JP2022530733A - フローサイトメトリー測定法およびそれを実施するためのキット - Google Patents

フローサイトメトリー測定法およびそれを実施するためのキット Download PDF

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Abstract

フローサイトメトリー測定法において、流体とそれに含まれる生体細胞とを有する分析媒体を準備する。マーカー分子を準備し、細胞が標的構造を有する場合に、マーカー分子が細胞の表面上にある標的構造に特異的に結合することができるように分析媒体と接触させる。個々の細胞について、第１および第２の物理的パラメーターに対するフローサイトメトリー測定値を記録する。第１のパラメーターは、マーカー分子が励起時に発する蛍光放射である。細胞をフローサイトメトリー測定値に基づいて分類する。形態、サイズおよび材料に関して一致した固体粒子を有する第１および第２のキャリブレーターを準備する。第１のキャリブレーターの表面に、細胞の標的構造と一致した標的構造が固定化される。第２のキャリブレーターは、この標的構造を有しない。フローサイトメトリー測定値を記録する前にキャリブレーターを分析媒体と混合する。キャリブレーターについて、細胞と同様に対応する第１および第２のフローサイトメトリー測定値を記録する。第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値、第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値、および細胞の第１のフローサイトメトリー測定値から、細胞について正規化された第１のフローサイトメトリー測定値が生成される。

Description

本発明は、流体とそれに含まれる分類すべき生体細胞とを有する分析媒体を準備し、少なくとも１つのマーカー分子を準備し、細胞が標的構造を有する場合に、マーカー分子が細胞の表面上にある少なくとも１つの標的構造に特異的に結合することができるように分析媒体と接触させ、細胞が個々にエネルギー光線および／または電場の測定領域に到達する分析媒体の流体流を生じさせ、測定領域内にある個々の細胞について、それぞれ少なくとも第１の物理的パラメーターに対する第１のフローサイトメトリー測定値および第２の物理的パラメーターに対する第２のフローサイトメトリー測定値が記録され、少なくとも第１のパラメーターが、少なくとも１つのマーカー分子がエネルギー光線または電場によって励起された場合に発する蛍光放射であり、細胞がフローサイトメトリー測定値に基づいて分類される、フローサイトメトリー測定法に関する。加えて、本発明は上記方法を実施するためのキットに関する。
フローサイトメトリー（サイトメトリー：細胞測定）という用語は、生物学および医学において用いられる測定法を表す。これにより、個々に電場または光線を高速で通過する生体細胞の分析が可能となる。細胞の形態、構造および／または色に応じて異なるフローサイトメトリー測定値が記録され、それから個々の細胞の特性を導き出すことで、細胞を分類することができる。
フローサイトメトリーの一形態では、蛍光標識された細胞が色に応じて異なる試薬容器に選別される。対応する装置は、フローソーターまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）と称される。ＦＡＣＳ（＝蛍光活性化細胞スキャニング）という用語が、細胞の選別ではなく、細胞の特性の分析または分類のみを実施する装置に対して、この意味で使用されることがある。
この検査の原理は、レーザー光線を通過する際の細胞による光信号の放出に基づく。サンプルはシース流によって集束されて、ガラスまたは石英製の高精度キュベットのマイクロチャネル内に入り、各細胞が個々にレーザー光線の測定領域を通って次々に導かれる。その際に生じる散乱光または蛍光信号は、検出器によって記録される。これにより細胞１つ１つに関する定量的情報が得られる。多数の細胞を非常に短い時間間隔（＞１０００細胞／秒）で分析することによって、分析媒体に含まれる細胞集団に関する代表的な情報が迅速に得られる。
フローサイトメーターでは、散乱光と同時に蛍光色素を測定することができる。それ自体が蛍光を発する細胞はごく僅かである。したがって、例えば細胞の特定の標的構造に結合する色素のようなマーカー分子が使用される。例えば、細胞のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に結合する（ＤＡＰＩ）か、またはそれに挿入され、すなわち塩基間に沈着する（ヨウ化プロピジウム）、色素ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドールジヒドロクロリド）およびヨウ化プロピジウムを使用することで、細胞に固定化された少なくとも１つのマーカー分子がレーザー光線を通過する際に発する蛍光放射の明るさに基づいて、細胞が含有するＤＮＡの量を検査することができる。
蛍光色素で標識された抗体もマーカー分子として使用することができる。抗体は、主に特定の表面タンパク質、例えばＣＤ分類（ＣＤ：分化抗原群）のタンパク質に対するものである。この場合、標識後に必要に応じて、これらの特徴に従って細胞の選別を行うこともできる。様々な色のレーザーおよび特にフィルターを用いることで、使用可能な色素の数、ひいては情報密度を高めることができる。その際、抗体が細胞上の表面タンパク質を標識するために最もよく使用される分子である。マーカー分子は、少なくとも１つの光学マーカーで標識された抗体、および／または分析媒体に含まれる細胞、例えば癌細胞の表面上にある標的構造に特異的に結合し、細胞を光学的に標識するのに適した他の分子と理解される。
フローサイトメーターは、蛍光標識された細胞の場合に、標識された細胞の数の測定と個々の細胞が発した蛍光信号の測定値の記録との両方を可能にするが、測定に使用されるフローサイトメーターが様々であり、異なるフローサイトメーターで行われた測定では、フローサイトメトリー測定値の比較可能性が保証されないため、蛍光信号の定量的評価は困難である。特に、フローサイトメトリー測定値は、測定領域の照射に使用されるレーザー光線の強度、光学フィルターの許容誤差、フロー測定セル（流体）の構成、使用される試薬、検出器、およびマーカー分子を含有するサンプルの変動性によって影響を受ける。
第１のフローサイトメトリー測定値と閾値との比較により細胞の蛍光測定値の定量化が可能であるが、閾値は大抵の場合、任意に設定される。細胞当たりの結合事象の正確な定量化、ひいては蛍光測定値のプラットフォームに依存しない普遍的な比較可能性は、これまで不可能であった。
エネルギー光線または電場の測定領域を通って導かれる流体中に配置された蛍光微粒子を用いてフローサイトメトリー測定装置を較正することも既知である。しかしながら、この較正が、様々なフローサイトメーターで測定された蛍光測定値の正確な比較を可能にするには不十分であることが明らかになった。
したがって、本発明の課題は、細胞の表面上の標的構造を非常に正確に定量的に検出することを可能にする冒頭で述べたタイプのフローサイトメトリー測定法を提供することである。加えて、蛍光測定によって得られた定量的測定値は、様々なフローサイトメーターで測定されたものである場合に互いに正確に比較可能であることが望ましい（参照／正規化）。本発明の更なる課題は、上記方法を実施するためのキットを提供することである。
フローサイトメトリー測定法に関して、この課題は、請求項１の特徴によって解決される。この点で、本発明によると、流体とそれに含まれる分類すべき生体細胞とを有する分析媒体を準備し、少なくとも１つのマーカー分子を準備し、細胞が標的構造を有する場合に、マーカー分子が細胞の表面上にある少なくとも１つの標的構造に特異的に結合することができるように分析媒体と接触させ、細胞が個々にエネルギー光線および／または電場の測定領域に到達する分析媒体の流体流を生じさせ、測定領域内にある個々の細胞について、それぞれ少なくとも第１の物理的パラメーターに対する第１のフローサイトメトリー測定値および第２の物理的パラメーターに対する第２のフローサイトメトリー測定値が記録され、少なくとも第１のパラメーターが、少なくとも１つのマーカー分子がエネルギー光線または電場によって励起された場合に発する蛍光放射であり、細胞がこのフローサイトメトリー測定値に基づいて分類され、非水溶性、無機かつ／または高分子の材料から構成される固体粒子をそれぞれが有する、少なくとも１つの第１のキャリブレーターおよび少なくとも１つの第２のキャリブレーターを準備し、少なくとも１つの第１のキャリブレーターと少なくとも１つの第２のキャリブレーターの固体粒子とが形態、サイズおよび材料に関して一致しており、少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、細胞の少なくとも１つの標的構造と一致しかつ第１のキャリブレーターの固体粒子に固定化された少なくとも１つの標的構造を表面上に有し、少なくとも１つの第２のキャリブレーターが標的構造を有さず、少なくとも１つの第１のキャリブレーターおよび少なくとも１つの第２のキャリブレーターを、フローサイトメトリー測定値を記録する前に、分析媒体中にある少なくとも１つのマーカー分子が第１のキャリブレーターの少なくとも１つの標的構造に結合するように分析媒体と混合し、流体流中のキャリブレーターが個々に測定領域に次々に導入され、少なくとも１つの第１のキャリブレーターおよび少なくとも１つの第２のキャリブレーターについて、細胞と同様に対応する第１および第２のフローサイトメトリー測定値が記録され、細胞の第２のフローサイトメトリー測定値およびキャリブレーターの第２のフローサイトメトリー測定値に割り当てられたパラメーターが、キャリブレーターを第２の測定値に基づいて細胞と区別することができるように選択され、少なくとも１つの第１のキャリブレーターの少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値、少なくとも１つの第２のキャリブレーターの少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値、および少なくとも１つの細胞の第１のフローサイトメトリー測定値から、少なくとも１つの細胞について正規化された第１のフローサイトメトリー測定値が生成される、フローサイトメトリー測定法が提供される。
