CN113008764B - 一种单细胞功能评估试剂盒及评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单细胞功能评估试剂盒及评估方法，该试剂盒包括微腔阵列芯片、印刷有功能捕获抗体的抗体条形码芯片、功能检测抗体、生物亲和修饰试剂、荧光偶联物、抗体缓冲液、抗体封闭液和细胞缓冲液。本发明所公开的试剂盒及评估方法可以实现快速、准确、高通量、和相对低廉地在无菌密闭微腔中，对单细胞进行原位功能性评估，检测成本低、结果精确，检测灵敏度高，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞分析领域，特别涉及一种单细胞功能评估试剂盒及评估方法。
背景技术
单细胞功能性分析是针对严重疾病开发新疗法的最有力方法之一。最近实施的高级单细胞分析技术：Drop-sequence等，提高了我们对细胞基因组学中基因组以及转录组中复杂异质性的了解。但是，对单个细胞分泌物的分析对于充分理解异质性，发现细胞中潜在的亚群和破译细胞相互作用和沟通的潜在机制至关重要。
在过去的几年中，细胞分离和蛋白质分泌分析的创新策略取得了进步，从而实现了单细胞分离。其中，液滴微流控技术已被证明是用于单细胞分选和分析的有前途的平台。该技术主要涉及将单个细胞封装在装有特异性荧光抗体或酶的液滴中，以捕获和检测分泌的细胞因子。尽管该技术具有单细胞分离的功能，但是，随后的细胞因子定量需要使用流式细胞仪，这会增加整个系统的复杂性，并且无法实现原位检测，特别是贴壁细胞的正确检测。并且该方法所使用的流式细胞仪虽然可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，但是流式细胞仪是一种零时间分辨率的仪器，它只能测量细胞的某一时间点诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能对细胞动态监测，也不能观察单细胞在培养过程中的形态、增殖状态，无法实时在单细胞水平对细胞进行后续分析处理，它的细节分辨率为零，并且价格昂贵，不适用于大众。
对于某些应用，流式细胞术仍然受到一定程度的限制。细胞必须处于悬浮状态，这意味着组织需要解离，从而导致细胞功能和细胞-细胞相互作用以及组织结构的丧失。具有相似标记表达的亚群难以区分，并且荧光染料之间的发射光谱重叠可能会导致噪声水平升高，从而使低强度样品不可用于检测。此外，流式细胞术的分选系统对细胞活力可能具有不可忽略的影响。
除此以外，流式细胞仪系统的最小样品量为几百微升至几毫升。较长的管路导致无法使用稀有样品，尤其是在需要分析整个样品时。最后，由于由非一次性组件组成的复杂系统，一般来说流式细胞术难以实现无菌操作。
聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)具有良好的光学性能、热稳定性和生物兼容性等优点，是微流控芯片的主要加工材料之一。近年来，以PDMS为材料加工的芯片，即PDMS微流控芯片已逐步成为低成本、便携式和环保型生化微量检测工具。基于PDMS材料的芯片，已在细胞操纵、细胞内基因表达检测、细胞培养、免疫荧光分析等方面成功应用。在细胞培养方面，传统方法是在PDMS表面修饰有机生物活性材料，例如BSA等，但通过研究发现，修饰有机生物活性材料存在稳定性差，易染菌等问题，石墨烯纳米材料是一种新型无机生物基底材料，具有促进细胞黏附和增殖的作用，由于是新兴纳米材料，很少用在细胞培养方面。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种单细胞功能评估试剂盒及评估方法，以达到可以实现快速、准确、高通量、和相对低廉地在无菌密闭微腔中，对单细胞进行原位功能性评估的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种单细胞功能评估试剂盒，包括微腔阵列芯片、印刷有功能捕获抗体的抗体条形码芯片、功能检测抗体、生物亲和修饰试剂、荧光偶联物、抗体缓冲液、抗体封闭液和细胞缓冲液。
