CN102680679B - 检测单细胞特异性抗体分泌的细胞微孔芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种可以在单细胞水平上高通量检测分泌特异性抗体细胞的细胞微孔芯片。这一芯片适合鉴定、分析B细胞(来源于人或其他脊椎动物)、杂交瘤细胞(鼠源或人源)或分泌抗体的工程细胞等在单细胞水平上特异性抗体的分泌情况，并找出特异性好、亲和力高、分泌量大的单个抗体分泌细胞，且制备方便，价格经济，操作简单。
Description
技术领域
本发明建立了一种可以在单细胞水平上高通量检测表达或分泌特异性标志分子的细胞的微孔芯片。这一芯片适合鉴定、分析B细胞(来源于人或其他脊椎动物)、杂交瘤细胞(鼠源或人源)或分泌抗体的工程细胞等在单细胞水平上特异性抗体的分泌情况，另外还可用于检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响等，制备方便，价格经济，操作简单。
背景技术
微阵列芯片(Microarray Chip)研究起始于20世纪80年代末，是指以高密度阵列为特征，将核酸探针、蛋白质探针等以极高的密度固定在经过微细加工的固相表面上，通过荧光以进行高通量的筛选研究[1]。根据所阵列探针种类的不同，微阵列芯片可分为基因芯片、蛋白质芯片以及细胞芯片等。基因芯片和蛋白质芯片目前已经被广泛应用于基因表达差异研究、遗传学研究、蛋白质组学研究等生命科学的研究中[2]。
细胞芯片技术是以活细胞作为研究对象的一种生物芯片技术，其既保持传统的细胞研究方法的优点如原位检测等，又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求[3]。细胞芯片技术可以高通量分析细胞的多种生理现象及分子机制，具有传统方法不可比拟的优势。目前的细胞芯片技术一般指运用物理学、化学原理在芯片上完成对特异性细胞的捕获、固定、培养等精确操作，并通过对不同信号的分析实现对细胞特定生理指标的检测和性质分析。细胞免疫芯片是细胞芯片的重要种类，其原理主要基于抗原或抗体的固相化、抗原抗体特异性反应及抗原或抗体的检测方法(如荧光标记、酶标记及放射标记等)，以实现对特定细胞标志分子的精确检测，细胞免疫芯片具有特异性好、通量高、操作方便等优点，已经被广泛应用于新药筛选、免疫诊断、肿瘤靶标抗原分析等研究领域[3]。
目前的细胞免疫芯片主要的设计思路为以玻片为基底，通过不同方法活化并标记上抗体或抗原，形成蛋白微阵列芯片，然后将细胞悬液和微阵列孵育并洗去非特异性结合的细胞，再通过不同的标记方法检测特异性结合在芯片上的细胞。其实质还是固相蛋白芯片的设计思路和原理，只不过将待测样品中的研究对象换为了细胞。这一设计无法实现细胞的精确控制，不能在单细胞水平上检测细胞某特定生理指标(如抗体分泌)的情况。此外，目前被广泛使用的另一种重要的细胞分析方法流式细胞技术(FACS)，虽然可以分析出某细胞群落中特定细胞所占的比例，但是也无法在单细胞水平上高通量的实现对某个细胞特定指标的原位观察和分析。
在抗体工程的相关研究中，在单细胞水平上，尤其是在活体细胞中检测其分泌特异性抗体的情况是十分需要的。对于一群细胞，如杂交瘤细胞、抗体工程细胞等，如何高通量地在其中寻找到分泌抗体亲和力最高、分泌量最大的细胞，对于后续的杂交瘤克隆筛选或者工程抗体高表达细胞株的构建等都具有极其重要的意义。另外，单细胞水平上特异性抗体的检测对于研究B细胞群落中特定抗体分泌细胞的具体情况，对于某些天然存在的极少量的有特殊价值的B细胞(如分泌针对某些独特表位抗体的B细胞)的筛选和获得等也是十分需要的。
目前，国际上已经有几种可以在单细胞水平上高通量分析细胞某特定生物学指标变化的细胞微孔芯片出现。如Biran等制作了通过光成像技术在单细胞水平上检测细胞某生理指标变化(如基因表达差异)的细胞微孔芯片[4]，Deutsch等也研发了类似的单细胞高通量检测芯片[5]。但是，检测细胞分泌抗体情况的细胞微孔芯片产品国际上目前研究的还比较少。日本富山大学科研人员研制的抗体检测微孔芯片，采用微机电系统加工制作，首先用热氧化技术在硅片表面生长出一层二氧化硅薄膜，将利用光刻技术制作的微孔模型覆盖于二氧化硅薄膜表面，利用氢氟酸溶剂处理制备微孔芯片，并在其表面加工出氟碳聚合物。其芯片孔径适合容纳单一B细胞，并且通量达到234000孔/片。该芯片通过检测抗原刺激后，细胞内Ca2+变化情况或者直接荧光标记待测抗原并与细胞表面受体结合从而确定针对某抗原抗体的分泌细胞[6，7]。通过显微操作技术可以获取目的细胞并进行PCR，获得特异性抗体基因。
发明内容
