WO2017104821A1 - 浮遊培養馴化接着型細胞の調製方法、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導方法、及びそれらの利用 - Google Patents

浮遊培養馴化接着型細胞の調製方法、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導方法、及びそれらの利用 Download PDF

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孝明 平野
由美子 三村
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing adherent cells adapted to suspension culture.
  • the present invention also relates to a method for inducing epithelial-mesenchymal transition of adhesive epithelial cells.
  • a biopharmaceutical is a recombinant pharmaceutical produced by genetic engineering techniques.
  • recombinant medicines those containing as a component an antibody used for cancer treatment or rheumatism treatment, or a protein such as erythropoietin (EPO), which is a hormone for increasing red blood cells, are known.
  • EPO erythropoietin
  • recombinant drugs have not been widely spread because they are administered in large amounts for treatment and can be expensive to produce. Therefore, raising productivity is an issue.
  • Recombinant pharmaceuticals are, for example, in recombinant CHO cells prepared by introducing a gene of a target protein into adherent cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells and proliferating in a floating state. Produced by biosynthesis of the protein of interest.
  • adherent cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells
  • proliferating in a floating state Produced by biosynthesis of the protein of interest.
  • adherent cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells
  • proliferating in a floating state Produced by biosynthesis of the protein of interest.
  • adherent cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells
  • Patent Document 1 discloses that a gene having a gene encoding a target protein and a plasmid having a dihydrofolate reductase gene are introduced into a CHO cell, and the resulting recombinant CHO cell is obtained.
  • a method is described in which recombinant CHO cells are cultured in a suspended state by repeating the culture under conditions where the cell density is lower than usual.
  • this method repeats the culture until the CHO cells are brought into a floating state, a long time of about 8 weeks is required.
  • the subculture period becomes long, the labor and cost for managing and confirming the state of gene mutation, cell alteration, and the like will increase.
  • Patent Document 2 discloses that a recombinant CHO cell in which a human antithrombin gene and a dihydrofolate reductase gene are incorporated into a dihydrofolate reductase gene-deficient cell and is suspended is cultured using a hollow fiber culture apparatus.
  • a method for producing human antithrombin while suspending the cells is described.
  • this method has a problem in terms of cost because a device incorporating a hollow fiber is complicated and expensive.
  • the hollow fiber size was increased for mass culture, medium exchange at both ends of the hollow fiber was not uniform, and the medium was likely to be non-uniform. As a result, the pH of the medium changes and stress is applied to the cells in the hollow fiber, which may reduce the productivity of the target protein.
  • epithelial-mesenchymal transition Transformation
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • epithelial-mesenchymal transition marker Such a protein is called an epithelial-mesenchymal transition marker, and there are a protein whose expression level increases (up regulation) and a protein whose expression level decreases (down regulation) due to induction of epithelial-mesenchymal transition.
  • N-cadherin or vimentin is known as an expression level increasing
  • E-cadherin or cytokeratin is known as an expression level decreasing (Patent Document 3).
  • epithelial-mesenchymal transition is induced by growth factors such as TGF
  • growth factors such as TGF are known as epithelial-mesenchymal transition-inducing factors (Non-patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and does not require special operation of the adherent cells, and does not die even in a floating state, and a method for preparing an adherent cell adapted to suspension culture, Method for producing nucleic acid or protein using adhesion-type cells conditioned to suspension culture prepared by the method, suspension culture acclimation promoter for adhesion-type cells composed of polymer molded products containing alicyclic structures, and adhesion-type cells to suspension culture It is an object of the present invention to provide a container for acclimation to suspension culture of adherent-type cells, and use of an alicyclic structure-containing polymer molded body for acclimation.
  • the present invention also relates to a method for inducing epithelial-mesenchymal transition in the cells by simply contacting the adhesive epithelial cells, a method for producing a nucleic acid or protein using cells that have undergone epithelial-mesenchymal transition by the method, alicyclic Adhesive epithelial cell epithelial-mesenchymal transition inducer comprising structure-containing polymer molded product, use of alicyclic structure-containing polymer molded product for inducing epithelial-mesenchymal transition of adhesive epithelial cells, and adhesive epithelial cell
  • An object is to provide a container for inducing epithelial-mesenchymal transition.
  • the present inventor has cultivated an adhesion-type cultured cell in a state of being in contact with an alicyclic structure-containing polymer molded product, thereby originally producing an extracellular matrix that is a scaffold. It has been found that the required adherent cells can be grown in a suspension culture system, that is, the adherent cells can be acclimatized, and the present invention relating to the suspension acclimatization of adherent cells has been completed. Furthermore, the present inventors have found that the cells are converted into properties like mesenchymal cells by contacting the polymer molded product containing an alicyclic structure, and the epithelial-mesenchymal transition of the adhesive epithelial cells. The present invention related to induction has been completed.
  • a method for inducing mesenchymal transition, (16) an epithelial-mesenchymal transition inducer for adhesive epithelial cells, and (18), (19) a container for inducing epithelial-mesenchymal transition of adhesive epithelial cells are provided.
  • a method for preparing adherent cells adapted to suspension culture comprising a step of culturing adherent cells in contact with an alicyclic structure-containing polymer molded article.
  • Production method. (7) A suspension culture acclimatization promoter for adherent-type cells comprising an alicyclic structure-containing polymer molded article. (8) Use of an alicyclic structure-containing polymer molded product for acclimating adherent cells to suspension culture in a liquid medium. (9) A container for acclimatization of suspension culture of adherent cells, wherein at least the bottom surface is made of an alicyclic structure-containing polymer molded product. (10) The suspension culture acclimatization container according to (9), wherein the alicyclic structure-containing polymer is a saturated norbornene polymer.
  • a method for inducing epithelial-mesenchymal transition comprising a step of culturing adhesive epithelial cells in contact with an alicyclic structure-containing polymer molded product.
  • a nucleic acid or protein encoded by a foreign gene is cultured by culturing adherent cells that have undergone epithelial-mesenchymal transition by the method for inducing epithelial-mesenchymal transition according to any one of (12) to (14). Production method.
  • An epithelial-mesenchymal transition inducer for adhesive epithelial cells comprising an alicyclic structure-containing polymer molded product.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of counting the number of EPO-producing CHO cells pre-cultured by the method of the present invention.
  • FIG. 2 shows the total number of cells with respect to the number of days elapsed when all cells after preculture mainly composed of CHO cells adapted to suspension culture prepared by the method of the present invention were cultured in the suspension culture system. It is a graph.
  • FIG. 3 shows the average doubling time of each precultured sample in the first to third days of culture (live cell growth phase) calculated from the total cell data cultured in the suspension culture system by the method of the present invention. It is a graph to show.
  • the method of the present invention is characterized in that the adherent cells are cultivated in contact with the alicyclic structure-containing polymer molded product, thereby acclimatizing the adherent cells to suspension culture in a liquid medium.
  • This is a method for preparing adherent cells.
  • adherent cells are acclimated to suspension culture, the adherent cells are adapted to the culture environment, so compared to the average doubling time of suspension culture of adherent cells that are not suspended.
  • the adherent cells thus obtained have a shorter average doubling time.
  • the adherent cell according to the present invention is not particularly limited, and can be arbitrarily selected according to the purpose.
  • an adherent cell refers to a cell that can survive and proliferate by adhering to an extracellular matrix under normal culture conditions.
  • Adhesive cells include epithelial cells and fibroblasts.
  • cells that have been subjected to genetic engineering treatment, such as genetically modified adhesive cells, in which a foreign gene is incorporated into these cells may be used.
  • Specific examples of adherent cells include CHO cells, VERO cells, NIH3T3 cells, HEK293 cells, and the like. Among these, CHO cells are preferable because they are easy to acclimate to floating.
  • a cell that can express a foreign gene by transduction using a phage or plasmid vector or the like is used for the adherent cell.
  • the cells used in the method for inducing epithelial-mesenchymal transition of the present invention include single-layered squamous epithelial cells, multi-layered squamous epithelial cells, columnar epithelial cells, pili (multi-row pili) epithelial cells, transition cells Epithelial cells classified into epithelial cells, cubic epithelial cells, and the like, and epithelial cell-like cells having the same form as these.
