CN110178034A - 用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法和试剂 - Google Patents
用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法和试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110178034A CN110178034A CN201780083652.8A CN201780083652A CN110178034A CN 110178034 A CN110178034 A CN 110178034A CN 201780083652 A CN201780083652 A CN 201780083652A CN 110178034 A CN110178034 A CN 110178034A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igg
- target
- reagent
- cell
- capture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 274
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 174
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 172
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 145
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 145
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 110
- 239000011049 pearl Substances 0.000 claims description 104
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 90
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 87
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 83
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 56
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 34
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 25
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 21
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 13
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 13
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 13
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 9
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 8
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 claims description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 7
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 claims description 4
- 241001481798 Stochomys longicaudatus Species 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 2
- 230000000676 anti-immunogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 78
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 26
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 8
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 6
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 6
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 4
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 101000672034 Bacillus sp. (strain GL1) Unsaturated glucuronyl hydrolase Proteins 0.000 description 3
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 3
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 3
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 3
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 3
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 3
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 3
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 3
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 3
- 230000005408 paramagnetism Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 4,6-dichlorotriazine Chemical compound ClC1=CC(Cl)=NN=N1 IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 210000000776 antibody secreting cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013528 metallic particle Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 2-[(E)-N-[2-(4-chlorophenoxy)propoxy]-C-propylcarbonimidoyl]-3-hydroxy-5-(thian-3-yl)cyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCC\C(=N/OCC(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1)C1=C(O)CC(CC1=O)C1CCCSC1 KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000689231 Aeromonas salmonicida S-layer protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101000748795 Thermus thermophilus (strain ATCC 27634 / DSM 579 / HB8) Cytochrome c oxidase polypeptide I+III Proteins 0.000 description 1
- ZMJPCIAEJKVKMQ-UHFFFAOYSA-M [4-[[4-[benzyl(methyl)amino]phenyl]-[4-(dimethylamino)phenyl]methylidene]cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-dimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)N(C)CC=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 ZMJPCIAEJKVKMQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003918 blood extract Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004801 process automation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/686—Anti-idiotype
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本文公开了用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度以及用于分析IgG抗体产生用的多个细胞样品的方法和试剂。
Description
交叉引用
本申请要求于2017年1月18日提交的美国临时专利申请序列号62/447772的优先权,该临时专利申请通过引用整体并入本文。
背景技术
蛋白质生物制剂是增长最快的治疗方式。这些药物通常是蛋白质(即IgG)分子,其被施用于患者并改变疾病中涉及的特定生理过程。用于蛋白质生物制剂的商业制造工艺是一个漫长、昂贵且艰巨的过程。这是因为大多数蛋白质生物制剂是在细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等活细胞系中生产的。这些细胞系通常是经基因工程改造以产生并分泌感兴趣的蛋白质生物制剂至细胞外环境(细胞培养上清液)中。一旦生物制剂被分泌,其就被收获并纯化用于商业应用。由于这一过程的成本昂贵,需要设计生产细胞系以便其产生非常高水平的目的蛋白质。
发明内容
一方面,提供了用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法,包括:
(a)在微量滴定板中的多个孔中,将含有IgG抗体的生物样品与检测试剂一起温育,其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白或其片段与其所述IgG抗体均匀混合的时间和条件下发生,以在所述多个孔的每个孔中产生IgG抗体-靶IgG蛋白混合物;
(b)将所述多个孔的每个孔中的所述IgG抗体-靶IgG蛋白混合物与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合,其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白或其片段和所述IgG抗体结合至所述IgG同种型特异性捕获试剂群的时间和条件下进行,以产生IgG同种型特异性结合复合物;以及
(c)检测来自所述IgG同种型特异性结合复合物的信号,以确定所述生物样品中存在的一种或多种IgG抗体同种型的浓度,其中所述生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与从相关IgG同种型特异性结合复合物中检测到的所述信号成反比。
在一个实施方案中,该方法还包括
(d)温育对照样品的系列稀释液和所述检测试剂以产生对照混合物,其中所述对照样品的所述系列稀释液的每种稀释液存在于微量滴定板的单独孔中,其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育发生在促进所述对照样品中所述未标记的IgG蛋白同种型和一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段混合的时间和条件下;
(e)将所述对照混合物与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段和所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获珠群竞争性结合的时间和条件下进行,以产生对照IgG同种型特异性结合复合物;以及
(f)通过分析来自所述IgG同种型特异性结合复合物的所述信号产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中每种生物样品中的一种或多种IgG抗体同种型的浓度通过参考所述每种IgG蛋白同种型的标准曲线来测量。
在另一方面,提供了用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)同种型抗体浓度的方法,包括:
(a)在微量滴定板中的多个孔中,将表达IgG抗体的多个生物样品与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合;其中所述温育在促进所述IgG抗体与所述IgG同种型特异性捕获试剂的结合的时间和条件下进行,以产生IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物;
(b)将所述IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物与检测试剂一起温育,其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂复合物上的未占据位点结合的时间和条件下发生,以产生可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物;
(c)在所述可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物上检测来自所述可检测标记的靶IgG蛋白的信号,以确定一种或多种IgG抗体同种型的浓度,其中存在于所述生物样品中的IgG抗体同种型蛋白的量与检测到的信号成反比。
在一个实施方案中,该方法还包括
(d)温育对照样品的系列稀释液与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群以产生对照混合物,其中所述对照样品的所述系列稀释液的每个稀释液存在于微量滴定板的单独孔中,其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型与所述IgG同种型特异性捕获试剂结合的时间和条件下进行,以产生对照复合物;
(e)将所述对照复合物与所述检测试剂一起温育,其中所述温育在促进一种或多种可检测标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂上的未占据位点的结合的时间和条件下进行;并且