本発明は、細胞の標的構造へのマーカー分子の結合の検出に使用される試薬の許容誤差、マーカー分子の変動性、および分析媒体の組成が、分類すべき細胞のフローサイトメトリー測定値に大きな影響を与えるという認識に基づく。この許容誤差は、特にマーカー分子の古さ、方法、フローサイトメトリー測定法の実施前にマーカー分子をどのように、またどのような条件下で保存したか、および標的構造へのマーカー分子の結合を困難にするか、またはマーカー分子の代わりに標的構造に結合する、細胞の他に分析媒体に含まれる物質、例えば阻害剤によって影響を受ける。加えて、例えば温度等の環境条件も細胞のフローサイトメトリー測定値に影響を及ぼす可能性がある。
本発明による方法では、これらの影響は、標準化された第１および第２のキャリブレーターを準備すること、細胞と同様にこれらのキャリブレーターについて対応するフローサイトメトリー測定値を記録すること、ならびに細胞について測定されたフローサイトメトリー測定値をキャリブレーターのフローサイトメトリー測定値を用いて正規化することによって補償される。これにより、個々の細胞とマーカー分子またはその抗体との間に生じる結合事象の細胞当たりの正確な定量化が可能となる。正規化されたフローサイトメトリー測定値は、フローサイトメトリー測定を異なるフローサイトメーターを用いて実施するか、かつ／または特性に関して互いに異なる試薬もしくはマーカー分子を使用した場合であっても互いに正確に比較することができる。これにより、特にクラスター分析によって互いに密接に関係する細胞の部分集団を特定することが可能となる。キャリブレーターは生細胞ではなく、少なくとも１つの標的構造のキャリアとして固体粒子を有するため、キャリブレーターは長時間安定であり、すなわち、標的構造の検出に関連する特性が大幅に変化することなく長時間にわたって保存することができる。
各分析のパラメーター空間は、細胞当たりの最大結合事象の数および測定パラメーターに依存する。すなわち、例えば３つのパラメーターを決定する際に三次元空間が生じるが、その軸は必ずしも互いに直角になるとは限らない。この場合、マーカーのタイプおよびマーカーの密度（抗体当たりのフルオロフォアの数）、ならびに使用される抗体（またはマーカー分子）の結合強度および特異性も同様に役割を果たす。
本発明による方法では、細胞について正規化されたフローサイトメトリー測定値が得られるが、これは方法の実施に使用されるフローサイトメーターの物理的特性から独立し、使用される試薬およびマーカー分子の許容誤差から独立し、かつ細胞の他に分析媒体に含まれ得る物質および作用物質から独立している。
本発明の有利な実施形態では、正規化された第１のフローサイトメトリー測定値を生成するために、第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値と第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値との間の差を、細胞の第１のフローサイトメトリー測定値と第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値との間の差に対して関連付ける。その際、細胞の正規化されたフローサイトメトリー測定値は、好ましくは１００％となり、細胞の第１のフローサイトメトリー測定値が第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値と一致する。細胞の第１のフローサイトメトリー測定値が第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値と一致する場合、細胞の正規化されたフローサイトメトリー測定値は、ゼロの値をとる。第１のキャリブレーターは、好ましくは、少なくとも１つの第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値が、細胞の第１のフローサイトメトリー測定値の期待される最大値と一致するか、または期待される第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値を幾らか、特に最大で３％、最大で５％、最大で１０％または最大で２５％上回るように設計される。対応する期待値は、実験的に求めることができる。
本発明の好ましい形態では、複数の同一の第１のキャリブレーターおよび複数の同一の第２のキャリブレーターを準備し、個々についてのフローサイトメトリー測定値を記録する前に分析媒体と混合し、第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値から、第１のキャリブレーターについての平均された第１のフローサイトメトリー測定値が生成されるとともに、第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値から、第２のキャリブレーターについての平均された第１のフローサイトメトリー測定値が生成され、
－細胞の正規化された第１の測定値を生成するために、第１のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値と第２のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の差を、細胞の第１のフローサイトメトリー測定値と第２のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の差に対して関連付けるか、
または
－複数の細胞を含む細胞集団についての正規化された第１の測定値を生成するために、それぞれ個々の細胞について第１のフローサイトメトリー測定値を記録し、このフローサイトメトリー測定値から、細胞集団についての平均された第１のフローサイトメトリー測定値を生成し、複数の細胞についての正規化された第１の測定値を生成するために、
ａ）第１のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値と第２のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の差を、細胞集団の第１の平均されたフローサイトメトリー測定値と第２のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の差に対して関連付けるか、もしくは
ｂ）平均された第１のフローサイトメトリー測定値とキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の商を、所定の信号強度を有する信号、特に１００％の信号に対して生成する。
その際、平均値は、それ自体が既知の統計的方法を用いて決定することができ、特に算術平均値とすることができる。必要に応じて、正規化された第１の測定値をさらにスケーリングすることができ、スケーリング係数は、例えば第１のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値と数値１００との商に相当し得る。
本発明の発展形態では、少なくとも１つの第１のキャリブレーターに対し、第１のパラメーターについての測定信号に関して第１のキャリブレーターの測定信号強度と標的構造を有する第１の参照キャリブレーターの測定信号強度との間の比率に相当する第１の較正係数を準備し、第１のキャリブレーターの第１の物理的パラメーターについて第１の測定信号を記録するとともに、第１の測定信号および第１の較正係数から第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値を生成し、第２のキャリブレーターに対し、第１のパラメーターについての測定信号に関して第２のキャリブレーターの測定信号強度と標的構造を有しない第２の参照キャリブレーターの測定信号強度との間の比率に相当する第２の較正係数を準備し、第２のキャリブレーターの第１の物理的パラメーターについて第２の測定信号を記録するとともに、第２の測定信号および第２の較正係数から第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値を生成する。
較正係数によって、第１のキャリブレーターおよび／または第２のキャリブレーターの様々な互いに異なるバッチを用いて実施したフローサイトメトリーの測定値をさらに正確に互いに比較することが可能である。較正係数は、好ましくは正確に定義された条件下で実験的に測定される。
ここで、初めに第１のバッチにおいて生成される第１および第２の参照キャリブレーターについて、それぞれ第１のフローサイトメトリー測定値の期待値が決定される。その際、分析媒体の代わりに、第１または第２の参照キャリブレーターが配置された、定義された一定の特性を有するバッファーが使用される。生体細胞はバッファーに含まれない。このバッファーでは、多数の同じまたは本質的に同じ第１または第２の参照キャリブレーターについて、それぞれ対応する第１のフローサイトメトリー測定値が測定される。このようにして得られる参照フローサイトメトリー測定値から、それ自体が既知の統計的方法を用いて、第１および第２の参照キャリブレーターのそれぞれについて期待値を決定する。
更なる工程では、第２のバッチの第１および第２のキャリブレーターについて同様に期待値を決定する。
その後、第２のバッチの第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値の期待値と第１の参照キャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値の期待値とから商を生成することによって第１の較正係数を求める。同様に、第２のバッチの第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値の期待値と第２の参照キャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値の期待値とから商を生成することによって第２の較正係数を求める。
本発明の有利な実施形態では、少なくとも２つのキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターを準備し、分析媒体と混合するが、異なるキャリブレータータイプのキャリブレーターは、特に固体粒子の表面上の少なくとも１つの標的構造の面積占有密度および／または配置に関して、第１のキャリブレータータイプの第１のフローサイトメトリー測定値が、第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値の信号強度よりも大きく、かつ第２のキャリブレータータイプの第１のフローサイトメトリー測定値の信号強度よりも小さい信号強度を有するように互いに異なる。これにより、フローサイトメトリー測定値を記録する際の非線形の信号の推移の影響を補償することができる。
