CN109863398A

CN109863398A - 用于检测和/或表征肿瘤细胞的方法及相关装置

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Publication number: CN109863398A
Application number: CN201780036311.5A
Authority: CN
Inventors: 卡特琳娜·米歇尔·马里欧·阿利克斯-帕纳碧烈斯; 安德鲁·大卫·格里菲思; 拉斐尔·克莱门特·李-明·杜诺; 克莱门特·尼扎克; 菲利普·池-森那·那格; 让-玛丽·皮埃尔·博德里; 埃洛迪·米歇尔·克莉丝汀·布里恩特-利兹勒; 克劳斯·埃耶; 杰罗姆·比贝特
Original assignee: Languedoc - Luxi Yong Axlr Technology Transfer Acceleration Co; Paris Higher Physical And Chemical Industry Zone; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Current assignee: Languedoc - Luxi Yong Axlr Technology Transfer Acceleration Co; Paris Higher Physical And Chemical Industry Zone; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2037-04-18
Also published as: FR3050212A1; CA3020964C; WO2017178662A1; US20190170741A1; CA3020964A1; CN109863398B; JP6982057B2; JP2019514027A; AU2017248682B2; FR3050212B1; EP3443347A1; US11525826B2; AU2017248682A1

Abstract

本发明涉及肿瘤学中的生物诊断领域。本发明涉及通过检测肿瘤细胞分泌蛋白质组的一种或更多种成分(特别是一种或更多种肽或蛋白质，特别是一种或更多种肿瘤标志物)来检测和/或表征肿瘤细胞的装置。本发明还涉及检测和/或表征肿瘤细胞液滴及其制备方法。

Description

用于检测和/或表征肿瘤细胞的方法及相关装置

技术领域

本发明涉及肿瘤学中的生物诊断领域。本发明涉及通过检测肿瘤细胞的一种或更多种分泌蛋白质组成分(特别是一种或更多种肽或蛋白质，特别是一种或更多种肿瘤标志物)，而用于检测和/或表征肿瘤细胞的方法和装置。本发明还涉及肿瘤细胞液滴的检测和/或表征及其制备方法。

背景技术

发表于2014年9月的出版物“Nature Reviews Cancer”，第14卷，第623至6131页的文章“Challenges in circulating tumor cell research”描述了用于检测循环肿瘤细胞的各种技术。

用于检测通常由首字母缩略词EPISPOT(Epithelial Immunospot)指定的循环肿瘤细胞的方法是现有技术已知的，特别是从EP 1506407中已知。该技术通过检测这些细胞释放的肿瘤标志物，允许检测具有实体肿瘤的患者的生物样品中的循环肿瘤细胞。该技术涉及以每孔2×10⁵个细胞的比例将细胞沉积在固体培养表面，更特别是96孔板上，其中将针对目标肿瘤标志物的特异性抗体固定在该固体培养物表面上，然后培养这些细胞，然后洗出细胞，用特异性标记的抗体检测目标肿瘤标志物。

然而，通过这种方法获得的分辨率是有限的。事实上，检测到的蛋白质来自同一孔中的不同细胞。很难知道哪个细胞分泌了什么。该信号不提供关于细胞异质性的信息。此外，难以回收细胞以分析其基因型。

本发明旨在提供一种更准确和更可靠的检测方法。

WO 2009/011808 A1描述了一种用于确定将蛋白质固定在液滴中的活性的方法。

Mazutis等人于2013年4月4日在“Nature Protocols”在线发表出版物“Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics”阐述了这一原理。

将小鼠杂交瘤封装在包被抗小鼠抗体的珠粒的液滴中。杂交瘤分泌抗体。与荧光团偶联的二抗使得其显示分泌的抗体的存在成为可能。在不存在分泌抗体的情况下，二抗在液滴中的分布是均匀的，但是在抗体存在的情况下二抗重新定位在珠粒上。因此，该方法对于确定特定细胞的活性是非常有选择性。

另一方面，这种方法具有各种缺点。细胞和珠粒的区室化方法是随机的。可以通过泊松分布定律估计液滴中的珠粒数量。类似地，可以通过独立的泊松分布定律估计液滴内的细胞数量。调整珠粒和液滴的初始浓度，以使每个液滴具有平均一个细胞和一个珠粒。因此，对于所执行的分析，仅有一部分液滴是感兴趣的。

此外，每个液滴存在的具有显着尺寸的单个珠粒不利于该方法的实施。事实上，二抗分布在珠粒的整个表面上。因此，该方法的动态范围受限于每个珠粒的可用外表面积。

发明内容

本发明的一个目的是提供比现有方法更可靠和更灵敏的分析方法，从而允许单独或以聚集体形式的活细胞的分泌蛋白质组的分析，用于检测和/或表征细胞。肿瘤，特别是单个肿瘤细胞或肿瘤细胞的聚集体。

为此目的，本发明的目的是一种用于检测和/或表征肿瘤细胞的方法，包括：

-提供包含在载流体中的多个液滴，其中，至少一个液滴包含至少一个聚集颗粒的聚集体，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体，其中，至少一些液滴包含能够产生肿瘤细胞的分泌蛋白质组的靶成分的细胞，所述靶成分能够固定在所述聚集体上；

-测量至少一个物理参数，所述物理参数表征肿瘤细胞的所述分泌蛋白质组的靶成分在聚集体上的固定；和

-由所述至少一个物理参数的测量，检测和/或表征肿瘤细胞。

更具体地，根据本发明的用于检测和/或表征肿瘤细胞的方法包括：

-提供包含在载流体中的多个液滴，其中，所述液滴包含能够形成颗粒的聚集体的多个颗粒，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体，其中至少一些液滴包含细胞；

-在一定条件下孵育多个液滴足够的时间，使得在含有细胞的液滴中，细胞能够产生肿瘤细胞的至少一种分泌蛋白质组的靶成分，所述靶成分能够固定在聚集体上；

-在每个液滴中形成至少一个颗粒的聚集体，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体；

-测量至少一个物理参数，其中，每个物理参数表征肿瘤细胞的所述分泌蛋白质组的靶成分在聚集体上的固定；和

-通过测量至少一个物理参数来检测和/或表征肿瘤细胞。

细胞是单细胞或细胞聚集体，尤其是，被怀疑是肿瘤细胞的聚集体的聚集体。

肿瘤细胞的聚集体是寡克隆起源的，并且由若干个原发性肿瘤细胞的粘附或集聚而产生。肿瘤细胞的聚集体通常可含有2至15个肿瘤细胞。肿瘤细胞的聚集体基本上由肿瘤细胞组成，但也可含有有限数量的其他类型的细胞(诸如白细胞、血小板)。

因此，根据本发明的方法尤其涉及用于检测和/或表征单个肿瘤细胞的方法，包括：

-提供包含在载流体中的多个液滴，其中至少一个液滴包括至少一个颗粒的聚集体，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体，其中至少一些液滴包含单个细胞；

-在一定条件下孵育含有单个细胞的液滴足够的时间，使得单个细胞能够产生肿瘤细胞的至少一种分泌蛋白质组的靶成分，所述靶成分能够固定在聚集体上；

-由至少一个物理参数的测量，检测和/或表征单个肿瘤细胞。

“单细胞液滴”是指液滴包含单个细胞。

“含有单个肿瘤细胞的液滴”是指液滴包含单个细胞，该单细胞为肿瘤细胞。

在本发明的上下文中，肿瘤细胞不是通过肿瘤细胞与另一细胞的人工融合产生的细胞(诸如杂交瘤)。

特别地，该方法旨在确定液滴的存在，或甚至选择包含单个细胞的液滴，所述单个细胞的分泌蛋白质组包含特定的靶成分，其中，靶成分是肿瘤细胞的分泌蛋白质组的分子，并且特别是肿瘤标志物。

细胞的分泌蛋白质组是存在于培养中细胞的条件培养基中的成分组(有机或无机分子，诸如蛋白质、肽、碳水化合物、脂质，或核酸，或囊泡)。术语“分泌蛋白质组”在特定意义上是指存在于培养中细胞的条件培养基中的蛋白质组的一部分(即由细胞表达的所有蛋白质和肽)。

这些分子，并且特别地，蛋白质或肽是：

-分泌的(通过涉及内质网和高尔基体的所谓的“经典”途径，或通过所谓的“非经典”途径(诸如通过膜转运蛋白的主动转运，或通过再循环内体或胞吐的液泡的分泌))。例如，在蛋白质前列腺特异性抗原(PSA)、乳腺珠蛋白、人激肽释放酶3(hK3)、“人腺激肽释放酶”(hK2)、甲状腺球蛋白、CA19-9蛋白、CA15-3、CA 125(“CA”是“癌抗原”的缩写)、血管紧张素转换酶(ACE)、组织蛋白酶D、甲胎蛋白、S100蛋白、FGF-2或EGF的情况下；

-在它们的胞外域中切割，在胞外域被酶促切割并释放到细胞外培养基中(脱落蛋白)的膜蛋白的情况下。例如，HER2、EGFR(上皮生长因子受体)或MUC1标志物是切割的蛋白质；或者

-由细胞释放。释放的分子是，例如，细胞通过分泌途径的不同途径(例如通过出芽)分泌的非膜蛋白(诸如蛋白CK19(细胞角蛋白19))。

外泌体也是肿瘤细胞分泌蛋白质组的一部分。这些是由围绕小细胞溶质的脂质双层膜组成的囊泡。外泌体的细胞溶质可包含蛋白质、双链DNA，但也包括RNA(特别是mRNA，miRNA)。外泌体允许肿瘤细胞转移致癌蛋白和/或核酸以调节受体细胞的活性，从而在致瘤性、肿瘤生长、转移方法和抗药性中起作用。

根据本发明的方法可包括以下特征中的一个或更多个，这些特征单独使用或以任何技术上可行的组合来使用：

i)颗粒是磁性颗粒，有利地是顺磁性的，优选是超顺磁性的；

ii)提供液滴的步骤包括：

-将颗粒分散在流体本体中，用于形成液滴，然后

-以液滴形式分散流体本体，

-在每一液滴中形成至少一个颗粒的聚集体，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体，其中在分散之后在每一液滴中形成颗粒的聚集体；

iii)靶成分是肿瘤细胞的分泌蛋白质组的成分，

iv)靶成分是肿瘤细胞分泌蛋白质组的肽或蛋白质；

v)靶成分是核酸(DNA或RNA)，特别是肿瘤细胞的miRNA；

vi)靶成分是肿瘤细胞的外泌体；

vii)至少一些液滴包含能够产生靶成分的生产实体，其中生产实体是单个肿瘤细胞或肿瘤细胞的聚集体，并且特别是单个循环肿瘤细胞(CTC)、弥散性肿瘤细胞；(DTC)，或CTC或DTC的聚集体；

viii)该方法在测量步骤之前包括沿着检测轴线定向聚集体的主轴线的步骤；

ix)该方法包括多个测量步骤，具有根据用于每次测量的不同检测轴线定向聚集体的主轴线的步骤；

x)该方法包括：

-提供包括液滴循环组件和检测区域的设备；

-向检测区域的输送液滴，其中液滴内的测量在该检测区域中进行；

xi)该方法包括：

-提供包括液滴循环组件和多个分类区域的设备，以及用于选择性地将液滴或液滴的一部分导向至分类区域的构件，

-决定液滴或液滴的一部分的分类，其中，决定在于从多个分类区域中选择性地选择分类区域，

-将液滴或液滴的一部分输送到决定步骤中所选择的液滴的分类区域；

xii)可能通过捕获成分方法捕获至少一个液滴，该液滴包括至少一个靶成分、至少一个能够捕获靶成分的捕获成分和至少一个能够与靶成分形成复合物的信号实体，其中，方法包括测量表示聚集体上的至少一个信号实体的重新定位或浓度的信号；

