DE60211329T2

DE60211329T2 - Isolierung von sezernierte proteine exprimierenden zellen

Info

Publication number: DE60211329T2
Application number: DE60211329T
Authority: DE
Inventors: P. James LaGrangeville FANDL; Neil Carmel Stahl; Gang Yorktown Heights CHEN; D. George Yorktown Heights YANCOPOULOS
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: EP1392859A4; WO2002057423A3; US20050186623A1; WO2002057423A2; EP1392859A2; US20060234311A1; IL156910A; HK1059290A1; EP1392859B1; US7435553B2; JP4323167B2; ATE325865T1; CA2434802A1; JP2004520037A; US20020168702A1; IL156910A0; DE60211329D1; AU2002245272B2; US6919183B2; CA2434802C

Description

Fachgebiet der Erfindung
Das Gebiet dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Identifizieren und Isolieren von Zellen, die sekretierte Proteine produzieren. Dieses Verfahren basiert auf einer spezifischen Eigenschaft oder der Expressionshöhe des sekretierten Proteins, indem das sekretierte Protein vorübergehend an der Oberfläche einer einzelnen Zelle eingefangen und so die Selektion seltener Zellklone aus einer heterogenen Population ermöglicht wird. Das Gebiet umfasst auch die Anwendung dieses Verfahrens auf die Generierung von Zellen, die eine gewünschte Menge an sekretiertem Protein oder eines sekretierten Proteins einer/mehrerer bestimmter/n Eigenschaft(en) produzieren, und Organismen, die solche Zellen aufweisen. Insbesondere erlaubt das Verfahren die schnelle Isolatierung von hoch exprimierenden rekombinanten Antikörperproduzierenden Zelllinien, oder kann direkt auf die schnelle Isolierung spezifischer Hybridome oder die Isolierung Antikörper-produzierender transgener Tiere angewendet werden. Dieses Verfahren ist auf jegliche Zelle anwendbar, die Protein sekretiert.
Einführung
Das Verfahren der Erfindung bietet wesentliche Vorteile gegenüber den derzeitigen Verfahren zum Isolieren und Identifizieren von Protein-sekretierenden Zellen. Das beschriebene Verfahren ist effizienter, akkurater und breiter anwendbar. Spezifisch kann jegliche Zelle, die ein Protein sekretiert, mittels des Verfahrens der Erfindung isoliert werden. Dieser Aspekt ist besonders wichtig, da viele therapeutische Proteine sekretiert werden. Darüber hinaus können sekretierte Protein-produzierende Zellen ausgehend von den Eigenschaften des Proteins isoliert werden. Zum Beispiel können Zellen, die Antikörper sekretieren, schnell und bequem hinsichtlich der gewünschten Spezifität, Avidität oder Isotyp isoliert werden. Weiterhin kann, anders als bei vielen Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen die Produktion an sekretiertem Protein indirekt quantifiziert wird, die produzierte Menge an sekretiertem Protein direkt quantifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung liefert somit ein schnelles, bequemes und akkurates Verfahren für die systematische Isolation von Protein-sekretierenden Zellen.
Hintergrund der Erfindung
Viele Proteine, die von potentiellem pharmazeutischem Wert sind, sind sekretierte Proteine, einschließlich Wachstumsfaktoren, löslicher Rezeptordomänen und, von höchster Bedeutung, monoklonaler Antikörper. Die Produktionsmethoden unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie zur Erzeugung dieser und anderer Proteine machen Gebrauch von genetischen Expressionssystemen, die Wirtszellen und Expressionsvektoren venrwenden.
Die Expressionsvektoren tragen das Gen von Interesse (GOI), das in die Zelle eingeführt werden soll. Diese Expressionsvektoren führen die genetische Information ein, einschließlich des/der GOI(s), die sich in das Wirtszell-eigene genetische Material integriert. Nach der stabilen Integration des Gens von Interesse (GOI) können die standardmäßigen Methoden zur Isolierung hoch exprimierender Zellen das Sammeln von Zellpools, Handentnehmen von Kolonien von den Platten, Isolieren von einzelnen Zellen durch limitierte Verdünnung oder andere im Fachgebiet bekannte Methoden beinhalten. Pools oder einzelne Klone werden dann expandiert und auf die Produktion des Proteins von Interesse (POI) durch direkte Messung der POI-Aktivität, durch immunologischen Nachweis des POI oder mittels anderer geeigneter Techniken expandiert und gescreent. Diese Verfahrensweisen sind mühsam, ineffizient und kostenintensiv, und die Zahl der Klone, die analysiert werden kann, ist gewöhnlich auf einige Hundert beschränkt.
Der hohe Grad der Heterogenität in der Proteinexpression durch Zellen auf die stabile Integration hin macht es erforderlich, dass viele individuelle Klone in der Bemühung gescreent werden, das seltene Integrationsereignis zu identifizieren, das zu einer stabilen, hoch exprimierenden Produktionszelllinie führt. Dieses Erfordernis verlangt nach Methoden, die eine schnelle Identifizierung und Isolierung der Zellen ermöglichen, die das höchste Niveau der Proteinproduktion exprimieren. Darüber hinaus wird mit dem Sammeln von Klonpools, oder von Hand geernteten Kolonien, der Verlust von hoch exprimierenden Zellen, die oftmals langsamer wachsen, zugunsten von schneller wachsenden, gering exprimierenden Zellen riskiert. Daher besteht ein Bedarf an Methoden, die ein schnelles Screening und Isolieren einzelner Zellen erlauben, die zur Expression einer hohen Menge an sekretiertem POI fähig sind.
Die Einbeziehung der Flusszytometrie in die Methoden, die zur Isolierung stabil exprimierender Zelllinien angewendet werden, hat die Screenbarkeit großer Zahlen von individuellen Klone verbessert, wobei jedoch die derzeitig verfügbaren Methoden aus unterschiedlichen Gründen inadäquat bleiben. Die früheren Anwendungen der Flusszytometrie auf die Identifizierung und Isolierung von Hybridomen mit einer definierten Spezifität (Parks et al. (1979) PNAS 76:1962, und Pallavacini et al. (1989) J. Immunol. Methods 117:99), Isotyp (Dangl und Herzenberg (1982) J. Immunol. Methods 52:1) oder Avidität (Jantscheff et al. (1988) J. Immunol. 141:1624) hingen alle vom Nachweis von Antikörpern ab, die nicht-spezifisch an die Zelloberfläche gebunden waren. Diese Methoden gingen von einer Korrelation zwischen der Menge an Oberflächen-gebundenem und sekretiertem Antikörper aus. Die Diffusion des POI zwischen Zellen mit verschiedenen Eigenschaften stellte ebenfalls ein Problem dar. Vor Kurzem sind zwei weitere Methoden, die die Flusszytometrie nützen, für die Hochdurchsatz-Isolation von stabil hoch exprimierenden Zelllinien entwickelt worden.
Die erste Methode bezieht eine Modifikation des Expressionsplasmids ein, so dass es einen transkriptionellen Read-out für die GOI-mRNA enthält. Dies wird in den allermeisten Fällen durch Einführen einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und eines Gens, dessen Proteinprodukt durch Flusszytometrie leicht überwachbar ist, am häufigsten grün fluoreszierendes Protein (GFP), zwischen das Stoppcodon des GOI und die terminate Poly A-Stelle erreicht (Meng et al. (2000) Gene 242:201). Das Vorhandensein einer IRES erlaubt das Translatieren des POI und GFP von der selben mRNA. Daher steht die Expressionshöhe des GFP-Gens in indirektem Bezug zur mRNA-Menge für das GOI. Klone, die das GFP in hohen Mengen akkumulieren, werden durch Flusszytometrie isoliert und dann auf die POI-Produktion gescreent. Da diese Methode von der Kopplung der GOI-Expression an das Reportergen unter Verwendung einer IRES in einer rekombinanten Konstruktion abhängt, ist sie nicht auf die Isolation von Hybridomen anwendbar.
Die Anwendung der Flusszytometrie in der Isolierung von Expressionsklonen erlaubt die schnelle Analyse großer Anzahlen von Klonen in einem Hochdurchsatz-Format. Darüber hinaus verringert die Anwendung der Flusszytometrie die direkte Handhabung der Zellen beträchtlich. Ungünstigerweise ist die Höhe der GFP-Produktion nicht ein direktes Maß für die Produktionshöhe des POI. Verschiedene Mechanismen können die Produktion an sekretiertem POI von der Akkumulierung von GFP entkoppeln. Unterschiede in der Produktion des POI und des GFP-Reporters können aus Unterschieden in der Translationseffizienz der beiden Gene, der Sekretionseffizienz des POI oder der Stabilität der polycistronischen mRNA resultieren.
Eine andere Methode, die die Flusszytometrie zur Isolierung von Expressionsklonen anwendet, bezieht das Verkapseln von Zellen mit Agarose-Mikrotröpfchen ein (Weaver et al. (1990) Methods Enzymol. 2:234). Bei dieser Methode werden für das POI spezifische biotinylierte Antikörper an die biotinylierte Agarose durch Streptavidin so gebunden, dass sekretiertes POI eingefangen und innerhalb der Mikrotröpfchen rückgehalten wird (Gray et al., (1995) J. Immunol. Methods 182:155). Das eingefangene POI wird durch Immunfärbung mit einem für das POI spezifischen Antikörper detektiert. Um das Absorbieren von POI, das von benachbarten Zellen sekretiert wird, durch die einkapselnde Agarose zu vermindern, werden die Zellen in ein gering durchlässiges Medium platziert. Die Zellen mit der höchsten Antikörper-Anfärbung des POI in der einbettenden Agarose werden durch Flusszytometrie identifiziert und isoliert. Bei dem Ansatz mit den Gel-Mikrotröpfchen werden die Zellen direkt auf ihre Fähigkeit zum Sekretieren von POI gescreent und nicht indirekt auf die Expression von GOI mRNA gescreent, was aber die Verfügbarkeit geeigneter Antikörper für den Einfang und die Anfärbung des sekretierten POI erfordert, welches Verfahren spezielle Geräte zur Erzeugung der Agarosegel-Mikrotröpfchen notwendig macht. Darüber hinaus können einige Zellen empfindlich gegenüber dem Einkapselungsprozess sein.
Eine Abwandlung dieser Methode umgeht das Erfordernis des Einbettens der Zellen in eine Matrix durch indirekte Bindung eines für das POI spezifischen Antikörpers an die Zelloberfläche (Manz et al. 1995. PNAS 92:1921-1925). Bei dieser Methode folgt der nicht-spezifischen Biotinylierung der Zelloberflächen-Proteine mit Biotin-Hydroxysuccinimidester der Kontakt mit einem Streptavidin-konjugierten Antikörper, der zur Bindung des POI fähig ist. Die das POI sekretierenden Zellen werden mit dem POI dekoriert, welches dann mit einem geeignet markierten Sekundärantikörper nachgewiesen wird. Allerdings stellt die Diffusion des POI zwischen benachbarten Zellen ein Problem dar und erfordert diese Methode außerdem ein hoch visköses Medium, um die Diffusion des POI weg von den exprimierenden Zellen zu vermindern. Da diese hoch viskösen Medien zur Unterscheidung der Zellen erforderlich sind, müssen die Zellen gewaschen und in ein für die Zellsortierung geeignetes Medium eingebracht werden, sofern dies gewünscht wird. In WO 94/09117 und WO 99/58977 werden verwandte Methoden für die direkte Selektion von Zellen durch ein Sekretionsprodukt beschrieben.
Die mit der Identifizierung und Isolierung von hoch exprimierenden rekombinanten Zelllinien verbundenen Probleme betreffen speziell die Isolierung von Hybridomen, die einen Antikörper von Interesse exprimieren. Allerdings beinhaltet die Identifizierung nützlicher Hybridome mehrere zusätzliche Probleme; sie müssen zunächst auf ihre Antigen-bindende Aktivität gescreent werden, dann auf den Immunglobulin-Isotyp. Darüber hinaus lassen sich die GFP-basierten Methoden nicht auf die Identifikation und Isolation von Hybridomen anwenden, da die Konstruktion der Hybridome kein rekombinantes Konstrukt einbezieht, sodass die Expression der Antikörper-Gene an einen Transkriptions-Reporter wie GFP gekoppelt werden kann. Das Hybridom-Screening ist ein langsames, mühsames Unterfangen, bei dem die Zahl der gescreenten Klone durch die bestehenden Technologien eingeschränkt wird.
Ein ähnliches Problem stellt die Selektion seltener Zellen, die einen Antikörper, ein ScFv, ein Fragment davon, oder irgendein an eine Konstantregion eines Antikörpers fusioniertes Molekül, mit einer gewünschten Spezifität, Isotyp und Avidität für ein bestimmtes Antigen produzieren, aus einer heterogenen Population von Zellen dar, die verschiedene Antikörper, ScFvs, Fragmente davon oder an Konstantregionen von Antikörpern fusionierte Moleküle exprimieren.
