CN103339255A - 蛋白质的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞并对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质的方法及表达该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

Description

蛋白质的生产方法
技术领域
本发明涉及生产目标蛋白质的方法及利用该方法表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，所述生产目标蛋白质的方法中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并且对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质。
背景技术
利用基因重组技术的外源蛋白质的生产在药品和食品行业等各种产业中得到利用。多数情况下，重组蛋白质的生产通过如下方法进行：将包含编码目标蛋白质的碱基序列的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞等宿主中，选择出该表达载体重组到染色体中的转化株，再将该转化株在适当的培养条件下进行培养而使其表达目标蛋白质。
但是，为了开发出能够高效地生产外源蛋白质的宿主，需要根据每种目标蛋白质选择出生产率好的宿主细胞，因而期望对各宿主的外源蛋白质生产技术进行进一步的技术革新。
大肠杆菌等细菌或酵母的系统与动物细胞不同，大多难以进行糖链修饰等翻译后修饰，在生产具有活性的蛋白质方面存在问题。
昆虫细胞的系统具有如下优点：所生产的蛋白质接受磷酸化和糖链附加等翻译后修饰，能够在保持原来的生理活性的状态下进行表达，但由于分泌蛋白质的糖链结构不同于哺乳类来源的细胞的糖链结构，因此在药品用途方面存在抗原性等问题。
另外，本系统在外源基因的导入中使用重组病毒，因此，从安全性的观点出发，存在需要使其灭活或将其包埋的问题。
对于动物细胞的系统而言，能够以更等同于生物体中制造的蛋白质的方式对以人类为代表的高等动物来源的蛋白质进行磷酸化、糖链附加、折叠等翻译后修饰。这种准确的翻译后修饰是在重组蛋白质中重现蛋白质本来具有的生理活性所必需的，对于需要这种生理活性的药品等，经常使用以哺乳动物细胞为宿主的蛋白质生产系统。
但是，以动物细胞为宿主的蛋白质表达系统的生产率一般较低，导入基因的稳定性也大多存在问题。提高以哺乳动物培养细胞为宿主的蛋白质的生产率不仅在治疗用药品或诊断药品等的制造中非常重要，对于它们的开发研究也有很大贡献。因此，当务之急是开发以哺乳动物培养细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主且能够容易地获得高生产株的基因表达系统。
转座子是能够从染色体的一个基因座移动到另一个基因座的转座性遗传因子。转座子是分子生物学或遗传学的研究中强有力的工具，基于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作等目的用于昆虫或线虫(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))和植物中，但这种技术的开发在包括哺乳动物细胞在内的脊椎动物中很缓慢。
但是，近年来，在脊椎动物中也报道了具有活性的转座子，并且确认了其中若干转座子在小鼠或人类等的哺乳动物细胞中也具有活性。作为代表性的转座子，可以列举：由青鳉克隆得到的转座子Tol1(专利文献1)、Tol2(非专利文献1)、由存在于鲑科鱼类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty)(非专利文献2)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog prince)(非专利文献3)、昆虫来源的转座子piggyBac(非专利文献4)。
这些DNA转座子作为用于给哺乳动物细胞的基因组带来新的表现型的基因导入工具已经用于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作、表达抗药性蛋白质等(非专利文献5～12)。
对于昆虫而言，研究了使用鳞翅目昆虫来源的转座子piggyBac将外源基因导入家蚕染色体并使其表达该外源基因所编码的蛋白质的方法，并公开了使用该技术的蛋白质生产方法(专利文献2)。
但是，由于所表达的目标蛋白质的表达量不充分且在家蚕全身都有生产，因此，为了从存在大量杂质蛋白质的体液中以高纯度的形式回收表达的外源蛋白质，需要高度的纯化技术，因此在经济方面存在问题。
另外，已知使用青鳉来源的Tol2转座子在哺乳动物细胞中表达与G418抗性相关的蛋白质的例子(非专利文献12)。
作为高效地筛选高表达细胞的方法之一，已知选择标记基因的弱化。作为弱化的方法，已知抗新霉素基因中的氨基酸改变(非专利文献13、非专利文献14)和dhfr基因中的不稳定化序列的结合(非专利文献15)等。或者，还揭示了可以通过利用弱化的选择标记基因来获得高表达细胞。
但是，另一方面，也揭示了由于弱化而使抗药性细胞数大幅减少，结果，也存在完全得不到抗药性细胞的可能性，因而依然期待创造出高效地筛选高表达细胞的方法。
已知对于编码蛋白质的基因而言，根据生物种类对所使用的密码子存在偏好，并且已知通过优化该密码子的偏好使CHO细胞中的人促红细胞生成素的表达提高(非专利文献16)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2008/072540号
专利文献2：日本特表2001-532188号公报
非专利文献
非专利文献1：Nature383,30(1996)
非专利文献2：Cell91,501-510(1997)
非专利文献3：Nucleic Acids Res.31,6873-6881(2003)
非专利文献4：Insect Mol.Biol.5,141-151(1996)
非专利文献5：Genetics166,895-899(2004)
非专利文献6：PLoS Genet.2,e169(2006)
非专利文献7：Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,10769-10773(1998)
非专利文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6759-6764(2001)
非专利文献9：Nature436,221-226(2005)
非专利文献10：Nucleic Acids Res.31,6873-6881(2003)
非专利文献11：Nucleic Acids Res.35,e87(2007)
非专利文献12：Proc.Natl.Acad.Sci.USA103,15008-15013(2006)
非专利文献13：Biotech.Bioeng.89,530-538(2005)
非专利文献14：Journal of Immunological Methods295,49-56(2004)
非专利文献15：Metabolic Engineering9,304-316(2007)
非专利文献16：Gene199,293-301(1997)
发明内容
发明所要解决的问题
为了生产、分析目标蛋白质，必须使用哺乳动物来源的培养细胞选择出稳定地高表达目标蛋白质的细胞株，但生产目标蛋白质的细胞的制作和培养需要大量的劳动和时间。
另外，迄今为止已知使用转座子序列在哺乳动物细胞中进行蛋白质表达的技术，但关于通过使用转座子序列制作能够作为蛋白质的生产系统利用的蛋白质高表达细胞的技术以及包含转座子序列的高生产细胞和使用该细胞的蛋白质的生产方法还没有任何了解。另外，尚未获知改变密码子来抑制抗药性基因的表达(翻译)从而得到高表达细胞的例子。
一直以来期望高效且在短时间内制作如上所述使用哺乳动物培养细胞对目标蛋白质进行高表达的蛋白质生产系统从而高生产目标蛋白质的技术。此外，还期望在贯穿从基因导入到生产株建立的过程中完全不使用动物来源的成分的生产细胞的建立。
因此，本发明的目的在于提供能够高效制作的、高表达目标蛋白质的细胞和使用该细胞生产目标蛋白质的方法。
用于解决问题的手段
本发明人为了解决上述问题反复进行了深入研究，结果发现，通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到悬浮性哺乳动物细胞的染色体中，能够高效地制作高表达目标蛋白质的生产细胞，而且发现，由此能够大幅缩短目标蛋白质的高表达细胞株的制作时间，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于提供能够高效地制作高表达外源基因的生产细胞的新的生产细胞制作方法和重组蛋白质的生产方法。
即，本发明如下所述。
1.一种生产目标蛋白质的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并且对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质。
2.一种目标蛋白质的生产方法，其特征在于，包括下述(A)和(B)的步骤：
(A)将下述载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，利用暂时性表达的转座酶将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(b)含有编码识别所述转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