上述方案中，所述微腔阵列芯片采用聚二甲基硅氧烷和固化剂经烘烤、脱模制备得到，微腔壁修饰石墨烯纳米材料。
上述方案中，所述抗体条形码芯片含有多个不同抗体通道，通道宽10-40μm，间距20-50μm。
上述方案中，所述生物亲和修饰试剂包括石墨烯纳米材料偶联剂、石墨烯纳米材料修饰剂、生物改性剂，用于微腔阵列芯片的生物亲和改性。
上述方案中，所述荧光偶联物的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500，浓度大于100ug/ml。
上述方案中，所述抗体缓冲液是用磷酸盐缓冲液PBS、BSA溶液和阳离子溶液按一定比例配制的质量浓度为0.5-2％的BSA溶液，检测抗体浓度大于100ug/ml。
上述方案中，所述抗体封闭液是用磷酸盐缓冲液PBSBSA溶液和去离子水按一定比例配制的质量浓度为3-6％的BSA溶液。
上述方案中，所述细胞缓冲液包括完全培养基和细胞洗涤剂，所述完全培养基以基本培养基、FBS和青链霉素双抗为原料按一定体积比为配置。
一种单细胞功能评估方法，包括如下过程：
(1)细胞提取：对于贴壁细胞，先使用胰蛋白酶消化细胞组织，加入FBS终止消化，震荡混匀，离心2-8min，使用细胞洗涤剂重悬至管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用细胞洗涤剂重悬沉淀；对于悬浮细胞，离心2-6min，使用细胞洗涤剂重悬至到管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用细胞洗涤剂重悬沉淀；
(2)微腔阵列芯片的生物亲和预处理：Plasma羟基化微腔阵列芯片后，使用石墨烯纳米材料偶联剂结合在羟基基团上，实现氨基化微腔阵列芯片；然后使用石墨烯纳米材料修饰剂对微腔阵列芯片进行石墨烯纳米材料修饰；然后用生物改性剂对微腔阵列芯片进行生物亲和改性；最后使用细胞缓冲液浸润，干燥处理；
(3)抗体条形码芯片的预处理：使用抗体封闭液浸泡10-20min，离心机甩干；
(4)单细胞装载：将细胞均匀印刷在预处理后的微腔阵列芯片的微腔中；
(5)分泌信号捕获：将抗体条形码芯片覆盖于微腔阵列芯片上形成密闭腔室，放入37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中，8-16h待细胞贴壁分泌蛋白；
(6)分泌信号检测：取下抗体条形码芯片，使用抗体缓冲液清洗，取一定量混合的功能检测抗体铺在抗体条形码芯片上，孵育10-30min；再使用抗体缓冲液冲洗，取一定量荧光偶联物铺在抗体条形码芯片上，避光孵育20-40min后，进行检测；
(7)计算：通过蛋白定量公式，将各种分泌信号荧光值换算成各种分泌蛋白量。
通过上述技术方案，本发明提供的单细胞功能评估试剂盒及评估方法具有如下有益效果：
1、通用性强：本发明提供的试剂盒具有极强的通用性，适用于卵巢癌、乳腺癌等多种癌症的单细胞水平的分泌蛋白信号检测分析。
2、操作简便：本发明提供的试剂盒除去细胞分泌时间，整个检测时间不超过2小时，具有操作简便、快速的优势。
3、检测费用低廉：本发明提供的试剂盒采用微流控芯片实现了分泌蛋白的绝对定量，相比目前检测单细胞分泌蛋白的传统方法，价格更低廉，使用成本低，市场应用前景广。
4、检测结果准确可靠：本发明提供的单细胞分析试剂盒所使用的微腔阵列芯片微腔表面修饰石墨烯纳米材料生物亲和改性，使细胞处于正常分泌状态，准确性更高。目前，大多数单细胞分析方法都对细胞有一定的损害，细胞存活率与细胞状态很差，而本发明试剂盒的检测结果是在封闭微腔中得到，更加稳定可靠。
5、检测灵敏度高：本发明提供的单细胞分析试剂盒的检测基于微流控芯片技术，微流控芯片可以将细胞分配到三千多个nL级的微反应室中进行独立分泌蛋白，通过将样本进行有效的稀释，即可以实现单细胞微弱分泌蛋白信号的检测，灵敏度极高，这是传统的单细胞分析方法所无法实现的。
