CN104350068A - 生产型细胞系的增强子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在生产型细胞中异位表达EDEM2从而改善有用的多亚基蛋白质的产率的发现。因此，本发明提供了包含编码EDEM2的重组多核苷酸的生产型细胞系，例如经典的哺乳动物生物制药生产型细胞—CHO细胞。此外，本发明还公开了包含EDEM2的编码多核苷酸以及XBP1的编码多核苷酸的生产型细胞。也公开由这些细胞系生产的抗体的改善效价以及培养中由这些细胞得到的改善的细胞密度。

Description

生产型细胞系的增强子
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年5月29日提交的美国临时专利申请号61/652,549的权益，该申请的全部内容明确地以引用方式并入本文。
技术领域
本申请涉及一种或多种细胞，其表达用于改善地生产多亚基蛋白质的重组应激反应凝集素。具体而言，本发明提供了包含编码EDEM2的基因的哺乳动物细胞及由其衍生的细胞系，并且其产生高效价的抗体。
背景技术
制造治疗活性的蛋白质需要在分泌之前进行适当的折叠和加工。适当的折叠与蛋白质(例如抗体)尤其相关，所述的蛋白质由多个亚基组成，这些亚基在分泌之前必须适当地组装。真核细胞适应这样的系统，该系统确保蛋白质适当地折叠，并除去分泌途径中错误折叠的蛋白质。该系统被称为未折叠蛋白质反应(UPR)途径，并且由错误折叠的蛋白质在内质网(ER)中的累积所引发。
UPR的早期事件是转录因子Xbp1的激活，其依次激活内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质2(EDEM2)的转录，而该内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质2为内质网相关性降解(ERAD)途径的成员。EDEM2促进了错误折叠蛋白质的去除。ERAD途径包含5个步骤：(1)分子伴侣介导的对畸形蛋白质的识别；(2)使畸形蛋白质靶向与EDEM2有关的逆向转运机制或E3连接酶；(3)逆向转运的引发；(4)泛素化及进一步逆向转运；以及(5)蛋白体靶向及降解。
抗体为包含两条重链和两条轻链的多亚基蛋白质，其必须适当地折叠并结合从而形成功能异四聚体。为了改善功能抗体异四聚体的产率或效价，对重链和轻链的高效和精确加工的任何改良以都是需要的。
发明概述
本申请人惊奇地发现，在制造蛋白质的细胞系中，EDEM2的异位表达增加蛋白质的平均产量/细胞，增加被分泌至培养基中的蛋白质的效价，并增加生产型细胞系的积分细胞密度。
因此，在一个方面中，本发明提供了细胞，其包含(a)编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸和(b)编码多亚基蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，应激诱导的甘露糖结合凝集素为EDEM2蛋白质，其非限定性的实例在表1中提供，并且多亚基蛋白质为抗体。在其他的实施方案中，所述的细胞还包含编码活性剪切形式的XBP1的多核苷酸，其非限定性的实例在表2中提供。在一个实施方案中，所述的细胞为哺乳动物细胞，例如在生物制药制造中使用的CHO细胞。
在另一个方面中，本发明提供了由在上一方面中所述的细胞衍生的细胞系。“由……衍生”的意思是指由单个细胞以克隆方式遗传并具有一些所选的品质的细胞群体，例如生产给定效价的活性蛋白质的能力或增殖至特定密度的能力。在一些实施方案中，所述的细胞系能够生产效价为至少3克/升培养基(g/L)、至少5g/L或至少8g/L的多亚基蛋白质，其中所述的细胞系衍生自容留编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸和编码多亚基蛋白质的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，与由基本相同的细胞衍生的但不具有编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系所获得的积分细胞密度相比，所述的细胞系可以获得高至少30％、至少50％、至少60％或者至少90％的积分细胞密度(ICD)。
在另一个方面中，本发明提供了包含编码EDEM2蛋白质的核酸序列的分离的或重组的多核苷酸，所述的多核苷酸与构成型且普遍表达的哺乳动物启动子(例如泛素C启动子)可操作地连接(顺式)。在一些实施方案中，EDEM2蛋白质具有SEQ ID NO:8的氨基酸，或者与SEQ ID NO:1-7的任意一个具有至少92％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:16的核酸序列。在一个具体的实施方案中，所述的多核苷酸由SEQ ID NO:14的核酸序列组成；在另一个具体的实施方案中，所述的多核苷酸由SEQ ID NO:15的核酸序列组成。
在另一个方面中，本发明提供了包含编码XBP1蛋白质的核酸序列的分离的或重组的多核苷酸，所述的多核苷酸与构成型且普遍表达的哺乳动物启动子(例如泛素C启动子)可操作地连接(顺式)。在一些实施方案中，XBP1蛋白质具有SEQ ID NO:13的氨基酸，或者与SEQ ID NO:9-12的任意一个具有至少86％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的核酸序列。在一个具体的实施方案中，所述的多核苷酸由SEQ ID NO:17的核酸序列组成。
在另一个方面中，本发明提供了一种细胞，其包含在上一方面中所述的EDEM2的编码多核苷酸和编码多亚基蛋白质(例如抗体)的多核苷酸。在一些实施方案中，所述的细胞还包含在上一方面所述的XBP1的编码多核苷酸。在一个实施方案中，多亚基蛋白质为抗体，抗体的重链包含SEQID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列，抗体的轻链包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在这种及多个实施方案中，多亚基蛋白质的各个多肽亚基由独立的多核苷酸所编码。因此，例如编码抗体的多核苷酸可以包含编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸，因此包含两个亚基。在一些实施方案中，所述的细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一个实施方案中，所编码的多亚基蛋白质为具有SEQ ID NO:20的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:22的轻链可变区氨基酸序列的抗GDF8抗体。在一个实施方案中，抗GDF8抗体包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，编码抗GDF8抗体的重链的多核苷酸包含SEQ ID NO:23的核酸序列；并且编码抗GDF8抗体的轻链的多核苷酸包含SEQ ID NO:25的核酸序列。在一个实施方案中，编码抗GDF8抗体的重链的多核苷酸由SEQ ID NO:24的核酸序列组成；并且编码抗GDF8抗体的轻链的多核苷酸由SEQ ID NO:25的核酸序列组成。
在另一个实施方案中，所编码的多亚基蛋白质为具有SEQ ID NO:28的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:30的轻链可变区氨基酸序列的抗ANG2抗体。在一个实施方案中，抗ANG2抗体包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，编码抗ANG2抗体的重链的多核苷酸包含SEQ ID NO:31的核酸序列；并且编码抗ANG2抗体的轻链的多核苷酸包含SEQ ID NO:33的核酸序列。在一个实施方案中，编码抗ANG2抗体的重链的多核苷酸由SEQ ID NO:32的核酸序列组成；并且编码抗ANG2抗体的轻链的多核苷酸由SEQ ID NO:34的核酸序列组成。
在另一个实施方案中，所编码的多亚基蛋白质为具有SEQ ID NO:36的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:38的轻链可变区氨基酸序列的抗ANGPTL4抗体。在一个实施方案中，抗ANGPTL4抗体包含具有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，编码抗ANGPTL4抗体的重链的多核苷酸包含SEQ IDNO:39的核酸序列；并且编码抗ANGPTL4抗体的轻链的多核苷酸包含SEQ ID NO:41的核酸序列。在一个实施方案中，编码抗ANGPTL4抗体的重链的多核苷酸由SEQ ID NO:40的核酸序列组成；并且编码抗ANGPTL4抗体的轻链的多核苷酸由SEQ ID NO:42的核酸序列组成。
在另一个方面中，本发明提供了通过在培养基中培养之前方面所述的细胞来制造多亚基蛋白质的方法，其中所述的多亚基蛋白质是在细胞内合成的，并在随后被分泌至培养基中。在一些实施方案中，所述的多亚基蛋白质为抗体，例如抗GDF8、抗ANG2、抗ANGPTL4或者具有SEQ ID NO:43和44的重链序列以及SEQ ID NO:45和46的轻链序列的抗体。在一些实施方案中，所述的多亚基蛋白质的效价达到至少3g/L、至少5g/L、至少6g/L或者至少8g/L。在一些实施方案中，所述的细胞在培养基中增殖，并且建立大约≥5x 107个细胞-天/mL、大约≥1x 108个细胞-天/mL或者大约≥1.5x 108个细胞-天/mL的积分细胞密度。
在另一个方面中，本发明提供了根据在之前的方面中所述的方法制造的多亚基蛋白质。在一个实施方案中，所述的制造的多亚基蛋白质是抗体。在一些实施方案中，所述的抗体由包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链组成。在一个特定的实施方案中，所述的制造的多亚基蛋白质为具有SEQ ID NO:20的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:22的轻链可变区氨基酸序列的抗GDF8抗体。在另一个特定的实施方案中，所述的制造的多亚基蛋白质为具有SEQ ID NO:28的重链可变区氨基酸序列和SEQID NO:30的轻链可变区氨基酸序列的抗ANG2抗体。在另一个特定的实施方案中，所述的制造的多亚基蛋白质为具有SEQ ID NO:36的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:38的轻链可变区氨基酸序列的抗ANGPTL4抗体。