Daher besteht ein Bedarf an einer schnellen und effizienten Methode zur Identifizierung und Isolierung von Zellen, die verschiedene sekretierte POIs aus einer großen Population von Zellen exprimieren. Am Erwünschtesten ist eine Methode, die die Protein-Expressionshöhe und nicht die mRNA misst, da das Maß der mRNA oftmals nicht akkurat die Mengen an Protein widerspiegelt, die schließlich erzeugt werden. Außerdem besteht ein Bedarf an einer effizienteren Methode zur Identifizierung von Zellen, die bestimmte Antikörper produzieren, als den derzeit im Fachgebiet verfügbaren Methoden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Hochdurchsatz-Screeningmethode für die schnelle Isolierung jener Zellen, die Protein sekretieren, durch direktes Screening für das POI. Diese Erfindung erlaubt auch die bequeme Überwachung der POI-Expression auf einer Einzelzell-Basis während des Herstellungsprozesses. Darüber hinaus kann diese Technologie direkt auf das Screening von Antikörper-produzierenden Zellen angewendet werden.
Diese Erfindung betrifft die Konstruktion von Zelllinien, die Zelloberflächen-Fangmoleküle exprimieren, die verschiedene sekretierte POIs binden, und deren Anwendung zum Identifizieren und Isolieren der Zellen, die das POI sekretieren. Die Isolierung einer Zelle mittels der Methoden dieser Erfindung kann auf der Expressionshöhe des POI oder einem spezifischen Charakteristikum des POI basieren. Durch die Konstruktion oder Verwendung solch einer Zelle kann jegliches sekretierte Protein durch das Zelloberflächen-Fangmolekül eingefangen werden, vorausgesetzt, dass eine entsprechende Affinität zwischen den beiden vorhanden ist.
Wie weiter erläutert, kann jegliches Molekül manipuliert werden, sodass es als ein Zelloberflächen-Fangmolekül verwendet werden kann. Daher kann diese Erfindung zum Isolieren jeglicher Zelle genützt werden, die ein Protein sekretiert. Weiterhin können viele Zellen zum Produzieren der sekretierten Proteine transfiziert werden, weshalb selbst Zellen, die in ihrem nativen Zustand keine Proteine sekretieren, als sekretierte Proteinproduzenten durch die Anwendung dieser Erfindung isoliert werden können.
Der Nachweis der Zellen mit dem präsentierten POI kann durch die Verwendung jeglichen Moleküls erreicht werden, das zur direkten oder indirekten Bindung des präsentierten POI fähig ist. Diese Detektionsmoleküle können die Detektion und/oder Isolation der Zellen erleichtern, die das POI präsentieren. Bei einer Anwendungsform werden zwei Moleküle, die aneinander binden und unterschiedlich markiert sind, verwendet. Der Nachweis und/oder die Isolation können durch im Fachgebiet bekannte standardmäßige Techniken erreicht werden.
Außerdem kann diese Erfindung auf die Isolierung von Antikörper-produzierenden Zellen angewendet werden. Spezifisch kann eine Antikörper-produzierende Zelle an eine immortalisierte Zelle fusioniert werden, welche ein Zelloberflächen-Fangmolekül exprimiert, das das POI bindet, welches in diesem Fall ein Antikörper ist. Die Antikörper-produzierende Zelle kann eine B-Zelle oder ein Derivat davon sein, wie z.B. eine Plasmazelle, ein Hybridom, eine Myelom oder eine rekombinante Zelle. Die Erfindung kann auch zur Isolierung von Zellen verwendet werden, die die gewünschten Mengen, spezifisch hohe Mengen, eines rekombinanten Antikörpers oder Fragments davon exprimieren. Diese Erfindung erlaubt auch die Isolation seltener Zellen, die einen Antikörper, ScFv, Fragmente davon oder irgendein Molekül, das an eine Antikörper-Konstantregion fusioniert ist, exprimieren, mit einer gewünschten Spezifität, Isotyp und Avidität für ein bestimmtes Antigen aus einer Population von heterologen Zellen, die eine Bibliothek von Antikörper-Genen mit variierender Bindungsspezifität, Isotyp und Avidität exprimieren. Spezifischer betrifft die Erfindung die Identifikation von Antikörper-produzierenden Zellen, die sekretierte Antikörper einer gewünschten Spezifität und Isotyp exprimieren, als auch von Antikörpern, die für ein gewünschtes Epitop spezifisch sind.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen und Isolieren von Zellen bereit, die ein sekretiertes Protein von Interesse (POI) produzieren, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Zelle, umfassend eine Nukleinsäure, die ein sekretiertes POI codiert, und eine Nukleinsäure, die ein Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, das zur Bindung des POI fähig ist, wobei die Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, oder die Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, oder beide, in die Zelle transfiziert sind;
(b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, bei denen das POI und das Zelloberflächen-Fangmolekül exprimiert werden, und ein POI-Fangmolekül-Komplex intrazellulär gebildet und an die Zelloberfläche gebracht wird;
(c) Kontaktieren der Zelle mit einem Nachweismolekül, welches an das durch die Zelle gezeigte POI bindet; und
(d) Nachweisen und Isolieren der Zelle auf der Grundlage des Nachweismoleküls.

Bei einer speziellen Anwendungsform umfasst der Bereitstellungsschritt (a) des Verfahrens der Erfindung das Transfizieren der Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, und der Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, in die Zelle.
Bei einer Anwendungsform wird die Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangprotein codiert, vor der Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, in die Zelle transfiziert. Alternativ werden die Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangprotein codiert, und die Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, gleichzeitig in die Zelle transfiziert.
Das Verfahren der Erfindung kann an einer Population von Zellen vorgenommen werden, wobei der Isolierungsschritt die Zellen isoliert, die an das Nachweismolekül aus der Population gebunden sind. Die Zellen können unterschiedliche Mengen des POI exprimieren, und der Isolierschritt kann Zellen basierend auf der relativen Expressionshöhe des POI isolieren.
Außerdem wird bei der Erfindung die Hinzufügung eines Membranankers zu einem Protein erwogen, sodass es in einer Zellmembran verankert bleibt, an Außenseite der Zelle exponiert verbleibt und als ein Zelloberflächen-Fangmolekül fungiert. Ein solcher Membrananker kann ein Transmembrananker oder ein GPI-Verknüpfungssignal sein und kann für die Zelle nativ, rekombinant oder synthetisch sein.
Die Erfindung umfasst auch die Hinzufügung einer Signalsequenz zum Amino-Terminus eines Proteins, sodass das Protein an die Zelloberfläche transportiert wird und als ein Zelloberflächen-Fangmolekül fungiert. Diese Signalsequenz kann für die Zelle nativ, rekombinant oder synthetisch sein.
Bei einer anderen Anwendungsform wird ein Blockiermolekül, welches das Zelloberflächen-Fangmolekül bindet, zur Verminderung der Diffusion des POI aus der exprimierenden Zelle zu einer benachbarten Zelle hinzugefügt. Bei einer zusätzlichen Anwendungsform wird die Diffusion des POI aus der exprimierenden Zelle zu einer benachbarte Zelle und seine Haftung an jener Zelle durch Erhöhung der Viskosität des Mediums vermindert.
Diese Erfindung betrifft außerdem die Identifikation und Selektion von Zellen, die sekretierte Proteine exprimieren, einschließlich Liganden, lösliche Rezeptorproteine, Wachstumsfaktoren und Antikörper. Solche sekretierten Proteine können rekombinant produziert oder natürlich vorkommend sein. Außerdem kann die Nukleinsäure, die ein POI codiert, ausgewählt sein aus einer Bibliothek, einschließlich, doch nicht beschränkt auf eine cDNA-Bibliothek oder eine Genombank.
Bei einer Anwendungsform können solche Wachstumsfaktoren ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, Ziliärem Neurotrophischem Faktor(CNTF), Erythropoetin, Vaskulärem Endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), Angiopoetin 1, Angiopoetin 2, TNF, Interferon-gamma, GM-CSF, TGFβ, TNF-Rezeptor und Fusionsproteinen.
Bei einer anderen Anwendungsform wird der Antikörper ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IgM, IgG, IgA, IgD oder IgE, als auch verschiedenen Subtypen von diesen.
Bei noch einer anderen Anwendungsform verwendet die Erfindung einen Ligandenspezifischen Rezeptor, einen Rezeptor-spezifischen Liganden oder ein Antikörperbindendes Protein als dem Zelloberflächen-Fangmolekül, welches das POI bindet. Solch ein Zelloberflächen-Fangmolekül kann rekombinant erzeugt oder natürlich vorkommend sein.
Bei einer Anwendungsform ist das Zelloberflächen-Fangmolekül ein Ligandenspezifischer Rezeptor, ein Rezeptor-spezifischer Ligand, ein Antikörper-bindendes Protein, ein Antikörper, ein ScFv, ein Fragment davon, ein an eine Konstantregion eines Antikörpers fusioniertes Molekül und ein Peptid aus einem Phagen-Display oder einer Peptidbibliothek, und Derivate, die das POI binden. Bei einer anderen Anwendungsform ist das Zelloberflächen-Fangmolekül ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tie1, Tie2, VEGFRI (Flt1), VEGFRII (Flk1).
Außerdem betrifft die Erfindung die Identifikation von B-Zellen und Derivaten davon, oder Hybridomen, die sekretierte Antikörper einer gewünschten Spezifität, Affinität oder Isotyp exprimieren. Die Erfindung kann auch zum Isolieren von Zellen verwendet werden, die gewünschte Mengen eines Antikörpers oder von Antikörper-Fragmenten exprimieren.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Anti-Immunglobulin-Antikörpern, Anti-Immunglobulin-ScFv, Protein A, Protein L, Protein G oder Fc-Rezeptor (FcR) als dem Zelloberflächen-Fangmolekül, das das POI bindet, wobei das POI ein sekretierter Antikörper ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt die Konstruktion von pTE084, designed für die konstitutive Expression von humanem FcγRl, stromaufwärts vom CMV-MIE-Promoter dar.
2A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten CHO K1-Zellen.
2B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von FITC-hFc-gefärbten CHO K1.
2C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm eines FITC-hFc-gefärbten G418-resistenten CHO K1-Zellpools nach pTE084-Transfektion.
2D zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von FITC-hFc-gefärbten RGC3-Zellen.
3 zeigt eine Zusammenfassung der Fähigkeit von IgG anhand einer Vielzahl von Tier-Spezies, 4SC622 gegenüber einer Bindung an RGC1-Zellen zu blockieren.
4A zeigt eine flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten RGC1-Zellen.
4B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm der 4SC622-Bindung an FcγRl-exprimierende RGC1-Zellen, wie durch die PE-AG184-Bindung angegeben.
4C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von Ratten-IgG, das die Bindung von 4SC622 an RGC1-Zellen blockiert, wie durch Verlust der PE-AG184-Bindung angezeigt.
5A zeigt ein flusszytometrisches Zweiparameter-Histogramm von RGC2-Zellen, die das Gen für hFcγRl und GFP exprimieren, angefärbt mit PE-AG184.
5B zeigt ein flusszytometrisches Zweiparameter-Histogramm von RGC2-Zellen, die das Gen für hFcγRl und GFP exprimieren, inkubiert mit 1 μg/ml 4SC622 für 18 Stunden vor der Anfärbung mit PE-AG184.
5C zeigt ein flusszytometrisches Zweiparameter-Histogramm von RGC4-Zellen, die das Gen für hFcγRl und 4SC622 exprimieren, angefärbt mit PE-AG184.
5D zeigt ein flusszytometrisches Zweiparameter-Histogramm von RGC4-Zellen, die das Gen für hFcγRl und 4SC622 exprimieren, inkubiert mit Ratten-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit PE-AG184.
5E zeigt ein flusszytometrisches Zweiparameter-Histogramm eines Gemischs von RGC2-Zellen, die das Gen für hFcγRl und GFP exprimieren, und RGC4-Zellen, die das Gen für hFcγRl und 4SC622 exprimieren, miteinander vermengt und gemeinsam inkubiert für 18 Stunden vor der Anfärbung mit PE-AG184.
5F zeigt ein flusszytometrisches Zweiparameter-Histogramm eines Gemischs von RGC2-Zellen, die das Gen für hFcγRl und GFP exprimieren, und RGC4-Zellen, die das Gen für hFcγRl und 4SC622 exprimieren, miteinander vermengt und gemeinsam inkubiert für 18 Stunden mit 1 mg/ml Ratten-IgG vor der Anfärbung mit PE-AG184.
6 zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm eines MSX-resistenten Pools von RGC1-Zellen, transfiziert mit pEE14.1-622. Die Zellen im oberen 3% Gate (R3), 7-11% Gate (R5) und 15-19% Gate (R7) wurden gesammelt, expandiert und ihre 4SC622-Produktivität durch Immunfärbung quantifiziert.
7 zeigt eine Zusammenfassung eines Vergleichs der spezifischen Produktivitäten von 4SC622-exprimierenden Zelllinien. CHO K1, vorübergehend transfiziert mit pEE14.1-622, von Hand geerntete stabile MSX-resistente Klone von CHO K1, transfiziert mit pEE14.1-622, und MSX-resistente 4SC622-Produktionsklone, isoliert nach Transfektion von RGC1-Zellen mit pEE14.1-622.
