JP7170782B2 - 生物学的サンプルから免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体アイソタイプの濃度を決定するための方法および試薬 - Google Patents

Description

相互参照
本出願は、その全体が参照により本出願に組み込まれる２０１７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７７７２号に対する優先権を主張する。

背景
タンパク質バイオ医薬品は、最も急成長している治療様式である。これらの薬物は通常、患者に投与されて疾患に関与する特定の生理学的プロセスを変化させるタンパク質（すなわち、ＩｇＧ）分子である。タンパク質バイオ医薬品の商業的製造プロセスは、時間のかかる高価で困難なプロセスである。これは、殆どのタンパク質バイオ医薬品が、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞など、生きた細胞株の中で製造されるためである。これらの細胞株は、典型的には、目的のタンパク質バイオ医薬品を産生して細胞外環境（細胞培養上清）に分泌するように遺伝子操作されている。バイオ医薬品が分泌されたら、それは、商業的利用のために回収および精製される。このプロセスには高額な費用がかかるため、非常に高レベルの目的のタンパク質を産生するように産生細胞株を操作することが望ましい。

発明の概要
一態様では、生物学的サンプルから免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体アイソタイプの濃度を決定するための方法であって、
（ａ）マイクロタイタープレート内の複数のウェルにおいて、ＩｇＧ抗体を含む生物学的サンプルを検出試薬と共にインキュベートするステップであって、検出試薬は、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質またはそのフラグメントとそのＩｇＧ抗体との均一な混合を促進して複数のウェルの各ウェルにおいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｂ）複数のウェルの各ウェルにおいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートするステップであって、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含み、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、表面に結合しており、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団に対する１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質またはそのフラグメントおよびＩｇＧ抗体の結合を促進してＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｃ）ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルを検出して、生物学的サンプル中に存在する１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度を決定するステップであって、生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプの量は、検出された関連するＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルに反比例する、ステップと、
を含む方法が提供される。

一実施形態において、方法は、
（ｄ）対照サンプルの段階希釈物を検出試薬と共にインキュベートして対照混合物を生成するステップであって、対照サンプルの段階希釈物の各希釈物は、マイクロタイタープレートの別々のウェルに存在し、対照サンプルは、検出試薬中の１種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに対応する１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、対照サンプル中の非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプと１種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントとの混合を促進するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｅ）対照混合物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートするステップであって、インキュベートは、１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉ビーズ集団に対する１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントおよび１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの競合的結合を促進して対照ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｆ）ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルの分析によって各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を作成するステップであって、各生物学的サンプルにおける１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を参照することによって測定される、ステップと、
をさらに含む。

別の態様では、生物学的サンプルから免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）アイソタイプ抗体の濃度を決定するための方法であって、
（ａ）マイクロタイタープレート内の複数のウェルにおいて、ＩｇＧ抗体を発現する複数の生物学的サンプルを１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートするステップであって、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含み、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、表面に結合しており、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬に対するＩｇＧ抗体の結合を促進してＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｂ）ＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体を検出試薬と共にインキュベートするステップであって、検出試薬は、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体上の未占有部位に対する検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの結合を促進して検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質－ＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｃ）検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質－ＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質からのシグナルを検出して１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度を決定するステップであって、生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプタンパク質の量は、検出されたシグナルに反比例する、ステップと、
を含む方法が提供される。

一実施形態において、方法は、
（ｄ）対照サンプルの段階希釈物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートして対照混合物を生成するステップであって、対照サンプルの段階希釈物の各希釈物は、マイクロタイタープレートの別々のウェルに存在し、対照サンプルは、検出試薬中の１種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに対応する１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬に対する１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプの結合を促進して対照複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｅ）対照複合体を検出試薬と共にインキュベートするステップであって、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬上の未占有部位に対する１種以上の検出可能なように標識されたＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの結合を促進するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｆ）ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団に結合した検出可能なように標識されたＩｇＧアイソタイプからのシグナルの分析によって各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を作成するステップであって、各生物学的サンプルにおける１種以上のＩｇＧアイソタイプの濃度は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を参照することによって測定される、ステップと、
をさらに含む。

いずれかの態様の様々な実施形態において、検出試薬は、規定比率の２種、３種、４種または５種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、２種、３種、４種または５種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度が各生物学的サンプルにおいて決定される。

さらなる実施形態では、検出試薬は、検出可能な細胞生存マーカーをさらに含んでよく、方法は、各生物学的サンプルにおいて細胞生存率および／または細胞数を測定することをさらに含む。別の実施形態では、結合分子が結合している表面は、ビーズを含んでよい。一実施形態において、各捕捉試薬集団は、別々に識別可能である。さらなる実施形態では、結合分子は、抗体、アフィマー（affimer）、アプタマーおよび／またはＦｃ受容体を含む。別の実施形態では、方法は、各生物学的サンプルにおいて総ＩｇＧ抗体濃度を決定することをさらに含む。さらなる実施形態では、生物学的サンプルは、細胞サンプルを含む。一実施形態において、生物学的サンプルは、未希釈サンプルである。別の実施形態では、方法は、いかなる洗浄ステップも含まない。

一実施形態において、生物学的サンプルは、マウスＢ細胞、または細胞を含むか含まないマウス細胞ハイブリドーマ上清、を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からなる群より選択される。別の実施形態では、生物学的サンプルは、ヒト細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される。さらなる実施形態では、生物学的サンプルは、ラット細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ラットのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃからなる群より選択される。他の実施形態では、
（ｉ）生物学的サンプルは、ウサギ細胞またはヒツジ細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ウサギまたはヒツジのＩｇＧからなる群より選択される；
（ｉｉ）生物学的サンプルは、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウシ細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ヤギ、ブタまたはウシのＩｇＧ１およびＩｇＧ２からなる群より選択される；
（ｉｉｉ）生物学的サンプルは、ウマ細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ウマのＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧｔからなる群より選択される；または
（ｉｖ）生物学的サンプルは、サル細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、サルのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群より選択される。

別の態様では、
（ａ）規定比率の２種、３種、４種または５種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメント（antigenic fragment）を含む、検出試薬と、
（ｂ）２種、３種、４種または５種以上の捕捉試薬集団であって、各捕捉試薬集団は、異なるＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含み、各捕捉試薬集団中の結合分子は表面に結合している、２種、３種、４種または５種以上の捕捉試薬集団と、
を含むキットが提供される。

一実施形態において、表面は、ビーズを含む。別の実施形態では、各捕捉試薬集団は、別々に識別可能である。さらなる実施形態では、結合分子は、抗体を含む。別の実施形態では、キットは、検出試薬中の２種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントに対応する規定比率の２種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含む、対照サンプルをさらに含む。一実施形態において、対照サンプルは、検出試薬中の３種以上または４種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントに対応する規定比率の３種以上または４種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含む。

一実施形態において、検出試薬は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からなる群より選択される規定比率の２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的マウスＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含み、捕捉試薬は、２種、３種または４種の捕捉試薬集団を含み、各捕捉試薬集団は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からなる群より選択される異なるマウスＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。別の実施形態では、検出試薬は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される規定比率の２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的ヒトＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含み、捕捉試薬は、２種、３種または４種の捕捉試薬集団を含み、各捕捉試薬集団は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される異なるヒトＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。さらに他の実施形態では、検出試薬は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃからなる群より選択される規定比率の２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的ラットＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、捕捉試薬は、２種、３種または４種の捕捉試薬集団を含み、各捕捉試薬集団は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃからなる群より選択される異なるラットＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。様々な他の実施形態において、
（Ａ）検出試薬は、規定比率の、
（ｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２からなる群より選択される２種の異なる検出可能なように標識された標的ヤギ、ブタまたはウシＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメント；
（ｉｉ）ＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧｔからなる群より選択される２種または３種の異なる検出可能なように標識された標的ウマＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメント；あるいは
（ｉｉｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群より選択される２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的サルＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメント；
を含み、
（Ｂ）捕捉試薬は、
（ｉ）各捕捉試薬集団が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２からなる群より選択される異なる標的ヤギ、ブタまたはウシＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに選択的に結合する結合分子を含む、２種の捕捉試薬集団；
（ｉｉ）各捕捉試薬集団が、ＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧｔからなる群より選択される異なるウマＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに選択的に結合する結合分子を含む、２種または３種の捕捉試薬集団；あるいは
（ｉｉｉ）各捕捉試薬集団が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群より選択される異なるサルＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに選択的に結合する結合分子を含む、２種、３種または４種の捕捉試薬集団；
を含む。

別の態様では、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の産生について複数の細胞サンプルを分析するための方法であって、
（ａ）複数のサンプルウェルを有するアッセイプレートに複数の細胞サンプルを移すステップであって、各サンプルウェルが、標的ＩｇＧ抗体を発現する未希釈の細胞培養物である細胞サンプルを含む、ステップ、および複数の細胞サンプルを分析試薬と混合して複数の分析混合物を生成するステップであって、分析試薬が、
（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズ、および
（ｉｉ）（Ａ）対照ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントと、（Ｂ）第１の検出可能部分と、を含む第１の検出分子、
を含む、ステップ；
（ｂ）捕捉ビーズに対する標的ＩｇＧ抗体および第１の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で複数の分析混合物をインキュベートするステップ；ならびに
（ｃ）フローサイトメトリー分析によって複数の分析混合物の各分析混合物において標的ＩｇＧ抗体の濃度を決定するステップ；
を含む方法が提供される。

