JP6392245B2 - 遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生 - Google Patents
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Description
a.前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で治療用タンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程であって、細胞が前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している、工程、及び
b.前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法に関する。
c.治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
d.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法に関する。
e.組換え治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
f.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から組換え治療用タンパク質を収集する工程
を含む。
a.IGF−1又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1又はそのバリアントを収集する工程
を含み、前記哺乳動物細胞が、IGF1Rの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1,5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多いIGF−1又はそのバリアントを産生する、方法に関する。
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記細胞内に導入する工程であって、dsRNAが互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、治療用タンパク質の同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAが、前記細胞内に導入すると、組換え治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、上記方法の1つに関する。
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)を前記細胞内に導入する工程であって、dsRNAが互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記哺乳動物細胞のIGF−1RをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAが、前記細胞内に導入すると、IGF−1R遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、工程、及び
(b)IGF−1R遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより細胞内のIGF−1R遺伝子の発現を阻害する工程
を含む。
(a)組換え治療用タンパク質の同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるshRNAをコードするベクターを前記細胞内に導入する工程であって、前記shRNAが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)前記同族受容体遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持する工程
を含む。
a.前記細胞内で産生されるべき目的の治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、目的の治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.において選択した哺乳動物細胞を、目的の前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含み、別法として、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもできる。
a.インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、IGF−1、例えばヒトIGF−1又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.の哺乳動物細胞を、IGF−1タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞から前記IGF−1タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもでき、
前記哺乳動物細胞は、IGF−1Rの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1,5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多いIGF−1又はそのバリアントを産生する、産生に関する。
本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載される。
哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は治療用タンパク質の低力価をもたらし得る、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する前記哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質であり得る、前記治療用タンパク質を産生する問題についての解決策が開示される(実施例の段落を参照のこと)。
a.治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法を提供する。
c.組換え治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
d.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から組換え治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法を提供する。
a.インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.IGF−1又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで工程a.の細胞を形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.IGF−1又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で工程c.において選択した細胞を培養する工程、及び
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもできる、方法を提供する。
相同組換えは、特定の遺伝子の発現を欠損している(例えば遺伝子ノックアウト)哺乳動物細胞を得るための1つの手段である。この技術は、原則として、非標的法より特異的であるが、相同組換えの頻度は非常に低く、工業的な細胞株操作に適用できない(Vasquez KM, Marburger K, Intody Z, Wilson JH (2001) Manipulating the mammalian genome by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA 98(15): 8403-8410)。結果として、多くのクローンのスクリーニング及び分析がノックアウト細胞を識別するために必要とされる。この手順の成功例はCHO−DG44細胞におけるα1,6−フコシルトランスフェラーゼのノックアウトである(Yamane-Ohnuki N, Kinoshita S, Inoue-Urakubo M, Kusunoki M, Iida S, Nakano R, Wakitani M, Niwa R, Sakurada M, Uchida K, Shitara K, Satoh M (2004) Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng 87(5):614-622)。
