KR102491559B1 - 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하는 방법 및 시약 - Google Patents
생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하는 방법 및 시약 Download PDFInfo
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Abstract
생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하고, IgG 항체 생산에 대해 복수의 세포 샘플을 분석하기 위한 방법 및 시약이 본 명세서에 개시된다.
Description
교차-참조
본원은 2017년 1월 18일 출원된 미국 특허가출원 일련번호 62/447772에 대한 우순권을 주장하고, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다.
단백질 생물제제는 가장 빠르게 성장하는 치료적 양식이다. 이들 약물은 일반적으로 환자에게 투여되고 질환과 관련된 특이적 생리 과정을 변경시키는 단백질 (즉, IgG) 분자이다. 단백질 생물 제제의 상업적 제조 공정은 길고, 비싸며 힘든 과정이다. 이것은 대부분의 단백질 생물 제제가 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 살아있는 세포주 내에서 제조되기 때문이다. 이들 세포주는 전형적으로 세포외 환경 (세포 배양 상청액)에 관심 있는 단백질 생물학적 제제를 생산하고 분비하도록 유전자적으로 조작된다. 생물학적 제제가 분비되면, 상업적 용도로 수확되고 정제된다. 이 과정의 비싼 특성 때문에, 생산 세포주를 조작하여 매우 높은 수준의 관심 있는 단백질을 생산하는 것이 바람직하다.
일 양태에서 하기 단계를 포함하는 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
(a) 미세적정 플레이트 내 복수의 웰들에서, 검출 시약과 함께 IgG 항체를 함유하는 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 검출 시약은 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 인큐베이팅하는 단계는 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 생성하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 또는 이 단편과 그것의 IgG 항체의 균일한 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계
(b) 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 표면에 결합되고, 여기서 상기 인큐베이팅하는 단계는 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 또는 이의 단편과 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(c) 생물학적 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터의 신호를 검출하는 단계로, 여기서 생물학적 샘플 내에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 양은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례하는, 검출 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다
(d) 대조군 샘플의 연속 희석물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 대조군 샘플의 연속 희석물의 각각의 희석물은 대조 혼합물을 생성하기 위해 검출 시약과 함께 미세적정 플레이트의 별개의 웰에 존재하고, 여기서 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서의 하나 이상의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편에 상응하는 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 인큐베이션하는 단계는 하나 이상의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편과 대조군 샘플에서의 비표지된 IgG 단백질 아이소타입의 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계;
(e) 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 대조 혼합물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 인큐베이팅하는 단계는 대조 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해 포획 비드의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편 및 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 경쟁적 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(f) IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 신호의 분석에 의해 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계로, 여기서 각각의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 하여 측정되는, 표준 곡선 생성 단계.
또 다른 양태에서 하기 단계를 포함하는 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 아이소타입 항체 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
(a) 미세적정 플레이트 내 복수의 웰들에서, 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 IgG 항체를 발현하는 복수의 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합분자는 표면에 결합되고; 상기 인큐베이팅하는 단계는 IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 생성하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약에 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계;
(b) 검출 시약과 함께 IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 검출 시약은 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 인큐베이션하는 단계는 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질-IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 생성하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체 상의 비점유된 부위에 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계; 및
(c) 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질-IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체 상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질로부터의 신호를 검출하는 단계로, 여기서 생물학적 샘플 내에 존재하는 IgG 항체 아이소타입 단백질의 양은 검출된 신호에 역으로 비례하는, 검출 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다
(d) 대조군 샘플의 연속 희석물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 대조군 샘플의 연속 희석물의 각각의 희석물은 대조 혼합물을 생성하기 위해 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 미세적정플레이트의 별개의 웰에 존재하고, 여기서 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서의 하나 이상의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편에 상응하는 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 인큐베이팅하는 단계는 대조 복합체를 생성하도록 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약에 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계;
(e) 검출 시약과 함께 대조 복합체를 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 인큐베이팅하는 단계는 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 상의 비점유된 부위에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(f) 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 결합된 검출가능하게 표지된 IgG 아이소타입으로부터 신호의 분석에 의해 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계로, 여기서 각각의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 IgG 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 하여 측정되는, 표준 곡선 생성 단계.
어느 하나의 양태의 다양한 구현예에서, 검출 시약은 정의된 비의 둘, 셋, 넷 또는 그 초과 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함하고, 그리고 둘, 셋, 또는 넷 또는 그 초과 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 생물학적 샘플에서 결정된다.
추가 구현예에서, 검출 시약은 검출가능한 세포 생존력 마커를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 방법은 각각의 생물학적 샘플에서 세포 생존력 및/또는 세포 수를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 결합 분자가 결합되는 표면은 비드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서 포획 시약의 각각의 모집단은 별도로 구별할 수 있다. 추가 구현예에서, 결합 분자는 항체, 어피머 압타머, 및/또는 Fc 수용체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 각각의 생물학적 샘플에서 총 IgG 항체 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 샘플을 포함한다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 희석되지 않은 샘플이다. 또 다른구현예에서, 상기 방법은 임의의 세척 단계를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포가 있거나 없는 마우스 B 세포 또는 마우스 세포 하이브리도마 상청액을 포함하고, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간 세포를 포함하고, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은은 랫트 세포를 포함하고, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 랫트IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 생물학적 샘플은 하기를 포함한다:
(i) 토끼 세포 또는 양 세포, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 토끼 또는 양 IgG로 구성된 군으로부터 선택됨;
(ii) 염소 세포, 돼지 세포, 또는 소과 세포, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 염소, 돼지, 또는 소과 IgG1 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택됨;
(iii) 말 세포, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 말 IgGa, IgGb, IgGt로 구성된 군으로부터 선택됨; 또는
(iv) 원숭이 세포, 여기서 상이한 IgG 아이소타입은 원숭이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 구성된 군으로부터 선택됨.
또 다른 양태에서 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
(a) 정의된 비의 둘, 셋, 넷 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편을 포함하는 검출 시약; 및
(b) 포획 시약의 둘, 셋, 넷 또는 그 초과의 모집단, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 상이한 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 상기 포획 시약의 각각의 모집단에서의 결합 분자는 표면에 결합된다.
일 구현예에서, 상기 표면은 비드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 포획 시약의 각각의 모집단은 별도로 구별할 수 있다. 추가 구현예에서, 결합 분자는 항체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 검출 시약에서 둘 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편에 상응하는 둘 또는 그 초과의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하는 대조군 샘플을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서 셋 또는 그 초과 또는 넷 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편에 상응하는 셋 또는 그 초과 또는 넷 또는 그 초과의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함함.
일 구현예에서, 검출 시약은 gG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3, 또는 이들의 항원 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 마우스 IgG 단백질 아이소타입의 정의된 비를 포함하고; 그리고 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 gG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3, 또는 이들의 항원 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 마우스 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 검출 시약은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 또는 이들의 항원 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 인간 IgG 단백질 아이소타입의 정의된 비를 포함하고; 그리고 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 인간 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다. 또 추가의 구현예에서, 검출 시약은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 랫트 IgG 단백질 아이소타입의 정의된 비를 포함하고; 그리고 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 랫트 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다. 다양한 다른 구현예에서,
(A) 상기 검출 시약은 하기의 정의된 비를 포함한다:
(i) IgG1, IgG2 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 염소, 돼지, 또는 소과 IgG 단백질 아이소타입;
(ii) IgGa, IgGb, IgGt 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2 또는 3개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 말 IgG 단백질 아이소타입; 또는
(iii) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 원숭이 IgG 단백질 아이소타입; 그리고
(B) 상기 포획 시약은 하기를 포함한다
(i) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgG1, IgG2 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 표적 염소, 돼지, 또는 소과 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2개의 모집단;
(ii) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgGa, IgGb, IgGt 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 말 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2 또는 3개의 모집단; 또는
(iii) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 원숭이 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단.
또 다른 양태에서 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 생산에 대한 복수의 세포 샘플을 분석하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 복수의 세포 샘플을 복수의 샘플 웰들을 갖는 검정 플레이트로 이전시키는 단계로, 여기서 각각의 샘플 웰은 복수의 분석 혼합물을 생성하기 위해 표적 IgG 항체를 발현하고 복수의 세포 샘플을 분석 시약과 혼합하는 희석되지 않은 세포 배양물인 세포 샘플을 함유하고, 상기 분석 시약은 하기를 포함하는, 단계:
(i) 포획 비드가 IgG 항체에 결합하는, 상기 포획 비드; 및
(ii) (A) 대조 IgG 항체 또는 이의 단편, 및 (B) 제1 검출가능 분체를 포함하는 제1 검출 분자;
(b) 포획 비드에 표적 IgG 항체 및 제1 검출분자의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 복수의 분석 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및
(c) 유세포측정 분석에 의해 상기 복수의 분석 혼합물의 각각의 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도를 결정하는 단계.
일 구현예에서, 세포 배양물은 단일 클론으로부터 번식된다. 또 다른 구현예에서, 포획 비드는 단백질 G 또는 단백질 A와 공유결합된다. 추가 구현예에서, 포획 비드는 자기 비드 또는 아가로스 비드이다. 또 다른 구현예에서, 검정 플레이트는 복수의 샘플이 이전되지 전에 동결건조된 분석 시약을 함유한다. 일 구현예에서, 분석 시약을 복수의 샘플과 혼합하는 것은 웰들에서 세포 샘플에 분석 시약을 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 검정 플레이트는 유세포측정기에서 검정 플레이트에서의 복수의 분석 혼합물을 판독하기 전에 원심분리된다. 추가 구현예에서, 상기 혼합하는 것은 복수의 세포 샘플과 분석 시약의 전부를 동시에 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 분자는 포획 비드에 결합하는 것에 대해 표적 IgG 항체와 경쟁하고; 그리고 각각의 분석 혼합물에서 포획 비드에 결합된 제1 검출 분자의 양은 주어진 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도의 척도를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 상기 혼합하는 것은 포획 비드와 제1 검출 분자의 단계적인 첨가를 포함하고, 여기서 상기 단계적인 첨가는 하기를 포함한다:
복수의 제1 혼합물을 생성하기 위해 포획 비드에 표적 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 복수의 세포 샘플을 포획 비드와 제1 혼합하는 단계, 및 그 다음 복수의 분석 혼합물을 생성하기 위해 포획 비드에 제1 검출 분자의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 제1 검출 분자를 복수의 제1 혼합물에 부가하는 단계;
여기서 각각의 분석 혼합물에서 포획 비드에 결합된 제1 검출 분자의 양은 주어진 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도의 척도를 제공한다.
또 다른 양태에서 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 생산에 대한 복수의 세포 샘플을 분석하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 복수의 세포 샘플을 복수의 샘플 웰들을 갖는 검정 플레이트로 이전시키는 단계로, 여기서 각각의 샘플 웰은 복수의 분석 혼합물을 생성하기 위해 표적 IgG 항체를 발현하고 복수의 세포 샘플을 분석 시약과 혼합하는 희석되지 않은 세포 배양물인 세포 샘플을 함유하고, 상기 분석 시약은 하기를 포함하는, 단계:
(i) 포획 비드가 IgG 항체에 결합하는, 상기 포획 비드; 및
(ii) 제1 검출가능 분체를 포함하는 제1 검출 분자;
(b) 포획 비드에 표적 IgG 항체 및 제1 검출분자의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 복수의 분석 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및
(c) 유세포측정 분석에 의해 상기 복수의 분석 혼합물의 각각의 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도를 결정하는 단계.