发明详述
在描述本发明之前，应该理解的是本发明不限于所描述的具体的方法和试验条件，这些方法和条件本身是可以改变的。此外，还应该理解的是本发明所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且无意于进行限定，因为本发明的范围仅由所附的权利要求书来限定。
除非另作说明，否则本发明所用的所有的技术和科学术语都具有与本领域的任一普通技术人员所通常理解的含义。如本文所用，当术语“大约”用于指具体引用的数值或数值的范围时，其是指所述的值可以与所引用的值相差不超过1％。例如如本文所用，表述“大约100”包含99和101以及其中的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本发明所述的那些相似或相当的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明，但是优选的方法和材料现在进行描述。本发明提及的所有公开的全部内容均以引用方式并入本文。
如本文所用，当术语“重组多核苷酸”与“分离的多核苷酸”交换使用时，其是指来源于基因改造操作的、单链或双链的核酸聚合物，例如核酸或脱氧核酸。重组多核苷酸可以是在体外存在的或者在细胞内作为附加体存在的环状质粒或线性构建体。重组多核苷酸可以是整合在较大的多核苷酸分子或超分子结构(例如线性或环状染色体)中的构建体。较大的多核苷酸分子或超分子结构可以在细胞内或在细胞的细胞核中。因此，重组多核苷酸可以整合在细胞的染色体中。
如本文所用，术语“应激诱导的甘露糖结合凝集素”是指甘露糖结合蛋白质，其是指结合或者能够结合甘露糖和甘露糖的衍生物(例如甘露糖-6-磷酸)的蛋白质，或在其多糖-蛋白质复合物中表达甘露糖或甘露糖衍生物的糖蛋白；并且其活性在应激过程中受到上调。细胞应激包含饥饿、DNA损伤、缺氧、中毒、剪切应力和其他机械应力、肿瘤应激、错误折叠的蛋白质在内质网中的累积等。应激诱导的甘露糖结合凝集素的实例包含EDEM蛋白质(EDEM1、EDEM2和EDEM3)、Yos9、OS9和XTP3-B(参见Vembar and Brodsky,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.9(12):944-957,2008，以及其中引用的参考文献)。
如本文所用，术语“EDEM2”是指内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质的任何直系同源物、同源物或保守取代的变体。本领域公知的是EDEM2蛋白质与内质网相关性降解(ERAD)有关，其受到Xbp-1的上调并促进从钙连蛋白循环中提取错误折叠的糖蛋白用以去除(参见，Mast etal.,Glycobiology 15(4):421-436,2004；Olivari and Molinari,FEBS Lett.581:3658-3664,2007；Olivari et al.,J.Biol.Chem.280(4):2424-2428,2005；andVembar and Brodsky 2008，这些文献的内容以引用方式并入本文)。示例性EDEM2序列在表1中描述，其与序列表相互参考。
表1
动物 SEQ ID NO: 与人的％一致性 与小鼠的％一致性 与仓鼠的％一致性
小鼠 1 93 100 96
大鼠 2 94 98 96
仓鼠 3 93 96 100
人 4 100 93 93
黑猩猩 5 99 94 93
猩猩 6 97 92 92
斑马鱼 7 69 70 69
总计 8 100 100 100
如本文所用，术语“Xbp1”也称为XBP1或X盒结合蛋白质1，其是指Xbp1的任何直系同源物、同源物或保守取代的变体。Xbp1为UPR的转录因子和功能元件。ER应激激活：(1)转录因子ATF6，其进而上调Xbp1mRNA的转录；和(2)ER膜蛋白IRE1，其介导了前体Xbp1mRNA的剪切，从而生产活性的Xbp1。如上文所提及，激活的Xbp1进而上调EDEM2的活性(参见Yoshida et al.,Cell Structure and Function 31(2):117-125,2006；和Olivari,2005)。示例性Xbp1氨基酸序列在表2中描述，其与序列表相互参考。
表2
动物 SEQ ID NO 与人的％一致性 与小鼠的％一致性 与仓鼠的％一致性
小鼠 9 86 100 92
仓鼠 10 86 92 100
人 11 100 86 86
斑马鱼 12 47 47 48
总计 13 100 100 100
如本文所用，术语“抗体”通常是指包含四条多肽链的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)，其中两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互连接；然而，仅由重链组成(即，缺乏轻链)的免疫球蛋白分子也被涵盖在术语“抗体”的定义范围内。各重链均包含重链可变区(本发明中简称为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链均包含轻链可变区(本发明中简称为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分成超变区，也称为互补决定区(CDR)，其被更保守的所谓构架区(FR)间隔。各VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，由氨基末端至羧基末端的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“分离的抗体”或“纯化的抗体”基本上不含有其他的细胞材料或化学品。
术语“特异性地结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗体形成复合物，其在生理性条件下相对稳定。特异性地结合可以表征为解离常数为至少大约1x10-6Μ或更高。用于确定两个分子是否特异性地结合的方法是本领域的公知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。而且，与人GDF8(例如)特异性地结合的分离的抗体与其他抗原(例如得自其他物种的GDF8分子(直系同源物))可以具有交叉反应。
多种抗体可以作为由细胞所分泌的多亚基蛋白质的实例，其中所述的细胞容留编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的多核苷酸。这些实例包含抗GDF8、抗ANG2和抗ANGPTL4抗体。这些及相似的抗体分别在美国专利申请号20110293630、20110027286和20110159015中有所描述，这些文献的内容以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“细胞”是指能够复制DNA、转录RNA、翻译多肽并分泌蛋白质的原核或真核细胞。细胞包括用于商业化生产生物产物的动物细胞，例如昆虫细胞(例如Schneider细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、Tn-368细胞、BTI-TN-5B1-4细胞，参见Jarvis,Methods Enzymol.463:191-222,2009和Potter et al.,Int.Rev.Immunol.10(2-3):103-112,1993)和哺乳动物细胞(例如CHO或CHO-K1细胞、COS或COS-7细胞、HEK293细胞、PC12细胞、HeLa细胞、Hybridoma细胞，Trill et al.,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):553-560,1995；Kipriyanov和Little,Mo.Biotechnol.12(2):173-201,1999)。在一个实施方案中，所述的细胞为包含所描述的UPR途径多核苷酸的CHO-K1细胞。对于CHO-K1细胞的描述，还可以参见Kao et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 60:1275-1281,1968。
如本文所用，术语“启动子”是指通常以顺式并位于蛋白质的编码序列的上游的基因序列，并且其能促进蛋白质的编码序列的转录。启动子可以被调节(发育的、组织特异性的或诱导的(化学品、温度))或构成型活性的。在某些实施方案中，编码蛋白质的多核苷酸可操作地与构成型启动子连接。“可操作地连接”是指使蛋白质的编码多核苷酸位于启动子的3'端(下游)，在启动子的顺式作用下并处于启动子的控制之下。在某些实施方案中，所述的启动子为构成型哺乳动物的启动子，例如泛素C启动子(参见Schorpp et al.,Nucl.Acids Res.24(9):1787-1788,1996；Byun et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.332(2):518-523,2005))、或CMV-IE启动子(参见Addison et al.,J.Gen.Virol.78(7):1653-1661,1997；Hunninghake et al.,J.Virol.63(7):3026-3033,1989)或hCMV-IE启动子(人巨细胞病毒即早期基因启动子)(参见Stinski&Roehr,J.Virol.55(2):431-441,1985；Hunninghake et al.,J.Virol.63(7):3026-3033,1989)。
如本文所用，短语“积分细胞密度”或“ICD”是对一段时间对培养物培养基中的细胞密度的积分，其表示为个细胞-天/mL。在一些实施方案中，在细胞处于培养中大约第12天时，测量ICD。
如本文所用，术语“培养物或培养”是指：(1)包含细胞、培养基和分泌的多亚基蛋白质的组合物；以及(2)不管细胞是否积极地分裂，都在培养基中温育细胞的行为。可以在25mL烧瓶或更小、及10000升或更大的商业化生物反应器的容器中培养细胞。“培养基”是指培养物培养基，其包含营养物、脂类、氨基酸、核酸、缓冲剂和痕量元素等，从而允许细胞的生长、繁殖或维持，以及细胞的多亚基蛋白质生产。细胞的培养物培养基包含无血清且无水解产物的合成培养基，以及补充有血清(例如胎牛血清(FBS))或蛋白质水解产物的培养基。可以商业获得的培养基的非限定性实例包括RPMI培养基1640、杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F12混合物、F10营养混合物、Ham F12营养混合物和最基本培养基(MEM)。