8A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC1-Zellen, angefärbt mit PE-AG184.
8B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC1-Zellen, inkubiert mit 1 μg/ml 4SC622 für 1 Stunde vor der Anfärbung mit PE-AG184.
8C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC1-Zellen, die mit 1 μg/ml 4SC622 für 1 Stunde inkubiert wurden, dann in Medium ohne 4SC622 für 18 Stunden vor der Anfärbung mit PE-AG184 inkubiert wurden.
9 zeigt, dass die Expression des Gens für hFcγRl zum Verlust von 4SC622 aus dem Kulturmedium führt. RGC1-Zellen, oder CHO K1-Parentalzellen, wurden in Medium inkubiert, das 2 μg/ml 4SC622 enthielt. Die Konzentration des im Medium verbleibenden 4SC622 wurde durch Immunanfärbung nach 24 Stunden und 72-stündiger Inkubation quantifiziert.
10 zeigt die Konstruktion von pTE158, das zur Ermöglichung der TetR-regulierten Expression von humanem FcγRl designed wird. Zwei Wiederholungen der tet-Operatorsequenz (TetO) befinden sich unmittelbar stromabwärts des CMV-Promotors in pTE158.
11A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von CHO K1-Zellen, angefärbt mit FITC-hFc.
11B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC10-Zellen, angefärbt mit FITC-hFc.
11C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC10-Zellen, induziert mit 1 μg/ml Doxycyclin für drei Tage vor der Anfärbung mit FITC-hFc.
12A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von CHO K1-Zellen, angefärbt mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
12B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von MSX-resistenten RGC10-Zellen, transfiziert mit pEE14.1-622 und inkubiert mit Ratten-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
12C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von MSX-resistenten RGC10-Zellen, transfiziert mit pEE14.1-622, das mit 1 μg/ml Doxycyclin für drei Tage induziert wurde, dann inkubiert mit Ratten-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
13 fasst die spezifischen Produktivitäten von MSX-resistenten stabilen Klonen von RGC10-Zellen, transfiziert mit pEE14.1-622, zusammen.
14 zeigt die Struktur von pTE255, das für die konstitutive Expression von humanem FcγRl stromaufwärts vom MoMuSV-LTR-Promotor designed ist.
15A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten Sp2/0-Zellen.
15B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von Cy5-hFc-gefärbten Sp2/0-Zellen.
15C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten Sp2/0-FcR-4-Zellen.
15D zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von Cy5-hFc-gefärbten Sp2/0-FcR-4-Zellen.
16 zeigt die Struktur von pTE209, designed für die konstitutive Expression von 4SC622 stromaufwärts vom CMV MIE-Promotor.
17A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten Hygromycin B-resistenten Sp2/0-FcR-4-Zellen, transfiziert mit pTE209.
17B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von Hygromycin B-resistenten Sp2/0-FcR-4-Zellen, transfiziert mit pTE209 und inkubiert mit Kaninchen-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
17C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten Zellen, expandiert aus den obersten 1% der fluoreszierendsten Zellen in 4B.
17D zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von Zellen, expandiert aus den obersten 1% der fluoreszierendsten Zellen in 4B, inkubiert mit Kaninchen-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
17E zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten Klon 5H11-Zellen.
17F zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von Klon 5H11-Zellen, inkubiert mit Kaninchen-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
18 zeigt schematische Diagramme der Domänen des Protein G und Protein G/hFcγRl-Fusionsproteins, codiert in pTE300.
19 zeigt eine Skizze der Konstruktion von pTE300, designed für die Expression eines chimären Proteins, enthaltend die RORI-Signalsequenz, die Fc-Bindungsdomäne von Protein G und die Transmembran- und intrazelluläre Domäne von hFcγRl stromaufwärts vom CMV MIE-Promotor.
20A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten RGC14-Zellen.
20B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von FITC-hFc-gefärbten RGC14-Zellen.
20C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm eines ungefärbten G418-resistenten RGC14-Zellpools, transfiziert mit pTE300.
20D zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm eines FITC-hFc-gefärbten G418-resistenten RGC14-Zellpools, transfiziert mit pTE300.
20E zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten RGC18-Zellen.
20F zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, inkubiert mit 10% fötalem Rinderserum für 2 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem anti-bovinem IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
21A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm eines ungefärbten Hygromycin B-resistenten Zellpools, abgeleitet von RGC18 nach Transfektion mit pTE209.
21B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm des Hygromycin B-resistenten Zellpools, abgeleitet von RGC18 nach Transfektion mit pTE209, inkubiert mit Kaninchen-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
22A zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten RGC18-Zellen.
22B zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, inkubiert mit 4SC622 (1 μg/ml) für 1 Stunde vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
22C zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, inkubiert mit 4SC622 (1 μg/ml) und Kaninchen-IgG (1 mg/ml) für 1 Stunde vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
22D zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, inkubiert mit 4SC622 (1 μg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
22E zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, inkubiert mit 4SC622 (1 μg/ml) für 2 Stunden, dann mit 4SC622 (1 μg/ml) und Kaninchen-IgG (1 mg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
22F zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von ungefärbten RGC18-Zellen, abgeleitet von RGC18-Zellen durch Transfektion mit pTE209.
22G zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, angefärbt mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
22H zeigt ein flusszytometrisches Einparameter-Histogramm von RGC18-Zellen, inkubiert mit Kaninchen-IgG (1 μg/ml) für 18 Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung beschreibt ein neuartiges und bisher unbekanntes Verfahren zum Identifizieren und Isolieren von Zellen, die sekretierte Proteine produzieren. Die Erfindung basiert auf der Produktion einer Zelllinie, die ein Molekül lokalisiert an der Zelloberfläche exprimiert, welches das POI bindet. Das an der Zelloberfläche exponierte POI kann dann durch Markieren mit verschiedenen Nachweismolekülen detektiert werden. Die Menge an POI, die, unter spezifischen Bedingungen, an der Zelloberfläche exponiert ist, stellt ein direktes Maß der Gesamtmenge an sekretiertem POI dar. POI-Produzenten können dann von Nicht-Produzenten isoliert werden, und die Produktionsmengen oder POI-Eigenschaften können unterschieden werden. Der Vorteil der Erfindung ist, dass sie das sekretierte POI direkt quantifiziert und nicht indirekt die mRNA misst.
Diese Erfindung betrifft die Konstruktion oder Verwendung von Zellen, die Zelloberflächen-Fangmoleküle exprimieren, welche an verschiedene sekretierte POIs in der selben Zelle binden, die das POI produziert. Komplexe aus POI und Zelloberflächen-Fangmolekülen bilden sich intrazellulär und werden dann sekretiert. Die Zellen, die das sekretierte POI produzieren, können dann identifiziert und isoliert werden. Diese Identifizierung und Isolierung kann auf Eigenschaften des POI, der Produktion des POI oder deren Fehlen, oder auf spezifizierten Produktionsmengen basieren. Das Zelloberflächen-Fangmolekül und/oder das POI können durch die Zelle in ihrem nativen Zustand produziert werden, oder es können die Zelloberflächen-Fangmoleküle und/oder das POI rekombinant produziert werden. Durch die Konstruktion oder Verwendung solch einer Zelle kann jegliches sekretierte Protein durch das Zelloberflächen-Fangmolekül eingefangen werden, vorausgesetzt, dass eine entsprechende Affinität zwischen beiden besteht. Wie weiter erläutert, kann jegliches Molekül so manipuliert werden, dass es als ein Zelloberflächen-Fangmolekül verwendet werden kann. Daher kann diese Erfindung zum Isolieren jeglicher Zelle genützt werden, die ein Protein sekretiert.
Nahezu jegliches Protein besitzt die Fähigkeit, als ein Zelloberflächen-Fangmolekül zu fungieren, wie durch die Erfindung beschrieben. Dazu erforderlich ist die Fähigkeit des gewünschten Proteins, an der Zellmembran verankert zu werden und zum extrazellulären Raum exponiert zu liegen. Weist die gewünschte Zelle eine Signalsequenz auf, so braucht lediglich ein Membrananker, einschließlich, doch nicht beschränkt auf einen Transmembrananker oder ein GPI-Verknüpfungssignal, dem Zelloberflächen-Fangmolekül so hinzugefügt zu werden, dass es in der Zellmembran, die zur Außenseite der Zelle exponiert liegt, verankert bleibt. Fehlt weiterhin dem gewünschten Protein eine Signalsequenz, so kann eine Signalsequenz dem Amino-Terminus des gewünschten Proteins hinzugefügt zu werden, so dass es zur Zelloberfläche transportiert wird. Eine Signalsequenz und ein Membrananker können für die Zelle nativ, rekombinant oder synthetisch sein.
Zellen sekretieren oftmals eine breite Vielfalt von Proteinen, und zwar endogen oder nach Einführung einer rekombinanten DNA. Jegliches sekretierte Protein kann identifiziert werden und die Zelle, die es produziert, kann gemäß dem Verfahren dieser Erfindung isoliert werden. Zu solchen sekretierten Proteinen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Liganden, lösliche Rezeptorkomponenten, Antikörper und Peptidhormone. Solche sekretierten Proteine können rekombinant sein oder auch nicht. Das heißt, dass die Sekretion einiger Proteine von Interesse aus der gewünschten Zelle möglicherweise nicht die Einführung zusätzlicher Nukleotidsequenzen erfordert. Zum Beispiel ist die Sekretion von Antikörpern aus B-Zellen oder Plasmazellen nicht die Folge der Einführung rekombinanter Nukleotidsequenzen in die B-Zelle oder Plasmazelle. Rekombinante sekretierte Proteine können mittels standardmäßiger molekularbiologischer Techniken produziert werden, wie sie dem geübten Fachmann wohl bekannt sind (siehe z.B. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Bd. 1, 2 und 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hsg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Diese sekretierten Proteine sind für viele kommerzielle und Forschungszwecke nützlich. Diese Erfindung umfasst die Produktion solcher sekretierter Proteine mittels der Methodologien der Erfindung. Der Nachweis der Zellen mit dem exponierten POI kann durch die Verwendung jeglichen Moleküls erreicht werden, das zur direkten oder indirekten Bindung des präsentierten POI fähig ist. Diese Nachweismoleküle können die Detektion und/oder Isolierung der das POI präsentierenden Zellen erleichtern.
Diese Erfindung ist anwendbar auf die Isolierung unter anderem von a) Liganden-produzierenden Zellen durch Verwendung des Liganden-spezifischen Rezeptors als dem Zelloberflächen-Fangmolekül, b) löslichen Rezeptor-produzierenden Zellen durch Verwendung eines Oberflächen-gebundenen Rezepor-spezifischen Liganden als dem Zelloberflächen-Fangmolekül, oder c) Antikörper-produzierenden Zellen durch Verwendung eines Antikörper-bindenden Proteins als dem Zelloberflächen-Fangmolekül.
Bei einer Anwendungsform ist die Erfindung nutzbar zur Isolierung von Liganden-produzierenden Zellen unter Verwendung des Liganden-spezifischen Rezeptors als dem Zelloberflächen-Fangmolekül. Spezifischer gesagt können Zellen verwendet oder konstruiert werden, die ein Zelloberflächen-Fangmolekül exprimieren, das zur Bindung eines Wachstumsfaktors oder eines Zytokins fähig ist. Zu diesem Zelloberflächen-Fangmolekül können zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Tie1, Tie2, VEGFRI (Flt1), VEGFRII (Flk1). Solche Rezeptoren können ein POI binden, z.B. ein Zytokin oder einen Wachstumsfaktor. Zu den Zytokinen und Wachstumsfaktoren können zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Interleukin-(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, Ziliärer Neurotrophischer Faktor (CNTF), Erythropoetin, Vaskulärer Endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Angiopoetin 1, Angiopoetin 2, TNF, Interferon-gamma, GM-CSF und TGFβ.
Bei einer anderen Anwendungsform ist die Erfindung nutzbar zur Isolierung von Antikörper-produzierenden Zellen durch Verwendung eines Antikörper-bindenden Proteins als dem Zelloberflächen-Fangmolekül. Bei einer Anwendungsform kann eine Antikörper-produzierende Zelle an eine immortalisierte Zelle fusioniert werden, die ein Zelloberflächen-Fangmolekül exprimiert, das das POI bindet, welches in diesem Fall ein Antiköper ist. Zu solchen Antikörper-produzierenden Zellen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, B-Zellen und Derivate davon, insbesondere Plasmazellen, Hybridome (z.B. NSO), Myelome (z.B. SP2/0), rekombinante Zellen (z.B. CHO-Zellen, die rekombinante Antikörper exprimieren) oder andere Zellen, die Fusionsproteine produzieren, bestehend aus Antikörper-Fragmenten, wie zum Beispiel dem Fc-Fragment von IgG. Das POI kann ein Antikörper sein, der durch solche Zellen produziert wird, zu denen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein: IgM, IgG, IgA, IgD und IgE, als auch verschiedene Subtypen von diesen. Zu Zelloberflächen-Fangmolekülen, die zur Bindung von Antikörpern verwendet werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fc-Rezeptoren, wie etwa Fc-gamma RI, Fc-gamma RII, Fc-gamma RIII, Anti-Immunglobulin-Antikörper, Protein A, Protein L, Protein G und Protein H, oder funktionelle Fragmente davon.