xiii)至少一个液滴包含至少一个靶成分、至少一个能够与靶成分形成复合物的第一信号实体和至少一个能够与靶成分形成复合物的第二不同的信号实体，其中，方法包括测量表示聚集体上每个重新定位的信号实体的浓度的信号；

xiv)至少一个液滴包含至少一种靶成分、能够与靶成分形成复合物的至少一个信号实体和至少一个能够与靶成分形成复合物的定量实体，其中该方法包括：

-测量代表在聚集体上重新定位的信号实体的浓度的信号，

-测量代表在聚集体上重新定位的定量实体的浓度的信号，

-根据重新定位于重新定位定量实体的信号上的的信号实体的信号比值，确定靶成分与信号实体的解离常数；

xv)至少一个液滴包含至少两个不同的信号实体，其中两个信号实体中的每一个能够与在聚集体上的不同靶成分形成复合物，其中该方法包括测量表示每个重新顶位的信号实体的浓度的信号；

xvi)至少一些液滴包含生产实体，其中生产实体是能够产生肿瘤细胞的分泌蛋白质组成分的细胞，其中肿瘤细胞的分泌蛋白质组的每个成员是单独的靶成分，而表示每个重新定位的信号实体的浓度的信号的测量允许定量分泌蛋白质组的成分；

xvii)物理参数的测量是放射性测量、色度测量或荧光测量；

xviii)至少一个液滴包含能够分泌靶成分的细胞，并且该方法包括孵育步骤，在该步骤中，靶成分通过细胞分泌在液滴中；

xix)该方法包括测量物理参数的步骤，在液滴的至少一个中，在位于远离聚集体的第一点局部测量物理参数，以及在同一液滴中的聚集体附近的第二点局部测量相同的物理参数；

xx)最大的颗粒尺寸为小于液滴直径的50％；

xxi)液滴包含至少一个信号实体，并且物理参数的测量取决于液滴内的信号实体的位置或者相对于聚集体的位置；

xxii)生产实体产生多种靶成分，靶成分选自由成分，特别是，肿瘤细胞的分泌蛋白质组的蛋白质和肽组成的组；

xxiii)该方法包括确定生产实体的至少一个特征的步骤；

xxiv)分类决定步骤在测量步骤之后发生；

xxv)液滴包含超顺磁性颗粒，其中液滴或液滴的一部分通过选自磁场、电场、介电电泳、电泳或表面声波的引导方式导向分类区域；

xxvi)通过磁力方式提取液滴的一部分，其中提取的部分形成辅助液滴并包含聚集体；

xxvii)颗粒用适于固定靶成分的捕获成分功能化，而每个液滴包括能够固定靶成分的信号实体；

xxviii)信号实体是荧光的、放射性的或有色的；

xxix)物理参数的测量是色度测量、荧光测量或放射性测量；

xxx)物理参数的测量包括液滴内的荧光、色度或放射性信号的位置；

xxxi)物理参数的测量包括相对于液滴内的聚集体的荧光、色度或放射性信号的位置；

xxxii)物理参数的测量包括测量液滴内(优选在聚集体的水平)的荧光、色度或放射性信号的强度，；

xxxiii)物理参数的测量包括液滴内(优选在聚集体的水平)的荧光、色度或放射性信号的位置和/或强度随时间的变化；

xxxiv)每个液滴包含至少两个不同的信号实体，其中两个信号实体中的每一个能够在聚集体上形成具有不同靶成分的复合物，其中每个信号实体在单独的荧光通道中是荧光的。

xxxv)细胞是肿瘤细胞，特别是单个肿瘤细胞或肿瘤细胞聚集体；

xxxvi)细胞，特别是单个细胞或细胞聚集体，来源于生物体液，并选自由循环肿瘤细胞和弥散性肿瘤细胞组成的组；

xxxvii)测量步骤包括在位于液滴中的多个点处至少一个物理参数的局部测量，其中测量步骤优选地包括确定液滴内的测量值的积分；

xxxviii)测量步骤在没有液滴循环的微流体腔室中进行；

xxxix)该方法包括：

-提供包括液滴循环组件和多个分类区域的设备，以及用于选择性地将液滴或一部分液滴导向分类区域的设备，

-决定液滴或液滴的一部分的分类，其中该决定涉及从多个分类区域中选择性地选择分类区域，

-分别将液滴或液滴的一部分朝向在决定步骤期间选择的液滴的分类区域输送，

-并且可选地通过运输到分类区域进一步收获分选的液滴，然后裂解分选和收获的液滴，然后裂解液滴并收获分选和裂解的液滴中包含的活肿瘤细胞。

x1)至少一个液滴包含至少两个不同的信号实体，其中两个信号实体中的每一个能够在聚集体上形成具有不同靶成分的复合物，并且其中该方法包括测量指示每个重新定位的信号实体的浓度的信号；

xli)至少一些液滴包含能够分泌、切割或释放肿瘤细胞分泌蛋白质组的一种或多种成分的单个或聚集的细胞，其中肿瘤细胞分泌蛋白质组的每个成分是单独的靶成分，其中测量指示每个重新定位的信号实体的浓度的信号允许定量肿瘤细胞分泌蛋白质组的成分。

本发明还涉及用于检测和/或表征肿瘤细胞(单个地或以聚集体形式的肿瘤细胞)的装置，包括：

-提供包含在载流体中的多个液滴的组件，其中，至少一个液滴包含至少一个颗粒的聚集体，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体，其中，至少一些液滴包含能够产生适合固定在聚集体上的靶成分的单个肿瘤细胞或以细胞聚集体形式的细胞，

其特征在于，该装置包括用于测量物理参数的组件，该物理参数表征靶成分在聚集体上的固定，其中，所述装置可选地进一步包括：

-液滴的循环的组件，

-液滴的分类决定的组件，

-根据分类决定对液滴的分选的组件。

本发明的目的还在于用于检测和/或表征肿瘤细胞的液滴，所述肿瘤细胞为单个肿瘤细胞或以肿瘤细胞聚集体的形式，包括多个能够形成颗粒的聚集体的颗粒，所述聚集体限定了沿着细胞主轴线的细长物体，以及肿瘤细胞，所述肿瘤细胞为单个肿瘤细胞或以肿瘤细胞聚集体的形式，以及可选地至少一种肿瘤细胞分泌蛋白质组的靶成分，其在肿瘤细胞聚集体的形式中是唯一的，能够固定在聚集体上。

本发明的目的还在于制备检测液滴和/或肿瘤细胞的表征的方法，所述肿瘤细胞是单个肿瘤细胞或以肿瘤细胞聚集体的形式，包括：

-用于在旨在形成液滴的流体本体中分散颗粒和多个细胞，该颗粒适于形成限定了沿主轴线的细长物体的聚集体，其中至少一些细胞是能够产生肿瘤细胞的分泌蛋白质组的靶成分的肿瘤细胞，以及然后

-以液滴形式分散流体本体，使得每个液滴包含多个颗粒，并且至少一些液滴另外包含单个细胞或细胞聚集体的形式，和

-可选地在每个液滴中形成至少一个颗粒的聚集体，所述聚集体限定了沿主轴线的细长物体，其中在分散之后在每个液滴中形成颗粒聚集体。

附图说明

通过阅读下面仅作为示例的描述之后，并参考附图，将更好地理解本发明，特别是根据“单个细胞”模式，其中：

图1显示了根据本发明的第一分析装置的主要原理的示意图，

图2和图3示出了使用第一装置的方法步骤的示意图，

图4至7示出了在根据本发明的不同方法步骤期间，根据本发明的第二装置的一部分的照片，

图8示出了根据本发明的第三装置的示意图，

图9和10显示了液滴间隔和读数组件，

图11和12显示了用于产生液滴的设备，

图13显示了在实施方法的步骤期间液滴的示意图，

图14至26示出了该方法的应用实例。

具体实施方式

第一装置

根据本发明，第一装置1用于分析液滴内容物以及用于检测和/或表征以单个肿瘤细胞或以肿瘤细胞聚集体的形式的肿瘤细胞，如图1所示。

装置1包括包含在载流体8中的多个液滴6的供应组件4，其中至少一部分液滴6包括至少一个颗粒12的聚集体10，其限定了沿主轴线X的细长物体。

细长物体是具有细长形状的物体。细长形状沿主轴线的长度大于其在垂直于主轴线方向上的长度。因此，球体不是细长的。例如，椭圆形物体、锥形、杆形或非球形卵形具有细长形状。

装置1进一步包括液滴中的物理参数的测量组件14。

例如，测量组件14能够在至少一个液滴中距离聚集体10一定距离的第一点16处局部地测量物理参数，并且在同一液滴中聚集体10的附近的第二点18处局部地测量相同的物理参数。

装置1还包括设备20，设备20包括循环组件22、循环管道24和检测区域26。

循环组件22能够以一系列连续液滴的形式在管道24中的载流体8中使每个液滴6循环。

供应组件4包括加载组件28和聚集组件30。供应装置4还包括间隔组件31。

加载组件28能够供应含颗粒12的分散体的多个初始液滴32，其中至少一个初始液滴32进一步包括肿瘤细胞90的分泌蛋白质组中的至少一个靶成分37。

间隔组件31能够使液滴系列的两个连续液滴6间隔开，即增加两个连续液滴之间的距离。例如，间隔组件31具有载流体入口8。间隔组件的实例在图9和10中示出。

载流体8能够分离液滴系列的两个连续液滴6以防止其接触。或者，液滴6的分离可以通过机械设备执行。

形成液滴6和载流体8的内相的流体基本上是不混溶的。例如，液滴6包括含水内相，而载流体8是有机相或油相。

载流体8有利地是氟化油。

载流体8或形成液滴内相的流体有利地包含能够在接触时防止两个液滴6融合的表面活性剂，例如如专利US 2010/0105112中所述或来自RainDance Technologies公司的EA表面活性剂。

“基本上不混溶”通常是指在25℃和环境压力下测量的形成液滴的流体在载流体8中的溶解度小于1％。

液滴6的尺寸例如在1μm和1000μm之间。液滴6的体积有利地在0.1皮升和1微升之间。

提供的液滴6基本上是单分散的。这意味着液滴6的多分散性小于5％。

在所示的实例中，液滴6是球形的。或者，液滴6可以是沿着管道24的循环轴线Y的细长形状。或者，液滴6可以是沿着垂直于循环轴线Y的轴线的扁平的圆盘形。

液滴的组成

每个初始液滴32包括基础流体、基础流体中的固体颗粒12的分散体，以及多个信号实体34。此外，至少一个初始液滴32包括细胞90，优选单个肿瘤细胞或肿瘤细胞聚集体，和可选的肿瘤细胞分泌蛋白质组的至少一种靶成分37。

如上所述，液滴6的体积有利地在0.1皮升和1微升之间。细胞的体积约为1皮升。为了封装单个细胞或肿瘤细胞聚集体，对于单个细胞液滴体积为20至150皮升，例如20至50皮升，或30至40皮升，或甚至30至40皮升，或者液滴体积特别是对于细胞聚集体有利地选自60皮升至150皮升，或80至120皮升。