メガヌクレアーゼは大きな認識部位(12〜40塩基対)によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、結果として、この部位は、一般的に、任意の所与のゲノムにおいて1回のみ発生する。メガヌクレアーゼは、高度に標的化された手段で配列を置換、除去又は改変するために使用され得る「分子DNAハサミ」である。タンパク質操作を介してそれらの認識配列を改変することによって、標的配列は変化され得る。研究及びゲノム操作に最も広範に使用されている最適な特徴付けられたエンドヌクレアーゼには、I−SceI、I−CreI及びI−DmoIが含まれる。大部分のメガヌクレアーゼは、ホモダイマー又は内部対称モノマーである。触媒ドメインを含有するDNA結合部位は切断点のいずれかの側における2つの部分から構成される。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは哺乳動物ノックアウト細胞を産生するための非常に有用な手段である。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されたジンクフィンガードメイン、短いリンカー及び配列特異的DNA二本鎖切断を導入している改変されたFokIエンドヌクレアーゼドメインから構成される。ジンクフィンガードメイン内の残基を変化させることによって、異なるDNA結合特異性を有する新たなジンクフィンガーヌクレアーゼが産生され得る(Bibikova M, Beumer K, Trautman JK, Carroll D (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300 (5620):764; Cathomen T, Joung JK (2008) Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. Mol Ther 16(7):1200-1207)。ジンクフィンガーヌクレアーゼは任意の所望のゲノム部位を標的化するように設計され得るので、ジンクフィンガードメインは切断位置を誘導し、他の遺伝子標的プロセスより有益である。当業者は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び遺伝子標的化におけるそれらの適用を扱っている多数の科学出版物を知っている(Remy S, Tesson L, Menoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I (2010) Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals. Transgenic Res 19(3):363-371; Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436; Kandavelou K, Ramalingam S, London V, Mani M, Wu J, Alexeev V, Civin CI, Chandrasegaran S (2009) Targeted manipulation of mammalian genomes using designed zinc finger nucleases. Biochem Biophys Res Commun 388(1):56-61; Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus S, Jamieson AC, Porteus MH, Gregory PD, Holmes MC (2005) Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 435(7042):646-651;)。
RNAiプロセスは極めて詳細に従来技術において記載されている:
Carthew RW, Sontheimer EJ (2009) Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136(4):642-655;
Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA (2003) Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 4(6):457-467;
Kim DH, Rossi JJ (2007) Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet 8(3):173-184;
Siomi H, Siomi MC (2009) On the road to reading the RNAinterference code. Nature 457(7228):396-404;
Wu SC (2009) RNA interference technology to improve recombinant protein production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Adv 27(4):417-422.
Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411(6836):494-498.
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)を前記細胞内に導入する工程であって、dsRNAが互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、治療用タンパク質の同族受容体、例えばIGF−1RをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAが、前記細胞内に導入すると、治療用タンパク質の同族受容体、例えばIGF−1R遺伝子をコードする遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、工程、及び
(b)治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより細胞内の前記受容体、例えばIGF−1Rの発現を阻害する工程
を含む、方法に関する。
当業者は、遺伝子改変された哺乳動物細胞、例えばCHO−K1派生体、CHO−DUXB11派生体又はCHO−DG44細胞のようなCHO細胞を形質転換し、選択し、培養する方法を知っている。選択プロトコルが、成長因子、例えばIGF−1のような所望の治療タンパク質をコードする組換えDNAを組み込んでいる可能性のある細胞の選択を容易にするために通常使用されている。形質転換ベクターに同時に組み込まれた遺伝子によって付与される抗生物質耐性又は栄養選択培地中で成長する能力が通常使用される(Weber, W. and Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Amsterdam, pp. 589-604を参照のこと)(Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi)。組換えタンパク質産生のための2つの最も一般的なCHO発現系は、シヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)系メトトレキサート(MTX)選択又はグルタミン合成酵素(GS)系メチオニンスルホキシイミン(MSX)選択を利用する(Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb; 74(2):127-38. Epub 2009 Oct 22. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production)。