一実施形態において、細胞培養物は、単一のクローンから増殖させる。別の実施形態では、捕捉ビーズは、共有結合でプロテインＧまたはプロテインＡと連結されている。さらなる実施形態では、捕捉ビーズは、磁気ビーズまたはアガロースビーズである。別の実施形態では、複数のサンプルが移される前に、アッセイプレートは、凍結乾燥された分析試薬を含む。一実施形態において、分析試薬を複数のサンプルと混合することは、ウェル中の細胞サンプルに分析試薬を添加することを含む。別の実施形態では、アッセイプレートは、フローサイトメーターにおいてアッセイプレート内の複数の分析混合物を読み取る前に遠心分離される。さらなる実施形態では、混合は、複数の細胞サンプルと全ての分析試薬とを同時に混合することを含み、ここで、第１の検出分子は、捕捉ビーズへの結合に関して標的ＩｇＧ抗体と競合し、各分析混合物における捕捉ビーズに結合した第１の検出分子の量は、所与の分析混合物における標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する。別の実施形態では、混合は、捕捉ビーズと第１の検出分子の段階的添加を含み、ここで、段階的添加は、
まず、捕捉ビーズに対する標的ＩｇＧ抗体の結合を促進して複数の第１の混合物を生成するような時間と条件下で複数の細胞サンプルを捕捉ビーズと混合してから、捕捉ビーズに対する第１の検出分子の結合を促進して複数の分析混合物を生成するような時間と条件下で複数の第１の混合物に第１の検出分子を添加すること
を含み、各分析混合物における捕捉ビーズに結合した第１の検出分子の量は、所与の分析混合物における標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する。

別の態様では、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の産生について複数の細胞サンプルを分析するための方法であって、
（ａ）複数のサンプルウェルを有するアッセイプレートに複数の細胞サンプルを移すステップであって、各サンプルウェルが、標的ＩｇＧ抗体を発現する未希釈の細胞培養物である細胞サンプルを含む、ステップ、および複数の細胞サンプルを分析試薬と混合して複数の分析混合物を生成するステップであって、分析試薬が、
（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズ、および
（ｉｉ）第１の検出可能部分を含む第１の検出分子、
を含む、ステップ；
（ｂ）捕捉ビーズに対する標的ＩｇＧ抗体および第１の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で複数の分析混合物をインキュベートするステップ；ならびに
（ｃ）フローサイトメトリー分析によって複数の分析混合物の各分析混合物において標的ＩｇＧ抗体の濃度を決定するステップ；
を含む方法が提供される。

一実施形態において、第１の検出分子は、免疫グロブリン軽鎖を欠いており、且つ捕捉ビーズに結合することが可能である。別の実施形態では、方法は、捕捉ビーズに結合した標的ＩｇＧ抗体に対する第２の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で複数の分析混合物を第２の検出分子と接触させることをさらに含み、ここで、
第２の検出分子は、第１の検出分子と光学的に区別できる検出可能なように標識された抗ＩｇＧ軽鎖抗体を含み、
各分析混合物における標的ＩｇＧ抗体に結合した第２の検出分子の量は、所与の分析混合物におけるインタクトな標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する。

別の実施形態では、標識された抗軽鎖抗体が添加される前に、複数の分析混合物は、遠心分離され、洗浄ステップに供される。さらなる実施形態では、分析試薬は、細胞生存染料（cell viability dye）、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーのうちの１つ以上をさらに含む。様々な実施形態において、方法は、
（ｉ）各分析混合物における細胞の数；
（ｉｉ）各分析混合物における生存細胞のパーセンテージ；
（ｉｉ）各分析混合物における細胞あたりの標的ＩｇＧ抗体の濃度；および／または
（ｉｉｉ）各分析混合物における生存細胞あたりの標的ＩｇＧ抗体の濃度；
のうちの１つ以上を決定することをさらに含む。

別の態様では、
（ａ）アッセイプレート、および
（ｂ）（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズと、（ｉｉ）第１の検出可能部分を含む第１の検出分子と、を含む分析試薬、
を含むキットが提供される。

一実施形態において、第１の検出分子は、対照ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、キットは、第１の検出分子と光学的に区別できる検出可能なように標識された抗軽鎖抗体をさらに含む。さらなる実施形態では、分析試薬は、細胞生存染料、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーのうちの１つ以上をさらに含む。別の実施形態では、捕捉ビーズは、共有結合でプロテインＧまたはプロテインＡと連結されている。さらなる実施形態では、捕捉ビーズは、磁気ビーズまたはアガロースビーズである。別の実施形態では、アッセイプレートは、凍結乾燥された分析試薬を含む。

図１は、４種の異なるＩｇＧアイソタイプを捕捉するための４種の捕捉ビーズを用いたマルチプレックス競合アッセイフォーマットの図である。 図２は、マイクロタイタープレートにおける標準ウェルの例示的なセットアップの図である。

詳細な説明
引用される参考文献は全て、その全体が参照により本出願に組み込まれる。

本出願で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうではないことを文脈が明らかに指示しない限り、複数の指示対象を包含する。「および（ａｎｄ）」は、本出願で使用される場合、そうではないことが明記されない限り、「または（ｏｒ）」と同じ意味で使用される。

本発明の任意の態様の全ての実施形態は、そうではないことを文脈が明らかに指示しない限り、組み合わせて使用できる。

文脈上明らかに別段の要求がない限り、説明および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の単語は、排他的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味で（すなわち、「～を包含するがそれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という意味で）解釈されるべきである。単数形または複数形を用いる単語は、それぞれ複数形および単数形も包含する。さらに、単語「本出願で（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上記（ａｂｏｖｅ）」および「以下（ｂｅｌｏｗ）」ならびに同様の意味の単語は、本出願において使用される場合、本出願の特定の部分を指すのではなく、本出願全体を指すものとする。

本開示の実施形態の説明は、網羅的であることを意図するものでも、開示される形態そのものに開示を限定することを意図するものでもない。説明を目的として本開示の特定の実施形態と例が本出願で説明されているが、当業者であれば認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の改変が可能である。

第１の態様では、生物学的サンプルから免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体アイソタイプの濃度を決定するための方法であって、
（ａ）マイクロタイタープレート内の複数のウェルにおいて、ＩｇＧ抗体を含む生物学的サンプルを検出試薬と共にインキュベートするステップであって、検出試薬は、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質またはそのフラグメントとそのＩｇＧ抗体との均一な混合を促進して複数のウェルの各ウェルにおいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｂ）複数のウェルの各ウェルにおいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートするステップであって、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含み、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、表面に結合しており、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団に対する１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質またはそのフラグメントおよびＩｇＧ抗体の結合を促進してＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｃ）ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルを検出して、生物学的サンプル中に存在する１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度を決定するステップであって、生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプの量は、検出された関連するＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルに反比例する、ステップと、
を含む方法が提供される。

当該方法は、生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプが、検出された関連するＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルに反比例する、という逆相関に基づいて、生物学的サンプル中に存在する１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度を決定することを可能にする。

単離されたＩｇＧ抗体分泌細胞、ＩｇＧ抗体分泌細胞の集団、そのような細胞の上清、それらの細胞抽出物、血清、血清抽出物、体液（血液を包含するがこれに限定されない）および体液抽出物（血液抽出物を包含するがこれに限定されない）を包含するがこれらに限定されない、ＩｇＧ抗体を含む任意の好適な生物学的サンプルが使用されてよい。非限定的な実施形態において、生物学的サンプルは、抗体分泌Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、その上清（すなわち、細胞成分を含むか含まない、細胞またはハイブリドーマが培養された細胞培養培地）、またはその細胞抽出物を含んでよい。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、単一のクローンから増殖させた細胞を含む。他の実施形態では、生物学的サンプルは、未定義の細胞集団を含む。一実施形態において、生物学的サンプルは、細胞／ハイブリドーマ培養物からの未希釈サンプルなど、未希釈サンプルである。本発明の方法は、細胞／ハイブリドーマ培養物サンプルの希釈を伴わないＩｇＧ抗体アイソタイプの定量化を可能にするが、これは、以前の抗体濃度検出技術を用いては不可能であり、希釈係数の主観的推測を必要とする可能性がある中間のサンプル希釈ステップを除外することによってアッセイのワークフローを大幅に単純化する。

生物学的サンプルは、ヒト、げっ歯類（すなわち、マウス、ラット、ハムスター等）、ウサギ、ブタ、ヤギ、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ等を包含するがこれらに限定されない、任意の起源のものであってよい。

本出願で使用される場合、生物学的サンプル中のＩｇＧ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。特定の実施形態では、生物学的サンプル中のＩｇＧ抗体は、モノクローナル抗体、そのフラグメント、またはその免疫学的結合等価物（immunological binding equivalent）である。そのような抗体には、細胞が発現し得るか発現するように操作され得る任意のタイプの抗体が包含され、当該任意のタイプの抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ジスルフィド連結型Ｆｖ（disulfide-linked Fv）（ｓｄＦｖ）フラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体（intra-body）、合成抗体、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント、およびＩｇＧのＦｃ領域に相当する領域を含む融合タンパク質を包含するが、これらに限定されない。

検出試薬は、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプ、または対応するＩｇＧ抗体アイソタイプに結合する能力を保持するそのフラグメント、を含む。様々な実施形態において、検出試薬は、２種、３種、４種、５種または６種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。そのようなＩｇＧタンパク質は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを含むいくつかの業者から商業的に入手可能である。各標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、特定のＩｇＧ抗体アイソタイプに結合する能力を有する。非限定的な一実施形態において、生物学的サンプルは、マウスＢ細胞またはマウス細胞ハイブリドーマ上清（細胞を含むか含まない）を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からなる群より選択される。この実施形態では、検出試薬は、１種、２種、３種または４種の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよび／またはＩｇＧ３）またはそのフラグメントを含む。別の非限定的な実施形態では、生物学的サンプルは、ヒト抗体分泌細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される。この実施形態では、検出試薬は、１種、２種、３種または４種の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。さらなる非限定的な実施形態では、生物学的サンプルは、ラット抗体分泌細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ラットのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃからなる群より選択される。この実施形態では、検出試薬は、１種、２種、３種または４種の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。様々なさらなる実施形態では、
（ｉ）生物学的サンプルは、ウサギまたはヒツジの抗体を分泌する細胞を含み、唯一のＩｇＧアイソタイプは、ウサギまたはヒツジのＩｇＧである；
（ｉｉ）生物学的サンプルは、ヤギ、ブタまたはウシの抗体を分泌する細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ヤギ、ブタまたはウシのＩｇＧ１およびＩｇＧ２からなる群より選択される。この実施形態では、検出試薬は、１種または２種の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む；
（ｉｉｉ）生物学的サンプルは、ウマの抗体を分泌する細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、ウマのＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧｔからなる群より選択される。これらの実施形態では、検出試薬は、１種、２種または３種の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む；あるいは
（ｉｖ）生物学的サンプルは、抗体を分泌するサル細胞を含み、異なるＩｇＧアイソタイプは、サルのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群より選択される。この実施形態では、検出試薬は、１種、２種、３種または４種の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。