单细胞和聚集体的分析可以同时或依次进行。对于同时分析，使用能够封装细胞聚集体的液滴体积是有利的(例如60至150皮升，通常约100pl)。对于依次分析，可以使用集成分离系统(使用Sajeesh和Sen，Microfluidics和Nanofluidics 2014，17，1-52中描述的技术)分离单个细胞和细胞聚集体，然后一方面单独封装单个细胞，以及另一方面，单独封装细胞聚集体。或者，可将单细胞和细胞聚集体封装在小体积(例如20至50皮升)的液滴中，对细胞聚集体进行分选，随后将量加入含有细胞聚集体的液滴中。单个细胞和细胞聚集体的分离也可以在实施本发明之前进行，以及然后依次序并单独分析单个细胞和细胞聚集体。

液滴最初包含基础流体中的细胞，通常是适于哺乳动物细胞(特别是人细胞)培养的培养基(诸如DMEM或RPMI)，其中，基础流体不含细胞分泌蛋白质组的成分。通过从单细胞分泌、切割或释放，分泌蛋白质组成分随时间积累在基础流体中。

基础流体的设计使得液滴中的单个细胞或细胞聚集体能够产生至少一种能够与聚集体结合的肿瘤细胞分泌蛋白质组的靶成分，特别是当单细胞是肿瘤细胞，或当细胞聚集体包含肿瘤细胞或由肿瘤细胞组成时。

例如，封装在液滴中的每个肿瘤细胞90(单个或以细胞聚集体的形式)，能够产生靶成分37。特别地，肿瘤细胞90分泌、切割或释放分泌蛋白质组成分(诸如蛋白质或肽，特别是标记肿瘤的蛋白质或肽)。特别地，单个或以细胞聚集体的形式的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞或弥散性肿瘤细胞。

颗粒12用于形成细长聚集体10。例如，颗粒12是在施加磁场时获得磁矩的超顺磁性颗粒。超顺磁性是当它们呈小粒子或纳米颗粒的形式时，出现的铁磁性或亚铁磁性材料的行为。在足够小尺寸的粒子中，磁化可以在温度的影响下自发地反转。本文中的术语“磁性颗粒”是指超顺磁性颗粒。

磁性颗粒12例如选自Dynal(Life Technologies)或Ademtech或Miltenyi公司提供的颗粒。

颗粒12例如是纳米级的。因此，它们的最大尺寸小于1μm并且例如在50nm和1000nm之间。颗粒12有利地基本上是单分散的。例如，颗粒12的最大尺寸之间的差异严格小于10％。选择每个液滴6的颗粒12的尺寸和数量，以形成所需数量的聚集体。最大粒径12小于液滴6直径的50％。

颗粒12的浓度允许胶体稳定性。

液滴6中的颗粒12的浓度使得颗粒12占液滴6的体积的0.1％至5％，例如1.7％。

在一个实例中，33皮升的每个液滴平均含有500个直径为300nm的颗粒12。

颗粒12最初在初始液滴32中形成均匀的分散体。它们基本上均匀地分布在初始液滴32的体积中。因此，颗粒12的浓度在整个初始液滴32上是均匀的。

颗粒12有利地具有允许生物分子偶联的表面，由表面材料组成。例如，颗粒12覆盖有具有COOH或NH₂功能的聚集体。

有利地，该表面材料还可以限制颗粒12在液滴中的自发聚集。

另外，例如通过聚集体中的珠粒材料与相邻材料之间的非特异性键，其可以有利地促进聚集体10的稳定性。

颗粒12有利地被官能化。这特别地意味着颗粒12的表面材料包括官能团成分。

在所示的示例中，官能团部分包括捕获成分36。捕获成分36例如能够捕获靶成分37。捕获成分36能够经由靶成分37间接地结合信号实体34。

单独或以聚集体形式的肿瘤细胞分泌或释放，或从单独或以聚集体形式的肿瘤细胞切割下来的靶成分37，通过颗粒12捕获成分36和通过信和实体34识别。

当靶成分37是分泌蛋白质组、肽、脂质、碳水化合物或外泌体时，捕获成分36有利地由直接针对靶成分37或对靶成分37特异的多克隆抗体或单克隆抗体(多拷贝)构成。

当靶成分37是分泌蛋白质组的靶核酸(诸如miRNA)时，捕获成分36有利地由与靶核酸杂交的核酸(多拷贝)构成，优选核酸包含与靶核酸序列互补的序列或由与靶核酸序列互补的序列组成。捕获核酸通常是DNA序列，由例如10至200、10至100、10至50，或10至30个核苷酸组成。

当靶成分37是外泌体时，捕获成分36有利地由针对存在于膜中的蛋白质的抗体构成，或者由固定在固体表面上的脂质或甾醇构成，例如，如Kuhn等人所描述的颗粒。(IntegrBiol，2012，4，1550-1555)。

以相同的方式，取决于靶成分的性质，信号实体34有利地由(i)直接针对靶成分37或对靶成分37特异的多克隆抗体或单克隆抗体(多拷贝)构成，其中可检测地标记单克隆抗体或多克隆抗体，或(ii)与靶核酸杂交的信号核酸(多拷贝)，优选包含与靶核酸序列互补的序列或由其组成，其中可检测地标记信号核酸。

标记通常可以是放射性元素、发色团化合物、荧光团，或直接或间接与抗体或核酸偶联的酶。

在液滴6中这些靶成分37的存在允许信号实体34重新定位到聚集体10，如稍后将描述的。

另一方面，当单个细胞不是肿瘤细胞时，当细胞聚集体不含肿瘤细胞时，或当单细胞或细胞聚集体不产生或未以足够量产生肿瘤细胞分泌蛋白质组的靶成分37时，则信号实体34不会重新定位在聚集体10上。

因此，信号实体34重新定位到聚集体使得检测单个或以聚合形式的细胞分泌、切割或释放靶成分37成为可能，并因此：

-如果靶成分是肿瘤细胞或肿瘤细胞类型的特定标记，则表征细胞是肿瘤细胞，和/或

-表征靶成分37是细胞的分泌蛋白质组的一部分。

当寻求几种不同的靶成分37时，不同的信号实体和不同的捕获成分相关联。它们的重新定位由不同的信号实体和不同的捕获成分独立地检测，例如在不同的荧光通道上。

与不同靶成分相关联的不同信号实体34的每次重新定位使得检测到细胞分泌、切割或释放相关联的靶成分37成为可能。

聚集组件30能够沿着主轴线X产生颗粒12的聚集体。

聚集组件30包括例如位于管道24两侧的两个磁体38。磁场与循环轴线Y不平行，并且有利地垂直于循环轴线Y。聚集组件30允许在每个液滴6中形成细长的聚集体。

在一个实施方案中，磁体38是永磁体。

或者，聚集组件30可包括非永磁体。

或者，聚合组件30能够从活动模式切换到非活动模式，以便仅在一些液滴中生成细长的聚集体。

颗粒12的每个聚集体10例如包括沿主轴线X方向的柱形物。柱形物的高度有利地在液滴6的直径的50％和l00％之间。其宽度例如小于高度的60％。

另外，聚集组件30例如能够使聚集体沿着优选轴线定向。在所示的示例中，聚集体12的轴线X垂直于循环管道24中的液滴6的循环轴线Y。

测量组件14例如包括激光线，该激光线能够光学测量沿着相对于循环轴线Y垂直或倾斜的轴线X′延伸的线的荧光强度。

测量组件14能够在检测区域26中的液滴内进行测量。

激光线的轴线X有利地平行于检测区域26中的聚集体X的轴线。

当载流体8的流速恒定时，随激光线获得的信号的时间变化的测量对应于通过激光线前部的液滴6进行空间扫描。这使得可以连续地获取多个测量点，并且特别地，位于距离聚集体10一定距离处的至少一个第一测量点16，和位于聚集体10附近更靠近聚集体10的第二测量点18。

实际上，在液滴6朝测量组件14逐渐通过期间，在液滴6的整个纵向尺寸上获取多个连续的测量点。

在图1至3所示的示例中，信号实体34是发荧光的。

循环管道24用于允许液滴6、液滴32沿着流动方向上的循环轴线Y从供应组件4循环到测量组件14。

循环管道24有利地具有小于或等于1mm的内径。

循环管道24沿循环轴线Y延长。循环管道24具有圆状轮廓的内部横截面(诸如圆形或椭圆形)，或多边形轮廓(诸如矩形)。

例如，循环管道24限定为半透明材料，允许通过测量组件14测量光学参数。或者，循环管道24可以在检测区域26中限定有至少一个透明测量窗口。

循环管道24的壁相对于载流体8密封。

例如，循环管道24限定在内部尺寸有利地小于1mm的毛细管中。或者，循环管道24可以限定在微流体芯片中。

循环液滴的组件22用于使液滴6、液滴32沿循环方向一个接一个地在管道24中移动。

循环组件22包括例如用于将受控流速施加到载流体8的注射泵。或者，循环组件22可包括压力控制器。

用第一装置的分析方法

现在将描述在第一装置1中实现的根据本发明的第一分析方法。

提供如前所述的装置1。在载流体8中制备如上所述的初始液滴32。

优选地，颗粒12均匀地分散在每个初始液滴32中。考虑到单个颗粒12具有比初始液滴32小的尺寸，每个初始液滴32包含大量(例如大于10个)的单个颗粒12。获得没有颗粒12的初始液滴32的概率非常低，甚至为零。

一些液滴6包含分泌、释放或切割靶成分37的单个肿瘤细胞90。

优选地，信号实体34均匀地分散在每个初始液滴32中。

在初始液滴32内，在具有特定亲和力的成分之间形成键。

在一个实例中，每个靶成分37结合信号实体34和捕获成分36。因此，信号实体34被重新定位到颗粒12上。

在下文中，“重新定位”的实体是结合聚集体10的实体。

通过循环组件22，将初始液滴32与载流体8一起在管道24中循环。

至少一个初始液滴32引导至聚集组件30。通过初始液滴32中的聚集组件30形成限定了沿着主轴线X的细长物体的颗粒12的聚集体10。

优选地，当颗粒12是磁性颗粒时，它们通过聚集组件30的每个磁体38期间，颗粒12沿着主轴线X对齐。

包括细长物体的液滴6引导到检测区域26。通过测量组件14，在至少一个液滴6中的至少一个第一点16处局部地测量物理参数。

在特定实施方案中，通过测量组件14，在至少一个液滴6中的至少一个第一点16处测量局部地物理参数，并且通过测量组件14在同一液滴6中的聚集体10附近至少一个第二点18处局部测量相同的物理参数。

测量

图2以举例说明的方式示出了对不同液滴6获得的不同测量值。该图显示了随时间变化的由激光线测量的荧光强度。

在信号实体34的特征波长范围内测量荧光强度。在该实例中，在颗粒12的波长特征范围内进一步测量荧光强度，其中颗粒12是发荧光的。因此，聚集体10更容易识别。

针对不同的液滴6，对应于在激光线上测量的信号实体34的荧光的荧光强度40在图2中以虚线示出。

针对不同的液滴6，对应于颗粒12的荧光的荧光强度41在图2中以实线呈现。

测量步骤包括在液滴中的多个点处局部地确定物理参数。它还有利地包括在多个点处测量的值的累加，例如确定液滴6内的测量值的积分。

所示的第一液滴42是不同的信号实体34尚未重新定位到颗粒12上的液滴6。信号实体34的分布在液滴6内是均匀的。测量的荧光强度信号为平稳期44。

所示的第二液滴48是信号实体34的一部分已经重新定位到颗粒12上的液滴6。这些信号实体34结合由捕获成分36捕获的靶成分37。因此，在聚集体10附近的荧光强度大于液滴6的其余部分。测量的荧光强度信号除了平稳期52之外还具有峰值50。

