JP6392245B2 - 遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生 - Google Patents

遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生 Download PDF

Info

Publication number
JP6392245B2
JP6392245B2 JP2015548825A JP2015548825A JP6392245B2 JP 6392245 B2 JP6392245 B2 JP 6392245B2 JP 2015548825 A JP2015548825 A JP 2015548825A JP 2015548825 A JP2015548825 A JP 2015548825A JP 6392245 B2 JP6392245 B2 JP 6392245B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
igf
cells
therapeutic protein
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2015548825A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2016507222A (ja
Inventor
フォルナーロ,マーラ
グラス,デイヴィッド
ジョストック,トーマス
ロー,ホルガー
ロマン,サンドリン
Original Assignee
ノバルティス アーゲー
ノバルティス アーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノバルティス アーゲー, ノバルティス アーゲー filed Critical ノバルティス アーゲー
Publication of JP2016507222A publication Critical patent/JP2016507222A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6392245B2 publication Critical patent/JP6392245B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/65Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50Physical structure
    • C12N2310/53Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

本発明は、哺乳動物細胞系において組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質を産生する方法に関する。
治療適用に使用するためのタンパク質様酵素、抗体又はホルモンを産生する必要性は絶えず増加している。現在使用されている最新の異種タンパク質産生系には、大腸菌(E.coli)、酵母、ウイルス、真菌及び昆虫細胞のような原核及び真核細胞系が含まれる。グリコシル化(及び工業的規模の産生が必要とされる場合)などの翻訳後又は翻訳周辺(peri-translational)改変を必要とする組換えタンパク質を産生するために、非常に多くの場合、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)、ホモサピエンス(Homo sapiens)、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)、ハツカネズミ(Mus musculus)及びオナガザル種(Chlorocebus species)由来の細胞を含む哺乳動物細胞系が使用される。哺乳動物細胞系は治療用タンパク質及び抗体のための慣用の産生系となっている。前記細胞は、最近、広範囲に特徴付けられており、それらは極めて高い産生レベルに到達することができ、感染性又はウイルス様粒子を含まないようにすることができ、バイオリアクターにおいて非常に高密度まで成長でき、それらは遺伝子操作され得、形質転換され得る。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、適切なグリコシルトランスフェラーゼのトランスフェクションによってヒトグリカンプロファイルに類似するように操作され得る。組換え産生された成長因子は、治療適用において既に広範に使用されているか、又は新規治療の開発のための有望な候補である。しかしながら、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞株における成長ホルモンの発現は細胞成長阻害及び低力価をもたらし得る。
近い将来において、ますます「非抗体」タンパク質型が製薬会社のパイプラインの部分になるであろう。しかしながら、大規模での成長因子、ホルモン、神経伝達物質及びサイトカインのような細胞外シグナル伝達分子の発現は、低い力価をもたらす成長阻害に起因して哺乳動物細胞株において可能であり得ない。従って、工業的規模において成長因子及び他の治療用タンパク質を産生する適切な方法を得ることが明確に望まれる。
本開示の主題は、治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、
a.前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で治療用タンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程であって、細胞が前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している、工程、及び
b.前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法に関する。
本開示の別の主題は、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
c.治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
d.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法に関する。
本開示の別の実施形態において、方法は、組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記組換え治療用タンパク質を異種産生することに関し、前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が前記哺乳動物細胞の成長遅延及び組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法は、前記組換え治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、構成的又は誘導プロモーターの制御下で異種組換え治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
e.組換え治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
f.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から組換え治療用タンパク質を収集する工程
を含む。
特定の実施形態において、上記のように組換え治療用タンパク質であり得る、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は、同族受容体の発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1.5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多い治療用タンパク質を産生する。
本開示の別の実施形態において、組換え治療用タンパク質であり得る、上述の治療用タンパク質は成長因子である。
さらに別の実施形態において、成長因子はインスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントであり、本開示は、哺乳動物細胞におけるインスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントを産生する方法であって、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損し、その方法が、
a.IGF−1又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1又はそのバリアントを収集する工程
を含み、前記哺乳動物細胞が、IGF1Rの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1,5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多いIGF−1又はそのバリアントを産生する、方法に関する。
本開示の別の実施形態において、組換え治療用タンパク質、例えばインスリン様成長因子1受容体であり得る、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は遺伝子改変されており、前記同族受容体の発現の欠損は、RNA干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される。
本開示の特定の実施形態において、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によってノックアウトされている。
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体の発現の欠損が、RNA干渉を適用することによって達成され、その方法が、
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記細胞内に導入する工程であって、dsRNAが互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、治療用タンパク質の同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAが、前記細胞内に導入すると、組換え治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、上記方法の1つに関する。
本開示の特定の実施形態において、前記治療用タンパク質の同族受容体はインスリン様成長因子1受容体であり、方法は、
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)を前記細胞内に導入する工程であって、dsRNAが互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記哺乳動物細胞のIGF−1RをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAが、前記細胞内に導入すると、IGF−1R遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、工程、及び
(b)IGF−1R遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより細胞内のIGF−1R遺伝子の発現を阻害する工程
を含む。
本開示の上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、上記の方法の別の特定の実施形態において、RNA干渉はshRNA分子を使用することによって達成され、方法は、
(a)組換え治療用タンパク質の同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるshRNAをコードするベクターを前記細胞内に導入する工程であって、前記shRNAが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)前記同族受容体遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持する工程
を含む。
特定の態様において、本開示は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)、ホモサピエンス(Homo sapiens)、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)、ハツカネズミ(Mus musculus)及びオナガザル種(Chlorocebus species)細胞からなる群から選択される、上記方法に関する。別の態様において、哺乳動物細胞は、CHO、COS、Vero、Hela、BHK、HEK、NS0、C127、ハイブリドーマ、PerC6(登録商標)、CAP及びSp−2/0細胞からなる群から選択される。特定の態様において、上記の開示された方法に使用される哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であり、前記CHO細胞は、CHO−K1細胞の派生体、CHO−DUXB11細胞の派生体、CHO−DG44細胞、CHO−SSF3細胞又はCHO−S細胞の派生体であってもよい。
さらなる実施形態において、CHO−DUXB11由来細胞におけるインスリン様成長因子1受容体の発現の欠損は小ヘアピンRNA(shRNA)分子を使用することによって達成され、前記shRNA分子の配列は、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、上記のインスリン様成長因子1受容体の発現の欠損は、二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)分子を使用することによって達成され、前記siRNAのセンス鎖の配列は配列番号1及び3からなる群から選択される配列を含む。
本開示はさらに、配列番号1及び3からなる群から選択されるsiRNAのセンス鎖を含むdsRNA分子に関する。さらなる態様において、本開示は、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される配列を含むshRNA分子に関する。
さらに別の実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現の欠損は標的遺伝子組換え技術を使用してノックアウト細胞を産生することによって達成される。
従って、本開示はまた、同族受容体がIGF−1Rであり、治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、IGF−1Rの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼを使用することによって達成される、上記方法にも関する。
さらなる実施形態において、本開示は、インスリン様成長因子1タンパク質がヒトインスリン様成長因子1タンパク質(配列番号16)又はそのバリアントである、上記方法に関する。
別の実施形態において、上記に開示されている方法は、
a.前記細胞内で産生されるべき目的の治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、目的の治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.において選択した哺乳動物細胞を、目的の前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
を含み、別法として、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもできる。
さらに特定の実施形態において、上記に開示されている方法は、IGF−1、例えばヒトIGF−1(配列番号16)又はそのバリアント(例えば配列番号21〜29)の産生であって、
a.インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、IGF−1、例えばヒトIGF−1又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.の哺乳動物細胞を、IGF−1タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞から前記IGF−1タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもでき、
前記哺乳動物細胞は、IGF−1Rの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1,5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多いIGF−1又はそのバリアントを産生する、産生に関する。
別の態様において、本開示は、成長因子、特にIGF−1タンパク質又はヒトIGF−1(配列番号16)又はそのバリアント(例えば配列番号21〜29)であり得る、治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、上記の方法に関する。
本開示はさらに、インスリン様成長因子1タンパク質、例えばヒトIGF−1(配列番号16)又はそのバリアント(例えば配列番号21〜29)の発現が、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して少なくとも1,5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多いように遺伝子改変されており、前記遺伝子改変がIGF−1受容体の発現の欠損をもたらす、哺乳動物細胞を提供する。
本開示の上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、本開示の別の態様において、上記の哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)細胞、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)細胞、ホモサピエンス(Homo sapiens)細胞、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)細胞、ハツカネズミ(Mus musculus)細胞及びオナガザル種(Chlorocebus species)細胞である。
特定の実施形態において、上記の哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、特にCHO−K1細胞の派生体、CHO−DUXB11細胞の派生体、CHO−DG44細胞、CHO−SSF3細胞又はCHO−S細胞の派生体であり、前記細胞におけるIGF−1受容体の発現の欠損はRNA干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される。
別の態様において、本開示は、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質を産生するための哺乳動物細胞の使用であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は治療用タンパク質の低力価をもたらす、使用に関する。
本開示の別の実施形態は、組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質が成長因子である、上記の使用に関する。
本開示の別の特定の実施形態は、成長因子がインスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントであり、同族受容体がインスリン様成長因子1受容体である、上記の使用に関する。
A:細胞成長:バイオリアクターでの実施における組換え抗体を発現するCHO−K1派生細胞(太字)及びhIGF−1Ea 3mut(配列番号35)を発現するCHO−K1派生細胞(点線)の生存細胞密度(VCD)。B:細胞生存率:バイオリアクターでの実施における生存細胞の百分率(太線、CHO−K1派生クローンを産生する抗体、点線、hIGF−1Ea 3mut発現クローン)。 A:細胞成長:実線はCHO−K1派生細胞の生存細胞密度(VCD)を示す。hIGF−1Ea 3mut又はhIGF−1との共培養の間、細胞成長は阻害される(それぞれ破線及び点線)。3回の生物学的反復の平均を示す(hIGF−1急上昇を除く;エラーバー:標準誤差)。hIGF−1Ea 3mut/hIGF−1は0日目に急上昇した(急上昇実験)。B:細胞生存率:実線はCHO−K1派生細胞の細胞生存率を示し、破線、点線のそれぞれはhIGF−1Ea 3mut/hIGF−1急上昇後の低下した細胞生存率を示す。3回の生物学的反復の平均を示す(hIGF−1急上昇を除く;エラーバー:標準誤差)。細胞生存率は、細胞をhIGF−1Ea 3mut/hIGF−1と同時にインキュベートした場合、2日早く下降する。細胞成長又は細胞生存率においてhIGF−1とhIGF−1Ea 3mutとの差異は検出できなかった。 CHO−DUXB11派生細胞の生存細胞密度(VCD)(太線)及びhIGF−1Ea 3mutとの共培養の間の低下した細胞成長(点線)を示す。IGF−1Rチロシンキナーゼ阻害剤NVPAEW541(アスタリスクを有する太線)を加えた後、細胞成長はわずかに低下する。IGF−1Ea 3mutとの共培養及びIGF−1Rチロシンキナーゼ阻害剤の添加により、さらなる細胞成長阻害は生じなかった(アスタリスクを有する点線)(細胞を、阻害剤を結合させる時間まで、hIGF−1Ea 3mutの急上昇前にNVPAEW541と1時間インキュベートした)。 IGF−1R mRNA発現を、CHO−DUXB11由来親細胞におけるsiRNAトランスフェクション後、リアルタイムRT−PCRによって定量した。トランスフェクション後4日目に、スクランブルsiRNA(100%一致)でトランスフェクトした細胞と比較した、IGF−1Rに対して2つの異なるsiRNAでトランスフェクトした細胞におけるIGF−1R mRNAレベルの百分率。試料のIGF−1R mRNAレベルを正規化した(GAPDH)。 IGF−1R mRNA発現を、CHO−DUXB11由来親細胞(プールレベル)における安定なshRNAトランスフェクション及びピューロマイシン選択後、リアルタイムRT−PCRによって定量した。50ml細胞培養の培養5日目に、スクランブルshRNA(100%一致)でトランスフェクトした細胞と比較した、IGF−1Rに対して6つの異なるshRNAでトランスフェクトした細胞のIGF−1R mRNAレベルの百分率。試料のIGF−1R mRNAレベルをGAPDHに正規化した。shRNA4は、IGF−1R発現を抑制するのに最適な効果を示した。 50mlバッチの培養5日目における、hIGF−1Ea 3mutの存在及び非存在下でのIGF−1Rノックダウンクローン及びCHO−DUXB11由来対照クローン(対照)の生存細胞密度(VCD)が強調される。IGF−1Rノックダウンクローン(shRNA;n=12の最適shRNAクローン)は、親CHO−DUXB11由来対照クローン(n=7)と比較してhIGF−1Ea 3mutの存在下で改善された細胞成長を示す(エラーバー:標準誤差)。 太線において、親CHO−K1派生細胞の生存細胞密度(VCD)、円を有する太線において、hIGF−1Ea 3mutとの共培養の間の低下した細胞成長を示す。破線により、3つのIGF−1R KOクローンの細胞成長平均を示す(エラーバー:標準誤差)。細胞成長は野生型親CHO−K1派生細胞と比較してわずかに改善した。hIGF−1Ea 3mutとの共培養により、少しのみの細胞成長阻害が生じ、細胞成長はhIGF−1Ea 3mut共培養をしていない親CHO−K1派生細胞と同様である。 太線において、親CHO−DUXB11由来細胞の細胞成長、円を有する太線において、hIGF−1Ea 3mutとの共培養の間の低下した細胞成長を示す。破線により、2つのIGF−1R KOクローンの細胞成長平均を示す(エラーバー:標準誤差)。細胞成長は野生型親CHO−DUXB11由来細胞と比較して改善する。hIGF−1Ea 3mutとの共培養により、1つのKOクローンについて細胞成長阻害は生じず、第2のIGF−1R KOクローンについて少しの細胞成長阻害が生じた。 14日のバッチ培養のIGF−1−Fc融合タンパク質力価を示す(プールレベル)。5つの異なる細胞株における7つの異なるIGF−1−Fc融合タンパク質の発現を強調する。IGF−1−Fc融合タンパク質の発現は、CHO−K1又はCHO−DUXB11派生野生型細胞株と比較して、CHO−K1派生IGF−1R−KO細胞株、CHO−DUXB11派生IGF−1R−KO細胞株及びCHO−DUXB11派生shRNA(IGF−1R及びINSRの発現は低下した)細胞株において5〜20倍増加した。 50mlバッチ培養の14日目における、クローンのIGF−1−Fc融合タンパク質力価。IGF−1−Fc融合タンパク質の力価:15個の最適なCHO−DUXB11派生IGF−1R−KOクローンにおけるhIGF−1−Ea−fc_mut 13/2_Aは、IGF−1−Fc融合タンパク質:CHO−DUXB11派生野生型細胞クローンにおけるhIGF−1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、R77Q−fcドメインの力価と比較して約6〜7倍高かった。
一般的定義
本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載される。
約:「約」という用語は、近似的、ほぼ、およそ又はその付近を意味するために本明細書に使用される。「約」という用語が、数値範囲と併せて使用される場合、それは、数値より上及び下の境界を拡大することによって範囲を示すという変更である。一般に、「約」という用語は、30パーセント、好ましくは20パーセントより上又は下(多い又は少ない)の分散によって、述べられている値より上及び下に数値を変更するために本明細書に使用される。本明細書に使用される場合、「又は」という単語は特定のリストの任意の1つの要素を意味する。
同族受容体:本明細書に使用される場合、例えば異種組換え治療用タンパク質の「同族受容体」という用語は、哺乳動物細胞(前記治療用タンパク質の発現に使用される)の内因性受容体を指し、異種組換え治療用タンパク質は前記受容体のリガンドである。つまり、同族受容体は異種組換え治療用タンパク質に特異的に結合し、その結合は前記細胞内で生理反応を誘発する(例えばシグナル伝達反応を誘導する)。
含む:「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」を意味し、例えば、Xを「含む」組成物は、Xのみからなってもよいか、又は追加のもの、例えばX+Yを含んでもよい。
所与の遺伝子の発現の欠損:「所与の遺伝子の発現の欠損」という語句は、遺伝子操作により、細胞内の特定の遺伝子が低下した発現レベルを示す状況を指す。発現レベルは、(i)mRNAの量が前記遺伝子から転写される場合又は(ii)タンパク質の量が前記遺伝子によってコードされる場合又は(iii)遺伝子操作した細胞においてタンパク質の活性が前記遺伝子によってコードされる場合に低下し、遺伝子操作した細胞は、誘導された又は自発的な変異を含み、遺伝子操作していない同じ種類の細胞における前記遺伝子によってコードされるmRNA及び/又はタンパク質の量/活性より少ない。「欠損」及び「低下」という用語は交換可能に使用され、遺伝子発現のレベルが、遺伝子操作していない同じ種類の細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、完全な消滅(例えば同型遺伝子ノックアウト)から10%、20%、又は30%、又は40%、又は50%、又は60%、又は70%、又は80%、又は90%、又は95%の低下又はさらにそれより多い低下(例えば異型ノックアウト、siRNA又はshRNAアプローチ)の範囲である状況を含み、発現レベルはRNA及び/又はタンパク質レベルを決定することによって測定される。所与の遺伝子の発現の欠損はまた、mRNA及び/又はタンパク質が、非機能的形態において又は機能障害を有するが、正常なレベルで発現される状況を指す。
異種:本明細書に使用される場合、組換えタンパク質に関連する場合、「異種」という用語は、細胞が由来する種が、ポリペプチドが由来する種と同じではないことを示す。例えば、組換え治療用タンパク質は、タンパク質がヒトアミノ酸配列を有し、前記タンパク質がCHO細胞において発現される場合、異種組換え治療用タンパク質である。核酸配列に対して「異種」とは、天然でライゲーションされていない、又は天然で異なる位置にライゲーションされている核酸配列(例えばプロモーター)にライゲーションされるヌクレオチド配列も指す。さらに、核酸配列(例えばプロモーター配列)の文脈において、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞に対する「異種」という語句は、前記核酸配列が異なる生物(例えば、非ヒト生物において特定の遺伝子の発現を駆動するために使用されるヒトプロモーター)に由来することを示す。
「阻害」及び「遅延」という用語は、本発明の文脈において交換可能に使用され、哺乳動物細胞成長及び/又は哺乳動物細胞のタンパク質産生が異種タンパク質の発現の結果としてマイナスの影響を及ぼす状況を含む。それ故、細胞成長阻害又は遅延は、例えば、特定の培養時間にわたる細胞培養物中の生存細胞の数、細胞の生存率、全体又は個々のタンパク質の最大到達可能細胞密度及び/又は産生率が、形質転換されていない親細胞株と比較してトランスジェニック細胞において低下している状況を指す。
工業的製造規模:哺乳動物細胞における異種組換えタンパク質産生の文脈において「工業的製造規模」という用語は、バッチ、フェドバッチ又は灌流培養のために使用される従来又はエアリフトバイオリアクターのようなバイオリアクター産生システムを指す。バイオリアクターは、パイロットスケールリアクターについて50リットル〜2,000リットル、エアリフトバイオリアクターについて2,000リットル〜5,000リットル、従来のステンレス鋼撹拌式バイオリアクターについて最大25,000リットルの範囲である。大規模でのポリペプチドの産生は、例えば、ウェーブ、ガラス又はステンレス鋼バイオリアクターにおいて行われてもよい。その目的のために、通常、単一の凍結バイアル、例えばMaster Cell Bank製のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、いくつかの段階で増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適切な量の細胞を接種する。細胞密度は供給溶液及び添加剤をバイオリアクターに加えることによって増加し得る。細胞は長時間高い生存率で維持する。数百ミリグラム/リットルから数グラム/リットルまでの範囲のリアクターにおける産生力価が大規模で達成される。精製は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用又はサイズ排除クロマトグラフィー工程を含み得る、標準的なクロマトグラフィー方法論によって行われ得る。バイオリアクターのサイズは最終規模において最大で数千リットル体積であり得る(例えば、F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398も参照のこと)。上記のシステムにおいて産生されるタンパク質の量は、通常、1g/L〜5g/Lの範囲である。工業的製造規模は、(i)培養時間の間、最大2.5×10細胞/mlの細胞の成長、(ii)200時間超の時間にわたる細胞の培養、それによる維持、(iii)90%超の細胞生存率を可能にする。
インスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアント:「インスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアント」という語句は、インスリン様成長因子−1遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、特に好ましいものは、ヒトインスリン様成長因子1(hIGF−1)タンパク質及びそのバリアントである。IGF−1タンパク質バリアントはIGF−1野生型配列と少なくとも1つのアミノ酸が異なるタンパク質であり、「野生型配列」という用語は、少なくとも1つの天然に存在する生物において利用可能なポリペプチド若しくは遺伝子配列又はヒトにより変化、変異若しくは別様で操作されていないポリペプチド若しくは遺伝子配列を指す。
IGF−1バリアントはまた、ペプチドリーダー配列を含むIGF−1前駆タンパク質又はpro−IGF−1タンパク質である。IGF−1バリアントはまた、IGF−1タンパク質を含む融合タンパク質、例えば、免疫グロブリンFc領域に融合したIGF−1タンパク質を含むタンパク質である。IGF−1バリアントの例は、とりわけ、特許出願WO05033134(stabilized IGF-1 protein fused to an immunoglobulin Fc region)及びWO2007/146689(stabilized IGF-1 precursor proteins)に開示されている。上記のIGF−1バリアントは、このようなタンパク質が野生型IGF−1の機能的等価物としてみなされ得るという意味でその生物活性を保持する。
