WO2020177840A1 - Durchflusszytometrie-messverfahren und kit für dessen durchführung - Google Patents

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Holger Klapproth
Ulrich Birsner
Marc Kessemeier
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Ava Lifescience Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a flow cytometry measuring method in which an analysis medium is provided which has a fluid and contained therein, biological cells to be classified, at least one marker molecule being provided and brought into contact with the analysis medium in such a way that the marker molecule specifically can bind at least one target structure located on the surface of the cells if the cell has this target structure, a fluid flow of the analysis medium being generated in which the cells individually reach a measurement area of an energy beam and / or an electric field, whereby for the individual cells located in the measuring area each have a first and a second flow cytometry measured value for a first physical parameter and a second measured value for a second physical parameter, with at least the first parameter being a fluorescent radiation which represents the at least one marking mo lekül emits when excited with the energy beam or the electric field, and the cells are classified on the basis of the flow cytometry measured values.
  • the invention also relates to a kit for carrying out the method.
  • flow cytometry describes a measurement method that is used in biology and medicine. It allows the analysis of biological cells that pass an electric field or a beam of light individually at high speed. Depending on the shape, structure and / or color of the cells, different flow cytometry measurement values are recorded, from which the properties of the individual cells can be derived and the cells can thus be classified.
  • fluorescence-marked cells are sorted into different reagent vessels depending on their color.
  • Corresponding devices are used as flow sorters or as FACS (fluorescence-activated cell sorting).
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • FACS fluorescence-activated cell scanning
  • the principle of the investigation is based on the emission of optical signals by the cell when it passes a laser beam. Focused by an enveloping current fo, the sample enters the microchannel of a high-precision cuvette made of glass or quartz, in such a way that each cell is guided one after the other through the measuring area of a laser beam. The resulting scattered light or fluorescence signal is recorded by a detector. The result is quantitative information about each individual cell. By analyzing a large number of cells within a very short time interval (> 1000 cells / second), representative information about cell populations contained in the analysis medium is quickly obtained.
  • DAPI deoxyri bonucleic acid
  • Antibodies that are marked with fluorescent dyes can also be used as marking molecules.
  • the antibodies are mostly directed against certain surface proteins, eg proteins of the CD classification (CD: Cluster of Differentiation). After marking, the cells can then also be sorted according to these characteristics if necessary. By using different colored Lasers and, above all, filters can increase the number of dyes that can be used and therefore the information density.
  • Antibodies are the most commonly used molecules to mark surface proteins on cells. Labeling molecules are understood to mean antibodies that are labeled with at least one optical marker and / or other molecules that are suitable for specifically binding to a target structure located on the surface of a cell contained in the analysis medium, such as a cancer cell, for example Visually mark cell.
  • the flow cytometer enables both the measurement of the number of marked cells and the acquisition of a measured value for the fluorescence signal emitted by the individual cells in fluorescence-marked cells, a quantitative evaluation of the fluorescence signal is difficult because the flow cytometers used for the measurements are different and therefore In the case of measurements made with different flow cytometers, comparability of the flow cytometry measured values is not guaranteed.
  • the flow cytometry measured values are influenced by the intensity of the laser radiation used to illuminate the measuring area, by tolerances of optical filters, the structure of the flow measuring cell (fluidics), the reagents and detectors used and the variability of the samples containing the marker molecules.
  • a quantification of the fluorescence measurement values of the cells is possible by comparing the first flow cytometry measurement value with a threshold value, but this is usually set arbitrarily. An exact quantification of the binding events per cell and thus a universal platform-independent comparability of the fluorescence measurement values has not been possible up to now.
  • the object of the invention is therefore to provide a flow cytometry measuring method of the type mentioned at the outset which makes it possible to quantitatively detect the target structure on the surface of the cells with great precision.
  • the quantitative measured values obtained by fluorescence measurement, if measured with different flow cytometers, should be precisely comparable with one another (referencing / normalizing).
  • Another object of the invention is to provide a kit for carrying out the method.
  • a flow cytometry measuring method in which an analysis medium is provided which has a fluid and biological cells to be classified contained therein, at least one marker molecule being provided and brought into contact with the analysis medium in such a way that the marker molecule spe can bind cifically to at least one target structure located on the surface of the cells, if the cell has this target structure, a fluid flow of the analysis medium being generated in which the cells individually reach a measurement area of an energy beam and / or an electric field, for the individual cells located in the measurement area each have at least a first flow cytometry measured value for a first physical parameter and a second flow cytometry measured value for a second physical parameter, with at least the first parameter being a fluorescence radiation which the at least one M arkleitersmolekül emits when excited with the energy beam or the electric field, the cells are classified on the basis of these flow cytometry measurement values, with at least a first and at
  • the invention is based on the knowledge that the tolerances of the reagents used to detect the binding of the marker molecules to the target structure of the cells, the variability of the marker molecules and the composition of the analysis medium have a significant influence on the flow cytometry measured values of the to classifying cells. These tolerances are determined in particular by the age of the marker molecules, the way in which and under what conditions the marker molecules were stored before the flow cytometry measurement method was carried out, and by substances contained in the analysis medium in addition to the cells, such as inhibitors, which make the binding of the marker molecules to the target structure more difficult or instead of the marker molecules bind to the target structure. In addition, environmental conditions, such as temperature, can also influence the flow cytometry readings of the cells.
  • these influences are compensated for in that standardized first and second calibrators are provided, that corresponding flow cytometry measurement values are recorded for these calibrators as for the cells, and that the flow cytometry measurement values measured on the cells are Flow cytometry readings from the calibrators can be normalized. This enables an exact quantification of the binding events occurring between the individual cells and the marker molecules or their antibodies per cell.
  • the normalized flow cytometry measured values can also be compared exactly with each other in the case of flow cytometry measurements that were carried out with different flow cytometers and / or in which reagents or marker molecules were used that differ from one another with regard to their properties. This makes it possible in particular to identify cell sub-populations that belong together by means of cluster analysis.
  • the calibrators are not living cells but have solid particles as a carrier for the at least one target structure, the calibrators are long-term stable, i.e. they can be stored for a longer period of time without their properties that are relevant for the detection of the target structure changing significantly.
  • the parameter space of each analysis depends on the number of maximum binding events per cell and the measurement parameters. In other words, when determining, for example, three parameters, these result in a three-dimensional space whose axes are not necessarily at right angles to one another.
  • the type and density of marking (number of fluorophores per antibody) and the binding strength and specificity of the antibodies (or marking molecules) used also play a role.
  • normalized flow cytometry measurement values are provided for the cells, which are independent of the physical properties of the flow cytometer used for carrying out the method, independent of tolerances of the reagents and marker molecules used and independent of substances and active ingredients, which can be contained in the analysis medium in addition to the cells.
  • the difference between the first flow cytometry measured value of the first calibrator and the first flow cytometry measured value of the second calibrator becomes the difference between the first flow cytometry measured value of the cell and related to the first flow cytometer reading of the second calibrator.
  • the normalized flow cytometry measurement value of the cells is preferably 100% if the first flow cytometry measurement value of the cells agrees with the first flow cytometry measurement value of the first calibrator. If the first flow cytometry reading of the cells matches the first flow cytometry reading of the second calibrator, the normalized flow cytometry reading of the cells is zero.
  • the first calibrators are preferably designed in such a way that the first flow cytometry measured value of at least one first calibrator corresponds to the expected maximum value of the first flow cytometry measured value of the cells or is slightly higher, in particular a maximum of 3%, a maximum of 5%, a maximum of 10% or a maximum of 25% above the expected first flow cytometry reading from the first calibrator.
  • the corresponding expected value can be determined experimentally.
  • first calibrators and several identical second calibrators are provided and mixed with the analysis medium before the flow cytometry measurement values are recorded for the individual, with an averaged first flow cytometry from the first flow cytometry measurement values of the first calibrators -Measuring- value for the first calibrators and an averaged first flow cytometry measured value for the second calibrators is formed from the first flow cytometry measured values of the second calibrators, and
  • the difference between the averaged first flow cytometry measured value of the first calibrators and the averaged first flow cytometric measured value of the second calibrators to the difference between the first flow cytometry measured value of the cell and the averaged first flow cytometry - the measured value of the second calibrators is set in relation,
  • first flow cytometry measured values are recorded for the individual cells to form a normalized first measured value for a cell population comprising a plurality of cells, an averaged first flow cytometry measured value for the cell population being formed from these flow cytometry measured values, and for the formation of the normalized first measurement value for a plurality of cells
  • the difference between the averaged first flow cytometry measurement value of the first calibrators and the averaged first flow cytometry measurement value of the second calibrators are related to the difference between the first averaged flow cytometry measurement value of the cell population and the averaged first flow cytometry measurement value of the second calibrators or b) the quotient between the averaged first flow cytometry measured value and the averaged first flow cytometry measured value of a calibrator for a signal with a predetermined signal strength, in particular for a 100% signal, is formed.
  • the mean value can be determined using statistical methods known per se and in particular be the arithmetic mean value. If necessary, the normalized first measured value can also be scaled, the scaling factor being, for example, the quotient from the averaged first flow cytometry Measured value of the first calibrators and the number 100 can correspond.
  • a first calibration factor is provided for the at least one first calibrator which, with regard to the measurement signal for the first parameter, corresponds to the ratio between the measurement signal strength of the first calibrator and the measurement signal strength of a first reference calibrator having the target structure, wherein For the first physical parameter of the first calibrator, a first measurement signal is recorded and the first flow cytometry measurement value of the first calibrator is formed from the first measurement signal and the first calibration factor, a second calibration factor being provided for the second calibrator, which is related to of the measurement signal for the first parameter corresponds to the ratio between the measurement signal strength of the second calibrator and the measurement signal strength of a second reference calibrator that does not have the target structure, and with a two for the first physical parameter of the second calibrator tes measurement signal is detected and the first flow cytometry measurement value of the second calibrator is formed from the second measurement signal and the second calibration factor.
  • the calibration factors make it possible to compare flow cytometry measurement values that were carried out with different, differing batches of the first calibrator and / or the second calibrator with one another even more precisely.
  • the calibration factors are preferably measured experimentally under precisely defined conditions.
  • an expected value for the first flow cytometry measured value is determined for each of the first and second reference calibrators, which are produced in a first batch.
  • a buffer with defined, constant properties is used in which the first and second reference calibration ports are arranged.
  • the buffer does not contain biological cells.
  • ibrato- The respective first flow cytometry measured values were measured. From the reference flow cytometry measured values obtained in this way, an expected value is determined for each of the first and second reference calibrators using known methods of statistics.
  • expected values are determined in a corresponding manner for the first and second calibrators of a second batch.
  • the first calibration factor is then determined by forming the quotient from the expected value of the first flow cytometry measurement values of the first calibrators of the second batch and the expected value of the first flow cytometry measurement values of the first reference calibrators.
  • the second calibration factor is determined in a corresponding manner by forming the quotient from the expected value of the first flow cytometry measured values of the second calibrators of the second batch and the expected value of the first flow cytometric measured values of the second reference calibrators.
  • At least two types of calibrators are provided by the first calibrators and mixed with the analysis medium, the calibrators of the different types of calibrator differing from one another in particular with regard to the area coverage density and / or the arrangement of their at least one target structure on the surface of the solid particle, that the first flow cytometry measured values of a first calibrator type have a signal strength that is greater than the signal strength of the first flow cytometry measured values of the second calibrators and is less than the signal strength of the first flow cytometry measured values of a second calibrator type.
  • the influence of a non-linear signal curve can be compensated for when the flow cytometry measured values are recorded.
  • the fluid contains at least two different populations of cells which differ from one another in such a way that the first flow cytometry measured values of the cells of a first population in one first signal strength range and the first flow cytometry measurement values of the cells of a second population in a second signal strength range located outside of the first signal strength range, and if the signal strength of the first flow cytometry measurement values of the first calibrator type is selected such that it is between the first and second signal strength range lies.
  • the calibrator of the first type of calibrator generates a signal strength that allows the reference ranges of two subpopulations to be delimited from one another. That is, cells with a first flow cytometry measurement value that is smaller than the first flow cytometry measurement value of the first calibrator of the first calibrator type belong to a first population and cells with a higher flow cytometry measurement value to a second population.
  • the largest dimension of the solid particles is less than 20 ⁇ m, in particular less than 15 ⁇ m and preferably less than 10 ⁇ m and / or the smallest dimension of the solid particles is greater than 4 ⁇ m, in particular greater than 5 ⁇ m and preferably greater than 6 pm.
  • Suitable solid particles are, for example, microspheres with a diameter of 6-10 ⁇ m.
  • the solid particles preferably have a size similar to that of the cells in the analysis medium.
  • the solid particles are preferably synthetic microparticles.
  • the solid particles can have a polystyrene, melamine, latex and / or silicate or consist of one of these materials.
  • the marker molecules can be molecules that bind to target antigens on the surface of cells or calibrators and can then be used to detect these target antigens.
  • Such molecules are e.g. Antibodies and their fragments, lectins, other binding proteins (e.g. protein A).
  • the target antigens on the first calibrators are preferably covalently immobilized.
  • Methods for establishing such a covalent bond include, for example, binding to amines (via crosslinkers), thiols, epoxides, aldehydes, maleimides and other groups. Suitable processes and their chemical conversion are described in the specialist literature (Bioconjugate Techniques, Third Edition 3rd edition by Hermanson, Greg T. (2013)).
  • non-covalent methods can also be used, such as, for example, His-Tag, biotin-streptavidin, protein G, protein A, pre-immobilized antibodies.
  • Target antigens or target structures on the first calibrators can, for example, be proteins, peptides, receptors, allergens, glycosylated proteins, liposaccharides, oligo- and polysaccharides, nucleic acids and the fragments and derivatives of the aforementioned substances.
  • the at least one second flow cytometry measured value comprises a forward scatter measured value for a forward scatter of the energy beam occurring in the measuring area and / or a sideways scatter measured value for a lateral scatter of the energy beam occurring in the measuring area.
  • the forward scatter measurement is a measure of the size
  • the side scatter measurement is a measure of the granularity of the cells or the calibrators.
  • the cells can be distinguished from the calibrators on the basis of these measured variables.
  • the measured flow cytometry measured values can be clearly assigned to the cells and the calibrators on the basis of the forward and sideways scatter measured values.
  • the at least one second flow cytometry measured value prefferably be a fluorescence measured value for a fluorescence radiation sent by the marker molecules which differs from the fluorescence radiation of the first flow cytometry measured value.
  • the wavelengths of the fluorescence radiation of the first and second flow cytometry measurement values are preferably different.
  • At least one first flow cytometry measured value is recorded for several measuring channels for the cells as well as for the first and second calibrators, if at least two and in particular at least one number of different marker molecules corresponding to the number of measuring channels is provided and brought into contact with the analysis medium, and if the at least one first calibrator has at least one number of target structures corresponding to the number of measurement channels, each of which binds specifically to one of the different marker molecules when they come into contact with the marker molecule in question.
  • At least one first flow cytometry measured value is recorded for several measuring channels for the cells as well as for the first and second calibrators, that at least one number of different marking molecules corresponding to the number of measuring channels is provided and with the Analysis medium is brought into contact that at least two types of calibrators are provided by first calibrators, that at least one first calibrator of a first type of calibrator has at least one first target structure on its surface that corresponds to at least one first target structure of the cells and on the solid particle this calibrator is mobilized in that at least a first calibrator of a second type of calibrator has at least one second target structure on its surface, which corresponds to at least one second target structure of the cells and immobi on the solid particles of this calibrator is lized, and that the at least one first calibrator of the first calibrator type has the second target structure on its surface and the at least one first calibrator of the second calibrator type does not have the first target structure on its surface.