第二液滴48的平稳期52的高度小于第一液滴42的平稳期44的高度，因为较少的信号实体34自由地远离聚集体10。

所示的第三液滴56是更显著比例的信号实体34已经重新定位到聚集体上的液滴6。荧光强度信号具有峰值58和平稳期59。测量的峰值58的高度大于在第二液滴48中测量的峰值50的高度，因为更多的信号实体34被颗粒12捕获并且因此位于聚集体10的附近。

图3示出了对用于估算重新定位的信号实体34浓度的有用参数的选择。

在示出了信号S随时间t变化的图3中，看到三个液滴含具有较高信号峰的一个(左侧和右侧)或两个(中间)聚集体。有用的参数可以是信号的最大值(表示为Max)，即相对于给定阈值的信号积分(Int)。

第一种方法由通过每个液滴6中信号最大值(Max)估算该浓度，即重新定位在聚集体上的信号峰的高度组成。

第二种方法更精确，例如如图3所示，其由计算每个液滴6的超过用户所设阈值的信号积分(Int)组成。这种方法对于限制信号的离差是更有趣的。

这两种信号处理方法都可以实时地进行。

可应用其他方法，例如将这些方式组合，用于例如测量重新定位的和非重新定位的信号实体34。

本发明还能够测量液滴6中的靶成分37的浓度。

在这种情况下，一个简单的例子是：

-捕获成分36具有足够的量并且对靶成分37具有足够的亲和力，以便在聚集体上捕获至少大于90％的靶成分，有利地捕获全部靶成分；

-信号实体34的浓度大于靶成分37的浓度，并且信号实体34和靶成分37之间的解离常数Kd有利地以大于10的因数小于靶成分37的浓度。在使用优化的剂量试剂(诸如具有次纳摩尔Kd的单克隆抗体)时，和当需要检测大于纳摩尔的浓度的靶成分37时，这是通常的情况。

“纳摩尔”是指等于1纳摩尔/L。

在这些具体条件下，每个靶成分37的存在引起捕获成分36-靶成分37-信号实体34复合物的形成。因此，靶成分37的浓度与重新定位在聚集体10上的信号实体34的信号成比例。通过调整捕获成分36或信号实体34对于靶成分37的浓度和亲和力，其它条件使得执行定量成为可能，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。

应用：肿瘤细胞检测

如果靶成分是肿瘤细胞的分泌蛋白质组的特异性标志物，则其检测可能对于封装的单个或聚集的肿瘤细胞的检测是足够的。

如果靶成分是肿瘤细胞的分泌蛋白质组的特征性标志物，但不是肿瘤细胞特异性的，则其与构成肿瘤细胞的分泌蛋白质组的特征性标记的一种或更多种其他靶成分组合的检测可以使得检测单个封装的细胞是肿瘤细胞成为可能。

在测量步骤之后，获得关于封装在液滴中作为单个细胞或细胞聚集体的细胞的肿瘤性质的信息。

该信息使得知道哪些液滴在下面用于其他测量或使用必须恢复成为可能。

因此，该方法使得可以从包含异质细胞的生物样品中检测分离的肿瘤细胞。鉴定出不产生靶成分的非肿瘤细胞或肿瘤细胞，因为它们的液滴不含靶成分且信号实体尚未重新定位。因此，该方法使得检测或甚至计数来自生物样品的细胞群中的肿瘤细胞成为可能。

应用：肿瘤细胞表征

如果封装的单个细胞仅是肿瘤细胞，靶成分的测量能够获得与单个肿瘤细胞产生靶成分有关的信息，例如其浓度。

如果封装细胞的聚集体含有一个或更多个肿瘤细胞，则靶成分的测量可以获得与细胞聚集体产生靶成分有关的信息，例如其浓度。

在测量步骤之后，获得关于封装在液滴中的每个肿瘤细胞的一个或更多个特征的信息，或者包含封装在液滴中的一个或更多个肿瘤细胞的每个聚集体的信息。

该信息使得获得关于肿瘤细胞的异质性或性质的信息成为可能。

应用：肿瘤细胞的检测和表征

在测量期间，例如通过检测靶成分并测量其浓度，可以获得关于细胞的肿瘤性质和肿瘤细胞的特征的信息。

另外，通过检测多种靶成分，可以同时获得大量信息。例如，某些靶成分是肿瘤标志物并且分泌蛋白质组的其他成分(诸如蛋白质或肽)，不是特异性肿瘤标志物。

在测量步骤之后，获得关于封装在液滴中的每个肿瘤细胞的特征的信息。

该信息使得获得关于肿瘤细胞的异质性和各种机制的信息成为可能。

第二装置

图4至图7示出了根据本发明的第二装置60的一部分。

第二装置60与第一装置1的不同之处在于，设备20包括腔室62。腔室62包含多个循环通道64和多个分离垫66。

其他的腔室也是可能的。在一个变体中，腔室不包括文献PCT/FR2009/051396中所描述的分离垫。

腔室62用于在聚集步骤或定向步骤期间和在测量步骤期间，将多个滴液6存储在载流体8中。

第二装置60的测量单元与第一装置1的测量单元14的不同之处在于，它能够同时测量存在于腔室62中的若干个液滴6上的物理参数。

图4示出了含有在载流体8中的初始液滴32的腔室62。磁性颗粒12的分散体是可见的。图5示出了在液滴中形成聚集体10之后的同一腔室62。在每个液滴6中形成多个细长的聚集体。图6示出了在相同装置60中具有细长的聚集体10的多个液滴6。已经调节了液滴6的性质和数量，使得每个液滴中仅存在一个细长的聚集体10。每个液滴6存在一个聚集体10有利于测量。图7示出了在沿相同检测轴线D定向聚集体之后的同一腔室62。

用第二装置的分析方法

根据本发明的第二装置60的分析方法与先前描述的方法的不同之处在于，例如通过同时在整个腔室62中进行测量，而不是使液滴6在检测器前循环，同时对多个液滴6进行测量。

该方法的一个优点是能够随时间重复测量同一液滴上的物理参数，因为液滴是静止的，并因此能够确定分泌蛋白质组成分的分泌的动力学。

该方法的不同之处还在于，其在测量步骤之前包括沿检测轴线D定向聚集体10的主轴线X的步骤。

有利地，能够通过施加可变方向的磁场使检测轴线倍增。该方法具有能区分液滴的其他非磁性物体的聚集体10，或者减少寄生信号的优点。例如，可降低背景荧光。例如，沿不同轴线的检测能够区分信号实体34在聚集体10上的重新定位，和信号实体34在液滴6的另一物体(例如细胞)上的重新定位。

该想法的实现由以下组成：施加磁场B1，用于使聚集体10的主轴线X沿第一方向D1对齐，然后施加垂直于B1的磁场B2，以使聚集体10的主轴线X沿垂直于D1的第二方向D2对齐。

第三装置

图8中示出了根据本发明的第三装置70。该第三装置70与第一装置1的不同之处在于其进一步包括分类组件72。

此外，第三装置70与第一装置1的不同之处在于，加载组件28包括内相输入区域74，和载流体输入区域76，和汇合区域78。加载组件28进一步包括孵育区域79。

内相输入区域74包含第一输入导管80、第二输入导管82和汇合流导管84。

第一输入导管80用于引入第一流体本体86，该第一流体本体86旨在形成液滴的内相的一部分。在该实例中，第一内部流体本体包含颗粒12和多个信号实体34。

第二输入导管82用于引入第二流体本体88，该第二流体本体88旨在形成液滴的内相的一部分。在该实例中，第二内部流体本体包含产生靶成分37的肿瘤细胞90的悬浮液。

第二流体本体中的细胞90的浓度有利地使得相当大比例的液滴仅含有一个细胞90，例如大于10％的液滴含有一个细胞90。

汇合流导管84允许要形成内相的两个流体本体86、88的分布。

载流体输入区域76用于输入载流体8。在所示该实例中，载流体8通过两个输入导管92进入。

汇合区域78连接载流体输入区域76和内相输入区域74。具体地，汇合区域连接汇合流导管84与载流体输入管道92。

汇合区域78能够形成初始液滴32。这里所示的汇合区域78是流体动力学聚集汇合处。流体动力学聚集汇合处的实例在图11和图12中示出。或者，初始液滴32形成于T型汇合处。

初始液滴32包括两个流体本体86、88的混合物。初始液滴32包括颗粒12和信号实体34的分散体。

至少某些初始液滴32进一步包括以单独或细胞聚集体形式的细胞90。

孵育区域79位于汇合区域78的下游。孵育区域旨在允许通过单独或细胞聚集体形式的细胞90分泌靶成分37。

有利地，芯片包含在孵育区域79中供应或交换氧气的构件。

或者，孵育在设备20外进行。

第三装置70的不同之处在于，设备20进一步包括多个分类区域94、96，和用于将液滴或液滴的一部分选择性地导向分类区域94、96的构件98。

分类区域94、96位于检测区域26的下游。导管24包含在两个输出导管102、104中的分叉部100。第一分类区域94包含旨在接收第一组液滴106的第一输出导管102。第二分类区域96包含旨在接收第二组液滴108的第二输出导管104。或者，设备20根据分选标准的数量而包含更多数量的分类区域94、96。

用于选择性地引导液滴的构件98例如能够利用磁力，将液滴6导向分类区域94、96。

或者，以电极的方式引导液滴6。

例如，通过介电电泳，通过具有电流的电聚结或通过表面声波(SAW)，将液滴导向分类区域。

用第三装置的分析方法

现在将描述根据本发明的使用第三装置70的分析方法。

提供如前所述的装置70。制备磁性颗粒12和信号实体34的悬浮液，并将其注入第一输入导管80中。

制备能够包含肿瘤细胞90的悬浮液，并注入第二输入导管82中。

提供载流体8，并注入用于载流体输入管道92中。

利用循环组件22，使流体86、88开始运动。初始液滴32形成于汇合区域78中。

该方法进一步包含孵育步骤，在该步骤期间，单个或以细胞聚集体的形式的细胞90，能够分泌、切割或释放待分析的肿瘤细胞分泌蛋白质组的靶成分37，例如肿瘤细胞分泌蛋白质组的蛋白质或肽。因此，在对细胞90(特别是当其为单细胞形式时)在一定条件和足够的时间下进行孵育，能够产生肿瘤细胞的分泌蛋白质组的至少一种靶成分37。

通常，特别是对于分析从患者的生物体液中新鲜回收的细胞，孵育步骤持续5分钟至32小时，例如约1至24小时，或2至9小时。或者，特别是对于分析解冻的细胞，孵育步骤可持续32至72小时，例如约32至48小时，例如约36小时。

孵育通常在37±1℃，5％CO₂下进行。孵育通常在缓冲液或适当的培养基存在下进行。

根据本发明的方法的一个优点是，与专利申请EP 1506407中描述的EPISPOT分析方法相比，由于根据本发明的方法的灵敏度，可以缩短孵育步骤的持续时间。由于在具有相等的孵育时间的小体积的液滴中分泌蛋白质组成分的积累，与EPISPOT方法相比，在根据本发明的方法中待检测的分泌蛋白质组成分的浓度将更高。因此，根据本发明的方法的实施更快且更灵敏。