IGF−1タンパク質に関する機能的等価物は、天然又は人工変異を含むIGF−1タンパク質として理解されなければならない。変異は、IGF−1タンパク質の生物活性を減少しない1つ又は複数の核酸の挿入、欠失又は置換であってもよい。少なくとも80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%超の同一性、非常に特に好ましくは100%未満であるが、少なくとも98%の同一性を有する機能的等価物は、IGF−1野生型タンパク質、例えばヒトIGF−1タンパク質(配列番号16)と同一である。上記の融合タンパク質の場合、100%同一性はこのような融合タンパク質のIGF−1部分に基づいてのみ定義される。インスリン様成長因子(IGF)は、細胞がそれらの生理環境で連絡するために使用する複合系の部分である。この複合系(しばしばインスリン様成長因子軸と称される)は、2つの細胞表面受容体(IGF−1R及びIGF−2R)、2つのリガンド(IGF−1及びIGF−2)、6つの高親和性IGF結合タンパク質(IGFBP1〜6)のファミリー及び関連するIGFBP分解酵素(プロテアーゼ)からなる。この系は、正常な生理の調節だけでなく、多くの病理学的状態にも重要である(Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003)。IGF軸は細胞増殖の促進及び細胞死(アポトーシス)の阻害において役割を果たすことが示されている。IGF−1はヒト成長ホルモン(hGH)による刺激の結果として肝臓によって主に分泌される。ヒトの身体におけるほとんど全ての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺における細胞は、IGF−1による影響を受ける。インスリン様効果に加えて、IGF−1はまた、細胞成長を調節できる。IGF−1及びIGF−2はIGF結合タンパク質として知られている遺伝子産物のファミリーによって調節される。これらのタンパク質は、IGF受容体への結合を阻止することによってIGF作用を阻害すること、及び受容体への送達を補助し、血流中のIGF半減期を増加させることによってIGF作用を促進することの両方を含む複雑な手段でIGF作用を調節するのに役立つ。少なくとも6つの特性付けされた結合タンパク質(IGFBP1〜6)が存在する。IGF−1は広範囲の治療用途に使用される。メカセルミン(商標名Increlex(商標))は成長阻害の治療に承認されているIGF−1の合成類似体である。いくつかの会社が、1型糖尿病、2型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、重度の熱傷及び筋強直性ジストロフィーを含む、種々のさらなる適応症について臨床試験においてIGF−1を評価している。
細胞内への導入:核酸分子(DNA、RNA)を指す場合、「細胞内への導入」とは、基本的に形質転換又はトランスフェクションのプロセスを指す。dsRNAを指す場合、「細胞内への導入」はまた、当業者により理解されるように、細胞内へのdsRNAの摂取又は吸収を促進することを意味することができる。dsRNAの吸収又は摂取は、補助されていない拡散性又は活性のある細胞プロセスを介して、又は助剤若しくは装置によって行われ得る。
哺乳動物細胞:開示されている方法の文脈において「哺乳動物細胞」という用語は、工業的製造規模でタンパク質産生に適切である細胞を指す。これらの細胞は当業者に周知であり、例えば、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)、ホモサピエンス(Homo sapiens)、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)、ハツカネズミ(Mus musculus)及びオナガザル種(Chlorocebus species)に由来する。それぞれの細胞株は、CHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)、COS細胞(サルの腎臓(アフリカミドリザル)に由来する細胞株、Vero細胞(アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞)、Hela細胞(この株はHenrietta Lacksから得た子宮頸癌細胞に由来した)、BHK細胞(ベビーハムスター腎臓細胞、HEK細胞(ヒト胎児腎臓)、NS0細胞(マウス骨髄腫細胞株)、C127細胞(非腫瘍形成性マウス細胞株)、PerC6(登録商標)細胞(ヒト細胞株、Crucell)、CAP細胞(CEVEC’s Amniocyte Production)及びSp−2/0細胞(マウス骨髄腫細胞)として知られている。
RNA干渉:「RNA干渉」又は「RNAi」という用語は当該分野において周知であり、標的遺伝子に相補的な領域を有する「siRNA」又は「低分子干渉リボ核酸」による細胞内の1つ又は複数の標的遺伝子の阻害を意味すると一般に理解される。RNAiを媒介するその能力についてsiRNAを試験するために種々のアッセイが当該分野において知られている(例えば、Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213を参照のこと)。遺伝子発現に対する本発明に係るsiRNAの効果は、典型的に、例えば本明細書に記載されているsiRNA分子で処理されていない細胞と比較して少なくとも10%、30%、50%、90%、95%又は99%阻害される標的遺伝子の発現を生じる。
本発明に係る「siRNA」又は「低分子干渉リボ核酸」は、以下の態様を含む、当該分野において知られている意味を有する:siRNAは生理的条件下で相補領域と一緒にハイブリダイズするリボヌクレオチドの二本鎖からなる。鎖は分離しているが、特定の実施形態においてそれらは分子リンカーによって結合されてもよい。個々のリボヌクレオチドは、改変されていない天然に存在するリボヌクレオチド、改変されていない天然に存在するデオキシリボヌクレオチドであってもよく、又はそれらは本明細書のいずれかの場所に記載されているように化学的に改変若しくは合成されてもよい。
本発明に係るsiRNA分子は標的遺伝子のmRNAの領域と実質的に同一である二本鎖領域を含む。標的遺伝子の対応する配列と100%同一性を有する領域が適切である。この状態は「完全に相補的」と称される。しかしながら、領域はまた、標的化されるmRNAの領域の長さに応じて、標的遺伝子の対応する領域と比較して1つ、2つ又は3つのミスマッチを含有してもよく、それ自体が完全に相補的でなくてもよい。一実施形態において、開示されている方法に使用されるRNA分子は1つの所与の遺伝子を特異的に標的化する。所望のmRNAのみを標的化するために、siRNA試薬は、標的mRNAと100%相同性及び細胞又は生物に存在する全ての他の遺伝子に対して少なくとも2つのミスマッチしたヌクレオチドを有し得る。特異的標的配列の発現を効果的に阻害するために十分な配列同一性を有するsiRNAを分析し、識別する方法は当該分野において知られている。配列同一性は当該分野において知られている配列比較及びアラインメントアルゴリズム(Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991及び本明細書に引用されている参考文献を参照のこと)及び例えば、デフォルトパラメータを使用してBESTFITソフトウェアプログラムに実装されているSmith−Watermanアルゴリズム(例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group)によってヌクレオチド配列間の相違の百分率を計算することによって最適化され得る。
RNAi試薬の効果に影響を与える別の要因は標的遺伝子の標的領域である。RNAi試薬による阻害に効果的な標的遺伝子の領域は実験によって決定され得る。適切なmRNA標的領域はコード領域である。また、5’−UTR、3’−UTR及びスプライス部位などの非翻訳領域も適切である。例えば、Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888に記載されているトランスフェクションアッセイがこの目的のために実施されてもよい。多くの他の適切なアッセイ及び方法が当該分野において存在し、それらは当業者に周知である。
標的と相補的なsiRNAの領域の長さは、本発明によれば、18〜100ヌクレオチド、18〜25ヌクレオチド、18〜22ヌクレオチド又は19ヌクレオチドであってもよい。対応する標的領域に対してミスマッチが存在する場合、相補領域の長さはいくらか長いことが一般に必要とされる。
siRNAは、オーバーハング末端(標的に相補的であってもよく、又はなくてもよい)又は標的遺伝子ではないが、それ自体に相補的なさらなるヌクレオチドを有してもよいので、siRNAの各々の分離鎖の全長は、18〜100ヌクレオチド、18〜49ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド又は18〜25ヌクレオチドであってもよい。
小ヘアピンRNA又は短ヘアピンRNA(shRNA)は、RNA干渉(RNAi)によって標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得る密接なヘアピンターンを生じるRNAの配列である。小ヘアピンRNA(shRNA)はインビボで転写され得、siRNAと同様の対応するmRNAの分解を引き起こし得る(Shi, 2003)。これらの開発は、siRNA二本鎖又はshRNAを発現するベクター(小ヘアピンRNA)が、例えば受容体をコードする遺伝子の発現を遮断するために使用され得るという可能性を高める。小ヘアピンRNAを合成するための調節可能なプロモーターは記載されており、当業者に周知である(例えば、WO05007877A)。
標的遺伝子組換え:本明細書に使用される場合、「標的遺伝子組換え」という用語は、組換えが宿主細胞又は宿主生物内に存在するDNA標的遺伝子座内で発生するプロセスを指す。組換えは相同又は非相同DNAのいずれかを含み得る。標的遺伝子組換えを達成するために、操作したヌクレアーゼによるゲノム編集(GEEN)が適用され得る方法である。広く使用されている操作したヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、再操作したホーミングエンドヌクレアーゼのような操作したメガヌクレアーゼである。相同標的遺伝子組換えの一例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)による宿主DNAの選択した遺伝子座の切断(WO03087341に開示されている)、その後の外因性又は内因性起源のいずれかの相同DNAによる切断したDNAの相同組換えである。非相同標的遺伝子組換えの一例は、ZFNによる宿主DNAの選択した遺伝子座の切断、その後の切断したDNAの非相同末端結合(NHEJ)である。本明細書に使用される場合、「宿主細胞」又は「宿主生物」又は単に「標的宿主」という用語は、本発明の方法に使用される機能を発現するために1つ又は複数の遺伝子を保有するように遺伝的に形質転換されるように選択されている細胞又は生物を指す。宿主はさらに本発明の標的遺伝子組換え又は変異法によって形質転換されている生物又は細胞であってもよい。
治療用タンパク質:「治療用タンパク質」という用語は、ヒト又は獣医学的治療のためのタンパク質を指し、急性又は慢性投与を意図し得る。特に、「治療用タンパク質」は、疾患又は病的状態を有する哺乳動物の治療に使用されるタンパク質である。
形質転換:哺乳動物細胞「の形質転換」/「を形質転換する」又は「形質転換された」という用語は、組換えDNA構築物、例えばタンパク質発現構築物又はshRNA発現構築物の前記哺乳動物細胞内への導入を指す。形質転換は、細胞、例えばCHO細胞のような哺乳動物細胞のゲノム内の組換えDNAを組み込み、安定に維持するプロセスを示す。組換えDNA構築物を安定に維持することは、宿主生物のゲノム内への前記DNA構築物の組込み及び例えば一過性発現ベクターの場合、宿主生物内のベクターの染色体外の存在を含む。「形質転換」という用語は、「トランスフェクション」又は「形質導入」という用語と本明細書において交換可能に使用される。
センス鎖:「センス鎖」という用語は、本明細書に使用される場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むdsRNAの鎖を指す。
発明の詳細な説明
哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は治療用タンパク質の低力価をもたらし得る、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する前記哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質であり得る、前記治療用タンパク質を産生する問題についての解決策が開示される(実施例の段落を参照のこと)。
従って、一態様において、本発明は、治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において、組換えタンパク質であり得る、前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
a.治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、上記方法は、単離した治療用タンパク質を処理する工程を含む。
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし得る、前記治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する前記哺乳動物細胞における構成的又は誘導異種プロモーターの制御下で前記治療用タンパク質を産生する問題についての解決策を提供する(実施例の段落を参照のこと)。
従って、一態様において、本発明は、組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記組換え治療用タンパク質を異種産生する方法であって、前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、その方法が、前記組換え治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、前記哺乳動物細胞に対して異種である構成的又は誘導プロモーターの制御下で異種組換え治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
c.組換え治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
d.工程aにおいて培養した哺乳動物細胞から組換え治療用タンパク質を収集する工程
を含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、上記方法は、単離した治療用タンパク質を処理する工程を含む。
トランスフェクトした哺乳動物細胞、例えばCHO細胞を用いたポリペプチドの大規模産生は、例えば、ウェーブ、ガラス又はステンレス鋼バイオリアクターにおいて行われてもよい。その目的のために、通常、単一の凍結バイアル、例えばMaster Cell Bank製のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、いくつかの段階で増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適切な量の細胞を接種する。細胞密度は供給溶液及び添加剤をバイオリアクターに加えることによって増加し得る。細胞は長時間高い生存率で維持する。数百ミリグラム/リットルから数グラム/リットルまでの範囲のリアクターにおける産生濃度は大規模で達成される。精製は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用又はサイズ排除クロマトグラフィー工程を含み得る、標準的なクロマトグラフィー方法論によって行われ得る。バイオリアクターのサイズは最終規模において最大で数千リットル体積であり得る(例えば、F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398も参照のこと)。
特定の実施形態において、目的の前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は、治療用タンパク質の同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも1,5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多い治療用タンパク質を産生する。
本開示のさらに別の実施形態において、上記のように改変された細胞は、対照集団と比較して、少なくとも5パーセント、又は10パーセント又は15パーセント又は20パーセント又は30パーセント又は40パーセント、又は50パーセント又はそれより多い生存細胞を有する。代替として、又はさらに、改変された細胞は、改変されていない細胞と比較して長時間、細胞生存率を維持する。例えば、改変された細胞は、対照細胞と比較して長時間、特定の百分率の細胞生存率(例えば95パーセント)を維持できる。
別の特定の実施形態において、目的の前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞は、培養時間の間、0.5〜1×10細胞/ml又は1〜1.5×10細胞/ml又は1.5〜2×10細胞/ml又は2〜2.5×10細胞/ml又は3〜3.5×10細胞/ml又はそれより多い細胞密度まで成長する。前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞の生存率は、最初の80〜110時間又は110〜140時間又は140〜170時間又は170〜200時間又は200〜230時間又は230〜260時間又はそれより長い時間の培養時間の間、90%超である。
さらなる実施形態において、目的の前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損し、図10に記載されている条件下で培養した哺乳動物細胞の培養物は、少なくとも0.4g/L又は0.6g/L又は0.8g/L又は1.0g/L又は1.2g/L又は1.4g/L又は1.6g/L又は1.8g/L又は2.0g/L又は2.2g/l又はそれより多い治療用タンパク質を産生する。
別の実施形態において、上述の治療用タンパク質は成長因子である。成長因子は、当該分野において知られており、限定されないが、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、オートクリン運動因子、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮成長因子(EGF)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞成長因子(FGF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、成長分化因子−9(GDF9)、肝細胞成長因子(HGF)、肝癌由来成長因子(HDGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF−8)、神経成長因子(NGF)及び他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、形質転換成長因子アルファ(TGF−α)、形質転換成長因子ベータ(TGF−β)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)、血管内皮成長因子(VEGF)、Wntシグナル伝達経路胎盤成長因子(PlGF)、ウシ胎児成長ホルモン(FBS)、インターロイキン2−(IL2)、IL3−、IL4−、IL5−、IL6−、IL7−成長因子が含まれる。
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらに別の実施形態において、本開示はインスリン様成長因子1又はそのバリアントの産生に関する。その成熟形態において、ソマトメジンとも呼ばれるヒトIGF−1は、培養物中の広範囲の細胞の成長を刺激することが示されている70アミノ酸の小タンパク質である。成熟タンパク質は3つの公知のスプライスバリアントmRNAによって最初にコードされる。各mRNAのオープンリーディングフレームは、70アミノ酸IGF−1(配列番号16)及び特定のIGF−1 mRNAに応じて、C末端における特定のE−ペプチドを含有する前駆タンパク質をコードする。これらのE−ペプチドは、Ea(配列番号17)、Eb(配列番号18)及びEc(配列番号19)ペプチドと呼ばれており、35〜87アミノ酸長の範囲であり、N末端において共通配列領域及びC末端において可変配列領域を包含する。生理学的発現状況において、E−ペプチドは内因性プロテアーゼによって前駆体から切断されて、生物活性があることが知られている成熟70アミノ酸IGF−1を生じる。IGF−1タンパク質は、インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)、インスリン様成長因子2受容体(IGF−2R)及びインスリン受容体(INSR)に結合する。IGF−1は酵母及び大腸菌(E.coli)の両方を使用して大規模で組換えにより製造されている。IGF−1は、このタンパク質が患者の血清中の内因性プロテアーゼによって迅速に分解されるので、不十分な薬物候補である。前記不都合な点を克服するために異なる戦略が適用されている。WO05033134は、免疫グロブリンFc領域に融合した安定化されたIGF−1タンパク質を開示している。WO2007/146689は、プロテアーゼによるIGF−1由来のE−ペプチドの切断が低下している、安定化されたIGF−1前駆タンパク質を開示している。WO2005033134及びWO2007/146689に開示されている教示はインビボでIGF−1バリアントを安定化するために使用され得るが、それらは、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞株における組換えIGF−1又はそのバリアントの発現が、細胞成長阻害及び低力価をもたらすという問題を解決していない(実施例の段落を参照のこと)。
本発明の教示は、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞において組換えIGF−1又はそのバリアントを産生する方法であって、前記哺乳動物細胞は機能的インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損しており、その方法が、
a.インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.IGF−1又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで工程a.の細胞を形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.IGF−1又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で工程c.において選択した細胞を培養する工程、及び
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1又はそのバリアントを収集する工程
を含み、別法として、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程は同時に実施することもできる、方法を提供する。
特定の実施形態において、上記方法は、単離した治療用タンパク質を処理する工程を含む。
特定の実施形態において、工程a.からe.において上記のように産生し、培養した場合、インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損している哺乳動物細胞は、工程a.に記載されているように改変されていない(IGF−1Rの発現を欠損していない)が、上記の工程b.に記載されているように形質転換されている細胞より、少なくとも1.5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多いIGF−1又はそのバリアントを産生する。別の特定の実施形態において、上記のようにIGF−1Rの発現を欠損している哺乳動物細胞は、培養時間の間、0.5〜1×10細胞/ml又は1〜1.5×10細胞/ml又は1.5〜2×10細胞/ml又は2〜2.5×10又は3〜3.5×10細胞/ml又はそれより多くまで成長する。IGF−1Rの発現を欠損している哺乳動物細胞の生存率は、最初の80〜110時間又は110〜140時間又は140〜170時間又は170〜200時間又は200〜230時間又は230〜260時間の培養時間の間、97%超である。
さらなる実施形態において、本明細書に記載されており、開示されているように培養したIGF−1Rの発現を欠損している哺乳動物細胞の培養物は、少なくとも1g/L又は1.2g/L又は1.4g/L又は1.6g/L又は1.8g/L又は2g/L又は2.2g/L又は2.4g/L又は2.6g/L又は2.8g/L又は3g/l又はそれより多いIGF−1又はそのバリアントを産生する。
遺伝子改変細胞の形質転換、選択及び培養を含む、特定の遺伝子、例えばインスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞の産生は、微生物及び哺乳動物系について開発された古典的分子生物学の周知の全般的なパラダイムに従い、確立された技術であり、当業者に周知である。CHOノックアウト細胞は今世紀の初めに先行技術において既に記載されている(Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436を参照のこと)。以下の方法は特定の遺伝子の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生するために使用され得る:
相同組換えによる遺伝子標的
相同組換えは、特定の遺伝子の発現を欠損している(例えば遺伝子ノックアウト)哺乳動物細胞を得るための1つの手段である。この技術は、原則として、非標的法より特異的であるが、相同組換えの頻度は非常に低く、工業的な細胞株操作に適用できない(Vasquez KM, Marburger K, Intody Z, Wilson JH (2001) Manipulating the mammalian genome by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA 98(15): 8403-8410)。結果として、多くのクローンのスクリーニング及び分析がノックアウト細胞を識別するために必要とされる。この手順の成功例はCHO−DG44細胞におけるα1,6−フコシルトランスフェラーゼのノックアウトである(Yamane-Ohnuki N, Kinoshita S, Inoue-Urakubo M, Kusunoki M, Iida S, Nakano R, Wakitani M, Niwa R, Sakurada M, Uchida K, Shitara K, Satoh M (2004) Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng 87(5):614-622)。
二本鎖切断が相同組換えの発生を高めるためにメガヌクレアーゼによって導入され得る。メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼ)は、12〜45bpの長いDNA配列を認識する(Paques F, Duchateau P (2007) Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr Gene Ther 7(1):49-66)。I−SceI及びI−CreIが集中的に研究されているメガヌクレアーゼである(Epinat JC, Arnould S, Chames P, Rochaix P, Desfontaines D, Puzin C, Patin A, Zanghellini A, Paques F, Lacroix E (2003) A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res 31(11):2952-2962)。
操作されたメガヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断
メガヌクレアーゼは大きな認識部位(12〜40塩基対)によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、結果として、この部位は、一般的に、任意の所与のゲノムにおいて1回のみ発生する。メガヌクレアーゼは、高度に標的化された手段で配列を置換、除去又は改変するために使用され得る「分子DNAハサミ」である。タンパク質操作を介してそれらの認識配列を改変することによって、標的配列は変化され得る。研究及びゲノム操作に最も広範に使用されている最適な特徴付けられたエンドヌクレアーゼには、I−SceI、I−CreI及びI−DmoIが含まれる。大部分のメガヌクレアーゼは、ホモダイマー又は内部対称モノマーである。触媒ドメインを含有するDNA結合部位は切断点のいずれかの側における2つの部分から構成される。
これまで、種々の単細胞生物由来の約600個のメガヌクレアーゼが識別され、配列決定されている。これは、認識可能なDNA配列の数がゲノムカスタマイズ適用について非常に制限されていることを示す。この制限を克服するために、例えば、Cellectisのような会社は、目的の各遺伝子についての標的部位に特異的であるようにメガヌクレアーゼを操作している。メガヌクレアーゼの高度の特異性により、それらは高度の正確性及び低い細胞毒性を与えられる。
DNA二本鎖切断が(例えばメガヌクレアーゼを使用することによって)行われた後、「非相同末端結合」が生じる。「非相同末端結合」はDNAにおける二本鎖切断を修復する細胞の自然なプロセスである。切断したDNA末端は、相同組換えと対照的に、相同鋳型を必要とせずに、直接、再ライゲーションされる。「非相同末端結合」のエラープローン性質に起因して、一部の割合の二本鎖切断はヌクレオチドの付加及び/又は欠失によって修復過誤になる。ゲノム配列内のこれらの変異は二本鎖切断の部位において生じ、遺伝子機能の喪失をもたらし、従って、遺伝子ノックアウトを達成する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断
ジンクフィンガーヌクレアーゼは哺乳動物ノックアウト細胞を産生するための非常に有用な手段である。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されたジンクフィンガードメイン、短いリンカー及び配列特異的DNA二本鎖切断を導入している改変されたFokIエンドヌクレアーゼドメインから構成される。ジンクフィンガードメイン内の残基を変化させることによって、異なるDNA結合特異性を有する新たなジンクフィンガーヌクレアーゼが産生され得る(Bibikova M, Beumer K, Trautman JK, Carroll D (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300 (5620):764; Cathomen T, Joung JK (2008) Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. Mol Ther 16(7):1200-1207)。ジンクフィンガーヌクレアーゼは任意の所望のゲノム部位を標的化するように設計され得るので、ジンクフィンガードメインは切断位置を誘導し、他の遺伝子標的プロセスより有益である。当業者は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び遺伝子標的化におけるそれらの適用を扱っている多数の科学出版物を知っている(Remy S, Tesson L, Menoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I (2010) Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals. Transgenic Res 19(3):363-371; Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436; Kandavelou K, Ramalingam S, London V, Mani M, Wu J, Alexeev V, Civin CI, Chandrasegaran S (2009) Targeted manipulation of mammalian genomes using designed zinc finger nucleases. Biochem Biophys Res Commun 388(1):56-61; Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus S, Jamieson AC, Porteus MH, Gregory PD, Holmes MC (2005) Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 435(7042):646-651;)。