(B)对表达所述目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
3.如上述第1项或第2项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
4.如上述第1项～第3项中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任何一种细胞。
5.如上述第4项所述的方法，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任何一种细胞。
6.如上述第1项～第5项中任一项所述的方法，其中，弱化的选择标记基因为以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因。
7.如上述第6项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为编码与改变前的选择标记基因编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列且以含有在该哺乳动物细胞内使用频率低的密码子的方式进行改变后的基因。
8.如上述第6项或第7项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为对编码改变前的选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变后的基因。
9.如上述第6项～第8项中任一项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子为TTA的方式进行改变后的选择标记基因。
10.如上述第6项～第9项中任一项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
11.如上述第6项～第10项中任一项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子全部为TTA的方式或者以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子全部为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
12.如上述第1项～第11项中任一项所述的方法，其中，选择标记基因为选自由抗新霉素基因、抗嘌呤霉素基因、抗潮霉素基因、抗博莱霉素基因和抗杀稻瘟菌素基因组成的组中的一种选择标记基因。
13.如上述第1项～第12项中任一项所述的方法，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥功能的一对来源于转座子的碱基序列。
14.如上述第13项所述的方法，其中，一对来源于转座子的碱基序列为一对来源于Tol2的碱基序列。
15.如上述第14项所述的方法，其中，一对来源于Tol2的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
16.如上述第13项所述的方法，其中，一对来源于转座子的碱基序列为由序列号35表示的碱基序列和由序列号36表示的碱基序列。
17.一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有转座子序列的表达载体，将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到染色体中且生产目标蛋白质。
18.一种悬浮性哺乳动物细胞，其通过同时导入下述载体(a)和(b)而将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到染色体中且生产目标蛋白质，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体；
(b)含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的载体。
19.如上述第17项或第18项所述的哺乳动物细胞，其为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
20.如上述第17项～第19项中任一项所述的哺乳动物细胞，其为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任何一种细胞。
21.如上述第20项所述的哺乳动物细胞，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任何一种细胞。
22.如上述第17项～第21项中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，弱化的选择标记基因为以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因。
23.如上述第22项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为编码与改变前的选择标记基因编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列且以含有在该哺乳动物细胞内使用频率低的密码子的方式进行改变后的基因。
24.如上述第22项或第23项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为对编码改变前的选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变后的基因。
25.如上述第22项～第24项中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子为TTA的方式进行改变后的选择标记基因。
26.如上述第22项～第25项中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
27.如上述第22项～第26项中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子全部为TTA的方式或者以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子全部为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
28.如上述第17项～第27项中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，选择标记基因为选自由抗新霉素基因、抗嘌呤霉素基因、抗潮霉素基因、抗博莱霉素基因和抗杀稻瘟菌素基因组成的组中的一种选择标记基因。
29.如上述第17项～第28项中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥功能的一对来源于转座子的碱基序列。
30.如上述第29项所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于转座子的碱基序列为一对来源于Tol2的碱基序列。
31.如上述第30项所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol2的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
32.如上述第29项所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于转座子的碱基序列为由序列号35表示的碱基序列和由序列号36表示的碱基序列。
33.一种表达载体，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列。
34.如上述第33项所述的表达载体，其中，一对转座子序列为一对来源于Tol2的碱基序列。
35.如上述第34项所述的表达载体，其中，一对来源于Tol2的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
36.如上述第33项～第35项中任一项所述的载体，其中，弱化的选择标记基因为以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因。
37.如上述第36项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为编码与改变前的选择标记基因编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列且以含有在该哺乳动物细胞内使用频率低的密码子的方式进行改变后的基因。
38.如上述第36项或第37项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为对编码改变前的选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变后的基因。
39.如上述第36项～第38项中任一项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子为TTA的方式进行改变后的选择标记基因。
40.如上述第36项～第39项中任一项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