本发明首次使用光刻技术制备细胞微孔芯片模板，然后灌注聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，制成细胞培养阵列芯片，实现每个细胞单独处于一个阵列小室并进行培养。生物相容性材料PDMS作为细胞微孔芯片的制备材料，同硅片材料比较，其优点是生物相容性好，无毒，透气性佳，适合细胞生存，容易被锻造成任何形状，且制备方便，价格经济，操作简单。
与原有技术比较，Love等使用PDMS制成直径100μm细胞芯片，接种杂交瘤细胞系，使用蛋白芯片法进行检测杂交瘤细胞抗体特异性[8]。此方法存在以下缺陷：第一，微孔直径过大，不能实现每个微孔为单细胞的要求；第二，使用蛋白芯片法检测，必须使用蛋白芯片扫描仪，对仪器要求很高。Tokimitsu和Tajiri等使用硅片制成细胞微孔阵列，筛选特异性抗体分泌细胞[6，7]。此方法制备细胞微孔芯片成本高，制作过程复杂，并且每个硅片芯片只能使用一次。本发明使用PDMS制备的细胞微孔芯片，只需要制备一个模板，就能灌注出任意多的细胞芯片。并且微孔直径略大于单个细胞的尺寸，保证每个孔为单细胞；在微孔芯片中原位检测单个细胞抗体分泌，检测仪器只需要荧光显微镜即可。总体表明，本发明在芯片制作方面成本低，操作简单，模板能重复利用，能实现在单独的小室内对单个细胞原位进行抗体检测，检测方法简便易行。
另外，本发明还摸索了适合杂交瘤、B细胞、癌细胞等不同大小细胞的微孔孔径，增强了芯片的针对性，细胞铺于微孔中，其单细胞率可以达到80％。本发明采用荧光原位检测法检测细胞分泌抗体的特异性，首先在微孔中包被抗人(或其他物种)IgG抗体，用于捕获待测细胞分泌的抗体，封闭之后，加入细胞，分别用生物素标记的待测抗原和亲和素标记的荧光素和微孔杂交，在荧光显微镜下通过检测细胞表面或者微孔内部的荧光信号强度，从而确定该单个细胞抗体表达的情况(同时有非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定孔中是否有细胞)。该方法既可以检测细胞表面受体对特定抗原的结合情况，也可以检测细胞分泌出的抗体对目的抗原的结合情况，满足了对不同细胞的检测要求。此方法操作简便，特异性好，灵敏度高，可以区分抗体表达量，是一种十分有效的原位检测单细胞抗体分泌的方法。本发明在确定单个目的细胞后，还可以通过显微操作技术方便地取出目的细胞，进行后续操作和实验，实用性强。
另外，通过在免疫荧光检测方法中运用不同的抗特异性癌细胞标志分子或其他有重要生物学意义的标志分子的抗体，本方法还可用于检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响等。
因此，本发明第一方面提供一种细胞微孔芯片，所述芯片微孔的直径在30μm以下，深度在30μm以下。
在一具体实施例中，所述芯片微孔的直径在20μm以下，深度在20μm以下。
在一具体实施例中，所述微孔的直径为5～20μm，所述深度为5～20微米。
在一具体实施例中，所述芯片材料为生物相容性聚合物材料。
在一具体实施例中，所述生物相容性聚合物材料为聚二甲基硅氧烷。
本发明第二方面提供一种在细胞水平检测抗体表达的方法，所述方法包括：
(1)提供本发明所述的细胞微孔芯片；
(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上；
(3)用标记的抗体检测试剂与微孔杂交；和
(4)通过检测细胞表面或微孔内部的标记信号强度，确定微孔中细胞抗体表达的情况，实现抗体表达的检测。
在一具体实施例中，所述方法还包括：在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获抗体或抗原，用于捕获待测细胞表达的抗体。
在一具体实施例中，所述标记的抗体检测试剂为标记的细胞表达抗体的抗原或二抗和/或标记的荧光素。
在一具体实施例中，所述抗原或二抗使用生物素标记，所述荧光素使用亲和素标记。
在一具体实施例中，所述接种细胞为杂交瘤细胞或B细胞或分泌抗体的工程细胞。
在一具体实施例中，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
在一具体实施例中，本发明的在细胞水平检测抗体表达的方法包括：
(1)提供本发明所述的细胞微孔芯片；
(2)在芯片的微孔中包被捕获抗体，用于捕获待测细胞分泌的抗体；
(3)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有1个细胞；
(4)用标记的待测抗原和标记的荧光素与微孔杂交；和