ジンクフィンガーヌクレアーゼによって触媒されるDNA二本鎖切断は、2つの異なるDNA修復経路、すなわち、相同組換え又は非相同末端結合を活性化できる。相同組換えは、好ましくは、多量の適切なドナーDNAが利用可能であり、ゲノム内への新たなDNAの導入を可能にする場合、活性化される(Bibikova M, Beumer K, Trautman JK, Carroll D (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300 (5620):764))。
DNA修復の非相同末端結合は、切断したDNA末端の再ライゲーションを単純に利用している。いくつかの場合、ヌクレオチドの挿入又は欠失が行われてもよく、その後、元のセグメントと比較して異なる配列を導く。その結果、フレームシフト又はナンセンスコドンが起こり、転写の間、切断した又は異常なmRNAを生じる。カスタマイズされたジンクフィンガーヌクレアーゼはいくつかの手段において産生され得る(Beerli RR, Barbas CF 3rd (2002) Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors. Nat Biotechnol 20(2):135-141); Foley JE, Yeh JR, Maeder ML, Reyon D, Sander JD, Peterson RT, Joung JK (2009) Rapid mutation of endogenous zebrafish genes using zinc finger nucleases made by Oligomerized Pool ENgineering (OPEN). PLoS ONE 4(2):e4348)。カスタマイズされたジンクフィンガーヌクレアーゼは、Sangamo Biosciences/Sigma−Aldrichから購入できる。ジンクフィンガーヌクレアーゼを生成する原理は、Cathomen T, Joung JK (2008) Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. Mol Ther 16(7):1200-12078)に開示されている。別のアプローチは、「Zinc Finger Consortium」(www.zincfingers.org)によって提供されている自由にアクセス可能なオリゴマー化プール操作(OPEN)プラットフォームを使用する。このプラットフォームは標的DNA配列に基づいて組換えられているジンクフィンガープールアーカイブを使用する。その後、組換えられたジンクフィンガーは細菌2ハイブリッドシステムを介してスクリーニングされる。成功した結合はレポーター遺伝子の発現によって測定される(Maeder ML, Thibodeau-Beganny S, Osiak A, Wright DA, Anthony RM, Eichtinger M, Jiang T, Foley JE, Winfrey RJ, Townsend JA, Unger-Wallace E, Sander JD, Muller-Lerch F, Fu F, Pearlberg J, Gobel C, Dassie JP, Pruett-Miller SM, Porteus MH, Sgroi DC, Iafrate AJ, Dobbs D, McCray PB Jr, Cathomen T, Voytas DF, Joung JK (2008) Rapid “open-source” engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Mol Cell 31(2):294-301 Foley et al. 2009; Maeder et al. 2008)。ジンクフィンガー技術は、Kramer et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 88:425-436の表1に示されているように操作している細胞株において既に首尾良く適用されている。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって生成される人工の制限酵素である。TALエフェクターはキサントモナス(Xanthomonas)細菌によって分泌されるタンパク質である。DNA結合ドメインは第12及び第13アミノ酸を除いて高度に保存された33〜34アミノ酸配列を含有する。これらの2つの位置は非常に変わりやすく、特異的ヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。アミノ酸配列とDNA認識との間のこの簡単な関係は、適切な反復可変2残基(Repeat Variable Diresidue)(RVD)を含有する反復セグメントの組合せを選択することによって特異的DNA結合ドメインの操作を可能にする。従って、TALEのDNA認識の機構は簡単なコードに基づき、それにより1つのRVDはDNA配列の1つのヌクレオチドを認識し、各TALEのDNA結合ドメインが、高精度で大きな認識部位(15〜30nt)を標的化できることを確実にする。TALエフェクターヌクレアーゼの第2の成分は、DNA二本鎖切断を導入し、TALE DNA結合ドメイン(FokI)に融合しているエンドヌクレアーゼの触媒ドメインである。TALENは対で機能するので、2つの高度に配列特異的なTALEN単位から構成されるヘテロダイマーである。これらの単位は標的DNA配列に結合し、エンドヌクレアーゼドメインをダイマー化できるスペーサー領域を生じ、DNA二本鎖切断を生じる。DNA切断後、DNA二本鎖切断は非相同末端結合(NHEJ)によって修復される。NHEJは、2つの端部を一緒に結合し、いくつかの例において、塩基対の欠失又は挿入を導き、フレームシフトを産生し、タンパク質の産生を阻止することによって修復する。
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)に基づいたゲノム操作は、哺乳動物細胞のゲノム内へのDNA配列の挿入、欠失又は置換を可能にするrAAVベクターの使用についての中心となるゲノム編集プラットフォームである。相同組換え、天然DNAが機構を修復するという発見に基づく技術が、正確なゲノム変更を実施するために利用され得る。この技術は、タンパク質の生物製造のための生物産生細胞株を最適化するために細胞株を操作する際の使用として採用されている。
rAAVゲノムは、約4.7キロベース長である一本鎖デオキシリボ核酸から構築される。これらの一本鎖DNAウイルスベクターは、高い形質導入率を有し、例えば、ZFN又はTALEN技術のようにゲノム内の二本鎖DNAを切断せずに内因性HRを刺激する特異的性質を有する。rAAVベクターは任意の標的ゲノム遺伝子座に設計され得、例えば遺伝子ノックアウトを実施できる。rAAVは単一の対立遺伝子を一度に標的化する。
遺伝子を抑制するための別の選択肢は、例えば、KRAB又はSID転写抑制ドメインと融合したTALエフェクターを作製した、Garg A, Lohmueller JJ, Silver PA, Armel TZ. (Nucleic Acids Res. 2012 Aug;40(15):7584-95. Engineering synthetic TAL effectors with orthogonal target sites)及びZhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P (Nat Biotechnol. 2011 Feb;29(2):149-53. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription)によって報告されているTALリプレッサーである。TAL DNA結合ドメインの両方の末端又はN−若しくはC−末端に位置しているKRABは、レポータープラスミドの90%超の抑制を表したことが示された。
それ故、本開示の別の態様は、上記に開示されている、治療用タンパク質を産生する方法であって、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現を欠損している細胞が、標的遺伝子組換え技術を適用することによって産生されている、方法に関する。
RNA干渉
RNAiプロセスは極めて詳細に従来技術において記載されている:
Carthew RW, Sontheimer EJ (2009) Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136(4):642-655;
Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA (2003) Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 4(6):457-467;
Kim DH, Rossi JJ (2007) Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet 8(3):173-184;
Siomi H, Siomi MC (2009) On the road to reading the RNAinterference code. Nature 457(7228):396-404;
Wu SC (2009) RNA interference technology to improve recombinant protein production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Adv 27(4):417-422.
Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411(6836):494-498.
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
例えば、siRNAが、CHO細胞において、アポトーシスカスケードに関連するタンパク質である、タンパク質Requiem(Wong DC, Wong KT, Nissom PM, Heng CK, Yap MG (2006b) Targeting early apoptotic genes in batch and fed-batch CHO cell cultures. Biotechnol Bioeng 95(3):350-361)並びにカスパーゼ3及び7(Sung YH, Lee JS, Park SH, Koo J, Lee GM (2007) Influence of co-down-regulation of caspase-3 and caspase-7 by siRNAs on sodium butyrate-induced apoptotic cell death of Chinese hamster ovary cells producing thrombopoietin. Metab Eng 9(5-6):452-464)をサイレンシングするために使用された。
特定の実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞において、組換え治療用タンパク質、例えば、目的の治療用タンパク質がIGF−1タンパク質又はそのバリアントである場合、インスリン様成長因子1受容体であり得る、前記治療用タンパク質の同族受容体の発現の欠損が、RNA干渉を適用することによって達成される、上記の方法の1つであって、その方法が、
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)を前記細胞内に導入する工程であって、dsRNAが互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、治療用タンパク質の同族受容体、例えばIGF−1RをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAが、前記細胞内に導入すると、治療用タンパク質の同族受容体、例えばIGF−1R遺伝子をコードする遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、工程、及び
(b)治療用タンパク質の同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより細胞内の前記受容体、例えばIGF−1Rの発現を阻害する工程
を含む、方法に関する。
「サイレンス」及び「の発現を阻害する」という用語は、それらがIGF−1R遺伝子を指す限り、正常(未処理)細胞と比較して、転写された又は利用可能であるmRNAの量の低下によって現れる、IGF−1Rを標的とするdsRNA又はshRNAで処理した細胞内のIGF−1Rの発現の少なくとも部分的な抑制を指す。この尺度は、このように処理されていないが、第1の細胞又は細胞の群と実質的に同一である第2の細胞又は細胞の群(対照細胞)に対して、処理細胞(IGF−1R遺伝子の発現が阻害されるように処理されている最初の細胞又は細胞の群から単離され得る)内のmRNAレベルを比較することによって決定され得る。阻害の程度は通常
の観点から表される。
或いは、阻害の程度は、遺伝子転写に機能的に関連しているパラメータ、例えば、ポリペプチドの量、又はIGF−1Rに関連する特定の表現型を示す細胞の数の低下の観点から与えられ得る。例えば、特定の例において、IGF−1R遺伝子の発現は、それが、IGF−1R特異的dsRNA又はshRNAの投与によって少なくとも約20%、25%、35%、又は50%抑制される場合、阻害される。いくつかの実施形態において、IGF−1R遺伝子は、IGF−1R特異的dsRNA又はshRNAの投与によって少なくとも約60%、70%、又は80%抑制される。いくつかの実施形態において、IGF−1R遺伝子は、IGF−1R特異的dsRNA又はshRNAの投与によって少なくとも約85%、90%、又は95%抑制される。
dsRNAは二本鎖構造を形成するためにハイブリダイズするのに十分に相補的である2つのRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、IGF−1R遺伝子の遺伝子産物の配列に由来する標的配列に対して、実質的に相補的、及びほぼ完全に相補的である相補性の領域を含み、他方の鎖(センス鎖)は、適切な条件下で組み合わせた場合、2つの鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である領域を含む。一般的には、二本鎖構造は15から30の間、より一般的には18から25の間、さらにより一般的には19から24の間、最も一般的には19から21の間の塩基対長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、15から30の間、より一般的には18から25の間、さらにより一般的には19から24の間、最も一般的には19から21の間のヌクレオチド長である。dsRNAは平滑末端されてもよく(例えば、いずれかの鎖における各ヌクレオチドが、他方の鎖における塩基対に適したヌクレオチドを有する場合)、又はそれは、一般的に3’末端に1つ若しくは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含んでもよい。dsRNAは、以下にさらに説明されている当該分野において公知の標準的な方法によって、例えば、Biosearch,Applied Biosystems,Incから市販されているような自動DNA合成装置の使用によって合成され得る。
さらなる実施形態において、上記のインスリン様成長因子1受容体の発現の欠損は、二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)分子を使用することによって達成され、前記siRNAのセンス鎖の配列は配列番号1及び3からなる群から選択される配列を含む。
さらなる実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現の欠損は、小ヘアピンRNA(shRNA)分子を使用することによって達成され、前記shRNA分子の配列は、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される。
本明細書に開示されている標的遺伝子組換え技術若しくはRNA干渉アプローチ又は上述の先行技術に記載されているものが、目的の組換え治療用タンパク質であり得る、治療用タンパク質の同族受容体、例えば、インスリン様成長因子1受容体のような成長因子の発現を欠損している、組換え哺乳動物細胞、例えばCHO細胞を産生するために適用され得る(実施例の段落を参照のこと)。
トランスジェニック哺乳動物細胞の産生
当業者は、遺伝子改変された哺乳動物細胞、例えばCHO−K1派生体、CHO−DUXB11派生体又はCHO−DG44細胞のようなCHO細胞を形質転換し、選択し、培養する方法を知っている。選択プロトコルが、成長因子、例えばIGF−1のような所望の治療タンパク質をコードする組換えDNAを組み込んでいる可能性のある細胞の選択を容易にするために通常使用されている。形質転換ベクターに同時に組み込まれた遺伝子によって付与される抗生物質耐性又は栄養選択培地中で成長する能力が通常使用される(Weber, W. and Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Amsterdam, pp. 589-604を参照のこと)(Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi)。組換えタンパク質産生のための2つの最も一般的なCHO発現系は、シヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)系メトトレキサート(MTX)選択又はグルタミン合成酵素(GS)系メチオニンスルホキシイミン(MSX)選択を利用する(Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb; 74(2):127-38. Epub 2009 Oct 22. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production)。
外来DNAの組込み部位は発現のレベルに明確に影響を与える。Crew/loxPシステムを使用したゲノムの高度に転写活性のある領域内への外来遺伝子の組込みが記載されている(Kwaks, T. and Otte, A. (2006) Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. Trends Biotechnol., 24(3), 137-142.)。この特異的部位への任意の外来導入遺伝子の組込みが高産生クローンを生じると仮定すると、標的組込みは相互の部位特異的組込みにより達成され得る(Baer, A. and Bode, J. (2001) Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol., 12, 473-480.)。
さらに、その組込み部位に関係なく、外来DNAをより転写活性にするのに役立つ短いヌクレオチド配列が導入遺伝子に連結している。STARエレメント(安定化及び抗リプレッサーエレメント)は、ヒストン脱アセチル化パターンの範囲及び挿入された導入遺伝子に近接するメチル化の広がりを減少させる(Kwaks, T.; Barnett, P.; Hemrika, W.; Siersma, T.; Sewalt, R. Satijn, D.; Brons, J.; van Blokland, R.; Kruckeberg, A.; Kelder, A. and Otte, W. (2003) Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nat.Biotechnol., 21, 553-558.)。骨格/マトリクス関連領域は核マトリクスと相互作用し、遺伝子発現が調整され、抑制から保護されるループを生じ(Girod, P.; Zahn-Zabal, M.and Mermod, N. (2005) MAR elements as tools to increase protein production by CHO cells, in Animal cell technology meets genomics; Godia, M.F. and Fussenegges, M., Ed., Springer: Amsterdam, pp. 411-415; Girod, P.; Zahn-Zabal, M. and Mermod, N. (2005) Use of the chicken lysozyme 5' matrix attachment region to generate high producer CHO cell lines. Biotechnol. Bioeng., 91(1), 1-11.)、一方、UCOEエレメント(遍在性クロマチンオープニングエレメント)は高度に転写活性のある環境を生じる[(Benton, T.; Chen, T.; McEntree, M.; Fox, B.; King, D.; Crombie, R.; Thomas, T. and Bebbington, C. (2002) The use of UCOE vectors in combination with a preadapted serum free, suspension cell line allows for rapid production of large quantities of protein. Cytotechnology, 38, 43-46.)。
哺乳動物細胞、特にCHO及びDHFR遺伝子欠損CHO細胞などの齧歯動物細胞においてポリペプチドを産生するのに特に適しているベクターは特許出願WO09080720Aに開示されている。哺乳動物宿主細胞内に発現ベクターを導入するための従来技術において知られているいくつかの適切な方法が存在する。それぞれの方法は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃により及びポリマーにより媒介される遺伝子導入を含む。適切な宿主細胞は上記されている。宿主細胞内への発現ベクター核酸の導入後、得られた形質転換体を、発現カセット(MSM)内に含まれる哺乳動物選択可能マーカー遺伝子の発現をアッセイするのに適した選択的条件下で培養する。これは、例えば哺乳動物選択可能マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、形質転換体が、哺乳動物細胞内で対応する抗生物質活性を含有する培地中で培養され、このような条件下で生存する形質転換体が選択され、それによりマーカー遺伝子を発現する形質転換体の取得を可能にし、それによりベクターが組み込まれていることを意味する。さらに、第2の選択工程は、発現カセット(MASM)に含まれる増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を選択するのに適合された選択培地中で形質転換体を培養することによって実施され得る。例えばDHFRが増幅可能な選択可能マーカー遺伝子として使用される場合、形質転換体はDHFR阻害剤の存在下でヌクレオチド又はプリンを含まない培地中で培養され得る。誘導プロモーターが少なくとも1つの発現カセットに使用される場合、対応する誘導シグナルはポリペプチドの発現を開始するために提供されるべきである。DHFR選択/増幅系を使用するために、前記宿主細胞は、DHFR阻害剤の存在下で培養され得る。適切なDHFR阻害剤は例えばMTXなどの抗葉酸剤である。使用される抗葉酸剤/MTXの濃度は宿主細胞及びベクター内に組み込まれたDHFRバリアントに依存する。濃度範囲は、例えば約5nM〜20nMの範囲の値から500nM〜1000nMの値又は二次若しくはさらなる増幅工程のためにさらに高い値にてDHFR”宿主細胞において多工程の増幅手順のために選択され得る。DHFR+について、細胞開始濃度は、最初の工程において100nM〜750nM、好ましくは500nM、さらなる増幅工程について500nM〜1000nM及びそれ以上の範囲で通常高い。適切なDHFRバリアントは上記されている。
GS選択/増幅系を使用するために、前記宿主細胞は例えばMSXの存在下で培養され得る。使用されるMSXの濃度は宿主細胞に依存する。濃度範囲は、約15〜150マイクロモル、20〜100マイクロモル及び25〜50マイクロモルの間で選択され得る。これらの範囲はNSO及びCHO細胞に特に適している。
次の工程において、治療用タンパク質は細胞培養物から単離/収集され得る。治療用タンパク質は宿主細胞を破壊することによって得られ得る。治療用タンパク質はまた、発現され得、例えば、培養培地中に分泌され得、そこから得られ得る。また、それぞれの方法の組合せも可能である。それによって、産物、特にポリペプチドが産生され得、高収率で効果的に得られ/単離され得る。得られた治療用タンパク質はまた、所望の質で目的の産物を産生するために、例えば精製及び/又は改変工程などのさらなる処理工程に供されてもよい。
1つの代替によれば、目的の前記ポリペプチドは細胞培養培地中に分泌され、その後、細胞培養培地から単離される。
CHO細胞は当業者に公知の標準的な方法に従って培養され、収集される(例えば、Curr. Protoc. Protein Sci. 2001 May;Chapter 5: Unit5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S.; CHO cultivation media are furthermore described in Journal of Biotechnology, Volume 108, Issue 3, 18 March 2004, Pages 279-292: Serum- and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11. Martin Schroder, Kathrin Matischak, Peter Friedl。
さらなる実施形態において、本開示は、インスリン様成長因子1タンパク質がヒトインスリン様成長因子1タンパク質(配列番号16)又はそのバリアントである、上記の方法に関する。例えば、このような配列には、限定されないが、以下の配列が含まれる:
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる:
アミノ酸G42がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸が以下である、ヒトIGF−1 Ea−ペプチド前駆タンパク質を含むポリペプチド。
(1)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(2)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(3)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(4)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(5)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(6)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(7)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(8)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(9)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(10)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R77がグルタミン(Q)に変異している。
(11)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R77がグルタミン(Q)に変異している。
(17)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(19)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(22)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(25)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(27)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(1a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(2a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(3a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(4a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(5a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(6a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(7a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(8a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(9a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(10a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(11a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(17a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(19a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(22a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72 72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(25a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(27a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29a)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
さらに、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントは、上記ポリペプチド(1)〜(29a)の1つであって、1〜3位にて変異している代わりに前記分子が、アミノ酸E3のみが欠失している、タンパク質に関する(例えば、分子(28a)はまた、ヒトIGF−1 Ea−ペプチド前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、アミノ酸G42がアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している、ポリペプチドを指すことができる)。
さらに、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントは、ヒトIGF−1前駆タンパク質を含有する、すなわち、免疫グロブリンFc領域に融合しているヒトIGF−1由来のEa−ペプチドを含む、ポリペプチドであって、42位におけるアミノ酸グリシンが別のアミノ酸によって置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号16に対応する、ポリペプチドである。E−ペプチドは、Ea、Eb又はEcペプチド(配列番号17〜19)であってもよく、42位におけるグリシンが置換されているアミノ酸はセリンである。
従って、一実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントは、ヒトIGF−1前駆タンパク質を含むポリペプチドであって、(a)アミノ酸G42がアミノ酸セリンによって置換されており、(b)免疫グロブリンFc領域、特に改変されたFc領域、特にFc受容体へのその結合を調節するように改変されているFc領域に連結している、ポリペプチドに関する。例えば、1つ又は複数のアミノ酸は、Fc領域がFc受容体又は相補体のC1成分に対して変化した親和性を有するように、異なるアミノ酸残基と置き換えてもよい。いわゆる発現停止した免疫グロブリンFc領域が当該分野において記載されている:LALA及びN297A(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691);及びD265A(Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W.,上記)。サイレントFc IgG1抗体の例は、IgG1 Fcアミノ酸配列におけるL234A及びL235A変異を含む、いわゆるLALA変異体を含む。サイレントIgG1抗体の別の例はD265A変異を含む。別のサイレントIgG1抗体はN297A変異を含み、これにより、無グルコシル化(aglycosylated)/非グリコシル化(non-glycosylated)抗体が得られる。