如本文所用，当短语“保守取代的变体”用于多肽时，其是指具有一个或多个保守的氨基酸取代的多肽。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被另一个具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基)的氨基酸残基所取代。通常，保守的氨基酸取代基本不会改变蛋白质的功能性。在其中两条或多条氨基酸序列通过保守的取代而彼此不同的情况下，可以向上调节相似性的百分率或相似度，从而校正取代的保守性。用于进行这种调节的手段是本领域的那些技术人员所公知的。例如参见Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，该文献的内容以引用方式并入本文。具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的实例包含：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)包含氨基的侧链：天冬酰氨和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)包含硫的侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰氨-谷氨酰胺。备选地，保守替代是在Gonnet et al.(1992)Science 256:1443-45所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，其中所述文献的内容以引用方式并入本文。“适度保守的”替代是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
实施方案-细胞
在一个方面中，本发明提供了用于生产具有治疗或研究用途的蛋白质的细胞。在一些实施方案中，所述的蛋白质由多个亚基组成，这些亚基必须适当地折叠并组装，从而生产足量的活性蛋白质。抗体是具有治疗或研究用途的多亚基蛋白质的实例。在一些实施方案中，所述的细胞容留重组基因构建体(即，多核苷酸)，该构建体编码多亚基蛋白质的一个或多个单个的亚基。在其他的实施方案中，编码单个多肽亚基的基因构建体是天然形成的，例如在B细胞中编码抗体亚基的核酸序列。
为了促进多亚基蛋白质的适当组装和分泌，所述的细胞包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸，其中在一些实施方案中，应激诱导的甘露糖结合凝集素为ERAD的成分。在一些实施方案中，应激诱导的甘露糖结合凝集素为内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质2(EDEM2)。可以预见的是任何编码的EDEM2或保守取代的变体都可以成功地用于本发明。表1列出了脊椎动物EDEM2蛋白质的一些实例。这些蛋白质序列的多个成对比较表明每条所公开的EDEM2多核苷酸序列均与每条其他的EDEM2序列具有至少69％的一致性，其中所述的比较是使用Thompson et al.,Nucl.Acids Rev.22(22):4673-80,1994的Clustal W程序来进行的(此外参见Yuan et al.,Bioinformatics 15(10):862-3,1999)。所公开的哺乳动物EDEM2序列的Clustal W比较表明每条序列与其他序列具有至少92％的一致性。因此在一些实施方案中，所述的细胞包含编码EDEM2多肽的多核苷酸，其中所述的EDEM2多肽具有与任一哺乳动物EDEM2至少92％的一致性的序列。通过比对小鼠、大鼠、仓鼠、黑猩猩和人EDEM2多肽氨基酸序列来建立共有的EDEM2氨基酸序列。该共有序列描绘于SEQ ID NO:8中。因此在一些实施方案中，所述的细胞包含编码EDEM2多肽的多核苷酸，其中所述的EDEM2多肽具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在多个实施方案中，所述的细胞包含编码EDEM2多肽的重组多核苷酸，其中所述的EDEM2多肽具有与小鼠EDEM2(mEDEM2)氨基酸序列至少92％的一致性的氨基酸序列；并且在具体的实施方案中，所述的多肽为mEDEM2或其保守取代的变体。
在一些实施方案中，所述的多亚基蛋白质为抗体，并且所述的细胞包含编码任意一条或多条多肽的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。SEQID NO:43和SEQ ID NO:44各分别代表了特定抗体重链的大致的N末端和C末端部分的共有序列。因此在一个实施方案中，编码蛋白质亚基的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的多肽。SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46各分别代表了特定抗体轻链的大致的N末端和C末端部分的共有序列。因此在一个实施方案中，编码蛋白质亚基的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的多肽。在一些实施方案中，除了编码EDEM2蛋白质的重组多核苷酸以外，所述的细胞包含至少两条多核苷酸，每条多核苷酸均编码多亚基蛋白质的特定的亚基。例如并且如下举例，所述的细胞包含编码抗体重链(包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列)的多核苷酸和编码抗体轻链(包含SEQ ID NO:45和SEQID NO:46的氨基酸序列)的另一个多核苷酸。
在一些实施方案中，如上文所述，所述的细胞除了包含应激反应多核苷酸和一条或多条编码多肽亚基的多核苷酸以外，还包含编码未折叠蛋白质反应转录因子(其在EDEM2的上游进行操作)的多核苷酸。在一些情况下，所述的上游转录因子为剪切形式的XBP1。可以预见的是任何编码的XBP1都可以成功地用于本发明中。表2列出了脊椎动物XBP1剪切形式的多肽的序列的实例。这些多肽序列的多个成对比较表明每条所公开的剪切XBP1多核苷酸序列均与每条其他的XBP1序列具有至少48％的一致性，其中所述的比较是使用Clustal W程序(Thompson 1994；Yuan 1999)来进行的。所公开的哺乳动物XBP1序列的Clustal W比较表明每条序列与其他序列具有至少86％的一致性。因此在一些实施方案中，所述的细胞包含编码剪切形式的XBP1多肽的多核苷酸，其中所述的XBP1多肽具有与任一哺乳动物剪切XBP1至少86％的一致性的序列。通过比对小鼠、仓鼠和人XBP1氨基酸序列来建立共有的XBP1氨基酸序列。该共有序列描绘于SEQ ID NO:13中。因此在一些实施方案中，所述的细胞包含编码XBP1多肽的多核苷酸，其中所述的XBP1多肽具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在多个实施方案中，所述的细胞包含编码XBP1多肽的多核苷酸，其中所述的XBP1多肽具有与小鼠XBP1(mXBP1)氨基酸序列(SEQ ID NO:9)至少86％的一致性的氨基酸序列；并且在具体的实施方案中，所述的多肽为mXBP1或其保守取代的变体。
本发明预见任何细胞都可以用于容留凝集素编码多肽，以用于生产适当折叠且具有活性的多亚基蛋白质。此类细胞包含公知的蛋白质生产型细胞，例如细菌大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和类似的原核细胞，酵母菌毕赤酵母(Pichia pastoris)和其他毕赤及非毕赤酵母，植物细胞外植体(例如烟草的那些)，昆虫细胞(例如Schneider 2细胞、Sf9和Sf21，和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)衍生的High Five细胞)，以及通常用于生物生产的哺乳动物细胞(例如CHO、CHO-K1、COS、HeLa、HEK293、Jurkat和PC12细胞)。在一些实施方案中，所述的细胞为CHO-K1或改性的CHO-K1细胞，例如在美国专利号7,435,553,7,514,545和7,771,997、及美国专利申请公开号US 2010-0304436A1中所教导的那些，其中每一份文献的全部内容均以引用方式并入本文。
在一些具体的实施方案中，本发明离体提供了CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述的多肽包含SEQ ID NO:43和44的氨基酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述的多肽包含SEQ ID NO:45和46的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，本发明离体提供了CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明离体提供了CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明离体提供了CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
细胞系
在另一个方面中，本发明提供了细胞系，其包含起源于上文所述的细胞通过克隆扩增得到的多个细胞。至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或者大约100％的细胞系构成细胞包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸，在一些实施方案中，所述的应激诱导的甘露糖结合凝集素为ERAD的成分。在一些实施方案中，所述的应激诱导的甘露糖结合凝集素为内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质2(EDEM2)。可以预见的是任何编码的EDEM2或其保守取代的变体都可以成功地用于本发明中。如上述部分中所讨论的那样，表1列出了脊椎动物EDEM2蛋白质的一些实例。在一些实施方案中，所述的构成细胞包含编码EDEM2多肽的多核苷酸，其中所述的EDEM2多肽具有与任何哺乳动物EDEM2至少92％一致性的序列。在一些实施方案中，所述的构成细胞包含编码EDEM2多肽的多核苷酸，其中所述的EDEM2多肽具有SEQ ID NO:8的哺乳动物共有氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的构成细胞包含SEQ ID NO:1的重组多核苷酸或其保守取代的变体。