41.如上述第36项～第40项中任一项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子全部为TTA的方式或者以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子全部为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
42.如上述第33项～第41项中任一项所述的载体，其中，选择标记基因为选自由抗新霉素基因、抗嘌呤霉素基因、抗潮霉素基因、抗博莱霉素基因和抗杀稻瘟菌素基因组成的组中的一种选择标记基因。
发明效果
本发明的蛋白质的生产方法能够使用哺乳动物细胞高效地生产目标蛋白质。本发明的细胞能够作为用于生产基因重组蛋白质的蛋白质生产细胞使用。
附图说明
图1表示抗体表达载体A的结构。图1中，Tol2-L表示由Tol2-L序列(序列号2)构成的DNA片段，Tol2-R表示由Tol2-R序列(序列号3)构成的DNA片段，CMV表示CMV启动子，多聚A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示抗人CD98抗体的重链基因，Lc表示抗人CD98抗体轻链基因，SO表示SV40启动子，SV表示SV40多聚腺苷酸化位点，Neo-r表示抗新霉素基因。
具体实施方式
本发明涉及通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对(两个)转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞并对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质的方法及生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
作为本发明的生产目标蛋白质的细胞，可以列举：导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到染色体中且生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
另外，作为本发明的生产目标蛋白质的细胞，可以列举：通过同时导入下述(a)和(b)的载体而将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到染色体中且生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(b)含有编码识别上述转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体。
作为本发明的生产目标蛋白质的方法，可以列举下述目标蛋白质的生产方法，其特征在于，包括下述(A)和(B)的步骤：
(A)将下述表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，利用暂时性表达的转座酶将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(b)含有编码识别上述转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
(B)对表达上述目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
本说明书中使用的术语包含下述定义。
转座子为转座性遗传因子，是指在保持一定结构的状态下在染色体上转座(transposition)或者从染色体转座到其他染色体上的基因单元。
转座子在基因单元的两端具有反向或同向的重复的转座子序列[也称为反向重复序列(IR序列)或末端反向重复序列(TIR序列)]和编码识别该转座子序列并使存在于转座子序列之间的基因发生转移的转座酶的碱基序列。
由转座子翻译而成的转座酶识别转座子两端的转座子序列，将插入在一对转座子序列之间的DNA片段切出并插入到转移目的地，由此能够进行DNA的转移。
转座子序列是指被转座酶识别的转座子的碱基序列，与IR序列或TIR序列具有相同的含义。该序列只要能够在转座酶的作用下发生转移(插入到基因组中的其他位置)则也可以含有不完全的重复部分，存在对转座酶具有特异性的转座子序列。
本发明中使用的转座子序列可以是被转座酶识别且能够在哺乳动物细胞内发生转座的天然转座子序列或人工转座子序列中的任何一种，可以列举例如：来源于青鳉来源的Tol1、Tol2转座子、由存在于鲑科魚类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(SleepingBeauty)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog prince)和昆虫来源的转座子piggyBac的碱基序列。
其中，优选来源于由序列表的序列号6表示的碱基序列构成的青鳉来源的Tol2转座子的碱基序列。作为一对来源于Tol2转座子的碱基序列，可以列举：由序列表的序列号6表示的Tol2转座子的碱基序列的第1位至第2229位的碱基序列和第4148位至第4682位的碱基序列。
作为一对来源于Tol2转座子的碱基序列，可以更优选列举：由序列表的序列号1表示的碱基序列构成的Tol2转座子的碱基序列中第1位至第200位的碱基序列(序列号2)(以下，记作Tol2-L序列)和第2285位至第2788位的碱基序列(序列号3)(以下，记作Tol2-R序列)。
作为本发明的转座子序列，还可以使用来源于由序列表的序列号37表示的碱基序列构成的青鳉来源的Tol1转座子的碱基序列。作为一对来源于Tol1转座子的碱基序列，可以列举：来源于由序列表的序列号37表示的碱基序列构成的Tol1转座子的碱基序列中第1位至第157位的碱基序列和第1748位至第1855位的碱基序列。
作为一对来源于Tol1转座子的碱基序列，可以更优选列举：来源于由序列表的序列号37表示的碱基序列构成的Tol1转座子的碱基序列中第1位至第200位的区域(序列号35)(以下，记作Tol1-L序列)和第1351位至第1855位的区域(序列号36)(以下，记作Tol1-R序列)的序列。
另外，作为本发明的转座子序列，也包括通过使用上述的转座子中特异性的转座子序列的部分序列、调节碱基序列的长度以及利用碱基序列的添加、缺失或取代进行改变而对转移反应进行调控后的转座子序列。转移反应的调控通过增强或者相反地减弱由转座酶进行的识别而能够实现促进转移反应和抑制转移反应中的任何一种调控。
转座酶是指识别具有转座子序列的碱基序列并使存在于该碱基序列之间的基因片段在染色体上转座或者从染色体转座到其他染色体上的酶。
作为转座酶，可以列举例如来源于青鳉来源的Tol1、Tol2、由存在于鲑科魚类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(SleepingBeauty)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog Prince)、昆虫来源的转座子piggyBac的酶。
转座酶可以使用天然型酶，只要保持与转座酶同样的转座活性，也可以对其一部分氨基酸进行取代、缺失、插入和/或添加。通过调控转座酶的酶活性，能够调控存在于转座子序列之间的DNA的转移反应。
分析是否保持与转座酶同样的转移活性时，可以利用日本特开2003-235575号公报所公开的双组分分析系统进行测定。具体而言，可以分别使用含有Tol2转座酶发生缺陷的Tol2转座子(Tol2来源的非自主性转座子)的质粒和含有Tol2转座酶的质粒，对非自主性Tol2元件是否能够在转座酶的作用下转移、插入到哺乳动物细胞的染色体内进行分析。
本发明中，非自主性转座子是指存在于转座子内的转座酶发生缺陷、不能自主性地转移的转座子。对于非自主性转座子而言，可以通过使细胞内同时存在转座酶的蛋白质、编码转座酶的蛋白质的mRNA或编码转座酶的蛋白质的DNA而将插入在非自主性转座子的转座子序列之间的DNA转移到宿主细胞的染色体内。
转座酶基因是指编码转座酶的基因。为了提高哺乳动物细胞中的表达效率，可以在该基因的翻译起始密码子ATG的上游连接有kozak的共有序列(Kozak,M.Nucleic Acids Res.,12,857-872,1984)或者将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节至适当距离(例如6～18个碱基)而得到的序列。
本发明中，为了将表达载体重组到宿主细胞的染色体中，使转座酶对表达载体发挥作用。为了使转座酶对细胞发挥作用，可以将转座酶注入细胞内，也可以将编码转座酶基因的DNA重组到期望的表达载体中并转染到细胞内。或者，还可以将编码转座酶基因的RNA转染到细胞内而使转座酶在细胞内进行表达。
能够在此使用的载体没有特别限定，可以根据重组有转座酶基因的载体所要导入的宿主细胞、用途等从本领域技术人员已知的表达载体中适当选择来使用。
本发明中，在生产由两个以上的多肽构成的蛋白质的情况下，可以将编码两个以上的多肽的DNA重组到同一表达载体中或不同的表达载体中，并将该表达载体重组到宿主细胞的染色体中来使用。具体而言，可以考虑将抗体的重链和轻链重组到不同的表达载体中，并将该表达载体重组到宿主细胞的染色体中来使用。
转座酶可以重组到表达载体中与目标蛋白质一起表达，也可以重组到表达载体之外的载体中。转座酶可以暂时性地起作用，也可以持续性地起作用，为了制作稳定的产生细胞，优选使转座酶暂时性地起作用。
