JPH0489568A - ヒトｉｌ―６レセプターの免疫化学的測定法及び測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒトＩＬ−６レセプターの免疫化学的測定法
及びｔす定量キットに関する。

［従来の技術］ インターロイキン−６（ＢＳＦ２／以下、ＩＬ−６と略
す）は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖
分化に関与しているタンパク質である。また、ＩＬ−６
の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子である可能
性が報告されてイル（岸本、平野、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、
　Ｉｍｍｕｎｏ、　６．　ｐ４８５゜生体内で多様な生
理活性を発揮するＩ　Ｌ−６と特異的に結合し、Ｉ　Ｌ
−６のシグナルを伝達するＩＬ−６レセプターの生理的
濃度を知ることは各種疾患の新しい診断マーカーとして
期待されるものである。

ＩＬ−６レセプターに関しては、その−次構造（Ｋ、　
Ｙａｍａｓａｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１．　
ｐ８２５（１９８８＋　＋及びＩＬ−６レセプターに対
するモノクローナル抗体（Ｙ、　Ｈｉｒａｔａら、Ｊ、
　Ｉ＋＋ｍｕｎｏｌ−。

１４３、　ｐ２９００１）９８９１＋については既に報
告されている。

しかしながら、各種疾患診断マーカーとして検体中のＩ
　Ｌ−６レセプターを検出できるような低濃度レベルで
のＩＬ−６レセプターの検出方法は報告されていない。

また、ＩＬ−６レセブタのＩＬ−６との結合の有無を分
析する方法も知られていない。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の目的は、低濃度レベルのＩＬ−６レセ
プターを免疫化学的に測定する方法を提供するものであ
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、前記の課題を解決すべく種々検討した結
果、ヒトＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル抗
体を用いて数十Ｐｇ／ａｌｌの低濃度のＩ　Ｌ−６レセ
プターを測定することができる新しい測定方法を見出し
、この発明を完成した。

すなわち、本発明は、抗ヒトＩＬ−６レセプターモノク
ローナル抗体と、被検試料中に含まれるヒトＩ　Ｌ−６
レセプターとを反応させて形成される抗原抗体複合物を
定量する工程を含む、ヒトＩＬ−６レセプターの免疫化
学的測定法を提供する。

また、本発明は、ヒトＩＬ−６レセプターに対するモノ
クローナル抗体を含むことを特徴とする、上記本発明の
測定法を行なうための測定用キットを提供する。

［発明の詳細な説明］ 上述のように、本発明のヒトＩＬ−６レセプターの免疫
化学的測定方法においては、抗ヒト■Ｌ−６レセプター
モノクローナル抗体と、被検試料中に含まれるヒトＩＬ
−６レセプターとを反応させて形成される抗原抗体複合
物を定量する。

ここで、本発明の測定法に供される被検試料としてはヒ
ト血清、尿、その他例えば間接液等の体液、培養上清や
ヒト培養細胞、さらにはヒトＩ　Ｌ−６レセプターを遺
伝子工学的に生産した時に生じるサンプル等を挙げるこ
とができる。

本発明の測定法に用いられるモノクローナル抗体は、生
体内で産生されるＩ　Ｌ−６レセブタ及び標準品として
使用する遺伝子工学的に作製されたＩＬ−６レセプター
に同程度の抗体価を有する抗体であればよく、このよう
なモノクローナル抗体は常法により作製することができ
る。すなわち、遺伝子工学的に作製したりコンビナンド
Ｉ　Ｌ−６レセプターや培養細胞の上清から分離したＩ
　Ｌ−６レセプターをマウス、例えば、Ｂａ１ｂ／ｃ等
に免疫して、抗体価が上ったところで牌細胞をミエロー
マ細胞と融合してハイブリドーマを作製することができ
る０次に、ＩＬ−６レセプターを特異的に認識するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニ
ングすればよい。

本発明の測定法は、抗ヒトＩ　Ｌ−６レセブタ一モノク
ローナル抗体と、被検試料中に含まれるヒトＩ　Ｌ−６
レセプターとを反応させて形成される抗原抗体複合物を
定量する工程を含む方法であるならば、いかなる態様の
ものであってもよい。例えば、抗原認識部位の異なる２
種のヒト■Ｌ−６レセプターに対するモノクローナル抗
体、ヒトＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル抗
体とヒトＩ　Ｌ−６レセプターに対するポリクローナル
抗体のサンドイッチ法、ヒトＩＬ−６レセプターに対す
るモノクローナル抗体とヒトＩＬ−６のサンドイッチ法
等を挙げることができる。

以下に、これらの例として、＋１］　　ヒトＩＬ６レセ
プターに対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗
体によるサンドイッチ法及び（２）ヒトＩＬ−６を用い
、これと抗原抗体複合物との結合物を定量することによ
る測定法を説明する。