在一些实施方案中，由所述的细胞系生产的多亚基蛋白质为抗体，并且所述的细胞系的构成细胞包含编码任意一条或多条多肽的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列(其分别代表了特定抗体重链的N末端和C末端部分的共有序列)，以及SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列(其分别代表了特定抗体轻链的N末端和C末端部分的共有序列)。在一些实施方案中，所述的细胞系的构成细胞除了包含编码EDEM2蛋白质的重组多核苷酸以外，还包含至少两条多核苷酸，每条多核苷酸都编码多亚基蛋白质的特定的亚基。例如所述的构成细胞包含编码抗体重链(包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列)的多核苷酸和编码抗体轻链(包含SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:46的氨基酸序列)的另一种多核苷酸。
在一些实施方案中，如上文所述，所述的构成细胞除了包含应激反应多核苷酸和一条或多条编码多肽亚基的多核苷酸以外，还包含编码未折叠蛋白质反应转录因子(例如剪切形式的XBP1)(其在EDEM2的上游进行操作)的多核苷酸。可以预见的是任何编码的XBP1都可以成功地用于本发明中。如在上文部分中所讨论的那样，表2列出了脊椎动物XBP1剪切形式的多肽的一些实例。这些序列的Clustal W分析表明每条所公开的剪切XBP1多核苷酸序列均与每条其他的XBP1序列具有至少48％的一致性；并且哺乳动物XBP1序列的比较表明每条序列与其他序列具有至少86％的一致性。因此在一些实施方案中，所述的细胞系的构成细胞包含编码剪切形式的XBP1多肽的多核苷酸，其中所述的XBP1多肽具有与任一哺乳动物剪切XBP1至少86％的一致性的序列。在一些实施方案中，所述的构成细胞包含编码XBP1多肽的多核苷酸，其中所述的XBP1多肽具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列。
在多个实施方案中，所述的细胞包含编码XBP1多肽的多核苷酸，其中所述的XBP1多肽具有与小鼠XBP1(mXBP1)氨基酸序列(SEQ ID NO:9)至少86％的一致性的氨基酸序列；并且在具体的实施方案中，所述的多肽为SEQ ID NO:9的mXBP1或其保守取代的变体。
本发明预见所述的细胞系包含构成细胞，其亲本选自公知的蛋白质生产型细胞的列表中，例如细菌大肠埃希氏杆菌和类似的原核细胞，酵母菌毕赤酵母和其他毕赤及非毕赤酵母，植物细胞外植体(例如烟草的那些)，昆虫细胞(例如Schneider 2细胞、Sf9和Sf21，和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)衍生的High Five细胞)，以及通常用于生物生产的哺乳动物细胞(例如CHO、CHO-K1、COS、HeLa、HEK293、Jurkat和PC12细胞)。在一些实施方案中，所述的细胞为CHO-K1或改性的CHO-K1细胞，例如在美国专利号7,435,553,7,514,545和7,771,997、及美国专利申请公开号US2010-0304436A1中所教导的那些。
在一些实施方案中，在培养基中培养的细胞系能够生产多亚基蛋白质并将适当组装的多亚基蛋白质分泌至培养基中，其效价为至少3g/L、至少5g/L或至少8g/L。
此外，与不包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系积分细胞密度相比，所述的细胞系的构成细胞在培养中能够增殖达到积分细胞密度高出大约30％的程度。在一些情况下，与不包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系积分细胞密度相比，所述的细胞系能够达到积分细胞密度高出至少大约50％、至少60％或者至少90％。在一些实施方案中，在处于培养中大约第12天后，评估细胞系的积分细胞密度。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了包含克隆衍生的构成细胞的细胞系，其中所述的构成细胞为CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述的多肽包含SEQ ID NO:43和44的氨基酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述的多肽包含SEQ ID NO:45和46的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了包含克隆衍生的构成细胞的细胞系，其中所述的构成细胞为CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明提供了包含克隆衍生的构成细胞的细胞系，其中所述的构成细胞为CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明提供了包含克隆衍生的构成细胞的细胞系，其中所述的构成细胞为CHO-K1细胞，该细胞包含：(1)mEDEM2的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；(2)XBP1的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；(3)抗体重链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列；以及(4)抗体轻链的编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
EDEM2多核苷酸
在另一个方面中，本发明提供了编码EDEM2蛋白质的多核苷酸。EDEM2的编码多核苷酸是重组的，并且可以在体外(例如在试管中或在体外翻译系统中)或者在体内(例如在细胞中，细胞可以是离体的，例如细胞培养物中；或者是在体内的，例如在有机体中)制造、储存、使用或表达。在一些实施方案中，EDEM2的编码多核苷酸在基因中，这表示其处于启动子的控制之下，并且位于启动子下游且多聚腺苷酸位点的上游。EDEM2的编码多核苷酸或基因可以在质粒或者其他环状或线性载体中。EDEM2的编码多核苷酸或基因可以在环状或线性DNA构建体中，其可以作为附加体处于细胞中，或者整合至细胞的基因组中。
如上文所述，EDEM2的编码多核苷酸编码表1的任何直系同源物、同源物或保守取代的EDEM2多肽，或者具有与SEQ ID NO:1-5和8的任一至少92％的一致性的氨基酸序列(包括SEQ ID NO:8的哺乳动物共有序列)的EDEM2多肽。
在一些情况下，重组的或分离的EDEM2的编码多核苷酸可操作地与哺乳动物启动子连接。该启动子可以为任何启动子，但是在一些情况下，其为哺乳动物启动子，例如泛素C启动子。
在具体的实施方案中，EDEM2的编码多核苷酸基本上由(由5’至3’的顺序)启动子(例如泛素C启动子)、其后为可任选的内含子(β球蛋白内含子)、其后为编码EDEM2的序列、其后为多聚腺苷酸序列(例如SV40pA序列)组成。此类EDEM2的编码多核苷酸的特定实例(其也为具体的实施方案)如SEQ ID NO:16所述。该序列的保守变体也被设想为本发明的实施方案。
在一些情况下，重组EDEM2的编码多核苷酸为质粒的一部分，其可以为线性、环状、附加体、整合的、静态的DNA构建体，或者用于传递EDEM2基因或表达EDEM2蛋白质的载体。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含：(1)EDEM2基因，其处于泛素C启动子的控制之下，并以SV40多聚腺苷酸信号为结尾；和(2)选择标记，例如编码赋予对博来霉素抗性的多肽的多核苷酸或编码赋予对新霉素抗性的多肽的多核苷酸，其处于启动子(例如SV40启动子)的控制之下，并以多聚腺苷酸序列(例如PGK pA序列)为结尾。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含(5’至3’方向进行的环状形式)泛素C启动子、β球蛋白内含子、EDEM2的编码序列、SV40 pA序列、SV40启动子、新霉素抗性的编码序列和PGK pA序列。通过具有SEQ ID NO:14序列的质粒来举例说明该实施方案的特定实例。在另一个具体的实施方案中，所述的质粒包含(5’至3’方向进行的环状形式)泛素C启动子、β球蛋白内含子、EDEM2的编码序列、SV40pA序列、SV40启动子、博来霉素抗性的编码序列和PGK pA序列。通过具有SEQ ID NO:15序列的质粒来举例说明该实施方案的特定实例。
XBP1多核苷酸
在另一个方面中，本发明提供了编码XBP1蛋白质的多核苷酸。XBP1的编码多核苷酸是重组的，并且可以在体外(例如在试管中或在体外翻译系统中)或者在体内(例如在细胞中，细胞可以是离体的，例如细胞培养物中；或者是在体内的，例如在有机体中)制造、储存、使用或表达。在一些实施方案中，XBP1的编码多核苷酸在基因中，这表示其处于启动子的控制之下，并且位于启动子下游且多聚腺苷酸位点的上游。XBP1的编码多核苷酸可以在质粒或者其他环状或线性载体中。XBP1的编码多核苷酸或基因可以在环状或线性DNA构建体中，其可以作为附加体处于细胞中，或者整合至细胞的基因组中。
如上文所述，XBP1的编码多核苷酸编码表2的任何直系同源物、同源物或保守取代的XBP1多肽，或者具有与SEQ ID NO:9、10和11的任一至少86％的一致性的氨基酸序列(包括SEQ ID NO:13的哺乳动物共有序列)的XBP1多肽。
在一些情况下，重组的或分离的XBP1的编码多核苷酸可操作地与哺乳动物启动子连接。该启动子可以为任何启动子，但是在一些情况下，其为哺乳动物启动子，例如泛素C启动子。
在具体的实施方案中，XBP1的编码多核苷酸基本上由(由5’至3’的顺序)启动子(例如泛素C启动子)、其后为可任选的内含子(β球蛋白内含子)、其后为XBP1的编码序列、其后为多聚腺苷酸序列(例如SV40pA序列)组成。SEQ ID NO:18描述了XBP1的编码多核苷酸的实例。该示例序列的保守变体也被设想为本发明的实施方案。