  • At least one number of different first calibrators corresponding to the number of measurement channels can be provided and mixed with the analysis medium, and these first calibrators can have different target structures, each of which is binding-specific for one of the different marker molecules.
  • the use of several measuring parameters and their calibrators is only limited by the number of measuring channels of the measuring device and the available fluorophore.
  • Six to eight parameters can be recorded routinely. For the analysis of AML cells, 30 relevant parameters are already recorded, but they have to be recorded in several measurement runs. With modern devices that also allow measurements in the near infrared range, significantly more than eight parameters can be recorded. If subclasses of cells are to be recorded in such a parameter space, the resolution of the measurement is important.
  • the number of measurements that can be recorded per measurement channel can be increased by using calibrators of a further particle class whose solid particles differ in size from the solid particles of calibrators of a first particle class.
  • the resolution can be increased (e.g. by adjusting the laser power or the amplifier power of the detector, so that the maximum resolution is achieved can be obtained from the measurement).
  • cell populations can now be recorded using mathematical methods (e.g. cluster analysis - a standard mathematical method that is described at https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalysis).
  • cluster analysis a standard mathematical method that is described at https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalysis.
  • CD49d chronic lymphocytic leukemia
  • the target structure has at least one antigen on the first calibrators, which is preferably at least one a protein and / or at least one peptide and / or at least one receptor and / or at least one allergen and / or at least one glycosylated protein and / or at least one liposaccharide and / or at least one oligosaccharide and / or at least one polysaccharide and / or at least one Nucleic acid and / or at least one fragment and / or derivative of the aforementioned substances.
  • the target structure of the at least one first calibrator is immobilized on the solid particle of the first calibrator via at least one activated carboxy groups and / or at least one activated NFte group.
  • the target structure e.g. an antigen to the solid particle.
  • Corresponding microparticles are commercially available.
  • At least one target structure immobilized on the solid particle of the first calibrator corresponds to one of the target structures which is typical for cells of at least one type of blood cancer.
  • the method according to the invention can then be used to classify leukemia cells.
  • the fast-growing type M cells can be distinguished from the less aggressive type D cells.
  • the at least one target structure immobilized on the solid particle of the first calibrator corresponds to one of the target structure that occurs within the B cell receptor (BCR) on the surface of chronic lymphatic leukemia cells (CLL cells) .
  • BCR B cell receptor
  • CLL cells chronic lymphatic leukemia cells
  • FACS flow cytometric diagnostics
  • the calibrators are added to the analysis medium, eg blood, during the measurement. Suitable concentrations of the calibrators are preferably 1 ⁇ 10 5 per 1 ⁇ 10 6 cells. During the measurement, the calibrators are set using the Forward Scatter (size) and sideward scatter (granularity) identified and thus separated from the target cells.
  • the kit comprises
  • At least one first calibrator which has a first solid particle made of a water-insoluble, inorganic and / or polymeric material, the first calibrator having at least one target structure immobilized on the first solid particle on its surface
  • at least one second calibrator which is one with the first solid particle has second solid-state particles which match in terms of shape, size and material, the second calibrator not having the target structure on its surface
  • At least one marker molecule that is binding-specific for the target structure.
  • target structures which are arranged on the surface of biological cells to be classified contained in a fluid can be recorded quantitatively with great precision.
  • the corresponding measured values can be precisely compared with one another - even if they were measured with different flow cytometers.
  • the at least one target structure is preferably an antigen. If required, the kit can also contain a buffer.
  • kits which different target structures, which are immobilized on the first solid particle, are arranged on the surface of the at least one first calibrator.
  • the kit has for each of these target structures at least one binding-specific marker molecule for the relevant target structure.
  • Such a kit can be used to carry out parallel measurements.
  • the parallel loading of the calibrators with target structures is only limited by the density of the solid particles and therefore by the maximum signal that can be achieved.
  • the kit for performing parallel measurements has several different first calibrators which have different target structures on their surface. Each first calibrator can only have a single target structure. It is also possible for at least one first calibrator to have several areas with target structures that are binding-specific for the same marker molecules.
  • the marker molecules are preferably provided with fluorescent dyes.
  • fluorescent dyes are usually covalently bound to the marker molecules.
  • a variety of such dyes are commercially available, e.g. Cy3, Cy5, Cy 7, FITC, rhodamine, phycoerythrin, lyssamine; a list of various dyes can be found at: https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore.
  • the kit comprises at least one data carrier on which a first calibration factor for the at least one first calibrator and / or a second calibration factor for the at least one second calibrator is stored.
  • a kit can be used to compensate for calibrator tolerances. This is particularly advantageous if the measurement results of flow cytometry measurement methods are to be compared with one another, which were carried out with different batches of first and second calibrators.
  • the data carrier can be a machine-readable data carrier which, for example, can have a carrier that is provided with a barcode or a QR code. But it is also possible that the calibration factors in the form of numbers on a document belonging to the kit, e.g. an instruction leaflet or packaging belonging to the kit are printed on.
  • the kit has at least two types of calibrators from the first calibrators, and if the calibrators of the different types of calibrators differ from one another, in particular with regard to the surface occupancy density and / or the arrangement of their at least one target structure on the surface of the solid particle, such that they differ from one another in a flow cytometry measurement generate measurement signals with different signal strengths when their target structures are marked with the marker molecule.
  • a regression can be carried out for flow cytometry measurements in which the fluorescence signal has a non-linear course.
  • Measured values the measured intensity PE being plotted on the abscissa and the number n of binding events on the abscissa
  • FIG. 2 shows a representation similar to FIG. 1, but the measured values for a population of first calibrators of a first type of calibrator are shown,
  • FIG. 3 shows a representation similar to FIG. 1, but showing the measured values for a population of first calibrators of a second type of calibrator
  • 5 shows a graphic representation of the measurement signals measured for the parameters size and granularity, with the forward scatter (FSC) assigned to the parameter size on the abscissa and the sideways scatter (SSC) assigned to the parameter granularity of a fluorescence radiation on cells and on the ordinate Calibrator particles have been applied
  • 6 shows a graphic representation of the intensity values for IgM and CD19 measured for cells and calibrator particles, the intensity for IgM being plotted on the abscissa and the intensity for CD19 being plotted on the ordinate,
  • FIG. 7 shows a graphic representation of the cells and calibrator particles measured intensity values for IgD and CD19, the intensity for IgD being plotted on the abscissa and the intensity for CD19 being plotted on the ordinate,
  • FIGS. 6 to 8 shows a three-dimensional representation of the measuring space according to FIGS. 6 to 8, and
  • disease-associated antigens are provided as target structures.
  • IgM immunoglobolin M
  • IgD immunoglobolin D
  • solid particles namely microspheres made of polystyrene with a diameter of 6 ⁇ m.
  • the solid particles agree in terms of their shape, size and material.
  • the solid particles are coated on their surface with binding carboxyl groups (-COOFI). Instead of the carboxyl groups or in addition these NFh groups can be provided on the surface of the solid particles.
  • the first and second target structures can be bound to the surface of the solid particles via the carboxyl groups and / or the NFh groups.
  • First and second marker molecules are also provided.
  • the first marker molecules are antigens that are binding-specific for the first target structure IgM.
  • the second marker molecules are antigens that are binding-specific for the second target structure IgD.
  • the marker molecules each have at least one optical marker which emits fluorescence radiation when excited by suitable excitation radiation.
  • the first target structures are coupled to the surface of the solid particles of six solid particle populations and the second target structures are coupled to the surface of the solid particles of six further solid particle populations. Flierzu become solid particles
  • the supernatant is removed and set aside for a control measurement of the remaining antigen concentration.
  • the solid particles are taken up in a washing buffer and resuspended. After another centrifugation, the supernatant is discarded and the particles are added to saturation of unoccupied reactive groups in a washing and storage buffer (10mM Tris, pH 8.0; 0.05% BSA; 0.05% Proclin).
  • first nor second target structures are coupled to the surface of the solid particles of a thirteenth solid particle population.
  • the reactive COOH groups are brought into contact with a blocking protein in such a way that the blocking protein can bind to the COOH groups non-specifically.
  • Bovine serum albumin or hydrolyzed casein for example, can be used as blocking protein.
  • Each of the thirteen solid particle populations is measured using a flow cytometer (FACS).
  • FACS flow cytometer
  • the solid particles the first to sixth solid particle population and the first marker molecules (approx. 0.5 pg per measurement) are suspended in a fluid and incubated for 10 minutes in the dark. The samples are centrifuged and the supernatant discarded. It is washed once with 2 ml of PBS buffer (phosphate buffered saline) and then centrifuged again. After the supernatant has been discarded, the solid particles are taken up in 100-200 ⁇ l of PBS.
  • PBS buffer phosphate buffered saline
  • the suspension obtained in this way is passed through a nozzle opening of a flow cytometer that delimits a measuring area in such a way that the solid particles contained in the PBS individually reach a measuring area of a laser beam.
  • the first marker molecules specifically bound to the first target structure are excited by the laser beam to emit fluorescent radiation. From this fluorescence measurement values are recorded with the aid of an optical detector. A large number of fluorescence measurement values (intensity measurement values) are measured for each solid particle population. A mean value is formed from the fluorescence measurements recorded for the individual solid particles for each solid particle population (MFI value or median fluorescence intensity).
  • the solid particles of the seventh to twelfth solid particle population are measured with the aid of the flow cytometer. Since the laser beam excites the second marker molecules specifically bound to the second target structure to emit fluorescent radiation.
  • the fluorescence measurement values and the mean value for the first, second and seventh solid-state particle population are shown graphically.
  • the intensity PE of the fluorescent radiation measured with the aid of the flow cytometer for the solid particles of the solid particle population in question and the number n of binding events are plotted on the abscissa.
  • the mean values for the individual fluorescences are plotted to form a coupling curve against the amount of CD23 protein PM per 2.1-10 6 solid particles in each case for the first.
  • a corresponding coupling curve is created for the second target structure.
  • the amount of the first or second target structure required for a desired intensity or signal strength of the fluorescence can be read off from the relevant coupling curve.
  • the maximum mean value of the intensity Lax for the respective target structure is determined and defined on the basis of the coupling curve.
  • a 75% value (P75) and a 25% value (P25) are then defined as follows:
  • the aim is to create several calibrator populations for the first and second target structures (IgM and IgD).
  • a first calibrator population contains a plurality of matching first calibrators of a first calibrator type. These calibrators each have a solid particle on the surface of which IgM is immobilized as the first target structure in such a way that the fluorescence signal of the individual first calibrators of the first calibrator type reaches a relative intensity of 25% in a flow cytometric analysis.
  • a second calibrator population contains a plurality of matching first calibrators of a second calibrator type. These calibrators each have the same solid particles as the first calibrators of the first type of calibrator. The same target structure is immobilized on the surface of the solid particles of the first calibrators of the second calibrator type as on the surface of the first calibrators of the first calibrator type. The surface occupancy density and the arrangement of the target structure of the first calibrators of the second calibrator type is selected such that the fluorescence signal reaches the first calibrators of the second calibrator type in the flow cytometric analysis with a relative intensity of 75%.
  • a third calibrator population contains a plurality of matching first calibrators of a third calibrator type. These calibrators each have the same solid particles as the first calibrators of the first and second calibrator types.
  • a second target structure specific to IgD binding is immobilized on the first calibrator of the third calibrator type in such a way that the fluorescence Signal, the first calibrators of the fourth calibrator type in the flow cytometric analysis reached a relative intensity of 25%.
  • a fourth calibrator population contains a plurality of matching first calibrators of a fourth calibrator type. These calibrators each have the same solid particles as the first calibrators of the first, second and third types of calibrator. The same target structure is immobilized on the surface of the solid particles of the first calibrators of the fourth calibrator type as on the surface of the first calibrators of the third calibrator type. The surface coverage and the arrangement of the target structure of the first calibrators of the fourth calibrator type is selected such that the fluorescence signal of the first calibrators of the fourth calibrator type reaches a relative intensity of 75% in the flow cytometric analysis.
  • a fifth calibrator population which contains a multiplicity of matching first calibrators of a fifth calibrator type.
  • These calibrators each have the same solid particles as the first calibrators of the first, second, third and fourth calibrator types.
  • Two different target structures are immobilized on the surface of the solid particles of the first calibrators of the fifth calibrator type.
  • One of these target structures is identical to the first target structure (binding-specific for IgM) and the other target structure is identical to the second target structure (binding-specific antigen for IgD).
  • the surface density and the arrangement of the antigens IgM and IgD of the first calibrators of the fifth calibrator type is selected so that the fluorescence signal of the first calibrators of the fifth calibrator type in the flow cytometric analysis reaches a relative intensity of 75% for both IgM and IgD .
  • a negative population is created that has a large number of matching second calibrators. These each consist of a solid particle on which neither the first (IgM) nor the second target structure (IgD) is immobilized. In the negative population, the carboxyl groups (-COOFI) or NFh groups on the surface of the solid particles are non-specific bound to a blocking protein.
  • the solid particles of the second calibrators are identical to the solid particles of the first calibrators.
  • the amount of solid particles required for each population to be placed is transferred into a reaction vessel.
  • the solid particles are centrifuged at 800 g for 5 minutes and the supernatant is discarded.
  • the solid particles are then taken up in a coupling buffer.
  • the coupling takes place according to the protocol described above, an adequate amount of IgM being used for the first, second and fifth calibrator population and an adequate amount of IgD for the third, fourth and fifth calibrator population.
  • IgD calibrators PD25 - IgD concentration Int25
  • IgM and IgD calibrators Pmd - IgM and IgD concentration Int s
  • the individual calibrators are measured after their position by means of FACS (fluorescence-activated cell sorting) using commercially available antibodies marked with a marker.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • the calibrators are combined into a kit for use in later diagnostics. In the later FACS measurement, for diagnostic purposes, the measuring space is defined, standardized and normalized by the individual populations. 1.4 Using the calibrators to analyze blood samples using FACS
  • a kit is provided that includes:
  • a first population of first calibrators of the first calibrator type which comprises a multiplicity of the first PD25 calibrators described in Section 1.3, on the surface of which IgM is immobilized as the first target structure.
  • a second population of first calibrators of the first type of calibrator which comprises a large number of the first PD75 calibrators described in Section 1.3, on the surface of which IgM is immobilized as the first target structure.
  • a first population of first calibrators of the second calibrator type which comprises a multiplicity of the first PD25 calibrators described in Section 1.3, on the surface of which IgD is immobilized as the first target structure.
  • a second population of first calibrators of the second type of calibrator which comprises a plurality of the first PD75 calibrators described in Section 1.3, on the surface of which IgD is immobilized as the first target structure.
  • a population of second calibrators comprising a plurality of the second calibrators Po described in section 1.3.
  • a population of first marker molecules each of which has a first antigen which is binding-specific for the first target structure IgM.
  • the first marker molecules each have a first optical marker which is coupled to the first antigen and emits a first fluorescent radiation when excited with a suitable first excitation radiation.
  • a population of second marker molecules each of which has a second antigen which is binding-specific for the second target structure IgD.
  • the second marker molecules each have a second optical marker which is coupled to the second antigen and emits a second fluorescence radiation when excited by a suitable second excitation radiation.
  • a phosphate-buffered saline solution PBS-buffer.