  • CHO cells and HEK293 cells are examples of epithelial cells.
  • the foreign gene can be arbitrarily selected according to the purpose. Specifically, erythropoietin (hereinafter referred to as “EPO”), interferon ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ), granulocyte colony stimulating factor G-CSF, interleukin, granulocyte macrophage / colony stimulating factor GM-CSF, human growth hormone
  • EPO erythropoietin
  • ⁇ , ⁇ , ⁇ interferon
  • G-CSF interleukin
  • granulocyte macrophage / colony stimulating factor GM-CSF human growth hormone
  • a gene encoding a protein such as insulin, glucagon HGF, blood coagulation factor VIII, a biologically active protein such as a cytokine or a hormone such as a human-type antibody
  • RNA of a specific target eg, cancer cell
  • miR-369 A gene encoding nucleic acid (RNA) such as microRNA and its precursor, which inhibits synthesis and is expected as
  • a liquid medium When culturing cells, a liquid medium is used.
  • a medium having a pH buffering action having an osmotic pressure suitable for cells, containing nutrient components of cells, and not toxic to cells is used.
  • the component exhibiting pH buffering action include tris hydrochloride, various phosphates, and various carbonates.
  • the osmotic pressure of the liquid medium is usually adjusted using an aqueous solution in which the concentrations of potassium ions, sodium ions, calcium ions, glucose and the like are adjusted so as to be almost the same as the osmotic pressure of the cells.
  • aqueous solution examples include physiological saline such as phosphate buffered saline, Tris buffered saline, and HEPES buffered saline; Ringer's solution such as lactated Ringer's solution, acetated Ringer's solution, and bicarbonated Ringer's solution; It is done.
  • the nutrient component of the cell include amino acids, nucleic acids, vitamins, minerals and the like.
  • various commercial products such as RPMI-1640, HAM, ⁇ -MEM, DMEM, EMEM, F-12, F-10, and M-199 can be used.
  • additives can also be mix
  • additives include inducers such as proteins, low molecular compounds having differentiation-inducing activity, minerals, metals, and vitamin components.
  • Additives used include ligands, agonists and antagonists that act on receptors on the cell surface; ligands, agonists and antagonists of nuclear receptors; extracellular matrices such as collagen and fivenectin; part of the extracellular matrix or Simulated compounds; components that act on proteins involved in intracellular signal transduction pathways; components that act on enzymes of primary or secondary metabolism in cells; influences the expression of genes in the nucleus or mitochondria in cells Components to be given; DNA and RNA that can be introduced into cells in combination with viral vectors and the like. These additives can be used alone or in combination of two or more.
  • the cell culture conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined according to the cells to be used and the purpose.
  • the cells can be cultured using a humidified thermostat having a carbon dioxide concentration of about 5% and a constant temperature in the range of 20 ° C. to 37 ° C.
  • the alicyclic structure-containing polymer molded product used in the present invention is formed by molding an alicyclic structure-containing polymer into an arbitrary shape.
  • the alicyclic structure-containing polymer is a resin having an alicyclic structure in the main chain and / or side chain. Especially, what contains an alicyclic structure in a principal chain from viewpoints of mechanical strength, heat resistance, etc. is preferable.
  • Examples of the alicyclic structure include a saturated cyclic hydrocarbon (cycloalkane) structure and an unsaturated cyclic hydrocarbon (cycloalkene) structure. From the viewpoints of mechanical strength, heat resistance and the like, a cycloalkane structure or a cycloalkene structure is preferable, and among them, one having a cycloalkane structure is most preferable.
  • the number of carbon atoms constituting the alicyclic structure is not particularly limited, but is usually 4 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 5 to 15. When the number of carbon atoms constituting the alicyclic structure is within this range, mechanical strength, heat resistance, and moldability are highly balanced, which is preferable.
  • the proportion of the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer may be appropriately selected according to the purpose of use, but is usually 30% by weight or more, preferably 50% by weight or more, more preferably 70% by weight. %. If the proportion of the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer is excessively small, the heat resistance is inferior, which is not preferable.
  • the remainder other than the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer is not particularly limited and is appropriately selected according to the purpose of use.
  • alicyclic structure-containing polymer examples include (1) norbornene polymer, (2) monocyclic olefin polymer, (3) cyclic conjugated diene polymer, and (4) vinyl alicyclic carbonization.
  • examples thereof include hydrogen polymers and hydrides of (1) to (4).
  • hydrides of norbornene polymers are preferable from the viewpoints of heat resistance, mechanical strength, and the like.
  • Norbornene polymer and hydride thereof Norbornene polymer is obtained by polymerizing norbornene monomer which is a monomer having a norbornene skeleton, which is obtained by ring-opening polymerization and addition. It is roughly divided into those obtained by polymerization.
  • Examples of the ring-opening polymer obtained include ring-opening polymers of norbornene monomers, ring-opening polymers of norbornene monomers and other monomers capable of ring-opening copolymerization, and these A hydride etc. are mentioned.
  • Examples of the polymer obtained by addition polymerization include addition polymers of norbornene monomers and addition polymers of norbornene monomers and other monomers copolymerizable therewith.
  • the saturated norbornene-based polymer is preferable from the viewpoints of heat resistance, mechanical strength, etc., and preferably has no polar group because the cells easily float.
  • norbornene monomers examples include bicyclo [2.2.1] hept-2-ene (common name: norbornene), 5-methyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5,5- Dimethyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-ethyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-ethylidene-bicyclo [2.2.1] hept-2- Ene, 5-vinyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-propenylbicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-methoxycarbonyl-bicyclo [2.2.1] Bicyclic such as hepta-2-ene, 5-cyanobicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-methyl-5-methoxycarbonyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene Monomer; tricyclo [4.3.0 1,6 .
  • deca-3,7-diene (common name: dicyclopentadiene), 2-methyldicyclopentadiene, 2,3-dimethyldicyclopentadiene, 2,3-dihydroxydicyclopentadiene, etc.
  • Monomer Tetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene (tetracyclododecene), tetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene, 8-methyltetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene, 8-ethyltetracyclo [4.4.0.1 2,5 .
  • dec-3-ene (common name: methanotetrahydrofluorene: 1,4-methano-1, 4,4a, 9a-tetrahydrofluorene), 1,4-methano-8-methyl-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene, 1,4-methano-8-chloro-1,4,4a, 9a A tetracyclic monomer such as tetrahydrofluorene and 1,4-methano-8-bromo-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene;
  • monomers capable of ring-opening copolymerization with norbornene monomers include cyclohexene, cycloheptene, cyclooctene, 1,4-cyclohexadiene, 1,5-cyclooctadiene, 1,5-cyclodecadiene, And monocyclic cycloolefin monomers such as 1,5,9-cyclododecatriene and 1,5,9,13-cyclohexadecatetraene.
  • These monomers may have one or more substituents. Examples of the substituent include an alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a silyl group, an alkoxycarbonyl group, and an alkylidene group.
  • ⁇ -olefin monomers having 2 to 20 carbon atoms such as ethylene, propylene, 1-butene, 1-pentene and 1-hexene; cyclobutene, cyclopentene, cyclohexene, cyclooctene, tetracyclo [9.2.1.0 2,10.
  • Cycloolefin monomers such as 0 3,8 ] tetradeca-3,5,7,12-tetraene (also referred to as 3a, 5,6,7a-tetrahydro-4,7-methano-1H-indene);
  • Non-conjugated diene monomers such as 4-hexadiene, 4-methyl-1,4-hexadiene, 5-methyl-1,4-hexadiene, 1,7-octadiene, and the like.
  • ⁇ -olefin monomers are preferable, and ethylene is more preferable.
  • These monomers may have one or more substituents. Examples of the substituent include an alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a silyl group, an alkoxycarbonyl group, and an alkylidene group.