液滴6有利地包括培养基，其用于使细胞90在液滴中保持活性三天或更长时间。通常是含有或不含有血清的用于哺乳动物细胞，特别是人细胞的培养基。

该孵育步骤在设备20的孵育区域79中进行。

或者，该步骤在设备20之外进行。

用于形成和测量聚集体的步骤与使用第一装置1所进行的分析方法相同。

该方法的不同之处在于，测量步骤之后是分析步骤。分析步骤可以根据预定标准确定组106、108中的哪一组属于液滴6，并且在测量步骤之后对于每个液滴6生成分类决定。

根据分类决定，通过引导构件98将液滴6导向分类区域94、96之一。

在图8所示的实例中，其中强荧光强度的信号大部分位于聚集体10附近的液滴106被引导到第一分类区域94中。第一组液滴106例如对应于图2的第三液滴56。

这些液滴106包含例如肿瘤细胞90，其是唯一的或呈肿瘤细胞聚集体的形式，其中分泌蛋白质组包含靶成分37。可选地回收液滴106以使其含量，并且特别地，其中包含的肿瘤细胞可以通过其他技术进行分析，或者使肿瘤细胞90(单个或以肿瘤细胞聚集体的形式)放回培养物中。

导向液滴108到另一分类区域96，在液滴108中，测量了不同信号，特别是液滴108上的基本均匀的信号。第二组液滴108例如包括不含任何细胞90的液滴，和含有未以足够的量和质量产生肿瘤细胞分泌蛋白质组的靶成分37的单个细胞90的液滴。

一旦通过肿瘤细胞的分泌蛋白质组鉴定了活肿瘤细胞90并进行分选，可以在裂解液滴和液滴重新封装活肿瘤细胞90之后进行许多后续分析，诸如，例如分析转录组(基因表达的信使RNA和microRNA)、分析基因组、分析表观基因组，或分析蛋白质组(Alix-Panabières C，Pantel K.Clinical Applications of Circulating Tumor Cells andCirculating Tumor DNA as Liquid Biopsy.Cancer Discov 2016)。

转录组分析，特别是mRNA、肿瘤细胞(尤其是CTC)的分析，可以揭示关于药物敏感性和抗性的非常重要的信息。例如，在转移性和去势抵抗性前列腺癌中，ARV7 mRNA的表达(一种截短形式的雄激素受体，其配体没有结合域，但在活性CTC中持续存在)，可以预测抗雄激素治疗的失败(包括使用恩杂鲁胺和/或阿比特龙的治疗方法)。然而，CTC表达该ARV7mRNA的患者仍然可能对紫杉烷敏感，并且在CTC中检测该ARV7剪接变体可以成为在这些患者中选择合适治疗的标志物。

微小RNA(miRNA)是基因表达的关键调节因子，已成为抗癌治疗的潜在诊断标志物和靶标。由于原位杂交技术，使得在单个细胞的规模上分析大的miRNA(例如miR-10b)成为可能。

关于基因组分析，基因内的突变编码影响靶向疗法功效的靶标下游的治疗靶标或信号传导蛋白质。例如，EGFR突变影响肺癌中的抗EGFR治疗，而KRAS突变-下游EGFR蛋白-阻断了抗EGFR治疗在结肠癌中的功效。最近，对从结肠直肠癌患者获得的数百个CTC的分析显示，KRAS突变具有强烈的患者内和患者间异质性。携带突变的KRAS基因的CTC将逃避抗EGFR治疗，并且它们的早期检测在指导患者选择治疗中可能是重要的。

在液滴中分析的细胞可以从乳液中解封。用于使乳液解封的合适方法包括加入5％v/v 1H，1H，2H，2H-全氟-1-辛醇(Sigma-Aldrich)，然后孵育1小时。通过离心分离各相(例如，300g，5分钟)，并在两相(水相和氟化相)界面收集细胞。

为了促进细胞的收集，该方法可以包括在两相之间离心之前，引入密度介于水相和氟化相之间的密度(例如1.10g/ml)的第三层。第三层通常是适于与细胞接触的渗透浓度的水溶液。合适的溶液例如通过将27.6g Nycodenz(Progen)溶解在100ml由5mM TrisHCl、3mM KCL、0.3mM CaNa₂EDTA，pH 7.5组成的溶液中来制备。然后在第三层中收获细胞，将其置于水相和氟化相的界面处，从而避免将氟化相与细胞一起取出。

本发明的优点

使用相对于液滴尺寸的小尺寸颗粒12的分散体确保了颗粒12在液滴6中的均匀分布，因此几乎确定地在每个液滴中形成显著尺寸的聚集体。

总之，该方法使得测定/定量肿瘤细胞分泌蛋白质组的成分(诸如含有单细胞或细胞聚集体的液滴中的肿瘤细胞分泌蛋白质组的蛋白质或肽)成为可能。

与Mazutis等人(Nat prot 2013)描述的测试相比，在封装了单个珠粒的情况下，细长聚集体10的形成提供了更好的信噪比和更大的动态范围。实际上，由信号实体34产生的信号将聚焦在小于相等表面积的球体的宽度上。因此，对于相同数量的重新定位的信号实体34，如图2中所示的峰的高度将高于单个珠粒的情况。

该方法可用于许多生物分析方法中。根据本发明的方法可以应用于许多类型的分泌蛋白质组成分，特别是分泌蛋白质组的蛋白质或肽。

特别地，本发明使得通过表型分析、分泌蛋白质分析和以单个或以肿瘤细胞的聚集体的形式的肿瘤细胞的分子分析以非常完整的方式实时分析癌症的液体活组织检查成为可能。

根据本发明的装置可作为技术砖集成在更复杂的设备中，尤其是集成在高流量筛选设备、芯片实验室、实验室仪器中的“即时(point of care)”仪器、机器人或其他设备中。

此外，根据本发明的方法可整合至用于诊断、药物发现、靶标发现、药物评价的复杂的程序中。

此外，根据本发明的微流体系统和根据本发明的方法可以组合或包括在其他类型的微流体组件中，或用于现有技术中已知的其它微流体功能中。

此外，本发明特别适用于与各种光学方法，特别是光学检测方法结合。

例如，该方法适用于确定分泌蛋白质组中靶成分37的存在，分泌的、盐化的或切割的靶成分37的浓度，从而确认在液滴6中产生靶成分37的肿瘤细胞的特征。

该方法还使得分选、捕获和提取具有目标特征的液滴(特别是含有单个肿瘤细胞或肿瘤细胞聚集体的液滴)成为可能。

在一个实例中，该方法包括形成夹层，其中靶成分37一方面连接到颗粒12的捕获成分36，以及另一方面连接到信号实体34，其中信号实体34是发荧光的。

在一个实例中，捕获成分36是多克隆或单克隆抗体。在一个实例中，信号实体34是多克隆或单克隆抗体。在一个实例中，靶成分37是肽或分泌蛋白质组蛋白质。

在一个实例中，捕获成分36是核酸，特别是DNA探针或适体。在一个实例中，信号实体34是核酸，特别是DNA探针。在一个实例中，靶成分37是分泌蛋白质组的核酸，特别是双链DNA、mRNA或miRNA。

在一个实例中，捕获成分36是多克隆或单克隆抗体或纳米抗体，或针对存在于膜中或附着于膜上的蛋白质或针对脂质或甾醇的适体。在一个实例中，信号实体34是多克隆或单克隆抗体。在一个实例中，靶成分37是外泌体。在另一个实例中，可以同时分析几对捕获成分36-靶成分37对或捕获成分三元组36-靶成分37-信号实体34，以检测不同性质的若干靶成分37的存在。

例如，如图13中的液滴所示，液滴可包括若干不同性质的靶成分37a、37b和若干信号实体34a、34b，其中每个能够与靶成分37a、37b之一形成复合物。聚集体10的一些颗粒12包括用于捕获第一靶成分37a的捕获成分36a，而其他颗粒包括用于捕获第二靶成分37b的另一捕获成分36b。

在一些应用中，颗粒12的聚集是可逆的。

在一些情况下，靶成分37的存在使得聚集不可逆并且在聚集组件30中形成聚集体10期间使聚集体10固结。因此聚集体10仅在含有靶成分37的液滴6中稳定预存在。在不含靶成分37的液滴中，只要粒子12不进入读取区域26，粒子12的聚集的可逆性就会溶解聚集体10。在所选择的磁化和流体的区域中，通过另一种方法而不是通过信号实体34可以形成聚集体10并且仅在存在限制根据图2的峰值采集的这种预聚集的情况下定向到包含靶成分37的液滴。

本发明特别适用于检测和/或表征从生物流体中分离的肿瘤细胞。每个细胞可以在体外释放、分泌或切割肿瘤细胞分泌蛋白质组的许多成分，特别是一定数量的蛋白质或肽，特别是用于鉴定肿瘤细胞的一种或更多种肿瘤标志物。本发明还使得研究或表征以单个或以细胞聚集体的形式存在的细胞的分泌蛋白质组成为可能，其将在表征之前或同时被鉴定为肿瘤细胞，特别是通过根据本发明的检测肿瘤细胞的方法。

肿瘤细胞例如是从血液中分离的活的循环肿瘤细胞，下文称为缩写“CTC”，或从骨髓中分离的活的弥散性肿瘤细胞中，分离的下文以首字母称为“DTC”，或来自任何其他生物流体的活肿瘤细胞，例如尿液或脑脊髓液(CSF)。

能够产生远处转移的侵袭性转移性肿瘤细胞属于本发明所应用的细胞。特别地，血流中的聚集的CTC可具有比分离的CTC高得多的转移潜力。

本发明的优点是允许分析活的CTC，并从而研究这些细胞的功能，而现有技术的技术包括在分析前分离和固定CTC。

肿瘤细胞可以是实体癌或液体癌(白血病，淋巴瘤)的癌细胞。

例如，肿瘤细胞可以从患有实体癌的患者的生物体液中分离，例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、皮肤癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌等。

肿瘤细胞特别是人或动物细胞，诸如啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、灵长类动物(例如猴子)、犬科动物(例如狗)或猫科动物(例如猫)。

有利地，细胞将在封装之前被标记。事实上，细胞可以预先标记，例如用一种或更多种针对一种或更多种膜肿瘤标志物的标记抗体(例如用荧光染料)，细胞通过检测细胞水平或细胞聚集体水平上标记的抗体发出的信号，以鉴定封装细胞或封装细胞聚集体的肿瘤性质。可以如静态模式对循环液滴执行该检测。

举例来说，靶成分可以是细胞角蛋白(诸如CK19)。

或者，靶成分可以是组织标志物，诸如乳房珠蛋白(用于乳房)、前列腺特异性抗原(PSA)或人激肽释放酶3(hK3)(用于前列腺)。

或者，靶成分可以是间充质标志物，诸如“人腺激肽释放酶”(hK2)、Her2-neu、甲状腺球蛋白、CA19-9、CA15-3ACE(血管紧张素转化酶)、CA-125、组织蛋白酶D、甲胎蛋白、S100蛋白、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、上皮生长因子(EGF)等