(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号强度，确定该单个细胞抗体表达的情况，实现抗体表达的检测。
本发明第三方面提供一种检测细胞靶标的方法，所述方法包括：
(1)提供本发明所述的细胞微孔芯片；
(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上；
(3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交；和
(4)通过检测微孔中的标记信号，确定细胞靶标。
在一具体实施例中，所述方法还包括：在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获细胞或细胞靶标的试剂。
在一具体实施例中，所述的细胞靶标包括但不限于：细胞分泌的蛋白或小分子化合物，细胞表面蛋白等。
在一具体实施例中，所述的靶标检测试剂含有与靶标结合的物质，选自抗原、抗体、受体和配体。
在一具体实施例中，所述的标记为荧光标记。
在一具体实施例中，所述的细胞包括但不限于杂交瘤细胞、B细胞、分泌抗体的工程细胞、肿瘤细胞和胰岛细胞。
在一具体实施例中，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
本发明第四方面提供一种药物筛选方法，所述方法包括：
(1)提供本发明所述的细胞微孔芯片；
(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞；
(3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交，和
(4)通过检测微孔中的标记信号，确定该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物。
在一具体实施例中，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
在一具体实施例中，本发明的药物筛选方法包括：
(1)提供本发明所述的细胞微孔芯片；
(2)在芯片的微孔中包被特异性针对靶标的单克隆抗体；
(3)将待测细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有1个细胞，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞；
(4)用标记的抗靶标的抗体与微孔杂交，染色；和
(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号强度，确定该该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物。
本发明还包括本发明细胞微孔芯片在检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响中的应用。
附图说明
图1：细胞微孔芯片模板。
图2：细胞微孔芯片制作流程示意图。
图3：细胞芯片(a)细胞芯片模具；(b)细胞芯片；(c)细胞芯片显微照片。
图4：明场下细胞芯片中的细胞。
图5：细胞芯片中单细胞(a)杂交瘤细胞(b)小鼠脾脏细胞(每个绿点代表一个活细胞)。
图6：对照组杂交瘤细胞抗体检测(a)Calcein-AM细胞染色；(b)HA-Cy3染色；(c)Merge。
图7：阳性杂交瘤细胞S-95-7抗体检测(a)Calcein-AM细胞染色；(b)HA-Cy3染色；(c)Merge。
图8：对照组小鼠脾脏细胞抗体检测(a)Calcein-AM细胞染色；(b)HA-Cy3染色；(c)Merge。
图9：阳性HA DNA疫苗免疫小鼠脾脏细胞抗体检测(a)Calcein-AM细胞染色；(b)HA-Cy3染色；(c)Merge。
图10：微流控芯片小孔内的单个乳腺癌细胞。
图11：毛细管捕获微流控芯片上的单细胞。
具体实施方式
本发明的细胞微孔芯片可采用各种生物相容性聚合物材料制备。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是一种广泛应用于微流体等领域的聚合物材料，是一种生物相容性材料，无毒，透气性较好，适合细胞生存。因此，在优选的实施例中，使用聚二甲基硅氧烷材料制备本发明的细胞微孔芯片。本申请以PDMS为例进行说明，但应理解，本发明并不限于PDMS。
通常，可先采用本领域常规的光刻技术制备细胞微孔芯片模板，然后灌注生物相容性聚合物材料，制成细胞培养阵列芯片。