  • a ring-opening polymer of a norbornene-based monomer, or a ring-opening polymer of a norbornene-based monomer and another monomer capable of ring-opening copolymerization with a monomer component is a known ring-opening polymerization. It can be obtained by polymerization in the presence of a catalyst.
  • the ring-opening polymerization catalyst include a catalyst comprising a metal halide such as ruthenium or osmium, a nitrate or an acetylacetone compound, and a reducing agent, or a metal halide or acetylacetone such as titanium, zirconium, tungsten, or molybdenum.
  • a catalyst comprising a compound and an organoaluminum compound can be used.
  • the ring-opening polymer hydride of a norbornene-based monomer is usually obtained by adding a known hydrogenation catalyst containing a transition metal such as nickel or palladium to the polymerization solution of the ring-opening polymer, and then adding a carbon-carbon unsaturated bond. Can be obtained by hydrogenation.
  • a catalyst composed of a titanium, zirconium or vanadium compound and an organoaluminum compound can be used.
  • Monocyclic cyclic olefin polymer for example, an addition polymer of a monocyclic olefin monomer such as cyclohexene, cycloheptene, or cyclooctene can be used. it can.
  • Cyclic conjugated diene polymer and hydride thereof Cyclic conjugated diene polymer and hydride thereof include, for example, cyclic conjugated diene monomers such as cyclopentadiene, cyclohexadiene, 1, 2- or 1, Examples include 4-addition polymerized polymers and hydrides thereof.
  • Vinyl alicyclic hydrocarbon polymer and its hydride include, for example, vinyl alicyclic hydrocarbon monomers such as vinyl cyclohexene and vinyl cyclohexane. A polymer and a hydride thereof; a hydride of an aromatic ring portion of a polymer of a vinyl aromatic monomer such as styrene or ⁇ -methylstyrene; and the like.
  • the vinyl alicyclic hydrocarbon polymer may be a copolymer with other monomers copolymerizable with these monomers. These alicyclic structure-containing polymers can be used alone or in combination of two or more.
  • an alicyclic structure containing polymer Although there is no special restriction
  • the glass transition temperature of the alicyclic structure-containing polymer may be appropriately selected depending on the purpose of use, but is usually 50 to 300 ° C, preferably 100 to 280 ° C, particularly preferably 115 to 250 ° C, and more preferably 130. ⁇ 200 ° C. When the glass transition temperature is within this range, heat resistance and molding processability are highly balanced and suitable. In the present invention, the glass transition temperature is measured based on JIS K7121.
  • a compounding agent usually used in thermoplastic resin materials for example, a soft polymer, an antioxidant, an ultraviolet absorber, a light stabilizer, a near infrared absorber, a release agent. Coloring agents such as dyes and pigments, plasticizers, antistatic agents, fluorescent whitening agents, and other compounding agents can be added in amounts usually employed.
  • the alicyclic structure-containing polymer may be mixed with another polymer other than the soft polymer (hereinafter simply referred to as “other polymer”).
  • the amount of the other polymer mixed with the alicyclic structure-containing polymer is usually 200 parts by weight or less, preferably 150 parts by weight or less, more preferably 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the alicyclic structure-containing polymer. It is as follows. If the proportion of various compounding agents and other polymers to be blended with the alicyclic structure-containing polymer is too high, cells will not float easily, so all are blended within the range that does not impair the properties of the alicyclic structure-containing polymer. It is preferable.
  • the mixing method with the compounding agent and other polymers is not particularly limited as long as the compounding agent is sufficiently dispersed in the polymer. Moreover, there is no special restriction
  • a blending method for example, a method of kneading a resin in a molten state using a mixer, a single-screw kneader, a twin-screw kneader, a roll, a Brabender, an extruder, etc., after dissolving and dispersing in an appropriate solvent, Examples include a method of removing the solvent by a coagulation method, a casting method, or a direct drying method.
  • a biaxial kneader after kneading, it is usually extruded in a rod shape in a molten state, cut into an appropriate length with a strand cutter, and pelletized in many cases.
  • the molding method of the alicyclic structure-containing polymer can be arbitrarily selected according to the shape of the alicyclic structure-containing polymer molded product used when contacting the cells.
  • molding methods include injection molding, extrusion molding, cast molding, inflation molding, blow molding, vacuum molding, press molding, compression molding, rotational molding, calendar molding, and rolling molding. , Cutting molding method, spinning and the like, and these molding methods can be combined, or post-treatment such as stretching can be carried out as necessary after molding.
  • the shape of the polymer molded product containing an alicyclic structure in contact with cells there is no particular limitation on the shape of the polymer molded product containing an alicyclic structure in contact with cells, and examples thereof include a plate shape and a sheet shape. The surface may be flat or uneven. Good. Furthermore, the container which contains the molded body of such a shape as a part of a structural member may be sufficient, the container comprised entirely with the alicyclic structure containing polymer molded body, and an alicyclic ring may be sufficient as it. The container comprised with the laminated body of a structure containing polymer molded object and another polymer molded object may be sufficient. Specific container shapes include culture containers such as dishes, plates, bags, tubes, scaffolds, cups, and jar fermenters.
  • the alicyclic structure-containing polymer molded article thus obtained is the suspension culture acclimatization promoter of the present invention having a function of promoting the adaptation of adherent cells to suspension culture.
  • the molded body in order to bring the molded body into contact with the cultured cells, the molded body is usually sterilized.
  • a sterilization method there is no particular limitation on the sterilization method, and a known sterilization method can be selected according to the shape of the molded body and the cells used.
  • a heating method such as a high-pressure steam method or a dry heat method
  • a radiation method that irradiates radiation such as ⁇ rays or electron beams
  • an irradiation method that irradiates high frequency
  • a gas method in which a gas such as ethylene oxide gas (EOG) is brought into contact Examples of the method generally used in the medical field include a filtration method using a sterilizing filter.
  • the gas method is preferable because the change in the surface state is small.
  • the alicyclic structure-containing polymer molded product used in the present invention is only required to have at least the surface in contact with the cells formed of the alicyclic structure-containing polymer, and the whole is formed from the alicyclic structure-containing polymer. Not necessarily.
  • the water contact angle of the surface of the alicyclic structure-containing polymer molded product that contacts the cells is usually 85 ° to 110 °, preferably 85 ° to 105 °, preferably 85 ° to 100 °. It is particularly preferred.
  • the surface of these molded bodies can be subjected to general surface treatments other than sterilization purposes, such as plasma treatment, corona discharge treatment, ozone treatment, and ultraviolet irradiation treatment.
  • general surface treatments other than sterilization purposes, such as plasma treatment, corona discharge treatment, ozone treatment, and ultraviolet irradiation treatment.
  • the cost generated by performing these surface treatment operations can be suppressed; the cleanliness may be impaired by partial decomposition of the surface of the formed body accompanying the surface treatment; the ability of cells to float or epithelial mesenchyme It is preferable that these surface treatment operations are not substantially performed for reasons such as the possibility that the conversion ability is lowered;
  • “substantially do not perform these surface treatment operations” means that these surface treatment operations are not performed, or even if a surface treatment operation is performed, the surface defined by the following formula
  • the change rate [X (%)] of the water contact angle on the surface of the molded body after the treatment operation is within ⁇ 20%, preferably within ⁇ 10% Means that.
  • any method may be adopted depending on the shape of the alicyclic structure-containing polymer molded product.
  • a cell such as a petri dish, a bag, a bottle or the like having at least one surface formed of an alicyclic structure-containing polymer is used to attach cells to the surface formed of the alicyclic structure-containing polymer. Incubate as before. At the beginning of seeding, the cells that have adhered to the surface formed of the polymer containing the alicyclic structure naturally detach in a few days and survive in a floating state. That is, the cells that survive in this floating state are adherent cells that have been adapted to suspension culture.
  • Adhesive cells acclimated to suspension culture by the method of the present invention may form a cell mass when static culture is continued as it is, but dissociated by shaking in a normal suspension culture system, It can be used as an adherent cell adapted to a single suspension culture.
  • the culture method of the present invention can be cultured in a suspended state at a high density even in the case of an adherent cell, it is preferably used when producing nucleic acid or protein in the cell. .