第１の集団の細胞の第１のフローサイトメトリー測定値が第１の信号強度範囲内にあり、第２の集団の細胞の第１のフローサイトメトリー測定値が、第１の信号強度範囲外の第２の信号強度範囲内にあるように互いに異なる、少なくとも２つの異なる細胞の集団が流体に含まれる場合、および第１のキャリブレータータイプの第１のフローサイトメトリー測定値の信号強度が、第１の信号強度範囲と第２の信号強度範囲との間にあるように選択される場合が有利である。この場合、第１のキャリブレータータイプのキャリブレーターは、２つの部分集団の参照範囲を互いに区別することを可能にする信号強度を生じる。すなわち、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値よりも小さい第１のフローサイトメトリー測定値を有する細胞は、第１の集団に属し、より高いフローサイトメトリー測定値を有する細胞は、第２の集団に属する。
本発明の好ましい形態では、固体粒子の最大寸法は２０μｍ未満、特に１５μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満であり、かつ／または固体粒子の最小寸法は４μｍ超、特に５μｍ超、好ましくは６μｍ超である。適切な固体粒子は、例えば直径６～１０μｍのマイクロスフェアである。固体粒子は、好ましくは分析媒体中にある細胞と同様のサイズを有する。
固体粒子は、好ましくは合成微粒子である。固体粒子はポリスチレン、メラミン、ラテックスおよび／もしくはケイ酸塩を含むか、またはこれらの材料の１つからなるものであり得る。
マーカー分子は、細胞またはキャリブレーターの表面上の標的抗原に結合し、続いてこの標的抗原の検出に使用することができる分子であり得る。かかる分子は、例えば抗体およびその断片、レクチン、他の結合タンパク質（例えばプロテインＡ）である。
第１のキャリブレーター上の標的抗原は、好ましくは共有結合によって固定化されている。かかる共有結合を生じさせる方法は、従来技術で既知であり、例えばアミン（架橋剤による）、チオール、エポキシド、アルデヒド、マレインイミドおよび他の基への結合を含む。適切な方法およびその化学変換は、専門文献に記載されている（Bioconjugate Techniques, Third Edition 3rd edition by Hermanson, Greg T. (2013)）。しかし、非共有結合的な方法、例えばＨｉｓタグ、ビオチン－ストレプトアビジン、プロテインＧ、プロテインＡ、固定化済みの抗体を用いることもできる。
第１のキャリブレーター上の標的抗原または標的構造は、例えばタンパク質、ペプチド、受容体、アレルゲン、グリコシル化タンパク質、リポ糖、オリゴ糖および多糖、核酸、ならびに上述の物質の断片および誘導体であり得る。
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの第２のフローサイトメトリー測定値は、測定領域内で生じるエネルギー光線の前方散乱の前方散乱測定値および／または測定領域内で生じるエネルギー光線の側方散乱の側方散乱測定値を含む。これらの測定値は、適切なセンサーを用いて単純な方法で記録することができる。前方散乱測定値は、サイズの尺度であり、側方散乱測定値は、細胞またはキャリブレーターの粒度の尺度である。これらの測定量に基づいて細胞とキャリブレーターとを区別することができる。これにより、測定されたフローサイトメトリー測定値を、前方および側方散乱測定値に基づいて細胞およびキャリブレーターに明確に割り当てることができる。
しかしながら、少なくとも１つの第２のフローサイトメトリー測定値が、第１のフローサイトメトリー測定値の蛍光放射とは異なる、マーカー分子が発する蛍光放射の蛍光測定値であることも可能である。その際、好ましくは、第１および第２のフローサイトメトリー測定値の蛍光放射の波長は異なる。
細胞と第１および第２のキャリブレーターとの両方について、それぞれ複数の測定チャネルに対して少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値が記録される場合、測定チャネルの数に対応する数の異なるマーカー分子の少なくとも２つ、特に少なくとも１つを準備し、分析媒体と接触させる場合、ならびに少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、それぞれが当該のマーカー分子と接触したときに異なるマーカー分子の１つに特異的に結合する、測定チャネルの数に対応する数の標的構造の少なくとも１つを有する場合が有利である。
しかしながら、細胞と第１および第２のキャリブレーターとの両方について、それぞれ複数の測定チャネルに対して少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値が記録されること、測定チャネルの数に対応する数の異なるマーカー分子の少なくとも１つを準備し、分析媒体と接触させること、少なくとも２つのキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターを準備すること、第１のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、細胞の少なくとも１つの第１の標的構造と一致しかつこのキャリブレーターの固体粒子に固定化された少なくとも１つの第１の標的構造を表面上に有すること、第２のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、細胞の少なくとも１つの第２の標的構造と一致しかつこのキャリブレーターの固体粒子に固定化された少なくとも１つの第２の標的構造を表面上に有すること、ならびに第１のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、第２の標的構造を表面上に有さず、第２のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、第１の標的構造を表面上に有しないことも考えられる。その際、測定チャネルの数に対応する数の異なる第１のキャリブレーターの少なくとも１つを準備し、分析媒体と混合することもでき、この第１のキャリブレーターは、それぞれが異なるマーカー分子の１つに対して結合特異的な異なる標的構造を有していてもよい。
この場合、複数の測定パラメーターおよびそのキャリブレーターの使用は、測定装置の測定チャネルの数および利用可能なフルオロフォアによってのみ制限される。通常、６～８個のパラメーターを記録することができる。ＡＭＬ細胞の分析について、今日では既に３０個の関連パラメーターが記録されているが、それらは数回の測定で記録する必要がある。近赤外領域でも測定が可能な最新の装置では、８個よりもはるかに多いパラメーターを記録することができる。かかるパラメーター空間において細胞のサブクラスを記録する場合には、測定の分解能が重要である。測定チャネル当たりの記録することができる測定の数は、固体粒子のサイズが第１の粒子クラスのキャリブレーターの固体粒子とは異なる更なる粒子クラスのキャリブレーターを使用することで増加させることができる。
第１のキャリブレーター（相対信号強度１００％）により、予想される最大信号を装置特異的に記録することが可能であるため、（例えば、測定技術的に最大の分解能を測定から得ることができるような検出器のレーザー出力または増幅器出力の調整によって）分解能を高めることができる。そのように記録および処理された信号を用いることで、細胞集団を数学的方法（例えば、https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalyseに記載されている標準的な数学的方法であるクラスター分析）を用いて記録することができる。これにより、治療に対する反応の適切なマーカーを記録および評価することができることから、例えば白血病のような非常に多様な疾患をより良好に類型化するとともに、より良好に治療することができる。リンパ腫および白血病の特定の場合では、疾患の予後に強い影響を与える多数のマーカーが知られている。現在の研究では、ＣＤ３８のような既知のマーカーに加えて、ＣＤ４９ｄの発現が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の経過に非常に深刻な影響を与えることが証明されている（ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２１４１．２０１１．０８７２５．ｘ）。
本発明の好ましい形態では、第１のキャリブレーター上の標的構造は、少なくとも１つの抗原を有し、これは、好ましくは少なくとも１つのタンパク質、ならびに／または少なくとも１つのペプチド、ならびに／または少なくとも１つの受容体、ならびに／または少なくとも１つのアレルゲン、ならびに／または少なくとも１つのグリコシル化タンパク質、ならびに／または少なくとも１つのリポ糖、ならびに／または少なくとも１つのオリゴ糖、ならびに／または少なくとも１つの多糖、ならびに／または少なくとも１つの核酸、ならびに／または上述の物質の少なくとも１つの断片および／もしくは誘導体を含む。
本発明の有利な実施形態では、少なくとも１つの第１のキャリブレーターの標的構造は、少なくとも１つの活性化カルボキシ基および／または少なくとも１つの活性化ＮＨ２基を介して第１のキャリブレーターの固体粒子に固定化されている。これにより、固体粒子への標的構造、例えば抗原の安定したカップリングおよび固定化が可能となる。適切な微粒子は市販されている。
第１のキャリブレーターの固体粒子に固定化された少なくとも１つの標的構造が、少なくとも１つの血液癌タイプの細胞に典型的な標的構造の１つに一致していれば有利である。この場合、本発明による方法を白血病細胞の分類に用いることができる。特に、その際に、急速に成長するＭ型細胞とより侵襲性が低いＤ型細胞とを区別することができる。