일 구현예에서, 상기 제1 검출 분자는 면역글로불린 경쇄를 결하고 포획 비드에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 포획 비드에 결합된 표적 IgG 항체에 제2 검출 분자의 결합을 촉진시키기 위한 시간 및 조건하에서 복수의 분석 혼합물을 제2 검출 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고;
여기서 상기 제2 검출 분자는 제1 검출 분자와는 광학적으로 구별할 수 있는 검출가능하게 표지된 항-IgG 경쇄 항체를 포함하고; 그리고
여기서 각각의 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체에 결합된 제2 검출 분자의 양은 주어진 분석 혼합물에서 온전한 표적 IgG 항체 농도의 척도를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 복수의 분석 혼합물은 표지된 항-경쇄 항체가 첨가되기 전에 원심분리되고 세척 단계를 거친다. 추가 구현예에서, 상기 분석 시약은 세포 생존력 염료, 세포 표면 바이오마커, 또는 세포자멸사의 마커 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 하기의 것 중 하나 이상을 결정하는 것을 추가로 포함한다:
(i) 각각의 분석 혼합물에서의 세포의 수;
(ii) 각각의 분석 혼합물에서의 생존가능 세포의 백분율;
(ii) 각각의 분석 혼합물에서 세포당 표적 IgG 항체의 농도; 및/또는
(iii) 각각의 분석 혼합물에서 생존가능 세포당 표적 IgG 항체의 농도.
또 다른 양태에서 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
(a) 검정 플레이트, 및
(b) 분석 시약, 여기서 상기 분석 시약은 하기를 포함함:
(i) 포획 비드가 IgG 항체에 결합하는, 상기 포획 비드; 및
(ii) 제1 검출가능 분체를 포함하는 제1 검출 분자.
일 구현예에서, 상기 제1 검출 분자는 대조 IgG 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서 상기 키트는 제1 검출 분자로부터 광학적으로 구별할 수 있는 검출가능하게 표지된 항-경쇄 항체를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 분석 시약은 세포 생존력 염료, 세포 표면 바이오마커, 또는 세포자멸사의 마커 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 포획 비드는 단백질 G 또는 단백질 A와 공유결합된다. 추가 구현예에서, 상기 포획 비드는 자기 비드 또는 아가로스 비드이다. 또 다른 구현예에서, 상기 검정 플레이트는 동결건조된 분석 시약을 함유한다.
도 1은 4개의 상이한 IgG 아이소타입을 포착하기 위해 4개의 포획 비드를 갖는 다중화된 경쟁 검정 형식의 다이어그램이다.
도 2는 미세적정 플레이트에서 표준 웰들의 예시적인 셋업의 다이어그램이다.
도 2는 미세적정 플레이트에서 표준 웰들의 예시적인 셋업의 다이어그램이다.
인용된 모든 참조문헌은 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "및"은 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 "또는"과 교환적으로 사용된다.
본 발명의 임의의 양태의 모든 구현예는, 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한, 조합하여 사용될 수 있다.
문맥상 분명하게 다르게 요구하지 않는 한, 상세한 설명 및 청구항에 걸쳐, 용어 '포함한다', '포함하는' 및 기타 동종의 것은 배타적인 또는 철저한 의미와는 대조적으로 포괄적인 의미로 해석되어야 한다; 말하자면, "비제한적으로, 포함하는"의 의미로 해석된다. 단수 또는 복수의 수를 사용하는 단어는 또한 각각 복수 및 단수의 수를 포함한다. 추가로, 용어 "본 명세서에", "위에" 및 "아래에" 및 이와 유사한 도입 용어는 본원에서 사용될 때 본원의 임의의 특정 부분이 아닌 전체적으로 본원을 지칭하는 것이다.
본 개시내용의 구현예의 상세한 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 철저하게 하거나 한정하기 위한 것은 아니다. 본 개시내용의 특정 구현예 및 실시예가 예시적 목적으로 본 명세서에 기재되었지만, 관련 기술의 숙련가가 인식할 수 있는 바와 같이, 다양한 동등한 변형이 본 개시내용의 범위 내에서 가능하다.
제1 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
(a) 미세적정 플레이트 내 복수의 웰들에서, 검출 시약과 함께 IgG 항체를 함유하는 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 검출 시약은 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 인큐베이팅하는 단계는 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 생성하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 또는 이 단편과 그것의 IgG 항체의 균일한 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계
(b) 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 표면에 결합되고, 여기서 상기 인큐베이팅하는 단계는 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 또는 이의 단편과 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(c) 생물학적 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터의 신호를 검출하는 단계로, 여기서 생물학적 샘플 내에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 양은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례하는, 검출 단계.
상기 방법은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례하는 생물학적 샘플에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 역전 관계에 기반하여 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하는 것을 허용한다.
비제한적으로 단리된 IgG 항체-분비 세포, IgG 항체-분비 세포의 모집단, 이러한 세포의 상청액, 이들의 세포 추출물, 혈청, 혈청 추출물, 생체액 (비제한적으로 혈액을 포함함), 및 생체액 추출물 (비제한적으로 혈액 추출물을 포함함)을 포함한 IgG 항체를 함유하는 임의의 적합한 생물학적 샘플이 사용될 수 있다. 비-제한적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 항체-분비 B 세포, 하이브리도마 세포, 이들의 상청액 (즉, 세포 성분이 있거나 없는, 세포 또는 하이브리도마가 배양된 세포 배양 배지), 또는 이들의 세포 추출물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 단일 클론으로부터 번식된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 생물학적 샘플은 미정의된 세포 모집단을 포함한다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 희석되지 않은 샘플, 예컨대 세포/하이브리도마 배양물로부터의 희석되지 않은 샘플이다. 본 발명의 방법은 이전의 항체 농도 검출 기술을 사용하는 것이 가능하지 않고, 희석 인자의 주관적인 어림짐작을 요할 수 있는 매개 샘플 희석 단계를 제거함에 의해 검정 작업흐름을 크게 단순화하는, 세포/하이브리도마 배양물 샘플의 희석 없이 IgG 항체 아이소타입의 정량화를 가능하게 한다.
생물학적 샘플은 비제한적으로 인간, 설치류 (즉, 마우스, 랫트, 햄스터, 등), 토끼, 돼지, 염소, 원숭이, 양, 말, 소과, 등을 포함한 임의의 기원의 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생물학적 샘플에서의 IgG 항체는 다클론성 또는 단클론성 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 IgG 항체는 단클론성 항체, 이들의 단편, 또는 이들의 면역학적 결합 동등물이다. 이러한 항체는 비제한적으로 단클론성 항체 (mAbs), 인간화된 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체 (scFvs), Fab 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드-연결된 Fvs (sdFv) 단편, 항-개체 특이형 (항-Id) 항체, 인트라-바디, 합성 항체, 임의의 상기의 것의 에피토프-결합 단편, 및 IgG Fc 영역에 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함하여, 세포가 발현될 수 있거나 또는 발현되도록 조작될 수 있는 임의의 유형의 항체를 포함한다.
검출 시약은 상응하는 IgG 항체 아이소타입에 결합하는 능력을 보유한 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함한다. 다양한 구현예에서, 검출 시약은 2, 3, 4, 5, 또는 그 초과의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함한다. 이러한 IgG 단백질은 BD Biosciences, Sigma Chemical Company, Millipore, 및 ThermoFisher Scientific을 비롯한 수많은 판매인으로부터 상업적으로 입수가능하다. 각각의 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 특이적 IgG 항체 아이소타입에 결합하는 능력을 갖는다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 마우스 B 세포 또는 마우스 세포 하이브리도마 상청액 (세포가 있거나 없음)을 포함하고 그리고 상이한 IgG 아이소타입은 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 구현예에서, 검출 시약은 1, 2, 3, 또는 4개의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 (즉: IgG1, IgG2a, IgG2b, 및/또는 IgG3), 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 비제한적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간 항체-분비 세포를 포함하고 그리고 상이한 IgG 아이소타입은 인간IgG1, IgG2, IgG3, 및IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 구현예에서, 검출 시약은 1, 2, 3, 또는 4개의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함한다. 추가의 비제한적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 랫트 항체-분비 세포를 포함하고, 그리고 상이한 IgG 아이소타입은 랫트 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 구현예에서, 검출 시약은 1, 2, 3, 또는 4개의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함한다. 다양한 추가 구현예에서,
(i) 상기 생물학적 샘플은 토끼 또는 양 항체-분비 세포를 포함하고, 그리고 유일한 IgG 아이소타입은 토끼 또는 양 IgG이다;
(ii) 상기 생물학적 샘플은 염소, 돼지, 또는 소과 항체-분비 세포를 포함하고, 그리고 상이한 IgG 아이소타입은 염소, 돼지, 또는 소과 IgG1 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 구현예에서, 검출 시약은 1 또는 2개의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함한다;
(iii) 상기 생물학적 샘플은 말 항체-분비세포를 포함하고, 그리고 상이한 IgG 아이소타입은 말 IgGa, IgGb, IgGt로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 구현예에서, 검출 시약은 1, 2, 또는 3개의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함하거나 또는
(iv) 상기 생물학적 샘플은 항체-분비 원숭이 세포를 포함하고, 그리고 상이한 IgG 아이소타입은 원숭이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 구현예에서, 검출 시약은 1, 2, 3, 또는 4개의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함한다.
다양한 구현예에서 검출 시약은 정의된 비의 2, 3, 4 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함한다. 이 구현예는 생물학적 샘플에서 2, 3, 4, 또는 그 초과의 IgG 항체 아이소타입의 농도의 보다 신속한 정량화를 허용한다. 비가 알려져 있는 한, 임의의 정의된 비의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편이 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 각각의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편이 대략 동일한 농도로 존재한다. 또 다른 비제한적인 구현예에서, 각각의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편이 대략 동일한 양으로 존재한다 (즉, 3개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편이 있을 때 약 1:1:1).
표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 임의의 적합한 농도가 검정에서 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 검출 시약에 각각의 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 약 1 ng/mL 내지 약 10 mg/ml 사이로 존재한다. 다양한 다른 구현예에서, 검출 시약에 각각의 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 약 10 ng/mL 내지 약 1 mg/ml, 약 100 ng/mL 내지 약 750 μg/ml, 약 500 ng/mL 내지 약 500 μg/ml, 약 1 μg/ml 내지 약 250 μg/ml 사이, 또는 적어도 125 μg/ml로 존재한다.
비제한적으로 형광 표지, 합텐, 비색계 표지, 다양한 방사성 라벨, 효소, 보철 그룹, 형광 마커, 발광성 마커, 생물발광 마커, 표지된 입자 예컨대 실리콘, 유리, 또는 금속 입자; 단백질-단백질 결합 쌍, 단백질-항체 결합 쌍 및 기타 동종의 것을 포함한 임의의 적합한 검출가능한 표지가 사용될 수 있다. 형광 라벨의 예는, 비제한적으로, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 시아닌, 단실 염화물, 파이코시아닌, 알로피코시아닌 (APC), 빛나는 보라색 염료, 빛나는 자외선 염료, 및 파이코에리트린을 포함한다. 생물발광 마커의 예는, 비제한적으로, 루시퍼라아제 (예를 들어, 박테리아, 개똥벌레, 방아벌레 및 기타 동종의 것), 루시페린, 에쿼린 및 기타 동종의 것을 포함한다. 시각적으로 검출가능한 신호를 갖는 효소 시스템의 예는, 비제한적으로, 갈락토시다아제, 글루코리니다아제, 포스파타제, 페록시다아제, 콜린에스테라아제 및 기타 동종의 것을 포함한다. 검출가능한 표지는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 특정 구현예에서 검출 표지는 형광단 또는 형광 단백질을 포함한다. 검출 시약이 2, 3, 4 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함하는 경우, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 각각의 상이한 모집단은 의도된 검출 검정에 따라 동일 또는 구별할 수 있는 표지를 가질 수 있다.