(f)通过分析来自与所述IgG同种型特异性捕获试剂群结合的可检测标记的IgG同种型的信号,产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中通过参考每种IgG蛋白同种型的所述标准曲线,测量每种生物样品中一种或多种IgG同种型的浓度。
在任一方面的各种实施方案中,检测试剂包含两种、三种、四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的确定比例,并且在每种生物样品中测定两种、三种或四种或更多种IgG抗体同种型的浓度。
在进一步的实施方案中,检测试剂可以进一步包含可检测的细胞活力标记,并且其中所述方法还包括测量每个生物样品中的细胞活力和/或细胞数。在另一个实施方案中,结合分子结合的表面可包含珠粒。在一个实施方案中,每个捕获试剂群是可单独区分的。在进一步的实施方案中,结合分子包含抗体、affimers适体和/或Fc受体。在另一个实施方案中,该方法还包括确定每种生物样品中的总IgG抗体浓度。在进一步的实施方案中,生物样品包含细胞样品。在一个实施方案中,生物样品是未稀释的样品。在另一个实施方案中,该方法不包括任何洗涤步骤。
在一个实施方案中,生物样品包含具有或不具有细胞的小鼠B细胞或小鼠细胞杂交瘤上清液,其中不同的IgG同种型选自小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在另一个实施方案中,生物样品包含人细胞,其中不同的IgG同种型选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一个实施例中,生物样品包含大鼠细胞,其中不同的IgG同种型选自大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c。在其他实施方案中,生物样品包含:
(i)兔细胞或绵羊细胞,其中不同的IgG同种型选自兔或绵羊IgG;
(ii)山羊细胞、猪细胞或牛细胞,其中不同的IgG同种型选自山羊、猪或牛IgG1和IgG2;
(iii)马细胞,其中不同的IgG同种型选自马IgG1、IgGb、IgGt;或者
(iv)猴细胞,其中不同的IgG同种型选自猴IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
在另一方面,提供了试剂盒,包括:
(a)检测试剂,其包含确定比例的两种、三种、四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段;和
(b)两种、三种、四种或更多种捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合不同IgG抗体同种型的结合分子,其中每个捕获试剂群中的结合分子结合到表面。
在一个实施方案中,表面包含珠粒。在另一个实施方案中,每个捕获试剂群是可单独区分的。在进一步的实施方案中,结合分子包含抗体。在另一个实施方案中,试剂盒还包含对照样品,其包含确定比例的两种或更多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段,其对应于在检测试剂中的两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段。在一个实施方案中,对照样品包含确定比例的三种或更多种或四种或更多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段,其对应于检测试剂中的三种或更多种或四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段。
在一个实施方案中,检测试剂包含确定比例的两种、三种或四种不同的且可检测标记的靶小鼠IgG蛋白同种型,其选自IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3,或其抗原性片段;捕获试剂包含两种、三种或四种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的不同小鼠IgG抗体同种型的结合分子。在另一个实施方案中,检测试剂包含确定比例的两种、三种或四种不同的且可检测标记的靶人IgG蛋白同种型,其选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4,或其抗原性片段;捕获试剂包含两种、三种或四种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的不同人IgG抗体同种型的结合分子。在又一个实施方案中,检测试剂包含限定比例的两种、三种或四种不同的且可检测标记的靶大鼠IgG蛋白同种型,其选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或其片段;捕获试剂包含两种、三种或四种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c的不同大鼠IgG抗体同种型的结合分子。在各种其他实施例中,
(A)检测试剂包括确定比例的:
(i)2种不同的且可检测标记的靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型,选自IgG1、IgG2或其片段;
(ii)2或3种不同的且可检测标记的靶马IgG蛋白同种型,选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段;或者
(iii)2、3或4种不同的且可检测标记的靶猴IgG蛋白同种型,选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段;并且
(B)捕获试剂包括
(i)2种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2或其片段的不同靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型的结合分子;
(ii)2或3种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段的不同马IgG蛋白同种型的结合分子;或者
(iii)2、3或4种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段的不同猴IgG蛋白同种型的结合分子。
在另一方面,提供了用于分析多个细胞样品以产生免疫球蛋白γ(IgG)抗体的方法,该方法包括:
(a)将多个细胞样品转移到具有多个样品孔的测定板中,其中每个样品孔含有表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物的细胞样品,并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物,其中分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中所述捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)第一检测分子,其包含(A)对照IgG抗体或其片段,和(B)第一可检测部分;
(b)将所述多种分析混合物在促进所述靶IgG抗体和所述第一检测分子与所述捕获珠的结合的时间和条件下温育;和
(c)通过流式细胞术分析确定所述多种分析混合物的每种分析混合物中的所述目标IgG抗体浓度。
在一个实施方案中,细胞培养物从单个克隆繁殖。在另一个实施方案中,捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。在另一个实施方案中,捕获珠是磁珠或琼脂糖珠。在另一个实施方案中,在转移多个样品之前,测定板含有冻干的分析试剂。在一个实施方案中,将分析试剂与多个样品混合包括将分析试剂加入孔中的细胞样品中。在另一个实施方案中,将分析板离心,然后在流式细胞仪中读取分析板中的多个分析混合物。在进一步的实施方案中,混合包括同时混合多个细胞样品和所有分析试剂,其中第一检测分子与靶IgG抗体竞争结合捕获珠;和其中在每种分析混合物中与捕获珠结合的第一检测分子的量提供给定分析混合物中靶IgG抗体浓度的量度。在另一个实施方案中,混合包括逐步添加捕获珠和第一检测分子,其中逐步添加包括:
首先将所述多个细胞样品与所述捕获珠在促进所述靶IgG抗体与所述捕获珠结合的时间和条件下混合,以产生多个第一混合物,然后将所述第一检测分子加入所述多个第一混合物中,在促进所述第一检测分子与所述捕获珠结合的时间和条件下,以产生多种分析混合物;
其中在每种分析混合物中与所述捕获珠结合的所述第一检测分子的量提供给定分析混合物中所述靶IgG抗体浓度的测量。
在另一方面,提供了用于分析多个细胞样品以产生免疫球蛋白γ(IgG)抗体的方法,该方法包括:
(a)将多个细胞样品转移到具有多个样品孔的测定板中,其中每个样品孔含有表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物的细胞样品,并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物,其中所述分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中所述捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)包含第一可检测部分的第一检测分子;
(b)将所述多种分析混合物在促进所述靶IgG抗体和所述第一检测分子与所述捕获珠的结合的时间和条件下温育;并且
(c)通过流式细胞术分析确定所述多种分析混合物的每种分析混合物中的所述目标IgG抗体浓度。
在一个实施方案中,第一检测分子缺乏免疫球蛋白轻链并且能够结合捕获珠。在另一个实施方案中,该方法还包括使所述多种分析混合物与第二检测分子在促进所述第二检测分子与结合于所述捕获珠的所述靶IgG抗体结合的时间和条件下接触;
其中所述第二检测分子包含可检测标记的抗-IgG轻链抗体,其与第一检测分子在光学上可区分;和
其中在每种分析混合物中与靶IgG抗体结合的第二检测分子的量提供给定分析混合物中完整靶IgG抗体浓度的量度。
在另一个实施方案中,将多种分析混合物离心并在加入标记的抗轻链抗体之前进行洗涤步骤。在进一步的实施方案中,分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。在各种实施例中,该方法还包括确定以下中的一个或多个:
(i)每种分析混合物中的多种细胞;
(ii)每种分析混合物中活细胞的百分比;
(ii)每种分析混合物中每个细胞的靶IgG抗体浓度;和/或
(iii)每种分析混合物中每个活细胞的靶IgG抗体浓度。
在另一方面,提供了试剂盒,包括:
(a)测定板,和
(b)分析试剂,其中分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中所述捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)包含第一可检测部分的第一检测分子。
在一个实施方案中,第一检测分子包含对照IgG抗体或其片段。在另一个实施方案中,所述试剂盒还包含可检测标记的抗轻链抗体,其与第一检测分子在光学上可区分。在进一步的实施方案中,分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。在另一个实施方案中,捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。在另一个实施方案中,捕获珠是磁珠或琼脂糖珠。在另一个实施方案中,测定板含有冻干的分析试剂。
附图说明
图1是具有4种捕获珠以捕获4种不同的IgG同种型的多重竞争测定形式的图。
图2是微量滴定板中标准孔的示例性设置图。
具体实施方式
引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。
如本文所用,除非上下文另有明确规定,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。除非另有明确说明,否则本文所用的“和”可与“或”互换使用。
除非上下文另有明确规定,否则本发明任何方面的所有实施方案可以组合使用。
除非上下文明确要求,否则在整个说明书和权利要求书中,词语“包括”、“包含”等应以包含性的意义解释,而不是排他性或穷举性的意义;也就是说,在“包括但不限于”的意义上。使用单数或复数的单词也分别包括复数和单数。另外,当在本申请中使用时,词语“此处”、“上文”和“下文”以及类似含义的词语应当指代本申请的整体而不是本申请的任何特定部分。
本公开的实施例的描述不旨在是穷举的或将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方案和实施例,但是如相关领域的技术人员将认识到的,在本公开的范围内可以进行各种等同修改。
在第一方面,提供了用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法,包括:
(a)在微量滴定板中的多个孔中,将含有IgG抗体的生物样品与检测试剂一起温育,其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白或其片段与其所述IgG抗体均匀混合的时间和条件下发生,以在所述多个孔的每个孔中产生IgG抗体-靶IgG蛋白混合物;
(b)将所述多个孔的每个孔中的所述IgG抗体-靶IgG蛋白混合物与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合,其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白或其片段和所述IgG抗体结合至所述IgG同种型特异性捕获试剂群的时间和条件下进行,以产生IgG同种型特异性结合复合物;以及
(c)检测来自所述IgG同种型特异性结合复合物的信号,以确定所述生物样品中存在的一种或多种IgG抗体同种型的浓度,其中所述生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与从相关IgG同种型特异性结合复合物中检测到的所述信号成反比。
该方法允许基于生物样品中存在的IgG抗体同种型反比于从相关IgG同种型特异性结合复合物的检测信号的反比关系确定生物样品中存在的一种或多种IgG抗体同种型的浓度。
可以使用含有IgG抗体的任何合适的生物样品,包括但不限于分离的IgG抗体分泌细胞、IgG抗体分泌细胞群、该类细胞的上清液、其细胞提取物、血清、血清提取物、生物流体(包括但不限于血液)和生物液体提取物(包括但不限于血液提取物)。在非限制性实施方案中,生物样品可包含分泌抗体的B细胞、杂交瘤细胞、其上清液(即,细胞或杂交瘤已经培养的细胞培养基,有或没有细胞成分)、或其细胞提取物。在某些实施方案中,生物样品包含从单个克隆繁殖的细胞。在其他实施方案中,生物样品包含不确定的细胞群。在一个实施方案中,生物样品是未稀释的样品,例如来自细胞/杂交瘤培养物的未稀释的样品。本发明的方法允许定量IgG抗体同种型而不稀释细胞/杂交瘤培养物样品,这使用先前的抗体浓度检测技术是不可能的,并且通过去除可能需要主观猜测稀释因子的中间样品稀释步骤极大地简化了测定工作流程。
生物样品可以是任何来源,包括但不限于人,啮齿动物(即小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猪、山羊、猴子、绵羊、马、牛等。