光刻技术是半导体工业化技术，包括旋涂(甩胶)光刻胶、前烘、紫外曝光、后烘和显影等步骤。在一优选实施例中，本发明微孔的深度由光刻时旋涂光刻胶的厚度来决定。
可按照需要制备该模板，从而使得该模板的微孔数量、微孔之间的间距、微孔的深度和直径等满足所需要求。
制备得到模板后，可对其表面进行疏水化处理，目的是使得PDMS固化以后容易从模具表面分离。可采用本领域周知的各种疏水化处理方式。在一优选实施例中，本发明采用喷涂疏水性的硅烷的方式进行疏水化处理。
可配制含有生物相容性聚合物材料的胶，例如，可取市售获得的Siliconeelastomer base和SYGARD 184 silicone elastomer curing agent(购于陶氏化学)以10∶1的质量比配制含PDMS的胶。应理解，可根据实际需要选用不同的市售产品来配制该含PDMS的胶，且该质量比也可根据实际需要而变化，例如可在7∶1～13∶1的范围之内。
然后将配制好的PDMS胶倾倒在模具上。在一优选实施例中，通过抽真空的方式赶走配制时溶于PDMS的空气。
之后，可在常温下使PDMS胶固化。或者也可将PDMS胶置于烘箱进行烘烤，待其完全固化后取出。烘烤的方式可以大大缩短固化时间。
将PDMS与模具分离，即可获得本发明的细胞微孔芯片。而模具可多次反复使用。图1、2显示了本发明制备细胞微孔芯片的流程。
为实现单细胞目的，本发明细胞微孔芯片的微孔的直径和深度必须略大于细胞直径。通常，杂交瘤细胞的直径为16-18μm，原代B细胞直径为6-8μm。因此，设计微孔芯片直径为30μm以下，深度为30μm以下。
在优选的实施例中，微孔芯片中微孔的直径为25μm以下，深度为25μm以下。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为30μm以下，深度为25μm以下。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为25μm以下，深度为30μm以下。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为6～30μm，深度为6～30μm。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为10～30μm，深度为10～30μm。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为10～25μm，深度为10～25μm。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为25μm以下。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔深度为25μm以下。
在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为20μm以下，例如5～20μm、10～20μm不等；微孔芯片的微孔深度也为20μm以下，例如5～20μm、10～20μm不等。
本发明细胞微孔芯片中微孔的直径和深度不需要相等，只要在上述限定的范围内即可。
对本发明细胞微孔芯片上微孔的数量无特殊限制，通常其数量可在10～10000的范围之内。孔与孔之间的距离也无特殊限制，通常为两倍微孔直径。
在获得本发明的细胞微孔芯片后，可对其实施灭菌处理和亲水化处理。
可采用常规的方法实施灭菌处理，例如通过高温高压实现灭菌。在一具体实施例中，将本发明的细胞微孔芯片粘附于玻片上，放入耐高温的盒子，在121℃放置30分钟，从而实现灭菌处理。
可采用本领域多种常规的方式进行亲水化处理，例如，亲水硅烷处理、氧等离子处理等。在一优选实施例中，本发明通过将芯片放置于氧等离子体处理1分钟的方式实现亲水化处理。
通过以上处理，细胞微孔芯片是无菌的，并且表面具有亲水性。由于灭菌和亲水化处理都具有时效性，处理完的芯片通常需要在12小时内使用。
在其它优选实施方式中，可使用各种连接分子包被本发明细胞微孔芯片的微孔表面。所述连接分子包括各种生物活性分子，包括但不限于抗原或其活性片段、抗体或其活性片段等。
在优选的实施例中，本发明提供一种在细胞水平检测抗体表达的方法，所述方法包括：
(1)提供本发明所述的细胞微孔芯片；
(2)在芯片的微孔中包被捕获抗体，用于捕获待测细胞分泌的抗体；
(3)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有1个细胞；
(4)用标记的待测抗原和标记的荧光素与微孔杂交；和