本発明の好ましい形態では、第１のキャリブレーターの固体粒子に固定化された少なくとも１つの標的構造は、慢性リンパ性白血病細胞（ＣＬＬ細胞）の表面上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）内に存在する標的構造の１つと一致する。これらの白血病細胞は特に侵襲性である。この標的構造は、高い親和性および特異性のためにフローサイトメトリー診断（ＦＡＣＳ）によく適している。
キャリブレーターを測定時に分析媒体、例えば血液に添加する。キャリブレーターの適切な濃度は、好ましくは１×１０６個の細胞当たり１×１０５個である。測定時に、キャリブレーターは前方散乱（サイズ）および側方散乱（粒度）のパラメーターによって特定され、それにより標的細胞から分離される。
キットに関して、上述の課題は、請求項１４の特徴によって解決される。本発明によると、キットは、
－非水溶性、無機かつ／または高分子の材料から構成される第１の固体粒子を有し、第１の固体粒子に固定化された少なくとも１つの標的構造を表面上に有する、少なくとも１つの第１のキャリブレーターと、
－形態、サイズおよび材料に関して第１の固体粒子と一致した第２の固体粒子を有し、標的構造を表面上に有しない、少なくとも１つの第２のキャリブレーターと、
－標的構造に対して結合特異的な少なくとも１つのマーカー分子と
を含む。
かかるキットを用いることで、フローサイトメトリー測定法において、流体中に含まれる分類すべき生体細胞の表面上に配置された標的構造を非常に正確に定量的に記録することができる。対応する測定値を、異なるフローサイトメーターを用いて測定した場合であっても互いに正確に比較することができる。少なくとも１つの標的構造は、好ましくは抗原である。必要に応じて、キットがバッファーをさらに含んでいてもよい。
キットの好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１のキャリブレーターの表面上に、第１の固体粒子に固定化された複数の異なる標的構造が配置されている。この場合、キットは、これらの標的構造ごとに、当該の標的構造に対して結合特異的なマーカー分子をそれぞれ少なくとも１つ含む。かかるキットを用いて並行測定を実施することができる。標的構造によるキャリブレーターの並行負荷は、固体粒子の占有密度、ひいては達成され得る最大信号によってのみ制限される。
しかしながら、並行測定を実施するためのキットが、異なる標的構造を表面上に有する複数の異なる第１のキャリブレーターを含むことも考えられる。この場合、各々の第１のキャリブレーターは、それぞれ１つの標的構造しか有することができない。少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、同じマーカー分子に対して結合特異的な標的構造を有する複数の領域を有することも可能である。
マーカー分子は、好ましくは蛍光色素を備える。かかる色素は通常、共有結合によってマーカー分子に結合する。例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＦＩＴＣ、ローダミン、フィコエリトリン、リサミンのような多数のかかる色素が市販されており、様々な色素のリストは、https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophoreに見られる。
本発明の好ましい形態では、キットは、少なくとも１つの第１のキャリブレーターに対する第１の較正係数および／または少なくとも１つの第２のキャリブレーターに対する第２の較正係数を記憶する、少なくとも１つのデータキャリアを含む。かかるキットを用いてキャリブレーターの許容誤差を補償することができる。これは、第１または第２のキャリブレーターの異なるバッチを用いて実施したフローサイトメトリー測定法の測定結果を互いに比較すべき場合に特に有利である。データキャリアは、例えばバーコードまたはＱＲコードを備えるキャリアを有することができる機械可読データキャリアであり得る。しかしながら、例えば添付文書等のキットに付属する書類、またはキットに付属するパッケージに数値の形で較正係数が印刷されていることも可能である。
キットが少なくとも２つのキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターを含む場合、ならびに異なるキャリブレータータイプのキャリブレーターが、特に固体粒子の表面上の少なくとも１つの標的構造の面積占有密度および／または配置に関して、それらの標的構造がマーカー分子で標識されているときに、フローサイトメトリー測定において異なる信号強度の測定信号を生じるように互いに異なる場合が有利である。かかるキットを用いることで、蛍光信号が非線形の推移を有するフローサイトメトリー測定において回帰を実施することができる。
本発明の更なる詳細、特徴および利点は、図面に関連した以下の実施例の記載から明らかとなる。
フローサイトメーターを用いて第２のキャリブレーター（ゼロキャリブレーター）の集団について記録された測定値のグラフであり、測定された強度ＰＥを横軸にプロットし、結合事象の数ｎを横軸にプロットしたものである。 図１と同様の図であるが、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの集団についての測定値を示す。 図１と同様の図であるが、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの集団についての測定値を示す。 ２．１×１０６個の固体粒子当たりのタンパク質ＣＤ２３の量を横軸にプロットし、ＭＦＩ値（平均蛍光測定値）を縦軸にプロットした標準曲線である。 サイズおよび粒度のパラメーターについて測定された測定信号のグラフであり、細胞およびキャリブレーター粒子に対する蛍光放射のサイズのパラメーターに割り当てられた前方散乱（ＦＳＣ）を横軸にプロットし、粒度のパラメーターに割り当てられた側方散乱（ＳＳＣ）を縦軸にプロットしたものである。 ＩｇＭおよびＣＤ１９に対する細胞およびキャリブレーター粒子について測定された強度値のグラフであり、ＩｇＭに対する強度を横軸にプロットし、ＣＤ１９に対する強度を縦軸にプロットしたものである。 ＩｇＤおよびＣＤ１９に対する細胞およびキャリブレーター粒子について測定された強度値のグラフであり、ＩｇＤに対する強度を横軸にプロットし、ＣＤ１９に対する強度を縦軸にプロットしたものである。 ＩｇＤおよびＩｇＭに対する細胞およびキャリブレーター粒子について測定された強度値のグラフであり、ＩｇＤに対する強度を横軸にプロットし、ＩｇＭに対する強度を縦軸にプロットしたものである。 図６～８による測定空間の三次元表示である。 図６～９に示される測定空間についてのクラスター分析のグラフである。
本発明の第１の実施例では、標的構造として疾患関連抗原を準備する。第１の標的構造としてＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）を準備し、第２の標的構造としてＩｇＤ（免疫グロブリンＤ）を準備する。
加えて、多数の固体粒子、すなわち直径６μｍのポリスチレン製のマイクロスフェアを準備する。固体粒子は、その形態、サイズおよび材料に関して一致している。
固体粒子は、それに結合したカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で表面がコーティングされている。カルボキシル基の代わりにまたはカルボキシル基に加えて、固体粒子の表面上にＮＨ２基を設けることができる。カルボキシル基および／またはＮＨ２基を介して、第１および第２の標的構造を固体粒子の表面に結合することができる。
さらに、第１および第２のマーカー分子を準備する。第１のマーカー分子は、第１の標的構造ＩｇＭに対して結合特異的な抗原である。第２のマーカー分子は、第２の標的構造ＩｇＤに対して結合特異的な抗原である。マーカー分子はそれぞれ、適切な励起放射によって励起されて蛍光放射を発する、少なくとも１つの光学マーカーを有する。
１．１ 固体粒子の表面への疾患関連抗原のカップリング
表面上にカルボキシル基を有する同数の固体粒子をそれぞれが含む、１３個の固体粒子集団を準備する。
６個の固体粒子集団の固体粒子の表面に第１の標的構造をカップリングし、別の６個の固体粒子集団の固体粒子の表面に第２の標的構造をカップリングする。このために、固体粒子に対し、いずれの場合にも１．２×１０６個の固体粒子当たり、
－第１の固体粒子集団については２．００μｇのＩｇＭ、
－第２の固体粒子集団については１．００μｇのＩｇＭ、
－第３の固体粒子集団については０．４０μｇのＩｇＭ、
－第４の固体粒子集団については０．２０μｇのＩｇＭ、
－第５の固体粒子集団については０．０８μｇのＩｇＭ、
－第６の固体粒子集団については０．０４μｇのＩｇＭ、
－第７の固体粒子集団については２．００μｇのＩｇＤ、
－第８の固体粒子集団については１．００μｇのＩｇＤ、
－第９の固体粒子集団については０．４０μｇのＩｇＤ、
－第１０の固体粒子集団については０．２０μｇのＩｇＤ、
－第１１の固体粒子集団については０．０８μｇのＩｇＤ、
－第１２の固体粒子集団については０．０４μｇのＩｇＤを
当該の固体粒子集団の固体粒子に添加し、結合バッファー（５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．２；０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ）中で絶えず撹拌しながら６０分間インキュベートする。カップリングはそれぞれ、ＥＤＡＣ（カルボジイミド）による活性化を用いた標準プロトコルに従って行われる。固体粒子を洗浄し、ＥＤＡＣ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）中で活性化する。
個々の固体粒子集団を８００ｇで遠心分離した後、それぞれ上清を取り、残りの抗原濃度の対照測定のために別にしておく。固体粒子を洗浄バッファーに加え、再懸濁する。再度の遠心分離後に上清を捨て、占有されていない反応基を飽和させるために粒子を洗浄および保存バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；０．０５％ＢＳＡ；０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ）に加える。
第１３の固体粒子集団の固体粒子の表面には、第１の標的構造も第２の標的構造もカップリングしない。代わりに、ブロッキングタンパク質がＣＯＯＨ基に非特異的に結合し得るように、反応性ＣＯＯＨ基をブロッキングタンパク質と接触させる。ブロッキングタンパク質としては、例えばウシ血清アルブミンまたは加水分解カゼインを使用することができる。