  • the number of cells to be classified (lymphoma cells) in the analysis medium blood is determined after the blood has been taken and the required number of cells for each FACS analysis is placed in a reaction vessel (e.g. 1x10 6 cells per measurement). Then the marker molecules (approx. 0.5 pg per measurement) and the calibrators Po, PD25, PD75 are added and incubated for 10 minutes in the dark. After the incubation period, the volume is made up with 2 ml of lysis-fixing buffer and incubated again for 10 minutes. In this step, the cells are not only fixed, but the majority of the red blood cells are made to burst. These are not important for the measurement and might interfere with it.
  • the samples are centrifuged and the supernatant discarded. It is washed once with 2 ml of PBS buffer (phosphate buffered saline) and then centrifuged again. After the supernatant has been discarded, the cells are taken up in 100-200 ⁇ l PBS.
  • PBS buffer phosphate buffered saline
  • the analysis medium obtained in this way is then analyzed in a FACS flow cytometer.
  • the analysis medium is passed through a nozzle opening delimiting a measuring area in such a way that both the cells marked with the marking molecule and the different calibrators each come individually into the measuring area of the laser beams.
  • a first and two second flow cytometry measured values are recorded for each calibrator entering the measuring range and for each cell entering the measuring range.
  • the first flow cytometry measured value is dependent on the fluorescence radiation which emits at least one marker molecule bound to the relevant calibrator located in the measurement area or the relevant cell located in the measurement area due to the excitation by the laser beam.
  • the second two Flow cytometry measured values include a forward scatter measured value and a side scatter measured value for the scattered radiation generated when the laser beam impinges on the relevant calibrator located in the measurement area or the relevant cell located in the measurement area.
  • the second flow cytometry measurement values are compared with reference values. Depending on the result of the comparison, due to the different scattering properties of cells and calibrators, it can be determined whether the second flow cytometry measurement values were caused by scattering of the laser beam on a cell or on a calibrator.
  • the different calibrators can be distinguished on the basis of the signal levels of their first flow cytometry measured values. Accordingly, depending on the result of the comparison, the first flow cytometry measured value is assigned either to the cells or to a calibrator.
  • the first flow cytometry measured value is compared with comparison intervals which are assigned to the different calibrator particle populations.
  • the first measured flow cytometry value can be assigned to a calibrator of a specific calibrator particle population. The assignment can take place automatically, for example using suitable software.
  • the respective mean values of the first flow cytometry measurement values are determined for the individual calibrators Po, PD25 and PD75. These form the basis for the reference measuring room used for the measurement.
  • the first flow cytometry measured value for the calibrators Po is used to determine the background in the channel.
  • the first flow cytometry measured value for the calibrators Po enables a statement to be made about the quality of the coupling of the antigens of the marker molecules to the target structure assigned to them (negative control).
  • mean values of the first flow cytometry measured values are determined for the cells for each individual target structure.
  • the following mean values are determined for IgM for the first flow cytometry measured values:
  • the background noise is removed from the measured values.
  • the background noise is caused by unspecific binding of the antibodies of the marker molecules used to the solid particles of the calibrators or to the cells.
  • the first flow cytometry measured values of the first calibrators Po of the first calibrator type are subtracted from the first flow cytometry measured values of the first calibrators PD25 and PD75 of the first calibrator type, the second calibrators Po and the cells.
  • the following adjusted first flow cytometry measured values result for IgM:
  • the following mean values are determined for IgD for the first flow cytometry measured values:
  • First calibrators PD75 of the second calibrator type: 31030 - 144 30886
  • Second calibrators Po: 144 - 144 0
  • Reference units are again defined for the calibrators PD25 and PD75.
  • 100 reference units are assigned to the adjusted first flow cytometry measured value of the calibrator PD75 of the second calibrator type.
  • This number is also referred to as the second scaling factor in the following.
  • the adjusted first flow cytometry measured values of the cells become independent of the properties and settings of the flow cytometer used and can correspond to the adjusted first flow cytometry measured values obtained with a flow cytometer that is set differently than the first called flow cytometer or which has other properties than this are compared.
  • the normalized measured values of the cells related to the reference units can be related to those of the coupling curve (FIG. 4).
  • the coupling curve corresponds to a logistic function (Gauss-Lorentz distribution).
  • absolute values can be determined from the values specified in reference units, which correspond to the quantity of the target structure in question on the cells.
  • the number and combination of the individual populations are expanded compared to the first embodiment for the use of further parameters.
  • a standard curve for the effective intensity was first created for the human and recombinantly produced B-lymphocyte antigen CD19. In relation to this, the appropriate amounts were used for the coupling.
  • IgM and IgD calibrators Pmd - IgM and IgD concentration Int se) CD19 and IgM calibrators: PcDi 9 / m - CD19 and IgM concentration
  • This method can be extended and varied to any number of parameters.
  • the cells to be classified and the calibrator particles are measured and analyzed simultaneously in the flow cytometer.
  • the measurement signals of the cells and the measurement signals of the calibrator particles are separated according to the parameters size and granularity.
  • the size is represented by forward scatter measurement values (FSC) of the energy beam and the granularity is represented by side scatter measurement values (SSC) of the energy beam.
  • FSC forward scatter measurement values
  • SSC side scatter measurement values
  • the cells to be analyzed and the calibrator particles are selected (gated).
  • the measured values of the selected cells (cell populations) are delimited in FIG. 5 by a first oval 1 and the measured values of the selected calibrators (calibrator populations) by a second oval 2 ⁇ m.
  • the calibrator particles form a reference grid for each channel.
  • FIGS. 6 to 9 the exemplary analysis of three parameters (IgM, IgD and CD19) is shown graphically, with
  • - l (lgM) is the mean intensity measured for IgM
  • - l (lgD) is the mean intensity measured for IgD
  • the measured values of the first population of first calibrators PD25 - IgM of the first calibrator type are with the reference number 3, the measured values of the second population of first calibrators PD75 - IgM of the first calibrator type with the reference number 4, the measured values of the first population of first calibrators PD25 - IgD of the second calibrator type with the reference number 5, the measured values of the second population of first calibrators PD75 - IgD of the second calibrator type with the reference number 6 and the measured values of the population of second calibrators Po are designated with the reference number 7.
  • the measured values of the calibrators PD25 - CD19 are with the reference number 8, the measured values of the calibrators PD75 - CD19 with the reference number 9, the measured values of the calibrators Pmd - IgM and IgD with the reference number 10, the measured values of the calibrators PcDi9 / m - CD19 and IgM with the reference number 1 1 and the measured values of the calibrators PcDi9 / d - CD19 and IgD with the reference number 12.
  • the calibrator particles serve several purposes:
  • a profile of the cells to be analyzed with regard to the parameters to be analyzed can be created, and
  • Each circle represents a clustered subpopulation, the diameter of the circle being a measure of the number of measured values belonging to the relevant subpopulation in relation to the total number of measured values.
  • the information relates to the mean fluorescence intensity (MFI) of a starting population, which is marked by the circle with the largest diameter.
  • This starting population has MFI values X, Y and Z for CD19, IgM and IgD.

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Abstract

Bei einem Durchflusszytometrie-Messverfahren wird ein Analysemedium bereitgestellt, welches ein Fluid und darin enthaltene biologische Zellen aufweist. Es wird ein Markierungsmolekül bereitgestellt und derart mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass das Markierungsmolekül spezifisch an eine an der Oberfläche der Zellen befindliche Zielstruktur binden kann, wenn die Zelle diese Zielstruktur aufweist. Für die einzelnen Zellen werden für einen ersten und einen zweiten physikalischen Parameter Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst. Der erste Parameter ist eine Fluoreszenzstrahlung, welche das Markierungsmolekül bei Anregung abgibt. Die Zellen werden anhand der Durchflusszytometrie-Messwerte klassifiziert. Es werden ein erster und ein zweiter Kalibrator bereitgestellt, die bezüglich ihrer Form, Größe und ihres Materials übereinstimmende Festkörperpartikel aufweisen. An der Oberfläche des ersten Kalibrators ist eine Zielstruktur immobilisiert, die mit der Zielstruktur der Zellen übereinstimmt. Der zweite Kalibrator weist diese Zielstruktur nicht auf. Die Kalibratoren werden mit dem Analysemedium vermischt, bevor die Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst werden. Für die Kalibratoren werden entsprechende erste und zweite Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst wie für die Zellen. Aus dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators, dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert des zweiten Kalibrators und dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert der Zelle wird ein normalisierter erster Durchflusszytometrie-Messwert für die Zelle gebildet.

Description

Durchflusszytometrie-Messverfahren und Kit für dessen Durchführung
Die Erfindung betrifft ein Durchflusszytometrie-Messverfahren, bei dem ein Analy semedium bereitgestellt wird, welches ein Fluid und darin enthaltene, zu klassifi zierende biologische Zellen aufweist, wobei mindestens ein Markierungsmolekül bereitgestellt und derart mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass das Markierungsmolekül spezifisch an mindestens eine an der Oberfläche der Zel len befindliche Zielstruktur binden kann, wenn die Zelle diese Zielstruktur aufweist, wobei ein Fluidstrom des Analysemediums erzeugt wird, in dem die Zellen einzeln in einen Messbereich eines Energiestrahls und/oder eines elektrischen Felds ge langen, wobei für die einzelnen, in dem Messbereich befindlichen Zellen jeweils zumindest für einen ersten physikalischen Parameter ein erster und für einen zweiten physikalischen Parameter ein zweiter Durchflusszytometrie-Messwert er fasst werden, wobei zumindest der erste Parameter eine Fluoreszenzstrahlung ist, welche das mindestens eine Markierungsmolekül bei Anregung mit dem Energie strahl oder dem elektrischen Feld abgibt, und wobei die Zellen anhand der Durch- flusszytometrie-Messwerte klassifiziert werden. Außerdem betrifft die Erfindung ei nen Kit zur Durchführung des Verfahrens.
Der Begriff Durchflusszytometrie (Zytometrie: Zell-Vermessung) beschreibt ein Messverfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Es erlaubt die Analyse von biologischen Zellen, die mit hoher Geschwindigkeit einzeln ein elektrisches Feld oder einen Lichtstrahl passieren. Je nach Form, Struktur und/oder Färbung der Zellen werden unterschiedliche Durchflusszytometrie-Mess- werte erfasst, aus denen die Eigenschaften der einzelnen Zellen abgeleitet und die Zellen somit klassifiziert werden können.
Bei einer Form der Durchflusszytometrie werden Fluoreszenz-markierte Zellen je nach Färbung in unterschiedliche Reagenzgefäße sortiert. Entsprechende Geräte werden als Fluss-Sortierer (flow sorter) oder als FACS (fluorescence-activated cell sorting) bezeichnet. Manchmal wird der Begriff FACS (=fluorescence-activated cell scanning) mit dieser Bedeutung für Geräte verwendet, die keine Sortierung der Zellen, sondern nur eine Analyse oder Klassifizierung ihrer Eigenschaften durch führen.
Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahl passiert. Durch einen Hüllstrom fo kussiert, tritt die Probe in den Mikrokanal einer hochpräzisen Küvette aus Glas o- der Quarz ein, derart, dass jede Zelle einzeln nacheinander durch den Messbe reich eines Laserstrahls geführt wird. Das dabei entstehende Streulicht oder Fluo reszenzsignal wird von einem Detektor erfasst. Das Ergebnis sind quantitative In formationen über jede einzelne Zelle. Durch die Analyse einer großen Anzahl von Zellen innerhalb eines sehr kurzen Zeitintervalls (>1000 Zellen/Sekunde) erhält man schnell repräsentative Informationen über Zell-Populationen, die in dem Ana lysemedium enthalten sind.
Zugleich mit dem gestreuten Licht kann man im Durchflusszytometer Fluoreszenz farben messen. Nur wenige Zellen emittieren per se fluoreszierendes Licht. Daher verwendet man Markierungsmoleküle, wie z.B. Farbstoffe, die an bestimmte Ziel strukturen der Zellen binden. Setzt man z.B. die Farbstoffe DAPI (4',6-Diamidine- 2'-phenylindole dihydrochloride) und Propidiumiodid ein, welche an die Desoxyri bonukleinsäure (DNA) einer Zelle binden (DAPI) bzw. in diese interkalieren (Propi diumiodid) - d. h. sich zwischen die Basen einlagern -, kann man anhand der Hel ligkeit der Fluoreszenzstrahlung, die das mindestens eine, an die Zelle immobili sierte Markierungsmolekül beim Passieren des Laserstrahls aussendet, untersu chen, wie viel DNA die Zelle enthält.
Auch Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können als Markie rungsmoleküle verwendet werden. Die Antikörper sind meist gegen bestimmte Oberflächenproteine gerichtet, z.B. Proteine der CD-Klassifizierung (CD: Cluster of differentiation). Nach Markierung kann bei Bedarf dann auch die Sortierung der Zellen nach diesen Merkmalen erfolgen. Durch Einsatz von verschiedenfarbigen Lasern und vor allem Filtern kann die Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe und da mit die Informationsdichte erhöht werden. Dabei sind Antikörper die am häufigsten verwendeten Moleküle, um Oberflächenproteine auf Zellen zu markieren. Unter Markierungsmolekülen werden Antikörper, die mit mindestens einem optischen Markern markiert sind, und/oder andere Moleküle verstanden, die geeignet sind, spezifisch an eine an der Oberfläche einer in dem Analysemedium enthaltenen Zelle, wie zum Beispiel einer Krebszelle, befindliche Zielstruktur zu binden und die Zelle optisch zu markieren.
Obwohl das Durchflusszytometer bei fluoreszenzmarkierten Zellen sowohl die Messung der Anzahl der markierten Zellen als auch die Erfassung eines Mess werts für das von den einzelnen Zellen abgegebene Fluoreszenzsignal ermöglicht, ist eine quantitative Auswertung des Fluoreszenzsignals schwierig, da die für die Messungen verwendeten Durchflusszytometer unterschiedlich sind und daher bei Messungen, die mit verschiedenen Durchflusszytometern vorgenommen wurden, eine Vergleichbarkeit der Durchflusszytometrie-Messwerte nicht gewährleistet ist. Insbesondere werden die Durchflusszytometrie-Messwerte durch die Intensität der zur Beleuchtung des Messbereichs verwendeten Laserstrahlung, durch Toleran zen von optischen Filtern, dem Aufbau der Durchflussmesszelle (Fluidik), den ver wendete Reagenzien, Detektoren und der Variabilität der die Markierungsmoleküle enthaltenden Proben beeinflusst.
Zwar ist eine Quantifizierung der Fluoreszenzmesswerte der Zellen durch Ver gleich des ersten Durchflusszytometrie-Messwerts mit einem Schwellwert möglich, jedoch wird dieser meistens willkürlich gesetzt. Eine genau Quantifizierung der Bindungsereignisse pro Zelle und damit eine universelle plattformunabhängige Vergleichbarkeit der Fluoreszenzmesswerte ist bisher nicht möglich.