様々な実施形態において、検出試薬は、規定比率の２種、３種、４種または５種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。この実施形態は、生物学的サンプルにおける２種、３種、４種または５種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度の、より迅速な定量化を可能にする。その比率が分かっている限り、任意の規定比率の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントが使用されてよい。非限定的な一実施形態において、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの各々は、ほぼ同じ濃度で存在する。別の非限定的な実施形態では、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの各々は、ほぼ同じ量（すなわち、３種の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントが存在する場合には約１：１：１）で存在する。

任意の好適な濃度の標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントがアッセイで使用されてよい。非限定的な一実施形態において、検出試薬中の各標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌで存在する。様々な他の実施形態では、検出試薬中の各標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１２５μｇ／ｍｌで存在する。

蛍光標識、ハプテン、比色標識（colorimetric label）、様々な放射性標識、酵素、補欠分子族（prosthetic group）、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、標識された粒子（シリコン、ガラスまたは金属の粒子）、タンパク質－タンパク質結合ペア、タンパク質－抗体結合ペア等を包含するがこれらに限定されない、任意の好適な検出可能標識が使用されてよい。蛍光標識の例としては、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン（dichlorotriazinylamine fluorescein）、シアニン、塩化ダンシル、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ブリリアントバイオレット染料（brilliant violet dye）、ブリリアントウルトラバイオレット染料（brilliant ultraviolet dye）およびフィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。生物発光マーカーの例としては、ルシフェラーゼ（例えば、細菌のもの、ホタルのもの、コメツキムシ（click beetle）のもの等）、ルシフェリン、エクオリン等が挙げられるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素システムの例としては、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ（glucorinidase）、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能標識は、様々な供給元から商業的に入手可能である。特定の実施形態では、検出標識は、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質を含む。検出試薬が、２種、３種、４種または５種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む場合、異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの集団の各々は、目的の検出アッセイに応じて、同じ標識または区別可能な標識を有してよい。

さらなる実施形態では、検出試薬は、検出可能な細胞生存マーカーをさらに含み、方法は、各生物学的サンプルにおいて細胞生存率および／または細胞数を測定することをさらに含む。任意の好適な細胞生存マーカーが使用されてよい。細胞生存染料は、サンプルにおける非生存細胞の検出を可能にし得る。例えば、細胞生存染料は、細胞内の標的について細胞調製物がフローサイトメトリーによって分析されている場合でさえ、死細胞を恒久的に標識して分析からそれらを除外することを可能にし得る（例えば、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、一般的に生存細胞から排除される膜不透過性染料である）。細胞生存染料はまた、生細胞を標識することもできる。例えば、非蛍光化合物は、生細胞に自由に侵入し、細胞内のエステラーゼがそれを蛍光色素に変換する。そのような例では、固定または透過処理の後に当該色素が細胞内に保持されず、従って、細胞内染色プロトコルには有用でない。一部の実施形態において、分析試薬は、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーをさらに含む。当業者であれば、細胞表面マーカーが、細胞の表面上に発現されるタンパク質であり、しばしば特定の細胞型のマーカーとして便利に役立ち得る、ということを認識するであろう。例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞の表面マーカーは、分化プロセスにおけるそれらの系列と段階を特定する。

インキュベートは、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質またはそのフラグメントとそのＩｇＧ抗体との均一な混合を促進して複数のウェルの各ウェルにおいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を生成するような時間と条件下で行われる。そのような均一な混合を促進する任意の好適な条件が用いられてよく、温度、湿度レベル、インキュベートの長さ、撹拌または他の混合の力の適用、使用される培地等などの適切な条件を決定することは十分に当技術分野における通常の知識のレベルの範囲内である。

方法は、複数のウェルの各ウェルにおいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートすることを含み、ここで、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。各捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに対して特異的であり、従って、ＩｇＧアイソタイプに基づいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を分離するために使用することができる。特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する任意の好適な結合分子が使用されてよい。様々な非限定的な実施形態において、結合分子は、抗体、アフィマー、アプタマー、Ｆｃ受容体もしくは他のタンパク質／糖／脂質または組み合わせ分子を含む。特定の一実施形態では、結合分子は、ＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する抗体を含む。そのようなＩｇＧアイソタイプ選択的抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを含むいくつかの業者から商業的に入手可能である。

各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、表面に結合している。ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン支持体、磁気ビーズもしくは常磁性ビーズ、アガロースビーズおよび濾過媒体（ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＣＮＢｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなど）を包含するがこれらに限定されない、任意の好適な表面が用いられてよい。特定の一実施形態では、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどのビーズに結合している。磁気捕捉ビーズまたは常磁性捕捉ビーズは、典型的には、直径約１ｍｍ以下であり、沈降または目詰まりを防ぐのに十分なほど、十分に小さい。好適なビーズは、当業者に知られており、種々の供給元から入手できる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ（ノルウェー）のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ－Ｏｎｅ（商標）、またはＭｅｒｃｋ（フランス）のＥｓｔａｐｏｒｅ）。ビーズは、抗体または抗原の受動的または能動的なカップリングのために、結合分子と予めカップリングされてよいか結合分子でコーティングされてよい。他の実施形態では、捕捉ビーズは、アガロースビーズであってよい。典型的には、アガロースビーズは、直径約２０μｍ～３５０μｍである。別の特定の実施形態では、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、マイクロタイタープレートのウェル内のプリントされたアレイで存在する。

任意の好適な密度の捕捉試薬がアッセイにおいて使用されてよい。非限定的な一実施形態において、各捕捉試薬集団は、１ミリリットルあたり約１万個～約１億個の捕捉試薬という密度で存在する。様々なさらなる実施形態では、各捕捉試薬集団は、１ミリリットルあたり約１０万個～約５０００万個、約２５万個～約２５００万個、約５０万個～約１０００万個または約７５万個～約５００万個の捕捉試薬という密度で存在する。

インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団に対する１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質またはそのフラグメントおよびＩｇＧ抗体の結合を促進してＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体を生成するような時間と条件下で行われる。そのような均一な混合を促進する任意の好適な条件が用いられてよく、温度、湿度レベル、インキュベートの長さ、撹拌または他の混合の力の適用、使用される培地等などの適切な条件を決定することは十分に当技術分野における通常の知識のレベルの範囲内である。

生物学的サンプル中に存在する１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度を決定するためにＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からシグナル（すなわち、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントからのもの）が検出される。これは競合アッセイであるため、生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプの量は、検出された関連するＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルに反比例する。利用される検出可能な標識に応じて、ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルを検出するための任意の好適な技術が用いられてよく、それらには、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、プレートリーダー、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームおよび蛍光顕微鏡法が包含されるが、これらに限定されない。特定の一実施形態では、検出は、ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体を流体の流れに懸濁させてそれらを電子的検出装置に通すことによるフローサイトメトリーを伴い、これは、１秒あたり最大数万個の複合体の物理的および化学的な特性を同時にマルチパラメータ分析することを可能にする。

一実施形態において、方法は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を作成することをさらに含み、ここで、各生物学的サンプルにおける１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を参照することによって測定される。一つのそのような実施形態において、方法は、
（ｄ）対照サンプルの段階希釈物を検出試薬と共にインキュベートして対照混合物を生成するステップであって、対照サンプルの段階希釈物の各希釈物は、マイクロタイタープレートの別々のウェルに存在し、対照サンプルは、検出試薬中の１種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに対応する１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、対照サンプル中の非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプと１種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントとの混合を促進するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｅ）対照混合物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートするステップであって、インキュベートは、１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉ビーズ集団に対する１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントおよび１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの競合的結合を促進して対照ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｆ）ＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルの分析によって各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を作成するステップであって、各生物学的サンプルにおける１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を参照することによって測定される、ステップと、
をさらに含む。

この実施形態では、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントと１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団への結合に関して競合する。生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプの量は、検出された関連するＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルに反比例し、ＩｇＧアイソタイプ固有の標準曲線から補間でき、非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの濃度がゼロである対照ウェルから算出されたベースライン量を超える正の量によって定量化できる。

第２の態様では、生物学的サンプルから免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）アイソタイプ抗体の濃度を決定するための方法であって、
（ａ）マイクロタイタープレート内の複数のウェルにおいて、ＩｇＧ抗体を発現する複数の生物学的サンプルを１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートするステップであって、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含み、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、表面に結合しており、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬に対するＩｇＧ抗体の結合を促進してＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｂ）ＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体を検出試薬と共にインキュベートするステップであって、検出試薬は、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体上の未占有部位に対する検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの結合を促進して検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質－ＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｃ）検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質－ＩｇＧ抗体－ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬複合体上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質からのシグナルを検出して１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度を決定するステップであって、生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプタンパク質の量は、検出されたシグナルに反比例する、ステップと、
を含む方法が提供される。

この態様では、方法は、プレインキュベーションプロトコルに従う。

マウスハイブリドーマ培養物などのハイブリドーマ培養物の場合、完全競合アッセイプロトコルが好ましい可能性がある。このプロトコルは、マウスハイブリドーマ培養物で一般に見られるＩｇＧ範囲（１～５０μｇ／ｍＬ）の定量化を処理できる。

Ｂ細胞培養物の場合、プレインキュベーションアッセイプロトコルが好ましい可能性がある。このプロトコルは、調整された競合のプロトコルである。ＩｇＧのレベルが低いサンプルの場合、検出／競合試薬の添加前の捕捉試薬と生物学的サンプルとのプレインキュベーションにより、サンプル中の低レベルのＩｇＧがより良好に検出される可能性がある。このプロトコルは、例えばマウスＢ細胞培養物で一般に見られるマウスＩｇＧ範囲（０．１～２μｇ／ｍＬ）の定量化をより良好に処理できる。