在一个实例中，单个肿瘤细胞90是前列腺肿瘤细胞，并且至少一个靶成分37是PSA(前列腺特异性抗原)。该标志物对前列腺癌具有特异性。接枝到颗粒10上的捕获成分36是第一抗PSA抗体。信号成分34是第二抗PSA抗体，其特别用诸如Alexa 555的荧光染料标记。该标志物对前列腺癌非常特异；其单独存在使得将细胞表征为来自前列腺癌的肿瘤细胞成为可能。

在另一个实例中，组合检测几种标志物以表征肿瘤细胞。例如，一些标志物不是特定于一种类型的癌症，但是两种不同标志物的组合存在使得识别癌症类型成为可能。适用于鉴定癌症类型的标志物组合的选择在本领域技术人员的能力范围内。

因此，VEGF标记存在于许多肿瘤细胞的分泌蛋白质组中。然而，其与其他标志物的存在使得表征癌症成为可能。同样地，单独存在FGF2标记本身不足以表征癌症。

在图13所示的实例中，因此能够分析几种类型的分泌靶成分的存在。每种夹心型免疫测定检测由单个肿瘤细胞90分泌的不同靶成分37a、37b。

因此，每个荧光信号的测量使得获得关于细胞的性质或表型的信息成为可能。优选地，信号实体36包含荧光染料。不同的荧光染料优选与不同靶成分的每个特异性结合配偶体相关，特别是与不同的肿瘤标志物相关。

因此，在特别有利的实施方案中，根据本发明的方法允许通过EPISPOT多参数荧光类型的方法检测CTC或DTC，其使用不同的抗体对和不同的荧光染料。荧光染料的例子包括绿色的Alexa488、红色的Alexa555、蓝色的Alexa350等。

通过选择具有捕获成分和信号实体的功能化粒子对，在实验的上游选择可针对单个肿瘤细胞分析的靶成分37的数量。例如，可以对超过九种不同的荧光通道执行测量。这允许例如对单个肿瘤细胞的分泌蛋白质组成分进行多于九次的同时测量。

获得肿瘤细胞

根据本发明的有利特征，检测方法包括富集生物样品中存在的CTC或DTC的准备步骤。

生物样品的细胞的富集可以基于表达在细胞表面上的标志物的表达、细胞的大小、密度或电荷。例如，可以通过白细胞消除或通过过滤从血液中分离CTC。

生物样品的细胞的富集可以例如由基于上皮细胞的膜特异性蛋白质的表达(例如，上皮细胞粘附分子(EpCAM))的细胞阳性分选，或者，由基于不需要的造血细胞表面上特异性标志物的表达(例如CD45、CD4、CD8、CD19、CD56)的细胞阴性分选组成。

可以通过使用膜过滤器根据它们的大小对细胞进行分选，所述膜过滤器将保留大细胞并使较小尺寸的造血细胞通过。可以通过在特定梯度上离心根据它们的密度对细胞进行分选。

可以通过介电电泳根据它们的电荷对细胞进行分选，因为通过使用介电电泳，CTC/DTC具有与造血细胞不同的电荷。

用于获得本领域技术人员已知的活细胞的任何其他富集方法都适用于本发明的目的。因此，其将是一种不实施CTC/DTC固定或透化以维持其功能的方法(Alix-Panabièresand Pantel，Expert Rev Mol Diagn 2015；15(11)：1411-7)。

在富集步骤后获得的细胞也可以被鉴定为在液滴中是肿瘤的。根据一个实施方案，富集的细胞用针对一种或更多种肿瘤细胞表面标志物的标记抗体(特别是通过荧光)标记。然后肿瘤细胞通过其膜被标记，特别是通过荧光标记。举例来说，可以用下述抗体标记细胞：(1)抗-EpCAM荧光抗体和/或抗-E-钙粘蛋白荧光抗体标记细胞以检测细胞表面上EpCAM和/或E-钙粘蛋白的表达，以便鉴定任何上皮细胞，和/或(2)荧光抗PSMA抗体(前列腺特异性膜抗原)以鉴定前列腺的肿瘤细胞，和/或(3)抗荧光抗N-钙黏蛋白以鉴定经历上皮-间质转化(EMT)的间充质细胞，和/或(4)靶向新标志物丝束蛋白3的抗丝束蛋白3抗体，其在EMT期间没有低表达，并且允许检测上皮细胞和间充质肿瘤细胞，该步骤先于样品细胞的封装，并且可以确定CTC或DTC的表型。

本发明是特别有利的，因为在理论上，液滴的数量不受限制并且可以在实践中达到，例如，高达100,000，甚至高达1,000,000个液滴。因此可以使液滴不包含细胞或非富集细胞。如果封装的细胞不是肿瘤的，则信号将是不同的并且可以丢弃液滴。因此，该系统可以改进纯化。因此，其适用于不富含CTC的生物样品。

这对于检测血液中的罕见肿瘤细胞(诸如CTC)特别有利。

实施例

现在将描述上述方法的应用实施例。

以下实施例的程序包括：

-制备若干水性溶液，这些水溶液含有颗粒12、信号实体34和靶成分，或有利地含有能够在液滴中产生、释放或切割靶成分的细胞，

-在液滴生成芯片的入口处注入该水性溶液，

-产生包括所有测试试剂的液滴，

-孵育含有这些液滴的溶液，

-将这些液滴注入根据本发明的装置中(实施例1和2分别对应于第一装置1或第二装置60)，

-测量测试结果，

-可选地，根据测量分选出液滴。

实施例1：用于产生液滴并测量1型液滴的装置

在将试剂溶液和芯片上的样品溶液混合之后，实现液滴的生产，或称为区室化。

将溶液保持在冰中直到进行区室化，以避免试剂和样品发生任何降解。

就在开始区室化之前，将试剂溶液吸入到与填充有矿物油的1mL Hamilton注射器(Sigma Aldrich，#330760)连接的罐中。

待筛选的样品在区室化前与工作溶液混合，然后转移到预先装有氟化油(3M，NOVEC HFE-7500)的玻璃小瓶中，并将小瓶在冰上保持在4℃。

毛细管，有利地是内径为0.3mm的PTFE(由Fischer出售，#11919445)，可以将试剂溶液的小瓶和罐连接到用于形成液滴的设备。

这两种溶液都注入到用于形成液滴的芯片上，这可以产生液滴，该液滴包括相同体积的两种溶液中的每一种。

液滴的体积由使用者根据氟化油的流速来选择。有利地，液滴的体积为33皮升。氟化油是载流体8。它形成含液滴的乳液连续相。

将试验试剂溶液和待筛选的试验样品溶液以相同的流速注射到芯片中，各溶液有利地以200微升/小时的流速注射。通过标准注射泵系统(例如Cetoni的泵neMESYS)或通过控制压力的泵(例如由Fluigent销售的系统)，来施用流速。

如图11和图12所示，液滴在流体动力学聚集汇合处产生。在此处，外相是氟化油(3M，NOVEC HFE-7500)，在其中添加有重量/体积为2％的表面活性剂(例如包含两个全氟聚醚(PFPE)尾部(分子量约为6000g/mol)和PEG头部(约600g/mol)的三嵌段共聚物)。

图11和图12代表流动聚集设备，其可以在右侧的流体动力学聚集汇合处形成液滴之前，混合含磁珠的流与含样品的流，其中在含磁珠的流中，磁珠与其它试剂混合。在图11中，磁性颗粒直径的测量值为500nm，而在图12中，磁性颗粒直径的测量值为200nm。

第二步是收集阶段。小瓶允许液滴的收集，该小瓶在磁场下保持为4℃，磁场有利地由环形磁体(Amazing magnet H250H-DM)产生。短的毛细管可以将小瓶连接到芯片。理想情况下，输出毛细管测量值小于20厘米，有利地小于10厘米。

将液滴设置为有利地在37℃下孵育20至90分钟并处于磁场中，时间和孵育温度取决于所进行的分析，以及所研究的生产实体90的类型和靶成分37的类型。

孵育后，在4℃下转移含有乳液的小瓶，且始终保持在磁场中。

第一种类型的设备是如图1所述的根据本发明的设备。

含有液滴的小瓶连接到用于再注射的芯片，小瓶一方面连接到芯片，另一方面连接到压力系统、压力泵或注射器，其中它的泵构成循环组件22。

间隔组件31包括与芯片连接的两个油入口。这些入口旨在注入油，有利地注入氟化油，从而可以如图9所示，将乳液的液滴间隔开。

有利地，间隔开的油的流速各自设定为300微升/小时，循环组件的流速有利地设定为50微升/小时，并且可以调整液滴的流速和再注射频率，以便获得包括在250Hz和1000Hz之间的频率。

将有利地由K&J Magnetics，#BC 14-N52提供的永磁体对38放置在芯片两侧主通道24的周围。这些磁体38旨在在液滴的再注入期间产生和定向珠粒聚集体。

生成用于控制装备，例如激光器或光电倍增管的软件，用于分析和分选出液滴。分选系统需要用于进行实时信号分析的FPGA卡。

在液滴进入间隔组件之后逐个进行液滴测量，并且在经过图10所示的读取区域之后，这些液滴可被分选至期望的出口。

在分选和回收是期望的时，被分选出来的液滴和未被分选出来的乳液收集在冰上，并且按照标准程序回收液滴的内容物。

实施例2：用于测量2型液滴(第二装置60)的装置

第二类型的测量装置是用于存储在二维平面中产生的液滴的腔室。本实施例有两个可能的替代选择来制造该腔室。

第一选择是以常规的PDMS微制造制成的腔室，如图4～图7所示，其有利地包括以规则的方式定位的柱形物以避免腔室的塌陷。

第二选择是根据发明PCT/FR2009/051396的玻璃腔室。有利地，该方式可以在不使液滴变形的情况下长时间(＞1H)孵育液滴。因此，在液滴形成后，可以将其直接收集在该腔室中。

在一个实例中，测量装置是二维读取装置，例如在玻璃腔室中。磁场由一对永磁体38产生，永磁体38优选由K&J Magnetics，#BY042提供，放置在储藏腔室的两侧。这些永磁体38用于产生和引导存储在腔室中的液滴中的珠粒聚集体。

通过荧光显微镜测量重新定位到磁珠线的信号实体34的荧光信号。

实施例3：1型测量设备中肿瘤标志物的定量

该实施例的目的是证明肿瘤标志物的定量。

在该实施例中，靶成分37是肿瘤标志物，且更具体地，血管上皮生长因子(VEGF)血管生成标志物已经包含在待筛选的溶液中，该实施例不对细胞进行实施。

在该实施例中，液滴测量33皮升。

液滴的制备包括：

-制备在以下实施例中被称为“试剂溶液”和“待筛选的样品溶液”的两种水性溶液，其中“试剂溶液”含有颗粒12、信号实体34，而“待筛选的样品溶液”含有靶成分，

-在芯片入口处注入两种水性溶液，用于产生液滴，

-产生这些液滴，这些液滴包括相同体积的两种溶液中的每一种，

-在1型设备中测量这些液滴。

试剂溶液包含：

-这里是胶体磁性颗粒的颗粒12(诸如与链霉亲和素偶联的颗粒(例如，Ademtech链霉亲和素附加颗粒))，其用捕获成分36(例如与生物素偶联的VEGF特异性抗体(例如抗体)Ref500-P10GBt，Peprotech)功能化。其他固定方法是可能的并且是本领域技术人员已知的，诸如使用例如羧基和1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)颗粒，