为了使转座酶暂时性地起作用，例如，可以通过将转座酶基因重组到含有目标蛋白质的表达载体之外的表达质粒中并转染到细胞内来进行。
表达载体是指为了表达目标蛋白质而用于转化哺乳动物细胞的表达载体。本发明中使用的表达载体具有在表达盒的两侧至少存在一对转座子序列的结构。
表达盒是指具有用于表达目标蛋白质所需要的基因表达调控区域和编码目标蛋白质的序列的核酸序列。作为基因表达调控区域，可以列举例如增强子、启动子和终止子等。表达盒中可以含有选择标记基因。
作为启动子，只要能够在哺乳动物细胞中发挥功能则可以使用任何一种启动子，可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early，即刻早期)基因的启动子、SV40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的启动子和增强子等。另外，可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
选择标记基因是指能够用于区别导入有质粒载体的细胞和缺少该载体的细胞的任意的标记基因。作为选择标记基因，可以列举例如：抗药性基因(例如，抗新霉素基因、DHFR基因、抗嘌呤霉素基因、抗杀稻瘟菌素基因、抗博莱霉素基因和抗潮霉素基因)以及荧光或生物发光标记基因(例如，绿色荧光蛋白GFP等)等。
弱化的选择标记基因是指以使选择标记基因所编码的蛋白质在细胞内的活性降低的方式进行改变后的选择标记基因。
作为以使细胞内的活性降低的方式进行改变后的选择标记基因，可以列举：(A)通过改变选择标记基因所编码的蛋白质的氨基酸序列而使该蛋白质在细胞内的活性降低的选择标记基因，或者(B)通过改变对选择标记基因的表达进行调控的碱基序列或改变选择标记基因的ORF(Open Reading Frame，开放读码框)内的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的选择标记基因。
作为通过改变选择标记基因所编码的蛋白质的氨基酸序列而使该蛋白质在细胞内的活性降低的选择标记基因的例子，可以列举例如：Sauter et al.[Biotech.Bioeng.89,530-538(2005)]或Chen et al.[Journal ofImmunological Methods295,49-56(2004)]中记载的抗新霉素基因。
作为通过改变对选择标记基因的表达进行调控的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的方法，可以列举例如：对调控选择标记基因的表达的启动子序列、终止子序列、增强子序列、kozak的共有序列或夏因-达尔加诺序列的序列进行改变的方法。
更具体而言，可以列举例如：将调控选择标记基因的表达的启动子序列取代成更弱的启动子序列的方法。
作为通过改变选择标记基因的ORF内的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的方法，可以列举将该ORF内的密码子取代成在该细胞内的使用频率更低的同义密码子的方法。
作为本发明的弱化的选择标记基因，可以列举将上述的该基因的ORF内的密码子取代成在该细胞内的使用频率更低的同义密码子的选择标记基因。
在各种生物种类的细胞内，各同义密码子中使用频率更低的同义密码子可以基于公知的文献或数据库等进行选择。
这种取代成使用频率低的同义密码子的取代，具体而言，例如，在CHO细胞的情况下，是指将亮氨酸的密码子取代成TTA、将精氨酸的密码子取代成CGA或CGT、将丙氨酸的密码子取代成GCG、将缬氨酸的密码子取代成GTA、将丝氨酸的密码子取代成TCG、将异亮氨酸的密码子取代成ATA、将苏氨酸的密码子取代成ACG、将脯氨酸的密码子取代成CCG、将谷氨酸的密码子取代成GAA、将酪氨酸的密码子取代成TAT、将赖氨酸的密码子取代成AAA、将苯丙氨酸的密码子取代成TTT、将组氨酸的密码子取代成CAT、将谷氨酰胺的密码子取代成CAA、将天冬酰胺的密码子取代成AAT、将天冬氨酸的密码子取代成GAT、将半胱氨酸的密码子取代成TGT或者将甘氨酸的密码子取代成GGT。
弱化的选择标记基因中，只要能够高效地获得生产蛋白质的细胞则与改变前的选择标记基因相比被取代的密码子数没有特别限制，优选对20个以上的氨基酸残基所对应的密码子进行取代。
弱化的选择标记基因中，与改变前的选择标记基因相比被改变的碱基数没有特别限制，优选对编码选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变。
另外，弱化的选择标记基因中取代的密码子所编码的氨基酸残基没有特别限制，可以优选列举亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
弱化的选择标记基因中，在对亮氨酸残基所对应的密码子进行取代的情况下，没有特别限制，优选对选择标记基因中含有的全部亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子进行取代。另外，弱化的选择标记基因中，在对丙氨酸残基所对应的密码子进行取代的情况下，没有特别限制，优选对选择标记基因中含有的全部丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子进行取代。
作为这种通过取代成使用频率低的同义密码子而改变得到的、弱化的选择标记基因，具体而言，可以列举例如：由序列号9、11或13表示的碱基序列构成的抗新霉素基因、由序列号21、23或25表示的碱基序列构成的抗嘌呤霉素基因、由序列号27或29表示的碱基序列构成的抗博莱霉素基因、由序列号31或33表示的碱基序列构成的抗潮霉素基因。
此外，也可以通过在抗体生产细胞的制作中使选择抗药性细胞时的药剂的浓度与通常使用的浓度相比显著提高或在药剂代谢、分解之前追加施用抗药性基因等来使选择标记基因弱化。
作为将包含上述转座子序列的表达载体、表达转座酶的质粒载体或RNA导入宿主细胞中的方法，没有特别限定，可以列举例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪法、脂质体转染法等。在将转座酶以蛋白质的形式直接导入的情况下，可以列举例如通过显微注射法或胞吞作用供给到细胞内的方法。基因导入可以通过新基因工程手册、村松正实、山本雅编著、羊土社、ISBN9784897063737中记载的方法进行。
作为宿主细胞，可以列举能够传代培养且能够稳定地表达目标蛋白质的哺乳动物细胞。
作为具体的宿主细胞，可以列举例如：PER.C6细胞、人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猴细胞COS细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK、HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal ofExperimental Medicine,108,945(1958);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968);Genetics,55,513(1968);Chromosoma,41,129(1973);Methodsin Cell Science,18,115(1996);Radiation Research,148,260(1997);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980);Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968);Cell,6,121(1975);Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)]、CHO/DG44(ATCC CRL-9096)、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCCCCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、Pro-3和CHO细胞的亚系。
另外，上述宿主细胞也可以通过改变染色体DNA和导入外源性基因等以适合蛋白质生产的方式进行改变后用于本发明的蛋白质的生产方法。
此外，本发明中，为了调控生产的目标蛋白质上结合的糖链结构，也可以将获得了植物凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell and Moleculargenetics,12,55(1986)]或α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第05/35586号、国际公开第02/31140号)作为本发明的生产目标蛋白质的宿主细胞使用。
本发明中生产的目标蛋白质只要能够利用使用本发明的非自主性转座子的蛋白质的生产方法进行表达，则可以是任何蛋白质。具体而言，可以列举例如：人血清蛋白、肽激素、生长因子、细胞因子、血液凝固因子、纤溶类蛋白质、抗体和各种蛋白质的部分片段等。
作为本发明中生产的目标蛋白质，可以优选列举嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等单克隆抗体、Fc融合蛋白、白蛋白结合蛋白及其部分片段等。