本発明の第１の態様の全ての実施形態は、本発明の第２の態様における使用に適している。一実施形態において、方法は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を作成することをさらに含み、ここで、各生物学的サンプルにおける１種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を参照することによって測定される。一つのそのような実施形態において、方法は、
（ｄ）対照サンプルの段階希釈物を１種以上のＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団と共にインキュベートして対照混合物を生成するステップであって、対照サンプルの段階希釈物の各希釈物は、マイクロタイタープレートの別々のウェルに存在し、対照サンプルは、検出試薬中の１種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに対応する１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬に対する１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプの結合を促進して対照複合体を生成するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｅ）対照複合体を検出試薬と共にインキュベートするステップであって、インキュベートは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬上の未占有部位に対する１種以上の検出可能なように標識されたＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの結合を促進するような時間と条件下で行われる、ステップと、
（ｆ）ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団に結合した検出可能なように標識されたＩｇＧアイソタイプからのシグナルの分析によって各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を作成するステップであって、各生物学的サンプルにおける１種以上のＩｇＧアイソタイプの濃度は、各ＩｇＧタンパク質アイソタイプについての標準曲線を参照することによって測定される、ステップと、
をさらに含む。

この実施形態では、１種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントと１種以上の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団への結合に関して競合する。生物学的サンプル中に存在するＩｇＧ抗体アイソタイプの量は、検出された関連するＩｇＧアイソタイプ特異的結合複合体からのシグナルに反比例し、ＩｇＧアイソタイプ固有の標準曲線から補間でき、非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの濃度がゼロである対照ウェルから算出されたベースライン量を超える正の量によって定量化できる。

本発明の第１または第２の態様の一実施形態において、方法は、各生物学的サンプルにおける総ＩｇＧ抗体濃度を決定することをさらに含む。総ＩｇＧ抗体濃度を決定するための任意の好適な方法が使用されてよい。生物学的サンプル中に存在する各ＩｇＧアイソタイプの量が決定される実施形態では、この実施形態は、総ＩｇＧ抗体濃度に到達するために個々のＩｇＧアイソタイプの濃度の各々の量を加算することを単に必要とするだけである可能性がある。

本発明の第１または第２の態様の別の実施形態では、方法は、いかなる洗浄ステップも含まず、これは、労働集約的な処理時間を排除するとともに、細胞、ビーズまたはその両方のカウントなどの洗浄に関連した読み取りの変動を低減することによってデータの完全性を改善する。

第３の態様では、本開示は、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の産生について複数の細胞サンプルを分析するための方法であって、
（ａ）複数のサンプルウェルを有するアッセイプレートに複数の細胞サンプルを移すステップであって、各サンプルウェルが、標的ＩｇＧ抗体を発現する未希釈の細胞培養物である細胞サンプルを含む、ステップ、および複数の細胞サンプルを分析試薬と混合して複数の分析混合物を生成するステップであって、分析試薬が、
（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズ、および
（ｉｉ）（Ａ）対照ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントと、（Ｂ）第１の検出可能部分と、を含む第１の検出分子、
を含む、ステップ；
（ｂ）捕捉ビーズに対する標的ＩｇＧ抗体および第１の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で複数の分析混合物をインキュベートするステップ；ならびに
（ｃ）フローサイトメトリー分析によって複数の分析混合物の各分析混合物において標的ＩｇＧ抗体の濃度を決定するステップ；
を含む方法を提供する。一部の実施形態において、分析試薬と複数のサンプルとの混合は、ウェル中の細胞サンプルに分析試薬を添加することを含む。他の実施形態では、混合は、複数の細胞サンプルと全ての分析試薬とを同時に混合することを含み、ここで、第１の検出分子は、捕捉ビーズへの結合に関して標的ＩｇＧ抗体と競合し、各分析混合物における捕捉ビーズに結合した第１の検出分子の量は、所与の分析混合物における標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する。さらに別の実施形態では、方法は、捕捉ビーズと第１の検出分子の段階的添加を含み、ここで、段階的添加は、
まず、捕捉ビーズに対する標的ＩｇＧ抗体の結合を促進して複数の第１の混合物を生成するような時間と条件下で複数の細胞サンプルを捕捉ビーズと混合してから、捕捉ビーズに対する第１の検出分子の結合を促進して複数の分析混合物を生成するような時間と条件下で複数の第１の混合物に第１の検出分子を添加すること
を含み、各分析混合物における捕捉ビーズに結合した第１の検出分子の量は、所与の分析混合物における標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する。

特定の実施形態では、細胞培養物は、単一のクローンから増殖させる。他の実施形態では、細胞集団は、定義されていない。典型的には、目的の遺伝子が、候補産生細胞の集団に導入される。宿主染色体への染色体組込みは稀な事象であり、従って、通常、安定にトランスフェクトされた細胞は、様々な方法で選択および培養されなければならない。例えば、安定にトランスフェクトされた細胞の選択のために、選択マーカーが、目的の遺伝子と共発現される。Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの抗生物質に対する耐性、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはグルタミンシンセターゼを含め、トランスフェクトされた細胞を選択するための様々な系が存在する。そのような系は、当業者に周知である。遺伝子導入の後、細胞は、選択剤を含む培地において培養される。薬物耐性遺伝子を含むプラスミドが組み込まれた細胞のみが生き残る。目的の遺伝子が組み込まれた細胞の集団は、各ウェルに１つの細胞のみが配置されるように、希釈されてマルチウェル「マイクロタイター」プレートのウェルに分配される。これを行うための方法は、当技術分野において十分に説明されており、当業者に知られている。１ウェルあたり１つの細胞は、実際には、達成が困難な目標である。殆どのウェルは、１つの細胞を含むが、細胞がゼロのウェルおよび複数の細胞を含むウェルが数多く存在する。一般に、高レベルのタンパク質を分泌する少数の細胞株を見つけるには何十万ものウェルをスクリーニングする必要がある。

この第３の態様で使用される場合、用語「捕捉ビーズ」は、目的のＩｇＧ分子またはタンパク質への結合のための支持体を提供することができる任意の分子を指す。特定の実施形態では、捕捉ビーズは、目的のＩｇＧ分子またはタンパク質に特異的に結合する分子と共有結合で連結されている。例えば、プロテインＧおよびプロテインＡは、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を介して抗体に選択的に結合する。プロテインＧもしくはプロテインＡまたは他の免疫グロブリン結合性細菌タンパク質（プロテインＡ／ＧおよびプロテインＬなど）を用いて免疫グロブリンを結合／検出することができる。他の実施形態では、捕捉ビーズは、ＩｇＧ抗体を特異的に認識する抗体、または標的抗体が特異的に結合する分子、と共有結合で連結されてよい。一部の実施形態において、捕捉ビーズは、磁気ビーズまたはアガロースビーズである。磁気捕捉ビーズまたは常磁性捕捉ビーズは、典型的には、直径約１ｍｍ以下であり、沈降または目詰まりを防ぐのに十分なほど、十分に小さい。好適なマイクロビーズは、当業者に知られており、種々の供給元から入手できる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ（ノルウェー）のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ－Ｏｎｅ、またはＭｅｒｃｋ（フランス）のＥｓｔａｐｏｒｅ）。上記のように、ビーズは、抗体または抗原の受動的または能動的なカップリングのために、（プロテインＧなどの特異的親和性試薬と）予めカップリングされてよいか種々の分子でコーティングされてよい。他の実施形態では、捕捉ビーズは、アガロースビーズであってよい。典型的には、アガロースビーズは、直径約３５０μｍ～２０μｍである。

この第３の態様で使用される場合、用語「検出分子」は、目的の標的ＩｇＧ分子またはタンパク質の検出を可能にする任意の分子を指す。特定の実施形態では、検出分子は、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質などの検出可能部分を含む。検出可能部分を用いて検出分子を標識することができる。検出可能部分には、例えば、蛍光部分、ハプテン、比色部分（colorimetric moiety）、様々な放射性部分、酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質－タンパク質結合ペア、タンパク質－抗体結合ペア等が包含されてよい。蛍光部分の例としては、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、塩化ダンシル、フィコシアニン、フィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。生物発光マーカーの例としては、ルシフェラーゼ（例えば、細菌のもの、ホタルのもの、コメツキムシのもの等）、ルシフェリン、エクオリン等が挙げられるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素システムの例としては、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能部分は、様々な供給元から商業的に入手可能である。

特定の実施形態では、アッセイプレートは、凍結乾燥された分析試薬を含む。凍結乾燥は、高真空下での凍結物の急速な凍結と脱水による物質の安定調製物の創製である。凍結乾燥された生物材料は、インタクトであるとともに活性を有するはずであり、さらには、溶解が迅速であり実験室プロセスの自動化に理想的に適していること、ならびに製品の保管、輸送および最終使用者による貯蔵に望ましい、周囲温度での長い貯蔵寿命という利点を有する。

第４の態様では、本開示は、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の産生について複数の細胞サンプルを分析するための方法であって、
（ａ）複数のサンプルウェルを有するアッセイプレートに複数の細胞サンプルを移すステップであって、各サンプルウェルが、標的ＩｇＧ抗体を発現する未希釈の細胞培養物である細胞サンプルを含む、ステップ、および複数の細胞サンプルを分析試薬と混合して複数の分析混合物を生成するステップであって、分析試薬が、
（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズ、および
（ｉｉ）第１の検出可能部分を含む第１の検出分子、
を含む、ステップ；
（ｂ）捕捉ビーズに対する標的ＩｇＧ抗体および第１の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で複数の分析混合物をインキュベートするステップ；ならびに
（ｃ）フローサイトメトリー分析によって複数の分析混合物の各分析混合物において標的ＩｇＧ抗体の濃度を決定するステップ；
を含む方法を提供する。特定の実施形態では、第１の検出分子は、免疫グロブリン軽鎖を欠いており、且つ捕捉ビーズに結合することが可能である。一部の実施形態において、方法は、捕捉ビーズに結合した標的ＩｇＧ抗体に対する第２の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で複数の分析混合物を第２の検出分子と接触させることをさらに含み、ここで、第２の検出分子は、第１の検出分子と光学的に区別できる検出可能なように標識された抗ＩｇＧ軽鎖抗体を含み、各分析混合物における標的ＩｇＧ抗体に結合した第２の検出分子の量は、所与の分析混合物におけるインタクトな標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する。特定の実施形態では、標識された抗軽鎖抗体が添加される前に、複数の分析混合物は、遠心分離され、洗浄ステップに供される。