(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号强度，确定该单个细胞抗体表达的情况，实现抗体表达的检测。
所述捕获抗体是各种抗特异性癌细胞标志分子或其他有重要生物学意义的标志分子的抗体，所述方法用于检测癌细胞表面标志分子。这类表面标志分子包括但不限于：
| 癌细胞 | 表面标志 |
| 急性髓细胞白血病 | CD123，CD45等 |
| 乳腺癌 | 乙醛脱氢酶1等 |
| 结肠癌 | CD133，CD44，CD166，EpCAM等 |
| 胰腺癌 | CD44，CD24，ESA等 |
所述待测抗原可使用生物素标记，所述荧光素可使用亲和素标记，这些都在本领域技术人员所掌握的技术范围之内。
本发明还提供一种药物筛选方法，所述方法包括：
(1)提供本发明权利所述的细胞微孔芯片；
(2)在芯片的微孔中包被特异性针对靶标的单克隆抗体；
(3)将待测细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有1个细胞，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞；
(4)用标记的抗靶标的抗体与微孔杂交，染色；和
(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号强度，确定该该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物。
例如，可采用本发明的方法对胰岛细胞分泌胰岛素功能进行原位检测。本发明的方法还可用于其它细胞的相关功能的检测，以筛选出对所述细胞相关功能产生影响的药物。所述“靶标”指与待测的细胞功能相关的分子，例如，对胰岛细胞分泌胰岛素功能进行原位检测中的胰岛素。
在一具体实施例中，上述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
本发明还包括本发明细胞微孔芯片在检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响中的应用。
以下说明本发明即细胞微孔芯片具体制作过程以及原位检测单个细胞抗体特异性和分泌量的过程。必须指出，本方法不仅局限于制作直径20μm的微孔细胞芯片用于检测杂交瘤细胞系抗体分泌和来源于小鼠脾脏细胞的抗体特异性，同样适用于用此方法制作任何尺寸的细胞芯片，检测来源于小鼠、人以及基因工程改造的细胞。
以下说明还包括检测细胞特异性表面标志分子或分泌的重要的功能性标志分子的检测方法。
以上过程分为以下几部分：
(1)细胞微孔芯片模板设计与制作；
(2)PDMS细胞芯片制作和芯片表面处理；
(3)细胞接种密度实验；
(4)杂交瘤细胞系单细胞原位检测特异性抗体；
(5)小鼠脾脏细胞单细胞原位检测特异性抗体；
(6)肿瘤细胞原位检测肿瘤特异性表面标志分子；和
(7)胰岛细胞分泌胰岛素功能的原位检测。
材料
Silicone elastomer base∶SYGARD 184 silicone elastomer curing agent购于陶氏化学；
甲型H1N1流感病毒(2009/Cal)HA蛋白由本实验室昆虫表达系统表达；
甲型H1N1流感病毒(2009/Cal)HA蛋白DNA疫苗免疫BALB/c小鼠由本实验室提供；
生物素偶联试剂盒购于Pierce；
Cy3-streptavidin购于Sigma-Aldrich；
RPMI1640培养液和胎牛血清购于Invitrogen；
实施例1：细胞微孔芯片模板设计与制作
该芯片采用与微流控技术相同的半导体行业加工方式，具体过程如下：
(1)在掩膜版上制作直径相等的圆形阵列，阵列布局为120×120。用光刻的方式将掩模版上的图形转移到硅片或者玻璃等平整度满足要求的基底上，光刻技术是半导体工业化技术，包括旋涂(甩胶)光刻胶、前烘、紫外曝光、后烘和显影等步骤，其中本发明微孔的深度由光刻时旋涂光刻胶的厚度来决定；
(2)制作完成的硅片或者玻璃也称为模具，模具本身与需要的芯片为互补结构，即为圆柱阵列。
使用PDMS将光刻于硅片上的细胞芯片模板固定于10cm细胞培养皿中，图1中正方形方块就是芯片模板。
实施例2：PDMS细胞芯片制作和芯片表面处理
(1)PDMS(聚二甲基硅氧烷)是一种广泛应用于微流体等领域的聚合物材料；是一种生物相容性材料，无毒，透气性较好，适合细胞生存。
a)将制作好的模具表面进行疏水化处理，目的是使得PDMS固化以后容易从模具表面分离。处理的方式有很多，本发明采用喷涂疏水性的硅烷的方式；
b)取Silicone elastomer base∶SYGARD 184 silicone elastomer curingagent＝10∶1(质量比)于烧杯内，混合均匀；