Die Erfindung, wenn für die Isolierung von Antikörper-produzierenden Zellen angewendet, könnte zum Identifizieren und Isolieren von Zellen genutzt werden, die Antikörper mit einer gewünschten Spezifität, Isotyp und Avidität exprimieren. Darüber hinaus würde der Nachweis mit einem Peptid oder einem Proteinfragment die Identifizierung und Isolierung von Antikörper-produzierenden Zellen erlauben, die Antikörper exprimieren, die für ein gewünschtes Epitop spezifisch sind.
Gemäß der Methodologie dieser Erfindung wird eine Zelle zunächst mit einem Vektor transfiziert, der eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, welches zur Bindung des sekretierten POI unter Bedingungen fähig ist, bei denen das Zelloberflächen-Fangmolekül exprimiert wird. Transfizierte Zellen, die geeignete Produzenten solcher Zelloberflächen-Fangmoleküle sind, werden dann nachgewiesen und isoliert, woraufhin diese Zellen kultiviert werden. Diese Zellen können das POI entweder natürlich produzieren, oder das POI kann rekombinant produziert werden. Produzieren die Zellen das POI natürlich, so sind sie für den Nachweis und die Isolierung bereit. Muss das POI rekombinant produziert werden, so werden die isolierten und kultivierten Zellen, die das spezifizierte Zelloberflächen-Fangmolekül exprimieren, dann mit einer zweiten Nukleotidsequenz transfiziert, die das sekretierte POI codiert, unter Bedingungen, bei denen das sekretierte POI exprimiert wird. Auf die Expression hin bindet das sekretierte POI an die Zelloberflä chen-Einfangmoleküle, woraufhin die Zellen, die gebundenes POI zeigen, nachgewiesen und isoliert werden.
Wird das POI durch die Zelle natürlich produziert, so wird die Zelle nicht mit der Nukleotidsequenz, die das POI codiert, transfiziert werden. Daher ist dieser Aspekt der Erfindung auf jegliche und alle Zellen anwendbar, die ein POI produzieren. Wird außerdem das Zelloberflächen-Fangmolekül durch die Zelle natürlich produziert, so braucht die Zelle nicht mit Nukleotidsequenzen, die das Zelloberflächen-Fangmolekül codieren, transfiziert zu werden. Daher ist dieser Aspekt der Erfindung auf jegliche und alle Zellen anwendbar, die ein Zelloberflächen-Fangmolekül produzieren.
Die Transfektion und Expression wird durch die Verwendung verschiedener Vektoren bewirkt, die verschiedene Expressionskassetten und Promotoren, entweder konstitutiv oder reguliert, umfassen und die außerdem Enhancer, Transkriptionsterminatoren, Spleißdonor und Akzeptorstellen und andere Nukleotidsequenzen enthalten können (Kaufman et al., (1991) Meth. Enzymology 185:487).
Diese Vektoren sind allgemein kommerziell verfügbar oder können mittels im Fachgebiet bekannter standardmäßiger Techniken ohne Weiteres präpariert werden, wobei sie für die Expression in einem Wirt entweder durch Beibehaltung als einem extrachromosomalen Element oder durch Integration in das Wirtsgenom sorgen. Für einen Säugerwirt ist eine breite Vielfalt von Vektoren, basierend auf viralen Replikationssystemen, bekannt, wie etwa Affenvirus, Rinderpapillomavirus, Adenovirus, Epstein-Barr-Virus, Retrovirus und Ähnlichem. Diese Vektoren können als Expressionsvektoren verwendet werden, wo transkriptionelle und translationale Initiations- und Terminationssignale vorhanden und ein oder mehrere Restriktionsstellen für den Einbau eines GOI verfügbar sind. Außerdem weisen die Vektoren normalerweise ein oder mehrere Marker auf, die die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann einem auxotrophen Wirt Prototrophie; Biozidresistenz, z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika wie G418 oder Schwermetallen wie Kupfer; oder Ähnliches verleihen. Sofern erwünscht, können Expressionsvektoren durch Zusammenfügen der verschiedenen Komponenten präpariert werden, wie etwa des Replikationssystems, der Marker und der transkriptionellen und transla tionalen regulatorischen Initiations- und Terminationssignalen in Verbindung mit dem GOI. Häufig wird ein Vektor ein prokaryontisches Replikationssystem enthalten, welches die Klonierung, Manipulation, Reinigung und Expansion der gewünschten DNA-Sequenz erlaubt.
Eine breite Vielfalt von transkriptionellen und translationalen regulatorischen Sequenzen kann in Abhängigkeit von der Natur des Wirts eingesetzt werden. Die transkriptionellen und translationalen regulatorischen Signale können von viralen Quellen abgeleitet sein, wie etwa dem Zytomegalovirus, Adenovirus, Rinderpapillomavirus, Affenvirus oder Ähnlichen, wo die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, das eine hohe Expressionshöhe zeigt. Alternativ können Promotoren von Säuger-Expressionsprodukten, wie z.B. Actin, Collagen und Myosin, verwendet werden. Transkriptionelle regulatorische Initiationssignale können ausgewählt werden, die eine Repression oder Aktivierung erlauben, sodass die Expression der fusionierten Gene moduliert werden kann. Regulatorische Signale können von natürlichen Quellen stammen oder können dadurch chimär sein, dass Sequenzen mit dem regulatorischen Signal aus verschiedenen Quellen stammen können. Darüber hinaus können die zur Präparierung der Vektoren verwendeten Nukleinsäuresequenzen aus einer Vielfalt von Quellen stammen. Zu diesen Quellen zählen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon. Die genomische DNA kann natürlich vorkommende Introns enthalten oder auch nicht. Die aus natürlichen Quellen erhaltene DNA, nämlich die genomische DNA oder cDNA, kann in vielfältiger Weise erhalten werden. Die für die gewünschte Sequenz codierenden Wirtszellen können isoliert werden, die genomisch DNA kann fragmentiert werden, bequemerweise mittels ein oder mehreren Restriktionsendonukleasen, und die resultierenden Fragmente können kloniert und mit einer Sonde auf das Vorhandensein der DNA-Sequenz gescreent werden, die für die Polypeptidsequenz von Interesse codiert. Ist das klonierte Fragment, welches die gewünschte DNA-Sequenz enthält, einmal identifiziert worden, so kann dieses Fragment zur Entfernung überflüssiger DNA, Modifikation eines oder beider Termini, Entfernung der gesamten oder eines Abschnitts der intervenierenden Sequenzen (Introns) oder Ähnliches weiter manipuliert werden.
Ist der Vektor einmal für die Expression präpariert worden, so kann er in einen geeigneten Wirt eingeführt werden. Verschiedene Techniken können zur Einführung von Nukleinsäuren in Wirtszellen angewendet werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Calciumphosphat-Copräzipitation, die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Polybren-vermittelte Transfektion, Lipid-vermittelte Transfektion, Lipofektion, DNA-Mikroinjektion und den Mikroprojektil-vermittelten Gentransfer (Keown et al., (1990) Meth. Enzymology 185:527.)
Dem geübten Fachmann wird bewusst sein, dass im Fachgebiet wohl bekannte Techniken existieren, die eine stabile Integration von GOI und anschließende Expression der zu identifizierenden und zur weiteren Verwendung zu isolierenden Proteine induzieren. Kaufman et al., ((1991) Meth. Enzymology 185:537) gibt einen Überblick über verschiedene Transformationsprotokolle. Diese Techniken können viele verschiedene Bedingungen ausnützen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf verschiedene im Fachgebiet bekannte Vektoren, zahlreiche Zelllinien und diverse Kulturbedingungen.
Eine breite Vielfalt von Wirtszellen kann transfiziert werden. Diese Zellen werden von eukaryotischem Ursprung sein. Die Zellen werden häufig immortalisierte eukaryotische Zellen sein, und insbesondere Säugerzellen, zum Beispiel Affennierenzellen (COS), Chinesischer Hamster-Ovarzellen (CHO), HeLa-Zellen, Hamsternierenzellen (BHK), humane embryonale Nierenzellen (HEK293), Leukozyten, Myelome und embryonale Stammzellen. Die Zellen können auch Nicht-Säugerzellen sein, inklusive Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf beispielsweise Escherichia coli, Bacillus subtilus, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Alle Zellen können im Kulturschalen-Medium unter geeigneten Bedingungen oder in einem synergistischen Wirt gezüchtet werden. Die erwünschtesten Zellen werden kultivierbare Säugerzellen sein.
Das an das Zelloberflächen-Fangmolekül gebundene sekretierte POI kann mittels verschiedener, im Fachgebiet bekannter Techniken detektiert und isoliert werden. Kultivierte Zellen, die das sekretierte POI zeigen, können dann kontaktiert werden mit (a) Molekül(en), das/die zur direkten oder indirekten Bindung des sekretierten POI fähig ist/sind, wobei das/die Detektionsmolekül(e) eine nachweisbare Markierung enthalten kann/können, wie zum Beispiel eine chromogene, fluorogene, farbige, fluoreszierende oder magnetische Markierung. Die an das Nachweismolekül gebundene Markierung kann nachgewiesen und die Zellen unter Anwendung verschiedener Methoden isoliert werden. Am bevorzugtesten wird die Markierung innerhalb einer Zellpopulation nachgewiesen und werden die Zellen unter Anwendung der Flusszytometrie isoliert. Alternativ kann das Nachweismolekül für die direkte Isolierung von Zellen, die das POI zeigen, verwendet werden. Dies kann durch Konjugation des Nachweismoleküls an eine Kulturplatte, paramagnetische Moleküle oder jeglichen anderen Partikel oder festen Träger erreicht werden. Außerdem kann das präsentierte POI direkt anhand einer Eigenschaft des Nachweismoleküls oder des POI nachgewiesen werden.
Bei einer Anwendungsform werden zwei Nachweismoleküle, die aneinander binden und unterschiedlich markiert sind, zum Nachweis eines präsentierten sekretierten POI, das diese Interaktion blockiert, verwendet. Zeigt eine Zelle ein sekretiertes POI, das an das erste Nachweismolekül bindet und die Interaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Nachweismolekül blockiert, so kann diese Zelle basierend auf dem Vorhandensein lediglich des ersten Nachweismoleküls auf ihrer Oberfläche isoliert werden. Zeigt dagegen eine Zelle ein sekretiertes POI, das an das erste Nachweismolekül bindet, doch die Interaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Nachweismolekül nicht blockiert, so kann jene Zelle basierend auf dem Vorhandensein beider Nachweismoleküle auf ihrer Oberfläche isoliert werden. Zum Beispiel können Antikörper-produzierende Zellen, die Antikörper exprimieren, die spezifisch die Bildung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes blockieren bzw. nicht blockieren, identifiziert werden. Sind die Nachweismoleküle ein Rezeptor und sein Ligand, die unterschiedlich markiert sind, so kann dann eine Antikörper-produzierende Zelle, die Antikörper exprimiert, die die Bildung des Rezeptor-Ligand-Komplexes blockieren, anhand des Vorhandenseins einer Markierung auf ihrer Oberfläche nachgewiesen werden, wohingegen eine Antikörper-produzierende Zelle, die Antikörper exprimiert, die nicht die Bildung des Rezeptor-Ligand-Komplexes blockieren, anhand des Vorhandenseins beider Markierungen an ihrer Oberfläche nachgewiesen werden kann.
Bezüglich der Isolierung von exprimierenden Zellen von nicht-exprimierenden Zellen oder weniger exprimierenden Zellen, besteht eine der Hauptschwierigkeiten, wenn das POI ein sekretiertes Protein ist, in der Diffusion des POI zwischen benachbarten Zellen. Daher ist es entscheidend, dass jegliches System, das zum Einfangen des sekretierten POI an der Zelloberfläche entworfen ist, die Diffusion des POI aus der exprimierenden Zelle zu einer benachbarten Zelle und ihre Haftung an jener Zelle verhindern muss. Lässt man die Diffusion erfolgen, so werden benachbarte Zellen mit dem sekretierten POI dekoriert, wobei eine Trennung der Zellen ausgehend vom Grad der Dekoriertheit mit POI darin versagen wird, hoch exprimierende Zellen von Zellen mit geringen Expressionshöhen zu unterscheiden, und darin versagen kann, exprimierende von nicht-exprimierenden Zellen effektiv zu isolieren.