本发明中生产的单克隆抗体的效应活性可以通过各种方法进行调控。已知例如：对抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺(Asn)上结合的N连接复合型糖链的还原末端上存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上α-1,6连接的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行调控的方法(国际公开第05/035586号、国际公开第02/31140号、国际公开第00/61739号)；或者通过改变抗体的Fc段的氨基酸残基来进行调控的方法；等。本发明中生产的单克隆抗体可以使用任何一种方法调控效应活性。
效应活性是指经由抗体的Fc段而引起的抗体依赖性活性，已知抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)以及巨噬细胞或树突细胞等吞噬细胞的抗体依赖性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。
另外，通过对本发明中生产的单克隆抗体的Fc的N连接复合型糖链的核心岩藻糖的含量进行调控，能够增加或降低抗体的效应活性。作为使抗体的Fc上结合的N连接复合型糖链上结合的岩藻糖的含量降低的方法，可以通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因发生缺陷的CHO细胞表达抗体而获得未结合岩藻糖的抗体。
未结合岩藻糖的抗体具有高ADCC活性。另一方面，作为使抗体的Fc上结合的N连接复合型糖链上结合的岩藻糖的含量增加的方法，可以通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞表达抗体而获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体更低的ADCC活性。
另外，可以通过改变抗体的Fc段的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，可以通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书中记载的Fc段的氨基酸序列来增加抗体的CDC活性。另外，可以通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书中记载的氨基酸改变来增加或降低ADCC活性或CDC活性。
本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞是指不粘附于微珠或组织培养用培养器(也称为组织培养容器或粘附培养容器等)等培养细胞容易粘附且施加有涂层的细胞培养支持体上而能够悬浮于培养液中存活和增殖的细胞。只要细胞不粘附于细胞培养支持体上，则可以是在培养液中以一个细胞的状态存活、增殖或者以多个细胞相互聚集而成的细胞团的状态存活、增殖中的任何一种状态。
此外，作为本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞，优选能够在不含胎牛血清(fetal calf serum，以下记作FCS)等的无血清培养基中不粘附于细胞培养支持体上而悬浮于培养液中存活和增殖的细胞，更优选能够在不含蛋白质的无蛋白培养基中以悬浮状态存活和增殖的哺乳动物细胞。
作为组织培养用培养器，只要是粘附培养用的施加有涂层的烧瓶、培养皿等则可以是任何一种培养器，具体而言，通过使用市售的组织培养烧瓶(グライナー公司制造)、粘附培养烧瓶(住友ベークライト公司制造)等，可以确认为悬浮性哺乳动物细胞。
作为本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞，可以是原来就具有悬浮性的性质的在悬浮培养中驯化而得到的细胞，也可以是使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞。作为原来就具有悬浮性的性质的哺乳动物细胞，可以列举例如：PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和CHO-S细胞(Invitrogen公司制造)等。
本发明中，将粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞可以通过Mol.Biotechnol.2000,15(3),249-57中记载的方法或以下所示的方法等进行制作，可以通过建立与悬浮培养驯化前同样或者比悬浮培养驯化前更优良的增殖、存活的细胞来制作(J.Biotechnol.2007,130(3),282-90)。
与悬浮培养驯化前同等是指悬浮培养中驯化得到的细胞的存活率、增殖速度(倍增时间)等与悬浮培养驯化前的细胞相比实质上相同。
本发明中，作为使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化的方法，可以列举例如下述方法：将含有血清的培养基的血清含量减至1/10，以比较高的细胞浓度重复进行传代培养，在哺乳动物细胞能够存活、增殖的时刻进一步减少血清含量并重复进行传代培养，由此制作能够在无血清条件下存活、增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
另外，也可以通过向培养液中添加适当的非离子性表面活性剂Pluronic-F68等来制作悬浮性哺乳动物细胞。作为使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞，可以列举例如小鼠骨髓瘤细胞NS0或CHO细胞等。
本发明中，悬浮性CHO细胞优选具有如下性质：在将细胞以2×105个细胞/mL进行悬浮培养的情况下，3～4天后培养结束时的细胞密度为5×105个细胞/mL以上，优选为8×105个细胞/mL以上，更优选为1×106个细胞/mL以上，最优选为1.5×106个细胞/mL以上。另外，作为本发明的悬浮性CHO细胞的倍增时间，优选为48小时以下，更优选为24小时以下，进一步优选为18小时以下，最优选为11小时以下。
作为悬浮培养基，可以列举例如：CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)、EX-CELL325-PF培养基(SAFC Biosciences公司)、SFM4CHO培养基(HyClone公司)等市售的培养基。另外，也可以通过例如配合CHO细胞培养所需的糖类、氨基酸类、维生素类和金属盐类等并进行制备而得到。
悬浮培养可以使用能够进行悬浮培养的培养容器利用能够进行悬浮培养的培养条件来进行。作为培养容器，可以列举例如细胞培养用的96孔板(康宁公司)、T-烧瓶(BD公司)和三角烧瓶(康宁公司)等。
作为培养条件，例如可以在5%CO2气氛中、37℃的培养温度下通过静置培养等来进行。也可以使用作为悬浮培养专用培养设备的Wave生物反应器(GE医疗集团生命科学部)等振荡培养装置等。
关于使用Wave生物反应装置的CHO细胞的悬浮培养条件，可以通过GE医疗集团生命科学部主页http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf中记载的方法进行。
除了振荡培养以外，也可以利用生物反应器等旋转搅拌装置进行培养。利用生物反应器的培养可以通过Cytotechnology(2006)52:199-207中记载的方法等进行。
本发明中，在选择悬浮性CHO细胞以外的细胞株的情况下，也可以应用如上所述的悬浮培养中驯化得到的且能够使用本发明的蛋白质生产方法的任何一种细胞株。
培养细胞中生产的蛋白质的纯化通过从含有蛋白质的培养液或细胞破碎液中将目标蛋白质与目标蛋白质以外的杂质分离来进行。作为分离的方法，可以列举例如：离心、透析、硫酸铵沉淀、柱层析或过滤器等，可以利用目标蛋白质与杂质的物理化学性质的差异或在单一柱上的结合力的差异来进行。
蛋白质纯化的方法可以通过蛋白质实验记录(上)提取、分离和重组蛋白的表达(羊土社，冈田雅人、宫崎香编著，ISBN9784897069180)中记载的方法来进行。
本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献的全部内容按照与各自具体记载的内容相同的程度作为参考援引到本说明书中。
以上，为便于理解，示出了优选实施方式对本发明进行了说明。以下，基于实施例对本发明进行说明，但上述说明和下述实施例只是为了例示的目的而提供，并不是为了限定本发明的目的而提供。因此，本发明的范围不受本说明书中具体记载的实施方式和实施例的限定而仅由权利要求书进行限定。
以下示出实施例进一步对本发明进行具体说明，但本发明不限定于这些实施例的记载。
关于以下记载的克隆等与基因重组相关的各种实验技术，依据J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著、分子克隆第二版(MolecularCloning2nd edition)和Frederick M.Ausubel等编著、Current Protocols发行、Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验操作指南)等中记载的基因工程方法进行。
实施例
[实施例1]表达抗新霉素基因和抗人CD98抗体的转座子载体的制作
(1)表达野生型抗新霉素基因和抗人CD98抗体的转座子载体的制作
蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对来源于Tol2的碱基序列之间的任意的人抗体基因和抗药性标记基因的哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。