-信号实体34，其在此是针对用荧光分子功能化的VEGF的抗体(诸如用AlexaFluor 647的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)等官能化的贝伐单抗(由蒙彼利埃大学医院提供))。荧光团或功能化方法的其他组合是可能的；和

-用于检测液滴6的染料(例如磺酰罗丹明B)。

将这些试剂稀释在称为“工作溶液”的溶液中。工作溶液包括：

-RPMI 1640(Eurobio，RefCM1RPM00-01)，

-L-谷氨酰胺200mM/100X(Eurobio，RefCSTGLU00)：最终1％，

-胰岛素-转移蛋白-硒(ITS)100X(GIBCO，Ref51300-044)：最终1％，

-去补体胎牛血清10％(Eurobio，RefCVFSVF00-01)、EGF人(表皮生长因子)-Miltenyi(Ref 130093564)：最终20ng/mL，

-bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)-Miltneyi(Ref 130097750)：最终10ng/mL，

-抗生素(青霉素G 10,000IU/500mL+庆大霉素1mg/500mL)，

-pH 7.4的25mM HEPES缓冲液，

-Life Technologies提供的0.1％v/v普朗尼克F-68。

在使用前，处理磁性胶体颗粒12。颗粒12是由Chemicell(ScreenMAG)或Ademtech(Bio Adembeads)以储存溶液形式提供的颗粒。有利地，链霉亲和素(或类似物)已经由供应商(例如，Ademtech链霉亲和素附加珠粒)固定在颗粒上。将其保留在磁性介质上以除去储存溶液，然后将其悬浮在10％w/w(ThermoFisher)的过量普朗尼克F-127中，有利地是初始体积的10x，并孵育在4℃的超声波浴中15分钟。

在该处理之后，将磁性胶体颗粒12在PBS中洗涤两次并悬浮在工作溶液中。在该溶液中，过量加入生物素化形式的捕获分子1小时(室温)。

有利地，将颗粒12洗涤两次并悬浮在工作溶液中。

荧光试剂在使用前至少在12,000g和4℃下离心5分钟以除去试剂聚集物的痕迹。

待筛选的样品溶液包括：

-靶成分37(这里是VEGF)，能够被捕获成分36捕获；和

-工作溶液。

筛选含有以工作溶液稀释的不同浓度的靶成分37(VEGF)(例如，由Genscript提供)的样品溶液(参见上文)。

待筛选的样品溶液中的靶成分37(VEGF)的浓度为0nM、5nM、20nM或50nM。

试剂溶液含有以下试剂：

-用捕获成分36功能化的0.16％w/v磁性颗粒，这里是如上所述的VEGF特异性抗体，

-50nM合适的信号实体34，这里是与荧光分子偶联的另一种特异性VEGF抗体，

-1μM磺酰罗丹明B(用于标记液滴)。

该溶液由工作溶液完成(参见上文)。

这使得分别获得具有0nM、2.5nM、10nM或25nM靶成分37(VEGF)的四种不同乳液成为可能。

然后通过测量信号实体34的荧光团荧光(诸如Alexafluor488或647)的1型设备分析液滴。

实施例4：在1型测量设备中同时定量两种肿瘤标志物

该实施例的目的是同时证明两个信号实体(两个肿瘤标志物)的定量。该实施例在各方面与实施例3类似，不同之处在于同时测量两个不同的靶成分37。两个靶标实体是肿瘤标志物VEGF和CK19(细胞角蛋白19)。

试剂溶液包含：

-颗粒12，其为胶体磁性颗粒，用两种捕获成分36功能化，这里是特异性VEGF抗体(Ref 500-P10GBt，Peprotech)和特异性CK19抗体(Progen KS19.2)，其通过适当的方法(诸如生物素-链霉亲和素对)固定在颗粒上，

-第一信号实体34，其在此是用合适的荧光团荧光标记的特异性VEGF抗体(诸如贝伐单抗与AlexaFluor647的偶联)，

-第二信号实体34，其在此是由荧光团Alexa Fluor 488荧光标记的特异性CK19抗体(诸如(Progen KS19.1))，

-允许检测液滴6的染料(诸如磺酰罗丹明B)。

将这些试剂稀释在称为工作溶液的溶液中，该溶液与实施例2中使用的相同。

待筛选的样品溶液包括：

-第一靶成分37，这里是VEGF，能够被第一捕获成分36捕获，

-第二靶成分37，这里是CK19，用于被第二捕获成分36捕获，

-工作溶液。

待筛选的样品溶液含有不同浓度的第一靶成分37(VEGF)(例如由Genscript提供)，而第二靶成分37(CK19)，(例如由MyBioSource提供)稀释工作溶液(参见上文)。

待筛选的样品溶液中第一靶成分37(VEGF)的浓度如下：0nM、2.5nM、10nM或25nM。待筛选的样品溶液中第二靶成分37(CK19)的浓度为0nM、2.5nM、10nM或25nM。制备两种靶成分的总共16种浓度组合。

借助于1型装置分析液滴，同时测量两个信号实体34上的荧光团(诸如AlexaFluor488和647)的荧光。

实施例5：在1型测量设备中单细胞规模上分泌的肿瘤标志物的定量

该实施例的目的是证明检测和定量在单细胞水平分泌的肿瘤标志物的可能性。该实施例在所有方面与实施例3相似，不同之处在于在培养阶段期间靶成分37(VEGF)由液滴中的生产实体90(细胞)分泌。细胞是结肠癌CTC系(在LCCRH实验室中获得的CTC-MCC-41.4)，或富含CTC的结肠癌患者的细胞群。在第二种情况下，通过白细胞耗尽，使用RosetteSep方案(StemCell技术程序)富集CTC。

使用RosetteSep技术的CTC浓缩方案如下：

-将血液(15mL)从EDTA管转移到50mL falcon管中；

-每mL全血加入20μl Rosette StemCell(人循环上皮肿瘤细胞富集-参考15167)；

-在MACS混合物上混合并缓慢转动至少20分钟；

-根据供应商建议的血液量，将适当体积的Ficoll(淋巴细胞分离培养基)放入falcon管中；

-用1/2PBS 1x/2％SVF稀释血液；

-将溶液[血液+玫瑰花结+PBS]轻轻地沉积在Ficoll的表面上，并在没有制动的情况下以1200g离心20分钟。

-用细胞环(要找到循环肿瘤细胞的地方)恢复Ficoll的所有上部；

-用PBS/SVF 2％qs 50ml洗涤2次。

获得的细胞沉淀含有循环肿瘤细胞，并且可以用于根据本发明的单细胞EPISPOT。

待筛选的样品溶液含有悬浮在实施例3中所述的工作溶液中的细胞。有利地，每个液滴的细胞浓度为每个液滴0.3个细胞。如此处的，具有33皮升的液滴的乳液每毫升含有超过30×10⁶个液滴。为了具有每滴含有0.3个细胞，在待筛选的样品溶液中取走约每毫升18×10⁶个细胞(其相对于液滴浓缩两次)。应当注意，待筛选的样品溶液中的细胞浓度是最终浓度的两倍，因为两种水溶液将以50/50的比例混合在液滴中。

实施例6：在1型测量设备中单细胞规模上同时分泌的两种肿瘤标志物的定量

该实施例的目的是证明同时检测和定量在单细胞水平分泌的两种肿瘤标志物的可能性。该实施例在各方面与实施例5类似，不同之处在于同时测量两个不同的靶成分37。两种靶成分是肿瘤标志物VEGF和CK19，其如实施例4中所述进行测量。

实施例7：根据分泌的肿瘤标志物分选细胞

该实验的目的是证明根据分泌的肿瘤标志物筛选细胞。该实施例在各方面与实施例5相似，不同之处在于如Baret等人所述，通过“荧光激活介电电泳”(FADS)对具有对应于信号实体34上荧光团荧光的大荧光信号的液滴进行分选(Lab Chip 2009，9，1850-1858)。如Mazutis等人所述，将分选和收集的液滴破碎并回收细胞(Nat Prot 2013，8，870-891)。

实施例8：根据两种分泌的肿瘤标志物分选细胞

该实验的目的是证明根据两种分泌的肿瘤标志物筛选细胞。该实施例在所有方面与实施例7类似，不同之处在于同时测量两个不同的靶成分37。两个靶成分37是肿瘤标志物VEGF和CK19，其如实施例4中那样测量。具有对应于荧光团的荧光(诸如第一信号实体34上的Alexafluor488，以及第二信号实体34上的Alexafluor647)的大荧光信号的液滴，如Baret等人所述，通过“荧光激活的介电电泳”(FADS)对信号实体34进行分选(Lab Chip2009，9，1850-1858)。如Mazutis等人所述，将分选和收集的液滴破碎并回收细胞(Nat Prot2013)。

实施例9：2型测量设备(第二装置60)中肿瘤标志物的定量

该实施例的目的是证明2型设备中肿瘤标志物的定量，即其中液滴以二维单层分布在腔室中。该实施例在各方面与实施例3类似，不同之处在于液滴测量为40皮升，并且在类型2测量设备中进行分析。在两个载玻片之间产生38μm高的腔室。在上玻璃滑块中制造入口和出口，并分别设置有用于连接毛细管连接的标准连接器。

实施例10：在2型测量设备(第二装置60)中同时定量两种肿瘤标志物

该实施例的目的是在2型设备中同时证明两种信号实体(两种肿瘤标志物)的定量。该实施例在各方面与实施例4相似，不同之处在于液滴测量为40皮升，并且在类型2测量设备中进行分析，如实施例9中所述。

实施例11：2型仪表(第二装置60)中单细胞规模上分泌的肿瘤标志物的动力学和定量测量

该实施例的目的是证明在2型设备中单细胞规模上分泌的肿瘤标志物的动力学和定量测量。该实施例在各方面与实施例5类似，不同之处在于液滴测量40皮升，并且在类型2测量装置中进行分析，如实施例9中所述。在单细胞的规模上，通过测量磁珠线上重新定位的信号实体34荧光信号的演变，可以确定靶成分37(VEGF肿瘤标志物)的分泌速率。

实施例12：在2型测量设备(第二装置60)中单细胞规模上同时分泌的两种肿瘤标志物的动力学和定量测量

该实施例的目的是证明在2型设备中单细胞规模上两个同时分泌的肿瘤标志物的动力学和定量测量。该实施例在所有方面与实施例6类似，不同之处在于液滴测量40皮升，并且在类型2测量设备中进行分析，如实施例9中那样，除了同时测量两个不同的靶成分37。两个靶标实体是肿瘤标志物VEGF和CK19，其如实施例10中所述进行检测。

在单细胞水平上，通过测量重新定位在磁珠线上的两个信号实体34的荧光信号的演变，可以确定两个靶成分37(VEGF和CK19肿瘤标志物)的分泌速率。

执行实施例

图14说明了1型设备中肿瘤标志物的定量。该图显示了测量绿色荧光的通道获得的峰强度值。液滴包含用生物素化的抗PSA抗体包被的珠粒。将珠粒对齐以形成柱子。使用25nM PSA，将第二抗PSA抗体的荧光重新定位到磁珠柱，这增加了强度峰值(n＝200,000)。误差柱显示标准偏差。对含有LnCAP细胞的液滴进行相同的测量，所述LnCAP细胞已在37℃下在液滴中孵育1小时。LnCAP是源自来自人前列腺癌的上皮细胞系的细胞。