Daher besteht ein Aspekt im Blockieren der Diffusion von sekretiertem POI zwischen benachbarten Zellen. Dies kann durch Hinzufügen eines blockierenden Moleküls erreicht werden, das entweder das Zelloberflächen-Fangmolekül oder das POI bindet und die Bindung des sekretierten POI an das Zelloberflächen-Fangmolekül verhindert. Bei diesem Aspekt binden die Nachweismoleküle nicht an das Blockiermolekül. Ist zum Beispiel der Zelloberflächen-Rezeptor der hFc-gamma RI und besitzt das sekretierte POI das humane IgG Fc-Fragment, so kann dann die Diffusion des sekretierten POI zwischen benachbarten Zellen durch Zugabe von exogenem Ratten-IgG zum Kulturmedium blockiert werden. Der Nachweis von Zellen, die sekretiertes POI zeigen, und nicht gebundenem Ratten-IgG, wird unter Verwendung von Antikörpern erreicht, die für humanes IgG Fc spezifisch sind und die Ratten-IgG nicht erkennen.
Alternativ wird die Bindung des sekretierten POI zwischen benachbarten Zellen durch eine Erhöhung der Viskosität des Mediums herabgesetzt.
Bei einem anderen Aspekt wird das sekretierte POI am Akkumulieren im Medium gehindert. Dies kann durch Regulieren der Expression des sekretierten POI und/oder des Zelloberflächen-Fangmoleküls erreicht werden, sodass eine kurze Expression des POI dazu führt, dass ausreichend POI an das Zelloberflächen-Fangmolekül bindet, doch ungenügende Mengen für eine Diffusion vorhanden sind.
Die Zellen können aus dem Medium, das akkumuliertes POI enthält, entfernt werden, das an die Zellen gebundene POI abgestreift und die POI-Expression für einen begrenzten Zeitraum fortgesetzt, sodass sich nicht sekretiertes POI im Medium akkumuliert. Die Proteine können mittels im Fachgebiet bekannter Methoden abgestreift werden, zum Beispiel durch Waschen der Zellen mit einem niedrigen pH-Puffer.
Gemäß dieser Erfindung exprimieren jene Zellen in einer Zellpopulation, die die meisten Nachweismoleküle binden, auch das meiste sekretierte POI. Je mehr POI eine einzelne Zelle tatsächlich sekretiert, umso mehr POI wird an der Zelloberfläche präsentiert. Diese Korrelation zwischen der Menge des Oberfllächen-präsentierten POI und der Expressionshöhe des POI in jener Zelle erlaubt die schnelle Identifizierung von Zellen mit einer gewünschten relativen Expressionshöhe aus einer Population von Zellen.
Bei einer Anwendungsform kann eine DNA-Bibliothek zum Exprimieren von sekretiertem Protein, das an der Zelloberfläche durch das Zelloberflächen-Fangmolekül präsentiert werden kann, verwendet werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Bibliothek auch aus den Codierungsregionen der Antikörper-variablen Domänen von aus immunisierten Tieren isolierten B-Zellen generiert werden. Die DNA-Bibliothek kann dann in einer Zelle exprimiert werden, die ein für Antikörper spezifisches Zelloberflächen-Fangmolekül exprimiert, sodass Klone der gewünschten Spezifität, Isotyp oder Avidität durch das Verfahren der Erfindung identifiziert und isoliert werden können.
Transgene nicht-humane Säuger können geschaffen werden, die ein bestimmtes Zelloberflächen-Fangmolekül in ein oder mehreren Zelltypen exprimieren. Die Zellen solcher transgener nicht-humaner Säuger können dann direkt auf die Produktion eines POI hin gescreent werden. Zum Beispiel mag die Exprimierung eines Zelloberflächen-Fangmoleküls erwünscht sein, das für Antikörper in Plasmazellen spezifisch ist. Entsprechend können Plasmazellen aus immunisierten Mäusen geerntet und jene Zellen, die für das gewünschte Antigen spezifische Antikörper produzieren, mittels des Verfahrens der Erfindung isoliert werden.
Bei einer weiteren Anwendungsform der Erfindung wird die Antikörper-Produktion durch die Verwendung einer CHO-Zelllinie gemessen, die den humanen Fc-gamma R1-Rezeptor (FcγRl) exprimiert, welcher an den jeweiligen Antikörper, der das POI darstellt, bindet.
Beispiel 1
Konstruktion von pTE084: pTE084 wurde durch Ligieren des 1.436 bp Xba I-Fragments aus pCAE100, das den humanen FcγRl (hFcγRl; GenBank Zugriffsnummer M21091) codiert, in die Xba I-Stelle von pRG821 konstruiert. Die Orientierung von hFcγRl in den gewünschten Plasmiden, die aus der Ligation resultierte, wurde durch Restriktionskartierung mit Not I, Pst I, Eco RI und Stu I untersucht. pTE084 wurde für die hochgradige Expression von hFcγRl, dem hoch affinen Zelloberflächen-Rezeptor für die Fc-Domäne des Human-IgG, designed. Es enthält zwei unabhängige Expressionskassetten. Eine Kassette ist ein hFcγRl-Gen, angetrieben durch den CMV-MIE-Promotor, und die zweite Kassette ist das Neomycinphosphotransferase II (npt)-Gen, welches G418-Resistenz verleiht, angetrieben durch den späten SV40-Promotor.
Konstruktion eines CHO K1-Derivats, das hFcγRl exprimiert:
CHO K1-Zellen (4 × 10⁶) wurden mit pTE084 unter Verwendung von Lipofectamin^TM (Life Technologies; Rockville, MD) entsprechend den Anregungen des Herstellers transfiziert. Die Zellen wurden in das Kulturmedium (10% fötales Rinderserum, 90% Ham's F-12, 2 mM L-Glutamin; alle Reagenzien waren von Life Technologies, Rockville, MD), das 500 μg/ml G418 (Life Technologies) enthielt, für 15 Tage eingebracht. Die Zellen, die die G418-Selektion überlebten, wurden trypsiniert, gepoolt und mit FITC-konjugiertem Human-IgG, Fc-Fragment (FITC-hFc ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) angefärbt. Kurz dargestellt wurden die Zellen, die auf 10 cm-Kulturplatten gezüchtet waren, einmal mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid (Life Technologies) gewaschen. Drei ml an 0,25% Trypsin (Life Technologies) wurden jeder Platte zugegeben. Die Platten wurden gewirbelt, bis sich die Zellen von der Platte ablösten. 10 ml Kulturmedium wurde jeder Platte mit den abgelösten Zellen sofort zugegeben. Die Zellen wurden dann mittels Zentrifugation bei 1.000 × g für 4 Minuten gesammelt. Nach der Entfernung des Überstands wurden die Zellen in 4 ml an 2 μg/ml FITC-hFc, verdünnt in Kulturmedium, resuspendiert. Die Zellen wurden dann auf einen Plattform-Schüttler platziert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur angefärbt. Zur Entfernung von ungebundenem FITC-hFc wurden die Zellen zweimal mit 20 ml PBS gewaschen. Der Grad der FITC-hFc-Markierung an den Zellen wurde mittels Flusszytometrie auf einem Moflo-Zellsortierer (Zytomation; Fort Collins, CO) gemessen. Das FITC-hFc färbte mock-transfizierte parentale CHO K1-Zellen nicht an (2A und 2B), doch ließen eine Fluoreszenzverteilung im G418-resistenten, pTE084-transfizierten Pool entstehen (2C). Die oberen 1 % der fluoreszierendsten Zellen aus dem ausgewählten Pool wurden in 96-Well-Platten bei 1 Zelle/Well mittels Flusszytometrie platziert. Neun Tage später wurden 88 Zellklone in den 96-Well-Platten in 24-Well-Platten expandiert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen in den einzelnen Wells einmal mit 1 ml PBS gewaschen, mit 0,5 ml an 2 μg/ml FITC-hFc für 1 Stunde angefärbt, zweimal mit 1 ml PBS gewaschen und auf die Zelloberflächenfärbung unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die dreiunddreißig fluoreszierendsten Klone wurden ausgewählt, expandiert, dann mittels Flusszytometrie gescreent. Die FITC-hFc-Färbung eines solchen Klons, RGC3, ist in 2D gezeigt.
Die Diffusion des sekretierten Proteins innerhalb der Zellen zwischen exprimierenden Zellen und nicht-exprimierenden Zellen wurde durch Zugabe von IgG blockiert:
Da alle Zellen in einer hFcγRI-klonalen Zelllinie ein Zelloberflächen-hFcγRl exprimieren, besitzen sie alle die Fähigkeit zur Bindung von IgG oder Fusionsproteinen, bestehend aus der Fc-Domäne von IgG. Da hFcγRl an IgG aus einer Vielzahl von Spezies bindet (van de Winkel und Anderson, 1991), wurde ein Panel von Tier-IgGs auf die Fähigkeit zum Blockieren der Bindung eines Proteins, das einen humanen IgG1 (hIgG1) Fc-tag (4SC622) enthielt, an hFcγRl-exprimierende Zellen getestet. 4SC622 ist ein chimäres Molekül, bestehend aus der IL-2Rγ-extrazellulären Domäne, fusioniert an die hIL-4Rγ-extrazelluläre Domäne, die dann an die hIG-1Fc-Domäne fusioniert wird. Bei diesem Experiment wurden Kulturen von RGC1, einer hFcγRl-exprimierenden Zelllinie, selektioniert aus CHO K1-Zellen, die stabil mit pTE084 transfiziert worden sind, mit 1 μg/ml 4SC622 für 18 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mg/ml IgG von einer unterschiedlichen Spezie in einem 37 °C Gewebekulturinkubator inkubiert. Die Zelloberflächenbindung von 4SC622 wurde mittels Flusszytometrie nach dem Anfärben der gewaschenen Zellen mit Phycoerythrin-konjugiertem Maus-IgG1-monoklonalem AG184 (PE-AG184), der für die hIL-2Rγ-Komponente von 4SC622 spezifisch ist (BD PharMingen; San Diego, CA), gemäß den für die Zellfärbung mit FITC-hFc skizzierten Verfahrensweisen bestimmt. 3 zeigt, dass hIgG die Bindung von 4SC622 an den hFcγR1, der an der Oberfläche von RGC1 exprimiert war, vollständig blockierte. Von Ratte, Kaninchen und Hund abgeleiteter IgG blockierte die Bindung ebenfalls wirksam, wohingegen von Rind und Schwein abgeleiteter IgG sie nicht blockierte. Die Fähigkeit von exogen zugegebenem Ratten-IgG, die Bindung eines exogen zugesetzten hIgG1 Fc-tagged Proteins (4SC622) an Zelloberflächen-hFcγRl zu blockieren (4), legt nahe, dass Ratten-IgG ebenso den Transfer zwischen Zellen blockieren kann, die ein hIgG1 Fc-tagged Protein in unterschiedlichen Höhen exprimieren. Um dies zu testen, wurden zwei Zelllinien, die durch die Anwesenheit oder Abwesenheit des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) unterschieden werden können, aus RGC1 generiert. Kurz gesagt wurden, um RGC1-Zellen mit EGFP zu markieren, 2 × 10⁶ RGC1-Zellen mit 0,5 μg PTE073, welches ein Hygromycin B-Phosphotransferase-Gen, angetrieben durch Phosphoglycerat-Kinase-Promotor, codiert, und 5 μg pRG816-EGFP, welches ein EGFP-Gen, angetrieben durch CMV-MIE-Promotor, codiert, cotransfiziert. Die transfizierten Zellen wurden mit 200 μg/ml Hygromycin B (Sigma; St. Louis, MO) für zwei Wochen selektioniert. Grün fluoreszierende Zellen wurden mittels Flusszytometrie isoliert. Ein EGFP- und hFcγRl-exprimierender Klon, RGC2, wurde in Zellmischungs-Experimenten verwendet. Die andere bei diesen Experimenten verwendete Zelllinie, RGC4, wurde durch stabile Transfektion von RGC1 mit Plasmid pEE14.1-622 generiert. pEE14.1-622 ist ein Plasmid, bei dem die Expression von 4SC622 durch den CMV-MIE-Promotor angetrieben wird und das ein Glutaminsynthetase-Minigen enthält, welches dem Analogon Methioninsulfoximin (MSX) Resistenz verleiht und die Selektion von stabilen Integrationsereignissen erlaubt. RGC4-Zellen exprimieren hFcγRl auf der Zelloberfläche und sekretieren das hIgG1 Fc-tagged Protein 4SC622. Eine Platte mit gemischten Zellen, die sich aus 50% RGC2 und 50% RGC4-Zellen zusammensetzten, wurde mit 1 mg/ml Ratten-IgG für 18 Stunden vor der Anfärbung mit PE-AG184 inkubiert und dann mittels Flusszytometrie untersucht. 5A zeigt die EGFP-Fluoreszenz der RGC2-Zellen, und 5B zeigt, dass RGC2-Zellen auch exogen zugesetztes 4SC622 (1 μg/ml) binden, wie durch einen Anstieg der PE-AG184-Fluoreszenz angezeigt. 5C zeigt, dass RGC4 im EGFP-Gate nicht fluoreszierte. Signifikanterweise verminderte exogen zugesetztes Ratten-IgG nicht den Prozentsatz an RGC4-Zellen, die positiv für Zelloberflächen-4SC622 färbten (5D), was nahe legte, dass die Bindung von 4SC622 an hFcγRl erfolgte, während sich die Proteine im Übergang zur Zelloberfläche befanden. Wurden RGC2- und RGC4-Zellen gemischt (5E), so akkumulierte das aus RGC4-Zellen sekretierte 4SC622-Protein im Medium und band den Großteil der RGC2-Zellen. Die Zugabe von 1 mg/ml Ratten-IgG senkte jedoch den Prozentsatz an RGC2-Zellen, die 4SC622 banden, signifikant (5F), was zeigte, dass Ratten-IgG den Transfer von sekretiertem hIgG1 Fc-tagged Protein von exprimierenden Zellen zu nicht-exprimierenden Zellen blockierte.