  • the protein can be produced in large quantities by contacting the cell with an alicyclic structure-containing polymer molded product.
  • the adherent cells in contact with the alicyclic structure-containing polymer molded article have enhanced transcription amounts of epithelial-mesenchymal transition factors such as TGF, HGF, and FGF, decreased E-cadherin, N-cadherin and vimentin.
  • epithelial-mesenchymal transition marker such as an increase in. That is, as described above, the epithelial-mesenchymal transition can be induced in the adherent cells by culturing the adherent epithelial cells in contact with the alicyclic structure-containing polymer molded product. That is, the alicyclic structure-containing polymer molded product functions as an epithelial-mesenchymal transition agent.
  • the alicyclic structure-containing polymer molding is a culture vessel, no special operation is required, and epithelial-mesenchymal transition can be caused only by culturing using this vessel.
  • Plasmid pLXRN-EPO is constructed by inserting the EPO gene sequence into the expression gene insertion site of the vector pLXRN (manufactured by Chlontech) containing a gene resistant to antibiotic G418. did. The EPO gene in the constructed plasmid was confirmed by analyzing its base sequence. Next, virus particles containing the EPO gene were prepared by transducing the constructed plasmid pLXRN-EPO and the plasmid pVSV-G (Clontech) into package cells GP293T cells (Clontech). In addition, Lipofectamine (manufactured by Invitrogen) was used as a gene introduction reagent for the introduction of plasmid pLXRN-EPO into cells, and the gene introduction was performed according to the manufacturer's manual.
  • the GP293T cells subjected to the gene transfer operation are cultured, the culture supernatant is removed, filtered, and 8 ⁇ g / ml polybrene (manufactured by Santacruz) is added to the culture containing virus particles retaining the EPO gene.
  • a clear sample was prepared.
  • the virus retaining the EPO gene The particles were infected with CHO cells. After 8 hours of incubation, the culture medium for CHO cells was changed to a culture operation for CHO cells producing recombinant EPO.
  • Viral infection was confirmed by genomic PCR as follows. First, using Instagene (manufactured by BioRad), the genome was extracted from the infected CHO cells, and it was confirmed by PCR that the pLXRN-EPO sequence was introduced into the genome. Primers used for PCR were pLXRN-seq-F (5′-CGCCCTCCGTCTGAATTTT) and pLXRN-seq-R (TCCCTATGCAAAAGCGAAAC). In order to select CHO cells infected with the virus and having the EPO gene incorporated in the genome, antibiotic G418 is added to the medium, the culture is maintained, and antibiotic E418 resistant CHO cells are selected by drug selection. Producing CHO cells (hereinafter referred to as EPO producing CHO cells) were selected.
  • Example 1 As an alicyclic structure-containing polymer, a norbornene-based ring-opening polymer hydride [ZEONEX (registered trademark) 790R, manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd .; hereinafter simply referred to as “790R”] is used to produce a dish having a diameter of 3 cm by injection molding. Was made. Hereinafter, this dish is referred to as “790R dish”. The water contact angle of the bottom surface (the side in contact with the cells) of the 790R dish was 90 °.
  • EPO-producing CHO cells were seeded at 0.624 ⁇ 10 4 cells / cm 2 using a 790R dish as a culture container and Ham medium containing 10% fetal bovine serum as a liquid medium, and 5% CO Cultivation was performed for 7 days under conditions of 2 atmospheres and 37 ° C. (Counting the number of cells) The number of cells adhering to floating cells was counted by the following method. Floating cells: The culture supernatant was removed and centrifuged, and only the culture supernatant was removed, and trypan blue was allowed to act on the resulting cell components. After reacting for about 3 minutes, the sample was stained with trypan blue to count the number of live and dead cells. A cell number measuring device was used for the measurement.
  • Adherent cells The culture supernatant was removed, washed with physiological saline, and then detached from the dish by trypsin treatment. After detachment, these cell samples were stained with trypan blue in a serum-containing culture medium to count the number of live and dead cells. For the measurement, the same apparatus was used.
  • Example 1 In Example 1, instead of the 790R dish, the culture was performed in the same manner as in Example 1 except that a polystyrene dish [Falcon (registered trademark) dish (model number 353001, manufactured by Becton Dickinson)] was used. The cell number was counted.
  • a polystyrene dish [Falcon (registered trademark) dish (model number 353001, manufactured by Becton Dickinson)] was used. The cell number was counted.
  • Example 1 and Comparative Example 1 which are pre-culture steps, are shown in FIG.
  • the pre-culture period 7 days after seeding
  • the 790R dish the appearance of floating EPO-producing CHO cells of about 80% of the total number of cells was observed, and most of them were living cells.
  • the polystyrene dish most of the cells were adhered to the bottom surface, and the floating cells existed as one cell alone, and most of them were dead.
  • Example 2 Floating EPO-producing CHO cells that appeared in the 790R pre-dish culture step and EPO-producing CHO cells that were still attached were collected in tubes.
  • the culture supernatant in the dish was removed, washed with physiological saline, and then detached and collected from the dish by trypsin treatment.
  • Each cell was mixed in a sterilized tube, and after centrifugation, the culture medium was removed and only the cell components were suspended in fresh medium.
  • the culture medium in which the cells were suspended was added to the culture vessel of the suspension culture apparatus (Able), and suspension culture was started.
  • Example 2 In Example 2, except that a polystyrene dish was used in the pre-culture step, the same operation as in Example 2 was performed to start suspension culture.
  • Example 2 and Comparative Example 2 which are suspension culture processes, are shown in FIG.
  • the EPO-producing CHO cells pre-cultured in the 790R dish are more proliferating than the EPO-producing CHO cells pre-cultured in the polystyrene dish, and the cell sample pre-cultured in the 790R dish is a sample adapted to the floating cell system. It is believed that there is.
  • the average doubling time of the adherent cells statically cultured in the polystyrene dish was 15.6 hours, which was the fastest compared.
  • the cell sample pre-cultured in the 790R dish has a faster average doubling time than the cell sample pre-cultured in the polystyrene dish, and the cell sample pre-cultured in the 790R dish acclimated to the suspension culture. It is thought that it was converted to the state.
  • Example 3 The CHO cells in the culture vessel after 8 days of culture were collected by the same method as in Example 1 and the CHO cells in the culture vessel after 8 days of culture were collected by the same method as in Comparative Example 1, and all the collected cells were collected by Trizol ( Dissolved in Invitrogen). RNA was collected from the lysed sample. The collection method followed the product manual. Subsequently, the recovered RNA was analyzed by (HiSeq (registered trademark), manufactured by Illumina). The experiment was performed twice, changing the NGS analysis conditions. Both analyzes were performed by the paired-end method. Each of the Read numbers was about 30 million or 50 million.
  • TGF, HGF, and FGF which are epithelial-mesenchymal transition inducers, is enhanced in the cell sample cultured in the 790R dish compared to the cell sample cultured in the polystyrene dish. I understand.
  • the cell samples cultured in the 790R dish had less epithelial-mesenchymal transition markers E-cadherin and cytokeratin than the cell samples cultured in the polystyrene dish, and N-cadherin and vimentin. , And fibronectin is increased.
  • Tables 1 and 2 suggest that cells cultured by the method of the present invention were induced to undergo epithelial-mesenchymal transition.