추가 구현예에서, 검출 시약은 검출가능한 세포 생존력 마커를 추가로 포함하고, 그리고 상기 방법은 각각의 생물학적 샘플에서 세포 생존력 및/또는 세포 수를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 적합한 세포 생존력 마커가 사용될 수 있다. 세포 생존력 염료는 샘플에서 비-생존가능 세포 검출을 허용할 수 있다. 예를 들어 세포 생존력 염료는 세포 제제가 세포내 표적에 대해 유세포측정에 의해 분석되어 지는 경우에서도 죽은 세포가 분석으로부터 배제될 수 있게 하는 죽은 세포를 영구적으로 표지할 수 있다 (예를 들어 고정가능 생존력 염료 eFlour®, 프로피듐 아이오다이드 (PI)는 생존가능 세포로부터 일반적으로 배제되는 막 불침투성 염료이다). 세포 생존력 염료는 또한 생존 세포를 표지할 수 있다. 예를 들어, 비-형광 화합물은 생존 세포에 자유롭게 유입하고 세포내 에스테라제는 이것을 형광 염료로 전환시킨다. 그와 같은 예에서, 염료는 고착 또는 투과화 후 세포에서 유지되지 않을 것이고 따라서 세포내 염색 프로토콜에 유용하지 않다. 일부 구현예에서, 분석 시약은 세포 표면 바이오 마커 또는 세포자멸사의 마커를 추가로 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 세포 표면 마커가 세포의 표면 상에서 발현된 단백질이고 종종 특이적 세포 유형의 마커로 편리하게 작용할 수 있다는 것을 인식했다. 예를 들어, T 세포 및 B 세포 표면 마커는 분화 과정에서 그것의 계대 및 단계를 확인한다.
인큐베이팅 단계는 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 생성하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 또는 이의 단편을 이들의 IgG 항체와의 균일한 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생한다. 이러한 균일한 혼합을 촉진하기 위한 임의의 적당한 조건이 사용될 수 있고, 그리고 인큐베이션의 온도, 습도 수준, 길이, 교반 또는 다른 혼합력의 적용, 사용되어 지는 배지, 등과 같은 이러한 적절한 조건을 결정하는 것은 당해 분야의 숙련가의 수준 이내에 있다.
상기 방법은 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 인큐베이팅하는 단계를 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다. 포획 시약의 각각의 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 대해 특이적이고, 따라서 IgG 아이소타입에 기반하여 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 임의의 적합한 결합 분자가 사용될 수 있다. 다양한 비제한적인 구현예에서, 결합 분자는 항체, 어피머 압타머, Fc 수용체, 또는 다른 단백질/당/지질 또는 조합 분자를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 결합 분자는 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 IgG 아이소타입 선택적 항체는 BD Biosciences, Sigma Chemical Company, Millipore, 및 ThermoFisher Scientific을 비롯한 수많은 판매인으로부터 상업적으로 입수가능하다.
포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 표면에 결합된다. 비제한적으로 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 다염화비닐, 폴리프로필렌 지지체, 자기 또는 상자성 비드, 아가로스 비드, 및 여과 배지 예컨대 NHS-활성화된 세파로스 또는 CNBr-활성화된 세파로스를 포함한 임의의 적합한 표면이 사용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 비드, 예컨대 자기 또는 상자성 비드에 결합된다. 자기 또는 상자성 포획 비드는 전형적으로 직경이 약 1 mm 또는 그 미만이고, 침강 또는 막힘을 방지하기에 충분하게 충분히 작다. 적합한 비드는 본 기술의 통상인에게 알려져 있고 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 노르웨이 소재 Invitrogen Dynal로부터 Dynabeads My-One™, 또는 프랑스 소재 Merck로부터의 Estapore). 비드는 항체 또는 항원의 수동적인 또는 활성 커플링을 위해 결합 분자로 사전-커플링 또는 코팅될 수 있다. 다른 구현예에서, 포획 비드는 아가로스 비드일 수 있다. 전형적으로 아가로스 비드는 직경이 약 20μm 내지 350μm이다. 또 다른 특정 구현예에서, 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 미세적정 플레이트의 웰들에서 인쇄된 어레이에 존재한다.
포획 시약의 임의의 적합한 밀도가 검정에서 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 포획 시약의 각각의 모집단은 밀리리터당 약 만 내지 약 1억개 포획 시약의 밀도로 존재한다. 다양한 추가 구현예에서, 포획 시약의 각각의 모집단은 밀리리터당 약 십만 내지 약 오천만, 약 이십오만 내지 약 이천오백만, 약 오십만 내지 약 천만 포획, 또는 약 칠십오만 내지 약 오백만 포획 시약의 밀도로 존재한다.
인큐베이팅은 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 또는 이의 단편 및 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행된다. 이러한 균일한 혼합을 촉진하기 위한 임의의 적당한 조건이 사용될 수 있고, 그리고 인큐베이션의 온도, 습도 수준, 길이, 교반 또는 다른 혼합력의 적용, 사용되어 지는 배지, 등과 같은 이러한 적절한 조건을 결정하는 것은 당해 분야의 숙련가의 수준 이내에 있다.
신호 (즉: 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편으로부터의 신호)는 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출되어 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정한다. 이것은 경쟁 검정이기 때문에, 생물학적 샘플에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 양은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례한다. 비제한적으로 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 유세포측정, 플레이트 리더, 중간 규모 발견 플랫폼, 및 형광 현미경검사를 포함하여, 이용된 검출 가능한 표지에 의존하여, IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 신호를 검출하기 위한 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 검출은, 유체의 스트림에 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 현탁하고 이들을 전자 검출 장치에 통과시킴에 의해, 최대 수만의 복합체/초의 물리적 및 화학적 특성의 동시 다중-매개변수 분석을 허용하는 유세포측정을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대해 표준 곡선을 생성하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 측정된다. 하나의 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다
(d) 대조군 샘플의 연속 희석물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 대조군 샘플의 연속 희석물의 각각의 희석물은 대조 혼합물을 생성하기 위해 검출 시약과 함께 미세적정 플레이트의 별개의 웰에 존재하고, 여기서 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서의 하나 이상의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편에 상응하는 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 인큐베이션하는 단계는 하나 이상의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편과 대조군 샘플에서의 비표지된 IgG 단백질 아이소타입의 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계;
(e) 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 대조 혼합물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 인큐베이팅하는 단계는 대조 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해 포획 비드의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편 및 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 경쟁적 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(f) IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 신호의 분석에 의해 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계로, 여기서 각각의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 하여 측정되는, 표준 곡선 생성 단계.
이 구현예에서, 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편 및 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 생물학적 샘플에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 양은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례하고, IgG 아이소타입-특이적 표준 곡선으로부터 보간될 수 있고 그리고 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 제로 농도를 갖는 대조군 웰로부터 계산된 기준선 양 이상의 양성 양으로 정량화될 수 있다.
제2 양태에서 하기 단계를 포함하는 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 아이소타입 항체 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
(a) 미세적정 플레이트 내 복수의 웰들에서, 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 IgG 항체를 발현하는 복수의 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합분자는 표면에 결합되고; 상기 인큐베이팅하는 단계는 IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 생성하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약에 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계;
(b) 검출 시약과 함께 IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 검출 시약은 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 인큐베이션하는 단계는 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질-IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 생성하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체 상의 비점유된 부위에 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계; 및
(c) 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질-IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체 상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질로부터의 신호를 검출하는 단계로, 여기서 생물학적 샘플 내에 존재하는 IgG 항체 아이소타입 단백질의 양은 검출된 신호에 역으로 비례하는, 검출 단계.
이 양태에서, 상기 방법은 사전-인큐베이션 프로토콜을 따른다.
하이브리도마 배양, 예컨대 마우스 하이브리도마 배양을 위해, 전체 경쟁 검정 프로토콜이 바람직할 수 있다. 이 프로토콜은 마우스 하이브리도마 배양물에서 통상적으로 나타난 IgG 범위 (1-50ug/mL)의 정량화를 처리할 수 있다.
B 세포 배양물에 대해, 사전-인큐베이션 검정 프로토콜이 바람직할 수 있다. 이 프로토콜은 조정된 경쟁 프로토콜이다. 저-수준 IgG 샘플에 대해, 검출/경쟁 시약의 첨가 전에 포획 시약과 생물학적 샘플의 사전-인큐베이션은 샘플에서 낮은 수준의 IgG를 더 잘 검출할 수 있다. 이 프로토콜은 예를 들어, 마우스 B 세포 배양물에서 통상적으로 나타난 마우스 IgG 범위 (0.1-2μg/mL)의 정량화를 더 잘 처리할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 모든 구현예는 본 발명의 제2 양태에 사용하기에 적합하다. 일 구현예에서, 상기 방법은 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대해 표준 곡선을 생성하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 측정된다. 하나의 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다
(d) 대조군 샘플의 연속 희석물을 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 상기 대조군 샘플의 연속 희석물의 각각의 희석물은 대조 혼합물을 생성하기 위해 포획 시약의 하나 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 미세적정플레이트의 별개의 웰에 존재하고, 여기서 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서의 하나 이상의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편에 상응하는 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 인큐베이팅하는 단계는 대조 복합체를 생성하도록 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약에 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계;
(e) 검출 시약과 함께 대조 복합체를 인큐베이팅하는 단계로, 여기서 인큐베이팅하는 단계는 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 상의 비점유된 부위에 하나 이상의 검출가능하게 표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(f) 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 결합된 검출가능하게 표지된 IgG 아이소타입으로부터 신호의 분석에 의해 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계로, 여기서 각각의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 IgG 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 하여 측정되는, 표준 곡선 생성 단계.
이 구현예에서, 하나 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편 및 하나 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 생물학적 샘플에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 양은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례하고, IgG 아이소타입-특이적 표준 곡선으로부터 보간될 수 있고 그리고 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 제로 농도를 갖는 대조군 웰로부터 계산된 기준선 양 이상의 양성 양으로 정량화될 수 있다.
본 발명의 제1 및 제2 양태의 일 구현예에서, 본 방법은 각각의 생물학적 샘플에서 총 IgG 항체 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 총 IgG 항체 농도를 결정하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 생물학적 샘플에 존재하는 각각의 IgG 아이소타입의 양을 결정하는 구현예에서, 이 구현예는 총 IgG 항체 농도에 도달하도록 각각의 개별 IgG 아이소타입 농도의 양을 부가하는 것을 단순히 요할 수 있다.
본 발명의 제1 및 제2 양태의 또 다른 구현예에서, 본 방법은 임의의 세척 단계를 포함하지 않으며, 이는 노동-집약적인 처리 시간을 제거하고 세포, 비드 또는 둘 모두의 수와 같은 세척-관련된 판독 변화를 감소시킴으로써 데이터 완전성을 향상시킨다.