一部の実施形態において、分析試薬は、細胞生存染料、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーのうちの１つ以上をさらに含む。細胞生存染料は、サンプルにおける非生存細胞の検出を可能にし得る。例えば、細胞生存染料は、細胞内の標的について細胞調製物がフローサイトメトリーによって分析されている場合でさえ、死細胞を恒久的に標識して分析からそれらを除外することを可能にし得る（例えば、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、一般的に生存細胞から排除される膜不透過性染料である）。細胞生存染料はまた、生細胞を標識することもできる。例えば、非蛍光化合物は、生細胞に自由に侵入し、細胞内のエステラーゼがそれを蛍光色素に変換する。そのような例では、固定または透過処理の後に当該色素が細胞内に保持されず、従って、細胞内染色プロトコルには有用でない。一部の実施形態において、分析試薬は、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーをさらに含む。当業者であれば、細胞表面マーカーが、細胞の表面上に発現されるタンパク質であり、しばしば特定の細胞型のマーカーとして便利に役立ち得る、ということを認識するであろう。例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞の表面マーカーは、分化プロセスにおけるそれらの系列と段階を特定する。

特定の実施形態では、方法は、各分析混合物における細胞の数、各分析混合物における生存細胞のパーセンテージ、各分析混合物における細胞あたりの標的ＩｇＧ抗体の濃度、および／または各分析混合物における生存細胞あたりの標的ＩｇＧ抗体の濃度のうちの１つ以上を決定することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、既知のユーザー定義の標準品から濃度曲線をプロットし、それらのプロットを使用して、分泌タンパク質の濃度を決定する、分析ソフトウェアを伴ってよい。他の実施形態では、サンプル中に存在する産生細胞の数が決定される。ソフトウェアは、細胞数に対する分泌タンパク質の比率を自動的に決定し、細胞あたりの分泌タンパク質の濃度を算出し、細胞あたりの分泌タンパク質の値が最も高いウェルを特定する。ハイスループットフローサイトメトリーシステムがセルソーターと共に使用される場合、ソフトウェアはまた、高分泌細胞のウェルから個々の細胞を選別して所望の細胞株をさらに精製するようにシステムを制御する。

特定の実施形態では、本出願で開示される方法は、フローサイトメトリー分析に依存する。一部の実施形態において、フローサイトメトリー用のサンプルは、希釈されていない。他の例では、サンプルは、希釈されておらず、洗浄ステップを経ない。特定の実施形態では、サンプルは、フローサイトメーター（glow cytometer）で分析される前に洗浄されてよい。フローサイトメトリーは、細胞を流体の流れに懸濁させてそれらを電子的検出装置に通すことにより、細胞の計数、細胞選別、バイオマーカーの検出およびタンパク質工学において利用され得る。

第４の態様では、本発明は、
（ａ）規定比率の２種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含む、検出試薬と、
（ｂ）２種以上の捕捉試薬集団であって、各捕捉試薬集団は、異なるＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含み、各捕捉試薬集団中の結合分子は表面に結合している、２種以上の捕捉試薬集団と、
を含むキットを提供する。

この態様のキットは、例えば、本出願で説明される方法を実施するために使用されてよい。第１および第２の態様の検出試薬と捕捉試薬の実施形態は全て、この態様のキットにおいて用いられてよい。検出試薬は、２種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプ、または対応するＩｇＧ抗体アイソタイプに結合する能力を保持するそのフラグメント、を含む。様々な実施形態において、検出試薬は、３種、４種、５種または６種以上の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。各標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、特定のＩｇＧ抗体アイソタイプに結合する能力を有する。検出試薬は、規定比率の２種、３種、４種または５種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含む。この実施形態は、生物学的サンプルにおける２種、３種、４種または５種以上のＩｇＧ抗体アイソタイプの濃度の、より迅速な定量化を可能にする。その比率が分かっている限り、任意の規定比率の検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントが使用されてよい。非限定的な一実施形態において、異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの各々は、ほぼ同じ濃度で存在する。別の非限定的な実施形態では、検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの各々は、ほぼ同じ量（すなわち、３種の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントが存在する場合には約１：１：１）で存在する。任意の好適な濃度の標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントが検出試薬中に存在してよい。非限定的な一実施形態において、検出試薬中の各標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌで存在する。様々な他の実施形態では、検出試薬中の各標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントは、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１２５μｇ／ｍｌで存在する。蛍光標識、ハプテン、比色標識、様々な放射性標識、酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質－タンパク質結合ペア、タンパク質－抗体結合ペア等を包含するがこれらに限定されない、任意の好適な検出可能標識が使用されてよい。蛍光標識の例としては、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、塩化ダンシル、フィコシアニン、フィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。生物発光マーカーの例としては、ルシフェラーゼ（例えば、細菌のもの、ホタルのもの、コメツキムシのもの等）、ルシフェリン、エクオリン等が挙げられるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素システムの例としては、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能標識は、様々な供給元から商業的に入手可能である。特定の実施形態では、検出標識は、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質を含む。異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントの集団の各々は、目的の検出アッセイに応じて、同じ標識または区別可能な標識を有してよい。

各捕捉試薬集団は、異なる特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに対して特異的であり、従って、ＩｇＧアイソタイプに基づいてＩｇＧ抗体－標的ＩｇＧタンパク質混合物を分離するために使用することができる。特定のＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する任意の好適な結合分子が使用されてよい。様々な非限定的な実施形態において、結合分子は、抗体、アフィマー、アプタマー、Ｆｃ受容体もしくは他のタンパク質／糖／脂質または組み合わせ分子を含む。特定の一実施形態では、結合分子は、ＩｇＧタンパク質アイソタイプに選択的に結合する抗体を含む。

各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、表面に結合している。ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン支持体、磁気ビーズもしくは常磁性ビーズ、アガロースビーズおよび濾過媒体（ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＣＮＢｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなど）を包含するがこれらに限定されない、任意の好適な表面が用いられてよい。特定の一実施形態では、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどのビーズに結合している。磁気捕捉ビーズまたは常磁性捕捉ビーズは、典型的には、直径約１ｍｍ以下であり、沈降または目詰まりを防ぐのに十分なほど、十分に小さい。好適なビーズは、当業者に知られており、種々の供給元から入手できる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ（ノルウェー）のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ－Ｏｎｅ（商標）、またはＭｅｒｃｋ（フランス）のＥｓｔａｐｏｒｅ）。ビーズは、抗体または抗原の受動的または能動的なカップリングのために、結合分子と予めカップリングされてよいか結合分子でコーティングされてよい。他の実施形態では、捕捉ビーズは、アガロースビーズであってよい。典型的には、アガロースビーズは、直径約３５０μｍ～２０μｍである。別の特定の実施形態では、各ＩｇＧアイソタイプ特異的捕捉試薬集団中の結合分子は、マイクロタイタープレートのウェル内のプリントされたアレイで存在する。

任意の好適な密度の捕捉試薬がキット中に存在してよい。非限定的な一実施形態において、各捕捉試薬集団は、１ミリリットルあたり約１万個～約１億個の捕捉試薬という密度で存在する。様々なさらなる実施形態では、各捕捉試薬集団は、１ミリリットルあたり約１０万個～約５０００万個、約２５万個～約２５００万個、約５０万個～約１０００万個または約７５万個～約５００万個の捕捉試薬という密度で存在する。一実施形態において、異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントの数は、捕捉試薬の数と同じである。

特定の一実施形態では、検出試薬は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からなる群より選択される規定比率の２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的マウスＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含み、捕捉試薬は、２種、３種または４種の捕捉試薬集団を含み、各捕捉試薬集団は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３からなる群より選択される異なるマウスＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。

別の特定の実施形態では、検出試薬は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される規定比率の２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的ヒトＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含み、捕捉試薬は、２種、３種または４種の捕捉試薬集団を含み、各捕捉試薬集団は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される異なるヒトＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。

さらなる特定の実施形態では、検出試薬は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃからなる群より選択される規定比率の２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的ラットＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントを含み、捕捉試薬は、２種、３種または４種の捕捉試薬集団を含み、各捕捉試薬集団は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃからなる群より選択される異なるラットＩｇＧ抗体アイソタイプに選択的に結合する結合分子を含む。

様々なさらなる特定の実施形態において、
（Ａ）検出試薬は、規定比率の、
（ｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２からなる群より選択される２種の異なる検出可能なように標識された標的ヤギ、ブタまたはウシＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメント；
（ｉｉ）ＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧｔからなる群より選択される２種または３種の異なる検出可能なように標識された標的ウマＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメント；あるいは
（ｉｉｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群より選択される２種、３種または４種の異なる検出可能なように標識された標的サルＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメント；
を含み、
（Ｂ）捕捉試薬は、
（ｉ）各捕捉試薬集団が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２からなる群より選択される異なる標的ヤギ、ブタまたはウシＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに選択的に結合する結合分子を含む、２種の捕捉試薬集団；
（ｉｉ）各捕捉試薬集団が、ＩｇＧａ、ＩｇＧｂ、ＩｇＧｔからなる群より選択される異なるウマＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに選択的に結合する結合分子を含む、２種または３種の捕捉試薬集団；あるいは
（ｉｉｉ）各捕捉試薬集団が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群より選択される異なるサルＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはそのフラグメントに選択的に結合する結合分子を含む、２種、３種または４種の捕捉試薬集団；
を含む。これらの実施形態では、捕捉試薬は、検出試薬中に存在するＩｇＧタンパク質アイソタイプの種類に結合する結合分子を含む。

別の実施形態では、キットは、検出試薬中の２種以上の異なる検出可能なように標識された標的ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントに対応する規定比率の２種以上（２種、３種、４種または５種以上）の異なる非標識ＩｇＧタンパク質アイソタイプまたはその抗原性フラグメントを含む、対照サンプルをさらに含む。第１および第２の態様において開示されるような対照の実施形態は全て、この態様のキットにおいて用いられてよい。

キットは、意図される用途に適切である任意の追加的な構成要素をさらに含んでよい。一実施形態において、キットは、検出可能な細胞生存マーカーをさらに含む。

第５の態様では、
（ａ）アッセイプレート、および
（ｂ）（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズと、（ｉｉ）第１の検出可能部分を含む第１の検出分子と、を含む分析試薬、
を含むキットが提供される。