上述のLALAアプローチは、両方、Winterらによる、US5,624,821及びUS5,648,260にさらに詳細に記載されている。従って、一実施形態において、開示されているhIGF−1前駆タンパク質は、L234A及びL235A変異又はD265A変異又はN297A変異を含むFc領域に融合している。このようなFc LALA、D265A又はN297A構築物はADCC活性を低下させる。
従って、一実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントは、免疫グロブリンFc領域に融合したヒトIGF−1 Ea−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、42位におけるアミノ酸グリシンがセリンに置換され、バリアントが、アミノ酸G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104及び/又はM105にてさらなる欠失及び/又は変異をさらに含み、アミノ酸の番号付けが配列番号20に対応する、ポリペプチドである。
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる:
免疫グロブリンFc領域に融合したヒトIGF−1 Ea−ペプチド前駆タンパク質を含有するポリペプチドであって、42位におけるアミノ酸グリシンがアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号20に対応し、アミノ酸が以下である、ポリペプチド
(1b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(2b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(3b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(4b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(5b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(6b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(7b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(8b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(9b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失している。
(10b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(11b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R77がグルタミン(Q)に変異している。
(17b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(19b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(22b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(25b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(27b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29b)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(1c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(2c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(3c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(4c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(5c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(6c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(7c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(8c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(9c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失している。
(10c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(11c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(12c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36が置換され又は欠失しており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びQ104がグルタミン(Q)に変異している。
(13c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(14c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(15c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(16c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(17c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(18c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がグルタミン酸(E)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。(19c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(20c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(21c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がアラニン(A)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミンに変異している。
(22c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(23c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72 72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(24c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R37がプロリン(P)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(25c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74がグルタミン(Q)に変異している。
(26c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
27c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74及びR77がグルタミン(Q)に変異している。
(28c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
(29c)G1、P2、E3が欠失しており、アミノ酸R36がグルタミン(Q)によって置換されており、R37がアラニンによって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している。
別の実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントは、上記のポリペプチド(1b)〜(29c)を含むタンパク質であって、1〜3位にて変異している代わりに、前記分子が、アミノ酸E3のみが欠失している、タンパク質に関する(例えば、分子(28c)はまた、免疫グロブリンFc領域に融合したヒトIGF−1前駆タンパク質を含む、ポリペプチドであって、アミノ酸G42がアミノ酸のアミノ酸セリンによって置換されており、アミノ酸E3が欠失しており、アミノ酸R36及びR37の両方がグルタミン(Q)によって置換されており、アミノ酸K68、S69、A70、R71及びS72が欠失しており、アミノ酸R74、R77及びR104がグルタミン(Q)に変異している、ポリペプチドを指すことができる)。
別の実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントは、アミノ酸
a)VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG(配列番号33)、又は
b)VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS(配列番号34)
からなる変異したEa−ペプチドを含む、上記のポリペプチド1〜29cに関する。
さらなる実施形態において、開示されている方法に従って産生され得るIGF−1バリアントはFc領域に融合している上記のIGF−1前駆タンパク質であり、Fc領域は改変されたIGF−1前駆ポリペプチドに直接融合し得るか、又は当該分野において周知の組換えDNA技術を使用してヒンジ領域によって結合され得る。DNAヒンジ領域が使用される場合、Fc領域は改変されたIGF−1前駆ポリペプチドの任意の部分に結合していてもよい。一実施形態において、Fc領域は改変されたIGF−1前駆ポリペプチドのC末端に直接融合している。別の実施形態において、Fc領域は、Gly−Ser(−GS−)リンカーによって改変されたIGF−1前駆ポリペプチドのC末端に連結している。
DNAリンカーは、操作を容易にするように成分の間に制限部位を提供するために使用してもよい。リンカーはまた、宿主細胞からポリペプチドの発現を向上させるため、成分がその最適な三次又は四次構造を推測でき、且つ/又はその標的分子と適切に相互作用できるように立体障害を減少させるために提供してもよい。所望のスペーサーを識別するリンカー及び方法に関しては、例えば、George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879を参照のこと。
リンカー配列は、受容体成分に天然に結合した1つ又は複数のアミノ酸を含んでもよく、又は融合タンパク質の発現を向上させるために使用される付加配列であってもよく、目的の特に望まれる部位を提供し、成分ドメインが最適な三次構造を形成でき、且つ/又はその標的分子との成分の相互作用を向上させることができる。一実施形態において、リンカーは、1〜100アミノ酸、好ましくは1〜25アミノ酸長の間にある1つ又は複数のペプチド配列を含む。一実施形態において、リンカーは1〜5アミノ酸長である。一実施形態において、リンカーは3アミノ酸配列であり、より具体的には、Gly Pro Glyの3アミノ酸配列である。別の実施形態において、リンカーはGly−Serである。
このようなヒンジ分子の例は、限定されないが、以下のポリペプチドが含まれる:
ヒンジ1:CPPCPA(配列番号30)
ヒンジ2:DKTHTCPPCPA(配列番号31)
ヒンジ3:EPKSCDKTHTCPPCPA(配列番号32)
従って、本開示は、好ましくは、上記のようにアミノ酸234及び235の一方又は両方をアラニンに置換することによって、免疫グロブリンFc領域、特に改変されたFc領域、特にFc受容体へのその結合を調節するために改変されているFc領域に融合しているヒトIGF−1 Ea−ペプチド前駆タンパク質を含有するIGF−1バリアントが産生される方法であって、42位におけるアミノ酸グリシンが欠失し又はセリンに置換されており、アミノ酸の番号付けが配列番号20に対応し、免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域を介してIGF−1前駆タンパク質に融合している、方法に関する。
このような分子の例には、限定されないが、以下のポリペプチド:
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_E(配列番号23)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_A(配列番号24)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_C(配列番号25)
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F(配列番号26)
hIgF1−Ea−Fc_mut 04/2_A(配列番号28)
hIgF1−Ea−Fc_mut 04/2_E(配列番号27)
hIgF1−Ea−Fc_mut 04/2_F(配列番号29)
が含まれる。
特定の態様において、本開示は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)、ホモサピエンス(Homo sapiens)、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)、ハツカネズミ(Mus musculus)及びオナガザル種(Chlorocebus species)由来の細胞からなる群から選択される、上記の方法に関する。上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい他の実施形態において、哺乳動物細胞は、CHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)、COS細胞(サルの腎臓(アフリカミドリザル)に由来する細胞株、Vero細胞(アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞)、Hela細胞(この株はHenrietta Lacksから得た子宮頸癌細胞に由来した)、BHK細胞(ベビーハムスター腎臓細胞、HEK細胞(ヒト胎児腎臓)、NS0細胞(マウス骨髄腫細胞株)、C127細胞(非腫瘍形成性マウス細胞株)、PerC6(登録商標)細胞(ヒト細胞株、Crucell)、CAP細胞(CEVEC’s Amniocyte Production)及びSp−2/0細胞(マウス骨髄腫細胞)からなる群から選択される。
CHO細胞は1957年に初めて首尾良く単離された(Tjio JH, Puck TT (1958) Genetics of somatic mammalian cells. II. Chromosomal constitution of cells in tissue culture. J Exp Med 108(2):259-268)。元の不死化CHO細胞株に基づいて、いくつかの異なるクローンが開発されている。元の細胞株に由来するCHO−K1株はグリシン補充に依存する(Kao FT, Puck TT (1968) Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells. Proc Natl Acad Sci USA 60(4):1275-1281)。その後の遺伝子変異により、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の両方の対立遺伝子が欠失したCHO−DG44株が導かれた(Urlaub G, Chasin LA (1980) Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA 77(7):4216-4220)。この細胞株は成長のためにグリシン及びヒポキサンチン並びにチミジンを必要とする。DG44細胞株は研究を意図したが、この株は最も一般的に使用されるCHO発現系の1つになった。特定の態様において、上記に開示されている方法に使用される哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であり、前記CHO細胞は、CHO−K1派生細胞、CHO−DUXB11派生細胞又はCHO−DG44細胞であってもよい。CHO K1細胞は1957年に成体チャイニーズハムスターの卵巣生検から開始した親CHO細胞株(DSMZ番号:ACC110)のサブクローンである。それらは適切な合成装置の不在のためにプロリンを必要とする。翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特性機構を有する異なる宿主細胞(例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293及びWI38)はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である。
本発明の特定の実施形態において、CHO細胞はCHO−K1派生細胞であり、前記細胞のIGFR1は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用することによってノックアウトされているか、又はRNA干渉技術を使用することによってノックダウンされており、本発明の方法に係る前記細胞内で産生される治療用タンパク質は、配列番号23、又は配列番号24、又は配列番号25、又は配列番号26、又は配列番号27、又は配列番号28、又は配列番号29のIGF−1タンパク質である。
さらなる態様において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して前記細胞内の異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、前記遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、組換え治療用タンパク質の発現は、治療用タンパク質の同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞におけるより、少なくとも1.5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多い、哺乳動物細胞に関する。
別の特定の実施形態において、本開示は、改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内の異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、前記遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、治療用タンパク質を発現する場合、前記遺伝子改変哺乳動物細胞は、培養時間の間、0.5〜1×10細胞/ml又は1〜1.5×10細胞/ml又は1.5〜2×10細胞/ml又は2〜2.5×10又は3〜3.5×10細胞/ml又はそれより多くまで成長できる、哺乳動物細胞に関する。
さらなる実施形態において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内で異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、治療用タンパク質を発現する場合、前記遺伝子改変哺乳動物細胞の生存率が、最初の80〜110時間又は110〜140時間又は140〜170時間又は170〜200時間又は200〜230時間又は230〜260時間の培養時間の間、97%超である、哺乳動物細胞に関する。
別の態様において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内で異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている遺伝子改変哺乳動物細胞であって、異種組換え治療用タンパク質は前記細胞内で発現された内因性同族受容体のリガンドであり、遺伝子改変により、前記同族受容体の発現の欠損がもたらされ、(i)組換え治療用タンパク質の発現が、このように改変されていない細胞におけるより、少なくとも1.5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍又はそれより多く、(ii)前記遺伝子改変哺乳動物細胞は、培養時間の間、0.5〜1×10細胞/ml又は1〜1.5×10細胞/ml又は1.5〜2×10細胞/ml又は2〜2.5×10又は3〜3.5×10細胞/ml又はそれより多くまで成長でき、(iii)前記遺伝子改変哺乳動物細胞の生存率は、最初の80〜110時間又は110〜140時間又は140〜170時間又は170〜200時間又は200〜230時間又は230〜260時間の培養時間の間、90%超である、哺乳動物細胞に関する。
さらに別の態様において、本開示は、このように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、前記細胞内の異種組換え治療用タンパク質のより高い発現を可能にするように改変されている上記の遺伝子改変哺乳動物細胞であって、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)、ホモサピエンス(Homo sapiens)、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)、ハツカネズミ(Mus musculus)及びオナガザル種(Chlorocebus sp.)細胞からなる群から選択される、遺伝子改変哺乳動物細胞に関する。
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、他の実施形態において、上記の哺乳動物細胞は、CHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)、COS細胞(サルの腎臓(アフリカミドリザル)に由来する細胞株、Vero細胞(アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞)、Hela細胞(この株はHenrietta Lacksから得た子宮頸癌細胞に由来した)、BHK細胞(ベビーハムスター腎臓細胞、HEK細胞(ヒト胎児腎臓)、NS0細胞(マウス骨髄腫細胞株)、C127細胞(非腫瘍形成性マウス細胞株)、PerC6(登録商標)細胞(ヒト細胞株、Crucell)、CAP細胞(CEVEC’s Amniocyte Production)及びSp−2/0−細胞(マウス骨髄腫細胞)からなる群から選択される。特定の態様において、上記の哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であり、前記CHO細胞は、CHO−K1派生細胞、CHO−DUXB11派生細胞又はCHO−DG44細胞であってもよい。
本開示のさらに別の態様は、インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している、遺伝子改変CHO細胞、例えばCHO−K1派生又はCHO−DUXB11派生細胞を含む。
さらなる実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している上記のCHO細胞は、異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子1遺伝子又はそのバリアントの染色体又は染色体外の少なくとも1つのコピーを有する。
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらに別の実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している上記CHO細胞は、異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子1遺伝子又はそのバリアントの少なくとも1つの染色体又は染色体外のコピーを含み、IGF−1Rの発現がこのように改変されていない同じ種類の細胞と比較して、少なくとも1.5倍、又は2倍、又は3倍、又は4倍、又は5倍、又は6倍、又は7倍、又は8倍、又は9倍、又は10倍多いヒトインスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする。
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、他の実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している上記のCHO細胞は、異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子1遺伝子又はそのバリアントの少なくとも1つの染色体又は染色体外のコピー及び標的遺伝子組換え技術によってノックアウトされている唯一の非機能的インスリン様成長因子1受容体遺伝子を含む。
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらなる実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している上記のCHO細胞は、(i)異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子1遺伝子又はそのバリアントの1つの染色体又は染色体外のコピー及び(ii)互いに相補的である少なくとも2つの配列を含む二本鎖siRNA分子を少なくとも含み、センス鎖は第1の配列を含み、アンチセンス鎖はIGF−1RをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、siRNAの各々の分離鎖の全長は、15〜49ヌクレオチド、17〜30ヌクレオチド又は19〜25ヌクレオチドであってもよく、インスリン様成長因子1受容体の発現は、本開示に係る上述のdsRNA分子で処理されていない細胞と比較して少なくとも10%、30%、50%、90%、95%又は99%阻害される。一実施形態において、上記の細胞は少なくとも1つの二本鎖siRNA分子を含み、前記分子のセンス鎖の配列は配列番号1又は3からなる群から選択される。
上記の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、さらなる実施形態において、インスリン様成長因子1受容体の発現を欠損している上記のCHO細胞は、(i)異種プロモーターの制御下で、ヒトインスリン様成長因子1遺伝子又はそのバリアントの1つの染色体又は染色体外のコピー及び(ii)IGF−1RをコードするmRNAの少なくとも一部との相補性の領域を含むshRNA分子を少なくとも含み、インスリン様成長因子1受容体の発現は、本発明に係る上述のshRNA分子で処理されていない細胞と比較して、少なくとも10%、30%、50%、90%、95%又は99%阻害される。一実施形態において、上記の細胞は配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択されるshRNA分子の少なくとも1種類を含む。
配列
CHO細胞株における組換えIGF−1の発現は細胞成長阻害(図1、2)及び低力価をもたらす。shRNA技術又は「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」技術を使用したCHO細胞内のIGF1−Rの安定なノックダウン/ノックアウトにより、驚くべきことに、改善された細胞成長及びより高いIGF−1タンパク質力価がもたらされた(図6、7、8、9及び10)。IGF−1をコードするプラスミドで安定にトランスフェクトされたIGF−1−R(ノックダウン)の低下した発現を有するCHO細胞は、安定にトランスフェクトした野生型CHO細胞と比較して約5倍高いプール力価を生じた。さらに高いプール力価がIGF−1Rノックアウト細胞株の安定なトランスフェクション後に測定され得る。組換えIGF−1の5〜20倍の力価増加が野生型CHO細胞株と比較して検出され得る(図9)。要約すると、これらのデータは、哺乳動物細胞株における受容体遺伝子のノックダウン又はノックアウトが、治療用タンパク質を発現することが困難である産生を著しく改善できることを示す。
パートA:一般的方法
本発明を、ここで、非限定的な実施例によって記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を構成する。
I.細胞培養方法及びトランスフェクション
目的の治療用タンパク質を発現するための本発明に係る宿主細胞をトランスフェクトし、培養するための適切な方法は当業者に知られている。以下を実施例により開示する。
実施例1: 細胞培養
CHO細胞を成長させている懸濁液を、例えば米国特許第6,048,728号に開示されているように振盪フラスコ内の標準培地中で培養する。細胞を新鮮な培地中で1週間に2回継代し、この研究の間にわたって対数増殖期に維持する。
実施例2: トランスフェクション
トランスフェクションのために、95パーセント超の生存率を有する対数増殖期における親CHO細胞を使用した。製造業者(Lonza)の指示書に従ってAmaxa(商標)、Nucleofector(商標)技術を使用して、エレクトロポレーション(ヌクレオフェクション)によるトランスフェクションを行った。5×10細胞を90gにて10分、遠心分離し、100μlトランスフェクション試薬(「溶液V」)(Lonza)中で再懸濁した。細胞に何も加えないか(トランスフェクションの陰性対照)、又は30pmolのsiRNA若しくは3μgの線形DNAベクター(shRNAベクター若しくは(例えば配列番号23〜29の)IGF−1バリアントをコードするベクター又はジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする両方のベクター(pZFN1及び2(配列番号36/37))の6μg若しくは10μgの均一混合物を加え、全混合物をエレクトロポレーションキュベットに移した。ヌクレオフェクション(プログラム:U−23)後、キュベットを1mlの予め温めておいた(セ氏37度)培養培地ですすぎ、細胞を125mlの振盪フラスコ内の20mlの予め温めておいた培地に加え、セ氏37度及び10パーセントCOにて2日間、インキュベートした。
実施例3: ピューロマイシン/ジェネティシン選択
選択をトランスフェクションの48時間後に開始した。発現ベクター核酸に位置するピューロマイシン/ジェネティシン選択マーカーはピューロマイシン/G418耐性についての選択を可能にする。トランスフェクタントの選択のために、細胞が80%超の生存率に回復するまで、5μg/mlのピューロマイシン(PAA)/0.8mg/mlのG418(Invitrogen)の存在下で細胞を培養した。トランスフェクション及びピューロマイシン/G418選択の約4/2週後、大部分がピューロマイシン/G418耐性細胞からなるプール集団が出現する。プールを回収した後、細胞を凍結させた。
実施例4: G418耐性細胞の遺伝子増幅
G418耐性細胞のさらによりストリンジェントな選択を、G418を含まないMTX含有培養培地(1μM)に細胞を通すことによって開始した。培養の3週後、MTX耐性及び高産生細胞プールを生成した。DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)選択マーカーは、葉酸類似体メトトレキサート(MTX)を培養培地に加えることによって高産生細胞のストリンジェントな選択を可能にし、トランスフェクションプールについての増加した力価を生じる。MTX選択から細胞を回収した後、細胞を凍結させ、FACSクローニング及びスクリーニングの間にわたって培養をMTX含有培地中で継続した。
実施例5: 蛍光活性化細胞分類(FACS)によるクローン細胞株の確立
クローン細胞株(すなわち、単一細胞に由来する細胞株)を得るために、トランスフェクトした細胞のプールを96ウェルプレート中に播種した。トランスフェクトしたプール又は「スーパープール(superpool)」(いくつかのプールを調和した混合物)につき1×10細胞を遠心分離し、5mlの冷やしたPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄し、1mlの冷PBS中に再懸濁した。shRNA及びpZFNでトランスフェクトした細胞について、適切な量のCy5で標識したhIGF−1Ea 3mutを加えた。細胞を暗所で30分間、氷上でインキュベートし、続いて、5mlの冷やしたPBSで2回洗浄し、1mlの冷PBS中に再懸濁した。細胞を濾過し、保存又は/及びクローニングのためにFACSチューブ中に分配した。細胞クローニングをFACS Aria(Becton Dickinson)で実施した。shRNA及びpZFNでトランスフェクトしたCHO細胞は分類された単一細胞であった。ほとんど又は全く機能的でないIGF−1R発現を有する細胞のみを選択するために、5%の最も低いCy5蛍光細胞のみを選択した。標準的な手順を使用して細胞をスケールアップした。個々のクローンを、IGF−1R mRNA発現又はIGF−1Rエクソン3における変異のいずれかについて評価し、培養及び分析後に最も低いIGF−1R mRNA発現又はIGF−1Rノックアウトクローンが保持されている。これらの候補から、hIGF−1Ea 3mut又はrhIGF−1の存在下で適切に成長する細胞株を、ベクターをコードする配列番号23〜29のIGF−1バリアントでのトランスフェクションのために選択した。最も高い産生力を有するクローンを、組換えタンパク質の産生のために選択した。産生力は、通常、培養条件を確立/適合することによって、すなわちバイオプロセスパラメータ(例えば、温度、供給、酸素及び温度変化)によって又はそれを適合することによってさらに改善され得る。