(1)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(2)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(3)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(4)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(5)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(6)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(7)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(8)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(9)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(10)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R77がグルタミン(Q)に変異している。
(11)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R77がグルタミン(Q)に変異している。
(17)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(19)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(22)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(25)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(27)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(1a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(2a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(3a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(4a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(5a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(6a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(7a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(8a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(9a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(10a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(11a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(17a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(19a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(22a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72 72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(25a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(27a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(1b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(2b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(3b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(4b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(5b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(6b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(7b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(8b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(9b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(10b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(11b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R77がグルタミン(Q)に変異している。
(17b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(19b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(22b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(25b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(27b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(1c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(2c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(3c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(4c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(5c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(6c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(7c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(8c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(9c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(10c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(11c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(17c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。(19c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(22c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72 72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(25c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
27c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
a)VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG(配列番号33)、又は
b)VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS(配列番号34)
からなる変異したEa−ペプチドを含む、上記のポリペプチド1〜29cに関する。
ヒンジ1:CPPCPA(配列番号30)
ヒンジ2:DKTHTCPPCPA(配列番号31)
ヒンジ3:EPKSCDKTHTCPPCPA(配列番号32)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_E(配列番号23)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_A(配列番号24)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_C(配列番号25)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F(配列番号26)
hIgF1−Ea−Fc_mut 04/2_A(配列番号28)
hIgF1−Ea−Fc_mut 04/2_E(配列番号27)
hIgF1−Ea−Fc_mut 04/2_F(配列番号29)
が含まれる。
本発明を、ここで、非限定的な実施例によって記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を構成する。
目的の治療用タンパク質を発現するための本発明に係る宿主細胞をトランスフェクトし、培養するための適切な方法は当業者に知られている。以下を実施例により開示する。
CHO細胞を成長させている懸濁液を、例えば米国特許第6,048,728号に開示されているように振盪フラスコ内の標準培地中で培養する。細胞を新鮮な培地中で1週間に2回継代し、この研究の間にわたって対数増殖期に維持する。
トランスフェクションのために、95パーセント超の生存率を有する対数増殖期における親CHO細胞を使用した。製造業者(Lonza)の指示書に従ってAmaxa(商標)、Nucleofector(商標)技術を使用して、エレクトロポレーション(ヌクレオフェクション)によるトランスフェクションを行った。5×106細胞を90gにて10分、遠心分離し、100μlトランスフェクション試薬(「溶液V」)(Lonza)中で再懸濁した。細胞に何も加えないか(トランスフェクションの陰性対照)、又は30pmolのsiRNA若しくは3μgの線形DNAベクター(shRNAベクター若しくは(例えば配列番号23〜29の)IGF−1バリアントをコードするベクター又はジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする両方のベクター(pZFN1及び2(配列番号36/37))の6μg若しくは10μgの均一混合物を加え、全混合物をエレクトロポレーションキュベットに移した。ヌクレオフェクション(プログラム:U−23)後、キュベットを1mlの予め温めておいた(セ氏37度)培養培地ですすぎ、細胞を125mlの振盪フラスコ内の20mlの予め温めておいた培地に加え、セ氏37度及び10パーセントCO2にて2日間、インキュベートした。
選択をトランスフェクションの48時間後に開始した。発現ベクター核酸に位置するピューロマイシン/ジェネティシン選択マーカーはピューロマイシン/G418耐性についての選択を可能にする。トランスフェクタントの選択のために、細胞が80%超の生存率に回復するまで、5μg/mlのピューロマイシン(PAA)/0.8mg/mlのG418(Invitrogen)の存在下で細胞を培養した。トランスフェクション及びピューロマイシン/G418選択の約4/2週後、大部分がピューロマイシン/G418耐性細胞からなるプール集団が出現する。プールを回収した後、細胞を凍結させた。
G418耐性細胞のさらによりストリンジェントな選択を、G418を含まないMTX含有培養培地(1μM)に細胞を通すことによって開始した。培養の3週後、MTX耐性及び高産生細胞プールを生成した。DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)選択マーカーは、葉酸類似体メトトレキサート(MTX)を培養培地に加えることによって高産生細胞のストリンジェントな選択を可能にし、トランスフェクションプールについての増加した力価を生じる。MTX選択から細胞を回収した後、細胞を凍結させ、FACSクローニング及びスクリーニングの間にわたって培養をMTX含有培地中で継続した。
クローン細胞株(すなわち、単一細胞に由来する細胞株)を得るために、トランスフェクトした細胞のプールを96ウェルプレート中に播種した。トランスフェクトしたプール又は「スーパープール(superpool)」(いくつかのプールを調和した混合物)につき1×107細胞を遠心分離し、5mlの冷やしたPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄し、1mlの冷PBS中に再懸濁した。shRNA及びpZFNでトランスフェクトした細胞について、適切な量のCy5で標識したhIGF−1Ea 3mutを加えた。細胞を暗所で30分間、氷上でインキュベートし、続いて、5mlの冷やしたPBSで2回洗浄し、1mlの冷PBS中に再懸濁した。細胞を濾過し、保存又は/及びクローニングのためにFACSチューブ中に分配した。細胞クローニングをFACS Aria(Becton Dickinson)で実施した。shRNA及びpZFNでトランスフェクトしたCHO細胞は分類された単一細胞であった。ほとんど又は全く機能的でないIGF−1R発現を有する細胞のみを選択するために、5%の最も低いCy5蛍光細胞のみを選択した。標準的な手順を使用して細胞をスケールアップした。個々のクローンを、IGF−1R mRNA発現又はIGF−1Rエクソン3における変異のいずれかについて評価し、培養及び分析後に最も低いIGF−1R mRNA発現又はIGF−1Rノックアウトクローンが保持されている。これらの候補から、hIGF−1Ea 3mut又はrhIGF−1の存在下で適切に成長する細胞株を、ベクターをコードする配列番号23〜29のIGF−1バリアントでのトランスフェクションのために選択した。最も高い産生力を有するクローンを、組換えタンパク質の産生のために選択した。産生力は、通常、培養条件を確立/適合することによって、すなわちバイオプロセスパラメータ(例えば、温度、供給、酸素及び温度変化)によって又はそれを適合することによってさらに改善され得る。
1つのShot Stbl3細菌(Invitrogen、カタログC7373−03)を製造業者の指示書に従ってクローニングされるベクターで形質転換し、適切な濃度の抗生物質を含有するアガロースプレート上に塗布した。使用した抗生物質は、25μg/mlのカナマイシン又は100μg/mlのアンピシリンであった。一晩のインキュベーション後、明確な成長した細菌コロニーを採取し、2mlの抗生物質を含有するLB培養液中で8時間増殖させ、さらに100ml中で15時間増殖させた。製造業者の指示書に従って、Endofree Plasmid Maxiキット(Qiagen、カタログ12362)を使用してDNAベクターを精製した。ゲノム編集を必要とするベクター配列を、ベクター特異的フォワード及びリバースプライマーを使用してサンガーシークエンシングによって検証した。正確な配列を有するベクターをさらに使用した。
細胞培養を標準培地(50ml培養物)中で2×105生存細胞/mlの密度で継代した。適切な量の濾過滅菌した(0.22μmフィルタ)hIGF−1Ea 3mut又はrhIGF−1を50mg/lの最終濃度のために加えた。両方は、CHO−K1及びCHO−DUXB11派生親細胞の細胞成長阻害を誘発した。細胞を標準的な条件下で培養し、細胞生存率及び密度を24時間に基づいて定期的に測定した。
バイオリアクターにおいてIGF−1を発現する形質転換した細胞を培養するために、フェドバッチプロセスを適用した。細胞成長を補助し、生存率を維持することによって産生期を延ばすように供給開始及び温度変化などのプロセス事象の時間を決めた(Niraj Kumar, Patrick Gammell, Martin Clynes (2007) Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture; Cytotechnology (2007) 53:33-46)。