在一些情况下，重组的XBP1的编码多核苷酸为质粒的一部分，其可以为线性、环状、附加体、整合的、静态的DNA构建体，或者用于传递XBP1基因或表达剪切的且具有活性的XBP1蛋白质的载体。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含：(1)XBP1基因，其处于泛素C启动子的控制之下，并以SV40多聚腺苷酸信号为结尾；和(2)选择标记，例如编码赋予对博来霉素抗性的多肽的多核苷酸或编码赋予对新霉素抗性的多肽的多核苷酸，其处于启动子(例如SV40启动子)的控制之下，并以多聚腺苷酸序列(例如PGK pA序列)为结尾。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含(5’至3’方向进行的环状形式)泛素C启动子、β球蛋白内含子、XBP1的编码序列、SV40pA序列、SV40启动子、博来霉素抗性的编码序列和PGK pA序列。通过具有SEQ ID NO:17序列的环状质粒来举例说明该实施方案的特定实例。
编码抗体重链和轻链的多核苷酸
在另一个方面中，本发明提供了编码抗体重链多肽(HC)的多核苷酸。HC的编码多核苷酸是重组的，并且可以在体外(例如在试管中或在体外翻译系统中)或者在体内(例如在细胞中，细胞可以是离体的，例如细胞培养物中；或者是在体内的，例如在有机体中)制造、储存、使用或表达。在一些实施方案中，HC的编码多核苷酸在基因中，这表示其处于启动子的控制之下，并且位于启动子下游且多聚腺苷酸位点的上游。HC的编码多核苷酸可以在质粒或者其他环状或线性载体中。HC的编码多核苷酸或基因可以在环状或线性DNA构建体中，其可以作为附加体处于细胞中，或者整合至细胞的基因组中。
在一些情况下，重组的或分离的HC的编码多核苷酸可操作地与哺乳动物启动子连接。该启动子可以为任何启动子，但是在一些情况下，其为哺乳动物启动子，例如泛素C启动子或hCMV-IE启动子。
在具体的实施方案中，HC的编码多核苷酸为HC基因，其基本上由(由5’至3’的顺序)启动子(例如hCMV-IE启动子)、其后为可任选的内含子(β球蛋白内含子)、其后为重链的编码序列(例如编码SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:35的氨基酸序列的序列)、其后为多聚腺苷酸序列(例如SV40pA序列)组成。通过SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39描述了HC基因的特定实例。这些序列的任意一个的保守变体也被设想为本发明的实施方案。
在一些情况下，重组的HC的编码多核苷酸为质粒的一部分，其可以为线性、环状、附加体、整合的、静态的DNA构建体，或者用于传递重链基因或表达重链亚基的载体。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含：(1)HC基因，其处于hCMV-IE启动子的控制之下，并以SV40多聚腺苷酸信号为结尾；和(2)选择标记，例如编码赋予对潮霉素抗性的多肽的多核苷酸，其处于启动子(例如SV40启动子)的控制之下，并以多聚腺苷酸序列(例如PGK pA序列)为结尾。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含(5’至3’方向进行的环状形式)hCMV-IE启动子、β球蛋白内含子、抗体重链的编码序列(其编码具有SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:35的氨基酸的HC)、SV40pA序列、SV40启动子、潮霉素抗性的编码序列和PGK pA序列。通过SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:40描述了此类包含HC基因的质粒的特定实例和具体实施方案。这些序列的任意一个的保守变体也被设想为本发明的实施方案。
在另一个方面中，本发明提供了编码抗体轻链多肽(LC)的多核苷酸。LC的编码多核苷酸是重组的，并且可以在体外(例如在试管中或在体外翻译系统中)或者在体内(例如在细胞中，细胞可以是离体的，例如细胞培养物中；或者是在体内的，例如在有机体中)制造、储存、使用或表达。在一些实施方案中，LC的编码多核苷酸在基因中，这表示其处于启动子的控制之下，并且位于启动子下游且多聚腺苷酸位点的上游。LC的编码多核苷酸或基因可以在质粒或者其他环状或线性载体中。LC的编码多核苷酸或基因可以在环状或线性DNA构建体中，其可以作为附加体处于细胞中，或者整合至细胞的基因组中。
在一些情况下，重组的或分离的LC的编码多核苷酸可操作地与哺乳动物启动子连接。该启动子可以为任何启动子，但是在一些情况下，其为哺乳动物启动子，例如泛素C启动子或hCMV-IE启动子。
在具体的实施方案中，LC的编码多核苷酸为LC基因，其基本上由(由5’至3’的顺序)启动子(例如hCMV-IE启动子)、其后为可任选的内含子(β球蛋白内含子)、其后为轻链的编码序列(例如编码SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:37的氨基酸序列的序列)、其后为多聚腺苷酸序列(例如SV40pA序列)组成。通过SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:41描述了此类LC基因的特定实例和具体实施方案。这些序列的任意一个的保守变体也被设想为本发明的实施方案。
在一些情况下，重组的LC的编码多核苷酸为质粒的一部分，其可以为线性、环状、附加体、整合的、静态的DNA构建体或者用于传递轻链基因或表达轻链亚基的载体。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含：(1)LC基因，其处于hCMV-IE启动子的控制之下，并以SV40多聚腺苷酸信号为结尾；和(2)选择标记，例如编码赋予对潮霉素抗性的多肽的多核苷酸，其处于启动子(例如SV40启动子)的控制之下，并以多聚腺苷酸序列(例如PGK pA序列)为结尾。在一个具体的实施方案中，所述的质粒包含(5’至3’方向进行的环状形式)hCMV-IE启动子、β球蛋白内含子、抗体轻链的编码序列(其编码具有SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:37的氨基酸的LC)、SV40pA序列、SV40启动子、潮霉素抗性的编码序列和PGK pA序列。通过SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:42描述了此类包含LC基因的质粒的特定实例和具体实施方案。这些序列的任意一个的保守变体也被设想为本发明的实施方案。
制造多亚基蛋白质的方法
在另一个方面中，本发明提供了通过培养细胞或细胞系的构成细胞来制造多亚基蛋白质的方法，其中所述的细胞或细胞系的构成细胞在培养基中能够生产和分泌相对大量的适当组装的多亚基蛋白质，其中所述的多亚基成分以相对高的效价被分泌至培养基中。在该制造方法中使用的细胞为在之前的方面中所描述的细胞，其包含本发明所述的ERAD凝集素的编码多核苷酸。
为生产有用的重组蛋白质的培养细胞(特别是哺乳动物细胞)的方法是本领域公知的(例如参见De Jesus&Wurm,Eur.J.Pharm.Biopharm.78:184-188,2011，及其中引用的参考文献)。简言之，将包含所述的多核苷酸的细胞在培养基中培养，其中所述的培养基可以包含血清或水解产物，或者可以是化学限定并优化的，以用于蛋白质的生产。培养可以是分批供料培养或连续培养，例如在恒化器中。所述的细胞可以在试验台尺寸烧瓶(～25mL)中、在按生产规模呈比例扩大的生物反应器(1-5L)中或工业规模的生物反应器(5000-25000L)中培养。生产运行可以持续几周是一个月，其间多亚基蛋白质被分泌至培养基中。
题述细胞具有增强的生产和分泌适当组装的多亚基蛋白质的能力。在一些实施方案中，所述的多亚基蛋白质(例如抗体)以至少94ρg/个细胞/天、至少37ρg/个细胞/天或者至少39ρg/个细胞/天的速率分泌至培养基中。在一些实施方案中，所述的多亚基蛋白质在培养大约12天后的效价达到至少3g/L、至少5g/L、至少6g/L或者至少8g/L。
此外，题述细胞具有增强的增殖和达到相对高的细胞密度的能力，从而进一步优化生产率。在一些实施方案中，在培养中，细胞或细胞系的种子培养(seed train)的积分细胞密度达到至少5x 107个细胞-天/mL、至少1x 108个细胞-天/mL或者至少1.5x 108个细胞-天/mL。
可任选地，随后由其中分泌有多亚基蛋白质的培养基中纯化该蛋白质。蛋白质的纯化方法是本领域公知的(例如参见Kelley,mAbs1(5):443-452)。在一些实施方案中，通过离心除去液体培养基上清液中的细胞，然后经历多个层析步骤和过滤步骤以除去病毒和其他污染物或残杂物等，从而收获蛋白质。在一些实施方案中，层析步骤包括离子交换层析，例如阳离子交换或阴离子交换。此外，还可以使用多种亲和层析介质，例如用于纯化抗体的蛋白质A层析。
可任选地，所述的制造方法可以包括创建细胞的预备步骤。因此在一些实施方案中，制造多亚基蛋白质的方法包括使用上文所述的编码应激诱导的甘露糖凝集素的载体来转染细胞的步骤，然后选择其稳定的部分。载体的非限定性实例包括包含多核苷酸的基因构建体，其中所述的多核苷酸编码EDEM2，该EDEM2具有SEQ ID NO:1-8的任意一个的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1-8的任意一个具有至少92％的一致性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1-8的任意一种保守取代的变体。此外，有用的载体还包含例如容留SEQ ID NO:16基因的质粒、SEQ ID NO:15的质粒和SEQ ID NO:14的质粒。人们应该注意所述的质粒序列(例如SEQ ID NO:14、15、17、24、26、32、34、40和42)是在序列表中以线性方式描述的环状序列。因此在这些情况下，书写序列的3'最末端的核苷酸可以被认为与该书写序列的5'最末端核苷酸的5'端紧接。在SEQ ID NO:14质粒的实例中，通过对新霉素的抗性来选择转化子；在SEQ ID NO:15质粒的实例中，通过选择对博来霉素的抗性来选择转化子。