6、检测特异性高：本发明提供的单细胞分析试剂盒能够对样本中的单细胞所分泌的蛋白进行绝对定量，封闭的微腔反应室使样本不会受到其他单细胞分泌信号的干扰。因此，具有很高的特异性。
7、检测通量高：本发明提供的单细胞分析试剂盒，其配套的微腔阵列芯片具有三千多个微腔室，配套的抗体条形码芯片具有二十条流道，可以制作铺设最多二十种抗体的条形码衬底，其组合至少可以实现上千个单细胞二十种分泌蛋白信号的同时检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例功能性评估的流程原理图；
图2为微腔阵列芯片和抗体条形码芯片示意图；
图3为试剂盒检测细胞活性图；
图4a为Mesothelin蛋白浓度为101-106pg/ml的试剂盒检测灵敏度图；
图4b为1ug/ml蛋白浓度的Mesothelin的特异性图；
图4c为HE4蛋白浓度为103-108pg/ml的试剂盒检测灵敏度图；
图4d为1ug/ml蛋白浓度的HE4的特异性图；
图4e为IL8蛋白浓度为100-103的试剂盒检测灵敏度图；
图4f为1ng/ml蛋白浓度的IL8的特异性图；
图4g为HSP70蛋白浓度为102-106的试剂盒检测灵敏度图；
图4h为1ug/ml蛋白浓度的HSP70的特异性图；
图5a为实施例的4种细胞功能性评估分群分类图；
图5b为实施例的各类细胞12种分泌蛋白归一化结果图。
图中，1、微腔阵列芯片；2、微腔；3、抗体条形码芯片；4、捕获抗体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种单细胞功能评估试剂盒，具体实施例如下：
(1)卵巢癌、乳腺癌、血癌、正常上皮细胞相关分泌信号的筛选
通过对这些癌细胞分泌物的分析和对比，最终确定使用IL6、IL8、OPN、Mesothelin、HSP70、HE4、CA125、CA199、CA724、CA153、CEA抗体组。
(2)试剂盒的组成及配制：
试剂盒包括微腔阵列芯片1、抗体条形码芯片3(印刷有IL6、IL8、OPN、Mesothelin、HSP70、HE4、CA125、CA199、CA724、CA153、CEA多种捕获抗体4)、对应的IL6、IL8、OPN、Mesothelin、HSP70、HE4、CA125、CA199、CA724、CA153、CEA功能检测抗体、生物亲和修饰试剂、荧光偶联物、抗体缓冲液、封闭液、细胞缓冲液。
微腔阵列芯片采用聚二甲基硅氧烷、固化剂按质量比为10:1，经80℃烘烤2h，脱模制备得到，含有3381个微反应室。根据卵巢癌，乳腺癌，血癌，正常上皮细胞的细胞贴壁生长尺寸，设计微腔尺寸长、宽、深分别为2100um、100um、30um。微腔壁通过生物亲和修饰试剂生物亲和处理，促进细胞贴壁与生长。
微腔阵列芯片的生物亲和预处理具体如下：Plasma羟基化微腔阵列芯片后，使用石墨烯纳米材料偶联剂结合在羟基基团上，实现氨基化微腔阵列芯片；然后使用石墨烯纳米材料修饰剂对微腔阵列芯片进行石墨烯纳米材料修饰；然后用生物改性剂对微腔阵列芯片进行生物亲和改性；最后使用细胞缓冲液浸润，干燥处理。
抗体条形码芯片1-12通道印刷有分布IL6、IL8、OPN、Mesothelin、HSP70、HE4、CA125、CA199、CA724、CA153、CEA，通道宽20um，间距20um。荧光偶联物的选用APC-荧光偶联物，荧光偶联物的工作浓度稀释倍数为1:200，浓度为200ug/ml。
抗体缓冲液是用磷酸盐缓冲液PBS、BSA溶液和阳离子溶液配制的质量浓度为1％的BSA溶液。
抗体封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS、BSA溶液和去离子水配制的质量浓度为3％的BSA溶液。
细胞缓冲液包括完全培养基和细胞洗涤剂，所述完全培养基以基本培养基、胎牛血清FBS和青链霉素双抗为原料按体积比为10:1:0.1配置。细胞缓冲液中的基本培养基选用DMEM高糖培养基。