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Abstract

本発明は、接着型細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法、この方法により、前記浮遊培養に馴化した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法、脂環構造含有重合体成形体からなる接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤、接着型細胞を液体培地中に浮遊培養に馴化させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用、少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型細胞の浮遊培養馴化用容器、接着型上皮細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、上皮間葉転換の誘導方法、前記誘導方法により、上皮間葉転換した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法等である。

Description

浮遊培養馴化接着型細胞の調製方法、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導方法、及びそれらの利用
　本発明は、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法に関する。また、本発明は接着型上皮細胞の上皮間葉転換の誘導方法に関する。
　近年、低分子化合物からなる医薬品に代わり、副作用の少ないバイオ医薬品の研究が盛んになっている。バイオ医薬品は、遺伝子組み換え技術により製造される組み換え医薬品である。例えば、組み換え医薬品として、ガン治療やリウマチ治療に用いられる抗体や、赤血球を増やすためのホルモンであるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）等のタンパク質を成分とするものが知られている。
　しかしながら、組み換え医薬品は、治療のために投与する量が多く、また、生産するための費用が高いことがあり、十分に普及するには至っていない。したがって、生産性を上げることが課題となっている。
　組み換え医薬品は、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ－の卵巣；Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞等の接着型細胞に、目的のタンパク質の遺伝子を導入して、浮遊状態で増殖するよう調製した組み換えＣＨＯ細胞内で、目的のタンパク質を生合成させることにより生産される。一般的に、細胞は浮遊培養システム中では、接着型由来細胞の平均倍化時間は遅くなる。そこで、増殖能力を高めるために浮遊培養環境への馴化操作が必要となる。
　接着型細胞を浮遊培養に馴化させる方法として、例えば特許文献１には、目的のタンパク質をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するプラスミドをＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、得られた組み換えＣＨＯ細胞を、通常よりも細胞密度が低い条件で培養を繰り返すことにより、組み換えＣＨＯ細胞を浮遊状態で培養する方法が記載されている。
　しかしながら、この方法は、ＣＨＯ細胞を浮遊状態にするまで培養を繰り返すものであるため、８週間程度という長い時間が必要になる。また、継代培養期間が長くなると、遺伝子の変異や細胞の変質等の状態を管理し、確認する手間と費用が増加することとなる。
　また、特許文献２には、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損株細胞に、ヒトアンチトロンビン遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を組み込み、浮遊状態とした組み換えＣＨＯ細胞を、ホローファイバー型培養装置を用いて培養することで、この細胞を浮遊させながら、ヒトアンチトロンビンを製造する方法が記載されている。
　しかしながら、この方法には、ホローファイバーを組み込んだ装置が複雑で高価であるため、費用面での問題があった。また、大量培養のためにホローファイバーサイズを大きくすると、ホローファイバーの両端での培地交換が均等ではなく、培地が不均一になりやすかった。この結果、培地のｐＨ等が変化し、ホローファイバー内の細胞にストレスがかかるため、目的のタンパク質の生産性が低下するおそれがあった。
　ところで、上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ＥＭＴ）は、発生、創傷治癒、及びがんの浸潤や転移等の生命現象の中で観察される、上皮細胞の性質が間葉細胞のそれに転換されるプロセスである。上皮間葉転換により、細胞が発現するある種のタンパク質に変化が起こる。そのようなタンパク質を上皮間葉転換マーカーと言い、上皮間葉転換の誘導により発現量が増加するもの（ｕｐ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）と減少するもの（ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）とがある。例えば、発現量が増加するものとしては、Ｎ－カドヘリンやビメンチンが知られ、発現量が減少するものとしては、Ｅ－カドヘリンやサイトケラチンが知られている（特許文献３）。また、上皮間葉転換は、ＴＧＦ等の成長因子により誘導されるため、ＴＧＦ等の成長因子は、上皮間葉転換誘導因子として知られている（非特許文献１）。
特開平２－００９３８８号公報 特開２００５－０７３５０９号公報 ＷＯ２００６／１０１９２５号パンフレット
Ｍａｓｓａｇｕｅ　Ｊ，Ｃｅｌｌ，２００８年７月，１３４巻，２号，２１５－２３０ページ
　上記のように、これまでにも、接着型細胞を浮遊培養に馴化させる技術がいくつか提案されてきたものの、より効率よく、かつ、より安価に馴化させ得る方法が要望されているのが現状である。
　本発明は、かかる実情に鑑みてなされたものであり、接着型細胞を特殊な操作を要さずに、浮遊状態でも死滅することのない、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法、当該方法で調整された浮遊培養に馴化した接着型細胞を用いた核酸又はタンパク質の生産方法、脂環構造含有重合体成形体からなる接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤、接着型細胞を浮遊培養に馴化させるための脂環構造含有重合体成形体の使用、及び接着型細胞の浮遊培養馴化用容器を提供することを目的とする。
　また本発明は、接着型上皮細胞を接触させるのみの操作で該細胞に上皮間葉転換を誘導する方法、当該方法で上皮間葉転換された細胞を用いた核酸又はタンパク質の生産方法、脂環構造含有重合体成形体からなる接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤、接着型上皮細胞を上皮間葉転換誘導させるための脂環構造含有重合体成形体の使用、及び接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、接着型培養細胞を、脂環構造含有重合体成形体に接触させた状態で培養することで、本来、足場である細胞外基質を必要とする接着型細胞を、浮遊培養システム中で増殖させることができる、即ち接着型細胞を馴化できることを見出し、接着型細胞の浮遊馴化に関する本発明を完成するに至った。更に、本発明者らは、該細胞が脂環構造含有重合体成形体と接触することで、間葉系細胞のような性質に転換されることを見出し、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導に関する本発明を完成するに至った。
　かくして本発明によれば、（１）～（５）の接着型細胞の調製方法、（６）、（１５）の、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法、（７）の接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤、（８）、（１７）の脂環構造含有重合体成形体の使用、（９）、（１０）の浮遊培養馴化用容器、（１１）～（１４）の上皮間葉転換の誘導方法、（１６）の接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤、（１８）、（１９）の、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器が提供される。
（１）接着型細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法。
（２）前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である、（１）に記載の接着型細胞の調製方法。
（３）前記外来遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子である、（２）に記載の接着型細胞の調製方法。
（４）前記接着型細胞が動物由来の細胞である、（１）～（３）のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法。
（５）前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、（４）に記載の接着型細胞の調製方法。
（６）前記（１）～（５）のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法により、前記浮遊培養に馴化した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
（７）脂環構造含有重合体成形体からなる接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤。
（８）接着型細胞を液体培地中に浮遊培養に馴化させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用。
（９）少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型細胞の浮遊培養馴化用容器。
（１０）前記脂環構造含有重合体が飽和ノルボルネン系重合体である、（９）に記載の浮遊培養馴化用容器。
（１１）接着型上皮細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、上皮間葉転換の誘導方法。
（１２）前記接着型上皮細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である、（１１）に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
（１３）前記接着型上皮細胞が動物由来の細胞である、（１１）または（１２）に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
（１４）前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、（１３）に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
（１５）前記（１２）～（１４）のいずれかに記載の上皮間葉転換の誘導方法により、上皮間葉転換した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
（１６）脂環構造含有重合体成形体からなる接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤。
（１７）接着型上皮細胞を上皮間葉転換誘導させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用。
（１８）少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器。
（１９）前記脂環構造含有重合体が飽和ノルボルネン系重合体である、（１８）に記載の上皮間葉転換誘導用容器。
図１は、本発明の方法により前培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の細胞数計測結果を示すグラフである。 図２は、本発明の方法により調製された浮遊培養に馴化されたＣＨＯ細胞を主成分とする前培養後の全ての細胞を浮遊培養システムで培養したときの、経過日数に対する総細胞数を示すグラフである。 図３は、本発明の方法により、浮遊培養システムで培養された総細胞データから計算した、培養１日目～３日目（生細胞の増殖フェーズ）における各々前培養試料の平均倍化時間を示すグラフである。
　本発明の方法は、接着型細胞を脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養することにより、当該接着型細胞を、液体培地中での浮遊培養に馴化させることを特徴とする、接着型細胞の調製方法である。
　接着型細胞が浮遊培養に馴化されると、接着型細胞が培養環境に適合するため、浮遊馴化していない接着型細胞を浮遊培養したときの平均倍化時間と比較して、浮遊培養に馴化された接着型細胞は平均倍化時間が短くなる。
　本発明に係る接着型細胞は、特に限定されず、目的に応じて任意に選択することができる。
　本発明において、接着型細胞は、通常の培養条件において、細胞外基質に接着することで生存及び増殖可能な細胞のことをいう。接着型細胞としては、上皮細胞や線維芽細胞が挙げられる。また、これらの細胞に外来遺伝子を組み込んだ、遺伝子組み換えされた接着型細胞などの遺伝子工学処理を施された細胞であっても良い。接着細胞の具体例としては、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。これらの中でも浮遊馴化のしやすさからＣＨＯ細胞が好ましい。