Beispiel 2
Die Zelloberflächenfluoreszenz korreliert mit der Expressionshöhe von 4SC622:
RGC1-Zellen (4 × 10⁶) wurden mit pEE14.1-622 transfiziert, und ein Pool von stabilen Transfektanten wurde nach Selektion für 2 Wochen in einem Medium erhalten, das sich aus 10% dialysiertem fötalem Rinderserum, 90% Glutamin-freiem Dulbecco's Modifiziertem Eagle Medium, 1 × GS-Supplement und 25 μM MSX zusammensetzte (alle Reagenzien waren von JRH Biosciences, Lenexa, KS). Ratten-IgG wurde dem Kulturmedium zu 1 mg/ml 18 Stunden vor der Immunfärbung zugesetzt. Die Zellen wurden trypsiniert, mit PBS gewaschen und mit 1,5 μg/ml eines polyklonalen FITC-konjugierten Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragments (Jackson ImmunoResearch Laboratories) für eine Stunde bei Raumtemperatur im Anschluss an die für die FITC-hFc-Färbung in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweisen angefärbt. Die Zellfärbung wurde dann mittels Flusszytometrie analysiert. Die Fluoreszenzverteilung legte nahe, dass der ausgewählte Pool Zellen mit einem breiten Bereich der 4SC622-Expressionshöhen enthielt (6). Zellen in den oberen 3% (R3-Klammer), 7-11% (R5-Klammer) und 15-19% (R7-Klammer) bezüglich ihrer Immunfluoreszenz wurden in drei unterschiedliche Pools sortiert und für 9 Tage expandiert. Die mittlere 4SC622-Produktion pro Zelle für die Pools wurde durch Messen der Zellzahlen und 4SC622-Mengen in den Medien nach 3 Tagen der Anzucht mittels eines Immunbasierten Pandex-Assays (Idexx; Westbrook, ME) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers bestimmt. Im Pandex-Assay wurden Fluoriconpolystyrol-Assaypartikel, beschichtet mit Ziege-Anti-Human-IgG, für die γ-Kette spezifischem Antikörper (Sigma) zum Fangen des 4SC622 aus dem Medium verwendet, und wurde ein FITC-konjugierter Ziege-Anti-Human-Igg, Fc-spezifischer Antikörper (Sigma) zum Nachweis des Kügelchen-gebundenen 4SC622 verwendet. Bekannte Mengen an gereinigtem 4SC622 wurden in den Assay für die Kalibrierung aufgenommen. Die Zellen in den oberen 3%, 7-11% und 15-19% des Pools wurden als 4SC622 zu 1,42, 0,36 und 0,22 pg/Zelle/Tag produzierend befunden. Somit lag eine Korrelation zwischen der Zelloberflächen-4SC622-Färbung und der spezifischen Proteinproduktion vor. Dieses Ergebnis legt nahe, dass einzelne Zellen, die 4SC622 in hohen Mengen exprimieren, durch Isolieren von Zellen erhalten werden können, die durch das polyklonale FITC-konjugierte Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment am stärksten gefärbt wurden.
Beispiel 3
Isolierung von Expressionsklonen in RGC1:
IL-4-Trap. Um die Wirksamkeit bei der Erzeugung klonaler Zelllinien mit einer hohen Produktion von sekretiertem Protein anhand unserer Methodologie direkt nachzuweisen, wurden klonale 4SC622-produzierende Zelllinien aus RGC1 erzeugt. Die RGC1-Zellen (4 × 10⁶) wurden mit pEE14.1-622 transfiziert und für zwei Wochen mit 25 μM MSX zum Erhalt eines Pools von stabilen Transfektanten selektioniert. MSX-resistente Zellen wurden gepoolt und mit 1 mg/ml Human-IgG für 18 Stunden vor der Färbung mit PE-AG184 inkubiert. Sechs Zellen aus dem oberen 5%-Gate, wie mittels der flusszytometrischen Analyse der Zelloberflächen-4SC622-Färbung bestimmt, wurden isoliert und expandiert. Die 4SC622-Produktion aus den sechs klonalen Linien wurde bestimmt und zur 4SC622-Produktion von Klonen verglichen, die aus von Hand ausgewählten und geernteten Kolonien erhalten wurden, gefolgt von einer Verdünnungsklonierung und Amplifikation. Ein von RGC1 abgeleiteter Klon, RGC4, produzierte 4SC622 zu 12 pg/Zelle/Tag (7). Diese Menge ist ähnlich der vom besten 4SC622-Produzenten, die durch Von-Hand-Ernte und Analyse von 2.700 Klonen isoliert wurde. Daher erweist sich im Vergleich zu von Hand geernteten Kolonien die in dieser Erfindung skizzierte Methodologie als weit effizienter beim Screening und Klonieren von hohen Produzenten.
VEGF-Trap. Plasmide pTE080 und pTE081 codieren die Gene für die VEGF-Traps hVEGF-R1R2 und hVEGF-R1R3. hVEGF-R1R2 ist ein chimäres Molekül, das aus der ersten Ig-Domäne von hVEGFR1, fusioniert an die zweite Ig-Domäne von hVEGFR2, das dann an die hIg1FC-Domäne fusioniert ist, besteht. HVEGF-R1R3 ist ein chimäres Molekül, das aus der ersten Ig-Domäne von hVEGFR1, fusioniert an die zweite Ig-Domäne von hVEGFR3, die dann an die hIg1FC-Domäne fusioniert ist, besteht. Bei diesen Plasmiden wird das Gen für die VEGF-Trap durch den CMV-MIE-Promotor angetrieben, und ein Glutaminsynthetase-Minigen, welches MSX-Resistenz verleiht, wird für die Selektion von stabilen Integrationsereignissen exprimiert. RGC1-Zellen wurden mit jedem dieser Plasmide transfiziert und in einem Medium, das 25 μM MSX enthielt, für 2 Wochen gezüchtet, um Zellen zu selektionieren, in die das Plasmid stabil integriert wurde. MSX-resistente Zellen wurden mit 0,1 μg/ml Ig2a und Maus-IgG3 für 18 Stunden vor der Färbung mit 1,5 μg/ml polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment inkubiert. Die Zellen wurden für 1 Stunde gefärbt, dann zweimal mit PBS vor der Flusszytometrie gewaschen. Einzelzellen wurden aus dem Pool der Zellen, deren Fluoreszenz unter den höchsten 1 % rangierte, in 96-Well-Gewebekulturplatten sortiert. Die Zellen in den einzelnen Wells wurden expandiert, und ihre Produktivitäten wurden mittels Pandex-Assays bestimmt. 7 zeigt, dass von RGC abgeleitete Klone, die sowohl hVEGFR1R2 als auch hVEGFR1R3 exprirnierten, höhere spezifische Produktivitäten zeigten und durch Screening von weniger Klonen im Vergleich zu den am höchsten exprimierenden, von Hand geernteten MSX-resistenten Kolonien isoliert wurden.
Beispiel 4
Zelloberflächen-gebundenes hIgG1 Fc-tagged Protein wird durch RGC1 internalisiert:
hFcγRl ist dafür bekannt, die Internalisierung seines Zelloberflächen-gebundenen Liganden zu induzieren. Um zu analysieren, ob RGC1-Zellen Zelloberflächen-gebundenes 4SC622 internalisieren konnten, wurde 1 μg/ml 4SC622 den RGC1-Zellen für 1 Stunde zugefügt, woraufhin die Zellen sofort für die 4SC622-Immunfärbung mit PE-AG184 und flusszytometrischer Analyse prozessiert wurden. 93% der Zellen färbten positiv für das Zelloberflächen-4SC622 (8B). Alternativ wurde 1 μg/ml 4SC622 den RGC1-Zellen für 1 Stunde zugegeben, woraufhin die Zellen gewaschen und in Kulturmedium ohne 4SC622 mit PE-AG184 für 18 Stunden inkubiert wurden. Die flusszytometrische Analyse im Anschluss an die Immunfärbung für 4SC622 zeigte, dass 9% der Zellen 4SC622 an der Zelloberfläche beibehielten (8C). Um den Verlust an Oberflächen-gebundenem 4SC622 weiter zu charakterisieren, wurde gereinigtes 4SC622-Protein dem Medium aus RGC1 und parentalen CHO K1-Zellen zugesetzt und daraufhin die Mengen an 4SC622 in den Medien im Zeitverlauf gemessen. 9 zeigt, dass 4SC622, zugegeben zu 2 μg/ml zu den Kulturmedien in einer 10 cm-Platte, signifikant geringer war in RGC1-konditioniertem Medium nach 3-tägiger Inkubation im Vergleich zur CHO K1-Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von 4SC622 im Kulturmedium durch das Vorhandensein von hFcγRl an der Zelloberfläche verringert wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Depletion von 4SC622 aus den Medien das Ergebnis der Internalisierung des hFcγRl-4SC622-Komplexes war. Diese Internalisierung von Rezeptor-Ligand-Komplexen kann die wirksame Entfernung allen 4SC622 aus nicht-exprimierenden Zellen in Gegenwart von blockierendem IgG während des 18-ständigen Blockierschritts erleichtern.
Beispiel 5
Konstruktion von CHO K1-Zelllinien mit induzierbarer hFcγRl-Expression:
Auf Flusszytometrie basierende autologe Sekretions-Trap-Methoden, die den hFcγRl nützen, erlauben eine schnelle Isolation hoch exprimierender Klone. Vermittelt jedoch hFcγRl den Turnover von Fc-tagged Proteinen, so wäre die realisierte Produktion des sekretierten Proteins durch gentechnisch hergestellte hFcγRl-exprimierende Zellen höher, wenn die hFcγRl-Expression während der Produktionsperiode gehemmt werden könnte. Zu diesem Zweck wurde eine CHO K1-Zelllinie, bei der die Expression von hFcγRl durch Tetracyclin, oder das Analogon Doxycyclin, induziert wird, konstruiert. Bei diesem System wurden zunächst CHO K1-Zellen konstruiert, um das Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) zu exprimieren, und wurde hFcγRl unter die Transkriptionskontrolle eines Promotoren gestellt, dessen Aktivität durch TetR reguliert wurde. Zwei Tandem-TetR-Operatoren (TetO) wurden unmittelbar stromabwärts des CMV-MIE-Promotors/Enhancers in pTE084 platziert, um pTE158 zu generieren (10). Die Transkription von hFcγRl aus dem CMV-MIE-Promotor in pTE158 wurde durch TetR in Abwesenheit von Tetracyclin oder einem anderen geeigneten Induktoren blockiert. In Gegenwart des Induktors war TetR-Protein zur Bindung von TetO unfähig und erfolgte die Transkription von hFcγRl.
CHO K1-Zellen wurden mit pcDNA6/TR transfiziert, einem Plasmid, das Blasticidinresistenz verleiht, bei dem die Expression von TetR vom CMV-MIE-Promotor entspringt (Invitrogen; Carlsbad, CA). Nach zweiwöchiger Selektion mit 2,5 μg/ml Blasticidin (Invitrogen) wurden die stabilen Transfektanten gepoolt. Dieser Pool wurde dann mit pTE158 transfiziert, einem Plasmid, das G418-Resistenz verleiht, bei dem die Expression von hFcγRl von einem CMV-MIE/TetO-Hybridpromotor abhängt. Die nacheinander mit pcDNA6/TR und pTE158 transfizierten Zellen wurden mit 400 μg/ml G418 und 2,5 μg/ml Blasticidin für 12 Tage selektioniert und dann gepoolt. Der Pool wurde für zwei Tage durch Zugabe von 1 μg/ml Doxycyclin induziert, dann mit FITC-hFc zum Identifizieren der Zellen gefärbt, die hFcγRl exprimieren. Die oberen 5% der Zellen, die hFcγRl exprimieren, wurden als ein Pool abgesammelt, für 6 Tage in Abwesenheit von Doxycyclin expandiert und dann nochmals mit FITC-hFc für die Anwesenheit von hFcγRl gefärbt. Zellen, die sich nicht für hFcγRl färbten, wurden gesammelt und in Kulturmedium, das 1 μg/ml Doxycyclin enthielt, für drei Tage expandiert. Der Pool wurde dann für die Anwesenheit von hFcγRl gefärbt und mittels Flusszytometrie isoliert. Zellen, die die höchsten Mengen an hFcγRl exprimierten (obere 1 %), wurden auf 96-Well-Platten zu einer Zelle pro Well sortiert. Diese Zellen enthielten vermutlich Zellen, die geringe nicht-induzierte Expressionshöhen an FcR1 und hohe induzierbare Mengen an FcR1 aufwiesen. Nach der Expansion wurde die Induktion von hFcγRl durch Doxycyclin in 20 Klonen mittels Immunfärbung mit FITC-hFc und Flusszytometrie bestätigt. Ein Klon wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt und als RGC10 bezeichnet. 11 zeigt, dass in Abwesenheit von Doxycyclin RGC10 keine nachweisbaren Mengen an hFcγRl exprimierte, wohingegen hohe Mengen an hFcγRl in Zellen beobachtet wurden, die mit 1 μg/ml Doxycyclin für drei Tage induziert wurden. Die mittlere Fluoreszenz der RGC10-Zellen nahm um das mehr als 1.000-fache nach der Induktion durch Doxycyclin zu.