제3 양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 생산에 대해 복수의 세포 샘플을 분석하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 복수의 샘플 웰을 갖는 검정 플레이트로 복수의 세포 샘플을 이전시키는 단계로, 여기서 각각의 샘플 웰은 복수의 분석 혼합물을 생성하기 위해 표적 IgG 항체를 발현하고 복수의 세포 샘플을 분석 시약과 혼합하는 희석되지 않은 세포 배양물인 세포 샘플을 함유하고, 상기 분석 시약은: (i) 포획 비드가 IgG 항체에 결합하는, 상기 포획 비드; 및 (ii) (A) 대조 IgG 항체 또는 이의 단편, 및 (B) 제1 검출가능 분체를 포함하는 제1 검출 분자를 포함하는, 단계; (b) 포획 비드에 표적 IgG 항체 및 제1 검출분자의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 복수의 분석 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및 (c) 유세포측정 분석에 의해 상기 복수의 분석 혼합물의 각각의 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 복수의 샘플과 분석 시약을 혼합하는 것은 웰들 내 세포 샘플에 분석 시약을 부가하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 혼합하는 것은 복수의 세포 샘플과 분석 시약의 전부를 동시에 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 분자는 포획 비드에 결합하는 것에 대해 표적 IgG 항체와 경쟁하고; 그리고 각각의 분석 혼합물에서 포획 비드에 결합된 제1 검출 분자의 양은 주어진 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도의 척도를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 포획 비드와 제1 검출 분자의 단계적인 첨가를 포함하는 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 단계적인 첨가는 하기를 포함한다: 복수의 제1 혼합물을 생성하기 위해 포획 비드에 표적 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 복수의 세포 샘플을 포획 비드와 제1 혼합하는 단계, 및 그 다음 복수의 분석 혼합물을 생성하기 위해 포획 비드에 제1 검출 분자의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 제1 검출 분자를 복수의 제1 혼합물에 부가하는 단계; 여기서 각각의 분석 혼합물에서 포획 비드에 결합된 제1 검출 분자의 양은 주어진 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도의 척도를 제공한다.
특정 구현예에서, 세포 배양물은 단일 클론으로부터 번식된다. 다른 구현예에서, 세포 모집단은 한정되지 않는다. 전형적으로, 관심 유전자가 후보 생산자 세포의 모집단 안으로 도입된다. 숙주 염색체 안으로 염색체 통합은 드문 사건이고, 따라서 안정적으로-형질감염된 세포는 일반적으로 다양한 방식으로 선택되고 배양되어야한다. 예를 들어, 안정적으로-형질감염된 세포의 선택을 위해, 선택 마커는 관심 유전자와 함께-발현된다. G418, 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 또는 글루타민 합성효소에 내성을 부여하는, 네오마이신 인산전달효소와 같은 항생제에 대한 내성을 포함하여, 형질감염된 세포를 선정하기 위한 다양한 시스템이 존재한다. 이러한 시스템은 본 기술분야의 통상인에게 잘 알려져 있다. 유전자 전달 후, 세포는 선택적 제제를 함유하는 배지에서 배양된다. 플라스미드를 통합한 세포만이 약물 내성 유전자를 함유하여 생존한다. 관심 유전자와 통합된 세포의 모집단은 다중 웰 "미세적정" 플레이트의 웰들에서 희석되고 분포되어 단 하나의 세포만이 각각의 웰에서 침착된다. 이를 수행하기 위한 방법은 당업계에 잘 기술되어 있고 당업자에게 알려져 있다. 하나의 세포/웰은 실제로 달성하기 어려운 목표이다; 비록 대부분의 웰들이 하나의 세포를 함유하지만, 제로 세포를 갖는 많은 웰들, 및 다중 세포를 함유하는 많은 웰들이 있다. 일반적으로 높은 수준의 단백질을 분비하는 작은 수의 세포 주를 발견하기 위해 수백수천의 웰들을 검사하는 것이 필요하다.
이 제3 양태에서 사용된 바와 같이, 용어 "포획 비드"는 관심 있는 IgG 분자 또는 단백질에 결합하기 위한 지지체를 제공할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 포획 비드는 관심 있는 IgG 분자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 분자와 공유결합된다. 예를 들어, 단백질 G 및 단백질 A는 Fab 및 Fc 영역을 통해 항체에 선택적으로 결합한다. 단백질 G 또는 단백질 A 또는 다른 면역글로불린-결합 박테리아 단백질 예컨대 단백질 A/G 및 단백질 L은 면역글로불린에 결합/검출하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 포획 비드는 표적 항체에 의해 구체적으로 결합된 IgG 항체 또는 분자를 구체적으로 인지하는 항체와 공유결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 비드는 자기 비드 또는 아가로스 비드이다. 자기 또는 상자성 포획 비드는 전형적으로 직경이 약 1 mm 또는 그 미만이고, 침강 또는 막힘을 방지하기에 충분하게 충분히 작다. 적합한 마이크로 비드는 본 기술의 통상인에게 알려져 있고 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 노르웨이 소재 Invitrogen Dynal로부터 Dynabeads My-One™, 또는 프랑스 소재 Merck로부터의 Estapore). 전술한 바와 같이, 비드는 (특이적 친화성 시약 예컨대 단백질 G로) 사전-커플링될 수 있거나 또는 항체 또는 항원의 수동적인 또는 활성 커플링을 위해 상이한 분자로 코팅될 수 있다. 다른 구현예에서, 포획 비드는 아가로스 비드일 수 있다. 전형적으로 아가로스 비드는 직경이 약 350μm 내지 20μm이다.
이 제3 양태에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출 분자"는 관심 있는 표적 IgG 분자 또는 단백질의 검출을 허용하는 임의의 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서 검출 분자는 검출가능 분체 예컨대 형광단 또는 형광 단백질을 포함한다. 검출 분자를 표지하기 위해 검출가능 분체가 사용될 수 있다. 검출가능 분체는, 예를 들어, 형광 모이어티, 합텐, 비색계 모이어티, 다양한 방사성 모이어티, 효소, 보철 그룹, 형광 마커, 발광성 마커, 생물발광 마커, 금속 입자, 단백질-단백질 결합 쌍, 단백질-항체 결합 쌍 및 기타 동종의 것을 포함할 수 있다. 형광 모이어티의 예는, 비제한적으로, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 시아닌, 단실 염화물, 파이코시아닌, 파이코에리트린을 포함한다. 생물발광 마커의 예는, 비제한적으로, 루시퍼라아제 (예를 들어, 박테리아, 개똥벌레, 방아벌레 및 기타 동종의 것), 루시페린, 에쿼린 및 기타 동종의 것을 포함한다. 시각적으로 검출가능한 신호를 갖는 효소 시스템의 예는, 비제한적으로, 갈락토시다아제, 글루코리니다아제, 포스파타제, 페록시다아제, 콜린에스테라아제 및 기타 동종의 것을 포함한다. 검출가능한 모이어티는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
특정 구현예에서, 검정 플레이트는 동결건조된 분석 시약을 함유한다. 동결건조는 고진공하에서 냉동된 생성물의 신속 동결 및 탈수에 의해 물질의 안정한 제제의 창출이다. 동결건조된 생물학적 물질은 온전하고 활성적인 것 모두이어야 하고, 또한 신속한 용해의 이점을 가지고 실험실 공정 자동화뿐만 아니라 생성물의 창고보관, 운송 및 최종 사용자 보관에 바람직한 주위 온도에서의 긴 저장수명에 이상적이어야 한다.
제4 양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 생산에 대해 복수의 세포 샘플을 분석하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 복수의 샘플 웰을 갖는 검정 플레이트로 복수의 세포 샘플을 이전시키는 단계로, 여기서 각각의 샘플 웰은 복수의 분석 혼합물을 생성하기 위해 표적 IgG 항체를 발현하고 복수의 세포 샘플을 분석 시약과 혼합하는 희석되지 않은 세포 배양물인 세포 샘플을 함유하고, 상기 분석 시약은: (i) 포획 비드가 IgG 항체에 결합하는, 상기 포획 비드; 및 (ii) 제1 검출가능 분체를 포함하는 제1 검출 분자를 포함하는, 단계; (b) 포획 비드에 표적 IgG 항체 및 제1 검출분자의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 복수의 분석 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및 (c) 유세포측정 분석에 의해 상기 복수의 분석 혼합물의 각각의 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체 농도를 결정하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 제1 검출 분자는 면역글로불린 경쇄를 결하고 포획 비드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 포획 비드에 결합된 표적 IgG 항체에 제2 검출 분자의 결합을 촉진시키기 위한 시간 및 조건하에서 복수의 분석 혼합물을 제2 검출 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고; 여기서 상기 제2 검출 분자는 제1 검출 분자와는 광학적으로 구별할 수 있는 검출가능하게 표지된 항-IgG 경쇄 항체를 포함하고; 그리고 여기서 각각의 분석 혼합물에서 표적 IgG 항체에 결합된 제2 검출 분자의 양은 주어진 분석 혼합물에서 온전한 표적 IgG 항체 농도의 척도를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 복수의 분석 혼합물은 표지된 항-경쇄 항체가 첨가되기 전에 원심분리되고 세척 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 분석 시약은 세포 생존력 염료, 세포 표면 바이오마커, 또는 세포자멸사의 마커 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 세포 생존력 염료는 샘플에서 비-생존가능 세포 검출을 허용할 수 있다. 예를 들어 세포 생존력 염료는 세포 제제가 세포내 표적에 대해 유세포측정에 의해 분석되어 지는 경우에서도 죽은 세포가 분석으로부터 배제될 수 있게 하는 죽은 세포를 영구적으로 표지할 수 있다 (예를 들어 고정가능 생존력 염료 eFlour®, 프로피듐 아이오다이드 (PI)는 생존가능 세포로부터 일반적으로 배제되는 막 불침투성 염료이다). 세포 생존력 염료는 또한 생존 세포를 표지할 수 있다. 예를 들어, 비-형광 화합물은 생존 세포에 자유롭게 유입하고 세포내 에스테라제는 이것을 형광 염료로 전환시킨다. 그와 같은 예에서, 염료는 고착 또는 투과화 후 세포에서 유지되지 않을 것이고 따라서 세포내 염색 프로토콜에 유용하지 않다. 일부 구현예에서, 분석 시약은 세포 표면 바이오 마커 또는 세포자멸사의 마커를 추가로 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 세포 표면 마커가 세포의 표면 상에서 발현된 단백질이고 종종 특이적 세포 유형의 마커로 편리하게 작용할 수 있다는 것을 인식했다. 예를 들어, T 세포 및 B 세포 표면 마커는 분화 과정에서 그것의 계대 및 단계를 확인한다.