（１）ヒトＩ　Ｌ−６レセプターに対するモノクローナ
ル抗体とポリクローナル抗体によるサンドイッチ法゛ まず、モノクローナル抗体を固体支持体に固定する。固
体支持体としては、マイクロタイタープレート、ポリス
チレン、ポリプロピレン等のプラスチック製あるいは金
属セラミック等の無機物質製のビーズを用いることがで
きる。抗体の固定は、常法に従って行なうことができる
。次に、固定化された一次抗体と分析検体とを反応させ
ることにより、検体中のＩＬ−６レセプターは特異的に
ＩＬ−６レセプターに対する抗体と接合することができ
る。次に、標識物質としてビオチンが結合したヒトＩＬ
−６レセプターに対するポリクローナル抗体を二次抗体
として加え、−次抗体を介して支持体に固定されたヒト
ＩＬ−６レセプターと二次抗体とを結合させることがで
きる。

検出系に用いる酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどを挙
げることができるが、これらがヒトＩＬ−６レセプター
の検出に適当かどうかはりコンビナンドヒトＩＬ−６レ
セプターを標準物質として感度を調べれば良い。

β−ガラクトシダーゼを用いる場合を説明する。ストレ
プトアビジン／β−ガラクトシダーゼを添加し、前記ビ
オチンとストレプトアビジンとの結合を介してβ−ガラ
クトシダーゼが固定される。次に、β−ガラクトシダー
ゼの基質を加えて発色させ、発色強度を常法、例えば光
度計により測定する。発色性のβ−ガラクトシダーゼ基
質としては、免疫測定において一般的に用いられる４−
メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド、オルトニ
トロフェニルガラクトピラノシド（ＯＰＮＧ）等を用い
ることができる。

２）ヒトＩＬ−６を用いた免疫化学的測定法この方法に
よれば、ヒトＩＬ−６レセプターがヒトＩＬ−６との結
合を保持しているかどうかを分析することができる。

方法としては、前記の方法において二次抗体の代わりに
ＩＬ−６を用いる方法を挙げることができる。その際、
ＩＬ−６が一次抗体を介して支持体に固定されたＩＬ−
６レセプターと結合したかどうかを検出する方法として
ＩＬ−６に対する抗体を用いる方法や放射能標識された
ＩＬ−６を用いる方法がある。

また、支持体にＩＬ−６を固定してＩ　Ｌ−６レセプタ
ーに対する抗体とのサンドイッチ法でもよい。

本発明はさらに、上記本発明の方法を実施するためのキ
ットを提供する。明らかなように１本発明のキットはヒ
トＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル抗体を含
む、また、上記（１）のサンドイッチ法を行なうための
キットは、ヒトＩＬ−６レセプターに対するモノクロー
ナル抗体、ビオチン標識された該ポリクローナル抗体及
びストレプトアビジン／β−ガラクトシダーゼ接合体を
含んで成る。キットとしてはさらにβ−ガラクトシダー
ゼ基質を含むこともできるが、これは分析現場において
別途調達することもできる。

また、上記（２）の測定法を行なうためのキ・ントはヒ
トＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル抗体に加
え、ヒトＩＬ−６を含む。

本発明の方法では、下記実施例で明らかなようにリコン
ビナントＩＬ−６レセプターを数＋ｐｇ／ｍｌまで測定
が可能である。従って、本発明の方法により、ヒト血清
、尿、関節液等に含まれるＩ　Ｌ−６レセプターの生理
的濃度、細胞培養上清中あるいは培養細胞上のＩＬ−６
レセプターの濃度、さらにはＩＬ−６レセプターを遺伝
子工学的に生産したときの濃度を正確かつ迅速に測定す
ることができる。

［実施例］ 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明の実施例はこれらに限られるものではない。

叉＊ｍｉ ポリクローナル　　を用いたヒトＩＬ−６レセプターの
　　イ　　、　　法 コート用緩衝液ｆ０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ８〜
９（に溶解した２μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６レセプターモ
ノクローナル抗体Ｍ　７１　Ｂ　（Ｙ、　Ｈｉｒａｔａ
ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４３．　ｐ２９００
．１９８９年参声）を９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）
にウェル当たり１００μ！・入れ４℃で一晩放置した。