c)将PDMS胶倾倒在模具上，用抽真空的方式赶走配制时溶于PDMS的空气；
d)放置于常温下待其固化，也可将PDMS胶置于烘箱进行烘烤，待其完全固化后取出，烘烤的方式可以大大缩短其固化时间；
e)将PDMS与模具分离即得到制作好的芯片，保存好模具待下次使用。制备流程如图1、图2所示。
(2)高温高压灭菌：将PDMS芯片粘附于玻片上，放入耐高温的盒子，121℃，30分钟；
(3)亲水化处理：亲水化处理的方法有多种(亲水硅烷处理、氧等离子处理等)，本发明采用将芯片放置于氧等离子体处理1分钟的方式。
通过以上处理，此时PDMS微孔芯片是无菌的，并且表面具有亲水性。由于灭菌和亲水化处理都具有时效性，处理完的芯片应在12小时内使用。
通过PDMS细胞芯片制作流程制作出微孔细胞芯片，微孔直径分别为100μm，50μm，30μm，20μm。通过接种细胞表明，为实现单细胞目的，微孔的直径和深度必须略大于细胞直径。过程观察，杂交瘤细胞的直径为16-18μm，原代B细胞直径为6-8μm。根据以上条件，设计微孔芯片直径为20μm，深度也为20μm。
实施例3：细胞接种密度实验
(1)杂交瘤细胞系：用RPMI1640培养液稀释杂交瘤细胞的浓度，使其浓度为1.0×106个/ml，2.0×106个/ml，4.0×106个/ml，6.0×106个/ml，8.0×106个/ml。接种表面经处理为亲水的PDMS芯片，每张芯片接种100μl，静置10min，然后使用RPMI1640培养液清洗芯片表面，显微镜下观察并进行统计。
(2)小鼠脾脏细胞：分离小鼠脾脏细胞，调整密度为1.0×106个/ml，2.0×106个/ml，4.0×106个/ml，6.0×106个/ml，8.0×106个/ml，接种表面经处理为亲水的PDMS芯片，每张芯片接种100μl，静置10min，然后使用RPMI1640培养液清洗芯片表面，显微镜下观察并进行统计。
实验表明，20μm细胞芯片微孔略大于杂交瘤细胞直径，因此每个微孔中只能容纳一个杂交瘤细胞。接种时不需要调整细胞密度，见图4和图5a。20μm孔径的微孔芯片尺寸远大于原代B细胞直径，通过调整细胞密度来实现。密度为1.0×106/ml，每张芯片接种100μl，静置10min，单细胞接种率能够达到70％-80％。因此在后续实验中，脾脏细胞接种密度为1.0×106/ml，每张芯片接种100μl，静置10min。实验结果见图5b。
实施例4：杂交瘤细胞单细胞原位检测抗体特异性
原理：用于检测单细胞抗体分泌，包被二抗，使用荧光素标记的抗原来检测；对于表达于细胞膜表面的抗体，使用荧光素标记的抗原可以直接来检测。但是对于这两类细胞难区分，因此统一采用包被二抗于微孔芯片内部，加入细胞，使用荧光素标记抗原来检测的方法。以下实验使用能产生识别甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白抗体的小鼠杂交瘤细胞系(S-95-7)和不能识别甲型流感病毒HA蛋白抗体的小鼠杂交瘤细胞系(ctrl)进行实验。具体实验过程如下：
(1)HA蛋白进行生物素(biotin)标记
原理：NHS能够与氨基酸的氨基形成稳定的连接，可以将biotin偶连到蛋白上；并且不影响蛋白活性，因此广泛用于蛋白、抗体标记。具体步骤：
a)蛋白溶液不含NH4Cl等铵盐；
b)根据蛋白量计算所需biotin偶联试剂量；
c)Biotin偶联试剂加到需偶联蛋白中；
d)冰上反应2h；
e)使用分子筛进行蛋白纯化(biotin 244Da，HA 70KDa)
(2)检测杂交瘤细胞抗体分泌的特异性
a)微孔细胞芯片制备和表面处理如第一部分所述；
b)包被二抗，羊抗鼠IgG，4℃，过夜；
c)封闭，2％牛血清白蛋白(BSA，溶剂为RPMI1640)，37℃1h；
d)接种细胞(杂交瘤S-95-7和对照组ctrl)，37℃，5％CO2培养24h；
e)Calcein-AM和HA-biotin进行染色，37℃，30min；
f)Cy3-streptavadin染色，37℃，30min；
g)荧光显微镜下观察。
Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。本发明中使用其来表示活细胞。根据生物素和链菌素亲和作用原理，HA蛋白标记生物素，就可以与链菌素标记的Cy3结合，将Cy3偶联上HA蛋白，实现抗原的原位检测。对照组的杂交瘤细胞分泌的抗体不能识别HA蛋白，因此不能检测到HA-Cy3信号，既红色荧光，图片重叠(merge)看见的是单色荧光，如图6。S-95-7杂交瘤细胞分泌的抗体能够识别HA蛋白，因此能够检测到HA-Cy3信号，既红色荧光。绿色荧光和红色荧光叠加产生黄色荧光，出现黄色荧光位置的单细胞说明能够产生识别HA蛋白的抗体，见图7。实验组和对照组说明，本发明的细胞芯片能够检测杂交瘤细胞抗体的特异性。