如本文所用,生物样品中的IgG抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在一个具体实施方案中,生物样品中的IgG抗体是单克隆抗体,其片段或其免疫结合等同物。此类抗体包括细胞可表达或被工程化以表达的任何类型的抗体,包括但不限于单克隆抗体(mAb)、人源化或嵌合抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段、抗独特型(抗Id)抗体、体内、合成抗体,上述任何表位结合片段,以及包含与IgG Fc区域等同的的融合蛋白区域。
检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其保留结合相应IgG抗体同种型的能力。在各种实施方案中,检测试剂包含2、3、4、5或更多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。此类IgG蛋白可从许多供应商商购获得,包括BDBiosciences、Sigma Chemical Company、Millipore和ThermoFisher Scientific。每种靶IgG蛋白同种型或其片段具有结合特异性IgG抗体同种型的能力。在一个非限制性实施方案中,生物样品包含小鼠B细胞或小鼠细胞杂交瘤上清液(有或没有细胞),并且不同的IgG同种型选自小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在该实施方案中,检测试剂包含1、2、3或4种可检测标记的靶IgG蛋白同种型(即:IgG1、IgG2a、IgG2b和/或IgG3)或其片段。在另一个非限制性实施方案中,生物样品包含人抗体分泌细胞,并且不同的IgG同种型选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在该实施方案中,检测试剂包含1、2、3或4种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。在进一步的非限制性实施方案中,生物样品包含大鼠抗体分泌细胞,并且不同的IgG同种型选自大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c。在该实施方案中,检测试剂包含1、2、3或4种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。在各种其他实施例中,
(i)生物样品包含兔或绵羊抗体分泌细胞,唯一的IgG同种型是兔或绵羊IgG;
(ii)生物样品包含山羊、猪或牛抗体分泌细胞,不同的IgG同种型选自山羊、猪或牛IgG1和IgG2。在该实施方案中,检测试剂包含1或2个可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段;
(iii)生物样品包含马抗体分泌细胞,并且不同的IgG同种型选自马IgG1、IgGb、IgGt。在这些实施方案中,检测试剂包含1、2或3种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,或
(iv)生物样品包含分泌抗体的猴细胞,并且不同的IgG同种型选自猴IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在该实施方案中,检测试剂包含1、2、3或4种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。
在各种实施方案中,检测试剂包含限定比例的2、3、4或更多种不同的,可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。该实施方案允许更快速地定量生物样品中2、3、4或更多IgG抗体同种型的浓度。可以使用任何确定比例的可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,只要该比例是已知的即可。在一个非限制性实施方案中,每种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段以大约相同的浓度存在。在另一个非限制性实施方案中,每种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段以大约相同的量存在(即,当存在三种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段时,约为1:1:1)。
可以在测定中使用任何合适浓度的靶IgG蛋白同种型或其片段。在一个非限制性实施方案中,检测试剂中的每种靶IgG蛋白同种型或其片段以约1ng/ml至约10mg/ml存在。在各种其他实施方案中,检测试剂中的每种靶IgG蛋白同种型或其片段以约10ng/ml至约1mg/ml、约100ng/ml至约750μg/ml、约500ng/ml至约500μg/ml、约1μg/ml至约250μg/ml、或至少125μg/ml存在。
可以使用任何合适的可检测标记,包括但不限于荧光标记、半抗原、比色标记、各种放射性标记、酶、修复基团、荧光标记、发光标记、生物发光标记、标记颗粒如硅、玻璃或金属粒子;蛋白质-蛋白质结合对、蛋白质-抗体结合对等。荧光标记的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、花青、丹磺酰氯、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、亮紫染料、亮紫外染料和藻红蛋白。生物发光标记物的实例包括但不限于荧光素酶(例如,细菌、萤火虫、咔嗒甲虫等)、荧光素、水母发光蛋白等。具有视觉上可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、过氧化物酶、胆碱酯酶等。可检测标记可从各种来源商购获得。在某些实施方案中,检测标记包含荧光团或荧光蛋白。当检测试剂包含2、3、4或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段时,每种不同的可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段可具有相同或可区分的标记,这取决于预期的检测分析。
在进一步的实施方案中,检测试剂还包含可检测的细胞活力标记,并且该方法还包括测量每种生物样品中的细胞活力和/或细胞数。可以使用任何合适的细胞活力标记。细胞活力染料可以允许检测样品中的非活细胞。例如,细胞活力染料可以永久性地标记死细胞,即使细胞制剂通过流式细胞仪分析细胞内靶标,也可以将它们排除在分析之外(例如,Fixable Viability Dye碘化丙啶(PI)是膜不透性的染料,其通常从活细胞中排除)。细胞活力染料也可以标记活细胞。例如,非荧光化合物自由进入活细胞,细胞内酯酶将其转化为荧光染料。在这样的实例中,染料在固定或透化后不会保留在细胞中,因此对细胞内染色方案无用。在一些实施方案中,分析试剂还包含细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物。本领域技术人员认识到细胞表面标志物是在细胞表面上表达的蛋白质,并且通常可以方便地用作特定细胞类型的标志物。例如,T细胞和B细胞表面标志物鉴定其在分化过程中的谱系和阶段。
温育在促进可检测标记的靶IgG蛋白或其片段与其IgG抗体的均匀混合的时间和条件下发生以在多个孔的每个孔中产生IgG抗体-靶IgG蛋白混合物。可以使用促进这种均匀混合的任何合适条件,并且确定诸如温度、湿度水平、温育长度、施加搅拌或其他混合力、使用的培养基等适当条件完全在本领域技术人员的水平范围内。
该方法包括将多个孔的每个孔中的IgG抗体-靶IgG蛋白混合物与一个或多个IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每个IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合的结合分子。不同的特异性IgG蛋白同种型。每个捕获试剂群对不同的特异性IgG蛋白同种型是特异性的,因此可用于基于IgG同种型分离IgG抗体-靶IgG蛋白混合物。可以使用任何合适的结合分子,其选择性结合特定的IgG蛋白同种型。在各种非限制性实施方案中,结合分子包含抗体、affimers适体、Fc受体或其他蛋白质/糖/脂质或组合分子。在一个具体实施方案中,结合分子包含选择性结合IgG蛋白同种型的抗体。此类IgG同种型选择性抗体可从许多供应商商购获得,包括BD Biosciences、Sigma Chemical Company、Millipore和ThermoFisher Scientific。
每个IgG同种型特异性捕获试剂群中的结合分子与表面结合。可以使用任何合适的表面,包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯载体、磁性或顺磁珠、琼脂糖珠和过滤介质,例如NHS活化的琼脂糖珠或CNBr活化的琼脂糖珠。在一个具体实施方案中,每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的结合分子与珠粒结合,例如磁珠或顺磁珠。磁性或顺磁性捕获珠粒的直径通常为约1mm或更小,并且足够小以防止沉淀或堵塞。合适的珠粒是本领域技术人员已知的,并且可以从不同来源获得(例如,来自挪威Invitrogen Dynal的Dynabeads My-OneTM或来自法国Merck的Estapore)。珠粒可以预先偶联或涂覆有结合分子,用于抗体或抗原的被动或主动偶联。在其他实施方案中,捕获珠粒可以是琼脂糖珠粒。通常,琼脂糖珠的直径为约20μm至350μm。在另一个具体实施方案中,每个IgG同种型特异性捕获试剂群中的结合分子以微量滴定板的孔中的印刷阵列存在。
可以在测定中使用任何合适密度的捕获试剂。在一个非限制性实施方案中,每个捕获试剂群以每毫升约0.01百万至约1亿个捕获试剂的密度存在。在各种进一步的实施方案中,每个捕获试剂群以每毫升约10百万至约5千万之间、约25百万至约2千5百万之间、约0.5百万至约1千万之间的捕获、或约75万至约500万个捕获试剂之间的密度存在。
温育在促进一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白或其片段和IgG抗体与IgG同种型特异性捕获试剂群结合的时间和条件下进行,以产生IgG同种型特异性结合复合物。可以使用促进这种均匀混合的任何合适条件,并且确定诸如温度、湿度水平、温育长度、施加搅拌或其他混合力、使用的培养基等适当条件完全在本领域技术人员的水平范围内。
从IgG同种型特异性结合复合物中检测信号(即:来自可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段),以确定生物样品中存在的一种或多种IgG抗体同种型的浓度。由于其为竞争测定,生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与来自相关IgG同种型特异性结合复合物的检测信号成反比。可以使用用于检测来自IgG同种型特异性结合复合物的信号的任何合适技术,这取决于所使用的可检测标记,包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、酶标仪、Meso Scale Discovery平台和荧光显微镜。在一个具体实施方案中,检测涉及流式细胞术,通过将IgG同种型特异性结合复合物悬浮在流体流中并通过电子检测装置传递它们,允许同时多参数分析每秒高达数万复合物的物理和化学特征。
在一个实施方案中,所述方法还包括产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中通过参考每种IgG蛋白同种型的标准曲线测量每种生物样品中一种或多种IgG抗体同种型的浓度。在一个这样的实施方案中,该方法还包括
(d)温育对照样品的系列稀释液和所述检测试剂以产生对照混合物,其中所述对照样品的所述系列稀释液的每种稀释液存在于微量滴定板的单独孔中,其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育发生在促进所述对照样品中所述未标记的IgG蛋白同种型和一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段混合的时间和条件下;
(e)将所述对照混合物与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段和所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获珠群竞争性结合的时间和条件下进行,以产生对照IgG同种型特异性结合复合物;以及
(f)通过分析来自所述IgG同种型特异性结合复合物的所述信号产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中每种生物样品中的一种或多种IgG抗体同种型的浓度通过参考所述每种IgG蛋白同种型的标准曲线来测量。
在该实施方案中,一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段和一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段竞争结合IgG同种型特异性捕获试剂群。该生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与从相关IgG同种型特异性结合复合物的检测信号成反比,并且可以从IgG同种型特异性标准曲线内插并且通过高于基线量的阳性量进行定量。从具有零浓度的未标记的IgG蛋白同种型或其片段的对照孔计算。
在第二方面,提供了用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)同种型抗体浓度的方法,包括:
(a)在微量滴定板中的多个孔中,将表达IgG抗体的多个生物样品与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合;其中所述温育在促进所述IgG抗体与所述IgG同种型特异性捕获试剂的结合的时间和条件下进行,以产生IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物;
(b)将所述IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物与检测试剂一起温育,其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂复合物上的未占据位点结合的时间和条件下发生,以产生可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物;
(c)在所述可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物上检测来自所述可检测标记的靶IgG蛋白的信号,以确定一种或多种IgG抗体同种型的浓度,其中存在于所述生物样品中的IgG抗体同种型蛋白的量与检测到的信号成反比。
在这方面,该方法遵循预温育方案。
对于杂交瘤培养,例如小鼠杂交瘤培养,可以优选完全竞争测定方案。该方案可以处理小鼠杂交瘤培养物中常见的IgG范围的定量(1-50ug/mL)。
对于B细胞培养物,预温育测定方案可能是优选的。该方案是调整后的竞争方案。对于低水平IgG样品,在添加检测/竞争试剂之前预先温育捕获试剂和生物样品可以更好地检测样品中低水平的IgG。该方案通常可以更好地处理小鼠IgG范围的定量例如,在小鼠B细胞培养物(0.1-2μg/mL)中观察到。