用于构建多核苷酸及包含该多核苷酸的载体的详细方法在美国专利号7,435,553和7,771,997(这些文献的内容以引用方式并入本文)、以及例如Zwarthoff et al.,J.Gen.Virol.66(4):685-91,1985；Mory et al.,DNA.5(3):181-93,1986；和Pichler et al.,Biotechnol.Bioeng.108(2):386-94,2011中有所描述。
起始细胞(其中放置有编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的载体)已经包含编码或调节多亚基蛋白质的亚基、或XBP1(对于使用XBP1的那些实施方案而言)的表达的构建体或基因元件。备选地，编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的载体可以首先放置到细胞的内部，然后放置其他的构建体。
通过所述的方法来制造多亚基蛋白质
在另一个方面中，本发明提供了根据本发明公开的方法制造的多亚基蛋白质。考虑到包含可以促进多亚基蛋白质(例如抗体)的适当折叠、组装和翻译后修饰的一个或多个元件，本领域的任一普通技术人员有理由认为此类蛋白质具有不同的结构和功能性。例如有理由认为通过所公开的方法制造的抗体具有特定的糖基化模式和数量上较高比率的非累积的异四聚体。
实施例
提供以下实施例，从而为本领域的那些普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且无意于限定发明人所认为的该发明的范围。对于使用的数字(例如量、温度等)，努力确保精确，但是仍会导致一些试验误差和偏差。除非另作说明，否则份数为摩尔份数；分子量为平均分子量；浓度百分率(％)是指溶质质量(以克计)除以溶液的体积(以毫升计)，再乘以100％(例如10％物质X平均0.1克的物质X每毫升溶液)；温度为℃；而压力为大气压力或接近大气压力。实施例1：细胞系
使用编码人抗体的重链和轻链的两个质粒转染CHO-K1衍生的宿主细胞系。所述的两个质粒均包含赋予对潮霉素B抗性的hph基因(Asselbergsand Pronk,1992,Mol.Biol.Rep.,17(1):61-70)。使用LIPOFECTAMIN试剂(Invitrogen编号#18324020)转染细胞。简言之，在转染前的一天，将3.5x106个细胞平板接种于10cm平板的包含10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen编号#10100)的完全F12(Invitrogen编号#11765)中。在转染当天，清洗细胞一次，并使用OPTIMEM(Invitrogen编号#31985)替代培养基。在OPTIMEM培养基中制备DNA/Lipofectamin复合物，然后将其加入到细胞中。6小时后，将培养基再次更换成具有10％FBS的完全F12。使用400μg/ml的潮霉素B选择试剂来选择稳定整合的质粒。使用FASTR技术来分离克隆抗体的表达细胞系(在美国专利号6,919,183中有所描述，该文献的内容以引用方式并入本文)。
然后，使用EDEM2的编码质粒再次转染抗体的表达细胞系。EDEM2质粒包含新霉素磷酸转移酶(质粒构建体被命名为“p3”)或sh ble(质粒“p7”)基因，从而分别赋予对G418或博来霉素的抗性。使用相同的转染方法。根据选择标记，选择分别具有400μg/ml G418抗性或250μg/ml博来霉素抗性的细胞。然后，使用FASTR技术分离克隆细胞系。
表3：细胞系
实施例2
使用摇瓶，在规模缩小的12天分批供料方法中评价抗体的生产。在该方法中，将细胞以8x105个细胞/mL的密度接种于烧瓶的生产培养基(定义为具有高含量氨基酸的培养基)中。培养持续大约12天，并补充3份供料、以及糖。在整个批次中监视活细胞的密度和抗体的效价。
为了测定mEDEM2对蛋白质生产增强的影响，将包含mEDEM2和mXBP1的CHO细胞系的蛋白质生产与包含mXBP1但不包含mEDEM2的对照细胞的生产比较。在表达mEDEM2的那些细胞系中的蛋白质的效价高于不表达mEDEM2的那些细胞系的蛋白质的效价。
表4：效价
实施例3：积分细胞天数
积分细胞天数(“ICD”)是用于描述在整个分批供料工艺中培养物生长的短语。在为期12天的生产测定期间，我们在第0、3、5、7、10和12天监视活细胞的密度。然后将该数据针对时间绘图。ICD为活细胞密度的积分，以细胞密度曲线下的面积计算。EDEM2转染的细胞系在为期12天的分批供料工艺中具有更高的ICD(参见表5)。
表5：积分细胞密度
实施例4：抗GDF8抗体的生产
检测EDEM2、XBP1或两者的异位表达对具有SEQ ID NO:19的重链序列和SEQ ID NO:21的轻链序列的抗GDF8抗体的影响。检测单个细胞系的效价和积分细胞密度，并将其归于各“库”或值的范围中。EDEM2的异位表达显著增加了表达抗体的效价范围为5-6g/L的细胞系的数量。XBP1和EDEM2的组合显示不仅是增加高效价细胞系的相加的效应。此外，EDEM2在抗体的分泌细胞中的表达还显著地增加获得高ICD的细胞系的数量(参见表6)。
表6：

Claims (135)

1.一种细胞，其包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸和编码多亚基蛋白质的多核苷酸。
2.权利要求1所述的细胞，其中所述的应激诱导的甘露糖结合凝集素为内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质2(EDEM2)。
3.权利要求2所述的细胞，其中所述的EDEM2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
4.权利要求2所述的细胞，其中所述的EDEM2包含与SEQ ID NO:1具有至少92％的一致性的氨基酸序列。
5.权利要求1-4的任意一项所述的细胞，其中所述的多亚基蛋白质为抗体。
6.权利要求5所述的细胞，其中所述的抗体包含SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
7.权利要求1-6的任意一项所述的细胞，其包含编码未折叠蛋白质反应转录因子的多核苷酸，其中所述的未折叠蛋白质反应转录因子在所述的EDEM2的上游进行操作。
8.权利要求7所述的细胞，其中所述的转录因子为剪切形式的XBP-1。
9.权利要求8所述的细胞，其中所述的XBP-1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
10.权利要求8所述的细胞，其中所述的XBP-1包含与SEQ ID NO:9具有至少86％的一致性的氨基酸序列。
11.权利要求1-10的任意一项所述的细胞，其中所述的细胞为哺乳动物的细胞。
12.权利要求1-11的任意一项所述的细胞，其中所述的细胞为CHO细胞。
13.一种由权利要求1-12的任意一项所述的细胞衍生得到的细胞系。
14.权利要求13所述的细胞系，其生产效价为至少3g/L的所述的蛋白质。
15.权利要求13或权利要求14所述的细胞系，其生产效价为至少5g/L的所述的蛋白质。
16.权利要求13-15的任意一项所述的细胞系，其生产效价为至少8g/L的所述的蛋白质。
17.权利要求13-16的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细胞密度高出至少大约30％。
18.权利要求13-17的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细胞密度高出至少大约50％。
19.权利要求13-18的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细胞密度高出至少大约60％。
20.权利要求13-19的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细胞密度高出至少大约90％。
21.一种包含编码EDEM2的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物的泛素C启动子可操作地连接。
22.权利要求21所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2包含SEQID NO:8的氨基酸序列。
23.权利要求21或权利要求22所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
24.权利要求21-23的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2包含与SEQ ID NO:1具有至少92％的一致性的氨基酸序列。
25.权利要求21-24的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2由与SEQ ID NO:1具有至少92％的一致性的氨基酸序列组成。
26.权利要求21-25的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
27.权利要求21-26的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
28.权利要求21-27的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
29.权利要求21-28的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
30.权利要求21-29的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15的核苷酸序列组成。
31.一种包含编码Xbp-1蛋白质的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物的泛素C启动子可操作地连接。
32.权力要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
33.权力要求31或权利要求32所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成。
34.权利要求31-33的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质包含与SEQ ID NO:9具有至少86％的一致性的氨基酸序列。
35.权利要求31-34的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质由与SEQ ID NO:9具有至少86％的一致性的氨基酸序列组成。