Es ist auch bereits bekannt, Durchflusszytometrie-Messgeräte mit Hilfe von fluo reszierenden Mikropartikeln, die in einem Fluid angeordnet sind, das durch den Messbereich des Energiestrahls bzw. des elektrischen Felds geleitet wird, zu ka librieren. Es zeigte sich jedoch, dass diese Kalibrierung nicht ausreicht, um einen genauen Vergleich der mit verschiedenen Durchflusszytometern gemessenen Flu oreszenzmesswerte zu ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Durchflusszytometrie-Messverfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, das es ermöglicht, die Zielstruktur an der Oberfläche der Zellen mit großer Präzision quantitativ nachzuweisen. Außer dem sollen die durch Fluoreszenzmessung erhaltenen quantitativen Messwerte, wenn sie mit verschiedenen Durchflusszytometern gemessen wurden, präzise mit einander vergleichbar sein (Referenzieren / Normalisieren). Aufgabe der Erfindung ist außerdem, einen ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird bezüglich des Durchflusszytometrie-Messverfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Erfindungsgemäß ist dabei ein Durchflusszy- tometrie-Messverfahren vorgesehen, bei dem ein Analysemedium bereitgestellt wird, welches ein Fluid und darin enthaltene, zu klassifizierende biologische Zellen aufweist, wobei mindestens ein Markierungsmolekül bereitgestellt und derart mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass das Markierungsmolekül spe zifisch an mindestens eine an der Oberfläche der Zellen befindliche Zielstruktur binden kann, wenn die Zelle diese Zielstruktur aufweist, wobei ein Fluidstrom des Analysemediums erzeugt wird, in dem die Zellen einzeln in einen Messbereich ei nes Energiestrahls und/oder ein elektrisches Feld gelangen, wobei für die einzel nen, in dem Messbereich befindlichen Zellen jeweils zumindest für einen ersten physikalischen Parameter ein erster und für einen zweiten physikalischen Parame ter ein zweiter Durchflusszytometrie-Messwert erfasst werden, wobei zumindest der erste Parameter eine Fluoreszenzstrahlung ist, welche das mindestens eine Markierungsmolekül bei Anregung mit dem Energiestrahl oder dem elektrischen Feld abgibt, wobei die Zellen anhand dieser Durchflusszytometrie-Messwerte klas sifiziert werden, wobei mindestens ein erster und mindestens ein zweiter Kalibra tor bereitgestellt werden, die jeweils einen Festkörperpartikel aus einem nicht was serlöslichen, anorganischen und/oder polymeren Material aufweisen, wobei die Festkörperpartikel des mindestens einen ersten und des mindestens einen zwei- ten Kalibrators bezüglich ihrer Form, ihrer Größe und ihres Materials übereinstim men, wobei der mindestens eine erste Kalibrator an seiner Oberfläche mindestens eine Zielstruktur aufweist, die mit der mindestens einen Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalibrators immobilisiert ist, wobei der mindestens eine zweite Kalibrator diese Zielstruktur nicht aufweist, wobei der mindestens eine erste und der mindestens eine zweite Kalibrator mit dem Analysemedium vermischt werden, bevor die Durchflusszytometrie-Mess- werte erfasst werden, derart, dass mindestens ein in dem Analysemedium befindli ches Markierungsmolekül an die mindestens eine Zielstruktur des ersten Kalibra tors bindet, wobei die Kalibratoren in dem Fluidstrom einzeln nacheinander in den Messbereich eingebracht werden, wobei für den mindestens einen ersten und den mindestens einen zweiten Kalibrator entsprechende erste und zweite Durch- flusszytometrie-Messwerte erfasst werden wie für die Zellen, wobei der dem zwei ten Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen und dem zweiten Durchflusszyto- metrie-Messwert der Kalibratoren zugeordnete Parameter derart gewählt wird, dass sich die Kalibratoren anhand der zweiten Messwerte von den Zellen unter scheiden lassen, und wobei aus dem mindestens einen ersten Durchflusszytomet rie-Messwert des mindestens einen ersten Kalibrators, dem mindestens einen ers ten Durchflusszytometrie-Messwert des mindestens einen zweiten Kalibrators und dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert mindestens einer Zelle ein normali sierter erster Durchflusszytometrie-Messwert für die mindestens eine Zelle gebil det wird.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die Toleranzen der für den Nachweis der Bindung der Markierungsmoleküle an die Zielstruktur der Zellen ver wendeten Reagenzien, die Variabilität der Markierungsmoleküle und die Zusam mensetzung des Analysemediums einen wesentlichen Einfluss auf die Durch- flusszytometrie-Messwerte der zu klassifizierenden Zellen hat. Diese Toleranzen werden insbesondere durch das Alter der Markierungsmoleküle, die Art und Weise, wie und unter welchen Bedingungen die Markierungsmoleküle vor der Durchführung des Durchflusszytometrie-Messverfahrens gelagert wurden, und durch zusätzlich zu den Zellen in dem Analysemedium enthaltene Substanzen, wie z.B. Inhibitoren, welche die Bindung der Markierungsmoleküle an die Zielstruk tur erschweren oder anstelle der Markierungsmoleküle an die Zielstruktur binden, beeinflusst. Außerdem können auch Umgebungsbedingungen, wie z.B. die Tem peratur, die Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen beeinflussen.
Diese Einflüsse werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch kompen siert, dass standardisierte erste und zweite Kalibratoren bereitgestellt werden, dass für diese Kalibratoren entsprechende Durchflusszytometrie-Messwerte er fasst werden wie für die Zellen, und dass die an den Zellen gemessenen Durch flusszytometrie-Messwerte mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Messwerte der Ka libratoren normalisiert werden. Hierdurch wird eine genaue Quantifizierung der zwischen den einzelnen Zellen und den Markierungsmolekülen bzw. deren Anti körpern auftretenden Bindungsereignisse pro Zelle ermöglicht. Die normalisierten Durchflusszytometrie-Messwerte können auch bei Durchflusszytometrie-Messun- gen, die mit unterschiedlichen Durchfluss-Zytometern durchgeführt wurden und/o der bei denen Reagenzien bzw. Markierungsmolekülen verwendet wurden, die be züglich ihrer Eigenschaften voneinander abweichen, exakten miteinander vergli chen werden. Hierdurch ist es insbesondere möglich, durch Clusteranalyse zu sammengehörige Zell-Subpolulationen zu identifizieren. Da die Kalibratoren keine lebenden Zellen sind sondern Festkörperpartikel als Träger für die mindestens eine Zielstruktur aufweisen, sind die Kalibratoren langzeitstabil, d.h. sie lassen sich über einen längeren Zeitraum lagern, ohne dass sich ihre für den Nachweis der Zielstruktur relevanten Eigenschaften wesentlich verändern.
Der Parameterraum jeder Analyse ist von der Anzahl der maximalen Bindungser eignisse pro Zelle und den Messparametern abhängig. D.h. bei der Bestimmung von z.B. drei Parametern ergeben diese einen dreidimensionalen Raum, dessen Achsen aber nicht zwingend rechtwinkelig zueinander stehen. Die Markierungsart und Markierungsdichte (Anzahl der Fluorophore pro Antikörper) und die Binde stärke und Spezifität der verwendeten Antikörper (bzw. Markierungsmoleküle) spielen dabei ebenfalls eine Rolle. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden normalisierte Durchflusszytomet- rie-Messwerte für die Zellen bereitgestellt, die unabhängig von den physikalischen Eigenschaften des für die Durchführung des Verfahrens verwendeten Durch- flusszytometers, unabhängig von Toleranzen von den verwendeten Reagenzien und Markierungsmoleküle und unabhängig von Substanzen und Wirkstoffen ist, die in dem Analysemedium zusätzlich zu den Zellen enthalten sein können.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird zur Bildung des norma lisierten ersten Durchflusszytometrie-Messwerts die Differenz zwischen dem ers ten Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators und dem ersten Durch- flusszytometrie-Messwert des zweiten Kalibrators zur Differenz zwischen dem ers ten Durchflusszytometrie-Messwert der Zelle und dem ersten Durchflusszytomet rie-Messwert des zweiten Kalibrators ins Verhältnis gesetzt. Dabei beträgt der nor malisierte Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen vorzugsweise 100%, wenn der erste Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen mit dem ersten Durchflusszy tometrie-Messwert des ersten Kalibrators übereinstimmt. Wenn der erste Durch flusszytometrie-Messwert der Zellen mit dem ersten Durchflusszytometrie-Mess wert des zweiten Kalibrators übereinstimmt, hat der normalisierte Durchflusszyto metrie-Messwert der Zellen den Wert null. Die ersten Kalibratoren sind bevorzugt derart ausgestaltet, dass der erste Durchflusszytometrie-Messwert mindestens ei nes ersten Kalibrators mit dem zu erwartenden Maximalwert des ersten Durch flusszytometrie-Messwerts der Zellen übereinstimmt oder etwas darüberliegt, ins besondere maximal 3%, maximal 5%, maximal 10% oder maximal 25% über dem erwarteten ersten Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators. Der ent sprechende Erwartungswert kann experimentell ermittelt werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden mehrere identische erste Kalibratoren und mehrere identische zweite Kalibratoren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt, bevor die Durchflusszytometrie-Messwerte für die einzelnen erfasst werden, wobei aus den ersten Durchflusszytometrie-Mess- werten der ersten Kalibratoren ein gemittelter erster Durchflusszytometrie-Mess- wert für die ersten Kalibratoren und aus den ersten Durchflusszytometrie-Mess- werten der zweiten Kalibratoren ein gemittelter erster Durchflusszytometrie-Mess- wert für die zweiten Kalibratoren gebildet wird, und
wobei zur Bildung eines normalisierten ersten Messwerts einer Zelle die Dif ferenz zwischen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Messwert der ersten Kalibratoren und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Mess wert der zweiten Kalibratoren zur Differenz zwischen dem ersten Durch flusszytometrie-Messwert der Zelle und dem gemittelten ersten Durch flusszytometrie-Messwert der zweiten Kalibratoren ins Verhältnis gesetzt wird,
oder
wobei zur Bildung eines normalisierten ersten Messwerts für eine mehrere Zellen umfassende Zellpopulation jeweils für die einzelnen Zellen erste Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst werden, wobei aus diesen Durch- flusszytometrie-Messwerten ein gemittelter erster Durchflusszytometrie- Messwert für die Zellpopulation gebildet wird, und wobei zur Bildung des normalisierten ersten Messwerts für eine Mehrzahl von Zellen
a) die Differenz zwischen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert der ersten Kalibratoren und dem gemittelten ersten Durch flusszytometrie-Messwert der zweiten Kalibratoren zur Differenz zwi schen dem ersten gemittelten Durchflusszytometrie-Messwert der Zellpopulation und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert der zweiten Kalibratoren ins Verhältnis gesetzt wird, oder b) der Quotient zwischen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Mess wert eines Kalibrators für ein Signal mit vorbestimmter Signalstärke, insbesondere für ein 100%-Signal gebildet wird.
Dabei kann der Mittelwert mit an sich bekannten statistischen Verfahren bestimmt werden und insbesondere der arithmetische Mittelwert sein. Bei Bedarf kann der normalisierte erste Messwert zusätzlich skaliert werden, wobei der Skalierungsfak tor beispielsweise dem Quotient aus dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie- Messwert der ersten Kalibratoren und der Zahl 100 entsprechen kann.
Bei einer Weiterbildung der Erfindung wird für den mindestens einen ersten Kalib rator ein erster Kalibrierfaktor bereitgestellt, der bezüglich des Messignals für den ersten Parameter dem Verhältnis zwischen der Messsignalstärke des ersten Kalib rators und der Messsignalstärke eines die Zielstruktur aufweisenden ersten Refe renz-Kalibrators entspricht, wobei für den ersten physikalischen Parameter des ersten Kalibrators ein erstes Messsignal erfasst wird und der erste Durchflusszyto- metrie-Messwert des ersten Kalibrators aus dem ersten Messsignal und dem ers ten Kalibrierfaktor gebildet wird, wobei für den zweiten Kalibrator ein zweiter Kalib rierfaktor bereitgestellt wird, der bezüglich des Messignals für den ersten Parame ter dem Verhältnis zwischen der Messsignalstärke des zweiten Kalibrators und der Messsignalstärke eines die Zielstruktur nicht aufweisenden zweiten Referenz-Ka librators entspricht, und wobei für den ersten physikalischen Parameter des zwei ten Kalibrators ein zweites Messsignal erfasst wird und der erste Durchflusszyto- metrie-Messwert des zweiten Kalibrators aus dem zweiten Messsignal und dem zweiten Kalibrierfaktor gebildet wird.
Durch die Kalibrierfaktoren ist es möglich, Durchflusszytometrie-Messwerte, die mit unterschiedlichen, voneinander abweichenden Chargen des ersten Kalibrators und/oder des zweiten Kalibrators durchgeführt wurden, noch präziser miteinander zu vergleichen. Die Kalibrierfaktoren werden bevorzugt experimentell unter exakt definierten Bedingungen gemessen.
Hierbei wird zunächst für die ersten und zweiten Referenz-Kalibratoren, die in ei ner ersten Charge hergestellt werden, jeweils ein Erwartungswert für den ersten Durchflusszytometrie-Messwert bestimmt. Dabei wird anstelle des Analysemedi ums ein Puffer mit definierten, konstanten Eigenschaften verwendet, in dem die ersten bzw. zweiten Referenz-Kalibartoren angeordnet sind. Biologische Zellen sind in dem Puffer nicht enthalten. In diesem Puffer werden für eine Vielzahl von gleichen oder im Wesentlichen gleichen ersten bzw. zweiten Referenz-Kai ibrato- ren jeweils die entsprechenden ersten Durchflusszytometrie-Messwerte gemes sen. Aus den so erhaltenen Referenz-Durchflusszytometrie-Messwerten wird mit an sich bekannten Methoden der Statistik für die ersten und zweiten Referenz-Ka librator jeweils ein Erwartungswert bestimmt.
In einem weiteren Schritt werden für erste und zweite Kalibratoren einer zweiten Charge in entsprechender Weise Erwartungswerte bestimmt.
Danach wird der erste Kalibrierfaktor ermittelt, indem der Quotient aus dem Erwar tungswert der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der ersten Kalibratoren der zweiten Charge und dem Erwartungswert der ersten Durchflusszytometrie-Mess werte der ersten Referenz-Kalibratoren gebildet wird. In entsprechender Weise wird der zweite Kalibrierfaktor ermittelt, indem der Quotient aus dem Erwartungs wert der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der zweiten Kalibratoren der zweiten Charge und dem Erwartungswert der ersten Durchflusszytometrie-Mess werte der zweiten Referenz-Kalibratoren gebildet wird.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden mindestens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibratoren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt, wobei sich die Kalibratoren der unterschiedlichen Kalibratorarten insbe sondere hinsichtlich der Flächenbelegungsdichte und/oder der Anordnung ihrer mindestens einen Zielstruktur auf der Oberfläche des Festkörperpartikels derart voneinander unterscheiden, dass die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte ei ner ersten Kalibratorart eine Signalstärke aufweisen, die größer ist als die Signal stärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der zweiten Kalibratoren und kleiner ist als die Signalstärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte einer zweiten Kalibratorart. Flierdurch kann der Einfluss eines nichtlinearen Signalver laufs bei der Erfassung der Durchflusszytometrie-Messwerte kompensiert werden.
Vorteilhaft ist, wenn in dem Fluid mindestens zwei unterschiedliche Populationen von Zellen enthalten sind, die sich derart voneinander unterscheiden, dass die ers ten Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen einer ersten Population in einem ersten Signalstärkebereich und die die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen einer zweiten Population in einem außerhalb des ersten Signalstärkebe reichs befindlichen zweiten Signalstärkebereich liegen, und wenn die Signalstärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der ersten Kalibratorart derart gewählt wird, dass sie zwischen dem ersten und zweiten Signalstärkebereich liegt. Der Ka librator der ersten Kalibratorart erzeugt dabei eine Signalstärke, die es erlaubt, die Referenzbereiche von zwei Subpopulationen voneinander abzugrenzen. D.h. Zel len mit einem ersten Durchflusszytometrie-Messwert, der kleiner ist als der erste Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators der ersten Kalibratorart, ge hören zu einer ersten Population und Zellen mit einem höheren Durchflusszyto metrie-Messwert zu einer zweiten Population.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die größte Abmessung der Festkörperpartikel kleiner als 20 miti, insbesondere kleiner als 15 pm und bevor zugt kleiner als 10 pm ist und/oder die kleinste Abmessung der Festkörperpartikel ist größer als 4 pm, insbesondere größer als 5 pm und bevorzugt größer als 6 pm. Geeignet Festkörperpartikel sind beispielsweise Mikrosphären mit einem Durch messer von 6-10 pm. Die Festkörperpartikel haben bevorzugt eine ähnliche Größe wie die in dem Analysemedium befindlichen Zellen.