Beispiel 6
Isolierung von 4SC622-produzierenden Zelllinien aus RGC10:
RGC10-Zellen wurden mit pEE14.1-622 transfiziert, und MSX-resistente Zellen wurden nach der Selektion mit 25 μM MSX für zwei Wochen gepoolt. Die Expression von hFcγRl wurde durch Zugabe von 1 μg/ml Doxycyclin zum Kulturmedium für drei Tage induziert. Ein mg/ml Ratten-IgG wurde dem Kulturmedium, das Doxycyclin enthielt, 18 Stunden vor der Färbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment und der Analyse mittels Flusszytometrie zugegeben. Zellen, die die höchsten Mengen an 4SC622 exprimierten (obere 1%), wurden in 96-Well-Platten bei 1 Zelle pro Well sortiert (12C). 12B zeigt, dass ohne Induktion der hFcγRl-Expression durch Doxycyclin die Färbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment darin versagt, Zelloberflächengebundenes 4SC622 nachzuweisen. Sechzig Klone wurden in Abwesenheit von Doxycyclin expandiert. 13 zeigt die spezifische Produktivität der 13 höchsten Produzenten, wie durch Pandex-Assay bestimmt. Die spezifische Produktivität von Klon 1C2 betrug 17,8 pg/Zelle/Tag, was signifikant besser ist als die 12 pb/Zelle/Tag, die für die beste 4SC622-Zelllinie beobachtet wurden, die zuvor unter Verwendung der unregulierten hFcγRl-Zelllinie RGC1 isoliert worden waren.
Beispiel 7
Sp2/0-Myelomzellen können zum Exprimieren eines Zelloberflächen-Fangproteins gentechnisch bearbeitet werden:
In diesem Beispiel wurde die Sp2/0-Ag14-Myelomzelllinie zum stabilen Exprimieren von hFcγRl gentechnisch bearbeitet, um zu zeigen, dass die autologe Sekretions-Trap-Methode auf andere Zelllinien als CHO anwendbar war. Das Gen für hFcγRl wurde in die Myelomzelle durch retrovirale Infektion eingeführt. Das Plasmid pLXRN (Clontech; Palo Alto, CA), ein retroviraler DNA-Vektor, worin ein Gen von Interesse stromaufwärts vom murinen Moloney-Sarkomvirus-Long-Terminal-Repeat-(MoMuSV LTR)-Promotor exprimiert werden kann, wurde zur Generierung von das hFcγRl-Gen codierendem Retrovirus verwendet. Das 1,363 bp Xho I-Fragment von pTE084, das das humane FcγRl-Gen codiert, wurde in die Xho 1-Stelle von pLXRN kloniert. Ein Plasmid, in welchem die hFcγRl cDNA-Expression von MoMuSV LTR abhing, wurde ausgewählt und als pTE255 bezeichnet (14).
Pantropes Retrovirus für die Expression von hFcγRl wurde im Wesentlichen gemäß den Richtlinien des Herstellers generiert. Die Verpackungszelllinie GP-293, eine HEK 293-basierte Zelllinie, die die viralen gag- und pol-Proteine stabil exprimiert (Clontech; Palo Alto, CA), wurde mit 10 μg jeweils von pVSV-G und pTE255 cotransfiziert. Das Plasmid pVSV-G erlaubt die Expression des viralen Hüllproteins VSV-G, das den infektiven Partikeln einen breiten Wirtsbereich verleiht.
Konstruktion von Sp2-hFcγRl-4:
Das pantrope hFcγRl-Retrovirus wurde zum Infizieren von 1 × 10⁷ Sp2/0-Ag14-Myelomzellen (American Type Culture Collection; Manassas, VA) bei einer Multipli zität von etwa 10 infektiösen Partikeln pro Zelle verwendet. Drei Tage nach der Infektion wurden die Zellen für 1 Stunde angefärbt, dann zweimal mit PBS vor der Analyse mittels Flusszytometrie gewaschen. Jene Zellen, die hFcγRl exprimierten, wie durch gebundenen FITC-hFc angegeben, wurden als ein Pool mittels Flusszytometrie gesammelt. Der Pool wurde für 13 Tage expandiert, dann nochmals mit FITC-hFc gefärbt, und die hFcγRl-exprimierenden Zellen wurden als ein Pool mittels Flusszytometrie gesammelt. Diese sortierten Zellen wurden in 10% fötalem Rinderserum und 90% Dulbecco's Modifiziertem Eagle Medium (D-MEM) mit 4,5 g/l Glucose und 4 mM Glutamin für 3 Wochen kultiviert, mit FITC-hFc gefärbt, und die Zellen mit einer mittleren Fluoreszenz in den oberen 1 % der Population wurden durch Einzelzell-Sortierung kloniert. Nach der Expansion wurden 24 Klone mittels Flusszytometrie auf die Expression von hFcγRl untersucht, wie oben beschrieben, und ein Klon, Sp2-hFcγRl-4, wurde für eine weitere Charakterisierung ausgewählt (15).
Isolierung von Sp2-hFcγRl-4-Zellen, die 4SC622-Protein exprimieren:
Sp2-hFcγRl-4-Zellen (1 × 10⁷) wurden mit pTE209 transfiziert (16), einem Plasmid, das die konstitutive Expression von 4SC622 vom CMV-MIE-Promotor erlaubt und Hygromycinresistenz verleiht. Die transfizierten Zellen wurden in Medium, das 10% FCS, 90% D-MEM und 400 μg/ml Hygromycin enthielt, für 14 Tage eingebracht. Hygromycin-resistente Zellen wurden mit 1 mg/ml Kaninchen-IgG für achtzehn Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment inkubiert. Die Zellen wurden für 1 Stunde angefärbt, dann zweimal mit PBS vor der Analyse mittels Flusszytometrie gewaschen. Die markierten Zellen wurden als ein Pool mittels Flusszytometrie gesammelt, dann für 5 Tage kultiviert und wie oben beschrieben sortiert. Die Zellen aus dem expandierten Pool, die das meiste polyklonale FITC-konjugierte Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment banden, d.h. die Population der oberen 1%, wurden dann durch Einzelzellsortierung kloniert (17). Die Produktion von 4SC622 von zehn Klonen wurde mittels ELISA analysiert, und alle 10 Klone wurden als 4SC622 exprimierend befunden; Klon 5H11 produzierte 4SC622 bei 0,5 pg pro Zelle pro Tag. Diese Daten zeigten, dass die 4SC622 sekretierenden Klone durch die autologe Sekretions-Trap-Methode aus ei nem heterogenen Pool von Zellen, die aus der stabilen Transfektion von Sp2-hFcγRl-4-Zellen mit pTE209 stammten, effizient isoliert wurden.
Um zu bestätigen, dass 4SC622 autolog an der Oberfläche von Myelomzellen präsentiert wurde, die sowohl 4SC622 als auch hFcγRl exprimieren, wurde Klon 5H11 mit 1 mg/ml Kaninchen-IgG für 18 Stunden inkubiert, dann mit FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment angefärbt und als Zelloberflächen-4SC622 präsentierend befunden. Sekretiertes Protein wurde unter Bedingungen präsentiert, bei denen ein Cross-Feeding (gegenseitiges Füttern) durch Kaninchen-IgG blockiert wurde, was die autologe Präsentation von 4SC622 demonstrierte. Diese Daten zeigen, dass die oben beschriebene autologe Sekretions-Trap-Methode nicht auf CHO-Zellen beschränkt war und auch auf Myelom- und andere Zelltypen ausgeweitet werden kann.
Beispiel 8
Ein chimäres Protein G-Protein kann als ein Zelloberflächen-Fangprotein fungieren:
Um die Anwendung der autologen Sekretions-Trap-Methode auf ein anderes Zelloberflächen-Fangprotein als hFcγRl zu zeigen, wurde eine Protein G-exprimierende Zelllinie konstruiert. Protein G aus dem Streptococcus-Stamm G148 bindet an alle Mensch- und Maus-IgG-Subklassen, und weist als solches einen Nutzen für die Isolierung von rekombinanten Zellen auf, die Antikörper oder IgG Fc-Fusionsproteine exprimieren. Um zu zeigen, dass die Protein G IgG Fc-Bindungsdomäne als ein Zelloberflächen-Fangprotein genützt werden könnte, das zur Bindung an alle Mensch- und Maus-IgG-Subklassen fähig ist, konstruierten wir eine CHO-Linie, die ein chimäres Protein exprimiert, das sich aus der Fc-Bindungsdomäne von Protein G, fusioniert an die hFcγRl-Ttransmembran und intrazelluläre Domäne, zusammensetzt (18). Die Fc-Bindungsdomäne des Protein G enthält drei homologe Wiederholungen von 55 Aminosäuren Länge (Guss et al., (1986) EMBO 5: 1567 und Sjobring et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:399), wobei jede Wiederholung zur Bindung eines IgG Fc fähig ist. Um die Expression dieses chimären Proteins in CHO-Zellen zu verbessern, konstruierten wir eine synthetische DNA, in der die Signalsequenz aus dem Maus-ROR1-Gen an die Fc-Bindungsdomäne, Aminosäuren 303 bis 497, des Protein G fusioniert war (Zugriffsnummer X06173). Diese synthetische DNA wurde durch eine Kombination von Oligonukleotid-Annealing, Gap-Filling und PCR-Amplifikation erzeugt. Die synthetische DNA wurde dann mittels PCR an DNA fusioniert, die die Transmembran und intrazelluläre Domänen, nämlich Aminosäuren 279 bis 374, von hFcγRl codiert (Zugriffsnummer M21091). Die resultierende DNA, die das chimäre Protein G/hFcγRl-Protein codiert, wurde in pTE158 stromabwärts des CMV-MIE-Promotors kloniert, wobei sie das Gen ersetzte, das hFcγRl codiert, um das Plasmid pTE300 zu ergeben (19).
Eine auf das Wachstum in serumfreiem Medium angepasste CHO K1-Zelllinie, RGC14, wurde mit pTE300 transfiziert, und nach drei Tagen wurden 400 μg/ml G418 dem Kulturmedium zugegeben, um für eine stabile Integration von pTE300 zu selektionieren. Zwei Wochen nach dem Start der Selektion wurden die Zellen mit FITC-hFc angefärbt, um jene Zellen zu identifizieren, die hFcγRl exprimierten. Diese Zellen wurden mittels Flusszytometrie analysiert, und die Zellen, die hFcγRl exprimierten, wurden als ein Pool gesammelt (20). Die Zellen wurden für 10 Tage expandiert, und die Population der Zellen, die hFcγRl exprimierten, wurde nochmals mittels Flusszytometrie isoliert. Die Zellen wurden wiederum expandiert, mit FITC-hFc angefärbt, und einzelne Zellen, die hohe Mengen des chimären Protein G/hFcγRl-Proteins exprimierten, wurden mittels Flusszytometrie isoliert. Einzelne Zellen, die für die FITC-hFc-Bindung positiv färbten, wurden in ein Medium sortiert, das sich aus 10% fötalem Rinderserum, 90% Ham's F12 und 400 μg/ml G418 zusammensetzte. Nach einer zweiwöchigen Inkubation wurden 48 Klone auf die Bindung an in Kulturmedium vorhandenem Rinder-IgG durch Anfärben mit FITC-konjugiertem Anti-Rinder-IgG F(ab')₂-Fragment untersucht (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Ein Klon, RGC18, der mit diesem Antikörper positiv färbte, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Isolierung von Expressionsklonen in RGC18:
RGC18-Zellen (6 × 10⁶) wurden mit pTE209 transfiziert und für die Integration des Plasmids durch Zucht in 400 μg/ml Hygromycin für 18 Tage selektioniert. Hygromycin-resistente Zellen wurden mit 1 mg/ml Kaninchen-IgG für achtzehn Stunden vor der Anfärbung mit polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment inkubiert. Die Zellen wurden für 1 Stunde angefärbt, dann zweimal mit PBS vor der Analyse mittels Flusszytometrie gewaschen (21). Die fluoreszierendsten Zellen (obere 5%) wurden durch Einzelzellsortierung isoliert und für 3 Wochen expandiert. Zehn Klone wurden auf die 4SC622-Sekretion untersucht. Alle getesteten Klone sekretierten 4SC622 in hoher Menge, und der beste Klon, RGC19, wies eine spezifische Produktivität von 6,4 pg/Zelle/Tag auf. Dieses Ergebnis zeigt, dass 4SC622-exprimierende Zellen wirksam aus einem heterogenen Pool von Zellen isoliert wurden, die aus der stabilen Transfektion von RGC18 mit pTE209 mittels der autologen Sekretions-Trap-Methode stammten. Weiterhin zeigen diese Daten eindeutig, dass ein Fragment von Protein G so konstruiert werden konnte, dass es eine Signalsequenz und eine Transmembran-Domäne enthält und seine Funktion die eines Zelloberflächen-Fangproteins ist.