특정 구현예에서, 본 방법은: 각각의 분석 혼합물에서의 세포의 수; 각각의 분석 혼합물에서의 생존가능 세포의 백분율; 각각의 분석 혼합물에서 세포당 표적 IgG 항체의 농도; 및/또는 각각의 분석 혼합물에서 생존가능 세포당 표적 IgG 항체의 농도 중 하나 이상을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 알려진 사용자 정의된 표준으로부터 농도 곡선을 플롯팅하고, 분비된 단백질의 농도를 결정하기 위해 이들 플롯을 사용하는 분석 소프트웨어를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 샘플에 존재하는 생산자 세포의 수가 결정된다. 상기 소프트웨어는 분비된 단백질 대 세포 수의 비를 자동으로 결정하고, 세포당 기준으로 분비된 단백질 농도를 계산하고, 세포 값당 최고 분비된 단백질을 갖는 웰들을 확인한다. 만일 높은 처리량 유세포측정 시스템이 세포 정렬기와 공조하여 사용되는 경우, 상기 소프트웨어는 또한 원하는 세포주를 추가로 정제하기 위해 높은 분비자 웰들로부터 개별 세포를 분류하도록 시스템을 제어한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 유세포측정 분석에 의존한다. 일부 구현예에서 유세포측정을 위한 샘플은 희석되지 않는다. 다른 예에서, 샘플은 희석되지 않고 세척 단계를 거치지 않는다. 특정 구현예에서, 샘플은 글로우 세포계산기로 분석되기 전에 세척될 수 있다. 유세포측정은, 유체의 스트림에서 세포를 현탁하고 이것을 전자 검출 장치로 통과시킴에 의해, 세포 계수, 세포 분류, 바이오마커 검출 및 단백질 공학에 이용될 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명 하기를 포함하는 키트를 제공한다:
(a) 정의된 비의 둘 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편을 포함하는 검출 시약; 및
(b) 포획 시약의 둘 또는 그 초과의 모집단, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 상이한 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 상기 포획 시약의 각각의 모집단에서의 결합 분자는 표면에 결합된다.
이 양태의 키트는, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 제1 및 제2 양태의 검출 시약 및 포획 시약의 모든 구현예가 이 양태의 키트에서 사용될 수 있다. 검출 시약은 상응하는 IgG 항체 아이소타입에 결합하는 능력을 보유한 둘 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함한다. 다양한 구현예에서, 검출 시약은 3, 4, 5, 또는 그 초과의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함한다. 각각의 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 특이적 IgG 항체 아이소타입에 결합하는 능력을 갖는다. 검출 시약은 정의된 비의 2, 3, 4 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함한다. 이 구현예는 생물학적 샘플에서 2, 3, 4, 또는 그 초과의 IgG 항체 아이소타입의 농도의 보다 신속한 정량화를 허용한다. 임의의 정의된 비의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 그 비가 알려져 있는 한 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 각각의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 대략 동일한 농도로 존재한다. 또 다른 비제한적인 구현예에서, 각각의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 대략 동일한 양으로 존재한다 (즉, 3개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편이 있을 때 약 1:1:1). 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 임의의 적합한 농도가 검출 시약에 존재할 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 검출 시약에 각각의 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 약 1 ng/mL 내지 약 10 mg/ml 사이로 존재한다. 다양한 다른 구현예에서, 검출 시약에 각각의 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편은 약 10 ng/mL 내지 약 1 mg/ml, 약 100 ng/mL 내지 약 750 μg/ml, 약 500 ng/mL 내지 약 500 μg/ml, 약 1 μg/ml 내지 약 250 μg/ml 사이, 또는 적어도 125 μg/ml로 존재한다. 비제한적으로 형광 표지, 합텐, 비색계 표지, 다양한 방사성 라벨, 효소, 보철 그룹, 형광 마커, 발광성 마커, 생물발광 마커, 금속 입자, 단백질-단백질 결합 쌍, 단백질-항체 결합 쌍 및 기타 동종의 것을 포함한 임의의 적합한 검출가능한 표지가 사용될 수 있다. 형광 라벨의 예는, 비제한적으로, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 시아닌, 단실 염화물, 파이코시아닌, 파이코에리트린을 포함한다. 생물발광 마커의 예는, 비제한적으로, 루시퍼라아제 (예를 들어, 박테리아, 개똥벌레, 방아벌레 및 기타 동종의 것), 루시페린, 에쿼린 및 기타 동종의 것을 포함한다. 시각적으로 검출가능한 신호를 갖는 효소 시스템의 예는, 비제한적으로, 갈락토시다아제, 글루코리니다아제, 포스파타제, 페록시다아제, 콜린에스테라아제 및 기타 동종의 것을 포함한다. 검출가능한 표지는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 특정 구현예에서 검출 표지는 형광단 또는 형광 단백질을 포함한다. 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 각각의 상이한 모집단은 의도된 검출 검정에 따라 동일 또는 구별할 수 있는 표지를 가질 수 있다.
포획 시약의 각각의 모집단은 상이한 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 대해 특이적이고, 따라서 IgG 아이소타입에 기반하여 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 특이적 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 임의의 적합한 결합 분자가 사용될 수 있다. 다양한 비제한적인 구현예에서, 결합 분자는 항체, 어피머 압타머, Fc 수용체, 또는 다른 단백질/당/지질 또는 조합 분자를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 결합 분자는 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다.
포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서 결합 분자는 표면에 결합된다. 비제한적으로 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 다염화비닐, 폴리프로필렌 지지체, 자기 또는 상자성 비드, 아가로스 비드, 및 여과 배지 예컨대 NHS-활성화된 세파로스 또는 CNBr-활성화된 세파로스를 포함한 임의의 적합한 표면이 사용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 비드, 예컨대 자기 또는 상자성 비드에 결합된다. 자기 또는 상자성 포획 비드는 전형적으로 직경이 약 1 mm 또는 그 미만이고, 침강 또는 막힘을 방지하기에 충분하게 충분히 작다. 적합한 비드는 본 기술의 통상인에게 알려져 있고 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 노르웨이 소재 Invitrogen Dynal로부터 Dynabeads My-One™, 또는 프랑스 소재 Merck로부터의 Estapore). 비드는 항체 또는 항원의 수동적인 또는 활성 커플링을 위해 결합 분자로 사전-커플링 또는 코팅될 수 있다. 다른 구현예에서, 포획 비드는 아가로스 비드일 수 있다. 전형적으로 아가로스 비드는 직경이 약 350μm 내지 20μm이다. 또 다른 특정 구현예에서, 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 미세적정 플레이트의 웰들에서 인쇄된 어레이에 존재한다.
포획 시약의 임의의 적합한 밀도가 키트에서 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 포획 시약의 각각의 모집단은 밀리리터당 약 만 내지 약 1억개 포획 시약의 밀도로 존재한다. 다양한 추가 구현예에서, 포획 시약의 각각의 모집단은 밀리리터당 약 십만 내지 약 오천만, 약 이십오만 내지 약 이천오백만, 약 오십만 내지 약 천만 포획, 또는 약 칠십오만 내지 약 오백만 포획 시약의 밀도로 존재한다. 일 구현예에서, 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 수는 포획 시약의 수와 동일하다.
하나의 특정 구현예에서, 검출 시약은 gG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 마우스 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하고; 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 gG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 마우스 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 검출 시약은 gG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 인간 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하고; 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 인간 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다.
추가의 특정 구현예에서, 검출 시약은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 랫트 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편의 정의된 비를 포함하고; 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 여기서 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 랫트 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다.
다양한 추가의 특정 구현예에서, (A) 검출 시약은 정의된 비의 하기를 포함한다:
(i) IgG1, IgG2 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 염소, 돼지, 또는 소과 IgG 단백질 아이소타입;
(ii) IgGa, IgGb, IgGt 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2 또는 3개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 말 IgG 단백질 아이소타입; 또는
(iii) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 원숭이 IgG 단백질 아이소타입; 그리고
(B) 상기 포획 시약은 하기를 포함한다
(i) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgG1, IgG2 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 표적 염소, 돼지, 또는 소과 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2개의 모집단;
(ii) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgGa, IgGb, IgGt 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 말 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2 또는 3개의 모집단; 또는
(iii) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 원숭이 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단. 이들 구현예에서, 상기 포획 시약은 검출 시약에 존재하는 IgG 단백질 아이소타입의 종에 결합하는 결합 분자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 키트는 검출 시약에서의 둘 또는 그 초과의 상이한, 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편에 상응하는 둘 또는 그 초과 (2, 3, 4, 또는 그 초과)의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하는 대조군 샘플을 추가로 포함한다. 제1 및 제2 양태에서 개시된 바와 같은 대조의 모든 구현예가 이 양태의 키트에 사용될 수 있다.
상기 키트는 의도한 용도에 대해 적절한 임의의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 키트는 검출가능한 세포 생존력 마커를 추가로 포함한다.
제5 양태에서 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
(a) 검정 플레이트, 및
(b) 분석 시약, 여기서 상기 분석 시약은 하기를 포함한다:
(i) 포획 비드가 IgG 항체에 결합하는, 상기 포획 비드; 및
(ii) 제1 검출가능 분체를 포함하는 제1 검출 분자.
제3 양태에서 개시된 모든 구현예가 이 제5 양태에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 검출 분자는 대조 IgG 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 키트는 제1 검출 분자로부터 광학적으로 구별할 수 있는 검출가능하게 표지된 항-경쇄 항체를 추가로 포함한다. 상기 키트는 또한 세포 생존력 염료, 세포 표면 바이오마커, 또는 세포자멸사의 마커 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 포획 비드는 단백질 G 또는 단백질 A와 공유결합된다. 또 다른 구현예에서, 포획 비드는 자기 비드 또는 아가로스 비드이다. 특정 양태에서, 상기 키트는 동결건조된 분석 시약을 함유하는 검정 플레이트를 포함한다.
예시적 방법 및 시스템이 본 명세서에 기재되어 있다. 용어 "실시예", "예시적인" 및 "예시된"은 "실시예, 사례, 또는 예시로서 제공됨"을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다는 것이 이해되어야 한다. "실시예", "예시적인" 또는 "예시된" 것으로 본 명세서에 기재된 임의의 구현예 또는 특징은 반드시 다른 구현예 또는 특징보다 바람직하거나 또는 유리한 것으로 해석되는 것은 아니다. 본 명세서에 기재된 예시적인 구현예는 제한하는 것으로 의미되지 않는다. 본 명세서에 일반적으로 기재되고 도면에 예시된 바와 같은 본 개시내용의 양태는 다양한 상이한 배치형태들로 배열, 대체, 조합, 분리 및 설계될 수 있음을 쉽게 이해할 것이며, 이들 모두는 명백하게 본 명세서에서 고려된다.
실시예
1
예시적인 시약 조제:
1) 검출 시약 혼합물 조제: 동일한 튜브/저장소 안으로, 플루오레세인 이소시오티아네이트 (FITC)-마우스 IgG1, FITC-마우스 IgG2a, FITC-마우스 IgG2b, 및 FITC-마우스 IgG3과 적색 형광 세포막 완전성 염료를 인산염 버퍼 염수 (PBS)에서 0.1% 소과 혈청 알부민 (BSA)의 충분한 용적으로 부가하고 혼합한다. 최종 FITC-마우스 IgG 농도는 혼합물에서 각각의 아이소타입 (IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3)에 대해 125 μg/mL일 수 있다. 혼합물에서 최종 적색 형광 FL4 세포막 완전성 염료 (IntelliCyt Corporation)는 튜브/저장소에서 1:200으로 희석될 수 있다.
2) 마우스 IgG 표준 혼합물 조제: 사전-혼합된 마우스 IgG 표준 스톡의 바이알을 조제한다: 동일한 바이알 안으로, 비표지된 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 단백질을 부가하고 혼합한다. 각각의 아이소타입은, 예를 들어, 혼합물에서 200ug/mL 농도를 가질 수 있다. 사전-혼합된 마우스 IgG의 연속 적정은 신선한 세포 배양 배지 (생물학적 샘플이 유래하는 배양판 또는 플라스크에서 사용된 동일한 배지)로 수행될 수 있다. 이들 연속으로 희석된 표준은 후에 검정 셋업에서 사용되어 4개의 표준 곡선 (각각의 마우스 IgG 아이소타입에 대한 1개의 표준 곡선)을 생성할 수 있다.