実施例6: 環状ベクターの細菌クローニング
1つのShot Stbl3細菌(Invitrogen、カタログC7373−03)を製造業者の指示書に従ってクローニングされるベクターで形質転換し、適切な濃度の抗生物質を含有するアガロースプレート上に塗布した。使用した抗生物質は、25μg/mlのカナマイシン又は100μg/mlのアンピシリンであった。一晩のインキュベーション後、明確な成長した細菌コロニーを採取し、2mlの抗生物質を含有するLB培養液中で8時間増殖させ、さらに100ml中で15時間増殖させた。製造業者の指示書に従って、Endofree Plasmid Maxiキット(Qiagen、カタログ12362)を使用してDNAベクターを精製した。ゲノム編集を必要とするベクター配列を、ベクター特異的フォワード及びリバースプライマーを使用してサンガーシークエンシングによって検証した。正確な配列を有するベクターをさらに使用した。
実施例7: 急上昇実験
細胞培養を標準培地(50ml培養物)中で2×10生存細胞/mlの密度で継代した。適切な量の濾過滅菌した(0.22μmフィルタ)hIGF−1Ea 3mut又はrhIGF−1を50mg/lの最終濃度のために加えた。両方は、CHO−K1及びCHO−DUXB11派生親細胞の細胞成長阻害を誘発した。細胞を標準的な条件下で培養し、細胞生存率及び密度を24時間に基づいて定期的に測定した。
実施例8: バイオリアクターにおいてIGF−1を発現する形質転換したCHO細胞の培養。
バイオリアクターにおいてIGF−1を発現する形質転換した細胞を培養するために、フェドバッチプロセスを適用した。細胞成長を補助し、生存率を維持することによって産生期を延ばすように供給開始及び温度変化などのプロセス事象の時間を決めた(Niraj Kumar, Patrick Gammell, Martin Clynes (2007) Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture; Cytotechnology (2007) 53:33-46)。
実施例9: CHO細胞からのIGF−1の収集。
収集手段として、深層濾過、続いて濾過滅菌を用いる標準的な細胞分離技術を適用した。CHO細胞を培養し、当業者に知られている標準的な方法に従って収集した(例えば、Curr. Protoc. Protein Sci. 2001 May;Chapter 5: Unit 5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S; (Mahesh Prashada, Klaus Tarrach (2006) Depth filtration: Cell clarification of bioreactor offloads, Filtration & Separation Volume 43, Issue 7, September 2006, Pages 28-30)。
II ベクター構築
本発明の教示に係るいくつかのベクター構築物は実現可能である。ベクターの個々のエレメントは従来技術において知られているので、適切なベクターが、例えば、基本的な遺伝エレメントのシークエンシング又は増幅及び適切なクローニング並びに所望の方向における発現カセットによって構築され得る。それぞれのクローニング法は従来技術の水準であり、また、上記の遺伝エレメントの配列も従来技術に記載されている。続いて、ベクター構築物の生成は例として記載されている。しかしながら、それぞれのベクターを得るためのいくつかの他の実施形態及び手段が適しており、容易に利用できることは当業者により理解される。この段落に記載されている全てのプラスミド構築物(例えばpBW679)は、WO2009080720に記載されている哺乳動物発現ベクターに基づく。WO2009080720の実施例の段落、特に図1、表1及び実施例の段落II:ベクター構築物(21〜31ページ)は本明細書に参照として組み込まれる。
実施例10: shRNAベクター構築物:
6個のセンス(配列番号5〜10)及び6個の対応するアンチセンスヘアピンsiRNA鋳型オリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、製造業者の指示書に従ってpSilencer(商標)2.1−U6 puro発現ベクター(Ambion、品番AM5762)内でライゲーションした。これらのライゲーション産物を、100μg/mlのアンピシリンを使用して実施例6に記載されているように大腸菌(E.Coli)内でクローニングした。6個のshRNAベクターの各々について3個のコロニーを採取し、増殖させた。精製したDNAベクターの配列を、カスタムフォワードプライマー(配列番号46)及びT7リバースプライマー(配列番号47)を使用して検証した。正確なフォワード及びリバース配列を有するDNAベクターを、SspI(NEB、カタログR0132S)で線形化し、イソプロパノール及びエタノール沈殿で精製し、トランスフェクションの前にヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。2つのトランスフェクション複製を、これらの6個のshRNAベクターの各々について実施し(従って12個のプールを生成した)、1つのトランスフェクションをスクランブルshRNA対照(pSilencer(商標)2.1−U6 puro発現ベクターキットに含まれた)について行った。ピューロマイシンを用いてトランスフェクト細胞を選択した(実施例3)。shRNA1、4又は6(配列番号5、8、9)のいずれかに対応する2つのプールをそれぞれスーパープールし、shRNA2、3及び5(配列番号6、7、9)でトランスフェクトした6個全てのプールを、Cy5で標識したhIGF−1Ea 3mutで染色し、FACSを使用した単一細胞クローニングをする前に、スーパープール中で均一に合わせた(実施例5)。
実施例11: IGF−1Rのエクソン3に特異的であるZFNの設計/産生及び使用:
IGF−1Rのエクソン3及び隣接イントロンをCHO−K1及びCHO−DUXB11派生親細胞株(配列番号14/15)中で配列決定した。最初に、エクソン3を、エクソン3及びIGF−1R遺伝子のマウス配列を覆う所有のハムスターcDNA配列に基づいて配列決定した。PCRプライマーを保存部分において設計し、得られたPCR産物を配列決定した。エクソン3配列に基づいて、Sigmaはエクソン3隣接イントロンを配列決定し、2つのZFN標的化IGF−1Rエクソン3を操作した。各ZFNは、それぞれリバース(5’上)、フォワード(3’上)DNA鎖における18ヌクレオチドを標的とし、結合する。2つの結合部位は切断部位の5つのヌクレオチド(配列番号11)によって分離している。産物の詳細及び方法はSigmaから入手可能である(「74188 CompoZr Custom ZFN Tech Bulletin」に記載されている)。Sigmaはまた、周囲のイントロン配列(配列番号12及び13)においてフォワード及びリバースPCRプライマーを設計して、gDNAレベルにおいてIGF−1Rエクソン3を増幅して、501bpのPCR産物を得た。Sigmaは、それぞれリバース(pZFN1)、フォワード(pZFN2)鎖認識操作したZFNをコードする、20〜25μgの2つのDNAベクターを含む、CompoZr(商標)(カスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ、製品番号CSTZFN−1KT、ロット番号08021019MN)を提供した。
いずれかのベクターを用いて周知の形質転換プロトコル(実施例6を参照のこと)に従って大腸菌(E.coli)を形質転換し、アガロースプレートを含有する25μg/mlのカナマイシン上に播いた。各ベクターについて、4つの細菌コロニーを選択し、増殖した。各pZFNの4つの精製したDNAプラスミド試料のZFN配列を、T7フォワード及びBHGリバースプライマーを使用して検証し、プールした。環状pZFN1及びpZFN2ベクターの6μg又は10μgの均一混合物を、エレクトロポレーション(Amaxa)を使用してCHO−K1派生細胞及びCHO−DUXB11派生親細胞内でトランスフェクトした。3つの複製トランスフェクションを各量について実施し、各親細胞株について6つのプールを得た。プールにおけるZFNの切断効率を測定するために、Surveyor Mutation Detectionアッセイ(Transgenomics、カタログ706025)を、トランスフェクション(ゼロ日と数える)の3日及び10日後に使用した。GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprepキット(Sigma、カタログG1N70−1KT)を使用してプールのゲノムDNAを単離し、IGF−1R(配列番号12及び13)のフォワード及びリバースシークエンシングプライマーを使用したPCR反応においてエクソン3を増幅した。次いでPCR産物を95℃で変性させた。温度を徐々に低下させて、いくつかの野生型及び変異産物をハイブリダイズして、Surveyor(登録商標)酵素によって切断された切断部位周囲にミスマッチを有する二本鎖DNAを形成させた。lab901と呼ばれる毛管ゲル電気泳動系(LAB901)を使用して最終産物を分析した。6つ全ての形質転換したプールについて、予想される501bpの完全一致PCR産物に加えて、切断部位のいずれかの側における断片に対応する、約277bp及び224bpの2つのより小さなバンドを両方の細胞株の6つ全てのプールにおいて検出し、従って、CHO−K1及びCHO−DUXB11派生親細胞においてZFN活性を証明した。トランスフェクションの7日後、プールは10×96ウェルプレートにおいて(実施例5に記載されているように)クローニングした単一細胞であった。
pZFNでトランスフェクトしたCHO−K1派生細胞株の全部で507個のクローンを、上記のSurveyor Mutation Detectionアッセイを使用して変異について評価した(クローンのゲノムDNAを、Sigma製のExtract−N−Amp Blood PCRキット、カタログXNAB2を使用して96ウェルプレート中で抽出する)。42個のクローンにおいて、2つのより小さなバンドを検出し、これらのゲノムがエクソン3の少なくとも1つの変異コピーを含有することが示された。続いて、これらのクローンのIGF−1Rエクソン3を配列決定した。DNAシークエンシングクロマトグラムは、標的配列の2つのコピーを示す、2つの重複する同じ強度のシグナルを示した。42個のクローンのうちの6つは両方のコピーにおいてIGF−1R変異を有し、そのうちの2つのクローンは両方のコピー(クローン1及び2、配列番号38、39、41及び42)においてフレームシフト変異を有し、1つのクローン(3)は一方のコピーにおいてフレームシフト変異及び他方において114bp欠失(配列番号40及び43)を有した。これらの3つのクローンにおけるIGF−1R配列をTOPOクローニング(TAクローニングキット、Invitrogen、cat.K4575−40;6つの細菌コロニーを選択した)によって確認した。3つ全てのK.O.クローンを親細胞より顕著に高い生存細胞密度まで成長させた。50mg/Lの「hIGF−1Ea 3mut」(配列番号35)の急上昇は標準培地中で親細胞と同様の細胞成長挙動を生じた(図8)。遺伝子型Δ5/Δ22(配列番号39/41)を有するクローンを、インスリン様成長因子1タンパク質、例えばヒトIGF−1(配列番号16又は20)又はそのバリアント(例えば配列番号21〜29)でのトランスフェクションのために選択した。
pZFNでトランスフェクトしたCHO−DUXB11派生細胞株の単一細胞クローニングは117個のクローンを生じ、それらを上記のようにSurveyorアッセイを用いて変異について評価した。全部で28個のクローンは、IGF−1Rエクソン3の少なくとも1つの変異コピー(2つのより小さなバンドが検出された)を有したが、シークエンシングにより、全てのこれらのクローンは依然として野生型コピーを含有することが示された。変異配列が検出された2つのクローン(Δ22又はΔ16)をpZFNで2回トランスフェクトし、10μgの混合pZFNを使用して6つのプールを生成した。トランスフェクションの7日後、これらのプールは(実施例5に記載されているように)6×96ウェルプレートにおいて分類された単一細胞であった。全部で211個のクローンをIGF−1Rエクソン3について配列決定し(既に変異した配列が存在するのでSurveyorアッセイはもはや可能ではない)、重複配列をクロマトグラムで分析した。クローンの全体の約20%は野生型及び2つの変異配列(大部分は切断部位周囲で欠失している)を有した。遺伝子型Δ22/Δ7/野生型、Δ16/Δ7/野生型及びΔ16/Δ22/野生型を有する3つのクローンを、pZFNでの第3ラウンドのトランスフェクションのために選択した(これらの配列はTOPOクローニングによって確認した)。8μgの混合pZFNでの2つのトランスフェクションを3つのクローンの各々について実施した。7〜9日後、クローンに対応する2つのプールを混合した。非機能的IGF−1Rを有する細胞を濃縮するために、3つの得られたプールを、50mg/lのhIGF−1Ea 3mutの存在下で6〜8週共培養した。単一細胞クローニングの2日前に、(Cy5で標識したhIGF−1Ea 3mutの結合を可能にし、5%の最も低い蛍光細胞を選択するために)hIGF−1Ea 3mutを有さない細胞を培養した。3つのプールは9×96ウェルプレートにおいて分類された単一細胞であった。
IGF−1Rエクソン3における野生型切断部位配列に結合するPCRプライマーを設計し、変異クローンの効果的なスクリーニングを可能にした。IGF−1Rについてのフォワードシークエンシングプライマーと一緒にPCRを実施した(細胞が野生型IGF−1R配列を含有する場合、PCRはPCR産物を生じると仮定する)。全部で389個のクローンをスクリーニングし、58個のPCR陰性クローンを配列決定した。これらのクローンの30個において、野生型配列は検出できず、そのうちの22個のクローンはフレームシフト変異を含有した(配列Δ22/Δ7を有する13個のクローン)。50mg/lのhIGF−1Ea 3mutと共培養した及び共培養していないこれらの細胞成長を評価し、hIGF−1Ea 3mutの存在下で遺伝子型Δ22/Δ7(配列番号44/45)を有する最適な成長クローンを、配列番号21〜29のタンパク質をコードするDNA構築物でのトランスフェクションのために選択した。
実施例12:
(ベクターpBW806(hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A)のクローニング戦略(図11))
hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_AをコードするベクターpBW806を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E _pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A_pMA−T断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW806を得た。
(ベクターpBW807(hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C)のクローニング戦略(図12))
hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_CをコードするベクターpBW807を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARNWC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_C_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW807を得た。
(ベクターpBW808(hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F)のクローニング戦略(図13))
hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F(Novartis専売のベクター)をコードするベクターpBW808を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARNYC_hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_Fc融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIgF1−Ea−Fc_mut 13/2_F_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW808を得た。
(ベクターpBW809(hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E)のクローニング戦略(図14))
HIGF1−EA−FC_MUT 04/2_E Fc融合配列をコードする、ベクターpBW809を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARN2C_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW809を得た。
(ベクターpBW810(hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A)のクローニング戦略(図15))
hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_AをコードするベクターpBW810を2つの連続したクローニング工程に従って調製した。第1の工程において、プラスミド11AARNSC_hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_E_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したFc領域を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行して、pBW679(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、中間体ベクターpBW805を得た。第2の工程において、プラスミド11AARN2C_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A_pMA−T(Novartis専売のベクター)を、hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A融合タンパク質のn末端領域を抽出するためにXbaI及びSse232Iを用いて消化した。並行して中間体ベクターpBW805を続いて、Sse232I及びXbaIを用いて消化し、所望の骨格画分を送達し、それを11AARNUC_hIGF1−Ea−fc_mut 04/2_A_pMA−T(Novartis専売のベクター)断片と最後にライゲーションして、最終発現ベクターpBW810を得た。
(ベクターpBW410(hIGF−1Ea 3mut)のクローニング戦略(図16))
hIGF−1Ea 3mut配列をコードする、ベクター0610900pGA4(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したコードIGF配列を抽出するためにXbaI及びMluIを用いて消化した。並行してpBW165(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するMluI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターpBW410を得た。
(ベクターpBW664(hIGF1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、77−fcドメイン)のクローニング戦略(図17))
hIGF1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、77−fcドメイン配列をコードする、ベクター0905915(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したコードIGF配列を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行してpBW596(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターpBW664を得た。
(ベクターpBW666(hIGF1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、R77Q−fcドメイン)のクローニング戦略(図18))
hIGF1−Ea−Δ1−3、R37A、Δ71−72、R77Q−fcドメイン配列をコードする、ベクター0950919(Novartis専売のベクター)を、デノボ合成したコードIGF配列を抽出するためにXbaI及びAscIを用いて消化した。並行してpBW596(Novartis専売のベクター)を、転写及び翻訳調節エレメント並びにG418/DHFR選択/増幅マーカーを有する対応する骨格断片を生成するAscI及びXbaIを用いて消化した。両方の消化したエレメントをそれらの適合性のある末端によってライゲーションして、最終発現ベクターpBW666を得た。
結果:
CHO細胞株における組換えIGF−1の発現により、細胞成長阻害及び低力価が生じた。hIGF−1Ea 3mutの最大力価測定は8ug/mlであり、これは100mg/Lの抗体力価(モル質量に基づく)に対応する。バイオリアクタープロセスにおける組換え抗体の平均力価測定は約3g/Lである。IGF−1の低力価の1つの原因はIGF−1発現細胞の低下した細胞成長及び低い細胞生存率である。抗体発現プロセスの間、CHO−K1派生細胞は2×10細胞/mlまで成長し、細胞生存率は、最初の230〜260時間の培養時間の間、97%超である。対照的に、IGF−1を発現するCHO−K1派生細胞は0.5×10細胞/mlまでしか成長せず、細胞生存率は2日後で既に97%未満に低下する(図1を参照のこと)。
低下した細胞成長はまた、IGF−1と非トランスフェクトCHO−K1派生細胞の共培養の間に検出され得る。図2は、親CHO−K1派生細胞が2.5×10細胞/mlまで成長することを示す。rhIGF1又はhIGF−1Ea 3mut(50mg/L)とCHO−K1派生細胞の共培養の間、細胞成長はまた顕著に阻害された(0.9×10細胞/ml)(図2を参照のこと)。
次の工程において、特異的IGF−IRチロシンキナーゼ阻害剤(NVPAEW541)(NVPAEW541−IGF−IRキナーゼの新規で有効な選択的阻害剤のインビボ抗腫瘍活性;Carlos Garcia-Echeverria et al.; Cancer Cell;2004年2月26日にオンラインで公開されたDOI:10.1016/S1535610804000510)を、CHO−DUXB11派生細胞におけるhIGF−1Ea 3mut共培養実験の間に加えた。細胞成長阻害は阻止することができた(図3を参照のこと)。これにより、IGF−1Rが、細胞成長阻害を生じる細胞内にシグナルを誘発することが検証される。
これらの結果を確認するために、siRNA及びshRNAベクターでのCHO−DUXB11由来細胞のトランスフェクションを実施した(IGF−1Rに対するsi−及びshRNA)。IGF−1Rに対する2つの異なるsiRNA(配列番号1〜4)及び対照siRNA(スクランブル)を使用した。スクランブル配列は、siRNA送達法に起因し得る遺伝子発現プロファイルに対する任意の変化を差し引くために含んだ。このsiRNAはチャイニーズハムスターにおける任意の既知の遺伝子と相補的ではない。試験した両方のsiRNAは80%超のIGF−1RのmRNAレベルを低下させた(図4を参照のこと)。
IGF−1Rの永続的に低下した発現を有する細胞株を生成するために、親CHO−DUXB11由来細胞を、IGF−1Rに対してshRNAを発現するベクター(配列番号5〜10)でトランスフェクトした。IGF−1Rに対して全部で6つの異なるshRNA配列を評価した(図5を参照のこと)。IGF−1Rの94%までの低下した遺伝子発現が、プールレベルでこのアプローチ(shRNA4)により達成できた。
図5に示されるshRNAプールはFACS技術を使用してクローニングした単一細胞であった。この技術は、トランスフェクト細胞の不均一集団からの特定の性質(例えば高抗体産生体)を有するクローンの迅速な識別及び単離を可能にし、標準的な限界希釈クローニング法に関連する労力及び時間を減少させる(Borth N, Zeyda M, Kunert R, Katinger H.Efficient selection of high-producing subclones during gene amplification of recombinant Chinese hamster ovary cells by flow cytometry and cell sorting. Biotechnol Bioeng. 2000-2001;71(4):266-73.; Carroll, S.; Al-Rubeai, M. The selection of high-producing cell lines using flow cytometry and cell sorting. Expert Opin. Biol. Ther. 2004, 4, 1821-1829.; Yoshikawa, T.; Nakanishi, F.; Ogura, Y.; Oi, D.; Omasa, T.; Katakura, Y.; Kishimoto, M.; Suga, K. Flow cytometry: An improved method for the selection of highly productive geneamplified CHO cells using flow cytometry. Biotechnol. Bioeng. 2001, 74, 435-442.; Meng, Y. G.; Liang, J.; Wong, W. L.; Chisholm, V. Green fluorescent protein as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells. Gene 2000, 242, 201-207)。この特定の場合、細胞をCy5で標識したhIGF−1Ea 3mutで染色し、最も低い5%染色細胞を分類した。これらのクローンは、hIGF−1Ea 3mutとの共培養の間、親細胞株と比較してIGF−1Rの発現の劇的な低下及び生存細胞数の増加を示した(図5及び6を参照のこと)。それにも関らず、細胞成長阻害が依然として存在した(hIGF−1Ea 3mutの存在下及び非存在下で培養したクローンの直接比較)。依然として少量のIGF−1R mRNAが存在する(リアルタイムRT−PCRによって検出された)ので、IGF−1Rが細胞表面上で、より少ない量で依然として発現することが想定でき、これによりIGF−1に対する感受性が残っていることが説明される。
次の工程において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術(ZFN)を使用したIGF−1Rのノックアウトを、CHO−K1派生細胞及びCHO−DUXB11由来細胞株において実施した。IGF−1Rのエクソン3の領域において特異的に結合するZFNを設計した。2つのプラスミド(それらの各々はIGF−1R特異的ZFNの1つのサブユニットをコードする)をCHO−K1派生細胞又はCHO−DUXB11由来細胞において共トランスフェクトした。各ZFNサブユニットは特異的な18塩基対長の配列に結合し、従って全体で36bp配列が特異的に認識される(ゲノムの他の位置におけるランダム切断を回避する)。FokIのエンドヌクレアーゼドメインを、DNAを切断するためにヘテロダイマーとしてのみ機能するように再操作する。ZFNダイマーはIGF−1Rのエクソン3において標的化した二本鎖切断を生じる。非相同末端結合のエラープローン細胞プロセスによって、この二本鎖切断はDNA配列の改変を生じることができ、そのために標的遺伝子の機能的ノックアウトを生成する。CHO−K1派生細胞について、3つのノックアウトクローンを生成した(両方の対立遺伝子でのノックアウト):クローン1:Δ2(配列番号38)、クローン2:Δ5(配列番号39)及びクローン3:Δ2(配列番号40)、クローン1:+18(及び14bps置換)(配列番号42)、クローン2:Δ22(配列番号41)及びクローン3:Δ114(配列番号43)。
CHO−DUXB11由来細胞株は、CHO−K1派生細胞ポリクローナル及びIGF−1Rチャレンジングのノックアウトを生じた倍数性と対照的である(2つより多いIGF−1Rコピー/ゲノムがノックアウトされなければならない)。本発明者らはフレームシフト変異を有するいくつかの特有のノックアウトクローンを生成し、TOPOクローニング及びシークエンシングを用いてそれらの2つを検証した。クローン12:Δ7(50%)(配列番号45)/Δ22(50%)(配列番号44)、クローン19:Δ7(14.5%)/Δ16(44%)/Δ22(18%)/Δ22mut(15%)。括弧内の百分率は、この変異が32個の配列決定した細菌コロニーからどれくらいの頻度で発生するかに基づく。クローン19について、6つのIGF−1R対立遺伝子(3×Δ16、1×Δ7、1×Δ22、1×Δ22mut)が存在すると想定され得る。
3つの生成したCHO−K1派生細胞IGF−1R KOクローンをhIGF−1Ea 3mutと共培養し、細胞成長阻害は検出できなかった(図7を参照のこと)。2つの生成したIGF−1R KO CHO−DUXB11由来のクローンもまた、IGF−1の存在/非存在下で培養した。CHO−K1 IGF−1R KOクローンと同様に、改善された細胞成長を、野生型CHO−DUXB11由来細胞と比較してKOクローンについて検出することができた(図8を参照のこと)。KOクローンの1つは、IGF−1の存在下で細胞成長阻害が存在せず、他のKOクローンは、IGF−1の存在下で、IGF−1と共培養していないCHO−DUXB11由来細胞と同様の最大の生存細胞数を有したことを示した。
Δ5/Δ22 CHO−K1派生細胞IGF−1R KOクローン及びΔ7/Δ22 CHO−DUXB11細胞由来IGF−1R KOクローンを、5つの異なるIGF−1−FC融合物候補でトランスフェクトした(図9を参照のこと)。組換えIGF−1−FCタンパク質の5〜17倍の力価の増加を、異なるIGF−1−FC融合物候補でトランスフェクトした野生型CHO−K1派生細胞/CHO−DUXB11細胞由来細胞株と比較してプールレベルで検出することができた。
CHO−K1派生細胞IGF−1R−KO又はCHO−DUXB11由来IGF−1R−KO細胞株において発現したIGF−1−FC融合物候補(hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A及びhIGF1−Ea−fc_mut 04/2_E)の2つを、100Lのウェーブバイオリアクター(フェドバッチプロセス及び温度変化)において培養した。hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A/4を発現するCHO−K1派生細胞IGF−1RKOプールを3×10細胞/mlの最大生存細胞密度まで成長させ、これは平均ABプロセスより高い(平均細胞密度は2.2×10細胞/mlである。IGF−1を発現するCHO−K1由来野生型細胞と比較して、これは生存細胞数において3〜6倍高い(図1を参照のこと)。hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_A/4を発現するCHO−DUXB11由来IGF−1RKO細胞を1.5〜2×10細胞/mlの最大細胞密度まで成長させ、これは野生型CHO−DUXB11由来細胞株と比較してより高い最大細胞密度である。
hIGF1−Ea−fc_mut 13/2_Aを発現するCHO−DUXB11由来IGF−1R KO細胞が分類した単一細胞であり、24ウェル及び50mlのバッチ培養物中のバッチ力価を決定した。図9において、各群由来の15個の最適なクローンの振盪フラスコ力価。CHO−DUXB11細胞由来IGF−1R KOクローンの全ては8倍高い24ウェル力価及び7倍高い振盪フラスコ力価を有する。