１．２ カップリングに使用されるＩｇＭおよびＩｇＤの濃度の決定
１３個の固体粒子集団の各々を、それぞれフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて測定する。このために、第１～第６の固体粒子集団の固体粒子および第１のマーカー分子（１回の測定につき約０．５μｇ）を流体に懸濁し、暗所で１０分間インキュベートする。サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。２ｍｌのＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄した後、再度遠心分離する。上清を捨てた後、固体粒子を１００～２００μｌのＰＢＳに加える。このようにして得られる懸濁液を、ＰＢＳに含まれる固体粒子が個々にレーザー光線の測定領域に到達するように測定領域を制限するフローサイトメーターのノズル開口部を通して導く。第１の標的構造に特異的に結合した第１のマーカー分子がレーザー光線により励起して蛍光放射を発する。これにより光学検出器を用いて蛍光測定値を記録する。その際、各固体粒子集団のそれぞれについて多数の蛍光測定値（強度測定値）を測定する。各固体粒子集団の個々の固体粒子について記録された蛍光測定値から、それぞれ平均値を得る（ＭＦＩ値または蛍光強度中央値）。
第７～第１２の固体粒子集団の固体粒子を、同様にフローサイトメーターを用いて測定する。その際、第２の標的構造に特異的に結合した第２のマーカー分子がレーザー光線により励起して蛍光放射を発する。
血清に由来するヒトＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）は容易に入手可能であるが、固体粒子へのカップリング、特にカップリング後の安定性について、組換えにより作製されたヒト単量体ＩｇＭがより適切であることが判明している。血清中では、ＩｇＭは主に五量体で存在する。ＩｇＭ五量体の結合では、大抵の場合、完全な結合が生じないことが明らかになった。五量体のＩｇＭ分子の一部は、粒子に共有結合しない。この場合、無制御な分解が、その後の使用時にフローサイトメーターにおける分解能の喪失につながる。したがって、ＩｇＭとＩｇＤ（免疫グロブリンＤ）との両方について、組換えにより作り出された単量体ＩｇＭおよびＩｇＤが使用される。
図１～３に第１、第２および第７の固体粒子集団の蛍光測定値および平均値をグラフで示す。横軸には、それぞれ問題の固体粒子集団の固体粒子についてフローサイトメーターを用いて測定した蛍光放射の強度ＰＥをプロットし、横軸には結合事象の数ｎをプロットしている。
図４に示されるように、それぞれ第１の標的構造について個々の蛍光の平均値を２．１×１０６個の固体粒子当たりのＣＤ２３タンパク質量ＰＭに対してプロットし、カップリング曲線とする。対応するカップリング曲線を第２の標的構造について作成する。
当該のカップリング曲線に基づいて、蛍光の所望の強度または信号強度に必要とされる第１のまたは第２の標的構造の量を読み取ることができる。カップリング曲線に基づいて、それぞれの標的構造についての強度の最大平均値Ｉｍａｘを決定および定義する。その後、７５％値（Ｐ７５）および２５％値（Ｐ２５）を以下：
Ｐ７５＝Ｉｍａｘ×０．７５
Ｐ２５＝Ｐ７５／１０
のように定義する。
第１の実施例では、カップリングについて以下の値：
Ｉｍａｘ＝２１７００
Ｐ７５＝２１７００×０．７５＝１６２７５
Ｐ２５＝１６２７５／１０＝１６２７
が得られる。
これらの値を参照として設定する。ここで、カップリング曲線から適切なタンパク質量を読み取ることができる。Ｐ７５については、これは２．１×１０６個の固体粒子当たり１．３μｇとなる。
１．３ ＣＬＬに特徴的な２つのパラメーターであるＩｇＭおよびＩｇＤに対するキャリブレーターの準備
第１および第２の標的構造（ＩｇＭおよびＩｇＤ）について、それぞれ複数のキャリブレーター集団を作製することが目的である。
第１のキャリブレーター集団は、第１のキャリブレータータイプの多数の一致した第１のキャリブレーターを含む。これらのキャリブレーターはそれぞれ、第１のキャリブレータータイプの個々の第１のキャリブレーターの蛍光信号がフローサイトメトリー分析において２５％の相対強度にそれぞれ達するように第１の標的構造としてＩｇＭが表面に固定化された固体粒子を有する。
第２のキャリブレーター集団は、第２のキャリブレータータイプの多数の一致した第１のキャリブレーターを含む。これらのキャリブレーターはそれぞれ、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターと同じ固体粒子を有する。第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの固体粒子の表面には、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの表面と同じ標的構造が固定化される。しかしながら、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの標的構造の面積占有密度および配置は、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの蛍光信号がフローサイトメトリー分析において７５％の相対強度に達するように選択される。
第３のキャリブレーター集団は、第３のキャリブレータータイプの多数の一致した第１のキャリブレーターを含む。これらのキャリブレーターはそれぞれ、第１および第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターと同じ固体粒子を有する。第３のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターには、第４のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの蛍光信号がフローサイトメトリー分析において２５％の相対強度に達するように、ＩｇＤに対して結合特異的な第２の標的構造が固定化される。
第４のキャリブレーター集団は、第４のキャリブレータータイプの多数の一致した第１のキャリブレーターを含む。これらのキャリブレーターはそれぞれ、第１、第２および第３のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターと同じ固体粒子を有する。第４のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの固体粒子の表面には、第３のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの表面と同じ標的構造が固定化される。しかしながら、第４のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの標的構造の面積占有密度および配置は、第４のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの蛍光信号が、フローサイトメトリー分析において７５％の相対強度に達するように選択される。
加えて、第５のキャリブレータータイプの多数の一致した第１のキャリブレーターを含む第５のキャリブレーター集団を作製する。これらのキャリブレーターはそれぞれ、第１、第２、第３および第４のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターと同じ固体粒子を有する。第５のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの固体粒子の表面には、２つの異なる標的構造が固定化される。これらの標的構造の一方は、第１の標的構造（ＩｇＭに対して結合特異的）と同一であり、もう一方の標的構造は、第２の標的構造（ＩｇＤに対して結合特異的な抗原）と同一である。第５のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの抗原ＩｇＭおよびＩｇＤの面積占有密度および配置は、第５のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの蛍光信号が、フローサイトメトリー分析においてＩｇＭとＩｇＤとの両方について７５％の相対強度にそれぞれ達するように選択される。
さらに、多数の一致した第２のキャリブレーターを有する負の集団を作製する。第２のキャリブレーターはそれぞれ、第１の標的構造（ＩｇＭ）も第２の標的構造（ＩｇＤ）も固定化されていない固体粒子からなる。負の集団では、固体粒子の表面上にあるカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）またはＮＦ２基がブロッキングタンパク質に非特異的に結合する。第２のキャリブレーターの固体粒子は、第１のキャリブレーターの固体粒子と同一である。
固体粒子への抗原のカップリングのために、作製する各集団に必要とされる量の固体粒子を反応容器に移す。固体粒子を８００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てる。その後、固体粒子をカップリングバッファーに加える。カップリングは上記のプロトコルに従って行われ、第１、第２および第５のキャリブレーター集団については適量のＩｇＭ、第３、第４および第５のキャリブレーター集団については適量のＩｇＤを使用する。
このようにして準備されるキャリブレーター集団を以下に列挙する：
第１のキャリブレーター：
ａ）ＩｇＭキャリブレーター：
ＰＤ２５－ＩｇＭ濃度Ｉｎｔ２５
ＰＤ７５－ＩｇＭ濃度Ｉｎｔ７５
ｂ）ＩｇＤキャリブレーター：
ＰＤ２５－ＩｇＤ濃度Ｉｎｔ２５
ＰＤ７５－ＩｇＤ濃度Ｉｎｔ７５
ｃ）ＩｇＭおよびＩｇＤキャリブレーター：
Ｐｍｄ－ＩｇＭおよびＩｇＤ濃度Ｉｎｔ７５
第２のキャリブレーター：
Ｐ０－ＩｇＭもＩｇＤも有しない
個々のキャリブレーターを作製後にマーカーで標識された市販の抗体を使用してＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって測定する。その後の診断を目的とした用途については、キャリブレーターを組み合わせてキットにする。このため、その後のＦＡＣＳ測定では、診断目的で測定空間を個々の集団によって定義、標準化および正規化する。