3) 포획 시약 혼합물 조제: 동일한 튜브/저장소 안으로, PBS에서 0.1% BSA의 충분한 용적으로 마우스 IgG1 포획 비드, 마우스 IgG2a 포획 비드, 마우스 IgG2b 포획 비드, 및 마우스 IgG3 포획 비드를 부가하고 혼합한다. 마우스 IgG 포획 비드의 최종 밀도는 각각의 아이소타입 (IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3) 포획 비드에 대해 1백만/mL이다.
사용자는 이제 마우스 IgG 정량화/아이소타입화 검정을 수행하기 위해, 예를 들어, 전체 경쟁 프로토콜 또는 사전-인큐베이션 프로토콜 중 어느 하나를 따를 수 있다.
마우스
IgG
정량화/
아이소타입화
검정 (전체 경쟁 프로토콜)
전체 경쟁 프로토콜에 대한 검정
셋업
:
이 검정은 무-세척 작업 흐름을 사용할 수 있고 IgG 농도 (예를 들어, ㎍/mL)와 관련하여 결과를 제공할 수 있다. 4개 마우스 IgG 아이소타입에 대한 농도를 결정하기 위해 사용되는 4개의 표준 곡선을 생성하기 위해 참조 단백질 혼합물의 연속 희석액을 제조하는 것을 포함한다. 포획 비드 상의 FITC 검출 신호는 마우스 IgG 농도와 역전관계를 갖는다. 4개의 포획 비드는 단일 마우스 IgG 아이소타입에 특이적인 각각의 비드로 검정에서 사용될 수 있다. 총 마우스 IgG 농도는 4개의 마우스 IgG 아이소타입 농도를 합하여 ForeCyt™ (Intellicyt) 소프트웨어에 의해 각각의 웰에서 계산될 수 있다. 샘플이 마우스 IgG 상청액에 부가하여 세포를 가지고 있다면 세포 수와 세포 생존력 또한 분석될 수 있다.
하나의 예시적인 프로토콜에서:
1. 검출 시약 혼합물 (마우스 FITC-IgG 및 FL4 막완전성염료)을, 5 μL/미세적정플레이트의 웰로 부가한다;
2. IgG 샘플/IgG 표준을, 20 μL/웰로 부가하고; 빠르게 회전한다 (500g, 5초). 혼합한다 (2,000rpm, 20초).
3. 조제된 4-플렉스 포획 비드를 5 μL/웰로 부가하고; 빠르게 회전한다 (500g, 5초). 혼합한다 (2,000rpm, 20초). RT 60분.
플레이트는 이제, 예컨대 iQue™ 스크리너 유세포측정 플랫폼 상에서 샘플링함에 의해 신호 검출에 대해 준비되어 있다.
사전-
인큐베이션
프로토콜 마우스
IgG
정량화/
아이소타입화
검정:
사전-
인큐베이션
프로토콜에 대한 검정
셋업
:
이 검정은 무-세척 작업 흐름을 사용할 수 있고 IgG 농도 (예를 들어, ㎍/mL)와 관련하여 결과를 제공할 수 있다. 4개 마우스 IgG 아이소타입에 대한 농도를 결정하기 위해 사용되는 4개의 표준 곡선을 생성하기 위해 참조 단백질 혼합물의 연속 희석액을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 포획 비드 상의 FITC 검출 신호는 마우스 IgG 농도와 역전관계를 갖는다. 4개의 포획 비드는 단일 마우스 IgG 아이소타입에 특이적인 각각의 비드로 검정에서 사용될 수 있다. 총 마우스 IgG 농도는 4개의 마우스 IgG 아이소타입 농도를 합하여, 예를 들어, ForeCyt™ 소프트웨어에 의해 각각의 웰에서 계산될 수 있다. 샘플이 마우스 IgG 상청액에 부가하여 세포를 가지고 있다면 세포 수와 세포 생존력 또한 분석될 수 있다.
하나의 예시적인 프로토콜에서:
1. 제조된 4-플렉스 포획 비드를, 5 μL/웰로 부가한다;
2. IgG 샘플/IgG 표준을, 20 μL/웰로 부가하고; 빠르게 회전한다 (500g, 5초). 혼합한다 (2,000rpm, 20초). RT 30분.
3. 검출 시약 혼합물 (마우스 FITC-IgG 및 FL4 막 완전성 염료)을, 5 μL/웰로 부가하고; 빠르게 회전한다 (500g, 5초). 혼합한다 (2,000rpm, 20초). 빛없이 RT 60분.
플레이트는 이제, 예컨대 iQue™ 스크리너 유세포측정 플랫폼 상에서 샘플링함에 의해 신호 검출에 대해 준비되어 있다.
특정한 마우스 IgG 아이소타입을 구체적으로 포획하기 위한 하나의 포획 비드 유형을 갖는 다중화된 4개의 포획 비드가 일반적인 항-마우스 IgG 항체로 코팅된 전통적인 단일화된 포획 비드에서의 불일치된 정량화를 해결할 것이다. 4개의 상이한 마우스 IgG 아이소타입은 비드 상에 코팅된 일반적인 항-마우스 IgG에 대한 어느 정도 상이한 결합 친화도를 야기하는 어느 정도 상이한 단백질 구조를 갖는다. 마우스 하이브리도마 또는 B 세포 배양 스크리닝 플레이트에서, 상이한 웰들은 4개의 아이소타입 중 하나를 가질 수 있다. 플레이트의 각각의 웰에서 마우스 IgG를 포착하기 위해 단일화된 항-마우스 IgG 포획 비드가 사용되었다면, 상이한 웰들에서 상이한 아이소타입을 갖지만 동일한 양의 마우스 IgG는 IgG 아이소타입-의존적 결합 친화도 차이에 기인하여 비드 상에서 일반적인 상이한 결합 신호일 수 있고 표준 (4개 아이소타입의 천연 혼합물)으로 정제된 마우스 IgG로 표준 곡선상에 기반한 정량화는 상이한 마우스 IgG 양을 외삽할 것이다. 이것은 부정확한 양을 도출할 것이다. 4개의 상이한 포획 비드 (각각의 아이소타입에 대해 하나)로 다중화된 검정은 이 사안을 해결할 것이다. 예를 들어, 미세적정 플레이트에서 A1 웰이 마우스 IgG1을 갖는 경우, 이것은 혼합된 4개의 포획 비드에서 마우스 IgG1 포획 비드 상에서만 포획될 것이다. 형광 신호는 마우스 IgG1 표준 곡선을 사용함에 의해 마우스 IgG1 양에 외삽될 것이다. 만일 A2 웰이 마우스 IgG2a를 갖는다면, 이것은 혼합된 4개의 포획 비드에서 마우스 IgG2a 포획 비드 상에서만 포획될 것이고, 그리고 마우스 IgG2a 포획 비드에 대한 형광 신호는 마우스 IgG2a 표준 곡선을 사용함에 의해 마우스 IgG2a 양에 외삽될 것이다.
여기서 본 발명자들은 4개의 상이한 아이소타입을 포획하기 위해 4개의 포획 비드와 반응에서 4개의 FITC-마우스 IgG 아이소타입을 갖는 다중화된 경쟁 검정 형식을 확립했다 (참고도 1). 세포가 있거나 없는 알려지지 않은 아이소타입 샘플을 정확한 순서로 반응 안으로 첨가할 때, 알려지지 않은 및 비표지된 마우스 IgG 아이소타입은 4개의 포획 비드 중 단 하나에 대해 4개의 FITC-마우스 IgG 아이소타입의 하나가 경쟁할 것이다. 마우스 IgG 아이소타입과 양을 측정함에 있어서 이와 같은 임의의 검정은 없는 것 같다. 본 검정은 세척 및 희석이 필요 없으며 정상적으로 마우스 IgG 농도 1-50 ug/mL를 갖는 하이브리도마 상청액으로부터 마우스 IgG 양/아이소타입을 측정할 수 있다.
본 검정은 또한 사용자가 동일한 다중 검정에서 세포 수 및 세포 생존력을 측정하는 것을 허용할 수 있다. 사용자는 샘플 상청액 또는 세포 내측이 있는 샘플 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 후자의 경우, 세포 수 및 세포 생존력, 그리고 그뿐만 아니라 다중화된 비드가 고처리량 유세포측정에서 동시에 측정될 것이다.
본 검정은 포획 비드에 대한 아이소타입-특이적 포획 항체 및 검출 시약과 마우스종에서부터 다른 종 예컨대 인간 또는 랫트, 등으로 표준 단백질을 변형시킴에 의해 마우스 종에 부가하여 상이한 종에 대해서 동일한 종점 (IgG 아이소타입, 각각의 아이소타입에 대한 IgG 양, 세포 수 및 세포 건강)을 측정하도록 확장/변형될 수 있다.
도 2는 미세적정 플레이트에서 표준 웰들의 예시적인 셋업을 도시한다. 여기서 96-웰 미세적정 플레이트에서 IgG 표준 웰들의 예시적인 디자인이 도시되어 이다. 각각의 특이적 웰은 각각의 마우스 IgG 아이소타입 (마우스 IgG1, 2a, 2b, 및 3)의 동일한 양을 갖는 4개 아이소타입 단백질을 갖는다. 우측 상의 최상 농도 웰들 (이중 웰들) (A12 및 B12)은 각각의 아이소타입에 대해 최고 농도 50ug/mL를 갖는다. 1:2 연속 적정은 우측으로부터 좌측으로 적용되었다. 예를 들어, 웰 A11 및 B11은 각각의 아이소타입에 대해 25ug/mL를 가질 것이다. 웰 A1 및 B1은 신선한/블랭크 배지이지만 임의의 마우스 IgG 단백질 표준이 없는 음성 대조군으로 사용된다. 사용자는 새로운 최상 농도 또는 희석 인자 또는 희석 단계가 얼마나 많은지를 결정하는데 유연성을 가지고 있다. 예를 들어, 사용자는 도 2에서 표준 디자인에서 나타낸 바와 같이 최상 농도에 대해 아이소타입당 100ug/mL를 사용할 수 있고, 1:3 연속 적정을 사용할 수 있고, 그리고 11개 희석 단계보다는 6개 희석 단계를 사용할 수 있다. 사용자는 384-웰 플레이트와 같이 다른 플레이트 유형에 대해서 동일한 표준 디자인을 사용할 수 있다. 표준이 없는 동일한 플레이트, 예를 들어, 도 2에서 C-H행의 경우, 사용자는 세포가 있거나 없는 알려지지 않은 마우스 IgG 샘플을 수행할 수 있다.
하나의 예시적인 기술에서, 세포 및 비드는 크기 (전방 산란검출기, FSC) 및/또는 입도 (측면 산란검출기, SSC)에 기반하여 2D 산포도에서 분리를 통해 검출될 수 있다. 단일항 비드는 이중항 비드가 아니지만 2D 플롯을 사용하여 게이팅될 수 있다 (FSC-높이 대 FSC-면적). 단일항 비드는 2D 플롯에서 45도에서 우측 모집단일 것이다 (FSC-높이 대 FSC-면적). 이중항 또는 응집체는 좌측 상에 있을 것이다. 단일항 비드는 2D 플롯에서 4개의 포획 비드 모집단으로 추가로 분리될 수 있다 (적색 형광 채널 RL1-높이 대 FSC-높이). 생존 세포는 적색 형광 채널 RL1-높이의 1D 히스토그램에서 모든 세포로부터 게이팅될 수 있다. 생존 세포는 보다 적은 형광 염색을 갖는 좌측 모집단일 것이다. 죽어 있거나 죽어가는 세포는 더 많은 염료를 취할 것이며 우측 세포 모집단 (게이팅되지 않음)일 것이다.