本发明第一方面的所有实施方案适用于本发明的第二方面。在一个实施方案中,所述方法还包括产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中通过参考每种IgG蛋白同种型的标准曲线测量每种生物样品中一种或多种IgG抗体同种型的浓度。在一个这样的实施方案中,该方法还包括
(d)温育对照样品的系列稀释液与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群以产生对照混合物,其中所述对照样品的所述系列稀释液的每个稀释液存在于微量滴定板的单独孔中,其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型与所述IgG同种型特异性捕获试剂结合的时间和条件下进行,以产生对照复合物;
(e)将所述对照复合物与所述检测试剂一起温育,其中所述温育在促进一种或多种可检测标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂上的未占据位点的结合的时间和条件下进行;并且
(f)通过分析来自与所述IgG同种型特异性捕获试剂群结合的可检测标记的IgG同种型的信号,产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中通过参考每种IgG蛋白同种型的所述标准曲线,测量每种生物样品中一种或多种IgG同种型的浓度。
在该实施方案中,一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段和一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段竞争结合IgG同种型特异性捕获试剂群。该生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与来自相关IgG同种型特异性结合复合物的检测信号成反比,并且可以从IgG同种型特异性标准曲线内插并且通过高于基线量的阳性量进行定量。从具有零浓度的未标记的IgG蛋白同种型或其片段的对照孔计算。
在本发明第一或第二方面的一个实施方案中,该方法还包括测定每种生物样品中的总IgG抗体浓度。可以使用任何合适的测定总IgG抗体浓度的方法。在确定生物样品中存在的每种IgG同种型的量的实施方案中,该实施方案可以简单地要求添加每种单独IgG同种型浓度的量以达到总IgG抗体浓度。
在本发明第一或第二方面的另一个实施方案中,所述方法不包括任何洗涤步骤,其通过减少洗涤相关的读数变化(例如细胞、珠粒计数或两者)来消除劳动密集型处理时间并改善数据完整性。
在第三方面,本发明提供了用于分析多个细胞样品用于免疫球蛋白γ(IgG)抗体产生的方法,该方法包括:(a)将多个细胞样品转移至具有多个样品孔的测定板,其中每个样品孔含有细胞样品,所述细胞样品是表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物,并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物,其中所述分析试剂包含:(i)捕获珠,其中捕获珠与IgG抗体结合;(ii)第一检测分子,其包含(A)对照IgG抗体或其片段,和(B)第一可检测部分;(b)将多种分析混合物在促进靶IgG抗体和第一检测分子与捕获珠的结合的时间和条件下温育;(c)通过流式细胞术分析确定多种分析混合物的每种分析混合物中的目标IgG抗体浓度。在一些实施方案中,分析试剂与多个样品的混合包括将分析试剂添加到孔中的细胞样品中。在其他实施方案中,混合包括同时混合多个细胞样品和所有分析试剂,其中第一检测分子与靶IgG抗体竞争结合捕获珠;和其中在每种分析混合物中与捕获珠结合的第一检测分子的量提供给定分析混合物中靶IgG抗体浓度的量度。在另一个实施方案中,该方法包括混合包括逐步添加捕获珠和第一检测分子,其中逐步添加包括:首先将多个细胞样品与捕获珠在促进结合靶向获自捕获珠的IgG抗体以产生多个第一混合物的时间和条件下混合,然后将第一检测分子在促进第一检测分子与捕获珠结合的时间和条件下加入多个第一混合物中,以产生多个分析混合物;其中在每种分析混合物中与捕获珠结合的第一检测分子的量提供给定分析混合物中靶IgG抗体浓度的量度。
在某些实施方案中,细胞培养物从单个克隆繁殖。在其他实施方案中,细胞群是不确定的。通常,将目的基因引入候选生产细胞群中。染色体整合到宿主染色体中是罕见的事件,因此通常必须以各种方式选择和培养稳定转染的细胞。例如,为了选择稳定转染的细胞,选择标记与目的基因共表达。存在多种用于选择转染细胞的系统,包括对抗生素如新霉素磷酸转移酶的抗性,赋予对G418、二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶的抗性。这种系统是本领域技术人员所熟知的。基因转移后,将细胞培养在含有选择剂的培养基中。只有那些整合了质粒的细胞才能存活,含有抗药性基因。将与目的基因整合的细胞群稀释并分布在多孔“微量滴定板”的孔中,使得每个孔中仅沉积一个细胞。在本领域中充分描述了用于实现此目的的方法,并且本领域技术人员知道。每孔一个细胞实际上是一个难以实现的目标;尽管大多数孔包含一个细胞,但是有许多孔具有零细胞,并且许多孔含有多个细胞。通常,有必要筛选数十万个孔以找到分泌高水平蛋白质的少量细胞系。
如在该第三方面中所使用的,术语“捕获珠”是指能够提供与感兴趣的IgG分子或蛋白质结合的支持物的任何分子。在某些实施方案中,捕获珠与特异性结合目的IgG分子或蛋白质的分子共价连接。例如,蛋白G和蛋白A通过Fab和Fc区选择性地结合抗体。蛋白质G或蛋白质A或其他免疫球蛋白结合细菌蛋白质如蛋白质A/G和蛋白质L可用于结合/检测免疫球蛋白。在其他实施方案中,捕获珠可以与特异性识别IgG抗体的抗体或与靶抗体特异性结合的分子共价连接。在一些实施方案中,捕获珠粒是磁珠或琼脂糖珠粒。磁性或顺磁性捕获珠粒的直径通常为约1mm或更小,并且足够小以防止沉淀或堵塞。合适的微珠是本领域技术人员已知的并且可以从不同来源获得(例如,来自挪威Invitrogen Dynal的Dynabeads My-One或来自法国Merck的Estapore)。如上所述,珠粒可以预先偶联(用特定的亲和试剂,如蛋白质G)或涂有不同的分子,用于抗体或抗原的被动或主动偶联。在其他实施方案中,捕获珠粒可以是琼脂糖珠粒。通常,琼脂糖珠的直径为约350μm至20μm。
如在该第三方面中所使用的,术语“检测分子”是指允许检测目标IgG分子或蛋白质的任何分子。在某些实施方案中,检测分子包含可检测的部分,例如荧光团或荧光蛋白。可检测的部分可用于标记检测分子。可检测部分可包括,例如,荧光部分、半抗原、比色部分、各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标记、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对、蛋白质-抗体结合对等。荧光部分的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、花青、丹磺酰氯、藻蓝蛋白、藻红蛋白。生物发光标记物的实例包括但不限于荧光素酶(例如,细菌、萤火虫、咔嗒甲虫等)、荧光素、水母发光蛋白等。具有视觉上可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、过氧化物酶、胆碱酯酶等。可检测部分可从各种来源商购获得。
在某些实施方案中,测定板含有冷冻干燥的分析试剂。冷冻干燥是通过在高真空下快速冷冻和脱水冷冻产品来产生稳定的物质制剂。冻干的生物材料应该是完整的和活性的,并且还具有快速溶解的优点,并且理想地适用于实验室过程自动化,以及在环境温度下的长保质期,这对于产品的仓储、运输和最终用户存储是期望的。
在第四方面,本发明提供了用于分析多个细胞样品用于免疫球蛋白γ(IgG)抗体产生的方法,该方法包括:(a)将多个细胞样品转移至具有多个样品孔的测定板,其中每个样品孔含有细胞样品,所述细胞样品是表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物,并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物,其中所述分析试剂包含:(i)捕获珠,其中捕获珠与IgG抗体结合;(ii)包含第一可检测部分的第一检测分子;(b)将多种分析混合物在促进靶IgG抗体和第一检测分子与捕获珠的结合的时间和条件下温育;(c)通过流式细胞术分析确定多种分析混合物的每种分析混合物中的目标IgG抗体浓度。在某些实施方案中,第一检测分子缺乏免疫球蛋白轻链并且能够结合捕获珠。在一些实施方案中,进一步包括使多种分析混合物与第二检测分子在促进第二检测分子与结合捕获珠的靶IgG抗体的结合的时间和条件下接触;其中第二检测分子包含可检测标记的抗-IgG轻链抗体,其与第一检测分子在光学上可区分;和其中在每种分析混合物中与靶IgG抗体结合的第二检测分子的量提供给定分析混合物中完整靶IgG抗体浓度的量度。在某些实施方案中,将多种分析混合物离心并在加入标记的抗轻链抗体之前进行洗涤步骤。
在一些实施方案中,分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。细胞活力染料可以允许检测样品中的非活细胞。例如,细胞活力染料可以永久性地标记死细胞,即使细胞制剂通过流式细胞仪分析细胞内靶标,也可以将它们排除在分析之外(例如,Fixable Viability Dye碘化丙啶(PI)是膜不透性的染料,其通常从活细胞中排除)。细胞活力染料也可以标记活细胞。例如,非荧光化合物自由进入活细胞,细胞内酯酶将其转化为荧光染料。在这样的实例中,染料在固定或透化后不会保留在细胞中,因此对细胞内染色方案无用。在一些实施方案中,分析试剂还包含细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物。本领域技术人员认识到细胞表面标志物是在细胞表面上表达的蛋白质,并且通常可以方便地用作特定细胞类型的标志物。例如,T细胞和B细胞表面标志物鉴定其在分化过程中的谱系和阶段。
在某些实施方案中,该方法还包括确定以下一种或多种:每种分析混合物中的多个细胞;每种分析混合物中活细胞的百分比;每种分析混合物中每个细胞的靶IgG抗体浓度;和/或每种分析混合物中每个活细胞的靶IgG抗体浓度。在一些实施方案中,方法可以涉及分析软件,其从已知的用户定义的标准品的浓度绘制曲线,并使用这些图来确定分泌蛋白质的浓度。在其他实施方案中,确定样品中存在的生产细胞的数量。该软件自动确定分泌的蛋白质与细胞数量的比率,基于每个细胞计算分泌的蛋白质浓度,并鉴定每个细胞值具有最高分泌蛋白质的孔。如果高通量流式细胞术系统与细胞分选器结合使用,该软件还控制系统从高分泌孔中分选单个细胞以进一步纯化所需的细胞系。
在某些实施方案中,本文公开的方法依赖于流式细胞术分析。在一些实施方案中,用于流式细胞术的样品是未稀释的。在其他实例中,样品未稀释并且不经历洗涤步骤。在某些实施方案中,可以在用辉光细胞计分析之前洗涤样品。流式细胞术可用于细胞计数、细胞分选、生物标志物检测和蛋白质工程,通过将细胞悬浮在流体流中并通过电子检测装置使其通过。
在第四方面,本发明提供的试剂盒包括:
(a)检测试剂,其包含确定比例的两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段;和
(b)两种或更多种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合不同IgG抗体同种型的结合分子,其中每种捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合。
该方面的试剂盒可用于例如实施本文所述的方法。第一和第二方面的检测试剂和捕获试剂的所有实施方案可用于该方面的试剂盒中。检测试剂包含两种或更多种不同的,可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其保留结合相应IgG抗体同种型的能力。在各种实施方案中,检测试剂包含3、4、5或更多个可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。每种靶IgG蛋白同种型或其片段具有结合特异性IgG抗体同种型的能力。检测试剂包含限定比例的2、3、4或更多种不同的,可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段。该实施方案允许更快速地定量生物样品中2、3、4或更多IgG抗体同种型的浓度。可以使用任何确定比例的可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,只要该比例是已知的即可。在一个非限制性实施方案中,每种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段以大约相同的浓度存在。在另一个非限制性实施方案中,每种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段以大约相同的量存在(即,当存在三种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段时,约1:1:1)。任何合适浓度的靶IgG蛋白同种型或其片段可以存在于检测试剂中。在一个非限制性实施方案中,检测试剂中的每种靶IgG蛋白同种型或其片段以约1ng/ml至约10mg/ml存在。在各种其他实施方案中,检测试剂中的每种靶IgG蛋白同种型或其片段以约10ng/ml至约1mg/ml、约100ng/ml至约750μg/ml、约500ng/ml至约500μg/ml、约1μg/ml至约250μg/ml、或至少125μg/ml存在。可以使用任何合适的可检测标记,包括但不限于荧光标记、半抗原、比色标记、各种放射性标记、酶、修复基团、荧光标记、发光标记、生物发光标记、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对、蛋白质-抗体结合对等。荧光标记的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、花青、丹磺酰氯、藻蓝蛋白、藻红蛋白。生物发光标记物的实例包括但不限于荧光素酶(例如,细菌、萤火虫、咔嗒甲虫等)、荧光素、水母发光蛋白等。具有视觉上可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、过氧化物酶、胆碱酯酶等。可检测标记可从各种来源商购获得。在某些实施方案中,检测标记包含荧光团或荧光蛋白。取决于预期的检测分析,每种不同的可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段可具有相同或可区分的标记。
每个捕获试剂群对不同的特异性IgG蛋白同种型是特异性的,因此可用于基于IgG同种型分离IgG抗体-靶IgG蛋白混合物。可以使用任何合适的结合分子,其选择性结合特定的IgG蛋白同种型。在各种非限制性实施方案中,结合分子包含抗体、affimers适体、Fc受体或其他蛋白质/糖/脂质或组合分子。在一个具体实施方案中,结合分子包含选择性结合IgG蛋白同种型的抗体。