第３の態様において開示される実施形態は全て、この第５の態様において用いられてよい。一部の実施形態において、第１の検出分子は、対照ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントを含む。他の実施形態では、キットは、第１の検出分子と光学的に区別できる検出可能なように標識された抗軽鎖抗体をさらに含む。キットはまた、細胞生存染料、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーのうちの１つ以上をさらに含んでもよい。一実施形態において、捕捉ビーズは、共有結合でプロテインＧまたはプロテインＡと連結されている。別の実施形態では、捕捉ビーズは、磁気ビーズまたはアガロースビーズである。特定の態様では、キットは、凍結乾燥された分析試薬を含むアッセイプレートを含む。

例示的な方法と系が本出願で説明される。単語「例（ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」および「例示的（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ）」は、本出願では、「例、実例、または例証として役立つこと」を意味するために使用される、ということが理解されるべきである。本出願において「例（ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」または「例示的（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ）」であると説明される実施形態または特徴はいずれも、他の実施形態または特徴よりも好ましいか有利であると解釈されるべきであるというわけではない。本出願で説明される例示的な実施形態は、限定的であることを意味するものではない。本出願において一般的に説明されるような、および図面において示されるような、本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置する、置換する、組み合わせる、分離する、および設計することができ、それらの全てが、本出願において明示的に企図される、ということが容易に理解されるであろう。

実施例１

例示的な試薬の調製
（１）検出試薬混合物の調製：同じチューブ／リザーバーにおいて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の十分量にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－マウスＩｇＧ１、ＦＩＴＣ－マウスＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ－マウスＩｇＧ２ｂおよびＦＩＴＣ－マウスＩｇＧ３ならびに赤色蛍光細胞膜完全性染料（red fluorescent cell membrane integrity dye）を加えて混合する。この混合物において、最終的なＦＩＴＣ－マウスＩｇＧの濃度は、各アイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）について１２５μｇ／ｍＬであってよい。この混合物中の最終的な赤色蛍光ＦＬ４細胞膜完全性染料（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、当該チューブ／リザーバーにおいて１：２００で希釈されていてよい。
（２）マウスＩｇＧ標準品混合物の調製：予め混合したマウスＩｇＧ標準品ストックのバイアルを用意する：同じバイアルに、標識されていないマウスのＩｇＧ１タンパク質、ＩｇＧ２ａタンパク質、ＩｇＧ２ｂタンパク質およびＩｇＧ３タンパク質を加えて混合する。この混合物において、各アイソタイプは、例えば２００μｇ／ｍＬの濃度を有してよい。予め混合されたマウスＩｇＧの連続的タイトレーション（serial titration）は、新鮮な細胞培養培地（生物学的サンプルが由来する培養プレートまたは培養フラスコで使用されているのと同じ培地）を用いて実施されてよい。これらの段階希釈された標準品をアッセイのセットアップにおいて後で使用して４つの標準曲線（各マウスＩｇＧアイソタイプについて１つの標準曲線）を作成してよい。
（３）捕捉試薬混合物の調製：同じチューブ／リザーバーにおいて、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡの十分量にマウスＩｇＧ１捕捉ビーズ、マウスＩｇＧ２ａ捕捉ビーズ、マウスＩｇＧ２ｂ捕捉ビーズおよびマウスＩｇＧ３捕捉ビーズを加えて混合する。最終的なマウスＩｇＧ捕捉ビーズの密度は、各アイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）について１ｍＬあたり１００万個の捕捉ビーズである。

これで、ユーザーは、例えば、完全競合プロトコルまたはプレインキュベーションプロトコルのいずれかに従ってマウスＩｇＧの定量化／アイソタイプ決定アッセイを実行することができる。

マウスＩｇＧの定量化／アイソタイプ決定アッセイ（完全競合プロトコル）
完全競合プロトコルのためのアッセイのセットアップ：
このアッセイは、洗浄なしのワークフローを使用し、ＩｇＧの濃度（例えば、μｇ／ｍＬ）に関して結果を提供し得る。それは、４種のマウスＩｇＧアイソタイプについて濃度を決定するために使用される４つの標準曲線を作成するために基準タンパク質混合物の段階希釈物を調製することを伴う。捕捉ビーズ上のＦＩＴＣ検出シグナルは、マウスＩｇＧの濃度と逆相関を有する。４種の捕捉ビーズがアッセイにおいて使用されてよく、各ビーズは、単一のマウスＩｇＧアイソタイプに対して特異的である。４種のマウスＩｇＧアイソタイプの濃度を合計することによってＦｏｒｅＣｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）ソフトウェアにより各ウェルにおいて総マウスＩｇＧ濃度が算出されてよい。サンプルが、マウスＩｇＧ上清に加えて細胞を有する場合、細胞数と細胞生存率も分析されてよい。

一つの例示的なプロトコルでは：
（１）検出試薬混合物（マウスＦＩＴＣ－ＩｇＧおよびＦＬ４膜完全性染料）を加える（マイクロタイタープレートのウェル１つあたり５μＬ）；
（２）ＩｇＧサンプル／ＩｇＧ標準品を加える（２０μＬ／ウェル）；クイックスピン（５００ｇ、５秒）。混合（２，０００ｒｐｍ、２０秒）。
（３）調製された４種混合（4-plex）捕捉ビーズを加える（５μＬ／ウェル）；クイックスピン（５００ｇ、５秒）。混合（２，０００ｒｐｍ、２０秒）。室温６０分。

これで、プレートは、ｉＱｕｅ（商標） Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメトリープラットフォーム上でのサンプリングなどによるシグナル検出の準備が整っている。

プレインキュベーションプロトコルのマウスＩｇＧの定量化／アイソタイプ決定アッセイ：
プレインキュベーションプロトコルのためのアッセイのセットアップ：
このアッセイは、洗浄なしのワークフローを使用し、ＩｇＧの濃度（例えば、μｇ／ｍＬ）に関して結果を提供し得る。それは、４種のマウスＩｇＧアイソタイプについて濃度を決定するために使用される４つの標準曲線を作成するために基準タンパク質混合物の段階希釈物を調製することを伴う。捕捉ビーズ上のＦＩＴＣ検出シグナルは、マウスＩｇＧの濃度と逆相関を有する。４種の捕捉ビーズがアッセイにおいて使用されてよく、各ビーズは、単一のマウスＩｇＧアイソタイプに対して特異的である。４種のマウスＩｇＧアイソタイプの濃度を合計することによって、例えばＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェアにより、各ウェルにおいて総マウスＩｇＧ濃度が算出されてよい。サンプルが、マウスＩｇＧ上清に加えて細胞を有する場合、細胞数と細胞生存率も分析されてよい。

一つの例示的なプロトコルでは：
（１）調製された４種混合捕捉ビーズを加える（５μＬ／ウェル）；
（２）ＩｇＧサンプル／ＩｇＧ標準品を加える（２０μＬ／ウェル）；クイックスピン（５００ｇ、５秒）。混合（２，０００ｒｐｍ、２０秒）。室温３０分。
（３）検出試薬混合物（マウスＦＩＴＣ－ＩｇＧおよびＦＬ４膜完全性染料）を加える（５μＬ／ウェル）；クイックスピン（５００ｇ、５秒）。混合（２，０００ｒｐｍ、２０秒）。暗所で室温６０分。

これで、プレートは、ｉＱｕｅ（商標） Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメトリープラットフォーム上でのサンプリングなどによるシグナル検出の準備が整っている。

捕捉ビーズの１つのタイプが特定のマウスＩｇＧアイソタイプを特異的に捕捉する、マルチプレックスの４種の捕捉ビーズは、一般的な抗マウスＩｇＧ抗体でコーティングされた従来のシングルプレックスの捕捉ビーズにおける一貫性のない定量化を解決するであろう。４種の異なるマウスＩｇＧアイソタイプは、ビーズ上にコーティングされた一般的な抗マウスＩｇＧに対する僅かに異なる結合親和性を生じさせた僅かに異なるタンパク質構造を有する。マウスハイブリドーマまたはＢ細胞の培養物のスクリーニングプレートにおいて、異なるウェルが、４種のアイソタイプのうちの１つを有してよい。プレートの各ウェルにおいてマウスＩｇＧを捕捉するためにシングルプレックスの抗マウスＩｇＧ捕捉ビーズを使用したのであれば、同じ量ではあるが異なるウェルにおいてアイソタイプの異なるマウスＩｇＧは、ＩｇＧアイソタイプに依存した結合親和性の違いに起因して、異なる結合シグナルをビーズ上で生じさせる可能性があり、標準品として精製マウスＩｇＧ（天然の、４種のアイソタイプの混合物）を用いた標準曲線に基づく定量化は、異なるマウスＩｇＧ量を外挿することになる。これは、不正確な量を導入することになる。４種の異なる捕捉ビーズ（各アイソタイプについて１種）を用いたマルチプレックスアッセイは、この問題を解決することになる。例えば、マイクロタイタープレート内のＡ１のウェルがマウスＩｇＧ１を有する場合、マウスＩｇＧ１は、混合された４種の捕捉ビーズ中のマウスＩｇＧ１捕捉ビーズ上にのみ捕捉されることになる。蛍光シグナルは、マウスＩｇＧ１の標準曲線を用いることによってマウスＩｇＧ１の量に外挿されることになる。Ａ２のウェルがマウスＩｇＧ２ａを有する場合、マウスＩｇＧ２ａは、混合された４種の捕捉ビーズ中のマウスＩｇＧ２ａ捕捉ビーズ上にのみ捕捉されることになり、マウスＩｇＧ２ａ捕捉ビーズ上の蛍光シグナルは、マウスＩｇＧ２ａの標準曲線を用いることによってマウスＩｇＧ２ａの量に外挿されることになる。

ここで、我々は、４種の異なるアイソタイプを捕捉するための４種の捕捉ビーズと、４種のＦＩＴＣ－マウスＩｇＧアイソタイプと、を反応において用いるマルチプレックス競合アッセイフォーマットを確立した（図１を参照のこと）。細胞を含むか含まない、アイソタイプが不明であるサンプルが、正しい順序で反応に加えられると、不明であり且つ標識されていないマウスＩｇＧアイソタイプが、４種の捕捉ビーズのうちの１種のみに対して４種のＦＩＴＣ－マウスＩｇＧアイソタイプのうちの１種と競合することになる。マウスＩｇＧのアイソタイプと量の測定において、このようなアッセイは存在しないようである。このアッセイは、洗浄および希釈を必要とせず、通常は１～５０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ濃度を有するハイブリドーマ上清からマウスＩｇＧの量／アイソタイプを測定できる。