１．４ ＦＡＣＳによる血液サンプルの分析のためのキャリブレーターの使用
以下のものを含むキットを準備する：
ａ）セクション１．３に記載の多数の第１のキャリブレーターＰＤ２５を含み、第１の標的構造としてＩｇＭが表面に固定化された、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの第１の集団。
ｂ）セクション１．３に記載の多数の第１のキャリブレーターＰＤ７５を含み、第１の標的構造としてＩｇＭが表面に固定化された、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの第２の集団。
ｃ）セクション１．３に記載の多数の第１のキャリブレーターＰＤ２５を含み、第１の標的構造としてＩｇＤが表面に固定化された、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの第１の集団。
ｄ）セクション１．３に記載の多数の第１のキャリブレーターＰＤ７５を含み、第１の標的構造としてＩｇＤが表面に固定化された、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターの第２の集団。
ｅ）セクション１．３に記載の多数の第２のキャリブレーターＰ０を含む、第２のキャリブレーターの集団。
ｆ）第１の標的構造ＩｇＭに対して結合特異的な第１の抗原をそれぞれ有する、第１のマーカー分子の集団。第１のマーカー分子はそれぞれ、第１の抗原にカップリングし、適切な第１の励起放射によって励起されて第１の蛍光放射を発する第１の光学マーカーを有する。
ｇ）第２の標的構造ＩｇＤに対して結合特異的な第２の抗原をそれぞれ有する、第２のマーカー分子の集団。第２のマーカー分子はそれぞれ、第２の抗原にカップリングし、適切な第２の励起放射によって励起されて第２の蛍光放射を発する第２の光学マーカーを有する。
ｈ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳバッファー）。
血球のＦＡＣＳベースの分析の場合、分類すべき細胞（リンパ腫細胞）の細胞数を採血後に分析媒体である血液中で決定し、各ＦＡＣＳ分析に必要とされる細胞数を反応容器に入れる（例えば、１回の測定につき１×１０６個の細胞）。その後、マーカー分子（１回の測定につき約０．５μｇ）およびキャリブレーターＰ０、ＰＤ２５、ＰＤ７５を添加し、暗所で１０分間インキュベートする。インキュベーション時間後に、２ｍｌの溶解－固定バッファーで容量を満たし、再び１０分間インキュベートする。この工程では、細胞を固定するだけでなく、赤血球の大半を破裂させる。赤血球は測定には重要でなく、場合によっては測定を妨げる恐れがある。
サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。２ｍｌのＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄した後、再度遠心分離する。上清を捨てた後、細胞を１００～２００μｌのＰＢＳに加える。
その後、このようにして得られる分析媒体をＦＡＣＳフローサイトメーターにおいて分析する。ＦＡＣＳフローサイトメーターでは、分析媒体を、マーカー分子で標識された細胞および異なるキャリブレーターのそれぞれが個々にレーザー光線の測定領域に到達するように測定領域を制限するノズル開口部を通して導く。
ＦＡＣＳフローサイトメーターを用いて、測定領域に到達した各キャリブレーターおよび測定領域に到達した各細胞について、１つの第１のフローサイトメトリー測定値および２つの第２のフローサイトメトリー測定値をそれぞれ記録する。第１のフローサイトメトリー測定値は、測定領域内にある当該のキャリブレーターまたは測定領域内にある当該の細胞に結合した少なくとも１つのマーカー分子が、レーザー光線による励起によって発する蛍光放射に依存する。２つの第２のフローサイトメトリー測定値は、レーザー光線が測定領域内にある当該のキャリブレーターまたは測定領域内にある当該の細胞に衝突することで生じる散乱放射の前方散乱測定値および側方散乱測定値を含む。
第２のフローサイトメトリー測定値を参照値と比較する。比較の結果に応じて、細胞およびキャリブレーターの様々な散乱特性により、第２のフローサイトメトリー測定値が細胞またはキャリブレーターでのレーザー光線の散乱によって得られたものであるかを確認することができる。異なるキャリブレーターは、それらの第１のフローサイトメトリー測定値の信号レベルに基づいて区別することができる。したがって、比較の結果に応じて、第１のフローサイトメトリー測定値を細胞またはキャリブレーターのいずれかに割り当てる。
キャリブレーターである場合に、第１のフローサイトメトリー測定値を異なるキャリブレーター粒子集団に割り当てられる比較区間と比較する。これにより、第１のフローサイトメトリー測定値を特定のキャリブレーター粒子集団のキャリブレーターに割り当てることができる。割当ては、例えば適切なソフトウェアを用いて自動的に行うことができる。
個々の標的構造（ＩｇＭまたはＩｇＤ）ごとに、個々のキャリブレーターＰ０、ＰＤ２５およびＰＤ７５に対し、第１のフローサイトメトリー測定値（蛍光強度）のそれぞれの平均値を決定する。これらが測定に使用される参照測定空間の基礎となる。キャリブレーターＰ０の第１のフローサイトメトリー測定値は、チャネルのバックグラウンドを決定するために用いられる。加えて、キャリブレーターＰ０の第１のフローサイトメトリー測定値により、マーカー分子の抗原とそれらにそれぞれ割り当てられた標的構造（陰性対照）とのカップリングの品質について説明することが可能となる。
加えて、細胞について、個々の標的構造ごとに第１のフローサイトメトリー測定値の平均値を決定する。
実施例では、ＩｇＭに対し、第１のフローサイトメトリー測定値の以下の平均値：
第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５：１６００
第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ７５：１６０００
第２のキャリブレーターＰ０：２５
第１の標的構造に対する細胞：５６００
が求められる。
初めに、バックグラウンドノイズを測定値から除去する。バックグラウンドノイズは、使用されるマーカー分子の抗体とキャリブレーターの固体粒子または細胞との非特異的結合によって生じる。このために、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰ０の第１のフローサイトメトリー測定値を、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５およびＰＤ７５、第２のキャリブレーターＰ０、ならびに細胞の第１のフローサイトメトリー測定値からそれぞれ減算する。これにより、ＩｇＭに対し、以下の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値：
第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５：１６００－２５＝１５７５
第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ７５：１６０００－２５＝１５９７５
第２のキャリブレーターＰ０：２５－２５＝０
第１の標的構造に対する細胞：５６００－２５＝５５７５
が得られる。
キャリブレーターＰＤ２５およびＰＤ７５について参照単位を定義する。第１のキャリブレータータイプのキャリブレーターＰＤ７５の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値に１００参照単位を割り当てる。このため、参照単位は、１５９７５／１００＝１５９．７５の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値に相当する。この数値は、以下で第１のスケール係数とも称される。第１のキャリブレータータイプのキャリブレーターＰＤ２５の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値は、１５７５／１５９．７５＝９．８６参照単位に相当する。細胞の第１の標的構造に対する調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値および第１のスケール係数から、第１の正規化された測定値：５５７５／１５９．７５＝３４．９０参照単位が得られる。
実施例では、ＩｇＤに対し、第１のフローサイトメトリー測定値の以下の平均値：
第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５：３１０３
第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ７５：３１０３０
第２のキャリブレーターＰ０：１４４
第２の標的構造に対する細胞：４４５０
が求められる。
これにより、ＩｇＤに対し、以下の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値：
第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５：３１０３－１４４＝２９５９
第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ７５：３１０３０－１４４＝３０８８６
第２のキャリブレーターＰ０：１４４－１４４＝０
第２の標的構造に対する細胞：４４５０－１４４＝４３０６
が得られる。
この場合もキャリブレーターＰＤ２５およびＰＤ７５について参照単位を定義する。第２のキャリブレータータイプのキャリブレーターＰＤ７５の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値に１００参照単位を割り当てる。このため、参照単位は、３０８８６／１００＝３０８．８６の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値に相当する。この数値は、以下で第２のスケール係数とも称される。第２のキャリブレータータイプのキャリブレーターＰＤ２５の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値は、２９５９／３０８．８６＝９．５８参照単位に相当する。細胞の第２の標的構造に対する調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値および第２のスケール係数から、第２の正規化された測定値：４３０６／３０８．８６＝１３．９４参照単位が得られる。