Die Festkörperpartikel sind bevorzugt synthetische Mikropartikel. Die Festkörper partikel können ein Polystyren, Melamin, Latex und/oder Silikat aufweisen oder aus einem dieser Materialien bestehen.
Die Markierungsmoleküle können Moleküle sein, die an Zielantigene auf der Ober fläche von Zellen oder Kalibratoren binden und anschließend zum Nachweis die ser Zielantigene verwendet werden können. Solche Moleküle sind z.B. Antikörper und deren Fragmente, Lektine, andere bindende Proteine (z.B. Protein A).
Die Zielantigene auf den ersten Kalibratoren sind bevorzugt kovalent immobilisiert. Verfahren zum Herstellen einer solchen kovalenten Bindung sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. Bindung an Amine (über Crosslinker), Thi- ole, Epoxide, Aldehyde, Maleinimide und andere Gruppen. Geeignete Verfahren und deren chemische Umsetzung sind in der Fachliteratur beschrieben (Bioconju- gate Techniques, Third Edition 3rd edition by Hermanson, Greg T. (2013)). Es können aber auch nicht kovalente Verfahren angewandt werden, wie z.B. His-Tag, Biotin-Streptavidin, Protein G, Protein A, vorimmobilisierte Antikörper.
Zielantigene bzw. Zielstrukturen auf den ersten Kalibratoren können beispiels weise Proteine, Peptide, Rezeptoren, Allergene, glykosylierte Proteine, Liposac- charide, Oligo- und Polysacharide, Nukleinsäuren sowie die Fragmente und Deri vate der vorgenannten Substanzen sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der mindestens eine zweite Durchflusszytometrie-Messwert einen Vorwärtsstreuungs-Messwert für eine in dem Messbereich auftretende Vorwärtsstreuung des Energiestrahls und/oder einen Seitwärtsstreuungs-Messwert für eine in dem Messbereich auftre tende Seitwärtsstreuung des Energiestrahls. Diese Messwerte lassen sich auf ein fache Weise mittels geeigneter Sensoren erfassen. Der Vorwärtsstreuungs-Mess wert ist ein Maß für die Größe und der Seitwärtsstreuungs-Messwert ein Maß für die Granularität der Zellen bzw. der Kalibratoren. Anhand dieser Messgrößen las sen sich die Zellen von den Kalibratoren unterscheiden. Somit lassen sich die ge messenen Durchflusszytometrie-Messwerte anhand der Vorwärts- und Seitwärts- streuungs-Messwerte eindeutig den Zellen und den Kalibratoren zuordnen.
Es ist aber auch möglich, dass der mindestens eine zweite Durchflusszytometrie- Messwert ein Fluoreszenzmesswert für eine von den Markierungsmolekülen aus gesandte Fluoreszenzstrahlung ist, welche sich von der Fluoreszenzstrahlung des ersten Durchflusszytometrie-Messwerts unterscheidet. Dabei sind bevorzugt die Wellenlängen der Fluoreszenzstrahlung der ersten und zweiten Durchflusszyto metrie-Messwerte unterschiedlich. Vorteilhaft ist, wenn sowohl für die Zellen als auch für die ersten und zweiten Ka libratoren jeweils für mehrere Messkanäle mindestens ein erster Durchflusszyto- metrie-Messwerte erfasst wird, wenn wenigstens zwei und insbesondere zumin dest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedli chen Markierungsmolekülen bereitgestellt und mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, und wenn der mindestens eine erste Kalibrator zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von Zielstrukturen aufweist, die je weils spezifisch an eines der unterschiedlichen Markierungsmoleküle binden, wenn sie mit dem betreffenden Markierungsmolekül in Kontakt gelangen.
Es ist aber auch denkbar, dass sowohl für die Zellen als auch für die ersten und zweiten Kalibratoren jeweils für mehrere Messkanäle mindestens ein erster Durch- flusszytometrie-Messwerte erfasst wird, dass zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedlichen Markierungsmolekülen bereitgestellt und mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass mindes tens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibratoren bereitgestellt werden, dass min destens ein erster Kalibrator einer ersten Kalibratorart an seiner Oberfläche min destens eine erste Zielstruktur aufweist, die mit mindestens einer ersten Zielstruk tur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörperpartikel dieses Kalibrators im mobilisiert ist, dass mindestens ein erster Kalibrator einer zweiten Kalibratorart an seiner Oberfläche mindestens eine zweite Zielstruktur aufweist, die mit mindes tens einer zweiten Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörper partikel dieses Kalibrators immobilisiert ist, und dass der mindestens eine erste Kalibrator der ersten Kalibratorart an seiner Oberfläche die zweite Zielstruktur und der mindestens eine erste Kalibrator der zweiten Kalibratorart an seiner Oberflä che die erste Zielstruktur nicht aufweist. Dabei kann sogar zumindest eine der An zahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedlichen ersten Kalibra toren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt werden, und diese ers ten Kalibratoren können unterschiedliche Zielstrukturen aufweisen, die jeweils für eines der unterschiedlichen Markierungsmoleküle bindungsspezifisch sind. Die Verwendung mehrerer Messparameter und deren Kalibratoren ist dabei nur durch die Anzahl der Messkanäle des Messgerätes und die verfügbaren Fluoro phore beschränkt. Routinemäßig können sechs bis acht Parameter erfasst wer den. Für die Analyse von AML-Zellen werden heute schon 30 relevante Parameter erfasst, die aber in mehreren Messdurchgängen erfasst werden müssen. Mit mo dernen Geräten, die auch die Messung im nahen Infrarotbereich erlauben, lassen sich deutlich mehr als acht Parameter erfassen. Sollen in einem solchen Parame terraum Subklassen von Zellen erfasst werden, so ist die Auflösung der Messung wichtig. Die Anzahl der Messungen, die pro Messkanal erfasst werden kann, kann durch die Verwendung von Kalibratoren einer weiteren Partikelklasse, deren Fest körperpartikel sich hinsichtlich ihrer Größe von den Festkörperpartikeln von Kalib ratoren einer ersten Partikelklasse unterscheiden, erhöht werden.
Dadurch, dass die ersten Kalibratoren (relative Signalstärke 100%) es erlauben, das zu erwartende Maximalsignal gerätespezifisch zu erfassen, kann die Auflö sung erhöht werden (z.B. durch Anpassung der Laserleistung bzw. der Verstärker leistung des Detektors, so dass messtechnisch das Maximale an Auflösung aus der Messung geholt werden kann). Mit einem derart erfassten und aufgearbeiteten Signal lassen sich nun Zellpopulationen mit Hilfe mathematischer Verfahren erfas sen (z.B. Clusternalyse - ein Standardverfahren der Mathematik, das unter https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalyse beschrieben ist). Somit können sehr variable Erkrankungen wie z.B. Leukämien besser typisiert werden und damit auch besser therapiert werden, da entsprechende Marker für das Ansprechen von Therapien erfasst und bewertet werden können. Im besonderen Falle von Lym phomen und Leukämien sind eine Reihe von Markern bekannt, welche einen star ken Einfluss auf die Prognostik der Erkrankung haben. So belegen aktuelle Stu dien, dass neben bekannten Markern wie CD38, die Expression von CD49d eine sehr schwerwiegende Auswirkungen auf den Verlauf der chronisch lymphatischen Leukemie (CLL) hat (DOI: 10.1 1 1 1/j.1365-2141 .201 1 08725.x).
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist die Zielstruktur auf den ersten Kalibratoren mindestens ein Antigen auf, das vorzugsweise ein mindestens ein Protein und/oder mindestens ein Peptid und/oder mindestens einen Rezeptor und/oder mindestens ein Allergen und/oder mindestens ein glykosyliertes Protein und/oder mindestens ein Liposaccharid und/oder mindestens ein Oligosacharide und/oder mindestens ein Polysaccharid und/oder mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Fragment und/oder Derivat der vorgenannten Substan zen umfasst.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Zielstruktur des min destens einen ersten Kalibrators über mindestens eine aktivierte Carboxy-Grup- pen und/oder mindestens eine aktivierte NFte-Gruppe am Festköperpartikel des ersten Kalibrators immobilisiert. Dies ermöglicht eine stabile Kopplung und Immo bilisierung der Zielstruktur, wie z.B. eines Antigens, an den Festköperpartikel. Ent sprechende Mikropartikel sind kommerziell erhältlich.
Vorteilhaft ist, wenn mindestens eine auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalib rators immobilisierte Zielstruktur mit einer der Zielstruktur übereinstimmt, die für Zellen mindestens einer Blutkrebsart typisch ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann dann zur Klassifizierung von Leukemie-Zellen verwendet werden. Insbeson dere können dabei die schnellwachsenden Typ M Zellen von den weniger aggres siven Typ D Zellen unterschieden werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung stimmt die mindestens eine auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalibrators immobilisierte Zielstruktur mit ei ner der Zielstruktur übereinstimmt, die innerhalb des B Zell Rezeptors (BCR) auf der Oberfläche von chronisch lympatischen Leukemie-Zellen (CLL-Zellen) vor kommt. Diese Leukemie-Zellen sind besonders aggressiv. Durch ihre hohe Affini tät und Spezifität ist diese Zielstruktur gut für eine durchflusszytometrische Diag nostik (FACS) geeignet.
Die Kalibratoren werden bei der Messung dem Analysemedium, z.B. Blut, zugege ben. Geeignete Konzentrationen der Kalibratoren sind bevorzugt 1 x105 pro 1 x106 Zellen. Bei der Messung werden die Kalibratoren über die Parameter Forward- Scatter (Größe) und Sideward-Scatter (Granularität) identifiziert und somit von den Zielzellen getrennt.
Bezüglich des Kits wird die vorstehend genannte Aufgabe mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst. Erfindungsgemäß umfasst der Kit
mindestens einen ersten Kalibrator, der einen ersten Festkörperpartikel aus einem nicht wasserlöslichen, anorganischen und/oder polymeren Material aufweist, wobei der erste Kalibrator an seiner Oberfläche mindestens eine auf dem ersten Festkörperpartikel immobilisierte Zielstruktur hat, mindestens einen zweiten Kalibrator, der einen mit dem ersten Festkörper partikel bezüglich Form, Größe und Material übereinstimmenden zweiten Festkörperpartikel aufweist, wobei der zweite Kalibrator an seiner Oberflä che die Zielstruktur nicht aufweist, und
mindestens ein für die Zielstruktur bindungsspezifisches Markierungsmole kül.
Mit einem solchen Kit können bei Durchflusszytometrie-Messverfahren Zielstruktu ren, die an der Oberfläche von in einem Fluid enthalten, zu klassifizierenden biolo gischen Zellen angeordnet sind, mit großer Präzision quantitativ erfasst werden. Die entsprechenden Messwerte lassen sich - auch wenn sie mit verschiedenen Durchflusszytometern gemessen wurden - präzise miteinander vergleichen. Die mindestens eine Zielstruktur ist vorzugsweise ein Antigen. Bei Bedarf kann der Kit zusätzlich einen Puffer enthalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Kits sind an der Oberfläche des min destens einen ersten Kalibrators mehrere unterschiedliche Zielstrukturen angeord net, die auf dem ersten Festkörperpartikel immobilisiert sind. Dabei hat der Kit für jede dieser Zielstrukturen jeweils mindestens ein für die betreffende Zielstruktur bindungsspezifisches Markierungsmolekül. Mit einem solchen Kit können Parallel messungen durchgeführt werden. Der parallelen Beladung der Kalibratoren mit Zielstrukturen sind nur durch die Belegungsdichte der Festkörperpartikel und da mit durch das erreichbare Maximalsignal Grenzen gesetzt. Es ist aber auch denkbar, dass der Kit zum Durchführen von Parallelmessungen mehrere unterschiedliche erste Kalibratoren aufweist, die an ihrer Oberfläche un terschiedliche Zielstrukturen haben. Dabei kann jeder erste Kalibrator jeweils nur eine einzige Zielstruktur haben. Es ist auch möglich, dass mindestens ein erster Kalibrator mehrere Bereiche mit Zielstrukturen aufweisen, die für dieselben Mar kierungsmoleküle bindungsspezifisch sind.
Die Markierungsmoleküle sind bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen. Solche Farbstoffe sind im Normalfall kovalent an die Markierungsmoleküle gebun den. Kommerziell sind eine Vielzahl von solchen Farbstoffen verfügbar wie z.B. Cy3, Cy5, Cy 7, FITC, Rhodamin, Phycoerythrin, Lyssamin; eine Auflistung ver schiedener Farbstoffe findet sich unter: https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Kit mindestens ei nen Datenträger, auf dem für den mindestens einen ersten Kalibrator ein erster Kalibrierfaktor und/oder für den mindestens einen zweiten Kalibrator ein zweiter Kalibrierfaktor gespeichert sind. Mit einem solchen Kit können Toleranzen von Ka libratoren kompensiert werden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Mess ergebnisse von Durchflusszytometrie-Messverfahren miteinander verglichen wer den sollen, die mit unterschiedlichen Chargen von ersten bzw. zweiten Kalibrato ren durchgeführt wurden. Der Datenträger kann ein maschinenlesbarer Datenträ ger sein, der zum Beispiel einen Träger aufweisen kann, der mit einem Barcode oder einem QR-Code versehen ist. Es ist aber auch möglich, dass die Kalibrierfak toren in Form von Zahlen auf ein zu dem Kit gehörendes Dokument, wie z.B. ein Beipackzettel oder einer zu dem Kit gehörenden Verpackung, aufgedruckt sind.