36.权利要求31-35的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
37.权利要求31-36的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
38.权利要求31-37的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
39.权利要求31-38的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
40.权利要求31-39的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:17的核苷酸序列组成。
41.一种包含编码抗GDF8抗体重链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物的泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。
42.权利要求41所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体重链包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
43.权利要求41或权利要求42所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体重链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
44.权利要求41-43的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体重链由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。
45.权利要求41-44的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。
46.权利要求41-45的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列。
47.权利要求41-46的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:24的核苷酸序列组成。
48.一种包含编码抗GDF8抗体轻链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。
49.权利要求48所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
50.权利要求48或权利要求49所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体轻链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
51.权利要求48-50的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体轻链由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。
52.权利要求48-51的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
53.权利要求48-52的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
54.权利要求48-53的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:26的核苷酸序列组成。
55.一种包含编码抗ANG2抗体重链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。
56.权利要求55所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体重链包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
57.权利要求55或权利要求56所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体重链包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
58.权利要求55-57的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体重链由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
59.权利要求55-58的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列。
60.权利要求55-59的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列。
61.权利要求55-60的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:32的核苷酸序列组成。
62.一种包含编码抗ANG2抗体轻链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。
63.权利要求62所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
64.权利要求62或权利要求63所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体轻链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
65.权利要求62-64的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体轻链由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成。
66.权利要求62-65的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
67.权利要求62-66的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列。
68.权利要求62-67的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:34的核苷酸序列组成。
69.一种包含编码抗AngPtl4抗体重链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。
70.权利要求69所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体重链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
71.权利要求69或权利要求70所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
72.权利要求69-71的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体重链由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成。
73.权利要求69-72的任意一项所述的分离的多核苷酸，其包含SEQID NO:39的核苷酸序列。
74.权利要求69-73的任意一项所述的分离的多核苷酸，其包含SEQID NO:40的核苷酸序列。
75.权利要求69-74的任意一项所述的分离的多核苷酸，其基本上由SEQ ID NO:40的核苷酸序列组成。
76.一种包含编码抗AngPtl4抗体轻链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。
77.权利要求76所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体轻链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
78.权利要求76或权利要求77所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体轻链包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
79.权利要求76-78的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体轻链由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成。
80.权利要求76-79的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
81.权利要求76-80的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列。
82.权利要求76-81的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ IDNO:42的核苷酸序列组成。
83.一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列。
84.一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列。
85.一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
86.一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列。
87.一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列。
88.一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述的多肽包含SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