参照単位の割当てにより、細胞の調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値は、使用されるフローサイトメーターの特性および設定から独立し、最初に述べたフローサイトメーターとは異なる設定であるか、またはそれとは別の特性を有するフローサイトメーターによる、対応する調整済みの第１のフローサイトメトリー測定値と比較することができる。
その後の工程では、必要に応じて、参照単位に関する正規化された細胞の測定値をカップリング曲線（図４）の値と関連付けることができる。カップリング曲線は、ロジスティック関数（ガウス－ローレンツ分布）に相当する。したがって、「最適」曲線を用いて、細胞上にある当該の標的構造の量に相当する、参照単位に指定された値から絶対値を決定することができる。
２．１ ＣＬＬに特徴的な３つのパラメーターであるＩｇＭ、ＩｇＤおよびＣＤ１９を用いたキャリブレーターの準備
第２の実施例では、更なるパラメーターの使用のために、個々の集団の数および組合せを第１の実施例と比べて拡張する。ＩｇＭおよびＩｇＤについて説明したように、ヒトのおよび組換えにより作製されたＢリンパ球抗原ＣＤ１９についても、初めに有効強度の標準曲線を作成した。これに関し、適切な量をカップリングに使用した。
第１のキャリブレーター：
ａ）ＩｇＭキャリブレーター：
ＰＤ２５－ＩｇＭ濃度Ｉｎｔ２５
ＰＤ７５－ＩｇＭ濃度Ｉｎｔ７５
ｂ）ＩｇＤキャリブレーター：
ＰＤ２５－ＩｇＤ濃度Ｉｎｔ２５
ＰＤ７５－ＩｇＤ濃度Ｉｎｔ７５
ｃ）ＣＤ１９キャリブレーター：
ＰＤ２５－ＣＤ１９濃度Ｉｎｔ２５
ＰＤ７５－ＣＤ１９濃度Ｉｎｔ７５
ｄ）ＩｇＭおよびＩｇＤキャリブレーター：
Ｐｍｄ－ＩｇＭおよびＩｇＤ濃度Ｉｎｔ７５
ｅ）ＣＤ１９およびＩｇＭキャリブレーター：
ＰＣＤ１９／ｍ－ＣＤ１９およびＩｇＭ濃度Ｉｎｔ７５
ｆ）ＣＤ１９およびＩｇＤキャリブレーター：
ＰＣＤ１９／ｄ－ＣＤ１９およびＩｇＤ濃度Ｉｎｔ７５
第２のキャリブレーター：Ｐ０－ＩｇＭもＩｇＤもＣＤ１９も有しない
この方法は、任意の数のパラメーターに拡張し、変更することができる。
２．２ キャリブレーター粒子を用いた免疫プロファイリングの概略図
分類すべき細胞およびキャリブレーター粒子をフローサイトメーターにおいて同時に測定し、分析する。図５に示されるように、第１の工程では、細胞の測定信号およびキャリブレーター粒子の測定信号の分離をサイズおよび粒度のパラメーターに従って行う。その際、サイズはエネルギー光線の前方散乱測定値（ＦＳＣ）によって表され、粒度はエネルギー光線の側方散乱測定値（ＳＳＣ）によって表される。この段階においては、分析すべき細胞およびキャリブレーター粒子の選択（ゲーティング）を行う。図５では、選択された細胞（細胞集団）の測定値を第１の楕円１で囲み、選択されたキャリブレーター（キャリブレーター集団）の測定値を第２の楕円２で囲む。
これらの集団はここで、様々なパラメーター（カラーチャネル）について一緒に分析することができる。その際、キャリブレーター粒子が各チャネルについて参照グリッドを形成する。図６～９には、３つのパラメーター（ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＣＤ１９）の例示的な分析をグラフで示すが、
－Ｉ（ＩｇＭ）はＩｇＭについて測定された蛍光放射の平均強度を意味し、
－Ｉ（ＩｇＤ）はＩｇＤについて測定された蛍光放射の平均強度を意味し、
－Ｉ（ＣＤ１９）は抗原ＣＤ１９について測定された蛍光放射の平均強度を意味する。第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５－ＩｇＭの第１の集団の測定値は参照番号３で示し、第１のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ７５－ＩｇＭの第２の集団の測定値は参照番号４で示し、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ２５－ＩｇＤの第１の集団の測定値は参照番号５で示し、第２のキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターＰＤ７５－ＩｇＤの第２の集団の測定値は参照番号６で示し、第２のキャリブレーターＰ０の集団の測定値は参照番号７で示す。キャリブレーターＰＤ２５－ＣＤ１９の測定値は参照番号８で示し、キャリブレーターＰＤ７５－ＣＤ１９の測定値は参照番号９で示し、キャリブレーターＰｍｄ－ＩｇＭおよびＩｇＤの測定値は参照番号１０で示し、キャリブレーターＰＣＤ１９／ｍ－ＣＤ１９およびＩｇＭの測定値は参照番号１１で示し、キャリブレーターＰＣＤ１９／ｄ－ＣＤ１９およびＩｇＤの測定値は参照番号１２で示す。
キャリブレーター粒子は、複数の目的を果たす：
１．細胞と比較して同一条件下で使用される検出抗体の染色特性についての陽性および陰性対照。
２．測定空間の定義および標準化、これにより、
ｉ）特定の装置および／または製造業者からの独立性が達成され、
ｉｉ）分析すべき細胞のプロファイルを、分析すべきパラメーター（この例では、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ１９）に関して作成することができ、
ｉｉｉ）自動分析の基礎が築かれる。
このように定義および標準化された多パラメーター測定空間（図９）に関して、細胞の値を正規化し、それらの得られるプロファイルに基づいて群またはクラスターに組み合わせることができる。このクラスター化は、分析すべき細胞の抗原プロファイルの作成の基礎となる。
図１０にクラスター分析の結果をグラフで示す。各円はクラスター化された部分集団を表し、円の直径は、測定値の総数と比べた当該の部分集団に属する測定値の数の尺度である。この情報は、直径が最大の円によって示される初期集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関連する。この初期集団はＣＤ１９、ＩｇＭおよびＩｇＤについてＭＦＩ値Ｘ、ＹおよびＺを有する。別の部分集団は、対応するＭＦＩ値の変化を有する。したがって、初期集団の値がＸ＝１０００である場合、Ｘ＋２００のクラスターは、当該のパラメーターについて１２００のＭＦＩを有する。

Claims (16)

  1. 流体とそれに含まれる分類すべき生体細胞とを有する分析媒体を準備し、少なくとも１つのマーカー分子を準備し、前記細胞が標的構造を有する場合に、前記マーカー分子が前記細胞の表面上にある少なくとも１つの標的構造に特異的に結合することができるように前記分析媒体と接触させ、前記細胞が個々にエネルギー光線および／または電場の測定領域に到達する前記分析媒体の流体流を生じさせ、前記測定領域内にある個々の細胞について、それぞれ少なくとも第１の物理的パラメーターに対する第１のフローサイトメトリー測定値および第２の物理的パラメーターに対する第２のフローサイトメトリー測定値が記録され、少なくとも前記第１のパラメーターが、前記少なくとも１つのマーカー分子が前記エネルギー光線または前記電場によって励起された場合に発する蛍光放射であり、前記細胞がフローサイトメトリー測定値に基づいて分類される、フローサイトメトリー測定法において、非水溶性、無機かつ／または高分子の材料から構成される固体粒子をそれぞれが有する、少なくとも１つの第１のキャリブレーターおよび少なくとも１つの第２のキャリブレーターを準備すること、前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターと前記少なくとも１つの第２のキャリブレーターの前記固体粒子とが形態、サイズおよび材料に関して一致していること、前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、前記細胞の前記少なくとも１つの標的構造と一致しかつ前記第１のキャリブレーターの前記固体粒子に固定化された少なくとも１つの標的構造を表面上に有すること、前記少なくとも１つの第２のキャリブレーターが前記標的構造を有しないこと、前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターおよび前記少なくとも１つの第２のキャリブレーターを、前記フローサイトメトリー測定値を記録する前に、前記分析媒体中にある少なくとも１つのマーカー分子が前記第１のキャリブレーターの前記少なくとも１つの標的構造に結合するように前記分析媒体と混合すること、前記流体流中の前記キャリブレーターが個々に前記測定領域に次々に導入されること、前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターおよび前記少なくとも１つの第２のキャリブレーターについて、前記細胞と同様に対応する第１および第２のフローサイトメトリー測定値が記録されること、前記細胞の第２のフローサイトメトリー測定値および前記キャリブレーターの第２のフローサイトメトリー測定値に割り当てられたパラメーターが、前記キャリブレーターを前記第２の測定値に基づいて前記細胞と区別することができるように選択されること、ならびに前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターの少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値、前記少なくとも１つの第２のキャリブレーターの少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値、および少なくとも１つの細胞の第１のフローサイトメトリー測定値から、前記少なくとも１つの細胞について正規化された第１のフローサイトメトリー測定値が生成されることを特徴とする、フローサイトメトリー測定法。
  2. 前記正規化された第１のフローサイトメトリー測定値を生成するために、前記第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値と前記第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値との間の差を、前記細胞の第１のフローサイトメトリー測定値と前記第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値との間の差に対して関連付ける、請求項１記載のフローサイトメトリー測定法。