实施例5：小鼠脾脏细胞原位检测单细胞抗体特异性
取经甲型H1N1流感病毒HA蛋白DNA疫苗免疫过的小鼠脾脏细胞(该小鼠含有分泌针对HA蛋白抗体的B细胞)，将上述杂交瘤细胞试验中杂交瘤细胞替换为小鼠脾脏细胞，以未经过免疫的小鼠脾脏细胞为对照组进行试验。
具体实验过程如下：
a)微孔细胞芯片制备和表面处理如第一部分所述；
b)包被二抗，羊抗鼠IgG(20μg/ml)，4℃，过夜；
c)封闭，2％BSA，37℃，1h；
d)接种细胞(免疫小鼠脾脏细胞和对照组ctrl)，37℃，5％CO2培养24h；
e)Calcein-AM(2μM)和HA-biotin(2μg/ml)进行染色，37℃，30min；
f)Cy3-streptavadin(1μg/ml)染色，37℃，30min；
g)荧光显微镜下观察。
对照组小鼠脾脏细胞也不能检测出能识别HA蛋白的抗体分泌细胞，见图8。此细胞芯片能够检测到经HA蛋白DNA疫苗免疫过小鼠体内的识别HA蛋白的B细胞，见图9。
实施例6：微流控芯片单细胞捕获的显微操作
1)微流控芯片上的细胞接种：将处于对数生长期的乳腺癌细胞MDA231用含10％FBS的medium调整成密度为106个/ml的细胞悬液.把细胞悬液滴在微流控芯片上，涂成均匀的一层，水平放置30min.细胞在重力作用下单个进入微流控芯片的小孔内。
2)单细胞的捕获：将接种了细胞的微流控芯片用少量胶水固定在玻璃培养皿内，先用细胞外液轻轻地清洗掉微流控芯片上未进入小孔内残留的细胞.然后倒入浸没过微流控芯片的细胞外液。
3)在奥林巴斯正置显微镜40X水镜下，用三维显微操作仪进行精确的定位，可以用毛细管将微流控芯片小孔内的单个细胞吸住，同时转移到另外的小孔内或者取出到另外的培养瓶内。
4)图10和11显示了实验结果，其中图10显示微流控芯片小孔内的单个乳腺癌细胞，图11显示毛细管捕获微流控芯片上的单细胞。
实施例7：肿瘤细胞原位检测肿瘤特异性表面标志分子
取癌组织细胞，在细胞芯片上包被特异性针对癌细胞表面标志分子(见下表[9])的单克隆抗体，然后运用类似的免疫荧光的方法对其进行检测。
| 癌细胞 | 表面标志 |
| 急性髓细胞白血病 | CD123，CD45等 |
| 乳腺癌 | 乙醛脱氢酶1等 |
| 结肠癌 | CD133，CD44，CD166，EpCAM等 |
| 胰腺癌 | CD44，CD24，ESA等 |
具体实验过程如下：
a)微孔细胞芯片制备和表面处理如前述实施例所述；
b)封闭，2％BSA，37℃，1h；
c)接种细胞(癌细胞和对照组ctrl)，37℃，5％CO2培养24h；
d)Calcein-AM(2μM)和生物素标记的抗特异性癌症标志分子抗体(2μg/ml)进行染色，37℃，30min；
e)Cy3-streptavadin(1μg/ml)染色，37℃，30min；
f)荧光显微镜下观察。
实施例8：胰岛细胞分泌胰岛素功能的原位检测
取胰岛组织细胞，在细胞芯片上包被特异性针对胰岛素的单克隆抗体，然后运用夹心免疫荧光的方法对不同药物处理的胰岛组织细胞分泌胰岛素的功能进行检测。
具体实验过程如下：
g)微孔细胞芯片制备和表面处理如前述实施例所述；
h)包被二抗，抗鼠/人胰岛素抗体(20μg/ml)，4℃，过夜；
i)封闭，2％BSA，37℃，1h；
j)接种细胞(不同药物处理的胰岛细胞和对照组ctrl)，37℃，5％CO2培养24h；
k)Calcein-AM(2μM)和生物素标记的抗胰岛素多克隆抗体(2μg/ml)进行染色，37℃，30min；
l)Cy3-streptavadin(1μg/ml)染色，37℃，30min；
m)荧光显微镜下观察。
综上所述，本发明提供了一种能高通量地在单细胞水平上原位检测细胞分泌抗体的特异性和分泌量的细胞微孔芯片，并且能够实现单细胞捕获操作。除应用于抗体检测外，该芯片还可用于检测单细胞某特异性表面标志分子的表达或特定功能性分子的分泌。
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Claims (21)
1.一种在细胞水平检测抗体表达的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供细胞微孔芯片；
(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上；