每个IgG同种型特异性捕获试剂群中的结合分子与表面结合。可以使用任何合适的表面,包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯载体、磁性或顺磁珠、琼脂糖珠和过滤介质,例如NHS活化的琼脂糖珠或CNBr活化的琼脂糖珠。在一个具体实施方案中,每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的结合分子与珠粒结合,例如磁珠或顺磁珠。磁性或顺磁性捕获珠粒的直径通常为约1mm或更小,并且足够小以防止沉淀或堵塞。合适的珠粒是本领域技术人员已知的,并且可以从不同来源获得(例如,来自挪威Invitrogen Dynal的Dynabeads My-OneTM或来自法国Merck的Estapore)。珠粒可以预先偶联或涂覆有结合分子,用于抗体或抗原的被动或主动偶联。在其他实施方案中,捕获珠粒可以是琼脂糖珠粒。通常,琼脂糖珠的直径为约350μm至20μm。在另一个具体实施方案中,每个IgG同种型特异性捕获试剂群中的结合分子以微量滴定板的孔中的印刷阵列存在。
试剂盒中可存在任何合适密度的捕获试剂。在一个非限制性实施方案中,每个捕获试剂群以每毫升约0.01百万至约1亿个捕获试剂的密度存在。在各种进一步的实施方案中,每个捕获试剂群以每毫升约10百万至约5千万之间、约25百万至约2千5百万之间、约0.5百万至约1千万之间、或约75万至约500万之间的捕获试剂的密度存在。在一个实施方案中,不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段的数量与捕获试剂的数量相同。
在一个具体实施方案中,检测试剂包含限定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶小鼠IgG蛋白同种型,其选自gG1、IgG2a、IgG2b和IgG3,或其抗原性片段;捕获试剂包含2、3或4个捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的不同小鼠IgG抗体同种型的结合分子。
在另一个具体实施方案中,检测试剂包含限定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶人IgG蛋白同种型,其选自gG1、IgG2、IgG3和IgG4,或其抗原性片段;捕获试剂包含2、3或4个捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的不同人IgG抗体同种型的结合分子。
在另一个具体实施方案中,检测试剂包含限定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶大鼠IgG蛋白同种型,其选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或其片段;捕获试剂包含2、3或4个捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c的不同大鼠IgG抗体同种型的结合分子。
在各种进一步的具体实施方案中,(A)检测试剂包括确定比例的:
(i)2种不同的且可检测标记的靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型,选自IgG1、IgG2或其片段;
(ii)2或3种不同的且可检测标记的靶马IgG蛋白同种型,选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段;或者
(iii)2、3或4种不同的且可检测标记的靶猴IgG蛋白同种型,选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段;并且
(B)捕获试剂包括
(i)2种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2或其片段的不同靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型的结合分子;
(ii)2或3种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段的不同马IgG蛋白同种型的结合分子;或者
(iii)2、3或4种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段的不同猴IgG蛋白同种型的结合分子。在这些实施方案中,捕获试剂包含与检测试剂中存在的IgG蛋白同种型结合的结合分子。
在另一个实施方案中,试剂盒还包含对照样品,其包含两种或更多种(2、3、4或更多种)不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段的确定比例,其对应于两种或更多种不同的,可检测的检测试剂中标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原片段。根据第一和第二方面中公开的对照的所有实施方案可用于该方面的试剂盒中。
试剂盒可以进一步包含适合于预期用途的任何其他组分。在一个实施方案中,试剂盒还包含可检测的细胞活力标记。
在第五方面,提供了试剂盒,包括:
(a)测定板,和
(b)分析试剂,其中分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)包含第一可检测部分的第一检测分子。
在第五方面中可以使用在第三方面中公开的所有实施例。在一些实施方案中,第一检测分子包含对照IgG抗体或其片段。在其他实施方案中,试剂盒还包含可检测标记的抗轻链抗体,其可与第一检测分子在光学上区分。试剂盒还可以进一步包含细胞活力染料,细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。在一个实施方案中,捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。在另一个实施方案中,捕获珠是磁珠或琼脂糖珠。在某些方面,试剂盒包含含有冻干分析试剂的测定板。
本文描述了示例方法和系统。应当理解,词语“示例”、“示例性”和“说明性”在本文中用于表示“用作示例、实例或说明”。本文描述为“示例”、“示例性”或“说明性”的任何实施例或特征不必被解释为比其他实施例或特征更优选或更具优势。这里描述的示例实施例不意味着限制。容易理解的是,如本文一般描述的并且在附图中示出的本公开的方面可以以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计,所有这些都是本文明确设想的。
实施例1
示例性试剂制备:
1)检测试剂混合物制备:在相同的管/储液器中,加入并混合荧光素异氰酸酯(FITC)-小鼠IgG1、FITC-小鼠IgG2a、FITC-小鼠IgG2b和FITC-小鼠IgG3和红色荧光细胞膜完整性染料至在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中有充足体积的0.1%牛血清白蛋白(BSA)。对于混合物中的每种同种型(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3),最终的FITC-小鼠IgG浓度可以是125μg/mL。混合物中的最终红色荧光FLA细胞膜完整性染料(IntelliCyt Corporation)可以在管/储液器中以1:200稀释。
2)小鼠IgG标准混合物制备:制备一小瓶预混合的小鼠IgG标准储液:在同一小瓶中,加入并混合未标记的小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3蛋白。每种同种型可以在混合物中具有例如200ug/mL的浓度。可以用新鲜细胞培养基(在生物样品来自的培养板或烧瓶中使用相同的培养基)进行预混合小鼠IgG的连续滴定。这些连续稀释的标准品可以在测定设置中稍后使用以产生4条标准曲线(每种小鼠IgG同种型的1条标准曲线)。
3)捕获试剂混合物制备:在小鼠IgG1捕获珠、小鼠IgG2a捕获珠、小鼠IgG2b捕获珠和小鼠IgG3捕获珠中加入并混合至充足体积的0.1%BSA的PBS中。对于每种同种型(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)捕获珠,小鼠IgG捕获珠的最终密度为1百万/mL。
用户现在可以遵循例如完全竞争方案或预温育方案来进行小鼠IgG定量/同种型分析。
小鼠IgG定量/同种型分析(完全竞争方案)
完全竞争方案的分析方案:
该测定可以使用无洗涤工作流程并提供IgG浓度(例如,μg/mL)的结果。它涉及制备参考蛋白质混合物的连续稀释液以产生4条标准曲线,用于确定4种小鼠IgG同种型的浓度。捕获珠上的FITC检测信号与小鼠IgG浓度成反比关系。可以在测定中使用4种捕获珠,其中每种珠对于单个小鼠IgG同种型是特异性的。可以通过ForeCytTM(Intellicyt)软件在每个孔中通过累加4个小鼠IgG同种型浓度来计算总小鼠IgG浓度。如果样品除小鼠IgG上清液外还含有细胞,也可以分析细胞数和细胞活力。
在一个示例性方案中:
1.加入检测试剂混合物(小鼠FITC-IgG和FL4膜完整性染料),5μL/孔的微量滴定板;
2.加入IgG样品/IgG标准品,20μL/孔;快速旋转(500克,5秒)。混合(2,000rpm,20秒)。
3.加入制备的4重捕获珠,5μL/孔;快速旋转(500g,5秒)。混合(2,000rpm,20秒)。室温60分钟。
该板现在可用于信号检测,例如通过在iQueTM Screener流式细胞仪平台上进行采样。
预温育方案小鼠IgG定量/同种型分析:
预温育方案的分析设置
该测定可以使用无洗涤工作流程并且提供IgG浓度(例如,μg/mL)的结果。其可涉及制备参考蛋白质混合物的连续稀释液以产生4条标准曲线,其用于确定4种小鼠IgG同种型的浓度。捕获珠上的FITC检测信号与小鼠IgG浓度成反比关系。可以在测定中使用4种捕获珠,其中每个珠对于单个小鼠IgG同种型是特异性的。可以在每个孔中计算总小鼠IgG浓度,例如通过ForeCytTM软件,通过加入4种小鼠IgG同种型浓度。如果样品除小鼠IgG上清液外还含有细胞,也可以分析细胞数和细胞活力。
在一个示例性方案中:
1.加入制备的4重捕获珠,5μL/孔;
2.加入IgG样品/IgG标准品,20μL/孔;快速旋转(500g,5秒)。混合(2,000rpm,20秒)。室温30分钟。
3.加入检测试剂混合物(小鼠FITC-IgG和FL4膜完整性染料),5μL/孔;快速旋转(500g,5秒)。混合(2,000rpm,20秒)。室温60分钟无光照。
该板现在可用于信号检测,例如通过在iQueTM Screener流式细胞仪平台上进行采样。
具有一种捕获珠类型的多重4捕获珠以特异性捕获特定小鼠IgG同种型将解决涂覆有一般抗小鼠IgG抗体的传统单重捕获珠中的不一致定量。4种不同的小鼠IgG同种型具有轻微不同的蛋白质结构,这导致与包被在珠粒上的一般抗小鼠IgG的轻微不同的结合亲和力。在小鼠杂交瘤或B细胞培养筛选板中,不同的孔可具有4种同种型中的一种。如果单克隆抗小鼠IgG捕获珠用于捕获板的每个孔中的小鼠IgG,则由于IgG同种型依赖性结合亲和力,相同量的小鼠IgG但在不同孔中具有不同同种型可能在珠上具有一般不同的结合信号。差异和基于标准曲线的定量,其中纯化的小鼠IgG作为标准品(4种同种型的天然混合物)将外推不同的小鼠IgG量。这将引入不精确的数量。具有4种不同捕获珠(每种同种型一种)的多重测定将解决该问题。例如,如果微量滴定板中的A1孔具有小鼠IgG1,则它将仅在混合的4个捕获珠中的小鼠IgG1捕获珠上捕获。通过使用小鼠IgG1标准曲线将荧光信号外推至小鼠IgG1量。如果A2孔具有小鼠IgG2a,则其仅在混合的4个捕获珠中的小鼠IgG2a捕获珠上捕获,并且通过使用小鼠IgG2a标准曲线将小鼠IgG2a捕获珠上的荧光信号外推至小鼠IgG2a量。
在这里,我们已经建立了多重竞争测定形式,其具有4种捕获珠以捕获4种不同的同种型,并且在反应中具有4种FITC-小鼠IgG同种型(参见图1)。当具有或不具有细胞的未知同种型样品以正确的序列加入反应中时,未知和未标记的小鼠IgG同种型将4种FITC-小鼠IgG同种型中的一种与4种捕获珠中的仅一种竞争。似乎在测量小鼠IgG同种型和数量方面没有这样的测定。该测定不需要洗涤和稀释,并且可以从通常具有1-50ug/mL的小鼠IgG浓度的杂交瘤上清液测量小鼠IgG量/同种型。
该测定还可以允许用户在相同的多重测定中测量细胞计数和细胞活力。用户可以使用样品上清液或样品内部的细胞。对于后者,将在高通量流式细胞术中同时测量细胞计数和细胞活力以及多重珠粒。
通过修改捕获珠上的同种型特异性捕获抗体,可以扩展/修改测定以测量除小鼠物种之外的不同物种的相同终点(IgG同种型、每种同种型的IgG量、细胞数和细胞健康)。从小鼠物种到人或大鼠等其他物种的检测试剂和标准蛋白质。
图2显示了微量滴定板中标准孔的示例性设置。这里显示了96孔微量滴定板中IgG标准孔的示例性设计。每个特异性孔具有4种同种型蛋白质,每种小鼠IgG同种型具有相同量(小鼠IgG1、2a、2b和3)。右侧(A12和B12)的顶部浓度孔(重复孔)具有每种同种型的最高浓度50ug/mL。从右到左应用1:2连续滴定。例如,对于每种同种型,A11和B11井将具有25ug/mL。A1和B1孔用作新鲜/空白培养基的阴性对照,但没有任何小鼠IgG蛋白标准品。用户可以灵活地确定新的顶部浓度或稀释因子或多少稀释步骤。例如,用户可以使用每种同种型100ug/mL作为最高浓度,并使用1∶3连续滴定,并使用6个稀释步骤而不是11个稀释步骤,如图2中的标准设计所示。用户可以使用其他板类型的标准设计相同,如384孔板。对于没有标准的相同平板,例如图2中的行C-H,用户可以在有或没有细胞的情况下运行未知小鼠IgG样品。
在一个示例性技术中,基于尺寸(前向散射,FSC)和/或粒度(侧向散射,SSC),可以通过2D散射图中的分离来检测细胞和珠粒。单重珠但不是双重珠可以通过使用2D图(FSC-高度对FSC-区域)进行门控。单重珠将是2D图中45度的正确群体(FSC-高度与FSC-区域)。双重峰或聚合将在左侧。单重珠可以在2D图中进一步分成4种捕获珠群(红色荧光通道RL1-高度对FSC-高度)。可以在红色荧光通道RL1-Height的1D直方图中从所有细胞门控活细胞。活细胞将是左侧群体,荧光染色较少。死亡或垂死的细胞会吸收更多染料,并且是正确的细胞群(非门控)。
对于4种小鼠IgG同种型,每种方案的每种同种型可以产生1条标准曲线。检测动态范围和线性检测范围总结在表1中。对每个测试浓度运行重复的孔。使用ForeCytTM软件(Intellicyt)自动生成标准曲线,每个点代表平均值+/-标准偏差。检测动态范围和线性检测范围示于表1中(mIgG1是小鼠IgG1、mIgG2a是小鼠IgG2a等)。
表1.检测动态范围和线性检测范围
在标准曲线中测试的最高浓度是每种同种型100μg/mL。在测定中未测试高于100μg/mL。将标准品在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中稀释。在测试中进行19点1:2连续滴定。
对于曲线拟合:使用ForeCytTM软件(Intellicyt),采用4PL拟合方法,1/Y平方用于拟合重量,自动检测线性范围并提供线性范围。线性范围是输入或输出值的范围,电子放大器产生的输出信号是输入信号的直接线性函数。也就是说,输出可以用以下等式表示:输出=输入×增益。当未知样品的信号落入该范围时,线性范围提供精确/灵敏的定量。
使用的检测范围是指低端检测限(最小浓度与信号之间的范围,即空白的3*标准偏差,0μg/mL IgG)和高端检测限(信号的最大浓度)是由ForeCytTM软件确定的饱和信号的3*标准偏差。如果标准曲线未达到饱和,则使用最高测试浓度(此处为100μg/mL)。
对于来自杂交瘤培养物的样品,可推荐完全竞争方案;对于来自小鼠B细胞培养物的样品,可推荐预温育方案。
实施例2