Vorteilhaft ist, wenn der Kit mindestens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibrato ren aufweist, und wenn sich die Kalibratoren der unterschiedlichen Kalibratorarten insbesondere hinsichtlich der Flächenbelegungsdichte und/oder der Anordnung ih rer mindestens einen Zielstruktur auf der Oberfläche des Festkörperpartikels der art voneinander unterscheiden, dass sie bei einer Durchflusszytometrie-Messung Messsignale mit unterschiedlicher Signalstärke erzeugen, wenn ihre Zielstrukturen mit dem Markierungsmolekül markiert sind. Mit einem solchen Kit kann bei Durch- flusszytometriemessungen, bei denen das Fluoreszenzsignal einen nichtlinearen Verlauf hat, eine Regression durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Be zugnahme auf die Zeichnung. Es zeigt:
Fig. 1 eine graphische Darstellung von mit Hilfe eines Durchflusszytometers für eine Population von zweiten Kalibratoren (Nullkalibrator) erfassten
Messwerten, wobei auf der Abszisse die gemessene Intensität PE und auf der Abszisse die Anzahl n der Bindungsereignisse aufgetragen ist,
Fig. 2 eine Darstellung ähnlich Fig. 1 wobei jedoch die Messwerte für eine Po pulation von ersten Kalibratoren einer ersten Kalibratorart dargestellt sind,
Fig. 3 eine Darstellung ähnlich Fig. 1 wobei jedoch die Messwerte für eine Po pulation von ersten Kalibratoren einer zweiten Kalibratorart dargestellt sind,
Fig. 4 eine Standardkurve, bei der auf der Abszisse die Menge Protein CD23 pro 2,1 -106 Festkörperpartikel und auf der Ordinate der MFI-Wert (mitt lerer Fluoreszenz-Messwert) aufgetragen ist,
Fig. 5 eine graphische Darstellung der für die Parameter Größe und Granula- rität gemessenen Messignale, wobei auf der Abszisse die dem Parame ter Größe zugeordnete Vorwärtsstreuung (FSC) und auf der Ordinate die dem Parameter Granularität zugeordnete Seitwärtsstreuung (SSC) einer Fluoreszenzstrahlung an Zellen und Kalibratorpartikeln aufgetra gen sind, Fig. 6 eine graphische Darstellung der für Zellen und Kalibratorpartikel ge messenen Intensitätswerte für IgM und CD19, wobei auf der Abszisse die die Intensität für IgM und auf der Ordinate die Intensität für CD19 aufgetragen sind,
Fig. 7 eine graphische Darstellung der Zellen und Kalibratorpartikel gemesse nen Intensitätswerte für IgD und CD19, wobei auf der Abszisse die die Intensität für IgD und auf der Ordinate die Intensität für CD19 aufgetra gen sind,
Fig. 8 eine graphische Darstellung der Zellen und Kalibratorpartikel gemesse nen Intensitätswerte für IgD und IgM, wobei auf der Abszisse die die In tensität für IgD und auf der Ordinate die Intensität für IgM aufgetragen sind,
Fig. 9 eine dreidimensionale Darstellung des Messraums gemäß den Fig. 6 bis 8, und
Fig. 10 eine graphisch e Darstellung einer Clusteranalyse für den in Fig. 6 bis 9 abgebildeten Messraum.
Bei einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden als Zielstrukturen krankheitsassoziierte Antigene bereitgestellt. Als eine erste Zielstruktur wird IgM (Immunglobolin M) und als eine zweite Zielstruktur IgD (Immunglobolin D) bereit- gestellt.
Außerdem werden eine Vielzahl von Festkörperpartikeln bereitgestellt, nämlich Mikrosphären aus Polystyrol mit einem Durchmesser von 6 pm. Die Festkörper partikel stimmen bezüglich ihrer Form, ihrer Größe und ihres Materials überein.
Die Festkörperpartikel sind an ihrer Oberfläche mit daran bindenden Car- boxylgruppen (-COOFI) beschichtet. Anstelle der Carboxylgruppen oder zusätzlich zu diesen können an der Oberfläche der Festkörperpartikel NFh-Gruppen vorgese hen sein. Über die Carboxylgruppen und/oder die NFh-Gruppen können die ersten und zweiten Zielstrukturen an die Oberfläche der Festkörperpartikel gebunden werden.
Ferner werden erste und zweite Markierungsmoleküle bereitgestellt. Bei den ers ten Markierungsmolekülen handelt es sich um Antigene, die für die erste Zielstruk tur IgM bindungsspezifisch sind. Die zweiten Markierungsmoleküle sind Antigene, die für die zweite Zielstruktur IgD bindungsspezifisch sind. Die Markierungsmole küle haben jeweils mindestens einen optischen Marker, der bei Anregung mit einer geeigneten Anregungsstrahlung eine Fluoreszenzstrahlung aussendet.
1.1 Kopplung von krankheitsassoziierten Antigenen an die Oberfläche der Festkörperpartikel
Es werden dreizehn Festkörperpartikel-Populationen bereitgestellt, die jeweils die gleiche Anzahl von Festkörperpartikeln umfassen, die an ihren Oberflächen Kar- boxylgruppen tragen.
An die Oberfläche der Festkörper-Partikel von sechs Festkörperpartikel-Populatio nen werden die ersten Zielstrukturen und an die Oberfläche der Festkörper-Parti kel von sechs weiteren Festkörperpartikel-Populationen die zweiten Zielstrukturen gekoppelt. Flierzu werden zu den Festkörperpartikeln
- einer ersten Festkörperpartikel-Population 2,00 pg IgM,
- einer zweiten Festkörperpartikel-Population 1 ,00 pg IgM,
- einer dritten Festkörperpartikel-Population 0,40 pg IgM,
- einer vierten Festkörperpartikel-Population 0,20 pg IgM,
- einer fünften Festkörperpartikel-Population 0,08 pg IgM,
- einer sechsten Festkörperpartikel-Population 0,04 pg IgM,
- einer siebten Festkörperpartikel-Population 2,00 pg IgD,
- einer achten Festkörperpartikel-Population 1 ,00 pg IgD, - einer neunten Festkörperpartikel-Population 0,40 pg IgD,
- einer zehnten Festkörperpartikel-Population 0,20 pg IgD,
- einer elften Festkörperpartikel-Population 0,08 pg IgD und
- einer zwölften Festkörperpartikel-Population 0,04 pg IgD,
jeweils je pro 1 ,2-106 Festkörperpartikel zu den Festkörperpartikeln der betreffen den Festkörperpartikel-Population dazugegeben und in einem Bindungspuffer (50mM MES, pH 5,2; 0,05% Proclin) für 60 Minuten unter ständiger Bewegung in kubiert. Die Kopplung erfolgt jeweils nach einem Standardprotokoll mittels Aktivie rung durch EDAC (Carbodiimid). Die Festkörperpartikel werden gewaschen und in EDAC-Lösung (20 mg/ml) aktiviert.
Nach Zentrifugation der einzelnen Festkörperpartikel-Populationen bei 800 g wird jeweils der Überstand abgenommen und für eine Kontrollmessung der verbliebe nen Antigenkonzentration zurückgestellt. Die Festkörperpartikel werden in einen Waschpuffer aufgenommen und resuspendiert. Nach nochmaliger Zentrifugation wird der Überstand verworfen und die Partikel zur Sättigung nicht besetzter reakti ver Gruppen in einen Wasch- und Storagepuffer (10mM Tris, pH 8.0; 0,05% BSA; 0,05% Proclin) aufgenommen.
An die Oberfläche der Festkörperpartikel einer dreizehnten Festkörperpartikel-Po pulation werden weder erste noch zweite Zielstrukturen gekoppelt. Stattdessen werden die reaktiven COOH-Gruppen derart mit einem Blockierungsprotein in Kontakt gebracht, dass das Blockierungsprotein unspezifisch an die COOH-Grup pen binden kann. Als Blockierungsprotein kann beispielsweise bovines Serumal bumin oder hydrolisiertes Casein verwendet werden.
1.2 Bestimmung der für die Kopplung einzusetzenden Konzentrationen von IgM und IgD.
Jede der dreizehn Festkörperpartikel-Populationen wird jeweils mit Hilfe eines Durchflusszytometers (FACS) vermessen. Hierzu werden die Festkörperpartikel der ersten bis sechsten Festkörperpartikel-Population und die ersten Markierungs- moleküle (ca. 0,5 pg pro Messung) in einem Fluid suspendiert und für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Proben werden zentrifugiert und der Überstand verwor fen. Es wird einmal mit 2 ml PBS-Puffer (Phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend noch einmal zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen wurde, werden die Festkörperpartikel in 100-200 pl PBS aufgenommen. Die so er haltene Suspension wird derart durch eine einen Messbereich begrenzende Dü senöffnung eines Durchflusszytometers hindurch geleitet, dass die in dem PBS enthaltenen Festkörperpartikel einzeln in einen Messbereich eines Laserstrahls gelangen. Durch den Laserstrahl werden die spezifisch an die erste Zielstruktur gebundenen ersten Markierungsmoleküle zur Aussendung einer Fluoreszenz strahlung angeregt. Von dieser werden mit Hilfe eines optischen Detektors Fluo reszenzmesswerte erfasst. Dabei werden für jede Festkörperpartikel-Population jeweils eine Vielzahl von Fluoreszenzmesswerten (Intensitätsmesswerten) gemes sen. Aus den für die einzelnen Festkörperpartikel erfassten Fluoreszenzmesswer ten jede Festkörperpartikel-Population wird jeweils ein Mittelwert gebildet (MFI- Wert bzw. Median-Fluoreszenz-Intensity).
In entsprechender Weise werden die Festkörperpartikel der siebten bis zwölften Festkörperpartikel-Population mit Hilfe des Durchflusszytometers vermessen. Da bei werden durch den Laserstrahl die spezifisch an die zweite Zielstruktur gebun denen zweiten Markierungsmoleküle zur Aussendung einer Fluoreszenzstrahlung angeregt.
Obwohl humanes IgM (Immunglobolin M) aus dem Serum leicht zugänglich ist, stellte sich heraus, dass für die Kopplung an die Festkörperpartikel und insbeson dere für die Stabilität nach der Kopplung, humanes rekombinant erstelltes mono meres IgM besser geeignet ist. Im Serum liegt IgM meist in einem Pentamer vor. Es zeigte sich, dass es bei der Bindung von IgM-Pentameren meist nicht zu einer vollständigen Bindung kommt. Ein Teil der IgM-Moleküle der Pentamere werden nicht kovalent an die Partikel gebunden. Die unkontrollierte Degradierung führt dann bei der späteren Verwendung zu einem Verlust der Auflösung im Durch- flusszytometer. Daher werden sowohl für IgM als auch IgD (IgD (Immunglobolin D) rekombinant hergestelltes monomeres IgM und IgD verwendet. In Fig. 1 bis 3 sind die Fluoreszenzmesswerte und der Mittelwert für die erste, zweite und siebte Festkörperpartikel-Population graphisch dargestellt. Auf der Abszisse ist jeweils die mit Hilfe des Durchflusszytometers für die Festkörperparti kel der betreffende Festkörperpartikel-Population gemessene Intensität PE der Fluoreszenzstrahlung und auf der Abszisse die Anzahl n der Bindungsereignisse aufgetragen.
Wie in Fig. 4 zu sehen ist, werden die Mittelwerte für die einzelnen Fluoreszenzen zu einer Kopplungskurve gegen die CD23-Proteinmenge PM pro 2,1 -106 Festkör perpartikel jeweils für die erste aufgetragen. Eine entsprechende Kopplungskurve wird für die zweite Zielstruktur erstellt.
Anhand der betreffenden Kopplungskurve kann die für eine gewünschte Intensität bzw. Signalstärke der Fluoreszenz benötigte Menge der ersten bzw. zweiten Ziel struktur abgelesen werden. Anhand der Kopplungskurve wird maximale Mittelwert der Intensität Lax für die jeweilige Zielstruktur bestimmt und definiert. Anschlie ßend werden ein 75%-Wert (P75) und ein 25%-Wert (P25) wie folgt definiert:
P75 = Imax ' 0,75
P25 = p75 / 10 Für die Kopplung ergeben sich bei dem ersten Ausführungsbeispiel folgende Werte:
Imax = 21700
P75 = 21700 0,75 = 16275
P25 = 16275 / 10 = 1627
Diese Werte werden als Referenz festgelegt. Aus der Kopplungskurve kann nun die passende Proteinmenge ausgelesen werden. Für P75 beträgt diese 1 ,3 pg pro 2,1 -106 Festkörperpartikel. 1.3 Zubereitung von Kalibratoren für zwei CLL-charakteristische Parameter: IgM und IgD
Ziel ist es für die ersten und zweiten Zielstrukturen (IgM und IgD) jeweils mehrere Kalibratorpopulationen zu erstellen.
Eine erste Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer ersten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils einen Festkörperpartikel, auf dessen Oberfläche als erste Zielstruktur IgM derart immobi lisiert ist, dass das Fluoreszenzsignal der einzelnen ersten Kalibratoren der ersten Kalibratorart in einer durchflusszytometrischen Analyse jeweils eine relative Inten sität von 25% erreicht.
Eine zweite Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer zweiten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wir die ersten Kalibratoren der ersten Kalibratorart. Auf der Oberfläche der Festkörperpartikel der ersten Kalibratoren der zweiten Kalibra torart ist die gleiche Zielstruktur immobilisiert wie an der Oberfläche der ersten Ka libratoren der ersten Kalibratorart. Die Flächenbelegungsdichte und die Anordnung der Zielstruktur der ersten Kalibratoren der zweiten Kalibratorart ist jedoch derart gewählt, dass das Fluoreszenzsignal die ersten Kalibratoren der zweiten Kalibra torart in der durchflusszytometrischen Analyse eine relative Intensität von 75% er reicht.
Eine dritte Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer dritten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wie die ersten Kalibratoren der ersten und zweiten Ka libratorart. Auf der ersten Kalibratoren der dritten Kalibratorart ist eine für IgD bin dungsspezifische zweite Zielstruktur derart immobilisiert, dass das Fluoreszenz- Signal die ersten Kalibratoren der vierten Kalibratorart in der durchflusszytometri- schen Analyse eine relative Intensität von 25% erreicht.
Eine vierte Kalibratorpopulation enthält eine Vielzahl von übereinstimmenden ers ten Kalibratoren einer vierten Kalibratorart. Diese Kalibratoren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wie die ersten Kalibratoren der ersten, zweiten und dritten Kalibratorart. Auf der Oberfläche der Festkörperpartikel der ersten Kalibra toren der vierten Kalibratorart ist die gleiche Zielstruktur immobilisiert wie an der Oberfläche der ersten Kalibratoren der dritten Kalibratorart. Die Flächenbele gungsdichte und die Anordnung der Zielstruktur der ersten Kalibratoren der vierten Kalibratorart ist jedoch derart gewählt, dass das Fluoreszenzsignal die ersten Ka libratoren der vierten Kalibratorart in der durchflusszytometrischen Analyse eine relative Intensität von 75% erreicht.
Außerdem wird eine fünfte Kalibratorpopulation erstellt, eine Vielzahl von überein stimmenden ersten Kalibratoren einer fünften Kalibratorart enthält. Diese Kalibra toren haben jeweils die gleichen Festkörperpartikel wie ersten Kalibratoren der ersten, zweiten, dritten und vierten Kalibratorart. Auf der Oberfläche der Festkör perpartikel der ersten Kalibratoren der fünften Kalibratorart sind zwei unterschiedli che Zielstrukturen immobilisiert. Eine dieser Zielstrukturen ist mit der ersten Ziel struktur (bindungsspezifisch für IgM) und die andere Zielstruktur ist mit der zweiten Zielstruktur (für IgD bindungsspezifisches Antigen) identisch. Die Flächenbele gungsdichte und die Anordnung der Antigene IgM und IgD der ersten Kalibratoren der fünften Kalibratorart ist so gewählt, dass das Fluoreszenzsignal die ersten Ka libratoren der fünften Kalibratorart in der durchflusszytometrischen Analyse sowohl für IgM als auch für IgD jeweils eine relative Intensität von 75% erreicht.
Zusätzlich wird eine Negativpopulation erstellt, die eine Vielzahl von übereinstim menden zweiten Kalibratoren aufweist. Diese bestehen jeweils aus einem Festkör perpartikel, auf dem weder die erste (IgM) noch die zweite Zielstruktur (IgD) immo bilisiert ist. Bei der Negativpopulation sind die an der Oberfläche der Festkörper partikel befindlichen Carboxylgruppen (-COOFI) bzw. NFh-Gruppen unspezifisch an ein Blockierungsprotein gebunden. Die Festkörperpartikel der zweiten Kalibra toren sind mit den Festkörperpartikel der ersten Kalibratoren identisch.