4개의 마우스 IgG 아이소타입에 대해, 프로토콜당 아이소타입당 1개의 표준 곡선이 생성될 수 있다. 검출 동적 범위 및 선형 검출 범위는 표 1에 요약되어 있다. 이중 웰들은 각각의 시험된 농도에 대해 수행되었다. ForeCyt™ 소프트웨어 (Intellicyt)의 사용은 평균 +/- 표준편차를 나타내는 각각의 지점으로 자동으로 표준 곡선을 생성한다. 검출 동적 범위 및 선형 검출 범위는 표 1에 나타나 있다 (mIgG1은 마우스 IgG1이고, mIgG2a는 마우스 IgG2a 이고, 등등 같음).
표준 곡선에서 시험된 최상 농도는 아이소타입당 100 μg/mL였다. 100 μg/mL 초과는 검정에서 시험되지 않았다. 표준은 10% 우태 혈청으로 DMEM 배양 배지에서 희석되었다. 19-지점 1:2 연속 적정이 테스트에서 수행되었다.
곡선 적합 경우: 적합한 중량에 대해 1/Y 정사각형을 갖는 4PL 적합화 방법으로 ForeCyt™ 소프트웨어 (Intellicyt)가 사용되어, 선형 범위를 자동으로 검출하고 선형 범위를 제공했다. 선형 범위는 전자 증폭기가 입력 신호의 직접적인 선형 함수인 출력 신호를 생성하는 입력 또는 출력 값의 그 범위이다. 즉, 출력은 다음 방정식에 의해 표시될 수 있다: 출력 = 입력 × 이득. 선형 범위는 알려지지 않은 샘플의 신호가 이 범위 안으로 될 때 정확한/민감성 정량화를 제공한다.
사용된 검출 범위는 최저 검출 한계 (0 μg/mL IgG를 갖는 블랭크의 3 * 표준편차인 신호를 갖는 최소 농도와 최고 검출 한계 (ForeCyt™ 소프트웨어에 의해 결정된 포화신호의 3* 표준편차인 신호를 갖는 최대 농도) 사이의 범위를 의미한다. 표준 곡선이 포화 상태에 이르지 않으면, 최고 시험된 농도 (여기서는 100 μg/mL)가 사용된다.
하이브리도마 배양으로부터의 샘플인 경우, 전체 경쟁 프로토콜이 권고될 수 있고; 마우스 B 세포 배양으로부터의 샘플인 경우, 사전-인큐베이션 프로토콜이 권고될 수 있다.
실시예
2
높은 수준의 분비된 단백질 또는 IgG 항체를 생산하는 세포를 동정하기 위한, 특정 양태의 검정의 예시적인 프로토콜이 아래에 기재되어 있다.
1. 후보 생산자 세포가 다중웰 "미세적정" 플레이트의 웰들에서 희석되고 분포되어 단 하나의 세포만 각각의 웰에 침착된다. 이것을 수행하는 방법은 당업계에서 잘 설명되어 있다. 웰당 하나의 세포는 실제 달성하기 어려운 목표이다; 비록 대부분의 웰들이 하나의 세포를 함유하지만, 제로 세포를 갖는 많은 웰들, 및 다중 세포를 함유하는 많은 웰들이 있다. 일반적으로 높은 수준의 단백질을 분비하는 작은 수의 세포 주를 발견하기 위해 수백수천의 웰들을 검사하는 것이 필요하다.
2. 각각의 웰에서의 세포의 수를 증가시키기 위해 세포가 증식되도록 한다. 유사 분열을 통해 증식이 일어나기 때문에, 각각의 웰에서의 딸 세포는 웰에 침착된 최초 세포(들)의 정확한 복제일 것이다.
3. 세포가 증식하기 때문에, 세포는 단백질 생물학적 물질 (즉, IgG 항체)을 생산하고 그리고 그것을 배양물 상청액으로 분비한다.
4. 대표적인 양의 분비된 단백질 및 생산자 세포를 함유하는 각각의 웰의 희석되지 않은 분취액을 동결건조된 검정 플레이트에서의 새로운 웰로 옮긴다. 동결건조된 검정 플레이트의 각각의 웰은 존재하는 분비된 단백질의 양을 정량화하는데 사용되고, 그리고 동시에 샘플에 존재하는 생산자 세포의 수를 검정하는데 사용될 수 있는 동결건조된 시약을 함유한다. 시약 키트로부터 동결건조되지 않은 형태로 조제된 정량화 시약도 또한 분석에 사용될 수 있다. 동결건조된 검정 플레이트 또는 시약 키트는 하기 항목을 함유할 수 있다:
a. 포획 비드 - 예를 들어, 분비된 단백질 상의 특정 부위에 결합하고 마이크로구형체의 표면상에 분비된 단백질를 포획하는 분자로 코팅된 형광 마이크로구형체.
b. 형광 탐침으로 표지되고 마이크로구형체 표면상으로 포획된 분비된 단백질 상의 상이한 영역에 결합하는 검출 분자. 각각의 마이크로구형체와 연계된 형광의 강도는 그 다음 샘플에 존재하는 분비되고 포착된 단백질 분자의 수에 직접적으로 상관된다.
5. 인큐베이션 시간 후, 샘플은 고처리량 유세포측정에 의해 분석된다. 고처리량 유세포측정 시스템의 한 예는 분당 수천 개의 샘플을 분석할 수 있는 유세포측정기와 조합한 HyperCyt™ HTFC 시스템이다.
6. 고처리량 유세포측정 검출 시스템은 비드-연관된 검출 분자의 형광 강도를 보고하도록 설정되어, 표준 곡선으로부터 분비된 단백질 농도를 계산하는데 사용된다. 또한, 샘플에 존재하는 생산자 세포의 수가 동시에 결정될 수 있다. 전매 소프트웨어 분석 패키지는 분비된 단백질 대 세포 수의 비를 자동으로 결정하고 세포당 기준으로 분비된 단백질 농도를 계산한다. 고처리량 유세포측정 시스템이 세포 정렬기와 함께 사용되는 경우, 소프트웨어는 또한 높은 분비자 웰들에서 개별 세포를 분류하여 원하는 세포주를 추가로 정제하도록 시스템을 제어한다.
1차 프로토콜---
IgG
정량 검정-단계적인 프로토콜 (예시):
1. 단백질 G-코팅된 비드 (6-8um 크기, 0.5% v/v)를 와동한다. 인산염 버퍼 염수 (PBS) 내 0.1% 소과 혈청 알부민 (BSA)에 비드의 1:15 희석을 한다. 희석된 비드를 혼합하고, 미세적정 검정 플레이트 (96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트 중 어느 하나)의 각각의 웰에 5uL/웰 비드를 부가한다;
2. 검정 플레이트의 각각의 웰에, 20uL IgG 샘플 (IgG 표준 곡선을 생성하기 위해 IgG 표준 또는 현탁액 CHO 세포 배양물/분비된 IgG 혼합물 또는 단지 현탁액 CHO 세포 배양물로부터 IgG 상청액 중 어느 하나)을 부가한다.
3. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 샘플을 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
4. 검정 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 광으로부터 보호한다.
5. 조합된 검출 시약을 조제한다: 동일한 튜브 내 PBS 내 0.1% BSA에서 20ug/mL FITC-Fc 단편 (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.) 및 20nM FL4 막 완전성 염료 (IntelliCyt Corporation)를 제조한다.
6. 검정 플레이트의 각각의 웰에 5uL의 조합된 검출 시약을 부가한다.
7. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 샘플을 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
8. 검정 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 광으로부터 보호한다.
9. 고처리량 유세포측정기 예컨대 IntelliCyt iQue™ 스크리너 플랫폼에 의해 검정 플레이트로부터 샘플을 획득한다.
실시예
2: 2차 프로토콜---
IgG
정량 검정-동시 프로토콜:
1. 조합된 검출 시약을 조제한다: 동일한 튜브 내 PBS 내 0.1% BSA에서 20ug/mL FITC-Fc 단편 (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.) 및 20nM FL4 막 완전성 염료 (IntelliCyt Corporation)를 제조한다.
2. 미세적정 검정 플레이트 (96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트 중 어느 하나)의 각각의 웰에 5uL의 조합된 검출 시약을 부가한다.
3. 검정 플레이트의 각각의 웰에, 20uL IgG 샘플 (IgG 표준 곡선을 생성하기 위해 IgG 표준 또는 현탁액 CHO 세포 배양물/분비된 IgG 혼합물 또는 단지 현탁액 CHO 세포 배양물로부터 IgG 상청액 중 어느 하나)을 부가한다.
4. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 샘플 및 조합된 검출 시약 혼합물을 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
5. 단백질 G-코팅된 비드 (6-8um 크기, 0.5% v/v)를 와동한다. 인산염 버퍼 염수 (PBS) 내 0.1% 소과 혈청 알부민 (BSA)에 비드의 1:15 희석을 한다. 희석된 비드를 혼합하고, 샘플/검출 혼합물을 갖는 검정 플레이트의 각각의 웰에 5uL/웰 비드를 부가한다.
6. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 액체를 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
7. 검정 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 광으로부터 보호한다.
8. 고처리량 유세포측정기 예컨대 IntelliCyt iQue™ 스크리너 플랫폼에 의해 검정 플레이트로부터 샘플을 획득한다.
3차 프로토콜---
IgG
정량 &
경쇄
검출 검정-단계적인 프로토콜 (예시):
1. 단백질 G-코팅된 비드 (6-8um 크기, 0.5% v/v)를 와동한다. 인산염 버퍼 염수 (PBS) 내 0.1% 소과 혈청 알부민 (BSA)에 비드의 1:15 희석을 한다. 희석된 비드를 혼합하고, 미세적정 검정 플레이트 (96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트 중 어느 하나)의 각각의 웰에 5uL/웰 비드를 부가한다;
2. 검정 플레이트의 각각의 웰에, 20uL IgG 샘플 (IgG 표준 곡선을 생성하기 위해 IgG 표준 또는 현탁액 CHO 세포 배양물/분비된 IgG 혼합물 또는 단지 현탁액 CHO 세포 배양물로부터 IgG 상청액 중 어느 하나)을 부가한다.
3. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 샘플을 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
4. 검정 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 광으로부터 보호한다.
5. 조합된 검출 시약을 조제한다: 동일한 튜브 내 PBS 내 0.1% BSA에서 20ug/mL FITC-Fc 단편 (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.), 및 10ug/mL PE-F(ab')2 항-인간 Ig 카파 경쇄 (ThermoFisher), 및 20nM FL4 막 완전성 염료 (IntelliCyt Corporation)를 제조한다.
6. 검정 플레이트의 각각의 웰에 5uL의 조합된 검출 시약을 부가한다.
7. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 샘플을 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
8. 검정 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 광으로부터 보호한다.
9. 고처리량 유세포측정기 예컨대 IntelliCyt iQue 스크리너 플랫폼에 의해 검정 플레이트로부터 샘플을 획득한다.