翌日、溶液を捨ててブロック用緩衝液Ａ（ＰＢＳ、０．
１％ＢＳＡ、０．２１ゼラチン、０．０５％アジ化ナト
リウム）あるいはＢ（ＰＢＳ、　１％Ｍｉｌｋ、０．０
５％　Ｔｗｅｅｎｌ　をウェル当たり１５０ｔｔｆｆ加
え、３０分以上室温で放置した０次に、溶液を捨ててリ
ンス用緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０１で３
回以上洗った後、所定濃度のりコンビナンドＩ　Ｌ−８
レセプターを加え室温で２〜３時間放置した５溶液を捨
ててリンス用緩衝液で３回以上洗った後、リンス用緩衝
液に溶解した５ＬＬｉｔ　／ｅｌのビオチン化抗ＩＬ−
６レセプターポリクローナル抗体（モルモット由来）を
加えて３７℃で１時間放置した。さらに溶液を捨ててリ
ンス用緩衝液で３回以上洗った後、］　ｍＭ　ＭｇＣＬ
を含むリンス用緩衝液で１０００倍に希釈したストレプ
トアビジン−β−ガラクトシダーゼを加え３７℃で３０
分間放置した。その後、溶液を捨ててリンス用緩衝液で
３回以上洗浄した。基質用緩衝液（０，０１Ｍリン酸ナ
トリウム、０．ＩＭ　ＮａＣ１、１５ＭＭｇＣＩ２．０
．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７，（１）に溶解した０
月ｍｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−〇−
ガラクトシド（シグマ社）をウェル当たりＩＱＯｔｉＡ
加え、遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度
を蛍光イムノリーダーでｉ＋＋定した。その結果を図１
に示す。なお、図１中、Ａ、Ｂは、それぞれブロック用
緩衝ｗｉＡ及びＢを用いて行なった測定結果を示す。

図１より、培地に溶解したりコンビナンドＩＬ−６レセ
プターが数十ｐｇ／ｍｌまで測定できることが分かる。

及且皇ユ 通常の培養条件に従い、１０％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ　
１６４［）を培地として表１に示す細胞を培養した培養
細胞上清中の可溶化ヒトＩＬ−６レセプターの濃度を実
施例１と同様にして測定した。その結果を、表１に示す
。

表　　１ 化ｊソ包！厄し迭 コート用緩衝液ｔｏ、　０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ８
〜９）に溶解した２μｇ／ｍｌの抗Ｉ　Ｌ−６レセブタ
一モノクローナル抗体Ｍ　Ｔ　１８　（Ｙ、　Ｈｉｒａ
ｔａら、Ｊ。

Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．、１４３．ｐ２９００．１９８９年
参照）を９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）にウェル当た
り１００μβ入れ４℃で一晩放置した。翌日、溶液を捨
ててブロック用緩衝液Ａ　（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、
０．２ｚゼラチン、００５％アジ化ナトリウム）をウェ
ル当たり１５０μ！加え、３０分以上室温で放置した。

次に、溶液を捨ててリンス用緩衝液（ＰＢＳ、Ｏ１％Ｔ
ｗｅｅｎ　２０）で３回以上洗った後、リコンビナント
ヒトＩＬ−６レセプターを加え室温で２〜３時間放置し
た。溶液を捨てた後、ウェル当たり２００００ｃｐｍの
１２Ｊ−ＩＬ−６を加えて室温で２〜３時間放置した。

リンス用緩衝液で３回以上洗った後、残存放射能を測定
した。その結果を図２に示す。

本発明の方法により、培地に溶解したりコンビナンドＩ
　Ｌ−６レセプターが数ｎ　ｇ／ｗｎ　ｌまで測定する
ことができることが分かる。

［発明の効果］ 本発明の方法によりＩＬ−６レセプターを高感度に迅速
にしかも多検体を同時に測定することが可能になった０
本発明の測定法は、ＩＬ−６レセプターの生理的濃度を
調べたり、ＩＬ−６レセプターの疾患における役割を解
明したり他の薬剤の効果を調べるのに有用なものである
。

【図面の簡単な説明】

図１は、リコンビナント可滴性ヒトＩＬ−６レセプター
の濃度と１本発明の測定法により測定された吸光度との
関係を示す図、 図２は、リコンビナント可溶性ヒトＩＬ−６レセプター
の濃度と、本発明の測定法により測定された残存放射能
との関係を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトＩＬ−６レセプターモノクローナル抗体と
   、被検試料中に含まれるヒトＩＬ−６レセプターとを反
   応させて形成される抗原抗体複合物を定量する工程を含
   む、ヒトＩＬ−６レセプターの免疫化学的測定法。
2. （２）前記抗原抗体複合物の定量は、ビオチン標識抗ヒ
   トＩＬ−６レセプターポリクローナル抗体を用いたサン
   ドイッチ法により行なわれ、該ビオチン標識抗ヒトＩＬ
   −６レセプターポリクローナル抗体の検出は、ストレプ
   トアビジン／β−ガラクトシダーゼおよびその基質を用
   いる酵素免疫分析により行なわれる請求項１記載の測定
   法。
3. （３）前記抗原抗体複合物の定量は、該抗原抗体複合物
   とヒトＩＬ−６との結合物を定量することにより行なわ
   れる請求項１記載の測定法。
4. （４）ヒトＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル
   抗体を含むことを特徴とする、請求項１記載の測定法を
   行なうための測定用キット。
5. （５）ヒトＩＬ−６レセプターに対するモノクローナル
   抗体、ビオチン標識抗ヒトＩＬ−６レセプターポリクロ
   ーナル抗体、検出系としてのストレプトアビジン／β−
   ガラクトシダーゼおよびその基質を含むことを特徴とす
   る請求項４記載の測定用キット。
6. （６）ヒトＩＬ−６を含むことを特徴とする請求項４記
   載の測定用キット。