JP6087149B2 - タンパク質の生産方法 - Google Patents
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Description
1.目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞を得て、且つ該哺乳動物細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法。
2.以下の(A)および(B)の工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質の生産方法。
(A)以下のベクター(a)および(b)を同時に浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一過性に発現させたトランスポゼースにより、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
(a)目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
(B)前記目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
3.浮遊性の哺乳動物細胞が、無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性の哺乳動物細胞である、前項1または2に記載の方法。
4.浮遊性の哺乳動物細胞が、CHO細胞を浮遊培養に馴化した浮遊性のCHO細胞、PER.C6細胞、ラットミエローマ細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(またはYB2/0ともいう)および浮遊培養に馴化した浮遊性のマウスミエローマ細胞NS0から選ばれるいずれか1つの細胞である前項1〜3のいずれか1に記載の方法。
5.CHO細胞がCHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である前項4に記載の方法。
6.減弱化した選択マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子である、前項1〜5のいずれか1に記載の方法。
7.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ当該哺乳動物細胞内で使用頻度の低いコドンを含むように改変された遺伝子である、前項6に記載の方法。
8.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の10%以上を改変された遺伝子である、前項6または7に記載の方法。
9.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、70%以上のロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項6〜8のいずれか1に記載の方法。
10.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、70%以上のアラニン残基に対応するコドンがGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項6〜9のいずれか1に記載の方法。
11.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てTTAであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項6〜10のいずれか1に記載の方法。
12.選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる1の選択マーカー遺伝子である、前項1〜11のいずれか1に記載の方法。
13.一対のトランスポゾン配列が哺乳動物細胞で機能する一対のトランスポゾン由来の塩基配列である前項1〜12のいずれか1に記載の方法。
14.一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、一対のTol2由来の塩基配列である前項13に記載の方法。
15.一対のTol2由来の塩基配列が、配列番号2で表される塩基配列および配列番号3で表される塩基配列である前項14に記載の方法。
16.一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号35で表される塩基配列および配列番号36で表される塩基配列である前項13に記載の方法。
17.目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端にトランスポゾン配列を含む発現ベクターが導入され、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞。
18.以下のベクター(a)および(b)を同時に導入されることで、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞。
(a)目的タンパク質をコードするDNAと減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含むタンパク質発現ベクター
(b)該トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース(転移酵素)をコードするDNAを含むベクター
19.無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性の哺乳動物細胞である、前項17または18に記載の哺乳動物細胞。
20.CHO細胞を浮遊培養に馴化した浮遊性のCHO細胞、PER.C6細胞、ラットミエローマ細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(またはYB2/0ともいう)および浮遊培養に馴化した浮遊性のマウスミエローマ細胞NS0から選ばれるいずれか1つの細胞である前項17〜19のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
21.CHO細胞が、CHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である前項20に記載の哺乳動物細胞。
22.減弱化した選択マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子である、前項17〜21のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
23.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ当該哺乳動物細胞内で使用頻度の低いコドンを含むように改変された遺伝子である、前項22記載の哺乳動物細胞。
24.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の10%以上を改変された遺伝子である、前項22または23に記載の哺乳動物細胞。
25.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、70%以上のロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項22〜24のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
26.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、70%以上のアラニン残基に対応するコドンがGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項22〜25のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
27.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てTTAであるように、もしくはアラニン残基に対応するコドンが全てGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項22〜26のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
28.選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる1の選択マーカー遺伝子である、前項17〜27のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
29.一対のトランスポゾン配列が哺乳動物細胞で機能する一対のトランスポゾン由来の塩基配列である前項17〜28のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
30.一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、一対のTol2由来の塩基配列である前項29に記載の哺乳動物細胞。
31.一対のTol2由来の塩基配列が、配列番号2で表される塩基配列および配列番号3で表される塩基配列である前項30に記載の哺乳動物細胞。
32.一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号35で表される塩基配列および配列番号36で表される塩基配列である前項29に記載の哺乳動物細胞。
33.目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
34.一対のトランスポゾン配列が一対のTol2由来の塩基配列である前項33に記載の発現ベクター。
35.一対のTol2由来の塩基配列が、配列番号2で表される塩基配列および配列番号3で表される塩基配列である前項34に記載の発現ベクター。
36.減弱化した選択マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子である、前項33〜35のいずれか1に記載のベクター。
37.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ当該哺乳動物細胞内で使用頻度の低いコドンを含むように改変された遺伝子である、前項36に記載のベクター。
38.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の10%以上を改変された遺伝子である、前項36または37に記載のベクター。
39.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、70%以上のロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項36〜38のいずれか1に記載のベクター。
40.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、70%以上のアラニン残基に対応するコドンがGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項36〜39のいずれか1に記載のベクター。
41.哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項36〜40のいずれか1に記載のベクター。
42.選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる1の選択マーカー遺伝子である、前項33〜41のいずれか1に記載のベクター。
(a)目的タンパク質をコードするDNAと選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
以下の(A)および(B)の工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質の生産方法を挙げることができる。
(A)以下の発現ベクター(a)および(b)を同時に浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一過性に発現させたトランスポゼースにより、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程;
(a)目的タンパク質をコードするDNAと選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
(B)前記目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
(1)野生型ネオマイシン耐性遺伝子および抗ヒトCD98抗体を発現するトランスポゾンベクターの作製
タンパク質発現用プラスミドベクターには、一対のTol2由来の塩基配列の間に挿入された任意のヒト抗体遺伝子および薬剤耐性マーカー遺伝子を含む、哺乳動物細胞用遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いた。
トランスポゾン配列は、日本国特開2003−235575号公報により開示されている非自律性Tol2トランスポゾンの塩基配列(配列番号1)のうち、1番目から200番目の塩基配列(Tol2−L配列)(配列番号2)と、2285番目から2788番目の塩基配列(Tol2−R配列)(配列番号3)の塩基配列を用いた。
(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号9で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子1に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターBを作製した。
(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号11で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子2に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターCを作製した。
(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号13で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子3に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターDを作製した。