当該アッセイはまた、ユーザーが、同じマルチプレックスアッセイにおいて細胞数と細胞生存率を測定することも可能にし得る。ユーザーは、サンプル上清または細胞を含むサンプルのいずれかを用いることができる。後者の場合、細胞数および細胞生存率ならびにマルチプレックスビーズは、ハイスループットフローサイトメトリーで同時に測定されるであろう。

当該アッセイは、捕捉ビーズ上のアイソタイプ特異的捕捉抗体および検出試薬および標準タンパク質をマウス種から他の種（ヒトまたはラット等など）に変更することによって、マウス種に加えて異なる種について同じ評価項目（ＩｇＧのアイソタイプ、各アイソタイプについてのＩｇＧ量、細胞数および細胞の健康状態）を測定するように拡張／改変できる。

図２は、マイクロタイタープレートにおける標準ウェルの例示的なセットアップを示す。ここでは、９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるＩｇＧ標準ウェルの例示的なデザインが示されている。特定のウェルの各々は、４種のアイソタイプタンパク質を有し、ここで、各マウスＩｇＧアイソタイプ（マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）は同じ量である。右側（Ａ１２とＢ１２）の最高濃度のウェル（２連のウェル）は、各アイソタイプについて５０μｇ／ｍＬという最高濃度を有する。１：２の連続的タイトレーションを右から左に適用した。例えば、Ａ１１とＢ１１のウェルは、各アイソタイプについて２５μｇ／ｍＬを有することになる。Ａ１とＢ１のウェルは、新鮮／ブランク培地を含むがいかなるマウスＩｇＧタンパク質標準品も含まない、陰性対照として使用される。ユーザーは、新しい最高濃度もしくは希釈係数または希釈ステップの回数を決定することについて柔軟性を有する。例えば、ユーザーは、最高濃度についてアイソタイプ１種あたり１００μｇ／ｍＬを用いることができ、１：３の連続的タイトレーションを用いることができ、図２の標準品デザインにおいて示されるような１１回の希釈ステップではなく６回の希釈ステップを用いることができる。ユーザーは、３８４ウェルプレートなどの他のプレートのタイプで同じ標準品デザインを用いることができる。標準品を伴わない同じプレート（例えば、図２の列Ｃ～Ｈ）に関して、ユーザーは、細胞を含むか含まない未知のマウスＩｇＧサンプルを実行できる。

１つの例示的な技術では、細胞およびビーズは、サイズ（前方散乱、ＦＳＣ）および／または粒度（側方散乱、ＳＳＣ）に基づいて、２Ｄ散乱プロットにおける分離によって検出できる。２Ｄプロット（ＦＳＣ－Ｈｅｉｇｈｔ対ＦＳＣ－Ａｒｅａ）を用いることによって、ダブレットのビーズではなくシングレットのビーズをゲーティングすることができる。シングレットのビーズは、２Ｄプロット（ＦＳＣ－Ｈｅｉｇｈｔ対ＦＳＣ－Ａｒｅａ）において４５度で右側の集団となる。ダブレットまたは凝集物は、左側となる。シングレットのビーズは、２Ｄプロット（赤色蛍光チャネルＲＬ１－Ｈｅｉｇｈｔ対ＦＳＣ－Ｈｅｉｇｈｔ）において４種の捕捉ビーズ集団へとさらに分離することができる。生細胞は、赤色蛍光チャネルＲＬ１－Ｈｅｉｇｈｔの１Ｄヒストグラムにおいて全細胞からゲーティングすることができる。生細胞は、蛍光染色の少ない左側の集団となる。死細胞または死にかけの細胞は、より多くの染料を吸収し、右側の細胞集団となる（ゲーティングされない）。

４種のマウスＩｇＧアイソタイプについて、プロトコルごとにアイソタイプ１種あたり１つの標準曲線が作成されてよい。検出のダイナミックレンジと線形検出レンジを表１にまとめる。試験される濃度の各々について、二連のウェルで実行した。ＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）の使用により、各点が平均±標準偏差を表す標準曲線が自動的に作成される。検出のダイナミックレンジと線形検出レンジを表１に示す（ｍＩｇＧ１はマウスＩｇＧ１であり、ｍＩｇＧ２ａはマウスＩｇＧ２ａであり、他も同様である）。

標準曲線において試験される最高濃度は、アイソタイプ１種あたり１００μｇ／ｍＬであった。このアッセイでは、１００μｇ／ｍＬ超は試験されなかった。標準品は、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養培地で希釈された。試験では、１９ポイントの１：２の連続的タイトレーションが実行された。

曲線の当てはめに関して：線形レンジを自動的に検出して線形レンジを提示する、重みをフィッティングするための１／Ｙ平方での４ＰＬフィッティング方法を伴うＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を用いた。線形レンジは、それについて電子増幅器が入力信号の直接的な線形関数である出力信号を生成した入力値または出力値の範囲である。すなわち、出力は、式：出力＝入力×ゲインで表すことができる。線形レンジは、未知のサンプルのシグナルがこの範囲に入る場合、正確／高感度な定量化をもたらす。

使用される検出レンジは、下限検出限界（ＩｇＧが０μｇ／ｍＬであるブランクの標準偏差の３倍であるシグナルを伴う最小濃度）と上限検出限界（ＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェアによって決定された飽和シグナルの標準偏差の３倍であるシグナルを伴う最大濃度）との間の範囲を意味する。標準曲線が飽和に達しないのであれば、最も高い試験濃度（ここでは１００μｇ／ｍＬ）が使用される。

ハイブリドーマ培養物からのサンプルについては、完全競合プロトコルが推奨される可能性がある。マウスＢ細胞培養物からのサンプルについては、プレインキュベーションプロトコルが推奨される可能性がある。

実施例２
以下では、高レベルの分泌タンパク質またはＩｇＧ抗体を産生する細胞を特定するための特定の態様のアッセイの例示的なプロトコルが説明される。
（１）各ウェルに１つの細胞のみが配置されるように、候補産生細胞を希釈してマルチウェル「マイクロタイター」プレートのウェルに分配する。これを行うための方法は、当技術分野において十分に説明されている。１ウェルあたり１つの細胞は、実際には、達成が困難な目標である。殆どのウェルは、１つの細胞を含むが、細胞がゼロのウェルおよび複数の細胞を含むウェルが数多く存在する。一般に、高レベルのタンパク質を分泌する少数の細胞株を見つけるには何十万ものウェルをスクリーニングする必要がある。
（２）細胞を増殖させて各ウェルの細胞数を増加させる。増殖は、有糸分裂を介して起こっているため、各ウェルの娘細胞は、そのウェルに配置された元の細胞（複数可）の正確なコピーとなる。
（３）細胞が増殖するにつれて、それらはタンパク質バイオ医薬品（すなわち、ＩｇＧ抗体）を産生し、それを培養上清中に分泌する。
（４）代表的量の分泌タンパク質と産生細胞とを含む、各ウェルの未希釈アリコートを、凍結乾燥されたアッセイプレートの新しいウェルに移す。凍結乾燥されたアッセイプレートの各ウェルは、凍結乾燥された試薬を含み、当該試薬は、存在する分泌タンパク質の量を定量化するために使用されると同時に、サンプル中に存在する産生細胞の数をアッセイするために使用され得る。試薬キットから凍結乾燥されていない形態に調製された定量化試薬が分析のために使用される可能性もある。凍結乾燥されたアッセイプレートまたは当該試薬キットは、以下のアイテムを含んでよい：
（ａ）捕捉ビーズ－例えば、分泌タンパク質上の特定の部位に結合して分泌タンパク質をミクロスフェアの表面上に捕捉する分子でコーティングされた蛍光ミクロスフェア。
（ｂ）蛍光プローブで標識されている検出分子であって、ミクロスフェア表面上に捕捉された分泌タンパク質上の異なる領域に結合する検出分子。そのため、各ミクロスフェアに関連する蛍光の強度は、サンプル中に存在する捕捉された分泌タンパク質分子の数と直接相関する。
（５）インキュベーション時間の後、サンプルをハイスループットフローサイトメトリーによって分析する。ハイスループットフローサイトメトリーシステムの一例は、数千のサンプルを数分で分析できるフローサイトメーターと組み合わせたＨｙｐｅｒＣｙｔ（商標） ＨＴＦＣシステムである。
（６）ハイスループットフローサイトメトリー検出システムは、標準曲線から分泌タンパク質の濃度を算出するために使用される、ビーズと結合した検出分子の蛍光強度を報告するようにセットアップされる。さらに、サンプル中に存在する産生細胞の数を同時に決定できる。専売のソフトウェア解析パッケージが、細胞数に対する分泌タンパク質の比率を自動的に決定し、細胞あたりの分泌タンパク質の濃度を算出する。ハイスループットフローサイトメトリーシステムがセルソーターと共に使用される場合、ソフトウェアはまた、高分泌細胞のウェルから個々の細胞を選別して所望の細胞株をさらに精製するようにシステムを制御する。

第１のプロトコル---ＩｇＧ定量アッセイ－段階的プロトコル（例示）：
（１）プロテインＧでコーティングされたビーズ（６～８μｍのサイズ、０．５％ｖ／ｖ）をボルテックスする。ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１：１５希釈する。希釈したビーズを混合し、マイクロタイターアッセイプレート（９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのいずれか）の各ウェルにビーズを５μＬ／ウェルで加える。
（２）アッセイプレートの各ウェルに、２０μＬのＩｇＧサンプル（ＩｇＧの標準曲線を作成するためのＩｇＧ標準品または懸濁ＣＨＯ細胞培養物／分泌ＩｇＧ混合物もしくは懸濁ＣＨＯ細胞培養物からのＩｇＧ上清のみのいずれか）を加える。
（３）アッセイプレートを短時間スピンしてサンプルをウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（４）アッセイプレートを室温で３０分間インキュベートする。光からプレートを保護する。
（５）混合検出試薬を調製する：同じチューブ内においてＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで２０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－Ｆｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．）と２０ｎＭのＦＬ４膜完全性染料（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を作製する。
（６）アッセイプレートの各ウェルに５μＬの混合検出試薬を加える。
（７）アッセイプレートを短時間スピンしてサンプルをウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（８）アッセイプレートを室温で３０分間インキュベートする。光からプレートを保護する。
（９）ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ｉＱｕｅ（商標） Ｓｃｒｅｅｎｅｒプラットフォームなどのハイスループットフローサイトメーターによってアッセイプレートからサンプルを取得する。