下面描述了某些方面的测定的示例性方案,以鉴定产生高水平的分泌蛋白或IgG抗体的细胞。
1.将候选生产细胞稀释并分布在多孔“微量滴定板”的孔中,使得每个孔中仅沉积一个细胞。在本领域中充分描述了这样做的方法。每孔一个单元实际上是一个难以实现的目标;尽管大多数孔包含一个细胞,但是有许多孔具有零细胞,并且许多孔含有多个细胞。通常,有必要筛选数十万个孔以找到分泌高水平蛋白质的少量细胞系。
2.允许细胞增殖以增加每个孔中的细胞数量。因为通过有丝分裂发生增殖,所以每个孔中的子细胞将是沉积在孔中的原始细胞的精确拷贝。
3.随着细胞增殖,它们产生蛋白质生物制剂(即IgG抗体)并将其分泌到培养上清液中。
4.将含有代表量的分泌蛋白和生产细胞的每孔未稀释的等分试样转移到冻干测定板中的新孔中。冻干测定板的每个孔含有冻干试剂,其用于定量存在的分泌蛋白的量,并且同时可用于测定样品中存在的生产细胞的数量。从试剂盒中以非冻干形式制备的定量试剂也可用于分析。冻干的测定板或试剂盒包含以下物品:
a.捕获珠-例如涂有分子的荧光微球,该分子结合分泌蛋白上的特定位点并将分泌的蛋白质捕获到微球表面上。
b.检测分子,其用荧光探针标记并且结合分泌蛋白上已被捕获到微球表面上的不同区域。然后,与每个微球相关的荧光强度与样品中存在的分泌的,捕获的蛋白质分子的数量直接相关。
5.温育时间后,通过高通量流式细胞术分析样品。高通量流式细胞术系统的一个例子是HyperCytTM HTFC系统与流式细胞仪的组合,其可以在几分钟内分析数千个样品。
6.建立高通量流式细胞仪检测系统以报告珠粒相关检测分子的荧光强度,其用于从标准曲线计算分泌的蛋白质浓度。另外,可以同时确定样品中存在的生产细胞的数量。专有软件分析包自动确定分泌蛋白与细胞数的比例,并计算每个细胞的分泌蛋白浓度。如果高通量流式细胞术系统与细胞分选器结合使用,该软件还控制系统从高分泌孔中分选单个细胞以进一步纯化所需的细胞系。
第一方案---IgG定量分析-逐步方案(示例):
1.涡旋蛋白G包被的珠粒(6-8um大小,0.5%v/v)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.1%牛血清白蛋白(BSA)中1:15稀释珠粒。混合稀释的珠粒,并将5uL/孔的珠粒加入微量滴定测定板(96孔板或384孔板)的每个孔中;
2.在测定板的每个孔中,加入20uL IgG样品(IgG标准品以产生IgG标准曲线或悬浮CHO细胞培养物/分泌的IgG混合物或仅来自悬浮CHO细胞培养物的IgG上清液)。
3.短暂旋转测定板以将样品降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
4.将测定板在室温下温育30分钟。保护板免受光照。
5.制备组合的检测试剂:在相同的管中,在PBS中的0.1%BSA中制备20ug/mLFITC-Fc片段(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.)和20nM FL4膜完整性染料(IntelliCyt Corporation)。
6.在测定板的每个孔中加入5uL组合的检测试剂。
7.短暂旋转测定板以将样品降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
8.将测定板在室温下温育30分钟。保护板免受光照。
9.通过IntelliCyt iQueTM Screener平台等高通量流式细胞仪从测定板上采集样品。
实施例2:第二方案--IgG定量测定-同时方案:
1.制备组合的检测试剂:在相同的管中,在PBS中的0.1%BSA中制备20ug/mLFITC-Fc片段(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.)和20nM FL4膜完整性染料(IntelliCyt Corporation)。
2.在微量滴定测定板(96孔板或384孔板)的每个孔中加入5uL组合的检测试剂。
3.在测定板的每个孔中,添加20uL IgG样品(IgG标准品以产生IgG标准曲线或悬浮CHO细胞培养物/分泌的IgG混合物或仅来自悬浮CHO细胞培养物的IgG上清液)。
4.短暂旋转测定板以将样品和组合的检测试剂混合物降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
5.涡旋蛋白G包被的珠粒(6-8um大小,0.5%v/v)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.1%牛血清白蛋白(BSA)中1∶15稀释珠粒。混合稀释的珠粒,并用样品/检测混合物将5uL/孔珠粒加入到测定板的每个孔中。
6.短暂旋转测定板以将液体降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
7.将测定板在室温下温育60分钟。保护板免受光照。
8.通过IntelliCyt iQueTM Screener平台等高通量流式细胞仪从分析板上获取样品。
第三方案---IgG定量和轻链检测分析-逐步方案(示例):
1.涡旋蛋白G包被的珠粒(6-8um大小,0.5%v/v)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.1%牛血清白蛋白(BSA)中1:15稀释珠粒。混合稀释的珠粒,并按5uL/孔珠粒加入微量滴定测定板(96孔板或384孔板)的每个孔中;
2.在测定板的每个孔中,加入20uL IgG样品(IgG标准品以产生IgG标准曲线或悬浮CHO细胞培养物/分泌的IgG混合物或仅来自悬浮CHO细胞培养物的IgG上清液)。
3.短暂旋转测定板以将样品降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
4.将测定板在室温下温育30分钟。保护板免受光照。
5.制备组合检测试剂:制备20ug/mL FITC-Fc片段(Jackson ImmunoResearchLaboratory Inc.)和10ug/mL PE-F(ab′)2抗人Ig κ轻链(ThermoFisher)和20nM FL4膜完整性染料(IntelliCyt Corporation)在同一试管中的0.1%BSA PBS中。
6.在测定板的每个孔中加入5uL组合的检测试剂。
7.短暂旋转测定板以将样品降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
8.将测定板在室温下温育30分钟。保护板免受光照。
9.通过IntelliCyt iQue Screener平台等高通量流式细胞仪从测定板中采集样品。
实施例4:第4种方案---IgG定量和轻链检测分析-同时方案
1.制备组合检测试剂:制备20ug/mL FITC-Fc片段(Jackson ImmunoResearchLaboratory Inc.)和10ug/mL PE-F(ab′)2抗人Ig κ轻链(ThermoFisher)和20nM FL4膜完整性染料(IntelliCyt Corporation)在同一试管中的0.1%BSA PBS中。
2.在微量滴定测定板(96孔板或384孔板)的每个孔中加入5uL组合的检测试剂。
3.在测定板的每个孔中,添加20uL IgG样品(IgG标准品以产生IgG标准曲线或悬浮CHO细胞培养物/分泌的IgG混合物或仅来自悬浮CHO细胞培养物的IgG上清液)。
4.短暂旋转测定板以将样品和组合的检测试剂混合物降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
5.涡旋蛋白G包被的珠粒(6-8um大小,0.5%v/v)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.1%牛血清白蛋白(BSA)中1∶15稀释珠粒。混合稀释的珠粒,并用样品/检测混合物将5uL/孔珠粒加入到测定板的每个孔中。
6.短暂旋转测定板以将液体降至孔底(500g×8秒)。在板振荡器(2000rpm×20秒)上将板中的样品混合。
7.将测定板在室温下温育60分钟。保护板免受光照。
8.通过IntelliCyt iQue Screener平台等高通量流式细胞仪从分析板上获取样品。
Claims (53)
1.一种从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法,包括:
(a)在微量滴定板中的多个孔中,将含有IgG抗体的生物样品与检测试剂一起温育,其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白或其片段与其所述IgG抗体均匀混合的时间和条件下发生,以在所述多个孔的每个孔中产生IgG抗体-靶IgG蛋白混合物;
(b)将所述多个孔的每个孔中的所述IgG抗体-靶IgG蛋白混合物与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合,其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白或其片段和所述IgG抗体结合至所述IgG同种型特异性捕获试剂群的时间和条件下进行,以产生IgG同种型特异性结合复合物;以及
(c)检测来自所述IgG同种型特异性结合复合物的信号,以确定所述生物样品中存在的一种或多种IgG抗体同种型的浓度,其中所述生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与从相关IgG同种型特异性结合复合物中检测到的所述信号成反比。
2.根据权利要求1所述的方法,还包括
(d)温育对照样品的系列稀释液和所述检测试剂以产生对照混合物,其中所述对照样品的所述系列稀释液的每种稀释液存在于微量滴定板的单独孔中,其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育发生在促进所述对照样品中所述未标记的IgG蛋白同种型和一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段混合的时间和条件下;
(e)将所述对照混合物与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段和所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获珠群竞争性结合的时间和条件下进行,以产生对照IgG同种型特异性结合复合物;以及
(f)通过分析来自所述IgG同种型特异性结合复合物的所述信号产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中每种生物样品中的一种或多种IgG抗体同种型的浓度通过参考所述每种IgG蛋白同种型的标准曲线来测量。
3.一种用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)同种型抗体浓度的方法,包括:
(a)在微量滴定板中的多个孔中,将表达IgG抗体的多个生物样品与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子,其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合;其中所述温育在促进所述IgG抗体与所述IgG同种型特异性捕获试剂的结合的时间和条件下进行,以产生IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物;
(b)将所述IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物与检测试剂一起温育,其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂复合物上的未占据位点结合的时间和条件下发生,以产生可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物;
(c)在所述可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物上检测来自所述可检测标记的靶IgG蛋白的信号,以确定一种或多种IgG抗体同种型的浓度,其中存在于所述生物样品中的IgG抗体同种型蛋白的量与检测到的信号成反比。
4.根据权利要求3所述的方法,还包括
(d)温育对照样品的系列稀释液与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群以产生对照混合物,其中所述对照样品的所述系列稀释液的每个稀释液存在于微量滴定板的单独孔中,其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段,其中所述温育在促进所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型与所述IgG同种型特异性捕获试剂结合的时间和条件下进行,以产生对照复合物;
(e)将所述对照复合物与所述检测试剂一起温育,其中所述温育在促进一种或多种可检测标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂上的未占据位点的结合的时间和条件下进行;并且
(f)通过分析来自与所述IgG同种型特异性捕获试剂群结合的可检测标记的IgG同种型的信号,产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线,其中通过参考每种IgG蛋白同种型的所述标准曲线,测量每种生物样品中一种或多种IgG同种型的浓度。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述检测试剂包含确定比例的两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,并在每个生物样本中确定两种或更多种IgG抗体同种型的浓度。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述检测试剂包含确定比例的三种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,并确定在每个生物样本中三种或更多种IgG抗体同种型的浓度。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述检测试剂包含确定比例的四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段,并确定在每个生物样本中四种或更多种IgG抗体同种型的浓度。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述检测试剂还包含可检测的细胞活力标记,并且其中所述方法还包括测量每种生物样品中的细胞活力和/或细胞数。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述结合分子结合的所述表面包含珠粒。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中每个捕获试剂群是可单独区分的。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述结合分子包含抗体、affimers适体和/或Fc受体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述方法还包括确定每种生物样品中的总IgG抗体浓度。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述生物样品包含细胞样品。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述生物样品是未稀释的样品。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述方法不包括任何洗涤步骤。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述生物样品包含小鼠B细胞或者小鼠细胞杂交瘤上清液,所述上清液具有或不具有细胞,其中所述不同的IgG同种型选自小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、和IgG3。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述生物样品包含人细胞,其中所述不同的IgG同种型选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述生物样品包含大鼠细胞,其中所述不同的IgG同种型选自大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述生物样品包括:
(i)兔细胞或绵羊细胞,其中所述不同的IgG同种型选自兔或绵羊IgG;
(ii)山羊细胞、猪细胞或牛细胞,其中所述不同的IgG同种型选自山羊、猪或牛IgG1和IgG2;
(iii)马细胞,其中所述不同的IgG同种型选自马IgG1、IgGb、IgGt;或者
(iv)猴细胞,其中所述不同的IgG同种型选自猴IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
20.一种试剂盒,包括:
(a)检测试剂,其包含确定比例的两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段;和
(b)两种或更多种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合不同IgG抗体同种型的结合分子,其中每种捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合。
21.根据权利要求20所述的试剂盒,其中所述表面包含珠粒。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒,其中每个捕获试剂群是可单独区分的。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的试剂盒,其中所述结合分子包含抗体。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的试剂盒,还包括:
(c)对照样品,其包含确定比例的两种或更多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段,所述两种或更多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段对应于所述检测试剂中的所述两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的试剂盒,其中:
所述检测试剂包括确定比例的三种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段;和
所述捕获试剂包含三种或更多种捕获试剂群。
26.根据权利要求20-24中任一项所述的试剂盒,其中:
所述检测试剂包括确定比例的四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段;和
所述捕获试剂包含四种或更多种捕获试剂群。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的试剂盒,其中所述对照样品包含确定比例的三种或更多种或四种或更多种不同的且未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段,所述三种或更多种或四种或更多种不同的且未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段对应于在所述检测试剂中的所述三种或更多种或四种或更多种不同的且可检测标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒,其中:
所述检测试剂包括确定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶小鼠IgG蛋白同种型,其选自gG1、IgG2a、IgG2b和IgG3或其抗原性片段;和
所述捕获试剂包含2、3或4种捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的不同小鼠IgG抗体同种型的结合分子。
29.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒,其中:
所述检测试剂包括确定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶人IgG蛋白同种型,其选自gG1、IgG2、IgG3和IgG4或其抗原片段;和
所述捕获试剂包含2、3或4种捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的不同人IgG抗体同种型的结合分子。
30.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒,其中:
所述检测试剂包括限定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶大鼠IgG蛋白同种型,其选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或其片段;和
所述捕获试剂包含2、3或4种捕获试剂群,其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c的不同大鼠IgG抗体同种型的结合分子。
31.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒,其中,
(A)检测试剂包括确定比例的:
(i)2种不同的且可检测标记的靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型,选自IgG1、IgG2或其片段;
(ii)2或3种不同的且可检测标记的靶马IgG蛋白同种型,选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段;或者
(iii)2、3或4种不同的且可检测标记的靶猴IgG蛋白同种型,选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段;并且
(B)捕获试剂包括
(i)2种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2或其片段的不同靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型的结合分子;
(ii)2或3种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段的不同马IgG蛋白同种型的结合分子;或者
(iii)2、3或4种捕获试剂群,其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段的不同猴IgG蛋白同种型的结合分子。
32.一种用于分析多个细胞样品的免疫球蛋白γ(IgG)抗体产生的方法,所述方法包括:
(a)将多个细胞样品转移到具有多个样品孔的测定板中,其中每个样品孔含有表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物的细胞样品,并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物,其中分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中所述捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)第一检测分子,其包含(A)对照IgG抗体或其片段,和(B)第一可检测部分;
(b)将所述多种分析混合物在促进所述靶IgG抗体和所述第一检测分子与所述捕获珠的结合的时间和条件下温育;和
(c)通过流式细胞术分析确定所述多种分析混合物的每种分析混合物中的所述目标IgG抗体浓度。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述细胞培养物从单个克隆繁殖。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法,其中所述捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法,其中所述捕获珠粒是磁珠或琼脂糖珠。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法,其中所述测定板在转移所述多个样品之前含有冻干的分析试剂。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法,其中将所述分析试剂与所述多个样品混合包括将所述分析试剂添加到所述孔中的所述细胞样品中。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法,其中在流式细胞仪中读取所述测定板中的所述多种分析混合物之前,将所述测定板离心。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法,其中所述混合包括同时混合所述多种细胞样品和所有分析试剂,其中所述第一检测分子与所述靶IgG抗体竞争结合所述捕获珠;并且其中在每种分析混合物中与所述捕获珠结合的所述第一检测分子的量提供给定分析混合物中所述靶IgG抗体浓度的测量。
40.根据权利要求32-38中任一项所述的方法,其中所述混合包括逐步添加所述捕获珠和所述第一检测分子,其中所述逐步添加包括:
首先将所述多个细胞样品与所述捕获珠在促进所述靶IgG抗体与所述捕获珠结合的时间和条件下混合,以产生多个第一混合物,然后将所述第一检测分子加入所述多个第一混合物中,在促进所述第一检测分子与所述捕获珠结合的时间和条件下,以产生多种分析混合物;
其中在每种分析混合物中与所述捕获珠结合的所述第一检测分子的量提供给定分析混合物中所述靶IgG抗体浓度的测量。
41.一种用于分析多个细胞样品的免疫球蛋白γ(IgG)抗体产生的方法,所述方法包括:
(a)将多个细胞样品转移到具有多个样品孔的测定板中,其中每个样品孔含有表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物的细胞样品,并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物,其中所述分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中所述捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)包含第一可检测部分的第一检测分子;
(b)将所述多种分析混合物在促进所述靶IgG抗体和所述第一检测分子与所述捕获珠的结合的时间和条件下温育;并且
(c)通过流式细胞术分析确定所述多种分析混合物的每种分析混合物中的所述目标IgG抗体浓度。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述第一检测分子缺乏免疫球蛋白轻链并且能够结合所述捕获珠。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述方法还包括使所述多种分析混合物与第二检测分子在促进所述第二检测分子与结合于所述捕获珠的所述靶IgG抗体结合的时间和条件下接触;
其中所述第二检测分子包含可检测标记的抗-IgG轻链抗体,其与所述第一检测分子在光学上可区分;和
其中在每种分析混合物中与所述靶IgG抗体结合的所述第二检测分子的量提供给定分析混合物中完整靶IgG抗体浓度的测量。
44.根据权利要求43所述的方法,其中将所述多种分析混合物离心并在加入所述标记的抗轻链抗体之前进行洗涤步骤。
45.根据权利要求32-44中任一项所述的方法,其中所述分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。
46.根据权利要求31-45中任一项所述的方法,还包括确定以下中的一个或多个:
(i)每种分析混合物中的多种细胞;
(ii)每种分析混合物中活细胞的百分比;
(ii)每种分析混合物中每个细胞的靶IgG抗体浓度;和/或
(iii)每种分析混合物中每个活细胞的靶IgG抗体浓度。
47.一种试剂盒,包括:
(a)测定板,和
(b)分析试剂,其中所述分析试剂包括:
(i)捕获珠,其中所述捕获珠与IgG抗体结合;和
(ii)包含第一可检测部分的第一检测分子。
48.根据权利要求47所述的试剂盒,其中所述第一检测分子包含对照IgG抗体或其片段。
49.根据权利要求47或48所述的试剂盒,其中所述试剂盒还包含可检测标记的与所述第一检测分子在光学上可区分的抗轻链抗体。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的试剂盒,其中所述分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获珠粒是磁珠或琼脂糖珠。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的试剂盒,其中所述测定板含有冻干的分析试剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762447772P | 2017-01-18 | 2017-01-18 | |
US62/447,772 | 2017-01-18 | ||
PCT/US2017/063516 WO2018136152A1 (en) | 2017-01-18 | 2017-11-28 | METHODS AND REAGENTS FOR DETERMINING IMMUNOGLOBULIN GAMMA (IgG) ANTIBODY ISOTYPE CONCENTRATION FROM BIOLOGICAL SAMPLES |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110178034A true CN110178034A (zh) | 2019-08-27 |
Family
ID=60935935
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780083652.8A Pending CN110178034A (zh) | 2017-01-18 | 2017-11-28 | 用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法和试剂 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11733237B2 (zh) |
EP (2) | EP3674712A1 (zh) |
JP (2) | JP6878597B2 (zh) |