　本発明においては、この接着型細胞に、ファージやプラスミドのベクター等を用いた形質導入等によって、外来遺伝子を発現することのできる様になったものを用いる。
　尚、本発明の上皮間葉転換の誘導方法に用いる細胞は、上記接着細胞の内、単層扁平上皮細胞、重層扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、線毛（多列線毛）上皮細胞、移行上皮細胞、立方上皮細胞等に分類される上皮細胞やこれらと同様の形態を持つ上皮細胞様の細胞である。上述した具体例の内、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞が上皮細胞の例となる。
　外来遺伝子は、目的に応じて任意に選択することができる。具体的には、エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」という）、インターフェロン（α、β、γ）、顆粒球コロニー刺激因子Ｇ－ＣＳＦ、インターロイキン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子ＧＭ－ＣＳＦ、人成長ホルモン、インスリン、グルカゴンＨＧＦ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒト型抗体等のサイトカインやホルモンのような生理活性タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子；例えばｍｉＲ－３６９等、特定のターゲット（例えばガン細胞）のＲＮＡ合成を阻害し、次世代核酸医療の候補として期待されているマイクロＲＮＡ及びその前駆体等の核酸（ＲＮＡ）をコードする遺伝子；等が挙げられる。
　こうした組み換え細胞の培養中に脂環構造含有重合体成形体を接触させると、生理活性タンパク質の生産量が増大する。
　細胞を培養する際には、液体培地が用いられる。
　液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
　ｐＨ緩衝作用を示す成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
　液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
　細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
　液体培地としては、ＲＰＭＩ－１６４０、ＨＡＭ、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９等の各種市販品を利用することができる。
　液体培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、分化誘導活性を有する低分子化合物、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
　用いる添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチン等の細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝又は２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内又はミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクター等と組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
　これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
　細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
　例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃～３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
　本発明に用いる脂環構造含有重合体成形体は、脂環構造含有重合体を任意の形状に成形してなるものである。
　脂環構造含有重合体は、主鎖及び／又は側鎖に脂環構造を有する樹脂である。なかでも、機械的強度、耐熱性等の観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましい。
　脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造等が挙げられる。機械的強度、耐熱性等の観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、なかでもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。
　脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４～３０個、好ましくは５～２０個、より好ましくは５～１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、及び成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。
　脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。
　脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素重合体、及び（１）～（４）の水素化物等が挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体の水素化物が好ましい。
（１）ノルボルネン系重合体及びその水素化物
　ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
　開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体及びノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、並びにこれらの水素化物等が挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体等が挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物、ノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体、及び当該付加重合体の水素添加物等の飽和ノルボルネン系重合体が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましく、細胞が浮遊しやすいことから、とりわけ極性基を有しないものが好ましい。
　ノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン（慣用名：ノルボルネン）、５－メチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５，５－ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチリデン－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－ビニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メチル－５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン等の２環式単量体；トリシクロ［４．３．０１，６．１２，５］デカ－３，７－ジエン（慣用名：ジシクロペンタジエン）、２－メチルジシクロペンタジエン、２，３－ジメチルジシクロペンタジエン、２，３－ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８，９－ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチル－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチリデン－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－メチル－８－カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、７，８－ベンゾトリシクロ［４．３．０．１２，５］デカ－３－エン（慣用名：メタノテトラヒドロフルオレン：１，４－メタノ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４－メタノ－８－メチル－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－クロロ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－ブロモ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４－シクロヘキサジエン、１，５－シクロオクタジエン、１，５－シクロデカジエン、１，５，９－シクロドデカトリエン、１，５，９，１３－シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
　これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン等の炭素数２～２０のα－オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０２，１０．０３，８］テトラデカ－３，５，７，１２－テトラエン（３ａ，５，６，７ａ－テトラヒドロ－４，７－メタノ－１Ｈ－インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４－ヘキサジエン、４－メチル－１，４－ヘキサジエン、５－メチル－１，４－ヘキサジエン、１，７－オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
　これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α－オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
　これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウム等の金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデン等の金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
　ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウム等の遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素－炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
　ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
（２）単環の環状オレフィン系重合体
　単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン等の、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体及びその水素化物
　環状共役ジエン系重合体及びその水素化物としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン等の環状共役ジエン系単量体を１，２－又は１，４－付加重合した重合体及びその水素化物等が挙げられる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体及びその水素化物
　ビニル脂環式炭化水素重合体及びその水素化物としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサン等のビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体及びその水素化物；スチレン、α－メチルスチレン等のビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；等が挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
　これらの脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
　脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００～５００，０００、より好ましくは８，０００～２００，０００、特に好ましくは１０，０００～１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
　脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０～３００℃、好ましくは１００～２８０℃、特に好ましくは１１５～２５０℃、更に好ましくは１３０～２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
　本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳ　Ｋ　７１２１に基づいて測定されたものである。
　また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料等の着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤等の配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