本实施例的试剂盒组成如下：
本发明的一种单细胞功能评估方法，如图1所示，包括如下过程：
(1)细胞提取：对于贴壁细胞，先使用胰蛋白酶消化细胞组织，加入FBS终止消化，震荡混匀，离心3min，使用细胞洗涤剂重悬2次，管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用细胞洗涤剂重悬沉淀；对于悬浮细胞，离心3min，使用细胞洗涤剂重悬2次，管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用细胞洗涤剂重悬沉淀；
(2)微腔阵列芯片的生物亲和预处理：Plasma羟基化微腔阵列芯片后，使用石墨烯纳米材料偶联剂结合在羟基基团上，实现氨基化微腔阵列芯片；然后使用石墨烯纳米材料修饰剂对微腔阵列芯片进行石墨烯纳米材料修饰；然后用生物改性剂对微腔阵列芯片进行生物亲和改性；最后使用细胞缓冲液浸润，干燥处理；
(3)抗体条形码芯片的预处理：使用抗体封闭液浸泡10min，离心机甩干；
(4)单细胞装载：将细胞均匀印刷在预处理后的微腔阵列芯片的微腔中；
(5)分泌信号捕获：将抗体条形码芯片覆盖于微腔阵列芯片上形成密闭腔室，放入37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中，8-16h待细胞贴壁分泌蛋白；
(6)分泌信号检测：取下抗体条形码芯片，使用抗体缓冲液清洗2次，取200ul混合的功能检测抗体铺在抗体条形码芯片上，孵育20min；再使用抗体缓冲液冲洗2次，取200ul荧光偶联物铺在抗体条形码芯片上，避光孵育30min后，放入荧光扫描仪中扫描；
(7)计算：通过蛋白定量公式，将各种分泌信号荧光值换算成各种分泌蛋白量。
结果分析：
1)试剂盒灵敏度评价
对分泌信号的定量实验中，将蛋白浓度从100ug/ml进行10倍梯度稀释，得到100ug/ml(101倍稀释)、10ug/ml(102倍稀释)、1ug/ml(103倍稀释)、100ng/ml(104倍稀释)、10ng/ml(105倍稀释)、1ng/ml(106倍稀释)、100pg/ml(107倍稀释)、10pg/ml(108倍稀释)、1pg/ml(109倍稀释、0.1pg/ml(1010倍稀释)的10个不同浓度蛋白样品，检测结果如图4a，图4c，图4e，图4g所示，呈现良好的线性关系，相关系数R2大于0.98，最终的检测精度可以达到0.1pg/ml。
使用HE4检测抗体检测101-106pg/ml浓度的HE4蛋白，最低高于背景蛋白浓度荧光下限为10pg/ml。
2)试剂盒特异性评价
通过对抗体组的特异性分析，可以看出该试剂盒表现出良好的特异性，如图4b，图4d，图4f，图4h所示，使用HE4、Mesothelin、OPN、IL8、HSP70五种抗体分泌检测各自蛋白，与control背景对照，可以看出该试剂盒表现出良好的特异性。
3)试剂盒检测可信度评价
如图3所示，采用传统-BSA、传统-PLL、石墨烯、石墨烯纳米材料分别修饰微腔2，然后对细胞在微腔中的的增殖速度进行测定，采用石墨烯纳米材料修饰的微腔中细胞的存活率达100％，细胞的增殖速率曲线与细胞在培养基中正常增殖曲线一致。
4)试剂盒检测通量评价
该试剂盒中所设计的生物亲和微腔阵列芯片单细胞通量达到3381，可以快速得到实现上千个单细胞的生长分泌结果。
5)单细胞功能性评估结果
通过对细胞功能性评估，细胞分泌因子的分析，通过软件根据12种分泌蛋白的差异进行细胞分群分类分析，结果如图5a和图5b所示。
对细胞功能性评估，细胞根据12种细胞分泌因子差异聚类分群被分为4类，并对卵巢癌、乳腺癌、血癌，正常上皮细胞的12种细胞分泌因子量的差异进行分析。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种单细胞功能评估方法，采用一种单细胞功能评估试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括微腔阵列芯片、印刷有功能捕获抗体的抗体条形码芯片、功能检测抗体、生物亲和修饰试剂、荧光偶联物、抗体缓冲液、抗体封闭液和细胞缓冲液；