KR (2) | KR102491559B1 (zh) |
CN (1) | CN110178034A (zh) |
WO (1) | WO2018136152A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115327137A (zh) * | 2022-10-11 | 2022-11-11 | 苏州惠中生物科技有限公司 | 一种人免疫球蛋白g4亚型化学发光免疫检测试剂盒 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220137077A1 (en) * | 2019-03-01 | 2022-05-05 | Ava Lifescience Gmbh | Flow Cytometry Measurement Method and Kit for Carrying Out Same |
CN114807054B (zh) * | 2022-06-24 | 2022-09-13 | 北京索莱宝科技有限公司 | 小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1524180A (zh) * | 2001-04-10 | 2004-08-25 | 纽约市哥伦比亚大学信托人 | 新型微列阵及其使用方法 |
US20050153381A1 (en) * | 2002-02-14 | 2005-07-14 | Marusich Michael F. | Immunocapture of mitochondrial protein complexes |
US20050255491A1 (en) * | 2003-11-13 | 2005-11-17 | Lee Frank D | Small molecule and peptide arrays and uses thereof |
CN1768269A (zh) * | 2003-02-06 | 2006-05-03 | 阿克西斯-希尔德公司 | 蛋白质同种型的测定 |
CN1806053A (zh) * | 2003-04-14 | 2006-07-19 | 美国红十字会 | 对蛋白的结构同工型特异的配体的鉴定方法 |
US20090220989A1 (en) * | 2005-12-05 | 2009-09-03 | Guava Technologies | Particle-Based Analyte Characterization |
CN101871937A (zh) * | 2010-06-18 | 2010-10-27 | 中国检验检疫科学研究院 | 多种小分子化合物的同步间接竞争免疫检测法及试剂盒 |
CN103197077A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-07-10 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种检测微量牛免疫球蛋白g的试剂盒 |
CN103547921A (zh) * | 2011-04-18 | 2014-01-29 | 微测试矩阵有限公司 | 免疫测定 |
CN105717033A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-06-29 | 王博 | 一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04363663A (ja) | 1990-10-22 | 1992-12-16 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 物質検出法 |
US5747352A (en) | 1994-05-23 | 1998-05-05 | Beckman Instruments, Inc. | Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents |
GB0002539D0 (en) | 2000-02-03 | 2000-03-29 | Lonza Biologics Plc | Process for the discrimination of immunoglobulin G-producing cells from non-immunoglobulin G-producing cells |
US20140031249A1 (en) | 2004-07-20 | 2014-01-30 | Sqi Diagnostics Systems Inc. | Multiplex measure of isotype antigen response |
BRPI0800612A2 (pt) | 2008-01-02 | 2009-08-25 | Fundacao Fapemig | método e kit para a quantificação de subclasses de igg humanas especìficas a alérgenos para o acompanhamento da imunoterapia especìfica |
US20130165335A1 (en) | 2008-12-29 | 2013-06-27 | Peter Lea | Multiplex measure of isotype antigen response |
GB201223316D0 (en) | 2012-12-21 | 2013-02-06 | Ucb Pharma Sa | Method |
CN105308457B (zh) | 2013-03-14 | 2018-07-10 | 斯坦福大学托管董事会 | 检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统 |
-
2017
- 2017-11-28 EP EP19216005.9A patent/EP3674712A1/en active Pending
- 2017-11-28 WO PCT/US2017/063516 patent/WO2018136152A1/en unknown
- 2017-11-28 JP JP2019536040A patent/JP6878597B2/ja active Active
- 2017-11-28 EP EP17825643.4A patent/EP3571509B1/en active Active
- 2017-11-28 US US15/824,905 patent/US11733237B2/en active Active
- 2017-11-28 CN CN201780083652.8A patent/CN110178034A/zh active Pending
- 2017-11-28 KR KR1020197019192A patent/KR102491559B1/ko active IP Right Grant
- 2017-11-28 KR KR1020237002198A patent/KR20230022256A/ko not_active Application Discontinuation
-
2021
- 2021-04-28 JP JP2021076093A patent/JP7170782B2/ja active Active
-
2023
- 2023-06-30 US US18/345,170 patent/US20230341381A1/en active Pending
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1524180A (zh) * | 2001-04-10 | 2004-08-25 | 纽约市哥伦比亚大学信托人 | 新型微列阵及其使用方法 |
US20050153381A1 (en) * | 2002-02-14 | 2005-07-14 | Marusich Michael F. | Immunocapture of mitochondrial protein complexes |
CN1768269A (zh) * | 2003-02-06 | 2006-05-03 | 阿克西斯-希尔德公司 | 蛋白质同种型的测定 |
CN1806053A (zh) * | 2003-04-14 | 2006-07-19 | 美国红十字会 | 对蛋白的结构同工型特异的配体的鉴定方法 |
US20050255491A1 (en) * | 2003-11-13 | 2005-11-17 | Lee Frank D | Small molecule and peptide arrays and uses thereof |
US20090220989A1 (en) * | 2005-12-05 | 2009-09-03 | Guava Technologies | Particle-Based Analyte Characterization |
CN101871937A (zh) * | 2010-06-18 | 2010-10-27 | 中国检验检疫科学研究院 | 多种小分子化合物的同步间接竞争免疫检测法及试剂盒 |
CN103547921A (zh) * | 2011-04-18 | 2014-01-29 | 微测试矩阵有限公司 | 免疫测定 |
CN103197077A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-07-10 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种检测微量牛免疫球蛋白g的试剂盒 |
CN105717033A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-06-29 | 王博 | 一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
F.MARAÑÓN 等: "A Competitive Enzyme Immunoassay Subclass® for the Determination of Total IgG—Subclass Levels in Human Serum", 《JOURNAL OF IMMUNOASSAY》 * |
THERMO FISHER SCIENTIFIC INC: "AbC™ Total Antibody Compensation Bead Kit", 《TOTAL ANTIBODY COMPENSATION BEAD KIT》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115327137A (zh) * | 2022-10-11 | 2022-11-11 | 苏州惠中生物科技有限公司 | 一种人免疫球蛋白g4亚型化学发光免疫检测试剂盒 |
CN115327137B (zh) * | 2022-10-11 | 2023-01-17 | 苏州惠中生物科技有限公司 | 一种人免疫球蛋白g4亚型化学发光免疫检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3571509A1 (en) | 2019-11-27 |
JP7170782B2 (ja) | 2022-11-14 |
JP6878597B2 (ja) | 2021-05-26 |
WO2018136152A1 (en) | 2018-07-26 |
WO2018136152A9 (en) | 2019-05-16 |
EP3674712A1 (en) | 2020-07-01 |
EP3571509B1 (en) | 2023-05-10 |
KR20230022256A (ko) | 2023-02-14 |
US20180203002A1 (en) | 2018-07-19 |
US11733237B2 (en) | 2023-08-22 |
US20230341381A1 (en) | 2023-10-26 |
JP2020505583A (ja) | 2020-02-20 |
KR102491559B1 (ko) | 2023-01-25 |
JP2021120679A (ja) | 2021-08-19 |
KR20190104998A (ko) | 2019-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105242004B (zh) | 整体决策液份分级 | |
CN107110854B (zh) | 分析液滴内容物的方法及相关装置 | |
JP5550182B2 (ja) | 複合試料マトリクスからの細胞の単離および計数の方法 | |
US9097640B2 (en) | Method, system, and compositions for cell counting and analysis | |
JP7170782B2 (ja) | 生物学的サンプルから免疫グロブリンγ(IgG)抗体アイソタイプの濃度を決定するための方法および試薬 | |
JPH08511340A (ja) | 細胞決定用イムノアッセイ | |
JPH06503643A (ja) | 混合細胞集団のサブ集団内部の細胞サブセットの検出と定量のための方法 | |
CN104246502B (zh) | 用于测定至少一种能够包含在液体样品中的分析物的装置 | |
CN108291909A (zh) | 分析物检测及其方法 | |
CN106460056A (zh) | 新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测试剂盒 | |
US20180238876A1 (en) | Method For Assessing Cell Surface Receptors of Blood Cells | |
CN1836165B (zh) | 用于检测低水平融合蛋白的方法 | |
CN105705948B (zh) | 用于生物分析的装置和方法 | |
US20070015134A1 (en) | Quantitative stabilized cell reference control products and methods | |
CN116482345B (zh) | 用于检测双靶点药物受体占有率的方法 | |
KR20240019077A (ko) | 나노규모 반응 챔버 및 이를 사용하는 방법 | |
Litwin et al. | 15Diagnostic Immunology | |
Litwin et al. | Part II: DIAGNOSTIC IMMUNOLOGY | |
KR20170123465A (ko) | 항-b형 간염 바이러스 항체 융합체를 포함하는 면역크로마토그래피용 테스트 스트립 및 이를 포함하는 진단용 키트 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220630 Address after: New York, United States Applicant after: Saidoris bioanalytical Instrument Co.,Ltd. Address before: Michigan, USA Applicant before: Essen Instruments DBA Essen Biosciences |