実施例1(1)〜(4)で作製した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターA〜Dを、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるTol2トランスポゼースを発現するベクターpCAGGS−T2TP(Kawakami K&Noda T.Genetics.166, 895−899(2004))とともに浮遊化CHO−K1細胞にそれぞれ導入し、抗体生産細胞A〜Dを作製した。
(1)改変型ピューロマイシン耐性遺伝子1を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターの作製
実施例1(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を配列番号21で表される塩基配列からなる改変型ピューロマイシン耐性遺伝子1に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターEを作製した。
実施例1(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を配列番号23で表される塩基配列からなる改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターFを作製した。
実施例3(1)の改変型ピューロマイシン耐性遺伝子1を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターE、実施例3(2)の改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターF、Tol2トランスポゼース発現ベクターpCAGGS−T2TPを浮遊化したCHO−K1細胞に導入し、抗体生産細胞EおよびFを作製した。
実施例4で得られた改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2を発現する抗体生産細胞Fを三角フラスコで培養し、抗ヒトCD98抗体を生産した。
10%血清(FCS)を添加したα−MEM培地(Invitrogen社)で培養した接着性CHO−K1細胞EC85051005(European Collection of Cell Cultures)を、トリプシン処理により剥離、回収し、新しい10% FCS添加α−MEM培地を用いて、37℃、5% CO2インキュベータ内で、振とう培養した。数日後、これらの細胞が増殖していることを確認したのち、5%FCS添加α−MEM培地に2×105個/mLの濃度で播種し、振とう培養を行った。
配列番号2−人工配列の説明;Tol2−L配列
配列番号3−人工配列の説明;Tol2−R配列
配列番号7−人工配列の説明;野生型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号8−人工配列の説明;野生型ネオマイシン耐性遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
配列番号9−人工配列の説明;改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号10−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号11−人工配列の説明;改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号12−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号13−人工配列の説明;改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号14−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号15−人工配列の説明;抗ヒトCD98抗体重鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号16−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号17−人工配列の説明;抗ヒトCD98抗体軽鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号18−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号19−人工配列の説明;野生型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号20−人工配列の説明;野生型ピューロマイシン耐性遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
配列番号21−人工配列の説明;改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号22−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号23−人工配列の説明;改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号24−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号25−人工配列の説明;改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号26−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号27−人工配列の説明;改変型ゼオシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号28−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号29−人工配列の説明;改変型ゼオシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号30−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号31−人工配列の説明;改変型ハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号32−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号33−人工配列の説明;改変型ハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号34−人工配列の説明;合成コンストラクトのアミノ酸配列
Claims (22)
- 目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該CHO細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性のCHO細胞を得て、且つ該CHO細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法であって、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該CHO細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列である方法。 - 以下の(A)および(B)の工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質の生産方法であって、(A)以下のベクター(a)および(b)を同時に無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入し、一過性に発現させたトランスポゼースにより、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該CHO細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞を得る工程、
(a)目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、
(b)前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター、
(B)前記目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該CHO細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列である方法。 - CHO細胞がCHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である請求項1または2に記載の方法。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の10%以上が改変された遺伝子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、70%以上のロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、70%以上のアラニン残基に対応するコドンがGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てTTAであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる1の選択マーカー遺伝子である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端にトランスポゾン配列を含む発現ベクターが導入され、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞であって、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該CHO細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列であるCHO細胞。 - 以下のベクター(a)および(b)を同時に導入されることで、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞であって、
(a)目的タンパク質をコードするDNAと減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含むタンパク質発現ベクター、
(b)該トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース(転移酵素)をコードするDNAを含むベクター、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該CHO細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列であるCHO細胞。 - CHO細胞が、CHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である請求項9または10に記載のCHO細胞。
- 該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の10%以上が改変された遺伝子である、請求項9〜11のいずれか1項に記載のCHO細胞。
- 該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、70%以上のロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項9〜12のいずれか1項に記載のCHO細胞。
- 該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、70%以上のアラニン残基に対応するコドンがGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項9〜13のいずれか1項に記載のCHO細胞。
- 該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てTTAであるように、もしくはアラニン残基に対応するコドンが全てGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項9〜14のいずれか1項に記載のCHO細胞。
- 選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる1の選択マーカー遺伝子である、請求項9〜15のいずれか1項に記載のCHO細胞。
- 目的タンパク質をコードするDNAおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む、タンパク質生産に用いる発現ベクターであって、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該CHO細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列である発現ベクター。 - CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の10%以上が改変された遺伝子である、請求項17に記載のベクター。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、70%以上のロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項17または18に記載のベクター。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、70%以上のアラニン残基に対応するコドンがGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項17〜19のいずれか1項に記載のベクター。
- CHO細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンがTTAであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てGCGであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項17〜20のいずれか1項に記載のベクター。
- 選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる1の選択マーカー遺伝子である、請求項17〜21のいずれか1項に記載のベクター。
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