실시예
4: 4차 프로토콜---
IgG
정량 및
경쇄
검출 검정-동시 프로토콜
1. 조합된 검출 시약을 조제한다: 동일한 튜브 내 PBS 내 0.1% BSA에서 20ug/mL FITC-Fc 단편 (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.), 및 10ug/mL PE-F(ab')2 항-인간 Ig 카파 경쇄 (ThermoFisher), 및 20nM FL4 막 완전성 염료 (IntelliCyt Corporation)를 제조한다.
2. 미세적정 검정 플레이트 (96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트 중 어느 하나)의 각각의 웰에 5uL의 조합된 검출 시약을 부가한다.
3. 검정 플레이트의 각각의 웰에, 20uL IgG 샘플 (IgG 표준 곡선을 생성하기 위해 IgG 표준 또는 현탁액 CHO 세포 배양물/분비된 IgG 혼합물 또는 단지 현탁액 CHO 세포 배양물로부터 IgG 상청액 중 어느 하나)을 부가한다.
4. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 샘플 및 조합된 검출 시약 혼합물을 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
5. 단백질 G-코팅된 비드 (6-8um 크기, 0.5% v/v)를 와동한다. 인산염 버퍼 염수 (PBS) 내 0.1% 소과 혈청 알부민 (BSA)에 비드의 1:15 희석을 한다. 희석된 비드를 혼합하고, 샘플/검출 혼합물을 갖는 검정 플레이트의 각각의 웰에 5uL/웰 비드를 부가한다.
6. 검정 플레이트를 간단히 회전시켜 액체를 웰 바닥에 가라앉게 한다 (500g x 8초). 플레이트 진탕기 상에서 플레이트에서의 샘플을 혼합한다 (2000rpm x 20초).
7. 검정 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 광으로부터 보호한다.
8. 고처리량 유세포측정기 예컨대 IntelliCyt iQue 스크리너 플랫폼에 의해 검정 플레이트로부터 샘플을 획득한다.
Claims (53)
- 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 미세적정 플레이트 내 복수의 웰들에서, 검출 시약과 함께 IgG 항체를 함유하는 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계로, 상기 검출 시약은 정의된 비의 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 검출가능하게 표지되고, 상기 인큐베이팅하는 단계는 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 생성하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질, 또는 이의 단편과, 그것의 IgG 항체의 균일한 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계;
(b) 포획 시약의 둘 이상의 상이한 IgG 아이소타입-특정(specific) 모집단과 함께 복수의 웰들의 각각의 웰에서 IgG 항체-표적 IgG 단백질 혼합물을 인큐베이팅하는 단계로, 상기 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 특정 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합 분자는 표면에 결합되고, 상기 인큐베이팅하는 단계는 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 둘 이상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질, 또는 이의 단편과, IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(c) 생물학적 샘플 내에 존재하는 둘 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터의 신호를 검출하는 단계로, 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 IgG 항체 아이소타입의 양은 관련된 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 검출된 신호에 역으로 비례하는, 검출 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 추가로
(d) 대조군 샘플의 연속 희석물을 인큐베이팅하는 단계로, 상기 대조군 샘플의 연속 희석물의 각각의 희석물은 대조 혼합물을 생성하기 위해 검출 시약과 함께 미세적정 플레이트의 별개의 웰에 존재하고, 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서의 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편에 상응하는 둘 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입 또는 이의 단편을 포함하고, 인큐베이팅하는 단계는 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편과 대조군 샘플에서의 비표지된 IgG 단백질 아이소타입의 혼합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계;
(e) 포획 시약의 둘 이상의 상이한 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 대조 혼합물을 인큐베이팅하는 단계로, 상기 인큐베이팅하는 단계는 대조 IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체를 생성하기 위해, 포획 비드의 둘 이상의 IgG 아이소타입-특정 모집단에, 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편, 및 둘 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편의 경쟁적 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(f) IgG 아이소타입-특이적 결합 복합체로부터 신호의 분석에 의해 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계로, 각각의 생물학적 샘플에서의 둘 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 하여 측정되는, 표준 곡선 생성 단계를 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 아이소타입 항체 농도를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 미세적정 플레이트 내 복수의 웰들에서, 복수의 웰들의 각각의 웰에서 포획 시약의 둘 이상의 상이한 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 IgG 항체를 발현하는 복수의 생물학적 샘플을 인큐베이팅하는 단계로, 상기 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단은 상이한 특정 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하고, 포획 시약의 각각의 IgG 아이소타입-특정 모집단에서의 결합분자는 표면에 결합되고; 상기 인큐베이팅하는 단계는 IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 생성하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약에 IgG 항체의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계;
(b) 검출 시약과 함께 IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 인큐베이팅하는 단계로, 상기 검출 시약은 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 검출가능하게 표지되고, 인큐베이팅하는 단계는 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질-IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체를 생성하기 위해 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체 상의 비점유된 부위에 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 발생하는, 인큐베이팅 단계; 및
(c) 둘 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도를 결정하기 위해 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질-IgG 항체-IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 복합체 상의 검출가능하게 표지된 표적 IgG 단백질로부터의 신호를 검출하는 단계로, 생물학적 샘플 내에 존재하는 IgG 항체 아이소타입 단백질의 양은 검출된 신호에 역으로 비례하는, 검출 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 3에 있어서, 추가로
(d) 대조군 샘플의 연속 희석물을 인큐베이팅하는 단계로, 상기 대조군 샘플의 연속 희석물의 각각의 희석물은 대조 혼합물을 생성하기 위해 포획 시약의 둘 이상의 상이한 IgG 아이소타입-특정 모집단과 함께 미세적정 플레이트의 별개의 웰에 존재하고, 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서의 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편에 상응하는 둘 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 인큐베이팅하는 단계는 대조 복합체를 생성하도록 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약에 둘 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계;
(e) 검출 시약과 함께 대조 복합체를 인큐베이팅하는 단계로, 인큐베이팅하는 단계는 IgG 아이소타입-특이적 포획 시약 상의 비점유된 부위에 둘 이상의 상이한 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편의 결합을 촉진하기 위한 시간 및 조건하에 수행되는, 인큐베이팅 단계; 및
(f) 포획 시약의 IgG 아이소타입-특정 모집단에 결합된 검출가능하게 표지된 IgG 단백질 아이소타입으로부터 신호의 분석에 의해 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계로, 각각의 생물학적 샘플에서의 둘 이상의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 IgG 단백질 아이소타입에 대한 표준 곡선을 참고로 하여 측정되는, 표준 곡선 생성 단계를 포함하는, 방법. - 삭제
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 시약은 정의된 비의 셋 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 셋 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 검출가능하게 표지되고, 그리고 셋 또는 그 초과의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 생물학적 샘플에서 결정되는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 시약은 정의된 비의 넷 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 넷 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 검출가능하게 표지되고, 그리고 넷 또는 그 초과의 IgG 항체 아이소타입의 농도는 각각의 생물학적 샘플에서 결정되는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 시약은 검출가능한 세포 생존력 마커를 추가로 포함하고, 그리고 상기 방법은 각각의 생물학적 샘플에서의 세포 생존력 및/또는 세포 수를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 결합되는 표면은 비드를 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 시약의 각각의 모집단은 별도로 구별할 수 있는 것인, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 항체, 어피머 압타머, 및/또는 Fc 수용체를 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 각각의 생물학적 샘플에서 총 IgG 항체 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포 샘플을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 희석되지 않은 샘플인, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 임의의 세척 단계를 포함하지 않는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 마우스 B 세포 또는 세포가 있거나 없는 마우스 세포 하이브리도마 상청액을 포함하고, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 인간 세포를 포함하고, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 랫트 세포를 포함하고, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 랫트 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 하기를 포함하는, 방법:
(i) 토끼 세포 또는 양 세포, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 토끼 또는 양 IgG로 구성된 군으로부터 선택됨;
(ii) 염소 세포, 돼지 세포, 또는 소과 세포, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 염소, 돼지, 또는 소과 IgG1 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택됨;
(iii) 말 세포, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 말 IgGa, IgGb, IgGt로 구성된 군으로부터 선택됨; 또는
(iv) 원숭이 세포, 상기 상이한 IgG 아이소타입은 원숭이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 구성된 군으로부터 선택됨. - 하기를 포함하는 키트:
(a) 정의된 비의 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편을 포함하고, 상기 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편은 검출가능하게 표지되는, 검출 시약; 및
(b) 포획 시약의 둘 이상의 모집단으로, 상기 포획 시약의 각각의 모집단은 상이한 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 표면 결합된 결합 분자를 포함하고, 상기 포획 시약의 각각의 모집단은 구별할 수 있는 표지를 갖는, 모집단. - 청구항 20에 있어서, 상기 표면은 비드를 포함하는, 키트.
- 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 포획 시약의 각각의 모집단은 별도로 구별할 수 있는 것인, 키트.
- 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 결합 분자는 항체를 포함하는, 키트.
- 청구항 20 또는 21에 있어서, 추가로:
(c) 검출 시약에서 둘 이상의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편에 상응하는 둘 이상의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하는 대조군 샘플을 포함하는, 키트. - 청구항 20 또는 21에 있어서,
상기 검출 시약은 정의된 비의 셋 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편을 포함하고; 그리고
상기 포획 시약은 포획 시약의 셋 또는 그 초과의 모집단을 포함하는, 키트. - 청구항 20 또는 21에 있어서,
상기 검출 시약은 정의된 비의 넷 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편을 포함하고; 그리고
상기 포획 시약은 포획 시약의 넷 또는 그 초과의 모집단을 포함하는, 키트. - 청구항 24에 있어서, 상기 대조군 샘플은 검출 시약에서 셋 또는 그 초과 또는 넷 또는 그 초과의 상이한 표적 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편에 상응하는 셋 또는 그 초과 또는 넷 또는 그 초과의 상이한 비표지된 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하는, 키트.
- 청구항 20 또는 21에 있어서,
상기 검출 시약은, IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한 표적 마우스 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하고; 그리고
상기 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 마우스 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 키트. - 청구항 20 또는 21에 있어서,
상기 검출 시약은, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한 표적 인간 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이들의 항원 단편의 정의된 비를 포함하고; 그리고
상기 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 인간 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 키트. - 청구항 20 또는 21에 있어서,
상기 검출 시약은, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한 표적 랫트 IgG 단백질 아이소타입, 또는 이의 단편의 정의된 비를 포함하고; 그리고
상기 포획 시약은 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단을 포함하고, 포획 시약의 각각의 모집단은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 랫트 IgG 항체 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 키트. - 청구항 20 또는 21에 있어서,
(A) 상기 검출 시약은 하기의 정의된 비를 포함하고:
(i) IgG1, IgG2 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 상이한 표적 염소, 돼지, 또는 소과 IgG 단백질 아이소타입;
(ii) IgGa, IgGb, IgGt 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2 또는 3개의 상이한 표적 말 IgG 단백질 아이소타입; 또는
(iii) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 상이한 표적 원숭이 IgG 단백질 아이소타입; 그리고
(B) 상기 포획 시약은 하기를 포함하는, 키트
(i) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgG1, IgG2 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 표적 염소, 돼지, 또는 소과 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2개의 모집단;
(ii) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgGa, IgGb, IgGt 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 말 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2 또는 3개의 모집단; 또는
(iii) 포획 시약의 각각의 모집단이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 원숭이 IgG 단백질 아이소타입에 선택적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는, 포획 시약의 2, 3, 또는 4개의 모집단. - 삭제
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