  3. 複数の同一の第１のキャリブレーターおよび複数の同一の第２のキャリブレーターを準備し、個々についてのフローサイトメトリー測定値を記録する前に前記分析媒体と混合すること、前記第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値から、前記第１のキャリブレーターについての平均された第１のフローサイトメトリー測定値が生成されるとともに、前記第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値から、前記第２のキャリブレーターについての平均された第１のフローサイトメトリー測定値が生成されること、ならびに細胞の正規化された第１の測定値を生成するために、前記第１のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値と前記第２のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の差を、前記細胞の第１のフローサイトメトリー測定値と前記第２のキャリブレーターの平均された第１のフローサイトメトリー測定値との間の差に対して関連付ける、請求項１または２記載のフローサイトメトリー測定法。
  4. 前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターに対し、前記第１のパラメーターについての測定信号に関して前記第１のキャリブレーターの測定信号強度と前記標的構造を有する第１の参照キャリブレーターの測定信号強度との間の比率に相当する第１の較正係数を準備すること、前記第１のキャリブレーターの第１の物理的パラメーターについて第１の測定信号を記録するとともに、前記第１の測定信号および前記第１の較正係数から前記第１のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値を生成すること、前記第２のキャリブレーターに対し、前記第１のパラメーターについての測定信号に関して前記第２のキャリブレーターの測定信号強度と前記標的構造を有しない第２の参照キャリブレーターの測定信号強度との間の比率に相当する第２の較正係数を準備すること、ならびに前記第２のキャリブレーターの第１の物理的パラメーターについて第２の測定信号を記録するとともに、前記第２の測定信号および前記第２の較正係数から前記第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値を生成する、請求項１から３までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  5. 少なくとも２つのキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターを準備し、前記分析媒体と混合すること、異なるキャリブレータータイプのキャリブレーターが、特に前記固体粒子の表面上の前記少なくとも１つの標的構造の面積占有密度および／または配置に関して、第１のキャリブレータータイプの第１のフローサイトメトリー測定値が、前記第２のキャリブレーターの第１のフローサイトメトリー測定値の信号強度よりも大きく、かつ第２のキャリブレータータイプの第１のフローサイトメトリー測定値の信号強度よりも小さい信号強度を有するように互いに異なる、請求項１から４までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  6. 第１の集団の細胞の第１のフローサイトメトリー測定値が第１の信号強度範囲内にあり、第２の集団の細胞の第１のフローサイトメトリー測定値が、前記第１の信号強度範囲外の第２の信号強度範囲内にあるように互いに異なる、少なくとも２つの異なる細胞の集団が前記流体に含まれること、および前記第１のキャリブレータータイプの第１のフローサイトメトリー測定値の信号強度が、前記第１の信号強度範囲と前記第２の信号強度範囲との間にあるように選択される、請求項５記載のフローサイトメトリー測定法。
  7. 前記固体粒子の最大寸法が２０μｍ未満、特に１５μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満であり、かつ／または前記固体粒子の最小寸法が４μｍ超、特に５μｍ超、好ましくは６μｍ超である、請求項１から６までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  8. 前記固体粒子の材料がポリスチレン、メラミン、ラテックスまたはケイ酸塩である、請求項１から７までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  9. 少なくとも１つの第２のフローサイトメトリー測定値が、前記測定領域内で生じる前記エネルギー光線の前方散乱の前方散乱測定値および／または前記測定領域内で生じる前記エネルギー光線の側方散乱の側方散乱測定値を含む、請求項１から８までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  10. 前記細胞と前記第１および第２のキャリブレーターとの両方について、それぞれ複数の測定チャネルに対して少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値が記録されること、前記測定チャネルの数に対応する数の異なるマーカー分子の少なくとも１つを準備し、前記分析媒体と接触させること、ならびに前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、それぞれが当該のマーカー分子と接触したときに異なるマーカー分子の１つに特異的に結合する、前記測定チャネルの数に対応する数の標的構造の少なくとも２つ、特に少なくとも１つを有する、請求項１から９までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  11. 前記細胞と前記第１および第２のキャリブレーターとの両方について、それぞれ複数の測定チャネルに対して少なくとも１つの第１のフローサイトメトリー測定値が記録されること、前記測定チャネルの数に対応する数の異なるマーカー分子の少なくとも１つを準備し、前記分析媒体と接触させること、少なくとも２つのキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターを準備すること、第１のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、前記細胞の少なくとも１つの第１の標的構造と一致しかつ前記キャリブレーターの前記固体粒子に固定化された少なくとも１つの第１の標的構造を表面上に有すること、第２のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、前記細胞の少なくとも１つの第２の標的構造と一致しかつ前記キャリブレーターの前記固体粒子に固定化された少なくとも１つの第２の標的構造を表面上に有すること、ならびに前記第１のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、前記第２の標的構造を表面上に有さず、前記第２のキャリブレータータイプの少なくとも１つの第１のキャリブレーターが、前記第１の標的構造を表面上に有しない、請求項１から１０までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  12. 前記第１のキャリブレーター上の前記標的構造が、好ましくは少なくとも１つのタンパク質、ならびに／または少なくとも１つのペプチド、ならびに／または少なくとも１つの受容体、ならびに／または少なくとも１つのアレルゲン、ならびに／または少なくとも１つのグリコシル化タンパク質、ならびに／または少なくとも１つのリポ糖、ならびに／または少なくとも１つのオリゴ糖、ならびに／または少なくとも１つの多糖、ならびに／または少なくとも１つの核酸、ならびに／または上述の物質の少なくとも１つの断片および／もしくは誘導体を含む、少なくとも１つの抗原を有する、請求項１から１１までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  13. 前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターの前記標的構造が、少なくとも１つの活性化カルボキシ基および／または少なくとも１つの活性化ＮＨ２基を介して前記第１のキャリブレーターの前記固体粒子に固定化されている、請求項１から１２までのいずれか１項記載のフローサイトメトリー測定法。
  14. 請求項１記載の方法を実施するためのキットであって、
    －非水溶性、無機かつ／または高分子の材料から構成される第１の固体粒子を有し、前記第１の固体粒子に固定化された少なくとも１つの標的構造を表面上に有する、少なくとも１つの第１のキャリブレーターと、
    －形態、サイズおよび材料に関して前記第１の固体粒子と一致した第２の固体粒子を有し、前記標的構造を表面上に有しない、少なくとも１つの第２のキャリブレーターと、
    －前記標的構造に対して結合特異的な少なくとも１つのマーカー分子と
    を含む、キット。
  15. 前記キットが、前記少なくとも１つの第１のキャリブレーターに対する第１の較正係数および／または前記少なくとも１つの第２のキャリブレーターに対する第２の較正係数を記憶する、少なくとも１つのデータキャリアを含む、請求項１４記載のキット。
  16. 前記キットが少なくとも２つのキャリブレータータイプの第１のキャリブレーターを含むこと、異なるキャリブレータータイプのキャリブレーターが、特に前記固体粒子の表面上の少なくとも１つの標的構造の面積占有密度および／または配置に関して、前記標的構造が前記マーカー分子で標識されているときに、フローサイトメトリー測定において異なる信号強度の測定信号を生じるように互いに異なる、請求項１４または１５記載のキット。
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