Um zu bestätigen, dass 4SC622 an der Oberfläche von RGC19-Zellen, die sowohl chimäres Protein G/hFcγRl-Protein als auch 4SC622 exprimierten, autolog präsentiert wurde, wurde RGC19 mit 1 mg/ml Kaninchen-IgG für 18 Stunden inkubiert, dann mit FITC-konjugiertem Anti-Human-IgG (N+L) F(ab')₂-Fragment angefärbt und mittels Flusszytometrie analysiert. RGC19-Zellen wurden als das Zelloberflächen-4SC622 unter solchen Bedingungen aufweisend befunden, bei denen das Cross-Feeding durch Kaninchen-IgG blockiert war, was eine autologe Präsentation von 4SC622 nahelegt (22). Kaninchen-IgG blockiert die Bindung von exogenem 4SC622-Protein an RGC18-Zellen wirksam, doch blockierte nicht die Präsentation von 4SC622 an der Zelloberfläche von Zellen, die 4SC622 exprimieren. Diese Daten zeigten, dass die Eigenschaften des chimären Protein G/hFcγRl-Proteins ähnlich denen von hFcγRl als ein Zelloberflächen-Fangprotein waren und legten nahe, dass die autologe Sekretions-Trap-Methode weitere Proteine als Zelloberflächen-Fangproteine verwenden kann.
Beispiel 9
Isolierung von Antikörper-produzierenden Zellen aus RGC10:
Um den Nutzen der autologen Seketions-Trap-Methode für die Isolierung von CHO-Zelllinien, die rekombinante Antikörper exprimieren, zu zeigen, klonierten wir die DNA, die variable Leichtketten- und variable Schwerketten-Gene codiert, aus dem KD5-Hybridom. KD5 ist ein Hybridom, das einen für den humanen Tie-2-Rezeptor spezifischen monoklonalen Antikörper exprimiert.
Die Gensequenzen der Maus-IgG-Konstantregion wurden aus 500 ng MäusemilzpolyA+ RNA (Clontech, Palo Alto, CA) kloniert. Einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung des SuperScript Erststrang-Synthesesystems für RT-PCR, geprimed mit 50 ng willkürlicher Hexamere (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), synthetisiert. Die konstante Kappa-Leichtketten-DNA-Sequenz der Maus (Zugriffsnummer Z37499) wurde aus dieser cDNA mittels PCR unter Verwendung der Primer 5' mCLK1 (Z37499) (5'-CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC-3') und 3' mCLK1 (Z37499) (5'-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3') amplifiziert. Die Konstantregion der Maus-IgG2a-DNA-Sequenz (Zugriffsnummer AJ294738) wurde ebenfalls von dieser cDNA mittels PCR unter Verwendung der Primer 5' mCH2a (AJ294738) (5'-GCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCAC-3') und 3' mCH2a (AJ294738) (5'-TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAG-TCG-3') amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in pCR2.1-TOPO unter Verwendung des TOPO TA Klonierkits (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) kloniert, und die Sequenzen der Konstantregionen wurden verifiziert.
Die Gene der KD5-variablen Region wurden mittels RT-PCR von KD5 Hybridom-mRNA amplifiziert und in pCR2.1-TOPO unter Verwendung der Primergemische der variablen Region der schweren und der leichten Kette von Amersham-Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) kloniert. Das Gen der variablen Schwerkette wurde unter Verwendung der pCR2.1-TOPO-klonierten variablen Region als Matrize mit den Primern 5' BspMI/KD5VH N-term (5'-GAGAGTACCTGCGTCATGCAGATGTGAAACTGCAGGAGTCTGGCCCT-3') und 3' BspMI/KD5VH C-term (5'-GAGAGACCTGCGTCAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3') PCR-amplifiziert, mit BspMI verdaut und an das mit den Primern 5' BsaI/CH2a N-term (5'-GAGAGGGTCTCACAGCCAAAACAACAGCCCCATCG-3') und 3' BsaI/CH2a C-term (5'-GAGAGGGTCTCCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAA-3') amplifizierte BsaI-verdaute PCR-Fragment des konstanten IgG2a-Schwerketten-Gens ligiert. Dieses Fragment wurde dann in die BspMI- und NotI-Stellen von pRG882 ligiert. Das resultierende Plasmid, pTE317, war zum Exprimieren des rekombinanten KD5-Schwerketten-Gens, fusioniert an die mROR1-Signalsequenz, vom CMV-MIE-Promotor fähig. Das variable Leichtketten-Gen wurde unter Verwendung der pCR2.1-TOPO-klonierten variablen Region als Matrize mit den Primern 5' BsmBI/KD5VL N-term (5'-GAGAGCGTCTCATGCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3') und 3' BsmBI/KD5VL C-term (5'-GAGAGCGTCTCACAGCCCGTTTTATTTCCAG-CTTGGTCCC-3') PCR-amplifiziert, mit BsmBI verdaut und an das BsaI-verdaute PCR-Fragment des konstanten Kappa-Leichtketten-Gens, amplifiziert mit den Primern 5' BsaI/CLK N-term (5'-GAGAGGGTCTCAGCTGATGCTGCACCAACT-GTATCC-3') und 3' BsaI/CLK C-term (5'-GAGAGGGTCTCAGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTGAC-3'), ligiert. Dieses Fragment wurde dann in die BspMI- und NotI-Stellen von pRG882 ligiert. Das resultierende Plasmid, pTE316, war zum Exprimieren des rekombinanten KD5-Leichtketten-Gens, fusioniert an die mROR1-Signalsequenz, vom CMV-MIE-Promotor fähig.
Das 1450 bp EcoRI-NotI-Fragment von pTE317, das das KD5-Leichtketten-Gen codiert, wurde in die EcoRI- und NotI-Stellen von pRG980 kloniert, ein Vektor, der Hygromycinresistenz verleiht und die Expression rekombinanter Gene für den UbC-Promotor ermöglicht, um das Plasmid pTE322 zu erhalten. In ähnlicher Weise wurde das 750 bp EcoRI-NotI-Fragment von pTE316, das das KD5-Leichtketten-Gen codierte, in die EcoRI- und NotI-Stellen von pRG985 kloniert, ein Vektor, der Puromycinresistenz verleiht und die Expression von rekombinanten Genen für den UbC-Promotor erlaubt, um Plasmid pTE324 zu erhalten.
RGC10-Zellen (5 × 10⁶) wurden mit 3 μg pTE322 und 3 μg pTE324 transfiziert und für die Integration der Plasmide durch Anzucht in F12-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum mit 20 μg Puromycin und 400 μg/ml Hygromycin, für 14 Tage selektioniert. Die Expression von hFcγRl wurde durch Zugabe von 1 μg/ml Doxycyclin zum Kulturmedium für drei Tage induziert. Doppelt-resistente Zellen wurden mit 1 mg/ml Kaninchen-IgG für achtzehn Stunden vor der Anfärbung mit FITC-konjugiertem polyklonalen Ziege-Anti-Maus-IgG (Fcγ) F(ab')₂-Fragment (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) inkubiert. Die Zellen wurden für 1 Stunde angefärbt, dann zweimal mit PBS vor der Analyse mittels Flusszytometrie gewaschen. Die fluoreszierendsten Zellen (obere 5%) wurden als ein Pool isoliert und für 10 Tage expandiert, woraufhin das Protokoll wiederholt wurde, wobei aber das oberste 1% der fluoreszierendsten Zellen als ein Pool isoliert wurde. Dieser Pool wurde für 10 Tage expandiert, woraufhin die obersten 0,1% der fluoreszierendsten Zellen als Einzelzellen in 96-Well-Platten isoliert wurden. Die Klone wurden mittels ELISA für die Expression von Antikörper analysiert, und sieben Klone wurden aus den 53 analysierten Klonen ausgewählt. Die mittlere spezifische Produktivität dieser Klone betrug 35 pg/Zelle/Tag, und die besten Klone exprimierten den rekombinanten KD5-monoklonalen Antikörper zu 54 pg/Zelle/Tag.
Obschon die vorangegangene Erfindung anhand von Veranschaulichung und Beispiel in einiger Ausführlichkeit beschrieben worden ist, wird für Fachleute des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis ohne Weiteres erkennbar sein, dass bestimmte Veränderungen und Abwandlungen an den Lehren der Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Geiste oder Rahmen der beigefügten Ansprüche abzuweichen.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Nachweisen und Isolieren einer eukaryontischen Zelle, die ein sekretiertes Protein von Interesse (POI) produziert, umfassend: (a) Bereitstellen einer Zelle, umfassend eine Nukleinsäure, die ein sekretiertes POI codiert, und eine Nukleinsäure, die ein Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, das zur Bindung des POI fähig ist, wobei die Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, oder die Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, oder beide, in die Zelle transfiziert sind; (b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, bei denen das POI und das Zelloberflächen-Fangmolekül exprimiert werden, und ein POI-Fangmolekül-Komplex intrazellulär gebildet und an die Zelloberfläche gebracht wird; (c) Kontaktieren der Zelle mit einem Nachweismolekül, welches an das durch die Zelle gezeigte POI bindet; und (d) Nachweisen und Isolieren der Zelle auf der Grundlage des Nachweismoleküls.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Bereitstellens das Transfizieren der Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, und der Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangmolekül codiert, in die Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle in Schritt (d) durch Flusszytometrie nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nachweismolekül an einen festen Träger oder Partikel geknüpft ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, vorgenommen an einer Population von Zellen, wobei der Isolierschritt die Zellen, die an das Nachweismolekül binden, aus der Population isoliert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellen unterschiedliche Mengen des POI exprimieren, und der Isolierschritt Zellen auf der Grundlage der relativen Expressionshöhe des POI isoliert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem umfassend das Kontaktieren der Zellen mit einem Blockiermolekül, das das Zelloberflächen-Fangmolekül oder das POI bindet, um die Diffusion des sekretierten POI zwischen Zellen zu blockieren.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangprotein codiert, vor der Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, in die Zelle transfiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleinsäure, die das Zelloberflächen-Fangprotein codiert, und die Nukleinsäure, die das sekretierte POI codiert, gleichzeitig in die Zelle transfiziert werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das POI ein Antikörper, ein Fab, ein einzelkettiger Antikörper (ScFv) oder ein Fragment davon, oder ein Molekül ist, das an eine Antikörper-Konstantregion fusioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IgM, IgG, IgA, IgD und IgE und deren Subtypen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei, wenn das POI ein Ligand ist, das Zelloberflächen-Fangmolekül ein Rezeptor für den Ligand ist; wenn das POI ein Rezeptor ist, das Zelloberflächen-Fangmolekül der Ligand für jenen Rezeptor ist; wenn das POI ein Protein oder Peptid ist, das Zelloberflächen-Fangmolekül ein für das POI spezifischer Antikörper ist; oder wenn das POI ein Antikörper ist, das Zelloberflächen-Fangmolekül ein Antikörper-bindendes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Antikörper-bindende Protein ein Fc-Rezeptor, ein Anti-Immunglobulin-Antikörper, ein Anti-Immunglobulin-ScFv, Protein A, Protein G oder funktionelle Fragmente davon sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das sekretierte POI-Zelloberflächen-Fangmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tie1-Ang1, Tie2-Ang2, VEGFRI-VEGF und VEGFRII-VEGF.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Zelloberflächen-Fangmolekül einen Membrananker umfasst, der so an das Zelloberflächen-Fangmolekül angefügt ist, dass das Zelloberflächen-Fangmolekül in einer Membran der Zelle verankert und an der Zellaußenseite exponiert bleibt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Membrananker ein Transmembrananker oder eine GPI-Verknüpfung ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Membrananker der Zelle nativ, rekombinant oder synthetisch ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Säugerzelle eine CHO-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Säugerzelle eine Antikörperproduzierende Zelle ist, die an eine immortalisierte Zelle fusioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Antikörper-produzierende Zelle eine B-Zelle oder ein Derivat davon ist, welches eine Plasmazelle, ein Hybridom, ein Myelom oder eine rekombinante Zelle ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Nachweismolekül zwei Moleküle umfasst, die einander binden und unterschiedlich markiert sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren in einem hochviskösen Medium vorgenommen wird.