　また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００重量部に対して、通常２００重量部以下、好ましくは１５０重量部以下、より好ましくは１００重量部以下である。
　脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
　配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合順序に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機等を用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法等が挙げられる。
　二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
　脂環構造含有重合体の成形方法は、細胞と接触させる際に用いる脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
　細胞が接触する脂環構造含有重合体成形体の形状に格別な制限はなく、板状、シート状等が挙げられ、また、その表面は平らであっても、凹凸形状を有していてもよい。さらに、このような形状の成形体を、構成部材の一部として含む容器であってもよいし、脂環構造含有重合体成形体で全体を構成された容器であってもよいし、脂環構造含有重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器であってもよい。
　具体的な容器の形状としては、ディッシュ、プレート、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンター等の培養容器が挙げられる。
　そして、こうして得られる脂環構造含有重合体成形体は、接着細胞の浮遊培養への馴化を促進する機能を有する、本発明の浮遊培養馴化促進剤である。
　本発明においては、成形体を培養細胞と接触させるに当たり、通常、成形体を滅菌処理する。
　滅菌処理の方法に格別な制限はなく、成形体の形状や用いる細胞に応じて、公知の滅菌処理法選択することができる。例えば、高圧蒸気法や乾熱法等の加熱法；γ線や電子線等の放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）等のガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；等、医療分野で一般的に採用される方法が挙げられる。これらの中でも、表面状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。
　本発明に用いる脂環構造含有重合体成形体は、少なくとも細胞が接触する面が脂環構造含有重合体で形成されたものであればよく、全体が脂環構造含有重合体から形成されたものでなくてもよい。
　この脂環構造含有重合体成形体の細胞と接触する面の水接触角は通常８５°以上１１０°以下であり、８５°以上１０５°以下であることが好ましく、８５°以上１００°以下であることが特に好ましい。
　ここで、水接触角は、公知の全自動接触角計（本願実施例においては、協和界面科学社製「ＬＣＤ－４００Ｓ」を使用）を用い、ディッシュ底面をΦ３０ｍｍのサークルカッターで切り取って、試料の中心と、そこを中央とする１辺２０ｍｍの正方形の頂点４か所、計５か所を測定点とし、液滴の半径ｒと高さｈを求め、ｔａｎθ１＝ｈ／ｒ、θ＝２ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）で求められるθである（θ／２法）。
　また、これらの成形体表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理等培養容器に対して、滅菌目的以外の一般的な表面処理を行うこともできる。ただし、これらの表面処理操作を施すことにより発生する費用を抑えることができること；表面処理に伴う形成体表面の部分分解により清浄性が損なわれるおそれがあること；細胞の浮遊化能又は上皮間葉転換能が低下するおそれがあること；等の理由から、これらの表面処理操作を実質的に行わないことが好ましい。ここで、「これらの表面処理操作を実質的に行わない」とは、これらの表面処理操作を行わないか、又は、表面処理操作を行った場合であっても、下記式で定義される表面処理操作後における成形体表面（環構造含有重合体成形体の細胞と接触する面）の水接触角の変化割合〔Ｘ（％）〕が±２０％、好ましくは±１０％の範囲内であることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　培養細胞を脂環構造含有重合体成形体に接触した状態で培養する方法は、脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意の方法を採用すればよい。通常、シャーレ状、袋状、ボトル状等の容器であって、少なくとも一面が脂環構造含有重合体で形成されたものを用いて、脂環構造含有重合体で形成された面に細胞が接着するように培養する。播種当初、脂環構造含有重合体で形成された面に接着していた細胞は、数日で自然に剥離して浮遊状態で生存するようになる。即ち、この浮遊状態で生存する細胞が、浮遊培養に馴化した接着型細胞である。
　本発明の方法により浮遊培養に馴化した接着型細胞は、そのまま継続して静置培養すると、細胞塊を形成することがあるが、通常の浮遊培養型システムで、揺動することで解離し、単独の浮遊培養に馴化した接着型細胞として用いることができる。
　上記のように、本発明の培養方法は、接着型細胞であっても、浮遊状態で、高い密度で培養することができるため、当該細胞に核酸やタンパク質を産生させる際に、好ましく利用される。
　例えば、タンパク質をコードする外来遺伝子を発現することのできる組み換え細胞の培養中に、当該細胞と脂環式構造含有重合体成形体とを接触させることにより、タンパク質を大量に産生させることができる。
　こうして、脂環構造含有重合体成形体と接触した接着型細胞は、ＴＧＦ、ＨＧＦ及びＦＧＦ等の上皮間葉転換因子の転写量が増強され、また、Ｅ－カドヘリンの減少、Ｎ－カドヘリンとビメンチンの増加といった上皮間葉転換マーカーの転写量に変化が認められる。即ち、上述した通り、接着型上皮細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養することで、接着細胞に上皮間葉転換を誘導することができる。
　即ち、脂環構造含有重合体成形体は、上皮間葉転換剤として機能するものである。脂環構造含有重合体成形体が培養容器である場合、特別な操作を要さず、本容器を用いて培養するだけで上皮間葉転換を起こすことができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔製造例１〕組み換えＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の作製
　抗生物質Ｇ４１８への耐性遺伝子を内包するベクターｐＬＸＲＮ（Ｃｈｌｏｎｔｅｃｈ社製）の発現遺伝子の挿入サイトに、ＥＰＯ遺伝子配列を挿入してプラスミドｐＬＸＲＮ－ＥＰＯを構築した。構築したプラスミドの中のＥＰＯ遺伝子は、その塩基配列解析を行うことにより確認した。
　次に、構築したプラスミドｐＬＸＲＮ－ＥＰＯとプラスミドｐＶＳＶ－Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、パッケージ細胞であるＧＰ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に形質導入することにより、ＥＰＯ遺伝子を含有するウイルス粒子を調製した。
　なお、細胞へのプラスミドｐＬＸＲＮ－ＥＰＯの導入操作のための遺伝子導入試薬として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用い、遺伝子導入操作は、メーカーのマニュアルに従った。
　遺伝子導入操作を行ったＧＰ２９３Ｔ細胞を培養し、その培養上清を取り出して、フィルタ濾過し、８μｇ／ｍｌのポリブレン（ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）を加えることにより、ＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子を含む培養上清試料を調製した。
　続いて、あらかじめ培養したＣＨＯ細胞試料の培養液を除いて、上記のＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子を含む培養上清試料を添加して、８時間培養維持することにより、ＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子をＣＨＯ細胞に感染させた。
　８時間のインキュベーションの後に、ＣＨＯ細胞の培養培地に交換を行い、組み換えＥＰＯを産生するＣＨＯ細胞の培養操作を行った。
　ウイルスの感染は、以下のようにゲノムＰＣＲにより確認した。まず、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、感染操作を行ったＣＨＯ細胞からゲノムを抽出し、ｐＬＸＲＮ－ＥＰＯ配列がゲノムに導入されていることをＰＣＲで確認した。ＰＣＲに用いたＰｒｉｍｅｒは、ｐＬＸＲＮ－ｓｅｑ－Ｆ（５’－ＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴ）及びｐＬＸＲＮ－ｓｅｑ－Ｒ（ＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣ）とした。
　ウイルスが感染し、ゲノムにＥＰＯ遺伝子が組み込まれたＣＨＯ細胞を選抜するため、抗生物質Ｇ４１８を培地に添加し、培養維持して、抗生物質Ｇ４１８耐性のＣＨＯ細胞を薬剤選択することにより、組み換えＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞（以下、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞という。）を選抜した。
〔実施例１〕
　脂環構造含有重合体として、ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ、日本ゼオン社製；以下、単に「７９０Ｒ」という〕を用いて、射出成形法により、直径３ｃｍのディッシュを作製した。以下、このディッシュを「７９０Ｒ製ディッシュ」という。７９０Ｒ製ディッシュの底面（細胞と接触する側）の水接触角は、９０°であった。
　培養容器として７９０Ｒ製ディッシュを使用し、液体培地として１０％牛胎児血清を含むＨａｍ培地を使用して、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を０．６２４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種して、５％ＣＯ２雰囲気３７℃の条件で７日間培養を行った。
（細胞数の計測）
　以下の方法により、浮遊している細胞と接着している細胞の数を計測した。
　浮遊している細胞：培養上清を取り出して遠心処理した試料から、培地上清のみを除き、得られた細胞成分にトリパンブルーを作用させた。３分程度反応させた後、試料をトリパンブルー染色して生細胞及び死細胞数を計測した。計測には、細胞数計測装置を用いた。
　接着している細胞：培養上清を除去し、生理食塩水で洗浄後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離した。剥離後、血清含培養培地で、これら細胞試料をトリパンブルー染色して生細胞及び死細胞数を計測した。計測は、同様に装置を用いた。
〔比較例１〕
　実施例１において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュ〔ファルコン（登録商標）ディッシュ（型番３５３００１、ベクトンデッキンソン社製）〕を使用したことを除き、実施例１と同様にして培養を行い、細胞数を計測した。
　前培養工程である実施例１及び比較例１の結果を図１に示す。
　前培養（播種後７日）期間に、７９０Ｒ製ディッシュでは、全細胞数に対して８割程度の浮遊しているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の出現が観察され、大部分が生細胞であった。一方、ポリスチレン製ディッシュでは、大部分は底面に接着している細胞であり、浮遊している細胞は、１個の細胞単独で存在し、かつ、大部分が死滅状態にあった。
〔実施例２〕
　７９０Ｒ製ディッシュ前培養工程で出現した浮遊しているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞及び未だ接着しているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞をチューブに回収した。尚、ここで接着している細胞については、ディッシュ中の培養上清を除去し、生理食塩水で洗浄後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離・回収した。各々の細胞を滅菌チューブの中に混合し、遠心分離操作後に、培養培地を取り除き、細胞成分のみを新しい培地に懸濁した。細胞が懸濁された培地を浮遊培養装置（エイブル社製）の培養容器に添加し、浮遊培養を開始した。
〔比較例２〕
　実施例２において、前培養工程でポリスチレン製ディッシュを使用したことを除き、実施例２と同様に操作を行い、浮遊培養を開始した。
　浮遊培養工程である実施例２及び比較例２の結果を図２に示す。
　７９０Ｒ製ディッシュで前培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞は、ポリスチレン製ディッシュで前培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞よりも増殖しており、７９０Ｒ製ディッシュで前培養した細胞試料は、浮遊細胞システムに馴化した試料であると考えられる。
　更に、浮遊培養システムの試験から得られた細胞数計測結果から、実施例２及び比較例２の浮遊培養システムにおける細胞の増殖フェーズの培養１日目～３日目（Ｄａｙ１－３）に関して、各々細胞試料の平均倍化時間を算出した。結果を図３に示す。