本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現する哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が前記治療用タンパク質の低力価をもたらし、前記方法が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されている哺乳動物細胞を用いて、
a.前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
b.工程aにおいて培養した前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程を含み、前記哺乳動物細胞が、前記同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも1.5倍多い治療用タンパク質を産生する、方法。
[2]
前記治療用タンパク質が成長因子である、請求項1に記載の方法。
[3]
前記成長因子がインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はそのバリアントであり、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損している、請求項2に記載の方法。
[4]
前記哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が、RNA干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[5]
前記哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が前記RNA干渉技術を適用することによって達成され、前記方法が、
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記細胞内に導入する工程であって、前記dsRNA分子が互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNA分子が、前記細胞内に導入すると、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する工程、及び
(b)前記組換え治療用タンパク質遺伝子の前記同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより前記細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、請求項4に記載の方法。
[6]
前記RNA干渉がshRNA分子を使用して達成され、前記方法が、
(a)前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるshRNAを前記細胞内に導入する工程であって、前記shRNAが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
(b)前記同族受容体遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持する工程
を含む、請求項5に記載の方法。
[7]
前記哺乳動物細胞が、CHO、COS、Vero、Hela、BHK、HEK、NS0、C127、ハイブリドーマ、PerC6、CAP及びSp−2/0細胞からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
[8]
前記哺乳動物細胞がCHO−K1派生細胞、CHO−DUXB11派生細胞又はCHO−DG44細胞である、請求項7に記載の方法。
[9]
前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、shRNAの配列が、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
[10]
前記RNA干渉が二本鎖siRNA分子を使用して達成され、前記同族受容体が配列番号44のIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、前記siRNAのセンス鎖の遺伝子配列が配列番号1及び3からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
[11]
配列番号1及び3からなる群から選択されるsiRNAのセンス鎖を含む、dsRNA分子。
[12]
配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される配列を含む、shRNA分子。
[13]
前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はそのバリアントであり、前記IGF−1Rの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によって達成される、請求項4に記載の方法。
[14]
前記成長因子が、配列番号16のヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はそのバリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[15]
a.前記インスリン成長因子1受容体の発現を欠損している哺乳動物細胞を産生する工程、
b.工程a.の細胞を、IGF−1又はそのバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
d.工程c.において選択した細胞を、IGF−1タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養する工程、
e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
を含み、前記哺乳動物細胞が、工程aに記載されているように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1.5倍多いIGF−1又はそのバリアントを産生し、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程を同時に実施することもできる、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[16]
前記治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
[17]
インスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントの発現が、このように改変されていない細胞と比較して少なくとも1.5倍高いように遺伝子改変されている哺乳動物細胞であって、前記遺伝子改変により、IGF−1受容体の発現の欠損がもたらされる、哺乳動物細胞。
[18]
前記細胞が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)細胞、ミドリザル(Cercopithecus aethiops)細胞、ホモサピエンス(Homo sapiens)細胞、ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)細胞、ハツカネズミ(Mus musculus)細胞及びオナガザル種(Chlorocebus sp.)細胞からなる群から選択される、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
[19]
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項18に記載の細胞。
[20]
CHO−K1派生細胞、CHO−DUXB11派生細胞又はCHO−DG44細胞である、請求項19に記載の細胞。
[21]
IGF−1受容体の発現の欠損を導く前記遺伝子改変が、RNA干渉技術又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、請求項17〜20に記載の細胞。
[22]
組換え治療用タンパク質を産生するための哺乳動物細胞の使用であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は前記組換え治療用タンパク質の低力価をもたらす、使用。
[23]
前記組換え治療用タンパク質が成長因子である、請求項22に記載の使用。
[24]
前記成長因子がインスリン様成長因子1タンパク質又はそのバリアントであり、前記同族受容体がインスリン様成長因子1受容体である、請求項23に記載の使用。
[25]
請求項1〜10、11、14又は15のいずれか一項に記載の方法における、請求項17〜21に記載の細胞の使用。
[26]
前記成長因子が、配列番号23、24、25、26、27、28及び29からなる群から選択されるヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質バリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