Für die Kopplung der Antigene an den Festkörperpartikeln wird die für jede zu er stellende Population benötigte Menge Festkörperpartikel in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Festkörperpartikel werden bei 800 g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Anschließend werden die Festkörperpartikel in ei nen Kopplungspuffer aufgenommen. Die Kopplung erfolgt nach dem zuvor be schriebenen Protokoll, wobei für die erste, zweite und fünfte Kalibratorpopulation eine adäquate Menge IgM und für die dritte, vierte und fünfte Kalibratorpopulation eine adäquate Menge IgD eingesetzt wird.
Die auf diese Weise bereitgestellten Kalibratorpopulationen sind nachstehend auf gelistet:
Erste Kalibratoren:
a) IgM-Kalibratoren: PD25 - IgM Konzentration Int25
PD75 - IgM Konzentration Int s b) IgD-Kalibratoren: PD25 - IgD Konzentration Int25
PD75 - IgD Konzentration Int75 c) IgM- und IgD- Kalibratoren: Pmd - IgM und IgD Konzentration Int s
Zweite Kalibratoren: Po - weder IgM noch IgD
Die einzelnen Kalibratoren werden nach ihrer Fierstellung mittels FACS (flu- orescence-activated cell sorting) unter Verwendung kommerziell erhältlicher, mit einem Marker markierter Antikörper vermessen. Für eine Anwendung zum Zwecke der späteren Diagnostik werden die Kalibratoren zu einem Kit zusammengefasst. So wird bei der späteren FACS-Messung, zu diagnostischen Zwecken, der Mess raum durch die einzelnen Populationen definiert, standardisiert und normiert. 1.4 Verwendung der Kalibratoren zur Analyse von Blutproben mittels FACS
Es wird ein Kit bereitgestellt, der folgendes aufweist:
a) Eine erste Population von ersten Kalibratoren der ersten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD25 umfasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgM immobilisiert ist. b) Eine zweite Population von ersten Kalibratoren ersten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD75 um fasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgM immobilisiert ist.
c) Eine erste Population von ersten Kalibratoren der zweiten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD25 umfasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgD immobilisiert ist. d) Eine zweite Population von ersten Kalibratoren zweiten Kalibratorart, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen ersten Kalibratoren PD75 umfasst, an deren Oberfläche als erste Zielstruktur IgD immobilisiert ist. e) Eine Population von zweiten Kalibratoren, die eine Vielzahl der in Abschnitt 1.3 beschriebenen zweiten Kalibratoren Po umfasst.
f) Eine Population von ersten Markierungsmolekülen, die jeweils ein erstes Antigen aufweisen, welches für die erste Zielstruktur IgM bindungsspezi fisch ist. Die ersten Markierungsmoleküle weisen jeweils einen ersten opti schen Marker auf, der an das erste Antigen gekoppelt ist und bei Anregung mit einer geeigneten ersten Anregungsstrahlung eine erste Fluoreszenz strahlung aussendet.
g) Eine Population von zweiten Markierungsmolekülen, die jeweils ein zweites Antigen aufweisen, welches für die zweite Zielstruktur IgD bindungsspezi fisch ist. Die zweiten Markierungsmoleküle weisen jeweils einen zweiten op- tischen Marker auf, der an das zweite Antigen gekoppelt ist und bei Anre gung mit einer geeigneten zweiten Anregungsstrahlung eine zweite Fluo reszenzstrahlung aussendet. h) eine Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS-Puffer).
Bei einer FACS-basierten Analyse von Blutzellen wird nach der Blutentnahme die Zellzahl der zu klassifizierenden Zellen (Lymphomzellen) im Analysemedium Blut bestimmt und die benötigte Zellzahl für jede FACS-Analyse in ein Reaktionsgefäß gegeben (z.B. 1x106 Zellen pro Messung). Anschließend werden die Markierungs moleküle (ca. 0,5 pg pro Messung) und die Kalibratoren Po, PD25, PD75 hinzuge fügt und für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird das Volumen mit 2 ml Lyse-Fixierungspuffer aufgefüllt und noch einmal für 10 Minuten inkubiert. In diesem Schritt werden die Zellen nicht nur fixiert, sondern die Mehr heit der roten Blutkörperchen zum Platzen gebracht. Diese sind für die Messung nicht von Bedeutung und würden diese unter Umständen stören.
Die Proben werden zentrifugiert und der Überstand verworfen. Es wird einmal mit 2 ml PBS-Puffer (Phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend noch einmal zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen wurde, werden die Zellen in 100-200 pl PBS aufgenommen.
Das so erhaltene Analysemedium wird anschließend in einem FACS-Durch- flusszytometer analysiert. Im FACS-Durchflusszytometer wird das Analysemedium derart durch eine einen Messbereich begrenzende Düsenöffnung hindurch gelei tet, dass sowohl die mit dem Markierungsmolekül markierten Zellen als auch die unterschiedlichen Kalibratoren jeweils einzeln in den Messbereich von Laserstrah len gelangen.
Mit Hilfe des FACS-Durchflusszytometers werden für jeden in den Messbereich gelangenden Kalibrator und für jede in den Messbereich gelangende Zelle jeweils ein erster und zwei zweite Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst. Der erste Durchflusszytometrie-Messwert ist von der Fluoreszenzstrahlung abhängig, wel che mindestens ein an den betreffenden, im Messbereich befindlichen Kalibrator bzw. die betreffende, im Messbereich befindliche Zelle gebundenes Markierungs molekül aufgrund der Anregung durch den Laserstrahl abgibt. Die beiden zweiten Durchflusszytometrie-Messwerte umfassen einen Vorwärtsstreuungsmesswert und einen Seitwärtsstreuungsmesswert für die beim Auftreffen des Laserstrahls auf den betreffenden, im Messbereich befindlichen Kalibrator bzw. die betreffende, im Messbereich befindliche Zelle erzeugte Streustrahlung.
Die zweiten Durchflusszytometrie-Messwerte werden mit Referenzwerten vergli chen. In Abhängigkeit vom Ergebnis des Vergleichs lässt sich aufgrund der unter schiedlichen Streuungseigenschaften von Zellen und Kalibratoren feststellen, ob die zweiten Durchflusszytometrie-Messwerte durch Streuung des Laserstrahls an einer Zelle oder an einem Kalibrator verursacht wurden. Die unterschiedlichen Ka libratoren lassen sich anhand der Signalpegel ihrer ersten Durchflusszytometrie- Messwerte unterscheiden. Demgemäß wird in Abhängigkeit vom Ergebnis des Vergleichs der erste Durchflusszytometrie-Messwerte entweder den Zellen oder einem Kalibrator zugeordnet.
Falls es sich um einen Kalibrator handelt wird der erste Durchflusszytometrie- Messwert mit Vergleichsintervallen verglichen, welche des unterschiedlichen Ka libratorpartikel-Populationen zugeordnet sind. Somit lässt sich erste Durchflusszy- tometrie-Messwert einem Kalibrator einer bestimmten Kalibratorpartikel-Population zuordnen. Die Zuordnung kann automatisiert erfolgen, beispielsweise mittels einer geeigneten Software.
Für jede einzelne Zielstruktur (IgM bzw. IgD) werden für die einzelnen Kalibratoren Po, PD25 und PD75 die jeweiligen Mittelwerte der ersten Durchflusszytometrie- Messwerte (Fluoreszenz-Intensitäten) bestimmt. Diese bilden die Grundlage für den zur Messung genutzten Referenz-Messraum. Der erste Durchflusszytometrie- Messwert für die Kalibratoren Po dient dazu, den Hintergrund in dem Kanal zu be stimmen. Außerdem ermöglicht das erste Durchflusszytometrie-Messwert für die Kalibratoren Po eine Aussage über die Qualität der Kopplung der Antigene der Markierungsmoleküle an die ihnen jeweils zugeordnete Zielstruktur (Negativ-Kon trolle). Außerdem werden für die Zellen für jede einzelne Zielstruktur Mittelwerte der ers ten Durchflusszytometrie-Messwerte bestimmt.
Bei dem Ausführungsbeispiel werden für IgM folgende Mittelwerte für die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte ermittelt:
Erste Kalibratoren PD25 der ersten Kalibratorart: 1600
Erste Kalibratoren PD75 der ersten Kalibratorart:: 16000
Zweite Kalibratoren Po: 25
Zellen für die erste Zielstruktur: 5600
Zunächst wird das Hintergrundrauschen aus den Messwerten bereinigt. Das Hin tergrundrauschen entsteht durch unspezifische Bindungen der Antikörper der ver wendeten Markierungsmoleküle an die Festkörperpartikel der Kalibratoren bzw. an die Zellen. Dazu wird der erste Durchflusszytometrie-Messwerte der ersten Kalib ratoren Po der ersten Kalibratorart jeweils von den ersten Durchflusszytometrie- Messwerten der ersten Kalibratoren PD25 und PD75 der ersten Kalibratorart, der zweiten Kalibratoren Po und der Zellen subtrahiert. Es ergeben sich somit für IgM folgende bereinigte erste Durchflusszytometrie-Messwerte:
Erste Kalibratoren PD25 der ersten Kalibratorart: 1600 - 25 = 1575
Erste Kalibratoren PD75 der ersten Kalibratorart: 16000 - 25 = 15975
Zweite Kalibratoren Po: 25 - 25 = 0
Zellen für die erste Zielstruktur: 5600 - 25 = 5575.
Für die Kalibratoren PD25 und PD75 werden Referenzeinheiten definiert. Dem be reinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert des Kalibrators PÜ75 der ersten Kalibratorart werden 100 Referenzeinheiten zugewiesen. Somit entspricht eine Referenzeinheit einem bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert von 15975 / 100 = 159,75. Diese Zahl wird nachstehend auch als erster Skalierungs faktor bezeichnet. Der bereinigte erste Durchflusszytometrie-Messwert des Kalib- rators PD25 der ersten Kalibratorart entspricht 1575 / 159,75 = 9,86 Referenzein heiten. Aus dem bereinigte ersten Durchflusszytometrie-Messwert für die erste Zielstruktur der Zellen und dem ersten Skalierungsfaktor wird ein erster normierter Messwert gebildet: 5575 / 159,75 = 34,90 Referenzeinheiten.
Bei dem Ausführungsbeispiel werden für IgD folgende Mittelwerte für die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte ermittelt:
Erste Kalibratoren PD25 der zweiten Kalibratorart: 3103
Erste Kalibratoren PD75 der zweiten Kalibratorart:: 31030
Zweite Kalibratoren Po: 144
Zellen für die zweite Zielstruktur: 4450
Es ergeben sich somit für IgD folgende bereinigte erste Durchflusszytometrie- Messwerte:
Erste Kalibratoren PD25 der zweiten Kalibratorart: 3103 - 144 = 2959 Erste Kalibratoren PD75 der zweiten Kalibratorart: 31030 - 144 = 30886 Zweite Kalibratoren Po: 144 - 144 = 0
Zellen für die zweite Zielstruktur: 4450 - 144 = 4306.
Für die Kalibratoren PD25 und PD75 werden wiederum Referenzeinheiten definiert. Dem bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert des Kalibrators PD75 der zweiten Kalibratorart werden 100 Referenzeinheiten zugewiesen. Somit entspricht eine Referenzeinheit einem bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwert von 30886 / 100 = 308,86. Diese Zahl wird nachstehend auch als zweiter Skalierungs faktor bezeichnet. Der bereinigte erste Durchflusszytometrie-Messwert des Kalib rators PD25 der zweiten Kalibratorart entspricht 2959 / 308,86 = 9,58 Referenzein heiten. Aus dem bereinigte ersten Durchflusszytometrie-Messwert für die zweite Zielstruktur der Zellen und dem zweiten Skalierungsfaktor wird ein zweiter nor mierter Messwert gebildet: 4306 / 308,86 = 13,94 Referenzeinheiten. Durch die Zuweisung der Referenzeinheiten werden die bereinigten ersten Durch- flusszytometrie-Messwerte der Zellen von den Eigenschaften und Einstellungen des verwendeten Durchflusszytometers unabhängig und können mit entsprechen den bereinigten ersten Durchflusszytometrie-Messwerte, die mit einem Durch- flusszytometer, das anders eingestellt ist als das zuerst genannte Durchflusszyto- meter oder das andere Eigenschaften aufweist als dieses verglichen werden.
In einem späteren Schritt können bei Bedarf die auf die Referenzeinheiten bezo genen normierten Messwerte der Zellen, mit denen der Kopplungskurve (Fig. 4) in Bezug gesetzt werden. Die Kopplungskurve entspricht einer logistischen Funktion (Gauß-Lorentz Verteilung). Mit Hilfe einer„Best-Fitting“-Kurve können so aus den in Referenzeinheiten angegebenen Werten Absolutwerte bestimmt werden, die der Menge der betreffenden, auf den Zellen befindlichen Zielstruktur entsprechen.
2.1 Zubereitung von Kalibratoren mit drei CLL-charakteristischen Parametern IgM, IgD und CD19
Bei einem zweiten Ausführungsbeispiel werden für die Verwendung weiterer Para meter die Anzahl und die Kombination der einzelnen Populationen gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel erweitert. Wie für IgM und IgD beschrieben, wurde auch für das humane und rekombinant erstellte B-Lymphocyt Antigen CD19 zunächst eine Standardkurve für die effektive Intensität erstellt. Im Bezug darauf wurden die entsprechenden Mengen für die Kopplung verwendet.
Erste Kalibratoren:
a) IgM-Kalibratoren : PD25 - IgM Konzentration Int25
PD75 - IgM Konzentration Int s
b) IgD-Kalibratoren: PD25 - IgD Konzentration Int25
PD75 - IgD Konzentration Int75
c) CD19-Kalibratoren: PD25 - CD19 Konzentration Int25
PD75 - CD19 Konzentration Int75 d) IgM- und IgD- Kalibratoren: Pmd - IgM und IgD Konzentration Int s e) CD19- und IgM-Kalibratoren: PcDi 9/m - CD19 und IgM Konzentration
I nt75
f) CD19- und IgD-Kalibratoren: PcDi9/d - CD19 und IgD Konzentration
I nt75
Zweite Kalibratoren: Po - weder IgM noch IgD noch CD19
Dieses Verfahren lässt sich auf eine beliebige Anzahl von Parametern erweitern und variieren.
2.2 Schematische Darstellung des Immunoprofilings mittels Kalibratorpar- tikeln
Die zu klassifizierenden Zellen und die Kalibratorpartikel werden simultan im Durchflusszytometer vermessen und analysiert. Wie in Fig. 5 zu sehen ist, erfolgt in einem ersten Schritt die Auftrennung der Messsignale der Zellen und der Mess signale der Kalibratorpartikel nach den Parametern Größe und Granularität. Dabei wird die Größe durch Vorwärtsstreuungs-Messwerte (FSC) des des Energiestrahls und die Granularität durch Seitwärtsstreuungs-Messwerte (SSC) des Energie strahls repräsentiert. In dieser Phase erfolgt die Auswahl (gating) der zu analysie renden Zellen und der Kalibratorpartikel. Die Messwerte der ausgewählten Zellen (Zell-Populationen) sind in Fig. 5 durch ein erstes Oval 1 und die Messwerte der ausgewählten Kalibratoren (Kalibrator-Populationen) durch ein zweites Oval 2 um grenzt.