収集手段として、深層濾過、続いて濾過滅菌を用いる標準的な細胞分離技術を適用した。CHO細胞を培養し、当業者に知られている標準的な方法に従って収集した(例えば、Curr. Protoc. Protein Sci. 2001 May;Chapter 5: Unit 5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S; (Mahesh Prashada, Klaus Tarrach (2006) Depth filtration: Cell clarification of bioreactor offloads, Filtration & Separation Volume 43, Issue 7, September 2006, Pages 28-30)。
本発明の教示に係るいくつかのベクター構築物は実現可能である。ベクターの個々のエレメントは従来技術において知られているので、適切なベクターが、例えば、基本的な遺伝エレメントのシークエンシング又は増幅及び適切なクローニング並びに所望の方向における発現カセットによって構築され得る。それぞれのクローニング法は従来技術の水準であり、また、上記の遺伝エレメントの配列も従来技術に記載されている。続いて、ベクター構築物の生成は例として記載されている。しかしながら、それぞれのベクターを得るためのいくつかの他の実施形態及び手段が適しており、容易に利用できることは当業者により理解される。この段落に記載されている全てのプラスミド構築物(例えばpBW679)は、WO2009080720に記載されている哺乳動物発現ベクターに基づく。WO2009080720の実施例の段落、特に図1、表1及び実施例の段落II:ベクター構築物(21〜31ページ)は本明細書に参照として組み込まれる。
6個のセンス(配列番号5〜10)及び6個の対応するアンチセンスヘアピンsiRNA鋳型オリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、製造業者の指示書に従ってpSilencer(商標)2.1−U6 puro発現ベクター(Ambion、品番AM5762)内でライゲーションした。これらのライゲーション産物を、100μg/mlのアンピシリンを使用して実施例6に記載されているように大腸菌(E.Coli)内でクローニングした。6個のshRNAベクターの各々について3個のコロニーを採取し、増殖させた。精製したDNAベクターの配列を、カスタムフォワードプライマー(配列番号46)及びT7リバースプライマー(配列番号47)を使用して検証した。正確なフォワード及びリバース配列を有するDNAベクターを、SspI(NEB、カタログR0132S)で線形化し、イソプロパノール及びエタノール沈殿で精製し、トランスフェクションの前にヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。2つのトランスフェクション複製を、これらの6個のshRNAベクターの各々について実施し(従って12個のプールを生成した)、1つのトランスフェクションをスクランブルshRNA対照(pSilencer(商標)2.1−U6 puro発現ベクターキットに含まれた)について行った。ピューロマイシンを用いてトランスフェクト細胞を選択した(実施例3)。shRNA1、4又は6(配列番号5、8、9)のいずれかに対応する2つのプールをそれぞれスーパープールし、shRNA2、3及び5(配列番号6、7、9)でトランスフェクトした6個全てのプールを、Cy5で標識したhIGF−1Ea 3mutで染色し、FACSを使用した単一細胞クローニングをする前に、スーパープール中で均一に合わせた(実施例5)。
IGF−1Rのエクソン3及び隣接イントロンをCHO−K1及びCHO−DUXB11派生親細胞株(配列番号14/15)中で配列決定した。最初に、エクソン3を、エクソン3及びIGF−1R遺伝子のマウス配列を覆う所有のハムスターcDNA配列に基づいて配列決定した。PCRプライマーを保存部分において設計し、得られたPCR産物を配列決定した。エクソン3配列に基づいて、Sigmaはエクソン3隣接イントロンを配列決定し、2つのZFN標的化IGF−1Rエクソン3を操作した。各ZFNは、それぞれリバース(5’上)、フォワード(3’上)DNA鎖における18ヌクレオチドを標的とし、結合する。2つの結合部位は切断部位の5つのヌクレオチド(配列番号11)によって分離している。産物の詳細及び方法はSigmaから入手可能である(「74188 CompoZr Custom ZFN Tech Bulletin」に記載されている)。Sigmaはまた、周囲のイントロン配列(配列番号12及び13)においてフォワード及びリバースPCRプライマーを設計して、gDNAレベルにおいてIGF−1Rエクソン3を増幅して、501bpのPCR産物を得た。Sigmaは、それぞれリバース(pZFN1)、フォワード(pZFN2)鎖認識操作したZFNをコードする、20〜25μgの2つのDNAベクターを含む、CompoZr(商標)(カスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ、製品番号CSTZFN−1KT、ロット番号08021019MN)を提供した。
(ベクターpBW806(hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A)のクローニング戦略(図11))
hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_AをコードするベクターpBW806を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E _pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A_pMA−T断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW806を得た。
hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_CをコードするベクターpBW807を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARNWC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW807を得た。
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F(Novartis専売のベクター)をコードするベクターpBW808を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARNYC_hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_Fc融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW808を得た。
HIGF1−EA−FC_MUT 04/2_E Fc融合配列をコードする、ベクターpBW809を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARN2C_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW809を得た。
hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_AをコードするベクターpBW810を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARN2C_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW810を得た。
hIGF−1Ea 3mut配列をコードする、ベクター0610900pGA4(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したコードIGF配列を抽出するためにXbaI及びMluIを用いて消化した。並行してpBW165(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するMluI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターpBW410を得た。
hIGF1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、77−fcドメイン配列をコードする、ベクター0905915(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したコードIGF配列を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行してpBW596(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターpBW664を得た。