Claims (13)

  1. 組換え治療用タンパク質の同族受容体を内因的に発現するCHO哺乳動物細胞において前記治療用タンパク質を産生する方法であって、
    前記同族受容体への前記治療用タンパク質の結合が前記治療用タンパク質の低力価をもたらし、
    前記方法が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現を欠損し、前記治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されているCHO哺乳動物細胞を用いて、
    a.前記治療用タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び
    b.工程aにおいて培養した前記哺乳動物細胞から前記治療用タンパク質を収集する工程
    を含み、
    前記哺乳動物細胞が、前記同族受容体の発現がこのように改変されていない細胞より少なくとも1.5倍多い治療用タンパク質を産生し、
    前記治療用タンパク質が、インスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記哺乳動物細胞が機能的インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)の発現を欠損している、方法。
  2. 前記CHO哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が、RNA干渉又は標的遺伝子組換え技術を適用することによって達成される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記CHO哺乳動物細胞における前記治療用タンパク質の前記同族受容体の発現の欠損が前記RNA干渉技術を適用することによって達成され、前記方法が、
    (a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記細胞内に導入する工程であって、前記dsRNA分子が互いに相補的である少なくとも2つの配列を含み、センス鎖が第1の配列を含み、アンチセンス鎖が、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第2の配列を含み、前記相補性の領域が30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNA分子が、前記細胞内に導入すると、前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードする遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する工程、及び
    (b)前記組換え治療用タンパク質遺伝子の前記同族受容体をコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持し、それにより前記細胞内の前記同族受容体遺伝子の発現を阻害する工程
    を含む、請求項2に記載の方法。
  4. 前記RNA干渉がshRNA分子を使用して達成され、前記方法が、
    (a)前記治療用タンパク質の前記同族受容体をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるshRNAを前記細胞内に導入する工程であって、前記shRNAが、前記細胞内に導入すると、前記同族受容体遺伝子の発現を少なくとも10%阻害する、工程、及び
    (b)前記同族受容体遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、工程(a)において産生された細胞を維持する工程
    を含む、請求項3に記載の方法。
  5. 前記CHO哺乳動物細胞がCHO−K1細胞、CHO−DUXB11細胞又はCHO−DG44細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、shRNAの配列が、配列番号5、6、7、8、9及び10からなる群から選択される、請求項4または5に記載の方法。
  7. 前記RNA干渉が二本鎖siRNA分子を使用して達成され、前記同族受容体が配列番号44のIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記siRNAのセンス鎖の遺伝子配列が配列番号1及び3からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
  8. 前記同族受容体がIGF−1Rであり、前記治療用タンパク質がIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記IGF−1Rの発現の欠損がジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によって達成される、請求項2に記載の方法。
  9. 前記治療用タンパク質が、配列番号16のヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質又はそのバリアントである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  10. a.前記インスリン成長因子1受容体の発現を欠損しているCHO哺乳動物細胞を産生する工程、
    b.工程a.の細胞を、IGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換する工程、
    c.形質転換されている工程b.の細胞を選択する工程、
    d.工程c.において選択した細胞を、IGF−1タンパク質又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養する工程、
    e.工程dにおいて培養した哺乳動物細胞からIGF−1タンパク質又はそのバリアントを収集する工程
    を含み、
    前記哺乳動物細胞が、工程aに記載されているように改変されていない同じ種類の細胞より少なくとも1.5倍多いIGF−1又はその生物学的活性を保持するバリアントを産生し、工程a.及びb.の順序は逆転させることもでき、又は両方の工程を同時に実施することもできる、
    請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記治療用タンパク質が工業的製造規模で産生される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 組換え治療用タンパク質を産生するための、CHO哺乳動物細胞を含む組成物であって、前記細胞が前記治療用タンパク質の内因性同族受容体の発現を欠損しており、前記同族受容体の発現を欠損していない細胞内の前記同族受容体への前記組換え治療用タンパク質の結合が、前記哺乳動物細胞の成長遅延及び/又は前記組換え治療用タンパク質の低力価をもたらし、
    前記組換え治療用タンパク質が、インスリン様成長因子1タンパク質又はその生物学的活性を保持するバリアントであり、前記同族受容体がインスリン様成長因子1受容体である、組成物。
  13. 前記治療用タンパク質が、配列番号23、24、25、26、27、28及び29からなる群から選択されるヒトインスリン様成長因子1(IGF−1)タンパク質バリアントである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

