染6μg或10μg的环状pZFN1和pZFN2载体的均质混合物,每个量转染3次,从而每个细胞系产生六份汇集物(外加转染的阴性对照)。为了测量ZFN在汇集物中的切割效率,如Sigma提供的保密方案中所述,在转染(计为第零日)后第3日和第10日使用Surveyor突变检测测定法(Transgenomics,目录号706025)。使用GenElute哺乳动物基因组DNA微量制备试剂盒(Sigma,目录号G1N70-1KT),分离汇集物的基因组DNA;使用位于侧翼内含子序列内的IGF-1R正向和反向测序引物,在PCR反应中扩增外显子3。PCR产物随后在高温下变性。当温度逐渐降低时,一些野生型产物和突变产物杂交以形成在切割位点周围具有错配的双链DNA,由称作的酶切割。使用称作lab901的凝胶电泳系统,分析终产物。对于全部6份经转染的汇集物,除了501bp完美匹配PCR产物之外,还检测到两个大约277bp和224bp的较小条带,对应于切割位点的任一侧上的片段,因此阻滞我们细胞中的ZFN活性。在转染后7日,在10x96孔板中对汇集物进行单细胞克隆。
在pZFN转染的CHO-K1衍生细胞系中,将507个克隆在96孔板中培育并且使用上文描述的Surveyor突变检测测定法(在96孔板中使用来自Sigma,目录号XNAB2的Extract-N-Amp血液PCR试剂盒提取克隆的基因组DNA)评估突变。42个克隆为阳性(检测到两个较小条带),意味着它们的基因组至少含有外显子3的突变的拷贝,并且对其PCR扩增的IGF-1R外显子3测序。如对于从假二倍体CHO-K1衍生的细胞系产生的克隆所预期,DNA测序色谱图显示最多两个相同强度的叠加信号,提示靶序列的两个拷贝。6个克隆在两个拷贝中均具有突变,其中3个克隆在两个拷贝中(SEQIDNO.:99和100)具有引起附近终止密码子的突变或在一个拷贝中具有临近终止密码子并且在另一个拷贝中具有巨大缺失(SEQIDNO.:101)。通过TOPO克隆法(TA克隆试剂盒,Invitrogen,目录号K4575-40;挑取6个细菌菌落)证实这3个克隆中两个拷贝的序列。全部3个K.O.克隆均按照比亲本细胞显著更高的细胞密度生长,并且当IGF-1(‘hIGF-1Ea3mut’(SEQIDNO.:27)以50mg/L在标准培养基中掺入时,按照与亲本细胞相似的密度在标准培养基中生长(图8)。选择基因型为Δ5/Δ22的克隆(SEQIDNO.:100/102)用于用胰岛素样生长因子1蛋白例如人IGF-1(SEQIDNO.:1或5)或其变体(例如SEQIDNO.:8-14)转染。
在pZFN转染的CHO-DUXB11衍生细胞系中,仅将117个克隆在96孔板中生长并且用Surveyor测定法评估突变。28个克隆具有外显子3的至少一个突变的拷贝(检测到两个较小条带),但是测序表明,全部这些克隆仍然具有野生型拷贝;在测序色谱图中,野生型序列具有比突变的序列更高的强度。CHO-DUXB11衍生细胞是经诱变并且是多克隆的;核型显示在一些细胞中存在染色体的至多8个拷贝,造成难以估计基因的预期拷贝数。选择其中检测到的突变序列(Δ22或Δ16)引起临近终止密码子的两个克隆用于进行第二轮pZFN转染;使用10μg混合的pZFN产生3份汇集物/原始克隆。在转染后7日,在6x96孔板中对汇集物进行FACS克隆。生长379个克隆,对来自其中的211个克隆就IGF-1R外显子进行测序(由于已经是突变序列,不再可能Surveyor测定法)并且在色谱图上目视分析重叠序列。大多数测序的克隆具有野生型序列和预期的突变序列(Δ22或Δ16)的杂合子;约20%的克隆具有野生型序列和2个突变的序列(大多数在切割位点周围具有缺失);在两个克隆中,检测到4种不同序列(用TOPO克隆法实,但是序列之一是野生型或仅插入一个核苷酸);2个克隆是K.O.克隆,二者均有2个检测到的序列(Δ16/Δ22和Δ16/Δ5),但是它们在IGF-1存在下的生长比亲本CHO-DUXB11衍生细胞系中好不了多少。因此选择具有基因型Δ22/Δ7/野生型、Δ16/Δ7/野生型和Δ16/Δ22/野生型的三个克隆用第三轮pZFN转染(通过TOPO克隆法证实它们的序列,每个克隆挑取32个细菌菌落并测序)。这三个克隆中每个克隆用8μgpZFN转染2次。一旦从每个克隆回收两份汇集物(7-9日后活力>91%),将它们汇集并在50mg/lIGF-1存在下共培养约6-8周(以选择更多抗性细胞)。在FACS克隆之前两天,将它们在没有IGF-1的情况下分开(以允许IGF-1-Cy5的结合并选择少于5%的荧光细胞)。在总共9x96孔板中对三份汇集物进行FACS克隆。