実施例２：第２のプロトコル---ＩｇＧ定量アッセイ－同時プロトコル：
（１）混合検出試薬を調製する：同じチューブ内においてＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで２０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－Ｆｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．）と２０ｎＭのＦＬ４膜完全性染料（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を作製する。
（２）マイクロタイターアッセイプレート（９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのいずれか）の各ウェルに５μＬの混合検出試薬を加える。
（３）アッセイプレートの各ウェルに、２０μＬのＩｇＧサンプル（ＩｇＧの標準曲線を作成するためのＩｇＧ標準品または懸濁ＣＨＯ細胞培養物／分泌ＩｇＧ混合物もしくは懸濁ＣＨＯ細胞培養物からのＩｇＧ上清のみのいずれか）を加える。
（４）アッセイプレートを短時間スピンしてサンプルと混合検出試薬混合物をウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（５）プロテインＧでコーティングされたビーズ（６～８μｍのサイズ、０．５％ｖ／ｖ）をボルテックスする。ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１：１５希釈する。希釈したビーズを混合し、サンプル／検出混合物を伴うアッセイプレートの各ウェルにビーズを５μＬ／ウェルで加える。
（６）アッセイプレートを短時間スピンして液体をウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（７）アッセイプレートを室温で６０分間インキュベートする。光からプレートを保護する。
（８）ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ｉＱｕｅ（商標） Ｓｃｒｅｅｎｅｒプラットフォームなどのハイスループットフローサイトメーターによってアッセイプレートからサンプルを取得する。

第３のプロトコル---ＩｇＧ定量と軽鎖検出のアッセイ－段階的プロトコル（例示）：
（１）プロテインＧでコーティングされたビーズ（６～８μｍのサイズ、０．５％ｖ／ｖ）をボルテックスする。ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１：１５希釈する。希釈したビーズを混合し、マイクロタイターアッセイプレート（９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのいずれか）の各ウェルにビーズを５μＬ／ウェルで加える。
（２）アッセイプレートの各ウェルに、２０μＬのＩｇＧサンプル（ＩｇＧの標準曲線を作成するためのＩｇＧ標準品または懸濁ＣＨＯ細胞培養物／分泌ＩｇＧ混合物もしくは懸濁ＣＨＯ細胞培養物からのＩｇＧ上清のみのいずれか）を加える。
（３）アッセイプレートを短時間スピンしてサンプルをウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（４）アッセイプレートを室温で３０分間インキュベートする。光からプレートを保護する。
（５）混合検出試薬を調製する：同じチューブ内においてＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで２０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－Ｆｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．）と１０μｇ／ｍＬのＰＥ－Ｆ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇκ軽鎖（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と２０ｎＭのＦＬ４膜完全性染料（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を作製する。
（６）アッセイプレートの各ウェルに５μＬの混合検出試薬を加える。
（７）アッセイプレートを短時間スピンしてサンプルをウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（８）アッセイプレートを室温で３０分間インキュベートする。光からプレートを保護する。
（９）ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒプラットフォームなどのハイスループットフローサイトメーターによってアッセイプレートからサンプルを取得する。

実施例４：第４のプロトコル---ＩｇＧ定量と軽鎖検出のアッセイ－同時プロトコル：
（１）混合検出試薬を調製する：同じチューブ内においてＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで２０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－Ｆｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．）と１０μｇ／ｍＬのＰＥ－Ｆ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇκ軽鎖（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と２０ｎＭのＦＬ４膜完全性染料（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を作製する。
（２）マイクロタイターアッセイプレート（９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのいずれか）の各ウェルに５μＬの混合検出試薬を加える。
（３）アッセイプレートの各ウェルに、２０μＬのＩｇＧサンプル（ＩｇＧの標準曲線を作成するためのＩｇＧ標準品または懸濁ＣＨＯ細胞培養物／分泌ＩｇＧ混合物もしくは懸濁ＣＨＯ細胞培養物からのＩｇＧ上清のみのいずれか）を加える。
（４）アッセイプレートを短時間スピンしてサンプルと混合検出試薬混合物をウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（５）プロテインＧでコーティングされたビーズ（６～８μｍのサイズ、０．５％ｖ／ｖ）をボルテックスする。ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１：１５希釈する。希釈したビーズを混合し、サンプル／検出混合物を伴うアッセイプレートの各ウェルにビーズを５μＬ／ウェルで加える。
（６）アッセイプレートを短時間スピンして液体をウェルの底に沈める（５００ｇ×８秒）。プレートシェーカー上でプレート内のサンプルを混合する（２０００ｒｐｍ×２０秒）。
（７）アッセイプレートを室温で６０分間インキュベートする。光からプレートを保護する。
（８）ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒプラットフォームなどのハイスループットフローサイトメーターによってアッセイプレートからサンプルを取得する。

Claims (16)

1. 免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の産生について複数の細胞サンプルを分析するための方法であって、
   前記方法は、
   （ａ）複数のサンプルウェルを有するアッセイプレートに複数の細胞サンプルを移すステップであって、各サンプルウェルが、標的ＩｇＧ抗体を発現する未希釈の細胞培養物である細胞サンプルを含む、ステップ、および前記複数の細胞サンプルを分析試薬と混合して複数の分析混合物を生成するステップであって、前記分析試薬が、
   （ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズ、および
   （ｉｉ）（Ａ）対照ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントと、（Ｂ）第１の検出可能部分と、を含む第１の検出分子、
   を含む、ステップ；
   を含み、
   （ｂ）前記混合は、前記捕捉ビーズと前記第１の検出分子の段階的添加を含み、前記段階的添加は、
   まず、前記捕捉ビーズに対する前記標的ＩｇＧ抗体の結合を促進して複数の第１の混合物を生成するような時間と条件下で前記複数の細胞サンプルを前記捕捉ビーズと混合してから、前記捕捉ビーズに対する前記第１の検出分子の結合を促進して前記複数の分析混合物を生成するような時間と条件下で前記複数の第１の混合物に前記第１の検出分子を添加すること
   を含み、
   前記方法は、
   （ｃ）フローサイトメトリー分析によって前記複数の分析混合物の各分析混合物において前記標的ＩｇＧ抗体の濃度を決定するステップ；
   を含み、
   各分析混合物における前記捕捉ビーズに結合した第１の検出分子の量が、所与の分析混合物における前記標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する、
   方法。
2. 前記細胞培養物は、単一のクローンから増殖させる、請求項１に記載の方法。
3. 前記捕捉ビーズは、共有結合でプロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬと連結されている、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記捕捉ビーズは、磁気ビーズまたはアガロースビーズである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記アッセイプレートは、フローサイトメーターにおいて前記アッセイプレート内の複数の分析混合物を読み取る前に遠心分離される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の産生について複数の細胞サンプルを分析するための方法であって、
   （ａ）複数のサンプルウェルを有するアッセイプレートに複数の細胞サンプルを移すステップであって、各サンプルウェルが、標的ＩｇＧ抗体を発現する未希釈の細胞培養物である細胞サンプルを含む、ステップ、および前記複数の細胞サンプルを分析試薬と混合して複数の分析混合物を生成するステップであって、前記分析試薬が、
   （ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズ、および
   （ｉｉ）第１の検出可能部分を含む第１の検出分子、
   を含み、前記第１の検出分子は、免疫グロブリン軽鎖を欠いており且つ前記捕捉ビーズに結合することが可能である、ステップ；
   （ｂ）前記捕捉ビーズに対する前記標的ＩｇＧ抗体および前記第１の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で前記複数の分析混合物をインキュベートするステップ；ならびに
   （ｃ）フローサイトメトリー分析によって前記複数の分析混合物の各分析混合物において前記標的ＩｇＧ抗体の濃度を決定するステップ；
   を含む方法。
7. 前記捕捉ビーズに結合した標的ＩｇＧ抗体に対する第２の検出分子の結合を促進するような時間と条件下で前記複数の分析混合物を前記第２の検出分子と接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法であって、
   前記第２の検出分子は、前記第１の検出分子と光学的に区別できる検出可能なように標識された抗ＩｇＧ軽鎖抗体を含み、
   各分析混合物における前記標的ＩｇＧ抗体に結合した第２の検出分子の量が、所与の分析混合物におけるインタクトな標的ＩｇＧ抗体の濃度の尺度を提供する、
   方法。
8. 前記標識された抗軽鎖抗体が添加される前に、前記複数の分析混合物が、遠心分離され、洗浄ステップに供される、請求項７に記載の方法。
9. 前記分析試薬は、細胞生存染料、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. （ｉ）各分析混合物における細胞の数；
    （ｉｉ）各分析混合物における生存細胞のパーセンテージ；
    （ｉｉ）各分析混合物における細胞あたりの標的ＩｇＧ抗体の濃度；および／または
    （ｉｉｉ）各分析混合物における生存細胞あたりの標的ＩｇＧ抗体の濃度；
    のうちの１つ以上を決定することをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. （ａ）アッセイプレート、
    （ｂ）（ｉ）ＩｇＧ抗体に結合する捕捉ビーズと、（ｉｉ）第１の検出可能部分を含む第１の検出分子と、を含む分析試薬、および
    （ｃ）前記第１の検出分子と光学的に区別できる検出可能なように標識された抗軽鎖抗体、
    を含むキット。
12. 前記第１の検出分子は、対照ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントを含む、請求項１１に記載のキット。
13. 前記分析試薬は、細胞生存染料、細胞表面バイオマーカーまたはアポトーシスのマーカーのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１１～１２のいずれか１項に記載のキット。
14. 前記捕捉ビーズは、共有結合でプロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬと連結されている、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のキット。
15. 前記捕捉ビーズは、磁気ビーズまたはアガロースビーズである、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のキット。
16. 前記アッセイプレートは、凍結乾燥された分析試薬を含む、請求項１１～１５のいずれか１項に記載のキット。
    

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