JP2015548825A 2012-12-18 2013-12-16 遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生 Active JP6392245B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261738466P 2012-12-18 2012-12-18
US61/738,466 2012-12-18
PCT/IB2013/060982 WO2014097113A2 (en) 2012-12-18 2013-12-16 Production of therapeutic proteins in genetically modified mammalian cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2016507222A JP2016507222A (ja) 2016-03-10
JP6392245B2 true JP6392245B2 (ja) 2018-09-19

Family

ID=50001063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015548825A Active JP6392245B2 (ja) 2012-12-18 2013-12-16 遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10030063B2 (ja)
EP (1) EP2935319B1 (ja)
JP (1) JP6392245B2 (ja)
CN (1) CN104884467A (ja)
ES (1) ES2738641T3 (ja)
WO (1) WO2014097113A2 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2756330T3 (es) 2012-12-18 2020-04-27 Novartis Ag Polipéptidos de factor de crecimiento insulínico estabilizados
EP3015475A1 (en) 2014-10-31 2016-05-04 Novartis AG Mammalian cells expressing cytomegalovirus antigens
MX2019001859A (es) 2016-08-16 2019-08-29 Genzyme Corp Metodos de procesamiento de un fluido que incluye una proteina terapeutica recombinante y uso de los mismos.
KR20220145913A (ko) 2016-08-24 2022-10-31 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가공된 표적 특이적 뉴클레아제
PE20190568A1 (es) 2016-08-24 2019-04-22 Sangamo Therapeutics Inc Regulacion de la expresion genica usando nucleasas modificadas
WO2018156106A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Ding Enyu An mrna cancer vaccine encoding human gm-csf fused to multiple tandem epitopes
EP3749350A4 (en) 2018-02-08 2021-12-01 Sangamo Therapeutics, Inc. SPECIFICALLY MODIFIED TARGET-SPECIFIC NUCLEASES
EP3844288A1 (en) * 2018-10-01 2021-07-07 Lonza Ltd. Ssi cells with predictable and stable transgene expression and methods of formation
US11857641B2 (en) 2019-02-06 2024-01-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of mucopolysaccharidosis type I
WO2023223219A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Novartis Ag IMPROVED PROTEIN PRODUCTION USING miRNA TECHNOLOGY
WO2024023746A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Novartis Ag Improved production of cd39 variants

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
GB0212303D0 (en) 2002-05-28 2002-07-10 Isis Innovation Molecular targetting of IGF-1 receptor
US20050130919A1 (en) 2003-07-18 2005-06-16 University Of Massachusetts Regulatable promoters for synthesis of small hairpin RNA
WO2005033134A2 (en) 2003-09-30 2005-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Secreted protein therapeutics and uses thereof
HUE027645T2 (en) 2005-01-07 2016-10-28 Regeneron Pharma IGF-1 fusion proteins and therapeutic applications
CN101466399B (zh) * 2006-06-09 2015-05-13 诺华股份有限公司 稳定的胰岛素样生长因子多肽
UA97953C2 (uk) * 2006-06-09 2012-04-10 Новартіс Аг Стабілізовані поліпептиди інсуліноподібного фактора росту
PT2227546T (pt) 2007-12-21 2016-08-12 Novartis Ag Vector de expressão em mamíferos

Also Published As

Publication number Publication date
EP2935319B1 (en) 2019-04-24
WO2014097113A2 (en) 2014-06-26
CN104884467A (zh) 2015-09-02
EP2935319A2 (en) 2015-10-28
WO2014097113A3 (en) 2014-11-20
JP2016507222A (ja) 2016-03-10
ES2738641T3 (es) 2020-01-24
US20150322131A1 (en) 2015-11-12
US10030063B2 (en) 2018-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6392245B2 (ja) 遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生
EP3022304B1 (en) Methods and compositions for producing double allele knock outs
JP2021007397A (ja) Dna結合ドメイン、非フコシル化及び部分的フコシル化タンパク質、並びにその方法
JP5888616B2 (ja) 組換えタンパク質の高レベル発現用の発現ベクター
JP5701061B2 (ja) 哺乳類発現ベクター
RU2710726C2 (ru) Новые клетки позвоночных и способы рекомбинантной экспрессии интересующего полипептида
JP2020174681A (ja) 組み換え型タンパク質の効率的な選択性
US9340592B2 (en) CHO/CERT cell lines
EP2839003B1 (en) Reduction of formation of amidated amino acids in cell lines for protein expression
WO2016003368A1 (en) Optimized vectors for the production of recombinant proteins
CN108138147B (zh) 含Fc蛋白的表达
JP2011504741A (ja) 新規組換え配列
RU2656142C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA1
JP2009195197A (ja) 哺乳動物細胞の形質転換方法
JP6087149B2 (ja) タンパク質の生産方法
RU2801178C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА IGA2m1-ИЗОТИПА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
WO2023223219A1 (en) IMPROVED PROTEIN PRODUCTION USING miRNA TECHNOLOGY
RU2671477C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA2m1F16-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA2m1
RU2664184C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-Intht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IgA1
WO2024023746A1 (en) Improved production of cd39 variants
WO2023234866A1 (en) Method for production of a eukaryotic host cell or cell line for lambda-integrase-mediated recombination
Strippoli Transposon-based technology enhances the generation of stable and high-producing CHO clones for industrial production of recombinant proteins and antibodies
BR112017003074B1 (pt) Vetor, e, métodos de produção de uma proteína recombinante de interesse e de emprego de tunicamicina como um marcador de seleção
JP2004248509A (ja) 真核細胞内における配列特異的dna組換え

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20161124

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20171024

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180124

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180221

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180424

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180724

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180807

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180822

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6392245

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250