设计结合IGF-1R外显子3中野生型切割位点序列的PCR引物,从而允许高效筛选突变的克隆。PCR用IGF-1R的正向测序引物一起进行;假定PCR总是有效,如果克隆是PCR阴性的,则不存在野生型序列,或克隆生长得不好(提取的DNA太少,几乎没有细胞长出)。从如此筛选的所培育的389个克隆中,58个克隆是阴性的并且被测序。在这些克隆中的30个中,未检测到野生型序列,并且对于22个克隆,突变是移框(13个克隆具有两种序列Δ22/Δ7,来自克隆Δ22/Δ7/野生型)。评价它们在存在和不存在50mg/lIGF-1时的生长,并且选择具有序列Δ22/Δ7(由TOPO克隆法验证)的在IGF-1存在下生长最好的克隆(还有在IGF-1不存在下生长最好的克隆),用编码SEQIDNo.:8-14的蛋白质的DNA构建体进行转染。
Claims (50)
1.包含人IGF-1蛋白的多肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或突变,并且其中所述人IGF-1蛋白的氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:1。
2.包含人IGF-1前体蛋白的多肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸缺失或突变,并且其中氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
3.根据权利要求2的多肽,其中人IGF-1前体蛋白与人IgG的免疫球蛋白Fc区融合。
4.根据权利要求1-3中任一项的多肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸突变成丝氨酸。
5.根据权利要求2-4中任一项的多肽,其中人IGF-1前体蛋白包含Ea肽和选自由以下组成的组的氨基酸的额外缺失或突变:G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和M105。
6.根据权利要求3-5中任一项的多肽,其中IGF-1前体蛋白和Fc区由肽铰链区分隔。
7.根据权利要求6的多肽,其中肽铰链区选自由肽铰链1(SEQIDNO.:22)、铰链2(SEQIDNO.:23)和铰链3(SEQIDNO.:24)组成的组。
8.根据权利要求1的多肽,其中人IGF-1蛋白包含以下修饰:
a.氨基酸E3缺失,
b.氨基酸G42突变成丝氨酸,并且
c.氨基酸R37突变成丙氨酸,
其中所述人IGF-1蛋白的氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:1。
9.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中多肽包含E-肽并且其中
a.氨基酸E3、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42突变成丝氨酸,并且
c.氨基酸R37突变成丙氨酸,
其中所述人IGF-1蛋白的氨基酸的编号对应于SEQIDNO.:5。
10.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中多肽包含Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42突变成丝氨酸,并且
c.氨基酸R36、R74、R77和R104突变成谷氨酰胺,
d.氨基酸R37突变成丙氨酸。
11.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中多肽包含Ea肽并且其中
a.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71和S72缺失,
b.氨基酸G42突变成丝氨酸,
c.氨基酸R74、R77和R104突变成谷氨酰胺,并且
d.氨基酸R37突变成谷氨酸。
12.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中多肽包含Ea肽并且其中
e.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71、S72、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105缺失,
f.氨基酸G42突变成丝氨酸,并且
g.氨基酸R36、R74和R77突变成谷氨酰胺,并且
h.氨基酸R37突变成丙氨酸。
13.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中多肽包含Ea肽并且其中