(3)用标记的抗体检测试剂与微孔杂交；和
(4)通过检测细胞表面或微孔内部的标记信号强度，确定微孔中细胞抗体表达的情况，实现抗体表达的检测；
其中，所述细胞微孔芯片的微孔直径在30μm以下，深度在30μm以下。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获抗体或抗原，用于捕获待测细胞表达的抗体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述标记的抗体检测试剂为标记的细胞表达抗体的抗原或二抗和/或标记的荧光素。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗原或二抗使用生物素标记，所述荧光素使用亲和素标记。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种细胞为杂交瘤细胞或B细胞或分泌抗体的工程细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微孔的直径在20μm以下，深度在20μm以下。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞微孔芯片由聚二甲基硅氧烷制成。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
9.一种检测细胞靶标的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供细胞微孔芯片；
(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上；
(3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交；和
(4)通过检测微孔中的标记信号，确定细胞靶标；
其中，所述细胞微孔芯片的微孔直径在30μm以下，深度在30μm以下。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获细胞或细胞靶标的试剂。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细胞靶标选自细胞分泌的蛋白、小分子化合物和细胞表面蛋白。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的靶标检测试剂含有与靶标结合的物质，选自抗原、抗体、受体和配体。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的标记为荧光标记。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括但不限于杂交瘤细胞、B细胞、分泌抗体的工程细胞、肿瘤细胞和胰岛细胞。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微孔的直径在20μm以下，深度在20μm以下。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞微孔芯片由聚二甲基硅氧烷制成。
17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
18.一种药物筛选方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供细胞微孔芯片；
(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞；
(3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交，和
(4)通过检测微孔中的标记信号，确定该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物；
其中，所述细胞微孔芯片的微孔直径在30μm以下，深度在30μm以下。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微孔的直径在20μm以下，深度在20μm以下。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细胞微孔芯片由聚二甲基硅氧烷制成。
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