hIGF1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、R77Q−fcドメイン配列をコードする、ベクター0950919(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したコードIGF配列を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行してpBW596(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターpBW666を得た。
CHO細胞株における組換えIGF−1の発現により、細胞成長阻害及び低力価が生じた。hIGF−1Ea 3mutの最大力価測定は8ug/mlであり、これは100mg/Lの抗体力価(モル質量に基づく)に対応する。バイオリアクタープロセスにおける組換え抗体の平均力価測定は約3g/Lである。IGF−1の低力価の1つの原因はIGF−1発現細胞の低下した細胞成長及び低い細胞生存率である。抗体発現プロセスの間、CHO−K1派生細胞は2×107細胞/mlまで成長し、細胞生存率は、最初の230〜260時間の培養時間の間、97%超である。対照的に、IGF−1を発現するCHO−K1派生細胞は0.5×107細胞/mlまでしか成長せず、細胞生存率は2日後で既に97%未満に低下する(図1を参照のこと)。
本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が前記治療用タンパク質の低力価をもたらし、前記方法が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
a.前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程を含み、前記哺乳動物細胞が、前記同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも1.5倍多い治療用タンパク質を産生する、方法。
[2]
前記治療用タンパク質が成長因子である、請求項1に記載の方法。
[3]
前記成長因子がインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はそのバリアントであり、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損している、請求項2に記載の方法。
[4]
前記哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が、RNA干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[5]
前記哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が前記RNA干渉技術を適用することによって達成され、前記方法が、
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記細胞内に導入する工程であって、前記dsRNA分子が互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNA分子が、前記細胞内に導入すると、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する工程、及び
(b)前記組換え治療用タンパク質遺伝子の前記同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより前記細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、請求項4に記載の方法。
[6]
前記RNA干渉がshRNA分子を使用して達成され、前記方法が、
(a)前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるshRNAを前記細胞内に導入する工程であって、前記shRNAが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)前記同族受容体遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持する工程
を含む、請求項5に記載の方法。
[7]
前記哺乳動物細胞が、CHO、COS、Vero、Hela、BHK、HEK、NS0、C127、ハイブリドーマ、PerC6、CAP及びSp−2/0細胞からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
[8]
前記哺乳動物細胞がCHO−K1派生細胞、CHO−DUXB11派生細胞又はCHO−DG44細胞である、請求項7に記載の方法。
[9]
前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、shRNAの配列が、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
[10]
前記RNA干渉が二本鎖siRNA分子を使用して達成され、前記同族受容体が配列番号44のIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、前記siRNAのセンス鎖の遺伝子配列が配列番号1及び3からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
[11]
配列番号1及び3からなる群から選択されるsiRNAのセンス鎖を含む、dsRNA分子。
[12]
配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される配列を含む、shRNA分子。
[13]
前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、前記IGF−1Rの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によって達成される、請求項4に記載の方法。
[14]
前記成長因子が、配列番号16のヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はそのバリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[15]
a.前記インスリン成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、IGF−1又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.において選択した細胞を、IGF−1タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養する工程、
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、前記哺乳動物細胞が、工程aに記載されているように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1.5倍多いIGF−1又はそのバリアントを産生し、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程を同時に実施することもできる、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[16]
前記治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[17]
インスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントの発現が、このように改変されていない細胞と比較して少なくとも1.5倍高いように遺伝子改変されている哺乳動物細胞であって、前記遺伝子改変により、IGF−1受容体の発現の欠損がもたらされる、哺乳動物細胞。
[18]