　更に、比較のため、ポリスチレン製ディッシュで静置培養した、即ち接着状態で培養されている細胞の平均倍化時間も測定した。
　図３に示されるように、ポリスチレン製ディッシュで静置培養した接着している細胞の平均倍化時間は１５．６時間であり、比較した中では最も早かった。ポリスチレン製ディッシュで前培養した細胞試料に比較して、７９０Ｒ製ディッシュで前培養した細胞試料は、平均倍化時間が早くなっており、７９０Ｒ製ディッシュで前培養した細胞試料は、浮遊培養に馴化した状態に変換されたと考えられる。
〔実施例３〕
　実施例１と同様の方法により８日間培養後の培養容器中のＣＨＯ細胞と、比較例１と同様の方法により８日間培養後培養容器中のＣＨＯ細胞を回収し、回収した全細胞をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で溶解した。溶解した試料から、ＲＮＡを採取した。採取方法は製品マニュアルに従った。次いで、回収されたＲＮＡを、（ＨｉＳｅｑ（登録商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で解析した。
　実験はＮＧＳ解析条件を変更して２回実施した。両解析とも、ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ法で実施した。各々Ｒｅａｄ数は３０００万または５０００万程度であった。リファレンスとして、公開情報（ＧＣＦ＿０００２２３１３５．１＿ＣｒｉＧｒｉ＿１．０＿ｍａ．ｆａ．ｆａｉ）を用いた。
　得られた転写量のデータを、（ＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、ＣＬＣ　ｂｉｏ社製）にてＲＮＡ－Ｓｅｑを解析し、ｍＲＮＡの転写量をＲＰＫＭ値として数値化した。
　得られたＲＰＫＭ値を、（ＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、ＣＬＣ　ｂｉｏ社製）にてＥＤＧＥ解析し、７９０Ｒ製ディッシュで培養した細胞群の転写量と、ポリスチレン製ディッシュで培養した細胞群の転写量を比較し、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ値（ポリスチレン製ディッシュでの転写量に対する７９０Ｒ製ディッシュでの転写量の比率）を得た。ここで、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ値が正の整数であれば７９０Ｒ製ディッシュの転写量が多く、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ値が負の整数であればポリスチレン製ディッシュの転写量が多いことになり、その絶対値が大きいほど、両者間での差が大きいことになる。
　得られた結果を表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１の結果から、７９０Ｒ製ディッシュで培養した細胞試料は、ポリスチレン製ディッシュで培養した細胞試料に比べて、上皮間葉転換誘導因子であるＴＧＦ、ＨＧＦ及びＦＧＦの転写量が増強されていることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２の結果から、７９０Ｒ製ディッシュで培養した細胞試料は、ポリスチレン製ディッシュで培養した細胞試料に比べて、上皮間葉転換マーカーであるＥ－カドヘリンとサイトケラチンが減少し、Ｎ－カドヘリン、ビメンチン、及びフィブロネクチンが増加していることが分かる。
　表１及び２の結果は、本発明の方法により培養された細胞が、上皮間葉転換誘導されたことを示唆するものである。

Claims (19)

  1. 　接着型細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法。
  2. 　前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である、請求項１に記載の接着型細胞の調製方法。
  3. 　前記外来遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子である、請求項２に記載の接着型細胞の調製方法。
  4. 　前記接着型細胞が動物由来の細胞である、請求項１～３のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法。
  5. 　前記動物由来の細がＣＨＯ細胞である、請求項４に記載の接着型細胞の調製方法。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法により、前記浮遊培養に馴化した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
  7. 　脂環構造含有重合体成形体からなる接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤。
  8. 　接着型細胞を液体培地中に浮遊培養に馴化させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用。
  9. 　少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型細胞の浮遊培養馴化用容器。
  10. 　前記脂環構造含有重合体が飽和ノルボルネン系重合体である、請求項９に記載の浮遊培養馴化用容器。
  11. 　接着型上皮細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、上皮間葉転換の誘導方法。
  12. 　前記接着型上皮細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である、請求項１１に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
  13. 　前記接着型上皮細胞が動物由来の細胞である、請求項１１または１２に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
  14. 　前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１３に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
  15. 　請求項１２～１４のいずれかに記載の上皮間葉転換の誘導方法により、上皮間葉転換した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
  16. 　脂環構造含有重合体成形体からなる接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤。
  17. 　接着型上皮細胞を上皮間葉転換誘導させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用。
  18. 　少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器。
  19. 　前記脂環構造含有重合体が飽和ノルボルネン系重合体である、請求項１８に記載の上皮間葉転換誘導用容器。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020066396A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 日本ゼオン株式会社 心毒性評価方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH029388A (ja) 1988-03-09 1990-01-12 Ajinomoto Co Inc 生理活性タンパク質の製造法
JP2005073509A (ja) 2003-08-28 2005-03-24 Nihon Pharmaceutical Co Ltd ヒトアンチトロンビンの生産方法
WO2006101925A2 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors
WO2012081629A1 (ja) * 2010-12-15 2012-06-21 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 タンパク質の生産方法
WO2014038025A1 (ja) * 2012-09-05 2014-03-13 Ｓｃｉｖａｘ株式会社 細胞の上皮性維持に作用する物質のスクリーニング方法
WO2014138455A1 (en) * 2013-03-07 2014-09-12 California Stem Cell, Inc. Individualized high purity hepatocellular carcinoma stem cells, methods and use of the same
WO2015199119A1 (ja) * 2014-06-26 2015-12-30 日本ゼオン株式会社 接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法
WO2015199117A1 (ja) * 2014-06-26 2015-12-30 日本ゼオン株式会社 培養細胞の分化促進方法および培養細胞分化促進剤

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7858044B2 (en) * 2003-04-30 2010-12-28 Nexus Biosystems, Inc. Multi-well plate providing a high-density storage and assay platform
JP2009106160A (ja) * 2007-10-26 2009-05-21 Nipro Corp 細胞培養容器及び細胞培養方法
JP5024004B2 (ja) * 2007-12-03 2012-09-12 ニプロ株式会社 付着性細胞培養容器及び付着性細胞の培養方法
CN104039949B (zh) * 2011-12-28 2020-09-08 Jsr株式会社 细胞粘附抑制剂
WO2014028274A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 California Stem Cell, Inc. Rapid method production high purity cancer stem cells and population of high purity cancer stem cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH029388A (ja) 1988-03-09 1990-01-12 Ajinomoto Co Inc 生理活性タンパク質の製造法
JP2005073509A (ja) 2003-08-28 2005-03-24 Nihon Pharmaceutical Co Ltd ヒトアンチトロンビンの生産方法
WO2006101925A2 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors
WO2012081629A1 (ja) * 2010-12-15 2012-06-21 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 タンパク質の生産方法
WO2014038025A1 (ja) * 2012-09-05 2014-03-13 Ｓｃｉｖａｘ株式会社 細胞の上皮性維持に作用する物質のスクリーニング方法
WO2014138455A1 (en) * 2013-03-07 2014-09-12 California Stem Cell, Inc. Individualized high purity hepatocellular carcinoma stem cells, methods and use of the same
WO2015199119A1 (ja) * 2014-06-26 2015-12-30 日本ゼオン株式会社 接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法
WO2015199117A1 (ja) * 2014-06-26 2015-12-30 日本ゼオン株式会社 培養細胞の分化促進方法および培養細胞分化促進剤

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KI C.S. ET AL.: "Thiol-ene hydrogels as desmoplasia-mimetic matrices for modeling pancreatic cancer cell growth, invasion, and drug resistance", BIOMATERIALS, vol. 35, 2014, pages 9668 - 9677, XP029055289, DOI: doi:10.1016/j.biomaterials.2014.08.014 *
MASSAGUE J, CELL, vol. 134, July 2008 (2008-07-01), pages 215 - 230
RAZA A. ET AL.: "The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D", BIOMATERIALS, vol. 34, 2013, pages 5117 - 5127, XP028593862, DOI: doi:10.1016/j.biomaterials.2013.03.086 *
See also references of EP3392334A4
TOKUZO ARAO ET AL.: "EMT Kenkyu", MOLECULAR TARGETED THERAPY FOR CANCER, vol. 9, no. 1, 2011, pages 61 - 64 *

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