图15显示了1型设备中液滴的分选。该图显示了在1型设备中测量PSA分泌细胞的可能性。由于它们的液滴代码不同，可以区分三种不同的液滴群。(对应于标志物磺酰罗丹明B的荧光沿横坐标轴表示)。从左到右，观察待分选细胞的乳液，即阳性对照和阴性对照。在纵坐标轴上显示的荧光通道中，示出了抗PSA在珠粒柱上的重新定位。包含在黑色矩形中的液滴是用于PSA分泌并含有细胞的阳性液滴。

图16显示了1型设备中液滴的分选。该图显示了从含有细胞的液滴乳液中分选EpCAM阳性液滴的选择窗口。载量约为5％。这显示了选择窗口中EpCAM阳性与细胞载量之间的良好相关性。纵轴表示在液滴内测量的最大值(即对应于该细胞的峰值)。x轴表示峰值下信号的积分。

图17-20示出了基于1型设备中的两个标准的分选。图17显示了用于分选EpCAM阳性细胞的“门5”选择窗口。图18显示了用于PSA分泌细胞的“门6”选择窗口。要选择，必须满足两个标准，即所选择的液滴对应于具有“门5”和“门6”窗口中的测量值的液滴。

图19和20的图像表示根据两个标准成功分选的液滴：PSA的分泌(图19)和EpCAM的表达(图20)。还分选了空液滴(阴性对照)以促进目标液滴转移到显示腔室中。从具有0.2％目标液滴的乳液开始，获得20％的目标液滴富集。通过计数保留用于液滴转移的阴性对照液滴，获得约99％的有效液滴转移。

图21至23示出了2型设备中肿瘤标志物的定量。图21(在明视野中)和22(在荧光通道中)显示LNCAP细胞分泌PSA。将这些细胞在液滴中孵育1小时，PSA的分泌引起荧光在柱状粒子聚集体上的重新定位。

图23显示了用于从液滴表获得的PSA定量的校准曲线。该曲线具有通常在非洗涤免疫测定实验中观察到的形状。在蛋白质与珠粒结合的突然增加阶段(高达60nM)之后，由于珠粒上的饱和以及游离PSA浓度的增加，荧光重新定位减少。数据以平均值的平均和误差类型表示(SEM)。

该校准曲线由在不同浓度具有两种相应抗体的可溶形式的PSA蛋白制成。调节试剂、珠粒和检测剂的浓度，使PSA容量约为70nM。该系统对低于70nM的最低浓度非常敏感。确定白色极限(对应于空滴中预期的最强信号)是1.047。该值必须与浓度为0nM时获得的平均值1.031进行比较。检测限(即最小可区分的背景量)是2.5nM PSA，对应于仅60,000个分子。通过将细胞孵育一小时，可以检测到每秒分泌超过16个分子的所有细胞。通过将孵育时间延长至2小时，该限制可以减少至每秒分泌8个分子的细胞等。文献中报道的其他分子的分泌率可以在每秒10至10,000个分子之间变化，这取决于细胞类型和分泌的部分。这表明获得的数量级是令人满意的。

此外，校准曲线显示在较高浓度下信号增加。例如，在约500nM的PSA下，信号可以与背景噪声显着区分。这对于实验开发是有利的，因为甚至可以检测具有非常高的分泌水平的细胞。

图24和25示出了2型设备中肿瘤标志物的定量。图24(在明场中)和25(在荧光通道中)代表SK-BR-3细胞分泌蛋白质CK19。SK-BR-3是源自人乳腺癌肿瘤的细胞系。

CK19通常是整合到细胞膜中的蛋白质。然而，其可以分离并重新定位到细长聚集体上。

源自人前列腺癌(LnCAP)的上皮细胞系用于实验以观察PSA的细胞分泌。

发现温度是一个重要因素，因为蛋白质分泌只能在生理温度附近观察到，而不是在较低温度(诸如25℃)下观察到。在较低温度下，重新定位到细胞而不是颗粒的信号，表明PSA与膜结合或发生类似现象。

LnCAP系的细胞进一步用于确定这些细胞的PSA分泌百分比。考虑到文献和以往的经验，知道并非所有的细胞都能连续产生PSA。该实验背后的想法是收集在LnCAP群体中分泌PSA的细胞百分比。该实验在37℃下进行，并且分泌信号在0、30和60分钟测量。

下表代表使用LnCAP细胞作为模型的PSA分泌实验的条件和结果。

37℃下的孵育时间(分钟)	0	30	60
				液滴数	5860	6352	5745
细胞数	53	57	52

在细长聚集体上的荧光重新定位	0	16	27
				在细胞上的荧光重新定位	19	11	6
未发现重新定位	34	30	19
				分泌标志物的细胞％	0	27.9	52.25
重新定位至细胞的抗体％	36	19.2	11.6

在0分钟时，在延伸的聚集体水平上未发现荧光重新定位。然而，注意到检测剂重新定位在一些细胞的膜上。这种现象可能与培养条件和室温离心有关。对30分钟或60分钟的测量结果进行了相同的观察，但是在膜上重新定位检测剂的细胞数量稳定下降，而分泌标志物的细胞百分比增加。

因此，可以分析单独封装的LnCAP细胞的分泌模式。

图26说明了2型设备中分泌的标志物的动力学测量。图26显示了用液滴封装1小时然后以10分钟间隔测量的各个LnCAP细胞的PSA分泌模式。

这里，显示了单个细胞的分泌速率是变化的，尽管已经发现其他细胞系的类似分布。还表明，分泌遵循突然的动力学而非常规释放。

观察到一些细胞分泌超过800个PSA分子，而大多数细胞分泌极少的PSA分子(每个细胞约10个分子)或根本没有(这些细胞未显示)。

为了模拟血液中循环肿瘤细胞(CTC)的检测，将LnCAP细胞与Jurkat细胞混合。Jurkat细胞来自人淋巴细胞T的永生化系。两种细胞系在含有10％FBS的RPMI培养基中培养并封装在液滴中。这些实验表明，实际上可以检测少量细胞。在Jurkat细胞中进行了不同浓度的LnCAP的实验。具有荧光标记的细胞的大小用于检测。

下表显示了实验结果。

初步研究表明，LnCAP的最低检测值可能为0.0001。

构建该实验以检测液滴中的PSA并显示LnCAP细胞以可检测的水平分泌PSA。实验显示了人工混合有其他细胞的细胞的检测灵敏度。

Claims

1.检测和/或表征肿瘤细胞(90)的方法，包括：

-提供包含于载流体(8)中的多个液滴(6)，至少一个所述液滴(6)包括颗粒(12)的至少一个聚集体(10)，所述聚集体限定了沿主轴线(X)的细长物体，至少一些液滴(6)包含能够产生肿瘤细胞的分泌蛋白质组的至少一种靶成分的细胞(90)，所述靶成分能够固定在所述聚集体上；

-测量至少一个物理参数，所述物理参数表征肿瘤细胞的所述分泌蛋白质组的靶成分(37)在所述聚集体(10)上的固定；和

-由所述至少一个物理参数的所述测量，检测和/或表征肿瘤细胞(90)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是用于检测和/或表征单个肿瘤细胞的方法，包括：

-提供包含于载流体(8)中的多个液滴(6)，至少一个所述液滴(6)包括颗粒(12)的至少一个聚集体(10)，所述聚集体限定了沿主轴线(X)的细长物体，至少一些所述液滴(6)包含单个细胞(90)；

-在足以使所述单个细胞(90)能够产生能固定于在所述聚集体(10)上的肿瘤细胞的所述分泌蛋白质组的至少一种靶成分(37)的条件和时间下孵育含有单个细胞(90)的液滴(6)；

-测量至少一个物理参数，每个物理参数表征来自肿瘤细胞的所述分泌蛋白质组的不同靶成分(37)在所述聚集体(10)上的固定；和

-由所述至少一个物理参数的所述测量，检测和/或表征单个肿瘤细胞(90)。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞(90)源自生物体液，并且选自由循环肿瘤细胞(CTC)和弥散性肿瘤细胞(DTC)组成的组。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述测量步骤包括在所述液滴(6)中的多个点处局部地测量所述至少一个物理参数，其中，所述测量步骤优选地包括确定液滴(6)内所测量的值的积分。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述测量步骤在没有所述液滴的循环的微流体室中进行。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括：

-提供包括用于使所述液滴置于循环的组件(22)和多个分类区域(94、96)的设备，以及用于选择性地将所述液滴或所述液滴的一部分导向分类区域(94、96)的构件(98)，

-决定对所述液滴(6)或所述液滴的一部分的分类，所述决定包括选择性地选择多个分类区域(94、96)中的一个，

-分别将所述液滴(6)，或所述液滴的一部分输送到在所述决定步骤中所选择的所述液滴(6)的所述分类区域。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少一个液滴包含至少两个不同的信号实体(34)，其中，所述两个信号实体(34)中的每一个能够在聚集体(10)上与不同的靶成分(37)形成复合物，其中，所述方法包括测量表示每个重新定位的信号实体(34)的浓度的信号。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，至少一些液滴(6)包含能够分泌、切割或释放所述肿瘤细胞分泌蛋白质组的一种或更多种成分的肿瘤细胞，其中，所述肿瘤细胞分泌蛋白质组的每个成分是不同的靶成分(37)，其中，所述信号的测量表示每个重新定位的所述信号实体(34)的浓度，从而允许所述肿瘤细胞分泌蛋白质组的所述成分的定量。

9.用于检测和/或表征肿瘤细胞(90)的装置，包括：

-用于提供包含于载流体(8)中的多个液滴(6)的组件，其中，至少一个所述液滴(6)包括颗粒(12)的至少一个聚集体(10)，所述聚集体限定了沿主轴线(X)的细长物体，其中，至少一些液滴(6)包含能够产生靶成分(37)的肿瘤细胞(90)，所述靶成分能够固定在所述聚集体(10)上，

其特征在于，所述装置包括用于测量物理参数的组件，所述物理参数表征靶成分(37)在所述聚集体(10)上的固定，

其中，所述装置可选地另外包括：

-用于使所述液滴置于循环的组件(22)，

-用于所述液滴的分类决定的组件，

-根据所述分类决定对所述液滴进行分选的组件。

10.用于检测和/或表征肿瘤细胞(90)的液滴，包括能够形成颗粒(12)的聚集体(10)的多个颗粒，所述聚集体限定了延主轴线(X)的细长物体，以及肿瘤细胞(90)，以及可选的旨在被固定在所述聚集体(10)上的所述肿瘤细胞(90)的分泌蛋白质组的至少一种靶成分(37)。

11.制备用于检测和/或表征肿瘤细胞的液滴(6)的方法，包括：

-在旨在形成液滴(6)的流体本体(86)中，分散颗粒(12)盒多个细胞(90)，所述颗粒能够形成聚集体(10)，所述聚集体限定了沿主轴线(X)的细长物体，其中，至少一些细胞(90)是能够产生肿瘤细胞的分泌蛋白质组的靶成分(37)的肿瘤细胞，然后

-以所述液滴(32)的形式分散所述流体本体(86)，使得每个液滴包括多个颗粒(12)，而至少一些所述液滴(6)另外包括细胞(90)，以及

-可选地在每个液滴(6)中形成至少一个颗粒(12)的聚集体(10)，所述聚集体限定了沿主轴线(X)的细长物体，其中，所述颗粒(12)的聚集体(10)在所述分散后形成在每个液滴(6)中。