所使用的基因的DNA通过基于已知的碱基序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。
转座子序列使用由日本特开2003-235575号公报公开的非自主性Tol2转座子的碱基序列(序列号1)中第1位至第200位的碱基序列(Tol2-L序列)(序列号2)和第2285位至第2788位的碱基序列(Tol2-R序列)(序列号3)的碱基序列。
分别合成含有Tol2-R序列或Tol2-L序列的DNA片段来使用。
作为抗体重链基因表达盒，制备基于抗人CD98抗体N5KG1-ValC2IgG1NS/I117L载体(日本专利第4324637号公报)扩增得到的、含有在CMV启动子调控下编码抗体H链的碱基序列(序列号15)的DNA片段，作为抗体轻链基因表达盒，制备基于抗人CD98抗体N5KG1-ValC2IgG1NS/I117L载体扩增得到的、含有在SV40启动子调控下编码抗体轻链的碱基序列(序列号17)的DNA片段。
作为抗新霉素基因表达盒，制备具有由在SV40启动子调控下编码抗新霉素基因的碱基序列构成的DNA(由序列号7和Genbank登录号U47120.2表示的碱基序列构成的编码新霉素磷酸转移酶的DNA)的DNA片段。
将上述的抗体重链基因表达盒、抗体轻链基因表达盒和抗新霉素基因表达盒连接，再在其两端连接含有Tol2-R序列的DNA片段和含有Tol2-L序列的DNA片段，制作抗人CD98抗体表达载体A(图1)。
(2)具有改变型抗新霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号9表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因1，制作抗人CD98抗体表达转座子载体B。
改变型抗新霉素基因1与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的22%的167个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的25个亮氨酸残基所对应的密码子变为TAA的方式进行了改变。
(3)具有改变型抗新霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号11表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因2，制作抗人CD98抗体表达转座子载体C。
改变型抗新霉素基因2与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的23%的180个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的28个亮氨酸残基所对应的密码子变为TAA的方式进行了改变。
(4)具有改变型抗新霉素基因3的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号13表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因3，制作抗人CD98抗体表达转座子载体D。
改变型抗新霉素基因3与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的26%的203个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的30个亮氨酸残基所对应的密码子变为TAA的方式进行了改变。
[实施例2]利用表达改变型抗新霉素基因的抗体生产CHO细胞生产抗体
将实施例1(1)～(4)中制作的抗人CD98抗体表达转座子载体A～D分别与表达由序列号5表示的氨基酸序列构成的Tol2转座酶的载体pCAGGS-T2TP(Kawakami K&Noda T.Genetics.166,895-899(2004))一起导入悬浮化CHO-K1细胞中，制作抗体生产细胞A～D。
载体向悬浮CHO细胞中的导入通过如下方法进行：将CHO细胞(4×106个)悬浊于400μL的PBS缓冲液中，通过电穿孔法将保持环状DNA状态的抗人CD98抗体表达转座子载体(10μg)和Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP(20μg)同时导入。
在此，为了暂时性地表达Tol2转座酶，将Tol2转座酶表达载体也以环状DNA的状态导入。
另外，作为不使用Tol2转座酶的对照，利用限制性内切酶PciI(宝生物公司)使实施例1(4)的抗人CD98抗体表达转座子载体D(10μg)形成直链状后，通过电穿孔法导入悬浮化CHO-K1细胞中。
电穿孔使用电穿孔仪[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造)]，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。
通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞接种到1块96孔板中，使用添加有5%大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)在CO2孵育箱内培养3天。
接着，从基因导入4天后的培养基更换开始，添加G418(Geneticin(R)，Invitrogen公司)使终浓度为500μg/mL，在G418存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养3周。
培养后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法使用LANCE(R)分析试剂(パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。将其结果示于表1中。
[表1]
Figure BDA00003356717600311
如表1所示，表达改变型抗新霉素基因的细胞B～D中，与表达野生型抗新霉素基因的细胞A相比，抗人CD98抗体的表达量更高。
特别是，对于表达改变型抗新霉素基因3的抗人CD98抗体生产细胞D而言，得到了显示出表达野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体生产细胞A的10倍表达的细胞株。
另外，对于即使使用改变型抗新霉素基因3但未同时导入Tol2转座酶表达载体的对照细胞而言，尽管已使载体线性化，但仍未能得到抗人CD98抗体表达细胞。
[实施例3]表达抗嘌呤霉素基因和抗人CD98抗体的转座子载体的制作
(1)具有改变型抗嘌呤霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将实施例1(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号21表示的碱基序列构成的改变型抗嘌呤霉素基因1，制作抗人CD98抗体表达转座子载体E。
改变型抗嘌呤霉素基因1与由序列号19表示的碱基序列构成的野生型抗嘌呤霉素基因(嘌呤霉素-N-乙酰转移酶基因，由Genbank登录号U07648.1中公开的碱基序列构成)编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的3%的17个碱基进行了改变。
具体而言，通过改变使抗嘌呤霉素基因中含有的全部28个丙氨酸残基中的17个丙氨酸残基所对应的密码子成为GCG，与野生型中已为GCG的密码子合并，使全部丙氨酸残基所对应的密码子均为GCG。
(2)具有改变型抗嘌呤霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将实施例1(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号23表示的碱基序列构成的改变型抗嘌呤霉素基因2，制作抗人CD98抗体表达转座子载体F。
改变型抗嘌呤霉素基因2与野生型抗嘌呤霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的14%的79个碱基进行了改变。具体而言，在改变型抗嘌呤霉素基因1的丙氨酸残基所对应的密码子改变的基础上，使亮氨酸残基所对应的密码子为TAA、使缬氨酸残基所对应的密码子为GTA、使丝氨酸的密码子为TCG。
[实施例4]利用表达改变型抗嘌呤霉素基因的抗体生产CHO细胞生产抗体之1
将实施例3(1)的具有改变型抗嘌呤霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体E、实施例3(2)的具有改变型抗嘌呤霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体F、Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP导入悬浮化的CHO-K1细胞中，制作抗体生产细胞E和F。
载体向悬浮性CHO细胞中的导入通过如下方法进行：将悬浮化CHO细胞(4×106个)悬浊于400μL的PBS缓冲液中，通过电穿孔法将保持环状DNA状态的具有改变型抗嘌呤霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体(10μg)和pCAGGS-T2TP(20μg)同时导入。