e.氨基酸G1、P2、E3、K68、S69、A70、R71、S72、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104和/或M105缺失,
f.氨基酸G42突变成丝氨酸,
g.氨基酸R74和R77突变成谷氨酰胺,并且
h.氨基酸R37突变成谷氨酸。
14.根据权利要求10的多肽,其中IGF-1前体蛋白和Fc区由铰链1肽(SEQIDNO.:22)分隔。
15.根据权利要求11的多肽,其中IGF-1前体蛋白和Fc区由铰链3肽(SEQIDNO.:24)分隔。
16.前述权利要求中任一项的多肽,其中修饰Fc区以调节其与Fc受体的结合。
17.根据权利要求16的多肽,其中修饰Fc区以
IV.减少其对Fc受体的亲和力;
V.减少ADCC活性;或
VI.阻止ADCC活性。
18.权利要求10的多肽,包含SEQIDNO.:8。
19.权利要求10的多肽,包含SEQIDNO.:9。
20.权利要求12的多肽,包含SEQIDNO.:10。
21.权利要求12的多肽,包含SEQIDNO.:11。
22.权利要求11的多肽,包含SEQIDNO.:12。
23.权利要求11的多肽,包含SEQIDNO.:13。
24.权利要求13的多肽,包含SEQIDNO.:14。
25.权利要求9的多肽,包含SEQIDNO.:118。
26.前述权利要求中任一项的多肽,其中多肽是糖基化的。
27.多核苷酸,其包含编码根据权利要求1-25中任一项的多肽的核酸分子。
28.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:15中所述的核酸分子。
29.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:16中所述的核酸分子。
30.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:17中所述的核酸分子。
31.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:18中所述的核酸分子。
32.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:19中所述的核酸分子。
33.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:20中所述的核酸分子。
34.权利要求27的多核苷酸,其包含如SEQIDNO.:21中所述的核酸分子。
35.包含权利要求1-25中任一项的多肽的药物组合物,其用于治疗。
36.权利要求35的药物组合物,其用于治疗有需要的患者中的肌肉病症。
37.权利要求35的药物组合物,其用于治疗患有去脂体重损失和/或肌肉萎缩的烧伤患者。
38.权利要求35的药物组合物,其用于治疗COPD患者。
39.权利要求35的药物组合物,其用于治疗脊髓和延髓肌萎缩(SBMA或肯尼迪病)患者。
40.权利要求35的药物组合物,其用于治疗慢性肾脏病患者。
41.权利要求36的药物组合物,其中肌肉病症是肌肉萎缩。
42.权利要求41的药物组合物,其中肌肉萎缩选自由肥胖相关的少肌症、少肌症和糖尿病相关的肌肉萎缩组成的组。
43.治疗有需要的患者中肌肉病症的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的任何前述权利要求的多肽。
44.治疗患有去脂体重损失和/或肌肉萎缩的烧伤患者的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的任何前述权利要求的多肽。
45.治疗慢性阻塞性肺病(COPD)患者的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的任何前述权利要求的多肽。
46.治疗脊髓和延髓肌萎缩(SBMA或肯尼迪病)患者的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的任何前述权利要求的多肽。
47.治疗慢性肾脏病患者的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的任何前述权利要求的多肽。
48.根据权利要求43的方法,其中肌肉病症是选自由肥胖相关的少肌症、少肌症和糖尿病相关的肌肉萎缩的肌肉萎缩组成的组。
49.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中将位置42处的氨基酸甘氨酸缺失。
50.根据前述权利要求中任一项的多肽,其中人IGF-1前体蛋白聚乙二醇化。
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