前記細胞が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)細胞、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)細胞、ホモサピエンス(Homo sapiens)細胞、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)細胞、ハツカネズミ(Mus musculus)細胞及びオナガザル種(Chlorocebus sp.)細胞からなる群から選択される、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
[19]
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項18に記載の細胞。
[20]
CHO−K1派生細胞、CHO−DUXB11派生細胞又はCHO−DG44細胞である、請求項19に記載の細胞。
[21]
IGF−1受容体の発現の欠損を導く前記遺伝子改変が、RNA干渉技術又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、請求項17〜20に記載の細胞。
[22]
組換え治療用タンパク質を産生するための哺乳動物細胞の使用であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は前記組換え治療用タンパク質の低力価をもたらす、使用。
[23]
前記組換え治療用タンパク質が成長因子である、請求項22に記載の使用。
[24]
前記成長因子がインスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントであり、前記同族受容体がインスリン様成長因子1受容体である、請求項23に記載の使用。
[25]
請求項1〜10、11、14又は15のいずれか一項に記載の方法における、請求項17〜21に記載の細胞の使用。
[26]
前記成長因子が、配列番号23、24、25、26、27、28及び29からなる群から選択されるヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質バリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
Claims (13)
- 組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現するCHO哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、
前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が前記治療用タンパク質の低力価をもたらし、
前記方法が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されているCHO哺乳動物細胞を用いて、
a.前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞が、前記同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも1.5倍多い治療用タンパク質を産生し、
前記治療用タンパク質が、インスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損している、方法。 - 前記CHO哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が、RNA干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が前記RNA干渉技術を適用することによって達成され、前記方法が、
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記細胞内に導入する工程であって、前記dsRNA分子が互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNA分子が、前記細胞内に導入すると、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する工程、及び
(b)前記組換え治療用タンパク質遺伝子の前記同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより前記細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記RNA干渉がshRNA分子を使用して達成され、前記方法が、
(a)前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるshRNAを前記細胞内に導入する工程であって、前記shRNAが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)前記同族受容体遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持する工程
を含む、請求項3に記載の方法。 - 前記CHO哺乳動物細胞がCHO−K1細胞、CHO−DUXB11細胞又はCHO−DG44細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、shRNAの配列が、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される、請求項4または5に記載の方法。
- 前記RNA干渉が二本鎖siRNA分子を使用して達成され、前記同族受容体が配列番号44のIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記siRNAのセンス鎖の遺伝子配列が配列番号1及び3からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記IGF−1Rの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によって達成される、請求項2に記載の方法。
- 前記治療用タンパク質が、配列番号16のヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はそのバリアントである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- a.前記インスリン成長因子1受容体の発現を欠損しているCHO哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、IGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.において選択した細胞を、IGF−1タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養する工程、
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞が、工程aに記載されているように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1.5倍多いIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントを産生し、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程を同時に実施することもできる、
請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え治療用タンパク質を産生するための、CHO哺乳動物細胞を含む組成物であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は前記組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、
前記組換え治療用タンパク質が、インスリン様成長因子1タンパク質又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記同族受容体がインスリン様成長因子1受容体である、組成物。 - 前記治療用タンパク質が、配列番号23、24、25、26、27、28及び29からなる群から選択されるヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質バリアントである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
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