在此，为了暂时性地表达Tol2转座酶，将Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP也以环状DNA的状态导入。
电穿孔使用电穿孔仪[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造)]，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。
通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞接种到1块96孔板中，使用添加有5%大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)在CO2孵育箱内培养3天。
接着，从基因导入2天后的培养基更换开始，添加嘌呤霉素(P9620，Sigma-Aldrich公司)使终浓度为5μg/mL，每周用含有嘌呤霉素的培养基进行培养基更换，并培养4周。
培养后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法使用LANCE(R)分析试剂(パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。将其结果示于表2中。
[表2]
Figure BDA00003356717600331
如表2所示，表达改变型抗嘌呤霉素基因2的抗体生产细胞F显示出表达改变型抗嘌呤霉素基因1的抗体生产细胞E的2倍以上的抗体生产量。
[实施例5]利用表达改变型抗嘌呤霉素基因的抗体生产CHO细胞生产抗体之2
将实施例4中得到的表达改变型抗嘌呤霉素基因2的抗体生产细胞F在三角烧瓶中进行培养，生产抗人CD98抗体。
具体而言，将抗体生产细胞F依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板中进行扩大培养。选出细胞数充分增加后的抗体生产细胞F2株(细胞株1和细胞株2)，分别以2×105个/ml悬浊于35ml添加有5%大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)中，使用容量为125ml的三角烧瓶(带通气孔盖，康宁公司)，在37℃、5%CO2的气氛中旋转培养1周，生产抗人CD98抗体。
使用HPLC(Waters公司)对培养后的培养基中的抗体量进行定量。将其结果示于表3中。
[表3]
细胞株1 细胞株2
抗体表达量（mg/L) 15.6 14.8
以上的结果显示，悬浮性CHO细胞中，插入在一对转座子序列之间的抗体基因和改变型抗药性基因被高效地导入宿主的染色体内，而且对高表达细胞的筛选有效。另外可知，所得到的细胞能够进行扩大培养，能够在悬浮培养条件下进行目标蛋白质的生产。
[参考例](1)悬浮化CHO细胞的制作
将在添加有10%血清(FCS)的α-MEM培养基(Invitrogen公司)中培养的粘附性CHO-K1细胞EC85051005(European Collection of CellCultures，欧洲细胞培养物保藏中心)通过胰蛋白酶处理进行剥离、回收，使用新的添加有10%FCS的α-MEM培养基，在37℃、5%CO2孵育箱内进行振荡培养。几天后，确认这些细胞进行增殖后，以2×105个/mL的浓度接种到添加有5%FCS的α-MEM培养基中并进行振荡培养。
再过几天后，使用添加有5%FCS的α-MEM培养基进行同样的接种操作。最后使用不含血清的α-MEM培养基重复进行传代、振荡培养，确认与血清存在下的培养具有同样的增殖能力，制作悬浮培养驯化株。
使用特定的方式对本发明进行了详细说明，但对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的意图和范围的情况下可以进行各种变更和变形。另外，本申请基于2010年12月15日提出的日本专利申请(日本特愿2010-279850)，通过引用援引其全部内容。
产业上的可利用性
根据本发明的蛋白质的生产方法，能够使用哺乳动物细胞高效地生产目标蛋白质。本发明的细胞能够作为用于生产基因重组蛋白质的蛋白质生产细胞使用。
序列表自由文本
序列号1-人工序列的说明；非自主性Tol2转座子的碱基序列
序列号2-人工序列的说明；Tol2-L序列
序列号3-人工序列的说明；Tol2-R序列
序列号7-人工序列的说明；野生型抗新霉素基因的碱基序列
序列号8-人工序列的说明；由野生型抗新霉素基因编码的氨基酸序列
序列号9-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列
序列号10-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号11-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列
序列号12-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号13-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列
序列号14-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号15-人工序列的说明；编码抗人CD98抗体重链可变区的碱基序列
序列号16-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号17-人工序列的说明；编码抗人CD98抗体轻链可变区的碱基序列
序列号18-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号19-人工序列的说明；野生型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号20-人工序列的说明；由野生型抗嘌呤霉素基因编码的氨基酸序列
序列号21-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号22-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号23-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号24-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号25-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号26-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号27-人工序列的说明；改变型抗博莱霉素基因的碱基序列
序列号28-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号29-人工序列的说明；改变型抗博莱霉素基因的碱基序列
序列号30-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号31-人工序列的说明；改变型抗潮霉素基因的碱基序列
序列号32-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
序列号33-人工序列的说明；改变型抗潮霉素基因的碱基序列
序列号34-人工序列的说明；合成构建体的氨基酸序列
Figure IDA00003356718300011
Figure IDA00003356718300021
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Figure IDA00003356718300041
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Figure IDA00003356718300111
Figure IDA00003356718300121
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Figure IDA00003356718300191
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Claims (42)

1.一种生产目标蛋白质的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并且对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质。
2.一种目标蛋白质的生产方法，其特征在于，包括下述(A)和(B)的步骤：
(A)将下述载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，利用暂时性表达的转座酶将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(b)含有编码识别所述转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
(B)对表达所述目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任何一种细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任何一种细胞。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，弱化的选择标记基因为以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因。