89.一种细胞，其包含：权利要求21-30的任意一项所述的分离的多核苷酸；以及(b)编码多亚基蛋白质的多核苷酸。
90.权利要求89所述的细胞，其中所述的多亚基蛋白质为抗体。
91.权利要求90所述的细胞，其中所述的抗体包含权利要求83-88的任意一项所述的氨基酸序列。
92.权利要求91所述的细胞，其中所述的抗体包含权利要求85和88所述的氨基酸序列。
93.权利要求89-92的任意一项所述的细胞，其进一步包含权利要求31-40的任意一项所述的多核苷酸。
94.权利要求89-93的任意一项所述的细胞，其包含权利要求41-47的任意一项所述的多核苷酸和权利要求48-54的任意一项所述的多核苷酸。
95.权利要求89-93的任意一项所述的细胞，其包含权利要求55-61的任意一项所述的多核苷酸和权利要求62-68的任意一项所述的多核苷酸。
96.权利要求89-93的任意一项所述的细胞，其包含权利要求69-75的任意一项所述的多核苷酸和权利要求76-82的任意一项所述的多核苷酸。
97.权利要求89-96的任意一项所述的细胞，其中所述的细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
98.一种制备多亚基蛋白质的方法，其包括在培养基中培养权利要求89-97的任意一项所述的细胞的步骤，其中所述的多亚基蛋白质被所述的细胞分泌至所述的培养基中。
99.权利要求98所述的方法，其中所述的分泌的多亚基蛋白质在所述的培养基中的效价达到大约至少3g/L。
100.权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述的分泌的多亚基蛋白质在所述的培养基中的效价达到大约至少5g/L。
101.权利要求89-91的任意一项所述的方法，其中所述的分泌的多亚基蛋白质在所述的培养基中的效价达到大约至少6g/L。
102.权利要求89-92的任意一项所述的方法，其中所述的分泌的多亚基蛋白质在所述的培养基中的效价达到大约至少8g/L。
103.权利要求89-93的任意一项所述的方法，其中所述的细胞在所述的培养基中分裂达到积分细胞密度为大约至少5x107个细胞-天/mL。
104.权利要求89-94的任意一项所述的方法，其中所述的细胞在所述的培养基中分裂，从而产生积分细胞密度为大约至少1x108个细胞-天/mL。
105.权利要求89-95的任意一项所述的方法，其中所述的细胞在所述的培养基中分裂，从而产生积分细胞密度为大约至少1.5x108个细胞-天/mL。
106.权利要求89-96的任意一项所述的方法，其进一步包含从所述的培养基中纯化所述的分泌多亚基蛋白质的步骤。
107.一种根据权利要求98-106的任意一项所述的方法生产的多亚基蛋白质。
108.权利要求107所述的多亚基蛋白质，其中所述的多亚基蛋白质为抗体。
109.权利要求108所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体包含SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
110.权利要求109所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体为抗GDF8抗体。
111.权利要求110所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体包含SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
112.权利要求109所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体为抗ANG2抗体。
113.权利要求112所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体包含SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
114.权利要求109所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体为抗AngPtl4抗体。
115.权利要求114所述的多亚基蛋白质，其中所述的抗体包含SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
116.一种包含多核苷酸的离体哺乳动物细胞，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:16的核酸序列。
117.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；和(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核酸序列。
118.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽；和(c)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽。
119.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:23的核酸序列；和(c)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25的核酸序列。
120.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:31的核酸序列；和(c)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:33的核酸序列。
121.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:39的核酸序列；和(c)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:41的核酸序列。
122.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核酸序列；(c)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽；和(d)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽。
123.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核酸序列；(c)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:23的核酸序列；和(d)多核苷酸，其包含SEQID NO:25的核酸序列。
124.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核酸序列；(c)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:31的核酸序列；和(d)多核苷酸，其包含SEQID NO:33的核酸序列。
125.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:16的核酸序列；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的核酸序列；(c)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:39的核酸序列；和(d)多核苷酸，其包含SEQID NO:41的核酸序列。
126.一种包含多核苷酸的离体哺乳动物细胞，所述的多核苷酸由SEQID NO:14或15的核酸序列组成。
127.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；和(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:17的核酸序列组成。
128.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽；和(c)多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽。
129.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:24的核酸序列组成；和(c)多核苷酸，其由SEQ ID NO:26的核酸序列组成。
130.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:32的核酸序列组成；和(c)多核苷酸，其由SEQ ID NO:4的核酸序列组成。
131.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:40的核酸序列组成；和(c)多核苷酸，其由SEQ ID NO:42的核酸序列组成。
132.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:17的核酸序列组成；(c)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽；和(d)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽。
133.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:17的核酸序列组成；(c)多核苷酸，其由SEQ ID NO:24的核酸序列组成；和(d)多核苷酸，其由SEQ ID NO:26的核酸序列组成。
134.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:17的核酸序列组成；(c)多核苷酸，其由SEQ ID NO:32的核酸序列组成；和(d)多核苷酸，其由SEQ ID NO:34的核酸序列组成。
135.一种离体哺乳动物细胞，其包含：(a)多核苷酸，其由SEQ ID NO:14或15的核酸序列组成；(b)多核苷酸，其由SEQ ID NO:17的核酸序列组成；(c)多核苷酸，其由SEQ ID NO:40的核酸序列组成；和(d)多核苷酸，其由SEQ ID NO:42的核酸序列组成。
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