评估方法包括如下过程：
(1)细胞提取：对于贴壁细胞，先使用胰蛋白酶消化细胞组织，加入FBS终止消化，震荡混匀，离心2-8min，使用细胞洗涤剂重悬至管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用细胞洗涤剂重悬沉淀；对于悬浮细胞，离心2-6min，使用细胞洗涤剂重悬至到管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用细胞洗涤剂重悬沉淀；
(2)微腔阵列芯片的生物亲和预处理：Plasma羟基化微腔阵列芯片后，使用石墨烯纳米材料偶联剂结合在羟基基团上，实现氨基化微腔阵列芯片；然后使用石墨烯纳米材料修饰剂对微腔阵列芯片进行石墨烯纳米材料修饰；然后用生物改性剂对微腔阵列芯片进行生物亲和改性；最后使用细胞缓冲液浸润，干燥处理；
(3)抗体条形码芯片的预处理：使用抗体封闭液浸泡10-20min，离心机甩干；
(4)单细胞装载：将细胞均匀印刷在预处理后的微腔阵列芯片的微腔中；
(5)分泌信号捕获：将抗体条形码芯片覆盖于微腔阵列芯片上形成密闭腔室，放入37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中，8-16h待细胞贴壁分泌蛋白；
(6)分泌信号检测：取下抗体条形码芯片，使用抗体缓冲液清洗，取一定量混合的功能检测抗体铺在抗体条形码芯片上，孵育10-30min；再使用抗体缓冲液冲洗，取一定量荧光偶联物铺在抗体条形码芯片上，避光孵育20-40min后，进行检测；
(7)计算：通过蛋白定量公式，将各种分泌信号荧光值换算成各种分泌蛋白量。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述微腔阵列芯片采用聚二甲基硅氧烷和固化剂经烘烤、脱模制备得到，微腔壁修饰石墨烯纳米材料。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述抗体条形码芯片含有多个不同抗体通道，通道宽10-40μm，间距20-50μm。
4.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述生物亲和修饰试剂包括石墨烯纳米材料偶联剂、石墨烯纳米材料修饰剂、生物改性剂，用于微腔阵列芯片的生物亲和改性。
5.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述荧光偶联物的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500，浓度大于100μ g/ml。
6.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述抗体缓冲液是用磷酸盐缓冲液PBS、BSA溶液和阳离子溶液按一定比例配制的质量浓度为0.5-2％的BSA溶液，检测抗体浓度大于100μ g/ml。
7.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述抗体封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS、BSA溶液和去离子水按一定比例配制的质量浓度为3-6％的BSA溶液。
8.根据权利要求1所述的一种单细胞功能评估方法，其特征在于，所述细胞缓冲液包括完全培养基和细胞洗涤剂，所述完全培养基以基本培养基、FBS和青链霉素双抗为原料按一定体积比配置。
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