7.如权利要求6所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为编码与改变前的选择标记基因编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列且以含有在该哺乳动物细胞内使用频率低的密码子的方式进行改变后的基因。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为对编码改变前的选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变后的基因。
9.如权利要求6～8中任一项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子为TTA的方式进行改变后的选择标记基因。
10.如权利要求6～9中任一项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
11.如权利要求6～10中任一项所述的方法，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子全部为TTA的方式或者以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子全部为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，选择标记基因为选自由抗新霉素基因、抗嘌呤霉素基因、抗潮霉素基因、抗博莱霉素基因和抗杀稻瘟菌素基因组成的组中的一种选择标记基因。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥功能的一对来源于转座子的碱基序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中，一对来源于转座子的碱基序列为一对来源于Tol2的碱基序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中，一对来源于Tol2的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
16.如权利要求13所述的方法，其中，一对来源于转座子的碱基序列为由序列号35表示的碱基序列和由序列号36表示的碱基序列。
17.一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有转座子序列的表达载体，将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到染色体中且生产目标蛋白质。
18.一种悬浮性哺乳动物细胞，其通过同时导入下述载体(a)和(b)而将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到染色体中且生产目标蛋白质，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体；
(b)含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的载体。
19.如权利要求17或18所述的哺乳动物细胞，其为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
20.如权利要求17～19中任一项所述的哺乳动物细胞，其为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任何一种细胞。
21.如权利要求20所述的哺乳动物细胞，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任何一种细胞。
22.如权利要求17～21中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，弱化的选择标记基因为以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因。
23.如权利要求22所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为编码与改变前的选择标记基因编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列且以含有在该哺乳动物细胞内使用频率低的密码子的方式进行改变后的基因。
24.如权利要求22或23所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为对编码改变前的选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变后的基因。
25.如权利要求22～24中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子为TTA的方式进行改变后的选择标记基因。
26.如权利要求22～25中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
27.如权利要求22～26中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子全部为TTA的方式或者以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子全部为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
28.如权利要求17～27中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，选择标记基因为选自由抗新霉素基因、抗嘌呤霉素基因、抗潮霉素基因、抗博莱霉素基因和抗杀稻瘟菌素基因组成的组中的一种选择标记基因。
29.如权利要求17～28中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥功能的一对来源于转座子的碱基序列。
30.如权利要求29所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于转座子的碱基序列为一对来源于Tol2的碱基序列。
31.如权利要求30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol2的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
32.如权利要求29所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于转座子的碱基序列为由序列号35表示的碱基序列和由序列号36表示的碱基序列。
33.一种表达载体，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA和弱化的选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列。
34.如权利要求33所述的表达载体，其中，一对转座子序列为一对来源于Tol2的碱基序列。
35.如权利要求34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol2的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
36.如权利要求33～35中任一项所述的载体，其中，弱化的选择标记基因为以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因。
37.如权利要求36所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为编码与改变前的选择标记基因编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列且以含有在该哺乳动物细胞内使用频率低的密码子的方式进行改变后的基因。
38.如权利要求36或37所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为对编码改变前的选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变后的基因。
39.如权利要求36～38中任一项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子为TTA的方式进行改变后的选择标记基因。
40.如权利要求36～39中任一项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
41.如权利要求36～40中任一项所述的载体，其中，以使在哺乳动物细胞内的表达量减少的方式进行改变后的选择标记基因为以使该基因中含有的亮氨酸残基所对应的密码子全部为TTA的方式或者以使该基因中含有的丙氨酸残基所对应的密码子全部为GCG的方式进行改变后的选择标记基因。
42.如权利要求33～41中任一项所述的载体，其中，选择标记基因为选自由抗新霉素基因、抗嘌呤霉素基因、抗潮霉素基因、抗博莱霉素基因和抗杀稻瘟菌素基因组成的组中的一种选择标记基因。
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