Diese Populationen können jetzt zusammen für die verschiedenen Parameter (Farbkanäle) analysiert werden. Dabei bilden die Kalibratorpartikel für jeden Kanal ein Referenz Raster. In den Fig. 6 bis 9 ist die exemplarische Analyse von drei Pa rametern (IgM, IgD und CD19) graphisch dargestellt, wobei
- l(lgM) die für IgM gemessene mittlere Intensität, - l(lgD) die für IgD gemessene mittlere Intensität und
- I(CD19) die für das Antigen CD19 gemessene mittlere Intensität der Fluoreszenzstrahlung bedeuten. Die Messwerte der ersten Population von ers ten Kalibratoren PD25 - IgM der ersten Kalibratorart sind mit der Bezugsziffer 3, die Messwerte der zweiten Population von ersten Kalibratoren PD75 - IgM der ers ten Kalibratorart mit der Bezugsziffer 4, die Messwerte der ersten Population von ersten Kalibratoren PD25 - IgD der zweiten Kalibratorart mit der Bezugsziffer 5, die Messwerte der zweiten Population von ersten Kalibratoren PD75 - IgD der zweiten Kalibratorart mit der Bezugsziffer 6 und die Messwerte der Population von zweiten Kalibratoren Po sind mit der Bezugsziffer 7 bezeichnet. Die Messwerte der Kalibra toren PD25 - CD19 sind mit der Bezugsziffer 8, die Messwerte der Kalibratoren PD75 - CD19 mit der Bezugsziffer 9, die Messwerte der Kalibratoren Pmd - IgM und IgD mit der Bezugsziffer 10, die Messwerte der Kalibratoren PcDi9/m - CD19 und IgM mit der Bezugsziffer 1 1 und die Messwerte der Kalibratoren PcDi9/d - CD19 und IgD mit der Bezugsziffer 12 bezeichnet.
Die Kalibratorpartikel erfüllen mehrere Zwecke:
1 . Positiv- und Negativkontrollen für die Färbeeigenschaften der einge setzten Detektionsantikörper unter identischen Bedingungen im Ver gleich zu den Zellen.
2. Definition und Standardisierung des Messraumes, womit
i) eine Unabhängigkeit von bestimmten Geräten und oder Fier stellern erreicht wird,
ii) ein Profil der zu analysierenden Zellen bezüglich der zu Ana lysierenden Parameter (im Beispiel, IgM, IgD, CD19) erstellt werden kann, und
iii) die Grundlage für eine automatisierte Analyse gelegt wird. In Bezug auf den so definierten und standardisierten multiparametrischen Mess- raum (Fig. 9) werden die Werte der Zellen normiert und können an Hand ihrer ent stehenden Profile zu Gruppen oder Clustern zusammengefasst werden. Dieses Clustering ist die Basis die Erstellung eines Antigenprofils der zu analysierenden Zellen.
In Fig. 10 ist das Ergebnis der Clusteranalyse graphisch dargestellt. Jeder Kreis repräsentiert eine geclusterte Subpopulation, wobei der Durchmesser des Kreises ein Maß für die Anzahl der zu der betreffenden Subpopulation gehörenden Mess- werte ist im Verhältnis zur Gesamtzahl der Messwerte ist. Die Angaben beziehen sich auf die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) einer Ausgangspopulation, die durch den Kreis mit dem größten Durchmesser markiert ist. Diese Ausgangspopu lation hat für CD19, IgM und IgD MFI-Werte X, Y und Z. Die anderen Subpopulati onen haben einen entsprechenden veränderten MFI-Wert. Wenn also der Wert der Ausgangspopulation X= 1000 wäre, dann hätte ein Cluster mit X+200 einen MFI von 1200 für den betreffenden Parameter.

Claims

Patentansprüche
1. Durchflusszytometrie-Messverfahren, bei dem ein Analysemedium bereitge stellt wird, welches ein Fluid und darin enthaltene, zu klassifizierende biolo gische Zellen aufweist, wobei mindestens ein Markierungsmolekül bereitge stellt und derart mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass das Markierungsmolekül spezifisch an mindestens eine an der Oberfläche der Zellen befindliche Zielstruktur binden kann, wenn die Zelle diese Ziel struktur aufweist, wobei ein Fluidstrom des Analysemediums erzeugt wird, in dem die Zellen einzeln in einen Messbereich eines Energiestrahls und/o der eines elektrischen Felds gelangen, wobei für die einzelnen, in dem Messbereich befindlichen Zellen jeweils zumindest für einen ersten physika lischen Parameter ein erster und für einen zweiten physikalischen Parame ter ein zweiter Durchflusszytometrie-Messwert erfasst werden, wobei zu mindest der erste Parameter eine Fluoreszenzstrahlung ist, welche das mindestens eine Markierungsmolekül bei Anregung mit dem Energiestrahl oder dem elektrischen Feld abgibt, und wobei die Zellen anhand der Durch- flusszytometrie-Messwerte klassifiziert werden, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein erster und mindestens ein zweiter Kalibrator bereitge stellt werden, die jeweils einen Festkörperpartikel aus einem nicht wasser löslichen, anorganischen und/oder polymeren Material aufweisen, dass die Festkörperpartikel des mindestens einen ersten und des mindestens einen zweiten Kalibrators bezüglich ihrer Form, ihrer Größe und ihres Materials übereinstimmen, dass der mindestens eine erste Kalibrator an seiner Ober fläche mindestens eine Zielstruktur aufweist, die mit der mindestens einen Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörperpartikel des ersten Kalibrators immobilisiert ist, dass der mindestens eine zweite Kalib rator diese Zielstruktur nicht aufweist, dass der mindestens eine erste und der mindestens eine zweite Kalibrator mit dem Analysemedium vermischt werden, bevor die Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst werden, derart, dass mindestens ein in dem Analysemedium befindliches Markierungsmole kül an die mindestens eine Zielstruktur des ersten Kalibrators bindet, dass die Kalibratoren in dem Fluidstrom einzeln nacheinander in den Messbe reich eingebracht werden, dass für den mindestens einen ersten und den mindestens einen zweiten Kalibrator entsprechende erste und zweite Durchflusszytometrie-Messwerte erfasst werden wie für die Zellen, dass der dem zweiten Durchflusszytometrie-Messwert der Zellen und dem zweiten Durchflusszytometrie-Messwert der Kalibratoren zugeordnete Parameter derart gewählt wird, dass sich die Kalibratoren anhand der zweiten Mess werte von den Zellen unterscheiden lassen, und dass aus dem mindestens einen ersten Durchflusszytometrie-Messwert des mindestens einen ersten Kalibrators, dem mindestens einen ersten Durchflusszytometrie-Messwert des mindestens einen zweiten Kalibrators und dem ersten Durchflusszyto metrie-Messwert mindestens einer Zelle ein normalisierter erster Durch flusszytometrie-Messwert für die mindestens eine Zelle gebildet wird.
2. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekenn zeichnet, dass zur Bildung des normalisierten ersten Durchflusszytometrie- Messwerts die Differenz zwischen dem ersten Durchflusszytometrie-Mess wert des ersten Kalibrators und dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert des zweiten Kalibrators zur Differenz zwischen dem ersten Durchflusszyto metrie-Messwert der Zelle und dem ersten Durchflusszytometrie-Messwert des zweiten Kalibrators ins Verhältnis gesetzt wird.
3. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, dass mehrere identische erste Kalibratoren und mehrere identische zweite Kalibratoren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt werden, bevor die Durchflusszytometrie-Messwerte für die einzel nen erfasst werden, dass aus den ersten Durchflusszytometrie-Messwerten der ersten Kalibratoren ein gemittelter erster Durchflusszytometrie-Mess wert für die ersten Kalibratoren und aus den ersten Durchflusszytometrie- Messwerten der zweiten Kalibratoren ein gemittelter erster Durchflusszyto metrie-Messwert für die zweiten Kalibratoren gebildet wird, und dass zur Bildung des normalisierten ersten Messwerts einer Zelle die Differenz zwi schen dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Messwert der ersten Kalibratoren und dem gemittelten ersten Durchflusszytometrie-Messwert der zweiten Kalibratoren zur Differenz zwischen dem ersten Durchflusszyto metrie-Messwert der Zelle und dem gemittelten ersten Durchflusszytomet rie-Messwert der zweiten Kalibratoren ins Verhältnis gesetzt wird.
4. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass für den mindestens einen ersten Kalibrator ein erster Kalibrierfaktor bereitgestellt wird, der bezüglich des Messignals für den ersten Parameter dem Verhältnis zwischen der Messsignalstärke des ersten Kalibrators und der Messsignalstärke eines die Zielstruktur auf weisenden ersten Referenz-Kalibrators entspricht, dass für den ersten phy sikalischen Parameter des ersten Kalibrators ein erstes Messsignal erfasst wird und der erste Durchflusszytometrie-Messwert des ersten Kalibrators aus dem ersten Messsignal und dem ersten Kalibrierfaktor gebildet wird, dass für den zweiten Kalibrator ein zweiter Kalibrierfaktor bereitgestellt wird, der bezüglich des Messignals für den ersten Parameter dem Verhältnis zwi schen der Messsignalstärke des zweiten Kalibrators und der Messsignal stärke eines die Zielstruktur nicht aufweisenden zweiten Referenz-Kalibra tors entspricht, und dass für den ersten physikalischen Parameter des zwei ten Kalibrators ein zweites Messsignal erfasst wird und der erste Durch flusszytometrie-Messwert des zweiten Kalibrators aus dem zweiten Mess signal und dem zweiten Kalibrierfaktor gebildet wird.
5. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibratoren bereitgestellt und mit dem Analysemedium vermischt werden, dass sich die Kalibratoren der unterschiedlichen Kalibratorarten insbeson dere hinsichtlich der Flächenbelegungsdichte und/oder der Anordnung ihrer mindestens einen Zielstruktur auf der Oberfläche des Festkörperpartikels derart voneinander unterscheiden, dass die ersten Durchflusszytometrie- Messwerte einer ersten Kalibratorart eine Signalstärke aufweisen, die grö ßer ist als die Signalstärke der ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der zweiten Kalibratoren und kleiner ist als die Signalstärke der ersten Durch- flusszytometrie-Messwerte einer zweiten Kalibratorart.
6. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, dass in dem Fluid mindestens zwei unterschiedliche Populationen von Zellen enthalten sind, die sich derart voneinander unterscheiden, dass die ersten Durchflusszytometrie-Messwerte der Zellen einer ersten Popula tion in einem ersten Signalstärkebereich und die die ersten Durchflusszyto metrie-Messwerte der Zellen einer zweiten Population in einem außerhalb des ersten Signalstärkebereichs befindlichen zweiten Signalstärkebereich liegen, und dass die Signalstärke der ersten Durchflusszytometrie-Mess werte der ersten Kalibratorart derart gewählt wird, dass sie zwischen dem ersten und zweiten Signalstärkebereich liegt.
7. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die größte Abmessung der Festkörperparti kel kleiner als 20 miti, insbesondere kleiner als 15 pm und bevorzugt kleiner als 10 pm ist und/oder dass die kleinste Abmessung der Festkörperpartikel größer als 4 pm, insbesondere größer als 5 pm und bevorzugt größer als
6 pm ist.
8. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der Festkörperpartikel Polysty- ren, Melamin, Latex oder ein Silikat ist.
9. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine zweite Durchflusszyto- metrie-Messwert einen Vorwärtsstreuungs-Messwert für eine in dem Mess bereich auftretende Vorwärtsstreuung des Energiestrahls und/oder einen Seitwärtsstreuungs-Messwert für eine in dem Messbereich auftretende Seit wärtsstreuung des Energiestrahls umfasst.
10. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl für die Zellen als auch für die ersten und zweiten Kalibratoren jeweils für mehrere Messkanäle mindestens ein erster Durchflusszytometrie-Messwert erfasst wird, dass zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedlichen Mar kierungsmolekülen bereitgestellt und mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, und dass der mindestens eine erste Kalibrator wenigstens zwei und insbesondere zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entspre chende Anzahl von Zielstrukturen aufweist, die jeweils spezifisch an eines der unterschiedlichen Markierungsmoleküle binden, wenn sie mit dem be treffenden Markierungsmolekül in Kontakt gelangen.
11. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl für die Zellen als auch für die ersten und zweiten Kalibratoren jeweils für mehrere Messkanäle mindestens ein erster Durchflusszytometrie-Messwert erfasst wird, dass zumindest eine der Anzahl der Messkanäle entsprechende Anzahl von unterschiedlichen Mar kierungsmolekülen bereitgestellt und mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird, dass mindestens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibrato ren bereitgestellt werden, dass mindestens ein erster Kalibrator einer ersten Kalibratorart an seiner Oberfläche mindestens eine erste Zielstruktur auf weist, die mit mindestens einer ersten Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörperpartikel dieses Kalibrators immobilisiert ist, dass mindestens ein erster Kalibrator einer zweiten Kalibratorart an seiner Ober fläche mindestens eine zweite Zielstruktur aufweist, die mit mindestens ei ner zweiten Zielstruktur der Zellen übereinstimmt und auf dem Festkörper partikel dieses Kalibrators immobilisiert ist, und dass der mindestens eine erste Kalibrator der ersten Kalibratorart an seiner Oberfläche die zweite Zielstruktur und der mindestens eine erste Kalibrator der zweiten Kalibrator art an seiner Oberfläche die erste Zielstruktur nicht aufweist.
12. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zielstruktur auf den ersten Kalibratoren mindestens ein Antigen aufweist, das vorzugsweise ein mindestens ein Pro tein und/oder mindestens ein Peptid und/oder mindestens einen Rezeptor und/oder mindestens ein Allergen und/oder mindestens ein glykosyliertes Protein und/oder mindestens ein Liposaccharid und/oder mindestens ein Oligosacharide und/oder mindestens ein Polysaccharid und/oder mindes tens eine Nukleinsäuren und/oder mindestens ein Fragmente und/oder De rivate der vorgenannten Substanzen umfasst.
13. Durchflusszytometrie-Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielstruktur des mindestens einen ersten Kalibrators über mindestens eine aktivierte Carboxy-Gruppen und/oder min destens eine aktivierte NFte-Gruppe am Festköperpartikel des ersten Kalib rators immobilisiert ist.
14. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 , umfassend
mindestens einen ersten Kalibrator, der einen ersten Festkörperparti kel aus einem nicht wasserlöslichen, anorganischen und/oder poly meren Material aufweist, wobei der erste Kalibrator an seiner Ober fläche mindestens eine auf dem ersten Festkörperpartikel immobili sierte Zielstruktur hat,
mindestens einen zweiten Kalibrator, der einen mit dem ersten Fest körperpartikel bezüglich Form, Größe und Material übereinstimmen den zweiten Festkörperpartikel aufweist, wobei der zweite Kalibrator an seiner Oberfläche die Zielstruktur nicht aufweist, und mindestens ein für die Zielstruktur bindungsspezifisches Markie rungsmolekül.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit mindestens ei nen Datenträger umfasst, auf dem für den mindestens einen ersten Kalibra tor ein erster Kalibrierfaktor und/oder für den mindestens einen zweiten Ka librator ein zweiter Kalibrierfaktor gespeichert ist.
16. Kit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit min destens zwei Kalibratorarten von ersten Kalibratoren aufweist, dass sich die Kalibratoren der unterschiedlichen Kalibratorarten insbesondere hinsichtlich der Flächenbelegungsdichte und/oder der Anordnung ihrer mindestens ei- nen Zielstruktur auf der Oberfläche des Festkörperpartikels derart vonei nander unterscheiden, dass sie bei einer Durchflusszytometrie-Messung Messsignale mit unterschiedlicher Signalstärke erzeugen, wenn ihre Ziel strukturen mit dem Markierungsmolekül markiert sind.
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